KR101026070B1

KR101026070B1 - 피부줄기세포의 배양방법 및 상기 배양방법으로 얻어진 피부줄기세포를 포함하는 주름개선 또는 발모촉진용 조성물

Info

Publication number: KR101026070B1
Application number: KR1020100059065A
Authority: KR
Inventors: 성종혁; 정형민; 강상진; 이선주; 김승현; 이형우; 심기성; 이민아; 강교빈; 원종현
Original assignee: 주식회사 엘컴사이언스; (주)차바이오앤디오스텍
Priority date: 2010-06-22
Filing date: 2010-06-22
Publication date: 2011-03-31

Abstract

본 발명은 천연물인 희렴으로부터 추출된 디테르펜(diterpene) 화합물을 포함하는 무혈청 배지 중에서 피부줄기세포를 배양하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 상기 배양방법으로 피부줄기세포를 배양하여 얻어진 배양물 또는 그의 분획물을 포함하는 주름개선용; 및/또는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물을 제공한다.

Description

피부줄기세포의 배양방법 및 상기 배양방법으로 얻어진 피부줄기세포를 포함하는 주름개선 또는 발모촉진용 조성물{Process for culturing epidermal skin stem cells and composition for wrinkle-caring or promoting hair growth comprising the epidermal skin stem cells obtained by the process}

본 발명은 무혈청(serum-free) 배지 중에서 피부줄기세포의 배양방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 천연물인 희렴으로부터 추출된 디테르펜(diterpene) 화합물을 포함하는 무혈청 배지 중에서 피부줄기세포를 배양하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 상기 배양방법으로 피부줄기세포를 배양하여 얻어진 배양물 또는 그의 분획물을 포함하는 주름개선용; 및/또는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물에 관한 것이다.

피부의 줄기세포는 피부건강을 위하여 매우 중요하며 피부의 생리학적 및 생화학적인 항상성을 유지하는데 중추적인 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 피부에 존재하는 줄기세포도 나이가 듦에 따라 노후화로 인하여 기능에 있어서 이상이 발생하게 되며, 이에 따라 피부의 항상성이 깨지면서 여러 가지 문제가 발생된다. 따라서 노후화된 줄기세포를 다시 활성화시킨다면 피부의 나이를 역으로 돌리는 것과 같은 효과를 가져올 것이다. 또한, 모발과 관련하여 모낭줄기세포를 활성화시킬 경우, 탈모방지는 물론 육모를 유도할 가능성도 매우 클 것으로 기대되고 있다.

피부는 외부로부터 표피, 진피 및 피하지방층의 3개의 층으로 구성되어 있다. 표피는 3개층 가운데 가장 얇으며 부위에 따라 두께에 차이가 있다. 표피는 주로 각질형성세포로 구성되며 이외에 멜라닌 색소를 생산하는 멜라닌세포, 면역학적 기능을 수행하는 랑게르한스 세포 등으로 구성되어 있다. 진피는 주로 교원질, 탄력섬유로 구성되는 결체조직과 기질로 이루어지며 그 속에 신경, 혈관, 림프관, 근육, 모낭, 피지선, 땀샘선 등을 내포하고 있다.

발생학적으로 사람 피부의 모든 구성성분은 외배엽이나 중배엽에서 유래되는 것으로 알려져 있다. 표피, 모낭, 피지선, 땀샘선 등은 외배엽에서 기원하며, 멜라닌세포, 신경 및 특수 감각 수용체는 신경 외배엽에서 유래된다. 신경외배엽에서 유래되는 멜라닌 세포는 발생 8주 후 피부에 도달하며 발생 4-5개월이 되면 수지상 돌기가 발달하여 주위 각질형성세포로 멜라닌 소체를 이동시킨다. 이와 같이 발생학적 시기에 따라 배아의 줄기세포는 분화를 거듭하게 되며 각각 맡은 바 기능에 알맞은 특성을 갖게 된다. 성체가 된 후에도 일정 수의 줄기세포는 조직에 남게 되는데 피부에서는 주로 두 곳에 줄기세포들이 존재한다.

첫째는 모낭 (hair follicle)에 존재한다. 이 곳은 세포분화가 일어나기 전의 세포로 표피의 재생과 관련해 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있으며, 털의 재생과 성장에 중요한 역할을 수행하고 있다.

