KR20120027440A - 천연추출물 또는 이로부터 단리된 화합물을 포함하는 동물세포 배양용 무혈청 배지 및 피부개선조성물 - Google Patents

천연추출물 또는 이로부터 단리된 화합물을 포함하는 동물세포 배양용 무혈청 배지 및 피부개선조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 동물세포의 배양을 위한 무혈청 배지에 관한 것으로, 보다 상세하게는 전통적으로 생체외 동물세포 배양에 사용되어 온 기본 배지들에 엉겅퀴 속 식물의 추출물, 오가피 속 식물의 추출물, 스티그마스테롤 및 엔-아세틸갈락토사민으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 물질을 첨가하여 동물세포, 특히 줄기세포를 종래의 혈청 함유 배지보다 우수한 세포 성장율로 배양할 수 있는 동물세포 배양용 무혈청 배지에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 동물세포 배양용 무혈청 배지에 첨가된 천연추출물 또는 이로부터 단리된 화합물, 및 상기 배지에서 동물세포를 배양한 후의 배양액의 피부 상태 개선 용도에 관한 것이다.

Description

천연추출물 또는 이로부터 단리된 화합물을 포함하는 동물세포 배양용 무혈청 배지 및 피부개선조성물{Serum-free medium for animal cell culture comprising natural extracts or compounds isolated from them}
본 발명은 동물세포의 배양을 위한 무혈청 배지에 관한 것으로, 보다 상세하게는 전통적으로 생체외 동물세포 배양에 사용되어 온 기본 배지들에 천연추출물 또는 이로부터 단리된 화합물을 첨가하여 동물세포, 특히 줄기세포를 종래의 혈청 함유 배지보다 우수한 세포 성장율로 배양할 수 있는 동물세포 배양용 무혈청 배지에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 동물세포 배양용 무혈청 배지에 첨가된 천연추출물 또는 이로부터 단리된 화합물의 피부 상태 개선 용도에 관한 것이다.
생물의약품의 여러 생산기술 가운데 하나인 동물세포 산업화 기술은 유전자가 조작된 인간 및 동물세포를 대량으로 배양하여 고부가가치의 생물의약품을 생산하는 기술로 각광받고 있으며, 최근 유전자 치료(gene therapy) 및 세포 치료(cell therapy) 기법의 개발로 인해 산업화 기술로서의 중요성이 더욱 강조되고 있다. 일반적으로 동물세포 유래 의약품 생산 공정 개발은 생산 제품의 안전성 확보와 세포 생산성에 의한 높은 생산비의 절감 등에 역점을 두고 있다. 현재까지 사용되고 있는 동물세포 배양법은 성장을 위하여 반드시 세포배양배지에 혈청을 공급해 주어야 한다. 현재 가장 널리 사용되는 혈청으로 FBS(Fetal Bovine Serum) 나 FCS(Fetal Calf Serum)이 있다. 이들 첨가 성분의 기능은 명확하진 않지만 성장 증진 작용, 영양분의 공급, 산화나 독소로부터 세포를 보호하는 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 이들 성분이 배제된 경우에는 세포배양 자체가 거의 안 되는 필수 성분이다. 그러나 고가의 혈청은 배지가격을 상승시키고 또한 그 복잡한 성분으로 인해 재조합 단백질의 정제를 어렵게 할 뿐 아니라, 생산되는 과정마다 성분 차이가 있어서 실험을 할 때마다 다른 결과를 초래할 우려가 있다. 또한, 혈청은 동물 유래이기 때문에 배양과정 중에 세포들이 바이러스나 감염성 프리온 등에 오염될 가능성이 상존한다. 소혈청에 감염된 프리온은 사람에게 그대로 전이될 수 있으므로 동물세포 배양은 여러 가지 안전장치를 하고 있음에도 여전히 감염가능성은 존재한다고 해야 할 것이다. 통상 혈청 사용시 다음과 같은 문제점을 수반한다: ⅰ) 혈청의 조성 변이 때문에 세포에 대한 성장촉진 능력에 있어서 변이가 크다; ⅱ) 인간에게 사용될 세포 생산물의 제조 시, 혈청이 감염물질에 의한 오염 잠재성을 가지고 있다; ⅲ) 상업적으로 제조된 FBS나 FCS에서 박테리오파아지(bacteriophage)와 보바인 바이러스(bovine virus)가 검출된다; ⅳ) 박테리아 오염 때문에 생긴 각종 독소(toxin)로 인해 세포배양 억제 물질도 함유된다; ⅴ) 여과(filteration) 전에는 오염으로 인한 세균성 독소(bacterial toxin)가 존재한다; ⅵ) 세포배양에 있어 생물학적 오염원(mycoplasmas, bacteriophages, viruses)이 되기도 한다; ⅶ) 감마-글로불린 분획에 배양액과 교차반응(cross reaction)하는 항체 및 세균이 분비한 독소를 함유한다; ⅷ) 열 불활성화(heat inactivation)는 면역글로불린의 세포독성(cytotoxin) 작용을 감소시키지만 불안정한 구성물질까지 파괴되어 열처리하지 않은 혈청보다 만족한 결과가 항상 나타나는 것은 아니다; ⅸ) 혈청 단백질의 흡착/결합에 의한 세포표면의 변형이 유도된다; ⅹ) 세포생산물의 분리 시 방해의 원인이 된다; xi) 1차 배양시에 섬유아세포의 과도한 성장이 조장된다.
1950년대에 합성배지로 자연배지를 부분적으로 대체할 수 있다고 보고된 이후로 혈청없이 세포배양을 하려는 시도를 하게 되었고, 현재는 특정목적을 위하여 일부의 경우에 혈청없이 세포배양을 하고 있다. 그러나 이들 무혈청 배지는 특정세포만 잘 자라게 하고, 혈청 대신에 사용하는 단백질성 세포성장인자 등이 너무 고가인데다 혈청을 포함한 배지에서보다 성장 및 산물생산이 안정적이지 못하다고 보고되고 있다. 또한 무혈청배지는 줄기세포의 배양에는 적용이 불가능한 것으로 알려져 있다. 줄기세포를 상업적으로 이용한 분야에서 가장 중요한 분야가 세포치료제로써 인체에서 얻어진 줄기세포를 시험관에서 배양한 후 다시 환자에게 투입하는 방식의 치료기술이다. 이러한 분야에서는 반드시 줄기세포 배양과정을 거치게 되는데 가능한 한 동물성 배지나 혈청을 피하는 것이 중요하다. 질병 치료 목적으로 줄기세포 이식하는 경우 얻는 치료 이득을 고려할 때 이에 따르는 감염 위험은 감수될 수 있으나, 미용목적의 시술인 경우에는 줄기세포 등의 이식으로 얻어지는 이득보다 감염위험에 노출되는 위험이 더 크게 부각될 수 있다. 따라서 줄기세포 배양분야에서 동물성 혈청대체제를 찾는 일은 상업적으로 매우 의미가 있다고 할 것이다.
한편, 피부에서 줄기세포가 자리하고 있는 곳은 크게 다음과 같다. 첫째는 모낭과 모낭 사이의 표피(interfollicular epidermis)라고 불리우는 표피의 기저층(the basal cell layer of epidermis)에 존재한다. 둘째는 모낭(hair follicle)이다. 모낭은 세포분화가 일어나기 전의 세포로 표피의 재생과 관련해 가장 중요한 역할을 담당하고 있는 세포가 존재한다. 셋째는 피하지방층에 존재하는 지방유래 줄기세포이다. 이처럼 피부에 존재는 줄기세포는 피부의 건강과 직결된 전체적인 역할을 담당하고 있어 피부건강과 관련하여 가장 중요한 세포군이라 할 수 있다.
줄기세포들은 살아있는 동안 끊임없는 세포분열을 통해 증식과 여러 가지 세포 활성화물질을 분비하여 주위 세포들을 활성화시킴으로써 유해한 환경에 따른 세포들의 노화를 억제하고 문제가 있는 부위를 재생하거나 복구한다고 알려져 있다. 그러나 줄기세포 역시 세포군이기 때문에 나이에 따라 점차 그 기능을 서서히 소실하게 된다. 즉 피부의 줄기세포도 노화에 따라 그 활성이 점차 감소하기 때문에 세포분열능력이 떨어지고 점차 비활성화됨으로써 노화에 따른 주름, 검버섯, 더딘 상처치유, 더딘 복구 등의 여러 문제들이 발생하게 된다. 따라서 피부에 존재하는 줄기세포를 활성화시킬 수 있다면 줄기세포의 노화를 막고 활성을 다시 복원할 수 있을 것이다.
