KR101570808B1 - 지방줄기세포 배양액 추출물과 하수오 줄기세포 배양 추출물을 함유하는 육모 또는 양모용 조성물 - Google Patents

지방줄기세포 배양액 추출물과 하수오 줄기세포 배양 추출물을 함유하는 육모 또는 양모용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 육모효과를 갖는 인체 유래 지방줄기세포 배양액 추출물과 하수오 줄기세포 배양 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 인체 유래 지방줄기세포배양액과 하수오 줄기세포 배양 추출물은 모발에 작용하여 모근을 강화하는 효과가 있는데, 인체 지방 흡입술을 통해 얻어진 지방조직으로부터 지방 줄기세포를 분리하여 배양한 인체 유래 지방줄기세포 배양액 추출물과 하수오로부터 줄기세포를 유도한 뒤, 배양하여 얻은 하수오 줄기세포 배양 추출물을 함유하여 본 발명의 육모효과를 위한 조성물을 제조한다.
그러므로 본 발명은 일반적으로 모발에 사용하여 육모효과를 목적으로 범용적으로 사용하고 있지만 단독으로 사용해서 그 효과가 미비한 인체유래 줄기세포 배양액 추출물과 하수오 줄기세포 배양 추출물을 적당량으로 혼합하여 모발에 육모효과가 우수한 조성물을 얻을 수 있다.

Description

지방줄기세포 배양액 추출물과 하수오 줄기세포 배양 추출물을 함유하는 육모 또는 양모용 조성물{Hair Care Composition Containing Human Adipocyte Conditioned Media Extracts and Pleuropterus Multiflorus Stem Cell Culture Extracts for Hair Growth}
모발의 육모 및 양모를 증진시키는 지방줄기세포 배양액 추출물과 하수오 줄기세포 배양 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것이다.
모발은 포유동물 특유의 피부 부속기관으로 발생학적으로 표피에서 유래한 기관이다. 모발은 더위, 추위, 마찰 등으로부터 신체를 보호하는 보호기능, 성적 특징 및 장식의 기능을 갖는다. 모발은 케라틴 단백질로 구성되어 있으며 표피 안쪽의 모낭(Hair follicle)으로 둘러싸인 모근(Hair root)과 피부표면 밖으로 나온 모간(Hair shaft)으로 구분한다. 모발의 주성분인 케라틴 단백질을 구성하고 있는 것은 아미노산이다. 아미노산에는 천연 보습인자가 함유되어 있어 모발을 물에 넣으면 이 수분량이 35%까지 상승한다.
건강한 모발은 광택이 있고 윤이 나고 생생하며 수분이 충분히 함유되어 있어야만 한다. 하지만 현대인들은 대기 오염, 자외선 량 증가, 스트레스, 음주, 과로 등으로 신체적, 정신적 건강을 유지하기가 힘들어졌으며 모발의 건강도 위협을 받고 있다. 모발도 피부와 같이 손상받기는 쉬우나 회복되기까지는 몇 배의 노력과 시간을 투자해야 하고 일단 손상된 모발은 원래의 건강함을 지닌 모발로 회복시키기가 사실상 힘들다.
모발은 중심에 수질이 있고 그 주위를 피질이 둘러싸고 있으며 모표피가 그 위를 커버하고 있다. 그 중에서도 중요한 것은 전체의 90%를 차지하고 있는 피질 부분이다. 모표피(Cuticle)는 모발의 맨 바깥층은 케라틴이라는 단백질로 이루어져 있다. 비늘이나 기와 모양의 각질세포로 되어 있으며 외부자극으로부터 피질을 보호하고 수분증발을 억제한다. 일반적으로 모발이 손상되었다고 하면 이 큐티클 층이 손상된 것을 말한다. 피질(Cortex)은 모발의 가장 중요한 부분으로 모발의 탄력성, 유연성, 색상 등을 결정하며 천연보습 인자의 함유로 수분을 일정하게 보유하고 있다. 수질(Medulla)은 주성분이 케라틴으로 모근 중심이고 가운데가 비어 있는 죽은 세포로 싸여 있다.
모발에는 손상된 모발을 건강한 모발로 다시 태어나게 할 수 있는 모주기(Hair cycle)가 있다. 모주기는 성장주기에 따라 세포분열이 왕성한 성장기(Anagen), 더 이상 성장하지 않고 퇴화하는 퇴화기(Catagen), 모발이 빠지는 휴지기(Telogen)가 있는데 정상 어른 두피의 경우 모낭의 80-90%는 성장기이고 나머지의 대부분은 휴지기이며 퇴화기는 전체의 1% 이하이다. 모세혈관이 활동을 하여 모발이 자라나는 성장기를 거쳐 빠질 준비를 하는 퇴행기로 접어든다(기간은 2-3주). 다음 3-4개월의 휴지기 후에 새로운 모발에 밀려 빠지게 된다. 모주기는 여성의 경우 4-6년, 남성은 2-5년이며 한달에 1-1.5cm 정도 자란다. 보통 사람의 머리카락 숫자는 10-12만개 정도이고 하루 평균 50-100가닥 정도 빠지는 것이 정상이다. 머리카락의 성장 속도는 남녀 모두 20대에 가장 빠르고 나이가 들수록 늦어진다.