둘째는 모낭과 모낭 사이의 표피(interfollicular epidermis)라고 불리우는 표피의 기저층(the basal cell layer of epidermis)이다. 이 곳에 자리하고 있는 줄기세포는 표피는 물론 진피층의 섬유아세포까지 관장하여 피부건강을 지키는 중요한 역할을 수행하고 있음이 밝혀졌다. 이 곳의 줄기세포는 양이 많고 쉽게 얻을 수 있다는 장점이 있어 피부줄기세포 연구에 널리 사용되고 있다. 피부는 지속적으로 재생(renew)되며, 피부의 상피에 존재하는 줄기세포 즉, 피부의 상피 줄기세포(epidermal stem cells)는 상처 후 상피의 복구에 관여한다(Epidermal Stem Cells of the Skin, Cedric Blanpain, Elaine Fuchs, Annual Review of Cell and Developmental Biology, November 2006, Vol. 22, Pages 339-373). 상기 피부의 상피 줄기세포는 피부줄기세포(skin stem cells)로도 칭해지며, 상기 피부줄기세포를 활성화시킬 경우, 외상 등의 피부상처를 치료하거나 상처 치료를 촉진할 수 있을 것으로 기대된다. 피부줄기세포의 지표로는 인테그린 β1(integrin β1) 및 인테그린(integrin α6)이 사용되고 있고, 상피형태 형성 및 분화에 필요한 피부줄기세포의 유지는 p63 단백질에 의해 조절된다고 보고되고 있다.

한편, 인간의 피부줄기세포를 이용하여 약학 조성물 또는 화장료 조성물로 개발하기 위하여는, 오염 가능성을 최소화하면서 안정적으로 상기 세포를 증식 및 배양하는 것이 필요하다. 종래에 알려져 있는 인간의 피부줄기세포의 배양방법은 5∼20 %의 소태아 혈청(Fetal bovine Serum) 즉, 혈청 함유 배지의 사용을 포함한다. 상기 소태아 혈청은 알부민 등의 고분자 단백질, 영양분, 그리고 트랜스패린 등을 함유하고 있으며, 호르몬과 부착 인자와 같은 세포 배양에 필요한 성분들을 함유하고 있다. 또한 인슐린, EGF 등의 성장 인자를 가지고 있으며, 배지의 독성 성분을 중화시키는 역할을 하기도 한다. 그러나 소태아 혈청에는 미확인된 미량 성분이 있으며, 이러한 미량 성분들이 세포의 성장에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 소태아 혈청 내의 미량 성분들은 분석이 매우 어려울 뿐 만 아니라, 생산 시기나 장소에 따라 그 성분이 달라 질 수 있으므로, 재현성 있는 시험 및 생산 공정을 확립하는데 상당한 곤란성을 야기한다. 또한, 소태아 혈청은 동물에서 채취되므로 광우병 등 동물의 질병이나 바이러스 등 다른 요인으로부터의 오염에 대한 위험성을 갖고 있을 뿐만 아니라, 세포 배양을 통한 생산물을 이용하고자 할 때, 혈청 성분들을 정제가 어려워 공정이 복잡해지는 경우가 많다.

따라서, 소태아 혈청과 같은 이종 유래의 혈청이 없는 즉, 무혈청 배지 중에서 인간 유래의 피부줄기세포를 안정적으로 증식 및 배양할 수 있는 방법을 개발하는 것이 당업계에 요구되고 있다.

본 발명자들은 국화과(Compositae) 식물인 털 진득찰 또는 진득찰의 전초인 "희렴"으로부터 다양한 디테르펜 유도체를 분리한 바 있다(조예경, 성상현, 희렴의 화학 성분(Chemical Constituents of Sigesbeckia pubescens Herb), 석사학위논문, 서울대학교 대학원 약학과, Feb. 2009). 희렴은 40-100cm 높이로 자라는 한해살이 풀로 야산이나 들에서 흔히 볼 수 있으며, 전체에 짧은 털이 빽빽하게 나며, 끝이 뾰족하고 가장자리에 톱니가 있는 잎이 줄기에 마주 난다. 8-9월에 가지나 줄기 끝에 노란 꽃이 산방 꽃차례로 달리며, 열매를 둘러싸는 5개의 주걱 모양의 총포조각의 겉에 나있는 털에는 끈적거리는 액체가 묻어 있어서 다른 물체에 잘 달라 붙는다. 예로부터 한방에서 풍습(風濕)을 제거(除去)하고, 근육과 뼈를 튼튼히 하며, 혈압을 낮추는 효능이 있어 사지마비(四肢麻痺), 고혈압 (高血壓), 류마티스 등의 치료에 사용되고 있다.