이에 본 발명자들은 피부 줄기세포의 활성화를 통하여 피부 세포의 기능 감소 및 상실에 따른 여러 문제들을 예방하고 개선하기 위하여 먼저 동물성 혈청을 대신하여 무혈청 배지에서도 줄기세포의 증식을 촉진할 수 있는 물질을 식물성 소재로부터 찾고자 하였다. 그 결과 본 발명을 완성하게 되었으며, 또한 그 식물성 소재의 피부 줄기세포의 활성화 능력 및 그에 따른 다양한 피부 문제점을 해결할 수 있음을 발견하게 되었다.
따라서 본 발명의 하나의 목적은 동물 유래 혈청 성분을 대체하여 엉겅퀴 속 식물의 추출물, 오가피 속 식물의 추출물, 하기 화학식 1의 스티그마스테롤 및 하기 화학식 2의 엔-아세틸갈락토사민으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 물질을 포함하는 동물세포 배양용 무혈청 배지를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 엉겅퀴 속 식물의 추출물, 오가피 속 식물의 추출물, 하기 화학식 1의 스티그마스테롤, 하기 화학식 2의 엔-아세틸갈락토사민, 및 상기 동물세포 배양용 무혈청 배지에서 동물세포를 배양한 후 배양된 동물세포를 제거한 배양액으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 물질을 포함하는 피부상태 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
하나의 양태로써, 본 발명은 동물 유래 혈청 성분을 대체하여 엉겅퀴 속 식물의 추출물, 오가피 속 식물의 추출물, 하기 화학식 1의 스티그마스테롤 및 하기 화학식 2의 엔-아세틸갈락토사민으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 물질을 포함하는 동물세포 배양용 무혈청 배지를 제공한다.
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본 발명자들은 동물 유래 혈청을 대체하여 무혈청 배지에서도 동물세포, 특히 줄기세포 및 피부 세포 등의 증식 및 활성화를 촉진할 수 있는 물질을 식물 소재로부터 찾기 위하여 예의 노력하였다. 그 결과 엉겅퀴 속 식물 추출물, 오가피 속 식물 추출물, 상기 화학식 1의 스티그마스테롤 및 상기 화학식 2의 엔-아세틸갈락토사민이 동물 유래 혈청을 대체 가능할 정도로 동물세포의 증식 및 활성화를 촉진할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성한 것이다.
본 발명의 엉겅퀴(Cirsium) 속 식물은 국화과에 속하는 식물로서, 이의 예로는 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 가시엉겅퀴(Cirsium japonicum var. spinossimum), 엉겅퀴(Cirsium japonicum var. ussuriense), 좁은잎엉겅퀴(Cirsium japonicum for. nakaianum), 고려엉겅퀴(Cirsium rhinoceros var. niveoaraneum), 도깨비엉겅퀴(Cirsium schantarense) for. albiflorum), 동래엉겅퀴(Cirsium toraiense), 물엉겅퀴(Cirsium nipponicum), 바늘엉겅퀴(Cirsium rhinoceros), 버들잎엉겅퀴(Cirsium lineare), 서양가시엉겅퀴(Cirsium vulgare), 점봉산엉겅퀴(Cirsium zenii), 정영엉겅퀴(Cirsium chanroenicum var. lanceolata), 제주엉겅퀴(Cirsium chinense), 카나다엉겅퀴(Cirsium arvense), 큰엉겅퀴(Cirsium pendulum), 민흰잎엉겅퀴(Cirsium vlassovianum var. album), 흰꽃잎엉겅퀴(Cirsium vlassovianum for. leucanthum) 식물이 있다. 본 발명의 하나의 구체적 실시에서는 상기 엉겅퀴 속 식물 중에서 엉겅퀴(Cirsium japonicum var. ussuriense)이다.
본 발명의 오가피(Acanthopanax) 속 식물은 두릅나무과에 속하는 식물로서, 이의 예로는 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 가시오가피(Acanthopanax senticosus Harms(araliaceae)), 왕가시오가피(Acanthopanax Senticosus Var. Koreanus), 민가시오가피(Acanthopanax Senticosus Var. inermis), 단경오가피(Acanthopanax Sessmuorus), 지리산오가피(Acanthopanax Chilsanensis), 서울오가피(Acanthopanax Seoulensis), 털오가피(Acanthopanax Rufinerve), 섬오가피(Acanthopanax Koreanm), 당오가피(Acanthopanax Siebololianum) 식물이 있다. 본 발명의 하나의 구체적 실시에서 상기 오가피 속 식물 중 가시오가피(Acanthopanax senticosus Harms)이다.
본 발명에 있어서, 상기 엉겅퀴 속 식물 및 오가피 속 식물은 잎, 꽃, 종자, 줄기, 뿌리 및 전초를 원료로서 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 엉겅퀴 속 식물 추출물 및 오가피 속 식물 추출물은 이들 식물의 용매에 의한 추출물 또는 분획추출물, 그 추출물의 정제물, 그 추출물 또는 정제물의 농축 또는 건조된 형태 등 모두를 포함한다.
상기 엉겅퀴 속 식물 및 오가피 속 식물의 추출물 또는 분획추출물을 위한 용매는, 메탄올, 에탄올, 프로판올 등의 저급 알코올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 다가 알코올 및 물을 단독 혹은 2종 이상의 혼합물로서 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 엉겅퀴 속 식물 및 오가피 속 식물의 추출물 또는 분획추출물의 제조 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등을 사용할 수 있다.
상기 정제물은 추출물 또는 분획추출물로부터 부유하는 고체 입자를 제거하는 과정으로, 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러 내거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 크로마토그래피)에 의한 분리 과정을 추가로 포함할 수 있다.
상기 추출물, 분획추출물 또는 정제물은 액체 형태로 그대로 사용하거나 또는 이를 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 상기 농축 및/또는 건조 방법은, 이로써 제한되는 것은 아니나, 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등의 방법을 포함한다.
본 발명의 하나의 구체적 실시에서, 엉겅퀴 또는 오가피의 전초를 물 또는 저급 알코올을 이용하여 추출물을 제조하고, 이에 헥산, 클로로포름, 부탄올 등의 유기용매와 물을 사용하여 순차적으로 분획 추출한 분획추출물을 제조하였다. 또한, 그 분획추출물을 실리카겔 크로마토그래피, 세파덱스 LH-20 컬럼 등으로 정제하였다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1의 스티그마스테롤은 엉겅퀴 속 식물의 추출물, 바람직하게는 엉겅퀴(Cirsium japonicum var. ussuriense) 추출물, 보다 바람직하게는 엉겅퀴 클로로포름 가용 분획추출물로부터 단리된 화합물이다. 하나의 구체적 실시에서, 상기 화학식 1의 스티그마스테롤은 저급 알코올로 추출하여 얻어진 엉겅퀴추출물을 헥산을 이용하여 수가용성 분획추출물을 제조한 후, 클로로포름으로 추출하여 클로로포름 가용 분획추출물을 제조하고, ODS flash 컬럼에서 100% 수용성 메탄올로 용출한 다음, 실리카겔 크로마토그래피로 정제하고 세파덱스 LH-20 컬럼에서 여과하여 분획 수집기로 나누어 단리함으로써 제조된다. 다만, 상기 화학식 1의 스티그마스테롤이 엉겅퀴 속 식물의 추출물로부터 단리되고 그 효능이 밝혀진 화합물이지만, 본 발명에서 화학적으로 합성한 상기 화학식 1의 스티그마스테롤을 배제하는 것은 아니다.