누구나 매일 머리카락이 빠지지만 지나친 탈모는 문제가 된다. 건강한 사람의 머리카락은 하루에 50-60개씩 빠지므로 다소의 탈모는 자연스러운 현상이나 하루 100개 이상의 탈모는 주의해야 한다. 계절적으로는 가을에 탈모가 가장 심한데 그 이유는 여름의 강한 자외선에 머리카락이 상하고 날씨가 건조해 수분을 쉽게 잃기 때문이다. 탈모억제를 위한 가장 좋은 대책은 두피의 혈행 촉진이다. 머리를 감을 때 트리트먼트를 하여 두피를 튼튼히 하고 영양을 충분히 공급한다. 특히 두피 마사지는 피지 분비를 원활하게 하고 혈액 순환도 좋게 하여 탈모 치료에 효과적이다. 동시에 모발 생성을 촉진하는 우유, 계란 등의 고단백 식품과 비타민A, P, E 등이 많이 함유된 야채를 많이 섭취하여 충분한 영양을 주고 수면을 충분히 하는 것도 필요하다. 아울러 심리적으로 스트레스, 긴장, 근심 등으로 혈액 순환이 나빠지는 경우 모발의 발육이 멈추고 탈모 현상이 일어나는 '신경성 탈모증'이 일어날 수 있으므로 평상시 편안한 마음을 갖는 생활이 필요하다.
탈모방지를 위해 다양한 모발관련 화장품, 의약품, 미용기기, 의료기기 및 건강식품 등이 개발되어 판매되고 있고, 특히 탈모방지 샴푸나 헤어토닉 등과 같은 두피에 작용하여 혈행촉진 등과 같은 효과를 통해 육모와 탈모방지 효과를 부여하는 다양한 제품 등도 개발되고 있다. 최근에는 사람의 줄기세포를 활용한 다양한 치료 방법들도 개발되어 활용되고 있으나 탁월한 효과를 보이진 않는다. 뿐만아니라 민간요법에 근거한 다양한 식물추출물들이 육모와 양모효과를 위해 활용되고 있으나 이 또한 탁월한 효과를 보이진 않는다.
한편, 생화학 및 분자생물학의 발전을 기반으로 하여 우리 생체 내에 존재하는 성장인자와 같은 소량의 신호물질들이 발견되었으며, 이를 기반으로 한 생체의 노화이론이 재정립되고 있는 중이다. 또한 이 신호물질은 나이가 증가함에 따라 생체 내에서 감소하게 되는데 바로 이 성장인자의 감소가 우리의 노화와 밀접한 관계가 있고 이런 노화현상으로 인한 탈모의 원인으로 밝혀지고 있다. 이러한 성장인자들은 각 조직의 기저에 존재하고 있는 줄기세포에서 다량 생산되고 있다.
우리 몸은 약 210여 가지의 세포들로 구성되어 있고 각각의 세포는 고유의 특성을 유지하면서 생명활동을 담당하고 있다. 모든 생명체가 생명이 있듯이 우리 몸의 각각의 세포는 수명이 있고 끊임없이 죽고 대신 새로운 세포로 채워지게 된다. 바로 이러한 과정을 가능하게 하는 것이 줄기세포이다.
줄기세포는 조직이나 기관의 분화된 세포들 사이에 존재하는 미분화 세포로써, 끊임없이 스스로 증식하는 자가 재생능력(Self Renewal)과 신체 내의 모든 조직세포로 분화할 수 있는 능력(Differentiation to specific tissue)을 가진 만능세포이다.
줄기세포는 또 크게 배아줄기세포, 성체줄기세포로 나누어진다. 줄기세포는 출생 후부터 우리 몸에 있는 여러 종류의 조직에 존재하는 성체줄기세포(Adult Stem Cell)와 인간 생명의 시초가 되는 수정란에서 유래하는 배아줄기세포(Embryonic Stem Cell)의 두 종류로 구분될 수 있다. 줄기세포가 어떤 세포로 분화되느냐 하는 것은 그 줄기세포를 어떠한 환경에서 배양하느냐에 따라 좌우된다.
성체줄기세포는 조혈모세포, 중간엽줄기세포, 신경모세포, 상피모세포 등이 존재하며 조혈모세포의 경우 혈구 및 임파구를 생산할 수 있는 모세포로서 혈액암을 포함한 면역계 질환 치료에 도움이 되고, 중간엽 줄기세포의 경우 뼈, 연골, 지방 및 섬유조직으로 분화되며 각 조직이 손상되었을 때 이들의 회복에 관여한다. 그러나 이러한 성체 줄기세포는 각각의 조직에 소량 존재하며 수년간 분열 혹은 증식을 하지 않고 잠잠하게 지내기도 한다. 즉, 줄기세포라 함은 이러한 분화능력은 가지고 있으나, 아직 분화는 일어나지 않은 '미분화'세포 이다. 이러한 미분화 상태에서 적절한 조건을 맞춰주면 줄기세포는 다양한 조직 세포로 분화할 수 있다.
현재 의약품 및 화장료 조성물에 많이 사용되고 있는 인간 유래 지방줄기세포 배양액 추출물(Human adipocyte conditioned media extracts)은 지방조직에서 지방을 제거한 세포를 여러 세대 배양해 줄기세포를 분리해 낸 후, 줄기세포 배양액으로부터 줄기세포가 만들어낸 단백질을 얻을 수 있다. 이 단백질 혼합물에는 vEGF(혈관내피성장인자), TGF(형질전환성장인자), HGF(간세포증식인자), FGF(섬유아세포성장인자), IGF(인슐린유사성장인자) 등 150여 가지의 성장인자(growth factor) 단백질 성분을 포함하고 있는 것으로 보고되고 있다. 지방줄기세포는 성체줄기세포의 한 종류로써 골수줄기세포나 제대혈 줄기세포보다 채취하기가 쉽고 대량배양이 가능하면서도 줄기세포 함유량이 많기 때문에 지방줄기세포가 가장 많이 활용되고 있다.
