KR101992922B1

KR101992922B1 - 무항생제 무혈청 중간엽줄기세포배양액, 이의 제조방법 및 이를 이용한 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101992922B1
Application number: KR1020140021843A
Authority: KR
Inventors: 김은영; 박세필
Original assignee: 주식회사 미래셀바이오
Priority date: 2014-02-25
Filing date: 2014-02-25
Publication date: 2019-06-25
Also published as: KR20150100260A

Abstract

본 발명은 무항생제 무혈청 중간엽줄기세포배양액, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 무항생제 무혈청 기본 배양액을 사용하여 보다 안전한 중간엽줄기세포배양액을 생산하는 방법을 제공하며, 이를 포함하는 화장료 조성물은 피부 주름개선에 효과적이다.

Description

무항생제 무혈청 중간엽줄기세포배양액, 이의 제조방법 및 이를 이용한 화장료 조성물{NON-ANTIBIOTICS SERUM-FREE MESENCHYMAL STEM CELLS MEDIUM, METHOD FOR PREPARING THE SAME, AND COSMETIC COMPOSITION COMPRISING THE SAME}

본 발명은 무항생제 무혈청 중간엽줄기세포배양액, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 화장료 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 무항생제 무혈청 기본 배양액을 사용하여 보다 안전한 중간엽줄기세포배양액을 생산하는 방법에 관한 것이며, 이를 함유하는 피부 주름개선에 효과적인 화장료 조성물에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell) 는 자가 증식하고 다른 조직의 세포로 분화될 수 있는 세포로 우리 몸의 많은 조직에 존재한다. 성체줄기세포 중 가장 얻기 쉬우면서도 풍부하게 존재하는 줄기세포는 지방조직에서 획득될 수 있다. 최근, 지방조직은 다분화능 줄기세포의 소스로 지방조직뿐만 아니라 상피세포, 연골모세포, 골형성세포, 신경세포, 근육세포 등 다양한 조직을 재생한다고 밝혀졌다 (M. Brzoska et al., BBRC, 330:142, 2005; Y. Cao et al., BBRC, 332:370, 2005; K.M. Safford et al., BBRC, 294:371, 2005; H.A. Awad et al., Biomaterials, 25:3211, 2004; J. Fujimura et al., BBRC, 333:116, 2005).

줄기세포의 재생능력과 분화능력은 손상된 조직을 재생하는 등의 치료에 이용하기에 적합하므로, 이를 응용하기 위한 연구가 의료, 화장품 등 다양한 분야에서 현재 진행되고 있다. 하지만 국내에서 인체줄기세포 배양액을 이용한 제품이 생산되려면 원료 안정성검사를 통과한 다음에야 사용 가능하다. 따라서, 무항생제 무혈청 기본 배양액을 사용하여 보다 안전한 인체지방줄기세포 배양액을 생산할 필요성이 요구되며, 이를 사용하는 경우 피부개선에 효과적이면서도 인체에 무해한 화장료를 생산할 수 있다.

본 발명의 목적은, 무항생제 무혈청 배양 배지에서 중간엽줄기세포를 배양하여 수득되는 중간엽줄기세포 배양액 및 이의 제조 방법을 제공하여 인체에 사용하더라도 안전한 중간엽줄기세포 배양액을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 피부개선에 효과적이면서도 인체에 무해하도록, 상기 중간엽줄기세포 배양액을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 중간엽줄기세포 배양액은, 녹-아웃 혈청대체제를 포함하는 무혈청 무항생제 배지에서 중간엽줄기세포를 배양한 후, 배지의 상층액을 회수하여 수득한다.

상기 무혈청 무항생제 배지는 DMEM 또는 DMEM/F12 배지일 수 있다.

상기 중간엽줄기세포는 인체 지방조직, 골수조직, 양막조직, 탈락막조직, 제대조직 및 태반조직 중 어느 하나로부터 유래된 것일 수 있다.

상기 중간엽줄기세포 배양액은, 드레이즈(Draize) 테스트에 따른 피부자극시험에서 피부자극지수가 1 미만인 것일 수 있다.

상기 중간엽줄기세포 배양액은, 드레이즈(Draize) 테스트에 따른 안점막 자극시험에서 안점막 자극지수가 0.1 미만인 것일 수 있다.

상기 중간엽줄기세포 배양액은, 아쥬반트 스트립(Adjuvant and Strip) 테스트에 따른 광감작성 피부반응 시험에서 광감작성 지수가 0.1 미만인 것일 수 있다.