상기 화학식 2의 엔-아세틸갈락토사민은 오가피 속 식물의 추출물, 바람직하게는 오가피(Acanthopanax senticosus Harms) 추출물, 보다 바람직하게는 오가피 클로로포름 가용 분획추출물로부터 단리된 화합물이다. 하나의 구체적 실시에서, 상기 화학식 2의 엔-아세틸갈락토사민은 저급 알코올로 추출하여 얻어진 오가피추출물을 헥산을 이용하여 수가용성 분획추출물을 제조한 후, 클로로포름으로 추출하여 클로로포름 가용 분획추출물을 제조하고, ODS flash 컬럼에서 100% 수용성 메탄올로 용출한 다음, 실리카겔 크로마토그래피로 정제하고 세파덱스 LH-20 컬럼에서 여과하여 분획 수집기로 나누어 단리함으로써 제조된다. 다만, 상기 화학식 2의 엔-아세틸갈락토사민이 오가피 속 식물의 추출물로부터 단리되고 그 효능이 밝혀진 화합물이지만, 본 발명에서 화학적으로 합성한 상기 화학식 2의 엔-아세틸갈락토사민을 배제하는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "무혈청" 배지는 인간을 포함한 동물로부터 유래된 혈청을 일정 함량 이상 함유하지 않는 임의의 동물세포 배양 배지를 의미한다. 상기 적절한 세포 배양 배지는 당업자에게 공지되어 있는데, 이로 한정되는 것은 아니지만, 예로 DMEM 배지, HAM 배지, IMDM 배지, RPMI 1640 배지 등이 있다. 이들 배지는 염, 비타민, 완충액, 에너지 공급원, 아미노산 및 다른 물질을 포함하고 있다. 또한, 이들 배지는 세포를 배양함에 있어서 일반적으로 동물 유래 혈청을 약 5 내지 20% 정도 사용하여 배양하고자 하는 세포의 성장을 위한 범용적인 영양분을 제공하게 된다. 그러나 본 발명의 배지는 세포의 성장을 위하여 필요한 동물 유래 혈청을 대체하여 상기 엉겅퀴 속 식물의 추출물, 오가피 속 식물의 추출물, 스티그마스테롤 및 엔-아세틸갈락토사민으로부터 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 물질을 첨가함으로써 동물 유래 혈청을 대체 가능할 정도로 우수한 세포의 성장 및 증식을 촉진한다. 본원에서 "동물 유래 혈청을 대체" 또는 "동물 유래 혈청을 일정 함량 이상 함유하지 않는"이란 동물세포 배양 배지에 첨가되는 동물 유래 혈청 함량의 10% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상, 보다 더 바람직하게는 40% 이상, 보다 더 바람직하게는 50% 이상, 가장 바람직하게는 100%로 상기 엉겅퀴 속 식물 추출물, 오가피 속 식물 추출물, 스티그마스테롤 및 엔-아세틸갈락토사민으로부터 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 물질이 대신 첨가되어 세포를 성장 및 증식하는 것을 의미한다. 하나의 구체적 실시에서, 본 발명의 상기 엉겅퀴 속 식물 추출물, 오가피 속 식물 추출물, 스티그마스테롤 및 엔-아세틸갈락토사민이 동물 유래 혈청을 대체하여 배지에 첨가되더라도 배지 내의 세포, 예를 들어 줄기세포 및 섬유아세포 등의 증식을 촉진하고 활성화하는 것이 밝혀졌다. 이에 따라 본 발명의 상기 엉겅퀴 속 식물 추출물, 오가피 속 식물 추출물, 스티그마스테롤 및 엔-아세틸갈락토사민이 상기 범위 내에서 동물 유래 혈청 대신 동물세포 배양 배지에 첨가되더라도 동물 유래 혈청에 의한 배양배지 내 세포 증식 및 활성화 기능의 동등 이상이 나타낼 것임을 당업자라면 당연히 알 수 있을 것이다.
본 발명에 있어서, 동물세포는 인간을 포함한 동물로부터 기원한 기능적 및 구조적 기본 단위이며, 인간을 포함한 동물로부터 기원한 세포이면 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명의 동물세포는 이로 제한되는 것은 아니나, 줄기세포, 근육세포, 생식세포, 피부 내 세포(예로, 섬유아세포, 각질세포) 등을 포함한다.
상기 줄기세포는 스스로 세포분열할 수 있고 매우 다양한 형태의 특이 세포 타입(specific cell type)으로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포이다. 하나의 구체적 일 양태로서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포 및 성체줄기세포를 모두 포함하나, 바람직하게는 동물 유래의 성체줄기세포이며, 보다 바람직하게는 인간 유래 성체줄기세포이다. 상기 성체줄기세포는 배아발달단계 이후에도 성체 전반에서 발견되는 분화되지 않고 세포분열에 의해 증식하여 사멸된 세포를 대체하고 손상된 조직을 재생하는 역할을 하는 줄기세포를 의미한다. 이러한 성체줄기세포는 주변조직의 특성에 세포자신을 맞추어 분화하는 조직특이적 분화능력(site-specific differentiation)을 가지고 있다. 이들 성체줄기세포의 예로는, 골수, 혈액, 뇌, 피부, 지방(즉, 지방조직 또는 지방세포), 탯줄, 제대혈, 제대의 바르톤 젤리(Wharton's jelly) 등의 다양한 성체 세포로부터 유래한다. 하나의 구체적 실시에서, 상기 성체줄기세포는 인간 탯줄혈액 유래 중간엽 줄기세포(human cord blood-derived stem cells, CB-MCSs), 피부 유래 줄기세포, 또는 인간 지방유래 줄기세포(human adipose-derived stem cells, ADSCs)이다. 다른 하나의 구체적 실시에서, 상기 성체줄기세포로서 피부 유래 줄기세포는 모낭과 모낭 사이의 표피(interfollicular epidermis)의 기저층에 존재하는 줄기세포, 모낭(hair follicle)에 존재하는 줄기세포, 또는 피하 지방층에 존재하는 지방유래 줄기세포이다.
본 발명의 상기 동물세포 배양용 무혈청 배지는 동물 유래 혈청을 대체 가능한 엉겅퀴 속 식물 추출물, 오가피 속 식물 추출물, 스티그마스테롤 및 엔-아세틸갈락토사민으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이 필수적으로 첨가되는 것 이외에, 필요에 따라 항생제, 항진균제 및 오염을 야기하는 마이코플라스마 억제제를 포함할 수 있다. 항생제로는 페니실린-스트렙토마이신 등 통상 세포배양에 사용되는 항생제를 사용할 수 있으며, 항진균제로는 암포테리신 B, 마이코플라스마 억제제로는 타일로신(tylosin), 젠타마이신, 시프로플록사신, 아지트로마이신 등을 사용할 수 있다. 또한, 필요에 따라, 글루타민 등의 산화영양소와 소디움 피루베이트 등의 에너지 대사물질을 더 첨가할 수 있다. 또한, 필요에 따라, 세포의 부착을 위한 피브로넥틴 등의 부착인자 및/또는 인터루킨, GM-CSF, G-CSF 등의 세포의 성장을 보조하는 성장인자 등을 더 첨가할 수 있다. 이와 같이 추가로 첨가되는 물질 및 그 함량은 세포의 종류 및 특성에 따라 당업자에 의하여 용이하게 조절할 수 있을 것이다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 엉겅퀴 속 식물의 추출물, 오가피 속 식물의 추출물, 상기 화학식 1의 스티그마스테롤, 상기 화학식 2의 엔-아세틸갈락토사민, 및 상기 동물세포 배양용 무혈청 배지에서 동물세포를 배양한 후 배양된 동물세포를 제거한 배양액으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 물질을 포함하는 피부상태 개선용 조성물을 제공한다.
상기 엉겅퀴 속 식물의 추출물, 오가피 속 식물의 추출물, 상기 화학식 1의 스티그마스테롤 및 상기 화학식 2의 엔-아세틸갈락토사민은 상술한 바와 같으므로, 이하에서는 구체적인 설명을 생략한다.
상술한 본 발명의 동물세포 배양용 무혈청 배지에서 동물세포를 배양한 후 배양된 동물세포를 제거한 배양액은 상기의 동물세포 배양용 무혈청 배지에서 동물세포를 배양한 후 동물세포를 제거하고 남은 배양액이다. 그 배양액을 제조하는 방법은 공지된 방법을 이용하여 행할 수 있다. 예컨대, 동물세포를 배양한 후 세포배양액을 회수하고, 회수된 배양액을 마이크로 시린지 필터를 이용하여 여과함으로써 동물세포가 제거된 배양액을 얻을 수 있다. 마이크로 필터의 세공 크기(pore size)는 동물세포를 제거할 수 있는 크기 내에서 적절하게 선택할 수 있고, 바람직하게는 0.1 내지 10um이다.
상기 "피부상태 개선"은 피부질환 또는 피부세포의 기능 저하 또는 손실 등의 원인에 의하여 피부의 외관 및 촉감에 나타나는 현상을 완화, 억제 또는 향상하는 것을 의미한다. 상기 피부질환은 예를 들어, 아토피성 피부염, 피부습진(eczema), 여드름 및 건선 등의 염증성 피부질환을 포함한다. 상기 피부세포의 기능 저하 또는 손실 등의 원인에 의하여 주름의 발생, 검버섯 등의 피부노화 발생, 피부 탄력 감소, 피부 흉터 등이 발생한다.