본 발명자들은 천연물 유래의 다양한 화합물들을 대상으로 피부의 상피 줄기세포 즉, 피부줄기세포를 무혈청 조건에서 증식 및 배양할 수 있는 물질들을 검색하였다. 그 결과, 놀랍게도 희렴으로부터 추출된 다양한 디테르펜 유도체 중 카우란(kauran) 골격을 갖는 특정 디테르펜 유도체를 함유하는 무혈청 배지 중에서 피부줄기세포가 효과적으로 증식된다는 것을 발견하였다. 또한, 상기와 같이 배양된 피부줄기세포는 다양한 성장인자를 분비하도록 활성됨으로써, 상기 배양물 및 그의 분획물이 우수한 피부주름 활성 및 발모 촉진 활성을 나타낸다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 상기 디테르펜 유도체를 포함하는 무혈청(serum-free) 배지 중에서 피부줄기세포를 배양하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 배양방법으로 얻어진 배양물 또는 그의 분획물을 포함하는 피부주름 개선 및/또는 탈모방지 또는 발모 촉진용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 하기 화학식 3 내지 9로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 화합물을 포함하는 무혈청(serum-free) 배지 중에서 피부줄기세포를 배양하는 것을 포함하는, 피부줄기세포의 배양방법이 제공된다.

본 발명의 배양방법에 있어서, 상기 무혈청 배지는 바람직하게는 화학식 6의 화합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 화합물의 농도는 1 ∼ 500 μM의 범위일 수 있다.

본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 배양방법으로 피부줄기세포를 배양하여 얻어진 배양물 또는 그의 분획물을 포함하는, 주름개선용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또다른 태양에 따라, 상기 배양방법으로 피부줄기세포를 배양하여 얻어진 배양물 또는 그의 분획물을 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물이 제공된다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 배양물은 상기 피부줄기세포의 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액; 상기 상층액의 농축물; 또는 상기 상층액의 동결건조물일 수 있다. 또한, 상기 분획물은 상기 피부줄기세포의 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액을 3 ∼ 200 kDa 단백질을 포함하도록 분획하여 얻어진 분획; 상기 분획의 농축물; 또는 상기 분획의 동결건조물일 수 있다.

본 발명에 의해, 희렴으로부터 유래된 카우란(kauran) 골격을 갖는 특정 디테르펜 유도체 즉, 화학식 3 내지 9의 화합물를 함유하는 무혈청 배지 중에서 피부줄기세포가 효과적으로 증식될 뿐만 아니라, 다양한 성장인자를 분비함으로써 우수한 피부주름 활성 및 발모 촉진 활성을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에 따른 배양방법은 소태아혈청과 같은 이종 유래의 혈청의 사용으로 인한 오염가능성을 최소화할 수 있으며, 또한, 상기 배양방법으로 얻어진 배양물(및 그의 분획물)은 피부주름 개선 및/또는 탈모방지 또는 발모 촉진용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따라 무혈청 배지 중에서 배양된 피부줄기세포의 특성을, 양성 지표로서 인테그린 α6 (횡축)와 음성지표로서 CD71(종축)를 이중 지표로 하여, 유세포 분리기(FACS)를 사용하여 평가한 결과이다.
도 2는 화학식 1의 화합물을 인간 피부줄기세포에 처리하였을 때, 사이토카인의 발현 정도를 RayBio^® Human Growth factor Antibody Array Ⅰ을 이용하여 측정한 결과이다. 도 2에서 왼쪽은 DMSO 처리군, 오른쪽은 화학식 1의 화합물 처리군이다. (1) AR, (2) FGF-4, (3) GM-CSF, (4) IGFBP-2, (5) IGFBP-6, (6) IGFBP-SR, (7) IGF-2, (8) PDGFAA, (9) VEGF
도 3은 피부 섬유아세포의 이주능 측정을 통하여 주름개선 활성을 평가한 결과이다. 왼쪽은 대조군으로서 무혈청 배지를 처리하였을 때의 결과이고, 오른쪽은 본 발명의 배양방법에 따라 얻어진 피부줄기세포의 배양액을 처리하였을 때의 결과이다.
도 4는 피부 섬유아세포의 콜라겐 유형1의 발현 측정을 통하여 주름개선 활성을 평가한 결과이다. 왼쪽은 본 발명의 배양방법에 따라 얻어진 피부줄기세포의 배양액을 처리하였을 때 피부 섬유아세포의 콜라겐 유형 1의 단백질 발현을 웨스턴 블롯팅 분석을 통하여 측정한 결과이고, 오른쪽은 상기 분석 결과를 수치화한 것이다.
도 5는 인간 두피의 모발 조직을 Williams' E media 배지 중에서(대조군) 또는 본 발명의 배양방법에 따라 배양된 피부줄기세포의 배양액으로부터 얻어진 분획물을 첨가한 Williams' E media 배지 중에서 각각 배양한 후, 세포 유사분열과 관련된 핵 내 단백질인 ki67의 발현 양상을 면역 조직 화학법(immunocytochemistry)을 통하여 측정한 결과이다.