하나의 세포가 증식하고 다른 종류로 분화하는데 있어서 가장 중요한 역할을 하는 것이 바로 성장인자(growth factor)이다. 이 성장인자는 세포가 증식 또는 분화를 일으키는 신호를 세포 내부로 전달하는 역할을 하며, 이러한 신호를 바탕으로 세포는 분열, 분화를 하게 되어 피부 및 모발을 생생하고 생기롭게 가꾸어주며 언제나 피부와 모발의 컨디션을 신선하고, 최상으로 만들어주는 상태를 유지할 수 있다. 줄기세포로부터 만들어낸 단백질들을 피부의 섬유아세포(fibroblast)에 처리하자 섬유아세포에서 생성되는 결합조직인 콜라겐의 양이 5배 이상 증가했으며, 섬유아세포 자체의 증식도 30% 이상 증가했다. 섬유아세포는 피부의 진피층을 형성하는 콜라겐을 생산하는 세포이며 콜라겐의 양이 줄어들면 피부 탄력이 줄고 주름이 늘어나는 특징을 가지고 있다. 줄기세포는 다 분화능을 지닌 세포로서 in vitro 뿐만 아니라 in vivo 조건에서 뼈, 연골, 인대, 지방, 심근, 근육 등의 세포로의 분화 능력을 지니고 있는 다분화능 세포이다. 이러한 다분화능 세포인 줄기세포는 각 조직 세포로의 분화기전 연구에 있어 좋은 모델로 이용되고 있을 뿐만 아니라, 현재 다양한 세포 치료법 개발에 이용되고 있다.
의약품과 화장품 분야에서의 줄기세포의 이용은 그 대사산물로서의 성장인자를 이용하는 것이다. 성장인자들은 세포의 표면에 있는 수용체와 결합하여 세포의 증식과 분화를 자극하는 작용을 하는 단백질이다. 성장인자들의 기능은 매우 다양하여 여러 가지 세포에 분열을 자극하는 작용을 하기도 하는 반면, 어떤 경우에는 특이한 세포형에만 작용하기도 한다. 성장인자는 세포 증식의 자극을 위해서 필수적인 성분으로서 세포 분화, 이주, 증식과정을 조절한다는 것이 밝혀졌다. 특이적 수용체에 성장인자가 결합하게 되면 신호 전달 사슬을 활성화하여 세포의 외부로부터 내부의 핵으로 신호가 전달된다. 신호 전달이 계속되면 다량의 다른 전달자와 같이 작용하여 최종적으로 새로운 단백질이 합성된다. 그러므로 성장인자는 세포간 상호작용의 전달, 기능 제어에 있어서 중요한 신호 전달 네트워크를 형성하게 된다. 또한 생쥐를 대상으로 한 피부 상처 재생 실험 결과에서도 줄기세포 유래 단백질을 적용했을 때 적용하지 않은 경우보다 상처 크기가 40%이상 줄어드는 것을 확인할 수 있다. 아울러 색소침착 인간을 대상으로 한 미백효과에서도 좋은 결과를 보여 화장품 원료로서 강한 효능효과 및 안전성을 확보하고 있다.
따라서 신경세포로 분화할 환경을 만들어 주면 신경세포가 되고, 피부세포로 분화할 환경을 만들어 주면 피부세포가 되며 모세포로 분화할 환경을 만들어 주면 모세포가 될 수 있는 것이다. 이러한 특성을 이용하여 화장품 조성물에 줄기세포배양 추출물을 응용하기 위한 연구가 진행되고 있다.
식물에도 줄기세포가 있으며, 식물줄기세포도 인체 유래 줄기세포와 마찬가지로 강한 분화능력과 재생능력이 있다. 또한 인체 유래 줄기세포와 같은 윤리적 문제나 안전성 문제가 없어, 최근에 식물줄기세포의 활용에 대한 관심이 점점 높아지고 있다.
식물에는 싹 말단 생장점 (SAM, shoot apical meristem)과 뿌리 말단 생장점 (RAM, root apical meristem)에 줄기세포가 존재한다. 이 식물줄기세포는 고유의 성격대로 분화하여 뿌리와 줄기 등과 같은 식물의 조직과 기관을 새롭게 만드는 기능을 한다. 이러한 식물줄기세포를 다능성(pluripotent) 줄기세포로 분류하는데, 전형적인 기능을 통하여 다양한 기관을 형성할 능력을 가지고 있다는 개념이다. SAM과 RAM에 존재하는 줄기세포는 분화를 통하여 식물의 성장을 이룩하는데, 줄기세포의 분화 및 줄기세포 밀도를 유지하는 것은 SAM과 RAM에서 이웃하고 있는 OC (organizing center) 또는 QC (quiescent center) 세포들과의 관계에 의하여 조절된다. 식물은 동물과 달리 전분화능력 (totipotency)이 있음은 1902년 호주의 식물학자 하버란트(Gottlieb Haberlandt)에 의하여 밝혀졌다. 식물의 전분화능은 식물세포가 다른 type의 세포나 식물체 전체로 분화할 수 있는 능력을 말한다.