그런데, 본 발명의 엉겅퀴 속 식물 추출물, 오가피 속 식물 추출물, 상기 화학식 1의 스티그마스테롤 및 상기 화학식 2의 엔-아세틸갈락토사민은 상술한 바와 같이 동물 유래 혈청 성분을 대체하고, 또한 동물세포, 특히 줄기세포, 바람직하게는 성체 줄기세포의 증식 촉진능을 갖고 있음이 본 발명자들에 의하여 발견되었다. 따라서 상기 물질들을 인체의 피부에 적용하는 경우 피부세포, 특히 피부에 존재하는 성체 줄기세포의 증식을 촉진하거나 활성화시킴으로써 피부 상태를 개선할 수 있다. 피부에 존재하는 성체 줄기세포는 예를 들어, 모낭과 모낭사이의 표피(interfollicular epidermis)의 기저층에 존재하는 줄기세포, 모낭(hair follicle)에 존재하는 줄기세포, 또는 피하 지방층에 존재하는 지방유래 줄기세포이다.
또한, 본 발명의 엉겅퀴 속 식물 추출물, 오가피 속 식물 추출물, 상기 화학식 1의 스티그마스테롤 및 상기 화학식 2의 엔-아세틸갈락토사민은 줄기세포 이외의 다양한 동물세포의 증식을 촉진 및 활성화시킬 수 있음이 본 발명자들에 의하여 발견되었다. 따라서 상기 물질들을 인체의 피부에 적용하는 경우 피부에 존재하는 섬유아세포 등의 증식을 촉진하거나 활성화시킴으로써 이로 인한 피부 상태를 개선할 수 있다.
또한, 본 발명의 엉겅퀴 속 식물 추출물, 오가피 속 식물 추출물, 상기 화학식 1의 스티그마스테롤 및 상기 화학식 2의 엔-아세틸갈락토사민이 동물 유래 혈청 성분을 대체하여 첨가된 상기 동물세포 배양용 배지에서 동물세포를 배양한 후 동물세포를 제거한 배양액은 동물세포, 바람직하게는 줄기세포로부터 분비된 다양한 생리활성물질(예를 들어, 줄기세포 증식 또는 활성화 촉진능을 갖는 사이토카인 등)이 함유되어 있으므로, 배양된 동물세포를 제거한 배양액을 인체에 적용하는 경우 인체에 존재하는 다양한 세포, 특히 성체 줄기세포 등의 증식 촉진 또는 활성화를 통해 피부 상태를 개선하는 효과를 얻을 수 있다. 또한, 상기 동물세포를 제거한 배양액에는 동물 유래 혈청 성분으로부터 유래될 수 있는 다양한 생물학적 오염물, 예를 들어 동물성 세균, 동물성 바이러스 뿐만 아니라 프리온(prion)이나 독소(toxin)와 같은 단백질 등이 포함되어 있지 않으므로, 상기 동물세포를 제거한 배양액을 인체에 적용하는 경우 상기 오염물에 의한 감염 또는 독성 문제가 발생하지 않는 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 상술한 바와 같은 효과를 가지고 있으므로 피부상태를 개선할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 피부질환의 완화, 주름의 개선, 피부노화 억제, 피부탄력의 개선, 피부 흉터 등의 상처 회복 및 피부 재생 등의 효능이 있으므로 피부상태를 개선할 수 있다.
상술한 효과를 갖는 본 발명의 상기 피부상태 개선용 조성물에는 엉겅퀴 속 식물 추출물, 오가피 속 식물 추출물, 상기 화학식 1의 스티그마스테롤, 상기 화학식 2의 엔-아세틸갈락토사민, 및 상기 동물세포용 배양 배지에서 동물세포를 배양한 후 배양된 동물세포를 제거한 배양액으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 물질이 전체 조성물에 대하여 0.01 내지 30중량%로 함유된다. 상기 물질의 함량이 0.01중량% 미만인 경우 본 발명의 하나의 목적인 피부 상태 개선 효과를 볼 수 없고, 30중량% 초과인 경우 증가되는 함량에 비해 증가된 개선 효과를 얻기 어려우며 제조 비용이 증가하는 단점이 있다.
상기한 본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 피부상태, 예를 들어 피부질환의 완화, 주름의 개선, 피부노화 억제, 피부탄력의 개선, 피부 흉터 등의 상처 회복 및 피부 재생 등을 목적으로 식품, 화장품 및 의약품의 제형으로써 제공되는 것이 바람직하다.
구체적인 하나의 양태로서, 본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 피부 상태의 개선을 목적으로 한 기능성 식품으로 제공될 수 있다.
본 발명의 피부상태 개선용 조성물이 기능성 식품의 형태로 제공되는 경우 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분인 엉겅퀴 속 식물 추출물, 오가피 속 식물 추출물, 상기 화학식 1의 스티그마스테롤 및 상기 화학식 2의 엔-아세틸갈락토사민으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 물질 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다. 식품에 대한 용이한 접근성을 고려한다면, 상기 기능성 식품은 피부상태 개선 용도로 매우 유용하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 기능성 식품 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 파우더, 바, 캔디, 아이스크림, 오일, 및 분말 유탁액 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 갖는다.
구체적인 또 하나의 양태로서, 본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 피부상태 개선을 목적으로 한 피부에 직접 적용되는 화장료로서 제공된다.
상기 화장료는 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
화장료의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
또한, 상기 화장료 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
또한, 상기 화장료 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
또한, 상기 화장료 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료에 포함되는 성분은 유효 성분과 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 화장료는 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 샴푸, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클린징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태이다.
구체적인 또 하나의 양태로서, 본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 피부 상태의 개선을 목적으로 한 의약품으로서 제공된다.
상기 의약품은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 의약품에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
상기 의약품은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
또한, 상기 의약품의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 엉겅퀴 속 식물 추출물, 오가피 속 식물 추출물, 스티그마스테롤 및 엔-아세틸갈락토사민으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 물질을 포함하는 동물세포 배양용 무혈청 배지는 고가의 동물성 혈청을 사용하지 않으므로 제조비용을 현저히 낮출 수 있고, 동물성 혈청을 배지에 사용함으로써 발생되는 동물성 물질의 오염을 원천적으로 차단함으로써 보다 안전한 동물세포를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 물질 및 상기 동물세포 배양용 무혈청 배지의 배양액을 유효성분으로 포함하는 조성물은 동물세포, 특히 줄기세포의 증식촉진능 및 활성화능을 가지므로 피부질환의 완화, 피부 주름의 개선, 피부노화 억제, 피부탄력의 개선, 피부 흉터 등의 상처 회복 및 피부 재생 효능 등과 같은 피부 상태의 개선 효과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 엉겅퀴 추출물의 제조 및 이로부터 신규 생리활성물질인 스티그마스테롤( stigmasterol )의 분리
1-1. 엉겅퀴 추출물의 제조
엉겅퀴(Cirsium japonicum var. ussuriense) 전초 10 kg을 건조 후 분쇄하여 분말화 한 후 에탄올로 7일간 냉침하여 추출하였다. 상기 추출원액을 여과한 후 농축하여 엉겅퀴추출물 0.5 kg을 제조하였다.
1-2. 엉겅퀴 핵산 가용 분획추출물의 제조
상기 실시예 1-1의 엉겅퀴추출물 100 g을 80% 메탄올 100ml에 녹인 후 핵산 100ml로 5회 추출하고 그 상층액을 여과 증류하여 엉겅퀴 핵산 가용 분획추출물 9.2 g을 수득하였다.
1-3. 엉겅퀴 클로로포름 가용 분획추출물의 제조
상기 실시예 1-2에서 얻은 수가용성 분획물 8.5 g을 80% 에탄올에 녹여서 감압 농축한 후 수층을 100ml 클로로포름에 5회 추출하여 클로로포름 가용 분획추출물 1.75 g를 얻었다.
1-4. 엉겅퀴 추출물로부터 단리된 신규 생리활성물질인 스티그마스테롤( stigmasterol )의 분리
상기 실시예 1-3에서 얻은 클로로포름 분획추출물 1 g을 ODS flash 컬럼에서 80% 수용성 에탄올을 첨가하여 분획추출물을 얻었다. 상기 분획추출물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 4개의 분획추출물로 나누고 2번째 분획추출물을 다시 세파덱스 LH-20 컬럼에서 여과하여 분획 수집기로 나누어 신규 활성성분물질을 단리하였다. 상기 신규한 활성물질에 대한 구조를 NMR, IR, UV 등의 기기를 사용하여 (분자량:412.70, Stigmasta-5,22-dien-3beta-ol)인 화합물임을 확인하였으며, 이하 상기 생리활성물질을 '스티그마스테롤 (stigmasterol)'이라 하였다.
상기 결과에 따라 스티그마스테롤의 화학구조는 하기 화학식 1과 같다.