본 명세서에서 "피부줄기세포(epidermal skin stem cells)"라 함은 인간에서 유래된 피부 내 줄기세포를 모두 포함한다. 상기 인간 유래 피부 줄기세포는 외배엽 및 중배엽으로부터 유래된 표피 층 및 진피 층의 전능 세포를 포함한다. 인간 피부줄기세포(Human epidermal stem cell)는 Millipore 사(Bedford, MA, USA)로부터 상업적으로 구입할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 CNT-57 배지(Millipore 사) 중에서 배양될 수 있다. 배양된 피부줄기세포는 또한 통상의 방법에 따라 트립신-EDTA(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 등으로 효소처리하고, 얻어진 세포 부유액을 원심분리함으로써, 분리할 수 있다.

본 발명은 하기 화학식 3 내지 9로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 화합물을 포함하는 무혈청(serum-free) 배지 중에서 피부줄기세포를 배양하는 것을 포함하는, 피부줄기세포의 배양방법을 제공한다:

<화학식 3>

<화학식 4>

<화학식 5>

<화학식 6>

<화학식 7>

<화학식 8>

<화학식 9>

본 발명에 의해, 희렴으로부터 유래된 카우란(kauran) 골격을 갖는 특정 디테르펜 유도체 즉, 화학식 3 내지 9의 화합물를 함유하는 무혈청 배지 중에서 피부줄기세포가 효과적으로(약 1.5∼3.5배) 증식된다는 것이 밝혀졌다. 특히, 본 발명에 따른 배양방법은 소태아 혈청과 같은 동물 유래의 혈청의 사용을 근본적으로 배제할 수 있으며, 따라서 얻어지는 피부줄기세포는 이종 물질에 의한 감염을 배제하면서, 질병의 치료 혹은 미용목적의 시술에 유용하게 사용할 수 있다.

상기 화학식 3 내지 9의 화합물 중 특히 바람직한 화합물은 화학식 6의 화합물이다. 상기 화학식 3 내지 9의 화합물은 공지의 물질로서, 희렴으로부터 공지의 방법에 따라 분리할 수 있다. 즉, 본 발명자들이 보고한 방법(조예경, 성상현, 희렴의 성분 연구(Chemical Constituents of Sigesbeckia pubescens Herb), 석사학위논문, 서울대학교 대학원 약학과, Feb. 2009) 또는 Jiang X, Yunbao M and Yunlong X (1992) Diterpenoids from Siegesbeckia pubescens. Phytochemistry 3 917-921 등 에 개시된 방법에 따라 화학식 1 내지 9의 화합물을 얻을 수 있다.

본 발명의 배양방법에 있어서, 상기 무혈청 배지 중, 상기 화학식 3 내지 9의 화합물의 농도는 1 ∼ 500 μM, 더욱 바람직하게는 5 ∼ 500 μM, 더더욱 바람직하게는 10 ∼ 50 μM의 범위일 수 있다. 상기 무혈청 배지는 혈청을 포함하지 않는 통상의 세포배양용 배지일 수 있으며, 예를 들어, CNT-57 배지(Millipore 사), 피부각질세포 성장 배지(Promocell 사, C-20211) 등일 수 있다. 또한, 필요에 따라, CaCl₂ 등의 미량원소를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 배양방법으로 피부줄기세포를 배양하여 얻어진 배양물 또는 그의 분획물을 포함하는, 주름개선용 및/또는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명에 의해, 희렴으로부터 유래된 카우란(kauran) 골격을 갖는 특정 디테르펜 유도체 즉, 화학식 3 내지 9의 화합물을 함유하는 무혈청 배지 중에서 피부줄기세포가 효과적으로 증식될 뿐만 아니라, 다양한 성장인자를 분비하도록 활성화됨으로써 우수한 피부주름 활성 및 발모 촉진 활성을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 즉, 본 발명의 배양방법에 따라 피부줄기세포를 무혈청 조건에서 배양할 경우, 피부졸기세포로부터 다양한 성장인자 분비를 현저하게 증가시킬 수 있으며, 이에 따라 피부 섬유아세포의 이주능 및 콜라겐 유형 1의 발현이 증가되고, 또한 모낭세포에서 세포의 유사분혈과 관련된 단백질인 Ki 67의 발현이 증가된다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에 따른 배양방법으로 얻어진 배양물(및 그의 분획물)은 피부주름 개선 및/또는 탈모방지 또는 발모 촉진용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 배양물은 상기 피부줄기세포의 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액; 상기 상층액의 농축물; 또는 상기 상층액의 동결건조물일 수 있다. 또한, 상기 분획물은 상기 피부줄기세포의 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액을 3 kDa 이상, 바람직하게는 3 ∼ 200 kDa 단백질을 포함하도록 분획하여 얻어진 분획; 상기 분획의 농축물; 또는 상기 분획의 동결건조물일 수 있다.