식물체를 탈분화 (de-differentiation)시켜, 미분화(un-differentiated) 세포인 캘러스(callus)를 얻을 수 있다. 식물체를 표면살균하고 잘라 상처를 내고, 적절한 식물호르몬 농도를 함유한 고체배지(solidified medium)에서 배양하면 캘러스 세포를 얻을 수 있다. 캘러스 세포는 그 상태로 계속 배양하거나, 액체배지에서 배양하여 현탁배양(suspension culture)을 이룰 수 있으며, 이를 통하여 많은 양의 세포를 얻을 수 있다. 캘러스 세포는 배지의 식물호르몬 농도 조절을 통하여 배 (embryo)를 발생시키고, 다시 뿌리나 싹을 형성시킬 수 있다. 이렇게 발생한 배 (embryo)나 싹, 뿌리는 발아 또는 성장을 통하여 완전한 식물체로 발전한다. 따라서 미분화 세포인 캘러스 세포는 줄기세포의 능력을 가지고 있어 줄기세포라 불릴 수 있다. 세포 치료 대상 세포로서의 응용적 측면에서 볼 때, 중간엽 줄기세포는 세포의 채취가 상대적으로 쉽고 안전하며 자가 이식이 가능하다는 점에서 배아줄기세포에 비해 많은 장점을 가지고 있다.
대한민국 특허출원 제2005-55017호에는 동종유래 및/또는 자기유래 지방세포, 동종유래 및/또는 자기유래지방세포로부터 분리한 줄기세포 또는 이들로부터 분리된 섬유아세포성장인자를 함유하는 주름개선 및/또는 노화방지용 함유하는 화장료 조성물이 공지되어 있으며, 대한민국 특허등록 제848056호 발명은 줄기세포 배양액 또는 그 배양액에서 분리된 단백질을 포함하는 미백용 화장료 조성물이 공지되어 있고, 대한민국 특허출원 제2007-15211호에는 인간 지방줄기세포를 항산화제, 비타민, 아미노산 및 무기질이 포함된 무혈청 배지에서 1일 이상 배양하여 수득한 조건배지를 함유하고, 조직 재생용 인간 줄기세포 함유 주사제에 사용되는 주사제용 첨가제가 공지되어 있다.
이에 본 발명자들은 이미 피부에 사용하여 피부 노화현상을 개선시킬 목적으로 다양하게 사용하고 있지만 그 효능이 아직은 미비한 인체유래 지방줄기세포 배양액 추출물과, 육모 및 양모 효과를 위해 오랫동안 민간요법으로 활용되어온 하수오로부터 줄기세포를 유도한 후 이를 배양하여 얻은 하수오 줄기세포 배양 추출물을 조합하는 경우, 인체 유래 지방줄기세포 배양액 추출물이 갖는 육모 효과와 상승작용하여 매우 우수한 육모 및 양모 효과를 나타낸다는 것을 발견하였다. 이에 인체 유래 지방줄기세포 배양액 추출물과 하수오 줄기세포 배양 추출물을 조합하여 육모 및 양모 효과를 극대화함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 인체 유래 지방줄기세포 배양액 추출물과 하수오 줄기세포 배양 추출물을 함유하는 육모 또는 양모용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 인체 유래 지방줄기세포 배양액 추출물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 20.0 중량% 함유되고, 상기 하수오 줄기세포 배양 추출물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 30.0 중량% 함유된다.
바람직하게는, 상기 조성물은 헤어토닉, 헤어트리트먼트, 샴푸, 린스, 헤어 에센스, 헤어팩, 헤어스프레이, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이크림, 세럼, 영양크림, 미스트, 오일, 비누, 맛사지크림, 클렌징크림, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 클렌징폼오일, 파우더, 엣센스, 팩, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 제형이다.
본 발명에 따른 인체 유래 지방줄기세포 배양액 추출물과 하수오 줄기세포 배양 추출물을 함유한 조성물은 매우 우수한 피부노화 방지, 육모 및 양모 효과를 나타낸다. 구체적으로, 피부노화 방지 및 육모 효과가 미비하지만 그 자체가 갖고 있는 상징성으로 인해 많이 사용되고 있는 인체 유래 지방줄기세포 배양액 추출물의 육모 효과를 하수오 줄기세포 배양 추출물과 함께 사용하는 경우 시너지 효과가 발생하여 매우 우수한 육모 효과를 나타낸다.
도 1은 C57BL/6 마우스를 대상으로 기간에 따른 육모 효과를 육안으로 관찰한 결과를 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명에서 '인체 유래 지방줄기세포 배양액 추출물'은 지방줄기세포를 배양하여 얻을 수 있는 배양액 및 배양한 지방줄기세포를 파쇄하여 얻을 수 있는 모든 추출물을 포함한다.
본 발명에서 '하수오 줄기세포 배양 추출물'은 본 발명을 위해 선정된 하수오를 각각 탈분화(de-differentiation)시켜, 미분화(un-differentiated) 세포인 하수오 캘러스(callus)를 유도하여 얻을 수 있다. 좀 더 자세하게는 본 발명을 위해 선정된 하수오 잎 표면을 살균하고 잘라 상처를 내고, 적절한 식물호르몬 농도를 함유한 고체배지(solidified medium)에서 배양하면 캘러스 세포를 얻을 수 있다. 캘러스 세포는 그 상태로 계속 배양하거나, 액체배지에서 배양하여 현탁배양 (suspension culture)하여 많은 양의 하수오 줄기세포 상태인 캘러스를 얻을 수 있다.
본 발명은, 인체 유래 지방줄기세포 배양액 추출물과 하수오 줄기세포 배양 추출물을 함유하는 조성물을 제공한다.