[화학식 1]
Figure pat00003

실시예 2: 오가피 추출물 및 이로부터 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)의 분리
2-1. 오가피 추출물의 제조
오가피(Acanthopanax senticosus Harms) 전초 10 kg을 건조 후 분쇄하여 분말화 한 후 에탄올로 7일간 냉침하여 추출하였다. 상기 추출원액을 여과 한 후 농축하여 오가피추출물 0.7 kg을 제조하였다.
2-2. 오가피 핵산 가용 분획추출물의 제조
상기 실시예 2-1의 오가피추출물 100 g을 80% 메탄올 100ml에 녹인 후 핵산 100ml로 5회 추출하고 그 상층액을 여과 증류하여 오가피 핵산 가용 분획추출물 10.2 g을 수득하였다.
2-3. 오가피 클로로포름 가용 분획추출물의 제조
상기 실시예 2-2에서 얻은 수가용성 분획물 8 g을 80% 에탄올에 녹여서 감압 농축한 후 수층을 100ml 클로로포름에 5회 추출하여 클로로포름 가용 분획추출물 1.65 g을 얻었다.
2-4. 엔-아세틸갈락토사민(N- acetylgalactosamine )의 분리
상기 실시예 2-3에서 얻은 클로로포름 분획추출물 1 g을 ODS flash 컬럼에서 80% 수용성 에탄올을 첨가하여 분획추출물 0.45 g을 얻었다. 상기 분획추출물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 4개의 분획추출물로 나누고 2번째 분획추출물을 다시 세파덱스 LH-20 컬럼에서 여과하여 분획 수집기로 나누어 신규 활성성분물질을 단리하였다. 상기 신규한 활성물질에 대한 구조를 NMR, IR, UV 등의 기기를 사용하여 2-Acetamido-2-deoxy-D-galactopyranose(분자량 : MW 221.21)인 화합물임을 확인하였으며, 이하 상기 생리활성물질을 '엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)'이라 하였다.
상기 결과에 따라 엔-아세틸갈락토사민의 화학구조는 하기 화학식 2와 같다.
[화학식 2]
Figure pat00004

실시예 3: 추출물 또는 이로부터 단리된 화합물이 혈청을 대체한 배지에서 줄기세포의 세포생존능 측정
3-1. 세포, 배지 및 배양방법
본 발명자들은 줄기세포배양용 혈청대체제를 찾기 위해 혈청이 첨가되지 않은 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양하면서 배지에 상기 실시예 1 및 2의 시료를 첨가하여 양호한 줄기세포 성장이 이루어지는 지를 관찰하였다.
구체적으로, 줄기세포 배양용 배지에 혈청대체제로써 엉겅퀴의 용매추출물(에탄올, 핵산, 클로로포름), 오가피의 용매추출물(에탄올, 핵산, 클로로포름) 및 이들로부터 분리된 스티그마스테롤과 엔-아세틸갈락토사민을 선정하여 첨가한 후 줄기세포의 배양 결과를 확인하였다.
줄기세포로는 인간 탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포와 인간 지방유래 줄기세포를 사용하였다.
인간 탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포(Human cord blood-derived mesenchymal stem cells, CB-MSCs)는 차 의과대학교(한국, 경기도 성남)로부터 얻었다. 세포들은 저농도의 글루코오스를 포함하고, 15％ FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)에서 37℃ 온도조건에서 배양하였다. 배지는 세포들이 컨플루언시(confluency)에 도달할 때 까지 3일 마다 교체하였다. 인간 지방유래 줄기세포(Human adipose-derived stem cells, ADSCs)는 Invitrogen (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)으로부터 구입하였다. 동결보존된 세포들을 37℃에서 녹인 후 곧 바로 2%의 동물혈청을 포함하고 있는 MesenPRO RSTM 배지(Gibco, Carlsbad, CA, USA)에서 배양하였다. 이어서, 세포들을 MesenPRO RSTM 배지를 이용하여 증식시켰다. 음성 대조군인 무혈청 조건 시험군에서는 세포 배양 배지인 MesenPRO RSTM 배지를 무혈청 DMEM (Cat. 11885, Invitrogen)배지로 교체하였다. 양성 대조군으로는 세포를 MesenPRO RSTM 배지에서 5％ FBS를 포함하는 DEME 배지로 교환하여 배양하였다.
3-2. 세포생존능 ( cell viability ) 측정
세포생존능은 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)분석을 통해 측정하였다. MTT 분석은 테트라졸륨환(tetrazolium ring)을 포함하는 기질(substrate)이 미토콘드리아 탈수소효소에 의해 청색의 포르마잔(formazan)으로 변환되는 것에 기초한 분석방법이다. 청색 포르마잔의 수준을 분광학적으로 측정한 후 이를 세포밀도의 간접적인 지표로 사용하였다. 간략하게 설명하면, 세포들을 37℃에서 MTT (1 mg/㎖)에 3 시간 동안 노출시킨 후, 배지를 제거하고 세포들을 DMSO (dimethyl sulfoxide)로 용해시켰다. 완전 용해된 후 청색 포르마잔의 존재는 파장 570 nm에서의 흡광도를 측정함으로서 분광학적으로 측정하였다.
MTT 분석법을 사용하여 줄기세포의 증식에 미치는 엉겅퀴 및 오가피의 용매추출물(에탄올, 핵산, 클로로포름), 스티그마스테롤, 엔-아세틸갈락토사민의 영향을 평가한 결과, 모두 성체줄기세포의 증식을 유도함을 관찰하였다. 그 중에서도 엉겅퀴의 에탄올추출물, 오가피의 에탄올추출물, 스티그마스테롤 및 엔-아세틸갈락토사민이 줄기세포의 증식을 현저히 유도함을 확인하였다(하기 표 1 참조). 엉겅퀴의 에탄올추출물, 오가피의 에탄올추출물, 스티그마스테롤 및 엔-아세틸갈락토사민이 탯줄혈액 유래 중간엽줄기세포(CB-MSCs)의 성장률을 각각 20.6%, 26.7％, 32.4% 및 42.7％로 현저히 증가시켰으며, 또한 지방 유래 줄기세포(ADSCs)의 세포 성장률도 각각 21.5%, 22.2％, 35.5% 및 45.4％로 현저히 증가시켰다(하기 표 1 참조).
Figure pat00005
실시예 4: 추출물 또는 이로부터 단리된 화합물을 함유한 무혈청 배지에서 동물세포의 세포생존능 측정
본 실시예에서는 엉겅퀴추출물, 오가피추출물, 이로부터 단리된 신규 생리활성물질인 스티그마스테롤(stigmasterol)이 다른 동물세포들의 증식도 촉진할 수 있는지를 알아보기 위해, 인간각질세포인 HaCaT과 마우스 섬유아세포(mouse fibroblast)인 NIH3T3 세포를 엉겅퀴추출물, 오가피추출물 및 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol)과 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)이 함유된 무혈청 배지에 배양하여 이들 세포생존능에 미치는 효과를 관찰하였다.
본 실시예의 실험은 다음과 같이 실시하였다. 5％ CO2 및 37℃ 하에서 10％의 FBS, 1％ 항생제가 포함된 DMEM 배지에서 배양한 HaCaT와 NIH3T3 세포 3 x 105 을 6 웰 플레이트(well plate)에 접종하여 안착시킨 후, 다음 날 혈청을 제거한 배양액으로 1회 세척한 다음, 무혈청조건과 엉겅퀴추출물, 오가피추출물 및 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol)과 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)이 각각 10% FBS를 대체하여 첨가된 무혈청조건으로 실험군을 나누어 배양하였다. 72 시간이 경과한 후, 혈청을 제거한 배양액으로 1회 세척한 다음, 10％ MTT가 들어있는 무혈청배지로 교체하여 3시간 후 O.D 값을 측정하여 백분율로 환산하였다.
하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 정상군(혈청 포함)을 100％로 환산하였을 시, 무혈청조건(54％)에 비해 엉겅퀴추출물, 오가피추출물 및 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol)과 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)이 각각 첨가된 조건에서 20％ 이상의 세포생존율 증가를 보여 엉겅퀴추출물, 오가피추출물 및 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol)과 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)이 줄기세포뿐만 아니라 일반 동물세포의 세포증식을 촉진하는 효과가 있음을 알 수 있었다.