상기 원심분리는 줄기세포, 거대 분자, 배지 성분들을 침강시켜 제거할 수 있는 조건, 예를 들어, 300 ∼ 600 g로 5 ∼ 10 분 동안, 바람직하게는 약 300 g로 약 5 분 동안 수행될 수 있다. 필요에 따라, 약 0.22㎛ 실린지 필터로 여과하여 잔여 줄기세포와 미지의 거대분자들을 제거할 수도 있다. 또한, 상기 농축물은 상기 배양액 또는 분획을 감압농축 등의 통상의 방법으로 원하는 단백질 농도가 얻어질 때까지 농축함으로써 얻을 수 있다. 또한 상기 분획은 특정 포어 사이즈를 갖는 통상의 멤브레인을 사용하여 수행할 수 있으며, 예를 들어 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액을 200 kDa의 포어 사이즈를 갖는 멤브레인으로 통과시킨 후, 막을 통과한 분획물을 다시 3kDa의 포어 사이즈를 갖는 멤브레인으로 통과시킴으로써 수행될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학 조성물 및/또는 화장료 조성물 형태로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 상기 배양방법으로 피부줄기세포를 배양하여 얻어진 배양물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 주름개선용 약학 조성물 및/또는 탈모방지 또는 발모촉진용 약학 조성물 형태일 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 상기 배양방법으로 피부줄기세포를 배양하여 얻어진 배양물 또는 그의 분획물을 포함하는, 주름개선용 화장료 조성물 및/또는 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물 형태일 수 있다.

상기 약학 조성물에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 액제, 현탁액, 에멀젼, 로오숀제, 연고제, 동결건조제 등의 비경구용 제형으로 제제화될 수 있다. 바람직하게는 외용액제, 에멀젼, 연고제 등의 경피투여용 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline), 정제수, 멸균수 등의 수성 희석제 혹은 용제를 포함하며, 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일등의 비수성 희석제 혹은 용제를 포함한다. 또한, 필요에 따라 습윤제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 상기 약학 조성물에 함유되는 상기 배양물 또는 그의 분획물은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 배양물 또는 그의 분획물은 1일 0.01 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.1 내지 10 mg/kg의 용량, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 5 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다.

상기 화장료 조성물에 있어서, 상기 조성물은 상기한 배양물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물 형태일 수 있다. 상기 화장료 조성물은 상기 배양물 또는 그의 분획물을 사용하여 통상의 화장료 제조방법에 따라, 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물은 상기 배양물 또는 그의 분획물을 함유하는 향장 제품, 샴푸, 헤어로션, 헤어크림, 헤어 젤 등의 형태로 제조될 수 있으며, 이는 통상의 클렌징액, 수렴액 및 보습액으로 희석하여 사용될 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물은 화장료 조성물 분야에서 통상적으로 사용되는 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물에 있어서, 상기 배양물 또는 그의 분획물의 함량(또는 예를 들어, 상기 약학 조성물의 투여량에 해당하는 배양물 또는 그의 분획물)은 주름개선용 및/또는 탈모방지 또는 발모촉진 효과를 달성하기에 유효한 양, 예를 들면 조성물 총 중량에 대하여 0.001 ∼ 10 중량%의 함량으로 함유될 수 있고, 바람직하게는 약 0.01 ∼ 1 중량%의 함량으로 함유될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 피부줄기세포의 배양

(1) 혈청(소태아혈청) 함유 배지 중에서의 피부줄기세포의 배양

인간 피부줄기세포(Human epidermal stem cell)는 Millipore (Millipore, Bedford, MA, USA)로부터 구입하였다. 48 웰 플레이트(well plate)에 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)이 첨가된 CNT-57 배지(Millipore 사)를 각각 넣고, 인간 피부줄기세포 5 X 10³를 접종하여, 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃ 조건에서 배양하여 세포를 배양 접시에 부착시킨 후, 5％ CO₂ 및 37℃ 조건에서 72 시간 동안 배양하였다.

(2) 무혈청 배지 중에서의 피부줄기세포의 배양

48 웰 플레이트(well plate)에 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)이 첨가된 CNT-57 배지(Millipore 사)를 각각 넣고, 인간 피부줄기세포(Millipore, Bedford, MA, USA) 5 X 10³를 접종하여, 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃ 조건에서 배양하여 세포를 배양 접시에 부착시켰다. 배양 완료 후, 배양액을 흡입관을 통하여 제거한 다음, 인산완충용액을 이용하여 배지성분을 제거하고, 소태아혈청이 포함 되지 않은 CNT-57 배지(Millipore 사)를 가한 다음, 카우란 계열의 화합물들(화학식 1 내지 9의 화합물, 하기 표 1 참조) 10μM를 각각 처리하였다. 상기 처리 후, 5％ CO₂ 및 37℃ 조건에서 72 시간 동안 배양하였다.