상기 인체 유래 지방줄기세포 배양액 추출물은 배아줄기세포를 제외한 성체로부터 얻어지는 줄기세포 배양액 추출물을 의미한다. 상기 인체 유래 지방줄기세포 배양액 추출물의 유효 성분은 주로 세포의 성장을 조절하는 펩타이드와 단백질로서, 예를 들면 PDGF(혈소판 유래 성장인자), Basic FGF(염기성 섬유아세포 성장인자), KGF(각질세포 성장인자), TGF-β1(형질변환성장인자), HGF(간세포 성장인자), VEGF(혈관내피 성장인자), 콜라겐, 파이브로넥틴, SOD(항산화 효소) 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 상기 인체 유래 지방줄기세포 배양액 추출물은 상기한 성장인자를 함유하고 있기 때문에 피부 구성세포인 섬유아세포 이동 촉진, 활성화 효과, 피부 재생 및 항노화 효과, 콜라겐합성 증가, 티로시나제의 활성 억제 효과, 멜라닌 합성 억제, 모발 성장 및 축소된 모낭 복원 효과를 기대할 수 있다.
본 발명의 인체 유래 지방줄기세포 배양액 추출물은 미국특허 제6,153,432호(2000.11.28)에서 명시된 방법으로 얻을 수 있다. 먼저, 지방 흡입술을 통해 얻어진 지방조직으로부터 지방줄기세포를 분리한다. 이를 기질 배지에 현탁시켜 배양 용기에 접종한 후 37℃, CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하여 지방줄기세포가 배양용기 바닥에 붙으면 기질 배지를 제거하고 분화배지(DIFFERENTIATION MEDIA)를 넣는다. 이를 3일 동안 배양한 후 지방세포 배지(adipocyte media)를 넣고 지방세포로 분화시킨다. 지방줄기세포의 분화 단계는 분화 초기에 세포질 내 작은 지질 방울의 형성이 시작되는 단계, 작은 지질 방울의 수가 점차 증가하는 단계, 그리고 작은 지질 방울들이 점점 합쳐져 큰 지질 방울을 형성하는 단계를 거치면서 성숙하고, 완전히 성숙하면 한 개의 지질 방울이 세포질 전체를 차지하게 되며 성숙과정 동안 세포의 크기도 점차 증가하게 된다. 이와 같은 지방유래 세포를 얻는 단계에서, 배양 배지를 무혈청 DMEM 배지로, 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF; basic Fibroblast Growth Factor) 및/또는 표피세포 성장 인자(EGF; Epidermal Growth Factor)를 각각 0.1∼100 ng/㎖ 농도로 더욱 포함하는 DMEM 배지로 배양하여 얻어진 배양액을 분리 정제하여 본 발명의 인체 유래 지방줄기세포 배양액 추출물로 사용하였다.
본 발명의 하수오 줄기세포 배양 추출물은 하수오(Pleuropterus multiflorus) 잎 또는 줄기 표면을 살균하고, 상처를 낸 후, M&S(Murashige & Skoog's) 고체배지 위에 치상하여 캘러스 줄기세포를 유도한다. M&S 고체배지에 식물호르몬인 옥신과 싸이토카인 농도를 배지에 0.01mg/l 내지 10mg/l로 바람직하게는 0.1mg/l 내지는 1mg/l로 각 식물에 적절하게 적용하여 캘러스 유도효과를 극대화 시킨다. 이렇게 하여 얻어진 Totipotent embryogenic stem cell인 캘러스 줄기세포량을 보다 많이 확보하기 위해서는 성장속도를 높일 수 있는 액체배양을 하는 것이 바람직하다. 현탁배양기(gyrotory shaker)에는 위에서 언급한 M&S 액체배지를 이용하여 유도된 하수오 캘러스를 1g/l 내지 50g/l, 바람직하게는 10g/l 내지 20g/l로 접종하여 현탁배양을 통하여 많은 양의 줄기세포를 확보할 수 있고, 대량생산을 위해서는 Bioreactor를 활용하는 것도 좋은 방안이다. 이렇게 얻어진 하수오 줄기세포를 저온에서 압착추출(squeeze)하여 본 발명의 하수오 줄기세포(캘러스) 배양추출물을 얻는다.
본 발명은 지방 흡입술을 통해 얻어진 지방조직으로부터 지방줄기세포를 분리한 뒤 배양하여 얻은 인체 유래 지방줄기세포 배양액 추출물과 하수오 잎 표면으로부터 유도해낸 줄기세포인 하수오 캘러스 배양 추출물을 본 발명을 위해 최적의 상태로 조합하여 이를 조성물에 함유시키는 것을 특징으로 한다.
인체 유래 지방줄기세포 배양액 추출물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 20.0 중량% 함유되고, 하수오 줄기세포 배양 추출물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 30.0 중량% 함유된다.