Figure pat00006
실시예 5: 추출물 또는 이로부터 단리된 화합물을 함유한 무혈청 배지에서 섬유아세포의 세포생존능 측정
인간 정상 섬유아세포(human normal fibroblasts)를 이용하여 무혈청 배지에 엉겅퀴추출물, 오가피추출물 및 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol)과 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)을 각각 처리한 후 세포생존율에 미치는 효과를 관찰하였다. 본 실험은 5 ％ CO2 및 37℃ 하에서 10％의 FBS, 1％ 항생제가 포함된 DMEM 배지에서 배양한 인간 정상 섬유아세포 3 X 105 를 6 웰 플레이트에 접종하여 안착시킨 후, 다음 날 혈청을 제거한 배양액으로 1회 세척한 다음, 무혈청조건 및 엉겅퀴추출물, 오가피추출물 및 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol)과 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)이 각각 첨가된 무혈청 조건으로 실험군을 나누어 배양하였다. 72 시간이 경과한 후, 혈청을 제거한 배양액으로 1회 세척한 다음, 10％ MTT가 들어있는 무혈청배지로 교체하고 3시간 후 O.D 값을 측정하여 백분율로 환산하였다. 이에 대한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
하기 표 3의 실험 결과에서 보여지는 바와 같이, 엉겅퀴추출물, 오가피 추출물 및 이들로부터 단리된 신규 생리활성물질인 스티그마스테롤(stigmasterol)과 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)을 처리한 경우에 음성대조군에 비해 높은 세포증식촉진 효과를 나타내었다. 따라서, 엉겅퀴추출물, 오가피추출물 및 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol)과 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)이 섬유아세포에서도 세포 증식을 촉진함을 확인할 수 있었다.
Figure pat00007
실시예 6: 추출물 또는 이로부터 단리된 화합물의 섬유아세포의 콜라겐 합성 촉진효과
섬유아세포의 콜라겐 생합성 촉진은 피부에 있어 주름을 방지하고 완화하는 주요 지표이다. 주름은 통상적으로 콜라겐의 생합성이 감소하고 만들어진 콜라겐이 분해되면서 발생하는 것으로 알려져 있다. 따라서 진피층에 존재하는 섬유아세포의 콜라겐 합성이 촉진되면 주름억제는 물론 생성된 주름도 개선될 수 있다.
사람의 정상 섬유 아세포(Human normal fibroblast, 태평양)를 DMEM 배지가 들어 있는 6-웰 마이크로 플레이트에 접종시키고(2 X 105 세포/웰) 5％ 농도의 CO2 배양기에서 37℃로 24 시간 배양하였다. 24 시간 후, 각 웰에서 배지를 제거한 후, 엉겅퀴추출물, 오가피추출물 및 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol)과 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine) 각각 처리하고, 24 시간 동안 다시 배양하였다. 24 시간 후, 세포 배지를 수집하여 샘플을 제조하였다. 콜라겐 합성량은 콜라겐 측정 키트(Procollagen Type I C-peptide EIA kit; MK101; Takara, Kyoto, Japan)를 이용하여 프로콜라겐 타입 I C-펩타이드 (Procollagen Type I C-peptide: PICP)의 양을 측정하였다. 실험은 키트 설명서에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 측정된 표준치는 평균ㅁ 표준편차의 형태로 표시하였고, SPSS/PC+ 프로그램을 이용하여 t-test로 유의성을 검정하였다. 실험 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
하기 표 4의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 엉겅퀴추출물, 오가피추출물 및 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol)과 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)은 모두 음성대조군에 비해 높은 콜라겐 생합성율을 나타내었다. 특히, 오가피 추출물 및 이로부터 단리된 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)이 엉겅피 추출물 및 이로부터 단리된 스티그마스테롤(stigmasterol)에 비하여 보다 높은 콜라겐 생합성율을 나타내었다.
Figure pat00008
실시예 7: 추출물 또는 이로부터 단리된 화합물의 콜라겐 분해효소에 대한 억제효과
콜라겐은 진피층을 구성하는 구조단백질로 그 양이 줄어들게 되면 주름이 생성된다. 반면에 만들어진 콜라겐이 잘 유지되면 주름발생이 억제될 수 있다. 따라서 콜라겐 분해효소의 활성을 억제하는 것은 항노화의 주요 생리학적인 지표이다.
사람의 정상 섬유아세포(Human normal fibroblast, 태평양)를 DMEM 배지가 들어 있는 6-웰 마이크로 플레이트에 접종시키고 (2 X 105 세포/웰) 5％ 농도의 CO2 배양기에 37℃로 24 시간 배양하였다. 24 시간 후, 각 웰에서 배지를 제거한 후, 엉겅퀴추출물, 오가피추출물 및 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol)과 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)을 각각 처리하고, 24 시간 동안 다시 배양하였다. 24 시간 후, 세포배지를 수집하여 샘플을 제조하였다. 콜라겐을 분해하는 효소인 콜라게나제(collagenase)의 활성정도를 측정하는 방법으로 콜라게나제에 대한 항체를 이용하였다. 콜라게나제 활성을 유도하는 물질로 PMA(phorbol myristate acetate)를 처리하였다. 실험은 상업적으로 판매되는 키트에 제조자의 지시서에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 타입 I 콜라게나제 분석 키트 (Type I collagenase assay kit, Amersham Biosciences, RPN2629)를 이용하였으며, ELISA 판독기로 흡광도를 측정하였다. 측정된 표준치는 평균 ㅁ 표준편차의 형태로 표시하였고, SPSS/PC+ 프로그램을 이용하여 t-test로 유의성을 검정하였다. 실험 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
하기 표 5에서 볼 수 있듯이, 엉겅퀴추출물, 오가피추출물 및 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol)과 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)은 모두 20％ 이상의 콜라겐 분해효소 활성억제 효과를 나타내었다.
Figure pat00009
실시예 8: 추출물 또는 이로부터 단리된 화합물을 함유한 줄기세포배양액을 이용한 피부줄기세포의 활성화 측정
엉겅퀴추출물, 오가피추출물 및 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol)과 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)이 각각 첨가된 무혈청배지에서 배양한 줄기세포 배양액을 피부줄기세포에 처리하여 피부줄기세포의 활성화 정도를 측정하였다.
본 실험에서 사용한 피부줄기세포는 대한피부연구학회지(2006;13(1):1-4)에 개재된 표피성체줄기세포 분리방법에 따라 분리하였다. 즉, 피부줄기세포(ESC)는 피부조직 또는 피부에서 수득한 세포들로부터 제4형 콜라겐에 부착성을 갖는 세포를 분리하여 얻었다. 이렇게 얻은 피부줄기세포를 3 X 105 개로 6 웰 플레이트에 접종하여 안착시킨 후, 혈청을 제거한 배양액으로 1 회 세척한 다음, 무혈청조건(SF),엉겅퀴추출물, 오가피추출물 및 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol)과 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)이 각각 첨가된 무혈청조건(P/SF)의 실험군으로 나누어 배양하였다. 72 시간 배양한 후에, MTT 분석을 하였다. 이에 대한 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
하기 표 6에서 볼 수 있듯이, 정상군(CM)을 100 ％로 환산하였을 시, 무혈청조건이 처리된 실험군(SF)에 비해, 엉겅퀴추출물 또는 엉겅퀴로부터 단리된 신규 생리활성물질인 스티그마스테롤 (stigmasterol)이 첨가된 무혈청조건이 처리된 실험군(P/SF)에서 유의성 있게 피부줄기세포의 생존율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
Figure pat00010
실시예 9: 추출물 또는 이로부터 단리된 화합물을 함유한 피부상태 개선용 외용조성물 제조
엉겅퀴추출물 또는 엉겅퀴로부터 단리된 신규 생리활성물질인 스티그마스테롤 (stigmasterol)을 일반적으로 화장품이나 연고 같은 피부외용제제로 만들 경우에 이용하는 Oil in Water 타입의 에멀젼 제형으로 시험제품을 만들었다. 각 시험제품의 조성에 하기 표 7에 나타내었다. 수상인 정제수, 트리에탄올 아민 및 프로필렌글리콜을 70℃로 가열하여 용해시킨 다음 유상인 지방산, 유성성분, 유화제 및 방부제를 70℃로 가열하여 용해한 액을 첨가하여 유화시켰다. 유화가 완료된 후 상기 용액을 45℃로 냉각시키고 엉겅퀴추출물 또는 엉겅퀴로부터 단리된 신규 생리활성물질인 스티그마스테롤 (stigmasterol)을 20ppm 첨가하였다.