상기 중간엽줄기세포 배양액은, 모리카와(Morikawa) 테스트에 따른 광독성 피부반응 시험에서 광독성 지수가 0.1 미만인 것일 수 있다.

상기 중간엽줄기세포 배양액은, 멕시미제이션(Maximization) 테스트에 따른 피부 감작성 시험에서 감작지수가 0.1 미만인 것일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은, 상기 중간엽줄기세포 배양액을 포함한다.

본 발명의 중간엽줄기세포 배양방법은, 중간엽줄기세포를 준비하는 단계, 녹-아웃 혈청대체제를 포함하는 무혈청 무항생제 배지를 준비하는 단계, 상기 무혈청 무항생제 배지에서 중간엽줄기세포를 배양하는 단계, 및 상기 중간엽줄기세포를 배양한 배지로부터 상층액을 회수하여 수득하는 단계를 포함한다.

상기 무혈청 무항생제 배지에서 중간엽줄기세포를 배양하는 단계 전에, 상기 중간엽줄기세포를 배양억제제로 전처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 중간엽줄기세포는, 인체 지방조직, 골수조직, 양막조직, 탈락막조직, 제대조직 및 태반조직 중 어느 하나로부터 유래된 것일 수 있다.

본 발명의 중간엽줄기세포배양액 제조 방법을 사용하여 인체에 안전한 무항생제 무혈청 중간엽줄기세포배양액을 생산할 수 있으며, 이를 포함하는 본 발명의 화장료 조성물은 인체에 보다 안전하고 피부 주름개선에 효과적이다.

도 1은, 인체지방조직 유래 무항생제 무혈청 중간엽줄기세포배양액 회수 전과 회수 후의 중간엽줄기세포 상태를 나타낸 실체현미경 사진이다.
도 2는 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포를 검증하기 위하여 중간엽줄기세포 마커 (CD90 and CD105)로 조사하였을 때 형광물질의 발현을 확인한 형광현미경사진이다 (Scale bars: 200 ㎛).
도 3은, 인체지방조직 유래 무항생제 무혈청 중간엽줄기세포배양액 농도에 따른 프로콜라겐 함량을 나타낸 그래프이다.
도 4는, 인체지방조직 유래 무항생제 무혈청 중간엽줄기세포배양액 농도에 따른 VEGF (혈관내피성장인자) 함량을 나타낸 그래프이다.
도 5는, 인체지방조직 유래 무항생제 무혈청 중간엽줄기세포배양액 농도에 따른 총 단백질 함량을 나타낸 그래프이다.
도 6은, 인체지방조직 유래 무항생제 무혈청 중간엽줄기세포배양액을 포함하는 화장료의 피부노화완화 임상에 의한 눈가주름개선 정도를 나타낸 것이다.
도 7은, 인체지방조직 유래 무항생제 무혈청 중간엽줄기세포배양액을 포함하는 화장료의 피부장벽강화 임상에 의한 경피수분손실량 개선율을 나타낸 것이다.

줄기세포란 미분화 세포로서, 오랜 기간 동안 분열을 하고 자기 갱신 (self-renewal)을 할 수 있으며, 어떤 조건이 주어지면 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 세포를 말한다. 줄기세포는 배반포(blastocyst)의 내부세포괴(inner cell mass)로부터 분리되는 배아줄기세포(embryonic stem cell) 및 성체 조직으로부터 분리되는 성체줄기세포(ad㎕t stem cell)로 크게 분류할 수 있는데 잠재 능력은 배아줄기세포보다 한정적인 단점이 있으나, 윤리적 문제가 없고 부작용이 없는 성체 줄기세포를 대상으로 많은 치료제가 연구되고 있다. 구체적으로, 본 발명에서는 성체 줄기세포를 이용하고, 이는 시판되는 줄기세포나 생체조직으로부터 분리한 줄기세포를 이용할 수 있다.

본 발명은, 녹-아웃 혈청대체제를 포함하는 무혈청 무항생제 배지에서 중간엽줄기세포를 배양한 후, 배지의 상층액을 회수하여 수득한, 중간엽줄기세포 배양액을 제공한다.