본 발명의 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 본 발명을 위해 조합한 인체 유래 지방 줄기세포 배양액 추출물과 하수오 줄기세포 배양 추출물 이외에 육모, 양모 및 두피 건강에 영향을 주는 다양한 성분들, 의약품이나 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없는데, 예를 들면, 헤어 에센스, 헤어 토닉, 샴푸, 린스, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이크림, 영양크림, 파우더, 에센스, 팩 등의 제형을 가질 수 있다. 또한, 각 제형의 조성물에 있어서, 육모효능을 증진시킬 목적으로 상기한 인체 유래 지방줄기세포 배양액 추출물과 하수오 줄기세포 배양 추출물을 포함하여 이외의 성분들을 조성물의 제형 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
이하, 실시예, 비교예 및 실험예에 의해 본 발명을 보다 명확하게 설명한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<제조예 1> 인체 유래 지방줄기세포 배양액 추출물 제조
본 발명을 위해 인체 지방줄기세포 배양액 추출물은 지방 흡입술을 통해 얻어진 지방조직으로부터 지방줄기세포를 분리하고, 이를 기질 배지에 현탁시켜 배양 용기에 접종한 후 37℃, CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하여 지방줄기세포가 배양용기 바닥에 붙으면 기질 배지를 제거하고 분화배지(DIFFERENTIATION MEDIA)를 넣는다. 이를 3일 동안 배양한 후 지방세포 배지(adipocyte media)를 넣고 지방세포로 분화시킨다. 지방줄기세포의 분화 단계는 분화 초기에 세포질 내 작은 지질 방울의 형성이 시작되는 단계, 작은 지질 방울의 수가 점차 증가하는 단계, 그리고 작은 지질 방울들이 점점 합쳐져 큰 지질 방울을 형성하는 단계를 거치면서 성숙하고, 완전히 성숙하면 한 개의 지질 방울이 세포질 전체를 차지하게 되며 성숙과정 동안 세포의 크기도 점차 증가하게 된다. 이와 같은 지방유래 세포를 얻는 단계에서, 배양 배지를 무혈청 DMEM 배지로, 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF; basic Fibroblast Growth Factor) 및/또는 표피세포 성장 인자(EGF; Epidermal Growth Factor)를 각각 0.1∼100 ng/㎖ 농도로 더욱 포함하는 DMEM 배지로 배양하여 얻어진 배양액을 분리 정제하여 본 발명의 지방줄기세포 배양액 추출물로 사용하였다.
<제조예 2> 하수오 줄기세포 배양 추출물 제조
본 발명의 하수오 줄기세포 배양 추출물은 하수오(Pleuropterus multiflorus) 잎 또는 줄기 표면을 살균하고, 상처를 낸 후, M&S(Murashige & Skoog's) 고체배지 위에 치상하여 캘러스 줄기세포를 유도하였다. M&S 고체배지에 식물호르몬인 옥신과 싸이토카인 농도를 배지에 0.5mg/l로 각 식물에 적절하게 적용하여 캘러스 유도효과를 극대화시킨다. 이렇게 하여 얻어진 Totipotent embryogenic stem cell인 캘러스 줄기세포량을 보다 많이 확보하기 위해서는 성장속도를 높일 수 있는 액체배양을 하는 것이 바람직하다. 현탁배양기(gyrotory shaker)에는 위에서 언급한 M&S 액체배지를 이용하여 유도된 하수오 캘러스를 15g/l로 접종하여 현탁배양을 통하여 많은 양의 줄기세포를 확보하였다. 이렇게 얻어진 하수오 줄기세포를 저온에서 압착추출(squeeze)하여 본 발명의 하수오 줄기세포(캘러스) 배양추출물을 얻었다.
< 실시예 1> 본 발명에 따른 인체 유래 지방줄기세포 배양액 추출물과 하수오 줄기세포 배양 추출물을 함유하는 조성물의 제조
상기 제조예 1 및 제조예 2에 의해 제조된 인체 유래 지방줄기세포 배양액 추출물과 하수오 줄기세포 배양 추출물을 포함하는 조성물(실시예 1)을 제조하였다.
성분 단위:중량%
실시예 1 비교예 1 비교예 2
인체유래지방줄기세포배양액 추출물(제조예 1) 5.0 5.0 0.0
하수오 줄기세포 배양 추출물(제조예 2) 5.0 0.0 5.0
A 세토스테아릴알콜 2.0 2.0 2.0
글리세릴스테아레이트 1.5 1.5 1.5
마이크로크리스탈린 0.7 0.7 0.7
스쿠알란 5.0 5.0 5.0
유동파라핀 3.0 3.0 3.0
트리옥타노인 5.0 5.0 5.0
폴리솔베이트 60 1.2 1.2 1.2
솔비탄스테아레이트 0.5 0.5 0.5
싸이크로메치콘 3.0 3.0 3.0
토코페릴아세테이트 0.2 0.2 0.2
BHT 0.05 0.05 0.05
정제수 잔량 잔량 잔량
B
농글리세린 4.0 4.0 4.0
1,3-부틸렌글리콜 2.0 2.0 2.0
산탄검 0.1 0.1 0.1
EDTA-2Na 0.05 0.05 0.05
향,방부제 적량 적량 적량
100 100 100
< 실험예 1> Dermal papilla cell 의 증식 효과
Rat vibrissa immortalized dermal papilla cell(Filsell W, et al., 1994)을 100 units/mL penicillin-100 ug/mL streptomycin(Gibco Inc, NY, USA)과 10heat-inactivated fetal bovin serum(FBS; Gibco Inc, NY, USA)이 함유된 DMEM(Hyclone Inc, USA) 배지를 사용하여 37°C, 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대배양하였다. Rat vibrissa immortalized dermal papilla cell의 증식은 MTT assay를 이용하여 측정하였다. Dermal papilla 세포 (1.0×104 cells/mL)를 96well plate에 넣고 24시간 배양 후 serum-free DMEM 배지로 교환하여 다시 24 시간 배양한 다음 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2를 각각 1, 10, 50 및 100㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 양성 대조군인 minoxidil sulfate(Sigma, USA)는 1μM의 농도로 처리한다. 4일 동안 배양한 후 50 uL의 MTT(Sigma, MO, USA)을 첨가하고 4시간 동안 반응시킨다. 상층액은 제거하고 DMSO 200 uL을 가하여 침전물을 용해시킨 후 microplate reader(Amersh-am Pharmacia Biotech, NY, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정한다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 증식 정도를 조사하여 아래 표 2에 나타내었다.