카우란 계열의 화합물


화합물	R₁	R₂	R₃	R₄
1	CH₃	COOCH₃	CH₂OH	H
2	CH₃	COOH	H
3	CH₃	COOH	CH₂OH	H
4	CH₃	COOCH₃	CH₂OH	OH
5	CH₂OH	COOH	H
6	CH₃	COOH	CH₂OH	OH
7	CH₂OH	COOH	H	CH₂OH
8		COOH	H	CH₂COOCH₃
9	CH₂OH	COOCH₃	OH	CH₂OH

실시예 2. 혈청 함유 배지 또는 무혈청 배지 중에서 배양된 피부줄기세포의 평가

실시예 1의 (2)에서 얻어진 피부줄기세포의 특성을 유세포 분리기(FACS)를 이용하여 평가하였다. 양성 지표로서 인테그린 α6와 음성지표로서 CD71를 이중 지표로 이용하였다. 그 결과는 도 1과 같다. 도 1은 대표적인 카우란 계열의 화합물로서 화학식 6의 화합물 처리하였을 때, 얻어진 피부줄기세포의 특성을 평가한 결과이다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 무혈청 배지에 카우란 화합물을 처리하여 얻어진 피부줄기세포는 줄기세포로의 특성을 그대로 유지하였다.

실시예 3. MTT 분석을 통한 피부줄기세포 증식 촉진 활성 평가

실시예 1의 (2)에서 얻어진 피부줄기세포를 소태아 혈청이 포함되지 않은 CNT-57 배지로 1회 세척한 다음, MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)분석을 수행하였다. MTT 분석은 테트라졸륨환(tetrazolium ring)을 포함하는 기질(substrate)이 미토콘드리아 탈수소효소에 의해 청색의 포르마잔(formazan)으로 변환되는 것에 기초한 분석방법이다. 청색 포르마잔의 수준을 분광학적으로 측정한 후 이를 세포밀도의 간접적인 지표로 사용하였으며, 세포들을 37℃에서 MTT (1 mg/㎖)에 3 시간 동안 노출시킨 후, 파장 450 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 분광학적으로 측정하였다. 각 화합물이 피부줄기세포의 증식에 미치는 영향은 측정된 흡광도 값으로부터 하기 식에 따라 세포수(relative cell number, %)을 구하였다. 하기 식에서 대조군은 화합물의 첨가 없이 소태아 혈청이 포함되지 않은 CNT-57 배지 중에서 피부줄기세포를 배양한 군을 나타낸다.

* 세포수(%) = (시료처리군의 흡광도 / 대조군의 흡광도) * 100

상기 세포수 측정 결과는 하기 표 2와 같다.

화합물	Relative cell number (%)
대조군	100.0 ± 24.8
1	0.0 ± 0.0
2	87.0 ± 29.6
3	138.2 ± 13.0
4	186.9 ± 14.0
5	192.9 ± 14.0
6	355.4 ± 13.2
7	210.1 ± 12.0
8	309.5 ± 7.5
9	152.7 ± 29.8

상기 표 2의 결과로부터, 화학식 3 내지 9의 카우란 유도체가 우수한 피부줄기세포의 증식 촉진 활성을 나타냄을 알 수 있으며, 이 중 화학식 6의 화합물이 가장 우수한 피부줄기세포의 증식 촉진 활성을 나타냄을 알 수 있다.

실시예 4. 인간 피부줄기세포의 사이토카인 발현 프로파일 측정

무혈청 배지 중에서 화학식 6의 화합물 존재하에서의 인간 피부줄기세포의 배양에 따른, 사이토카인 발현 프로파일을 측정하였다.

100mm 플레이트에 10% 혈청이 첨가된 CNT-57 배지(Millipore 사)를 각각 넣고, 인간 피부줄기세포 1.2 X 10⁶를 접종하여, 24시간 동안 5% CO₂및 37℃ 조건에서 배양하여 세포를 배양 접시에 부착시켰다. 각각의 플레이트를 혈청을 첨가하지 않은 배양액(즉, CNT-57 배지)으로 2회 세척한 다음, DMSO를 포함하는 무혈청 조건(DMSO 처리군) 및 화학식 6의 화합물 44 μM를 포함하는 무혈청 조건(화합물 처리군)으로 각각 나누었다. DMSO 처리군은 DMSO 16 ㎕을 처리하였고, 화합물 처리군은 화학식 6의 화합물을 DMSO에 44 μM의 농도로 용해시켜 16 ㎕을 처리하였다. 상기 처리 후, 5％ CO₂ 및 37℃ 조건에서 72 시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후, 배양 상등액을 RayBio^® Human Growth factor Antibody Array Ⅰ(RayBiotech Inc, Norcross, GA, USA)를 사용하여 제조자 지시 프로토콜에 따라 사이토카인 분석을 수행하였으며, 그 결과는 도 2와 같다.