상기 중간엽 줄기세포는 포유동물에서 유래된 배아 줄기세포뿐만 아니라 성체 줄기세포를 포함하며, 성체 줄기세포는 모든 조직의 성체줄기세포에서 유래한 것일 수 있다. 예를 들면 성체 줄기세포는 골수 유래, 제대혈 유래, 혈액 유래, 간장 유래, 피부 유래, 위장관 유래, 태반 유래, 신경 유래, 부신 유래, 상피 유래 및 자궁 유래 등으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 지방조직 (Fat tissue), 골수조직(bone marrow), 양막조직 (amniotic tissue), 탈락막조직 (decidual tissue), 제대조직 (umbilical cord tissue) 또는 태반조직 (placental tissue) 등에서 분리된 줄기세포일 수 있다.

바람직하게는 상기 중간엽줄기세포는 인체 지방조직으로부터 유래된 줄기세포일 수 있다. 인체 지방 유래 줄기세포는 인간의 지방조직으로부터 분리된 일종의 성체 줄기세포이다. 지방조직의 획득은 통상적으로 시행되는 지방흡입(liposuction) 과정, 분만 과정 또는 환자의 수술과정에서 개복부위 등에서 부수적으로 얻을 수 있어 충분한 양의 줄기세포를 용이하게 얻고 배양할 수 있다는 장점이 있으며, 또한 골수 채취에 비해 안전성이 우수하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 인체지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 중간엽줄기세포 배양액을 제조하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, '중간엽줄기세포 배양액'이란 중간엽줄기세포를 배지에서 배양하여 얻어진 중간엽줄기세포 배양액의 상층액 부분을 의미하며, 이와 구별하여, 본 명세서에 기술된 '기본 배양액' 또는 '배양액'은 줄기세포를 배양하기 위하여 넣어주는 배양액을 자체를 의미한다.

상기 줄기세포 배양을 위한 배지는 당업계에 알려진 기본 배지를 제한 없이 사용할 수 있으며, 다만 혈청 및 항생제가 첨가되지 않은 것을 사용한다. 기본 배지는 인위적으로 합성하여 제조할 수 있으며, 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수도 있다. 상업적으로 제조되는 배지의 예를 들면, DMEM (D㎕becco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM (α-Minimal essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Isocove's Modified D㎕becco's Medium 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 DMEM 또는 DMEM/F12 를 사용할 수 있다.

본 발명에 따라 제조된 무혈청 무항생제 중간엽줄기세포 배양액은 화장료 조성물 전체로서 사용될 수 있으나, 일반적으로 화장료 조성물 제조에 사용되는 첨가제들과 조합하여 화장료 조성물로 제조될 수 있으며, 화장료 조성물 전체 100 중량부에 대하여 0.01 내지 80 중량부로 포함할 수 있다. 전체 조성물 중량에 대하여 본 발명의 중간엽줄기세포 배양액이 0.01 중량부 미만으로 포함되는 경우 충분한 주름개선, 피부개선의 효과를 기대할 수 없고, 80 중량부를 초과하여 포함하는 경우 피부 알러지 반응등을 야기할 수도 있으므로 이를 방지하기 위함이다. 바람직하게는 1 내지 20 중량부로 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은, 본 발명의 무혈청 무항생제 중간엽줄기세포 배양액에 추가적으로, 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 사용될 수 있는 습윤화제로는 밀 단백질, 헤어 케라틴 아미노산, 나트륨 퍼옥실린카르볼산, 판테놀, 토코페롤(비타민 E) 및 디메티콘 또는 이들의 혼합물이 포함될 수 있다. 또한 염화나트륨이 존재할 수 있으며 특히 헤어 케라틴 아미노산이 습윤화제로서 포함되는 경우 그러하다. 습윤화제는 전형적으로 조성물의 약 0.01 내지 10 중량%, 바람직하게는 약 0.05 내지 1.5 중량%, 더욱 바람직하게는 약 0.01 내지 1 중량%이 사용된다.