Dermal papilla cell의 증식 효과
농도
Dermal papilla cell의 증식(%)
minoxidil sulfate (μM) 실시예 1 비교예 1 비교예 2
무처리 - - - -
1 36.0 42.1 24.1 10.2
10 79.9 82.5 53.9 38.7
50 92.5 95.7 78.3 51.1
100 97.2 97.7 83.6 75.9
표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1(인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 하수오 줄기세포 배양 추출물)의 Dermal papilla cell의 증식 효과를 평가한 결과 실시예 1은 Dermal papilla cell의 증식 효과가 우수함을 알 수 있었다. 특히, 실시예 1의 Dermal papilla cell의 증식 효과는 양성 대조군인 minoxidil sulfate와 유사한 Dermal papilla cell의 증식효과를 보였다. 따라서, 실시예 1에 사용한 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 하수오 줄기세포 배양 추출물이 모낭성장에 우수한 효과(육모 효과 및 양모 효과)를 나타냄을 알 수 있었다.
< 실험예 2> 5α- reductase 억제 효과
5α-reductase 활성은 rat prostate 5α-reductase를 이용하여 첨가한 [3H]testosterone(T)이 [3H]dihydrotestosterone (DHT)로 전환되는 양을 가지고 평 가하였다. 7~8주령 된 Wistar rat 수컷을 에틸 에테르로 마취시킨 후 경추 도살하여 전립선을 적출하고, 곧바로 액체 질소에 넣어서 보관하고 실험마다 필요한 양의 전립선을 꺼내어 사용하였다. 전립선을 4℃ homogeniger buffer(20 mM potassium phosphate, pH6.5, 0.32 M sucrose, 0.1 mM dithiothreitol (DTT))를 넣은 glass homogeniger에 넣고 뿌옇게 될 때까지 분쇄하였다. 원심분리(1000rpm, 10분, 4℃) 후 cell free extract를 얻은 후에 다시 원심분리(24,000rpm, 90분, 4℃)하여 상층액을 제거하였고, pellet에 homogenizer buffe를 넣어서 suspension하여 crude enzyme으로 사용하였다. 5α-reductase assay는 다음과 같이 수행하였다. 마이크로튜브에 crude enzyme과 시료 및 reaction buffer(40m M potassium phosphate, pH 6.5, 50uM NADPH, 120nCi[1,2,6,7-3H]T)를 넣어 최종 반응액을 500 uL로 맞춘 후, 37℃에서 30분간 반응시켰다. 1mL의 에틸 아세테이트를 넣고 원심분리(1000g, 10분)하여 상층액을 취해서 새로운 마이크로튜브로 옮긴 후, speed vac을 이용하여 완전히 건조한다. 마이크로튜브에 50uL의 에틸 아세테이트를 넣고, TLC plate에 spotting하고 전개용매(50% 사이클로헥산, 50% 에틸 아세테이트)하에서 2회 전개한다. UV spectrometer로 254nm에서 T(testosterone)을 확인하고 10% 황산을 뿌려서 DHT(dihydro testosterone)를 확인 후 T와 DHT 부위를 가위로 오려내서 각각의 scintilation vial에 넣고 cocktail 10 mL을 넣어 β-counter로 측정한다. 5α-reductase 활성에 의한 테스토스테론의 전환율을 DHT/(T+DHT)의 비로 계산하여 아래 표 3에 나타내었다.
5α-reductase 억제 효과
농도 5α-reductase 억제 효과(%)
minoxidil sulfate
(μM)
실시예 1 비교예 1 비교예 2
무처리 - - - -
1 22.3 30.4 17.5 28.7
10 47.8 53.7 36.3 55.0
50 63.5 78.4 51.6 72.8
100 81.9 90.2 69.4 86.6
표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1은 매우 우수한 5α-reductase 억제 효과를 나타냄을 알 수 있다. 특히 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 하수오 줄기세포 배양 추출물을 함께 사용하였을 때의 5α-reductase 억제 효과는 양성 대조군인 minoxidil sulfate 보다 높은 5α-reductase 억제 효과를 보여, 실시예 1이 우수한 육모 효과 및 양모 효과가 있음을 알 수 있다.
< 실험예 3> C57BL /6 마우스를 활용한 육모 효능 평가
발모, 양모 및 탈모 방지 등의 효과를 평가하기 위한 실험동물 모델로는 붉은 꼬리원숭이(stump tailed macaque), 토끼(rabbit), 햄스터(hamster), 마우스(mouse) 등이 있다. 본 연구에 사용된 C57BL/6 마우스는 체모가 검정색이고, 자연적 탈모(spontaneous alopecia)가 일어난다. 또한, 멜라노사이트가 모낭에만 한정적으로 존재하고 멜라닌 합성이 모발성장주기와 잘 일치되어 피부색으로 모발의 성장주기를 판정할 수 있는 장점을 가져 모발생리 연구에 널리 이용되고 있다 (Paus R, et al., 1999; Slominski A, et al., 1993; Slominski A, et al., 1994). C57BL/6 마우스는 7주령부터 모발주기가 휴지기로 들어간다고 알려져 있고(Paus R, et al., 1999;. MS, et al., 2001) 휴지기에 들어간 마우스는 털을 깎았을 때 피부색이 분홍색을 띄었고 실험을 진행함에 따라 피부색은 회색 그리고 검정색으로 변해갔다. 육모 효과를 살펴보기 위해 마우스 등 부위를 소동물용 clipper로 삭발하여 털을 완전히 제거한 후 상기 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2를 각각 200 ㎍씩 제모부위에 떨어뜨린 다음에 두드리면서 도포하고 그 이후로는 이틀에 한 번씩 도포했다.