도 2에 나타난 바와 같이, 화학식 6의 화합물 존재하에서 인간 피부줄기세포를 배양한 경우, 사이토카인 (1) AR, (2) FGF-4, (3) GM-CSF, (4) IGFBP-2, (5) IGFBP-6, (6) IGFBP-SR, (7) IGF-2, (8) PDGFAA, (9) VEGF의 생성량이 현저히 증가하였다. 구체적인 사이토카인 증가량은 하기 표 3과 같다.

사이토카인	발현 증가율^*
AR	1.596±0.0909
FGF-4	1.614±0.0045
GM-CSF	1.943± 0.047
IGFBP-2	1.640±0.079
IGFBP-6	1.47±0.0386
IGFBP-SR	3.31±0.00029
IGF-2	1.595±0.0469
PDGFAA	1.718± 0.089
VEGF	2.47±0.033

* 증가율: 미처리 대조군의 사이토카인 발현을 1로 하였을 때에 대한 비율

실시예 5. 피부 줄기세포 배양물의 활성 평가

(1-1) 피부 줄기세포의 배양

실시예 1의 (2)와 동일하게 무혈청 배지 중에서의 피부줄기세포의 배양한 후, 배양액으로부터 피부줄기세포 배양물을 조제하였다. 즉, 100mm 플레이트에 10% 혈청이 첨가된 CNT-57 배지(Millipore 사)를 각각 넣고, 인간 피부줄기세포 1.2 X 10⁶를 접종하여, 24시간 동안 5% CO₂및 37℃ 조건에서 배양하여 세포를 배양 접시에 부착시켰다. 각각의 플레이트를 무혈청 배양액(즉, CNT-57 배지)으로 2회 세척한 다음, 다시 CNT-57 배지를 가하고, 화학식 6의 화합물을 44 μM로 각각 처리한 후, 5％ CO₂ 및 37℃ 조건에서 72 시간 동안 배양하였다.

(1-2) 피부 줄기세포의 배양액으로부터 배양물 및 분획물의 조제

(1-1)에서 얻어진 배양액 500 ml을 300 g로 5 분간 원심분리하여 펠렛으로 가라앉는 줄기세포를 제거하였다. 얻어진 상층액을 0.22㎛ 실린지 필터로 여과하여 잔여 줄기세포 및 미지의 거대분자를 제거하였다. 얻어진 액을 반으로 나누어 감압 농축하여 5 ml의 농축액을 얻었다. 얻어진 농축액은 동결건조하여 -70 ℃에서 보관하였다.

잔여 줄기세포 및 미지의 거대분자가 제거된 나머지 액을 3 kDa의 포어 사이즈를 갖는 멤브레인을 통과시켜고, 멤브레인을 통과하지 못한 여과물에 인산 완충 식염수로 3회 세척하여 200 kDa 이상의 거대 분자 분획과 200 kDa 이하의 분획으로 분리한 다음, 200 kDa 이하의 용액과 세척한 인산 완충 식염수를 포함한 용액을 다시 3 kDa의 포어 사이즈를 갖는 멤브레인을 통과시켜 상층의 농축된 분획을 -70℃에서 보관하였다

(2) 주름개선활성 평가 - 피부 섬유아세포의 이주능 평가

6웰 플레이트(well plate)에 10% 혈청이 첨가된 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium 배지, Gibco 사)를 가한 후, 인간 피부 섬유아세포(Human dermal fibroblast cells)인 HS27 (Diagnostic HYBRIDS 사) 1ⅹ10⁶ cells를 접종하여 5％ CO₂ 및 37℃ 하에서 24시간 동안 배양하여 피부 섬유아세포를 부착시켰다. 무혈청 배양액(즉, DMEM 배지)으로 2회 세척한 다음, 마이크로 팁(micro tip)을 이용하여 세포에 상처를 만들고, 2군으로 나누었다. 제1군(대조군)은 무혈청 배지(즉, DMEM 배지)을 가하고, 제2군은 상기 (1-1)에서 얻어진 배양액을 각각 5 ml 씩 가하여, 20시간 동안 배양하였다. 그 결과는 도 3과 같다. 도 3의 결과로부터, 무혈청 배지 중에서 배양한 경우에 비하여, 피부줄기세포 배양액이 첨가된 조건에서 약 1.5배 이상 인간 피부 섬유아세포의 이주능이 증가하였음을 알 수 있다.