본 발명의 화장료 조성물에 사용될 수 있는 항산화제는 효소형 항산화제와 비효소형 항산화제 모두 사용될 수 있다. 천연 효소형 항산화제의 예로는 과산화물디스뮤타제(SOD), 카탈라제 및 글루타티온 퍼옥시다제를 들 수 있다. 적합한 비효소형 항산화제로는 비타민 E(예를 들면, 토코페롤), 비타민 C(아스코브산), 카로테노이드, 에키나코시드(Echinacoside), 카페오일 유도체, 올리고머 프로안토시아니딘, 프로안타놀(예를 들면, 포도 종자 추출물), 실리마린(예를 들면, 밀크 엉겅퀴 추출물, 실리붐 마리아늄), 은행나무(Ginkgo biloba) 및 녹차 폴리페놀 또는 이들의 혼합물이 포함될 수 있다. 카로테노이드는 강력한 항산화제이며 이의 예로는 베타-카로틴, 칸타크산틴, 제아크산틴, 라이코펜, 루테인, 크로세틴 및 캡산틴 등이 포함된다. 바람직한 항산화제는 비타민 E, 비타민 C 또는 카로테노이드이다. 항산화제는 사용되는 경우 피부에서 유리-라디칼의 영향을 억제하거나 경감시키기에 충분한 양으로 사용된다. 항산화제의 전형적인 사용량은 조성물의 약 0.001 내지 1중량%이고, 바람직한 양은 약 0.01 내지 0.5 중량%이다.

본 발명의 화장료 조성물은 본 분야에서 통상적으로 사용되는 다른 보조제를 함유할 수 있다. 이러한 보조제의 예로는 향료, 염료(헤어를 동시에 염색하거나 색조를 부가하는 염료를 포함), 용매, 불투명화제, 펄제(pearlescent agent)(예를 들면, 지방산과 폴리올의 에스테르, 지방산의 마그네슘 염 및 아연 염), 공중합체 계분산액, 농후화제(예를 들면, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화암모늄 및 황산나트륨), 지방산 알킬올아미드, 셀룰로즈 유도체, 천연 검, 식물 추출물(예를 들면, 알로에베라잎 추출물, 접시꽃 추출물 등), 알부민 유도체(예를 들면, 젤라틴), 콜라겐 가수분해 생성물, 천연 또는 합성폴리펩타이드, 난황, 레시틴, 라놀린 또는 라놀린 유도체, 지방, 오일(예를 들면, 해바라기씨 오일, 보리지씨 오일, 호호바씨오일, 동백 오일, 아보카도 오일 등), 지방 알코올, 실리콘, 디오더런트, 항균물질, 항지루성 물질, 각질용해제(예를 들면, 황, 살리실산, 벤조일 퍼옥사이드, 셀레늄 설파이드, PG, FA, 효소) 및 각화제(예를 들면, 타르, 황, 살리실산, 셀레늄 설파이드, 항균제, 벤조일 퍼옥사이드, 클로르헥시딘, 요오드, 트리클로산, 항진균제 및 효소) 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물을 함유하는 화장품은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등과 같은 화장수, 훼이셜 로션, 바디로션 등과 같은 유액, 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등과 같은 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션, 파우더, 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일과 같은 메이크업 제거제, 클렌징 폼, 비누, 바디 워쉬 등과 같은 세정제 등의 제형을 가질 수 있다.

상기 무혈청 무항생제 배지에서 중간엽줄기세포를 배양하는 단계 전에, 상기 중간엽줄기세포를 배양억제제로 전처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이는 중간엽줄기세포를 배양접시에 접종하고 배양접시 내 세포수가 90% 찼을 때, 즉 배양접시에 접종 후 약 2일 정도 되었을 때, 배양억제제로 세포의 성장을 억제시킨다. 상기 배양억제제로는 mitomycin-C (Sigma)가 사용될 수 있다.

이하, 실시 예를 통해서 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 하기 실시 예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.

1. 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액 제조

i) 인체지방조직세포의 배양

지방조직은 동의 받은 환자의 수술 중 개복부위 피하지방으로부터 채취되었다. 세포 배양을 위해 지방조직은 세포분리 효소인 0.1% 콜라게나제 type I (Invitrogen) 용액에 넣고 36℃ 교반배양기(shaking incubator)에서 1시간 동안 반응시켜 세포덩어리 또는 세포로 분리하였다. 분리된 세포의 배양을 위해 배양액 [90% D㎕becco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Nutrient Mixture F-12 (1:1, Gibco #11320), 10% 소태아혈청 (Hyclone), 0.1 mM β-mercaptoethanol, 1% nonessential amino acids, and 8 ng/mL basic fibroblast growth factor (bFGF, KOMA Biotech, Inc), 75 ug/mL potassium penicillin G, 50 ug/mL streptomycin s㎕fate] 으로 2번 세척하여 세포분리 효소 잔재물을 제거하고 새로운 배양액에 넣어 지름 100mm 배양접시에 대략 1 x 10⁶ 농도로 접종하였다. 계대배양을 위해 7일 에서 10일 동안 초기 배양 (primary cell c㎕ture)에서 자라난 세포는 단일 세포분리용 효소인 TrypLE (Gibco) 용액을 넣어 5분간 처리하여 분리하고 1 x 10⁶ 의 세포수로 새 배양 접시에 다시 접종하였다. 이러한 과정을 3회에서 5회 실시함으로써 지방조직세포를 대량 증식하였다.