실험 시작 후 0일, 7일, 14일, 21일, 28일 및 35일에 털이 자라는 상태를 육안으로 확인하여 도 1에 나타내었다.
실시예 1, 비교예 1, 비교예 2 순으로 관찰하였다. 제모 후 28일 이후부터 실시예 1은 완전히 성장하였으며, 35일에서는 본 발명의 인체 유래 지방줄기세포 배양액 추출물과 하수오 줄기세포 배양 추출물을 각각 5.0%씩 함유한 비교예 1과 비교예 2에서도 육모 효과가 확실히 나타났다.
< 실험예 4> 피부 안전성 시험
실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2에 대한 피부 안전성 시험을 실시하였다.
피검자 20명(평균연령 29.5세, 연령분포 18세-30세)을 대상으로 Haye's Test Chamber를 이용하여 상박에 피부 첩포시험(Patch Test)을 실시하였다. 단, 건선(Psoriasis), 습진(Eczema), 기타 피부병변 보유자나 임신, 수유부 또는 피임제, 항히스타민제 등을 복용하고 있는 사람은 본 실험의 피검자에서 제외하였다. 시험부위를 70% 에탄올로 닦아낸 뒤 건조시키고, 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2를 각각 15μg씩 Chamber에 적하시킨 후, 시험 부위인 상박 부위에 얹어 고정시켰다. 첩포는 24시간 동안 도포하고 첩포를 제거한 후에는 Marking Pen으로 시험부위를 표시하여 각각 24시간, 48시간 후에 시험부위를 관찰하였다. 판정은 첩포 제거 24시간, 48시간 후에 행하였으며, 피부반응은 하기 표 4의 국제접촉피부염연구회(International Contact Dermatitis Research Group:ICDRG)의 규정에 따라 판정하였다. 시험결과는 하기 표 5에 나타내었다.
국제접촉피부염연구회의 판정 기준
기호 판 정 기 준 평 가 Mean Score
±
+
++
+++
-
Doubtful or slight reaction and erythema
Erythema + Induration
Erythema + Induration + Vesicle
Erythema + Induration + Bullae
Negative
미소자극
경자극
중자극
강자극
무자극
0~0.9
1.0~2.9
3.0~4.9
5.0이상
0
피부 안전성
경과시간 실시예 1 비교예 1 비교에 2
24시간 0 0 0
48시간 0 0 0
표 5에서 알 수 있는 바와 같이, 피부안전성 시험 결과, 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2 모두 평균 자극정도가 0으로 피부에 자극이 없는 안전한 조성물임을 알 수 있다.
<실험예 5> 조성물의 제형 안정성 시험
상기 본 발명의 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 하수오 줄기세포 배양 추출물을 함유한 조성물에 대한 제형의 안정성 시험을 실시하였다. 조성물의 안정성을 실험하기위해 상기 표 1의 실시예 1, 비교예 1, 비교예 2를 4℃와 45℃로 일정하게 유지되는 항온조에 투명 초자 용기에 담아 각각 4주 동안 보관한 후 분리, 변색 및 변취(특이취) 정도를 비교 측정하였다. 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 이때 제품 분리, 변색, 변취 정도를 다음의 6등급으로 분류하여 평가하였다.
제품 변색 평가 기준 :
0: 변화 없음 1: 극히 조금 분리(변색, 변취)
2: 조금 분리(변색, 변취) 3: 조금 심하게 분리(변색, 변취)
4: 심하게 분리(변색, 변취) 5: 극히 심하게 분리(변색, 변취)
분리정도
온도 분리 변색 변취(특이취)
실시예3 비교예1 비교예2 실시예3 비교예1 비교예2 실시예3 비교예1 비교예2
45℃ 0 0 0 0 0 0 0 0 0
4℃ 0 0 0 0 0 0 0 0 0
상기 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 인체 지방줄기세포 배양액 추출물과 하수오 줄기세포 배양 추출물을 함유한 실시예 1과 인체 지방줄기세포 배양액 추출물만을 함유한 비교예 1, 하수오 줄기세포 배양 추출물만을 함유한 비교예 2 모두 분리, 변색 및 변취(특이취) 현상이 전혀 없어 안정한 기제임을 알 수 있다.

Claims (3)

  1. 인체 유래 지방줄기세포 배양액 추출물과 하수오 줄기세포 배양 추출물을 함유하는 육모 또는 양모용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 인체 유래 지방줄기세포 배양액 추출물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 20.0 중량% 함유되고, 상기 하수오 줄기세포 배양 추출물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 30.0 중량% 함유되는, 육모 또는 양모용 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 헤어토닉, 헤어트리트먼트, 샴푸, 린스, 헤어 에센스, 헤어팩, 헤어스프레이, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이크림, 세럼, 영양크림, 미스트, 오일, 비누, 맛사지크림, 클렌징크림, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 클렌징폼오일, 파우더, 엣센스, 팩, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 제형인, 육모 또는 양모용 조성물.
KR1020140097984A 2014-07-31 2014-07-31 지방줄기세포 배양액 추출물과 하수오 줄기세포 배양 추출물을 함유하는 육모 또는 양모용 조성물 KR101570808B1 (ko)

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