(3) 주름개선활성 평가 - 피부 섬유아세포의 콜라겐 유형1의 발현 평가

6웰 플레이트(well plate)에 10% 혈청이 첨가된 DMEM 배지를 가한 후, 인간 피부 섬유아세포 HS27 (Diagnostic HYBRIDS 사) 1.5ⅹ10⁶ cells를 접종하여 5％ CO₂ 및 37℃ 하에서 24시간 동안 배양하여 피부 섬유아세포를 부착시켰다. 무혈청 배양액(즉, DMEM)으로 2회 세척한 다음, 2군으로 나누었다. 제1군(대조군)은 무혈청 배지(즉, DMEM 배지)를 가하고, 제2군은 상기 (1-1)에서 얻어진 배양액을 각각 5 ml 씩 가하여, 72 시간 동안 배양하였다. 각각의 배양액으로부터 얻어진 세포를 RIPA 완충용액(50 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 % 트리톤 X-100, 1 % SDS, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 5 mM 디티오쓰레이톨(dithiothreitol), 1 ㎍/㎖ 류펩틴(leupeptin) 및 20 ㎍/㎖ PMSF, pH 7.4)을 이용하여 분해하여 단백질을 얻었다. 30μg의 단백질을 10 % SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 이용하여 분리하였다. 단백질이 분리된 겔을 PVDF막에 전이시켰다. PVDF막을 항-콜라겐 유형1(1:1000배 희석) 항체, β-actin 항체(1:10,000배 희석)로 배양한 후, HRP(horseradish peroxidase)-컨쥬게이티드(conjugated) anti-goat IgG 항체(1:10,000 희석)로 다시 배양하였다. 획득한 밴드를 immunobilon western reagent(Millipore 사)로 X-ray 필름에 노출시켰으며, 그 결과는 도 4와 같다. 도 4의 결과로부터, 무혈청 배지 중에서 배양한 경우에 비하여, 피부줄기세포 배양액이 첨가된 조건에서 콜라겐 유형1의 발현 정도가 2배 이상 증가하였음을 알 수 있다.

(4) 발모 촉진 활성 평가

24 웰 플레이트에 Williams' E media 배지(Sigma 사)을 가하고, 건강한 지원자로부터 채취한 모낭을 배양하여 인간 두피의 모낭 조직을 얻었다. 얻어진 모낭 조직을 Williams' E media 배지 중에서(대조군) 또는 상기 (1-2)에서 얻어진 3 kDa에서 200 kDa의 농축된 분획 1%를 포함하는 Williams' E media 배지 중에서 각각 48시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 대조군(control) 및 본 발명에 따른 분획물(KSC-CM)을 처리한 모낭조직으로부터, 세포 유사분열과 관련된 핵 내 단백질인 ki67의 발현 양상을 면역 조직 화학법(immunocytochemistry)으로 분석하였다. 상기 분석은 항-ki67 항체(ABcam사)를 채취한 모낭조직에 1차적으로 결합시킨 후, 2차로 GFP(green fluorescence protein)으로 표지하여 형광 현미경으로 관찰하였으며, 분석 결과는 도 5와 같다. 도 5의 결과로부터, 대조군에 비해서 본 발명에 따른 분획물(KSC-CM)을 처리한 모낭조직이, 세포 유사분열과 관련된 핵 내 단백질인 ki67의 발현을 현저하게 증가시켰음을 알 수 있다. 따라서, 상기 분획물은 모발 길이 성장의 필수적인 기질부위 상피의 세포분열을 촉진시킴으로써, 발모 촉진 활성을 나타냄을 알 수 있다.

Claims

하기 화학식 3 내지 9로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 화합물을 포함하는 무혈청(serum-free) 배지 중에서 피부줄기세포를 배양하는 것을 포함하는, 피부줄기세포의 배양방법:
<화학식 3>

<화학식 4>

<화학식 5>

<화학식 6>

<화학식 7>

<화학식 8>

<화학식 9>
제1항에 있어서, 상기 무혈청 배지가 화학식 6의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 피부줄기세포의 배양방법.
제1항에 있어서, 상기 화합물의 농도가 1 ∼ 500 μM의 범위인 것을 특징으로 하는, 피부줄기세포의 배양방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 배양방법으로 피부줄기세포를 배양하여 얻어진 배양물을 포함하는, 주름개선용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 배양물이 상기 피부줄기세포의 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액; 상기 상층액의 농축물; 또는 상기 상층액의 동결건조물인 것을 특징으로 하는 조성물.
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제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 배양방법으로 피부줄기세포를 배양하여 얻어진 배양액의 분획물을 포함하는, 주름개선용 조성물.
제10항에 있어서, 상기 분획물이 상기 피부줄기세포의 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액을 3 ∼ 200 kDa 단백질을 포함하도록 분획하여 얻어진 분획; 상기 분획의 농축물; 또는 상기 분획의 동결건조물인 것을 특징으로 하는 조성물.