Figure pat00011
실시예 10: 추출물 또는 이로부터 단리된 화합물을 포함하는 조성물의 여드름 개선 효과
엉겅퀴추출물, 오가피추출물 및 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol)과 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine) 자체의 염증성 피부개선 효과를 임상 시험을 통하여 측정하였다. 구체적으로, 여드름을 가진 환자(각40명)를 대상으로 엉겅퀴추출물, 오가피추출물 및 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol)과 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)을 각각 20 ppm 함유한 크림(시험군 1 내지 8)을 여드름 피부 피검자의 얼굴 왼쪽에 도포하였고, 다른 쪽에는 엉겅퀴추출물, 오가피추출물 및 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol)과 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)이 포함되지 않은 크림을 대조군(대조군 1 및 2)으로 각각 도포하였다. 도포 회수는 1일/2회로 하여 1개월 동안 진행되었으며, 사용 후 1개월 후에 여드름 개선 효과를 측정하였다. 측정은 온도 24-26℃, 습도 38-40％로 일정하게 유지되는 조건에서 눈 밑 2센티미터 아랫 쪽에 가상의 3제곱 센티미터의 사각형을 그린 후, 그 안에 들어가는 여드름의 개수를 세서 측정하였다. 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
Figure pat00012
상기 표 8에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 크림이 대조군 1의 크림에 비해 여드름 개선 효과가 있음을 확인하였다. 그 결과 엉겅퀴추출물, 오가피추출물 및 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol)과 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)이 각각 포함된 크림을 도포한 왼쪽 얼굴에서만 증세가 호전되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 11: 추출물 또는 이로부터 단리된 화합물을 포함하는 조성물의 피부 염증 개선효과
엉겅퀴추출물, 오가피추출물 및 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol)과 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)의 아토피나 건선 등과 같은 만성 염증성 피부 개선 효과를 임상 시험을 통하여 측정하였다. 구체적으로, 아토피를 가진 환자(각 시험당 60명)를 대상으로 엉겅퀴추출물, 오가피추출물 및 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol)과 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)을 각각 20ppm 함유한 크림(시험군 1 내지 8)과 상기 추출물 및 화합물을 전혀 함유하지 않은 크림(대조군 1 및 2)을 전신에 1개월 동안 사용하게 한 후, 아토피 개선 효과를 측정하였다. 측정은 온도 24-26℃, 습도 38-40％로 일정하게 유지되는 조건에서 팔의 접히는 부위를 중심으로 6곳을 임의로 정해 미놀타의 CR-300 색차계를 사용하여 홍반이 진정된 정도를 측정하고 설문을 통하여 가려움 정도를 측정한 후 두 값을 보정하여 최종 피부개선 정도를 수치화 하였다. 판정기준은 전혀 변화가 없는 경우를 0, 개선정도를 1 내지 5로 정하여 상대적인 값을 비교하였다. 높은 값 일수록 홍반과 가려움이 개선된 경우이다. 악화된 경우는 -1에서 -5까지 표기하였다. 이에 대한 실험 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
Figure pat00013
실시예 12 : 추출물 또는 이로부터 단리된 화합물을 포함하는 피부개선용 외용조성물의 항노화 효과
인체에 있어 항노화 효과는 여러 가지 기준으로 판정할 수 있으나 피부에 나타나는 주름은 손쉽게 측정할 수 있는 지표이다. 본 실험에서는 엉겅퀴추출물, 오가피추출물 및 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol)과 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)의 피부주름 개선효과를 측정하였다. 구체적으로 상기 표 7에서 제조한 크림 8종류와 대조군의 크림을 각각 건강한 여성 20명(25 내지 35세)을 대상으로 1일/2회, 3개월 동안 얼굴에 사용하게 한 후, 온도 24-26℃, 습도 38-40％로 일정하게 유지되는 조건에서 Cutometer SEM 474(Courage+Khazaka, Cologne, 독일)를 이용하여 주름개선 효과를 측정하였다. 판정기준은 피부 탄력이 없는 경우를 0, 많은 경우를 5로 하여 상대적인 값을 비교하였다. 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
Figure pat00014
상기 표 10에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 엉겅퀴추출물, 오가피추출물 및 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol)과 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)을 각각 함유한 크림(시험군 1 내지 8)이 이들을 전혀 함유하지 않은 크림(대조군)에 비해 주름개선 효과가 훨씬 우수함을 알 수 있었다. 즉, 엉겅퀴추출물, 오가피추출물 및 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol)과 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)은 모두 피부 주름 개선 효과가 있음을 알 수 있었다.
실시예 13 : 추출물 또는 이로부터 단리된 화합물의 경구투여에 의한 항노화 효과
노화는 모든 생물체에 시간과 함께 나타나는 현상으로 전조직과 기관에 나타난다. 피부는 동물의 경우 개체의 최외곽을 구성하는 가장 면적이 넓은 기관으로 피부에 나타나는 주름은 노화 정도를 가장 쉽게 판별할 수 있는 지표이다. 특히 자외선을 조사할 경우 인위적으로 노화과정을 촉진할 수 있기 때문에 동물시험에서 자외선을 쬔 후 시험물질을 경구나 경피로 투여하여 그 효과를 측정함으로써 그 물질이 실제 항노화 효과가 있는지를 확인할 수 있다.
따라서 본 실험에서는 본 발명의 엉겅퀴추출물, 오가피추출물, 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol) 및 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)을 함유하는 조성물이 광노화 증상에 미치는 영향을 조사하고자 무모생쥐 (hairless mouse)를 동물모델로 선정하여 실험하였다. 6-7 주령의 암컷 무모생쥐(hairless mouse)(Skh: HR-1)를 그룹 당 8 마리씩 정상군, UV 대조군, UV/엉겅퀴추출물 투여군, UV/오가피추출물 투여군, UV/스티그마스테롤(stigmasterol) 투여군 및 UV/엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine) 투여군으로 나누어 실험기간 동안 사육하였다. 정상군과 UV 대조군은 0.5 ㎖의 생리식염수를 경구투여하였고, UV/엉겅퀴추출물 투여군, UV/오가피추출물 투여군, UV/스티그마스테롤(stigmasterol) 투여군 및 UV/엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine) 투여군은 고형분 기준으로 체중 Kg당 500mg의 엉겅퀴추출물, 오가피추출물, 스티그마스테롤 또는 엔-아세틸갈락토사민을 0.5 ㎖ 식염수에 섞어 액체 투여용 주사기를 이용하여 경구 투여하였다.
투여기간은 총 5주로 주 5일 동일한 시간에 투여하였다. 경구투여 후 2주 부터 5주까지 UV대조군, UV/엉겅퀴추출물 투여군, UV/오가피추출물 투여군, UV/스티그마스테롤(stigmasterol) 투여군 및 UV/엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine) 투여군에 주 3회 태양광과 유사하게 UV를 조사하였다. 이때 실험기간 중 총 UV 조사량이 600 mJ/cm2이 되도록 하였다. 항노화 효과의 주 현상으로 주름개선 효과의 객관적 판정을 위하여 부검 전 무모생쥐(hairless mouse)의 등쪽에서 실리콘 폴리머를 이용하여 피부주형(replica)을 채취하였고, 마찬가지로 5주 후에 각 샘플 처리군으로부터 피부주형을 채취하여 항노화 효과 즉 주름개선 효과를 비교하였다. 이에 대한 결과를 하기 표 11에 나타내었다.
Figure pat00015
상기 표 11에서 볼 수 있는 바와 같이, 주름개선정도를 나타내는 R1, R2, R3, R4, R5 값이 모두 엉겅퀴추출물, 오가피추출물, 및 이들로부터 단리된 신규 생리활성물질인 스티그마스테롤 및 엔-아세틸갈락토사민을 각각 투여한 무모생쥐(hairless mouse)에서 상기 추출물 및 화합물을 투여하지 않은 UV/대조군에 비해 크게 감소한 것을 관찰하였다. 이 결과를 통해 본 발명의 엉겅퀴추출물, 오가피추출물, 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol) 및 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)을 함유하는 조성물을 경구 투여하더라도 주름개선 효과를 나타내 항노화 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 14 : 추출물 또는 이로부터 단리된 화합물의 경구투여에 의한 무모 생쥐의 경피에 존재하는 피부줄기세포의 활성화에 대한 효능 평가
상기 실시예 13에서와 같이, 총 5주간 주 5일 동일한 시간에 엉겅퀴추출물, 오가피추출물, 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol) 및 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)을 각각 무모생쥐에 경구 투여한 후, 경피로부터 피부줄기세포를 분리하였다. 피부줄기세포의 분리방법은 상기 실시예 8에 기재된 방법에 따라 행하였다. 분리된 피부줄기세포를 3 X 105 개로 6 웰 플레이트에 접종하여 안착시킨 후, 혈청이 포함된 배지에서 48 시간 배양한 후,MTT 분석법 (cell viability 측정방법)를 이용하여 세포활성을 측정하였다. 이에 대한 결과를 하기 표 12에 나타내었다.