ii) 인체지방조직세포로부터 중간엽줄기세포배양액 획득

대량 증식된 지방조직세포로부터 중간엽줄기세포를 획득하기 위해 세포 CD271 마이크로비드 키트 (MACS, Mitenyl Biotech GmbH, Germany)를 이용하였다. 그리고 획득된 세포가 중간엽줄기세포임을 검증하기 위해서 CD90 (ab133350, Abcam, 1:100), CD105 (ab114052, Abcam, 1:100) 항체를 이용하여 면역세포화학염색법을 실시하였다.

iii) 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액 제조

지방조직 유래 중간엽줄기세포를 cm² 당 30,000개씩 배양접시에 접종하고 배양용기 내에 세포수가 90% 정도 찼을 때 다시 말하면 배양용기에 세포 부착 후 대략 2일 정도 되어 세포가 왕성하게 성장하는 양상을 나타내는 세포가 되었을 때, 배양억제제 10 ㎍/㎖ mitomycin-C (Sigma)로 세포의 성장을 억제시킨 다음 항생제와 혈청, 페놀레드가 들어있지 않은 배양액으로 [90% D㎕becco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Nutrient Mixture F-12 (1:1, Gibco #21041), 20% 혈청대체제 (Knockout SR, Gibco), 1% nonessential amino acids, and 8 ng/mL basic fibroblast growth factor (bFGF, KOMA Biotech, Inc)] 새로이 교체 후 5일간 배양하면서 매일 그 상층액을 회수하고 0.22 ㎛ 필터로 필터링하여 완성하였다. 제조된 인체지방조직 유래 중간엽 줄기세포 배양농축액은 -80℃ 에서 보관하였다.

iv) 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포의 분리 검증

도 1은 중간엽줄기세포배양액 회수 전과 후의 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포의 증식 상태의 모양을 나타낸 실체현미경 사진이다.

도 1에서 나타난 바와 같이, 분리된 중간엽줄기세포를 증식시켜 도립현미경 (Inverted microscope) 하에서 관찰하였을 때 그 부착된 모습이 섬유아세포와 유사하였다.

중간엽줄기세포의 존재를 확인하기 위하여, 형광물질이 부착된 항체를 이용하여 확인하는 면역세포화학염색법을 실시하였다.

도 2는 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포를 검증하기 위하여 중간엽줄기세포 마커 (CD90 and CD105) 로 조사하였을 때 형광물질의 발현을 확인한 형광현미경 사진이다 (Scale bars: 200 ㎛).

도 2에서 나타난 바와 같이, CD90 및 CD105로 인하여 발현된 형광물질이 상당량 검출되어 중간엽줄기세포임을 확인할 수 있었다.

2. 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액의 유효물질 함량조사

인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액의 대표적인 유효물질로 프로콜라겐 (Procollagen Type 1C-Peptide (PIP) EIA kit, #MK101, TAKARA), 혈관내피성장인자 (Human VEGF Quantikine ELISA kit, #DVE00, R&D systems), 총단백질 (Pierce BCA Protein Assay Kit, #23227, Thermo) 함량을 조사하였다.

i) 프로콜라겐 (Procollagen) 함량 분석

프로콜라겐 함량 분석의 경우 항체가 코팅된 마이크로타이터 플레이트에 항체-퍼록시다제 결합 용액 100 ㎕와 조사하려는 샘플 또는 스탠다드 용액 20 ㎕을 넣고 37 ℃에서 3시간 반응시켰다. 시간이 지나면 반응용액은 제거하고 PBS로 4번 세척하고 물기를 완전히 제거한 다음, 100 ㎕ 기질용액을 넣어 실온에서 15분간 반응시킨 후 반응정지 용액 100 ㎕를 추가로 넣고 잘 혼합하여 리더기 450 nm 파장에서 30분 이내에 흡광도를 조사하였다. 스탠다드 용액은 희석하여 0, 10, 20, 40, 80, 160, 320 ng/ml 로 하여 흡광도를 조사하여 스탠다드 커브를 확인하였다.