Figure pat00016
상기 표 12에 나타낸 바와 같이, UV/대조군에 비해 모두 줄기세포 증식 속도가 증가된 것을 관찰하였다. 이러한 결과는 엉겅퀴추출물, 오가피추출물, 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol) 및 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)을 경구투여하였을 경우에도 성체줄기세포의 활성화에 효과가 있음을 의미한다.
실시예 15 : 급성경구독성시험
엉겅퀴추출물, 오가피추출물, 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol) 및 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)이 의약품, 식품 및 화장품 등에 안전하게 적용될 수 있는지를 확인하기 위해 급성 경구독성시험을 실시하였다. 구체적으로, 5 내지 6 주령된 SPF SD계 랫트 20 마리를 실험동물로서 사용하여 하기와 같은 조건에서 급성독성시험을 실시하였다.
ㆍ온도 및 습도조건: 온도 22 ± 2 ℃. 상대습도 50 ± 10 %
ㆍ명암 사이클: 형광등조명 (08시 점등, 20시 소등)
ㆍ조도: 200 내지 300 Lux
ㆍ자외선 처리된 음용수는 자유섭취 시킴
ㆍ시험물질을 멸균증류수에 희석하여 투여시료를 제조하여 대조구로서 멸균 증류수를 사용하여 동량 투입
투여 당일은 4 시간까지 매 시간마다 일반상태를 관찰하고, 투여 다음날부터 14일 까지는 매일 1 회씩 일반상태의 변화, 중독증상, 운동성, 외관, 자율신경 및 사망동물의 유무를 주의 깊게 관찰하였고 여러 가지 병리 해부학적인 검증을 거쳐 독성 유무를 판단하였다. 이에 대한 결과를 하기 표 13에 나타내었다. 하기 표 13에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 엉겅퀴추출물, 오가피추출물, 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol) 및 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)은 모두 독성이 없으므로, 의약품, 식품 및 화장품 등에 안전하게 사용할 수 있다.
Figure pat00017
실시예 16: 건강식품조성물 제조
상기 실시예 15에서 본 발명의 엉겅퀴추출물, 오가피추출물, 이들로부터 단리된 화합물인 스티그마스테롤(stigmasterol) 및 엔-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)이 아무런 독성을 나타내지 않았고, 상기 실시예 13 등에서 본 발명의 상기 물질들이 항노화 효과를 나타냈기 때문에 이들을 소재로 하여 건강식품을 개발하고자 하였다. 구체적으로, 하기 표 14에 나타낸 제제예와 같은 조성으로 통상의 액제 제조방법으로 제조하였다. 각 액제의 최종 양은 100㎖ 이었다. 하기 조성예는 하나의 예이며, 액체뿐만 아니라 정제, 산제, 과립제 등으로 통상의 식품형태로 사용되는 여러 가지 형태로써 제조가 가능할 것이다.
Figure pat00018
실시예 17. 에너지 상승효과
상기 실시예 14에서 사용한 엉겅퀴 에탄올추출물(시험군 1), 엉겅퀴 핵산 추출물(시험군 2), 엉겅퀴 클로로포름 추출물(시험군 3), 스티그마스테롤(시험군 4), 오가피 에탄올 추출물(시험군 5), 오가피 핵산 추출물(시험군 6), 오가피 클로로포름 추출물(시험군 7), 및 엔-아세틸갈락토사민(시험군 8)을 이용하여 무모 생쥐에서 에너지 상승효과를 관찰하였다. 구체적으로, 총 4주간, 주 5일 동일한 시간에 상기 시험군의 조성물들을 무모 생쥐에 구강으로 삽입하고 5주 후 희생시켜 장기로부터 SP(splenocytes), PBMC(peripheral blood mononuclear cell), LN(lymph node)와 같은 면역세포들을 분리한 후 시험군이 ATP 합성에 미치는 영향을 대조군과 비교하여 관찰하였다. 각각의 세포들을 PBS로 2번 세척한 후 용해물(lysate)를 얻은 다음, 0.6 M의 과염소산(perchloric acid)를 이용하여 단백질 제거시켜 원심분리하였다. 단백질 침전물(Protein pellet)이 혼입되지 않게 상등액만을 얻어서 KOH로 중화한 다음, 칼륨-과염소산염(K-perchlorate)를 제거하기 위해서 가볍게 원심분리하였다. 그 결과 얻어진 상등액을 ATP 합성에 사용하였다. ATP는 글루코오스(glucose), 헥소키나아제(hexokinase), 글루코즈-6-포스페이트 디히드로게나제(glucose-6-phosphate dehydrogenase)가 있는 상태에서 NADP+의 환원에 의해 측정하였다. 올리고마이신(Oligomysin)은 ATPase 활성에 대한 억제자로 사용하였다. 이에 대한 결과를 하기 표 15에 나타내었다.
Figure pat00019
상기 표 15에서 볼 수 있듯이, 엉겅퀴 에탄올추출물(시험군 1), 엉겅퀴 핵산 추출물(시험군 2), 엉겅퀴 클로로포름 추출물(시험군 3), 스티그마스테롤(시험군 4), 오가피 에탄올 추출물(시험군 5), 오가피 핵산 추출물(시험군 6), 오가피 클로로포름 추출물(시험군 7), 및 엔-아세틸갈락토사민(시험군 8) 모두 면역세포들의 에너지 상승 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

Claims (12)

  1. 동물 유래 혈청 성분을 대체하여 하기 화학식 1의 스티그마스테롤을 포함하는 동물세포 배양용 무혈청 배지.
    [화학식 1]
    Figure pat00020
  2. 제1항에 있어서, 상기 스티그마스테롤은 엉겅퀴 속 식물의 추출물로부터 단리된 것을 특징으로 하는 동물세포 배양용 무혈청 배지.
  3. 제1항에 있어서, 상기 동물 유래 혈청의 대체는 동물세포 배양용 배지에 첨가되는 동물 유래 혈청 함량의 50% 이상이 상기 화학식 1의 스티그마스테롤로 대신 첨가된 것인 동물세포 배양용 무혈청 배지.
  4. 제1항에 있어서, 상기 동물세포는 동물 유래 줄기세포 또는 피부세포인 것을 특징으로 하는 동물세포 배양용 무혈청 배지.
  5. 하기 화학식 1의 스티그마스테롤 또는 동물 유래 혈청 성분을 대체하여 하기 화학식 1의 스티그마스테롤을 포함하는 동물세포 배양용 무혈청 배지에서 동물세포를 배양한 후 배양된 동물세포를 제거한 배양액을 포함하는 피부상태 개선용 화장료 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pat00021
  6. 제5항에 있어서, 상기 스티그마스테롤은 엉겅퀴 속 식물의 추출물로부터 단리된 것을 특징으로 하는 피부상태 개선용 화장료 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 피부상태 개선은 염증성 피부질환의 완화, 피부 주름의 개선, 피부 노화 억제, 피부 탄력의 개선, 상처 회복 및 피부 재생으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 피부상태 개선용 화장료 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 염증성 피부질환은 아토피성 피부염, 피부습진(eczema), 여드름 또는 건선인 것을 특징으로 하는 피부상태 개선용 화장료 조성물.
  9. 제5항에 있어서, 상기 동물세포는 줄기세포 또는 피부 세포인 것을 특징으로 하는 피부상태 개선용 화장료 조성물.
  10. 제5항에 있어서, 상기 스티그마스테롤 또는 동물 유래 혈청 성분을 대체하여 스티그마스테롤을 포함하는 동물세포 배양용 무혈청 배지에서 동물세포를 배양한 후 배양된 동물세포를 제거한 배양액은 줄기세포 또는 피부 세포의 증식을 촉진하거나 활성화하는 것을 특징으로 하는 피부상태 개선용 화장료 조성물.
  11. 하기 화학식 1의 스티그마스테롤 또는 동물 유래 혈청 성분을 대체하여 하기 화학식 1의 스티그마스테롤을 포함하는 동물세포 배양용 무혈청 배지에서 동물세포를 배양한 후 배양된 동물세포를 제거한 배양액을 포함하는 피부상태 개선용 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pat00022
  12. 하기 화학식 1의 스티그마스테롤 또는 동물 유래 혈청 성분을 대체하여 하기 화학식 1의 스티그마스테롤을 포함하는 동물세포 배양용 무혈청 배지에서 동물세포를 배양한 후 배양된 동물세포를 제거한 배양액을 포함하는 피부상태 개선용 식품 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pat00023
KR1020120006168A 2012-01-19 2012-01-19 천연추출물 또는 이로부터 단리된 화합물을 포함하는 동물세포 배양용 무혈청 배지 및 피부개선조성물 KR101245553B1 (ko)

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