도 3은, 인체지방조직 유래 무항생제 무혈청 중간엽줄기세포배양액의 프로콜라겐 함량 조사하여 나타낸 그래프이다.

샘플은 1/5로 희석해서, 최종 1%, 3%, 5%, 100% 값을 조사하였을 때, 프로콜라겐 값은 70 ng/ml, 320 ng/ml, 340 ng/ml, 1700 ng/ml 로 나타났다.

ii) 혈관내피성장인자 (VEGF) 함량 분석

혈관내피성장인자 함량 분석의 경우 항체가 코팅된 마이크로타이터 플레이트에 희석액을 50 ㎕ 넣고 샘플 또는 스탠다드 용액을 200㎕ 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 시간이 지나면 반응용액은 제거하고 PBS로 3번 세척하고 물기를 완전히 제거한 다음, 200 ㎕ 항체 결합용액을 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 시간이 지나면 반응용액은 다시 제거하고 PBS로 3번 세척하고 물기를 완전히 제거한 다음, 200 ㎕ 기질용액을 넣어 광이 차단된 실온에서 25분간 반응시킨 후 반응정지 용액 50 ㎕를 추가로 넣고 잘 혼합하여 리더기 450nm 파장에서 30분 이내에 흡광도를 조사하였다. 스탠다드 용액은 희석하여 0, 15, 30, 60, 120, 250, 500, 1,000 pg/ml 로 하여 흡광도를 조사하여 스탠다드 커브를 확인하였다.

도 4는, 인체지방조직 유래 무항생제 무혈청 중간엽줄기세포배양액의 VEGF (혈관내피성장인자) 함량을 나타낸 그래프이다.

샘플은 1/5로 희석해서, 최종 1%, 3%, 5%, 100% 값을 조사하였을 때, 혈관내피성장인자 (VEGF) 값은 130 pg/ml, 410 pg/ml, 750 pg/ml, 6050 pg/ml 로 나타났다.

iii) 총 단백질 함량 분석

총 단백질 함량 분석의 경우 샘플과 스탠다드 용액을 각각 25 ㎕, 100 ㎕씩 마이크로 플레이트에 넣고 working 시약을 200 ㎕씩 첨가해서 shaker에서 30초간 잘 섞어주고 37 ℃에서 30분간 배양하였다. 실온에서 플레이트를 식힌 후 리더기 562nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 5는, 인체지방조직 유래 무항생제 무혈청 중간엽줄기세포배양액의 총 단백질 함량을 나타낸 그래프이다.

샘플 1%, 3%, 5%, 100%에서 총 단백질 함량은 290 mg/ml, 540 mg/ml, 820 mg/ml, 1,900 mg/ml 로 나타났다.

3. 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액의 안전성 시험

i) 피부자극시험

드레이즈(Draize) 테스트에 따라서 본 발명의 중간엽줄기세포 배양액의 피부자극성을 시험하였다. 젊고 건강한 백색토끼 (2.0 ~ 3.0kg)를 사용하였으며, 투여량 0.5ml로 하였다. 도포부위는 털 깎은 등 부위의 피부이고, 2.5cm×2.5cm의 비찰과피부 2개 부위와 찰과피부 2개 부위로 하였다. 도포 방법은 가로세로 2.5cm의 피부에 시험물질을 적용한 후 가아제로 덮고, 가아제를 테이프로 고정하며, 시험물질의 증발을 막기 위해 침투성이 없고 반응성이 없는 고형 재질의 박지로 덮고 테이프 등을 사용하여 고정하였다. 24 시간 동안 시험물질을 도포한 후, 72시간 동안의 사망률, 일반증상, 체중변화 및 피부자극성을 평가하였다.

(표 1) 피부반응의 평가

평가결과, 시험기간 중 시험물질 적용으로 인한 사망동물은 관찰되지 않았으며, 모든 시험동물에서 특이할 만한 이상증상은 관찰되지 않았다. 체중측정 결과 모든 동물에서 정상적인 체중증가를 보였다. 시험물질 적용 후 적용부의 피부자극성을 상기 표 1에 따라 관찰한 결과를 토대로, Draize 산출방법에 다른 피부자극지수 (P.I.I.)는 0.3으로 산출되어, 시험물질인 본 발명의 중간엽줄기세포 배양액은 비자극성 (None irritant)으로 판단되었다.

ii) 안점막 자극시험

드레이즈(Draize) 테스트에 따라서 본 발명의 중간엽줄기세포 배양액의 피부자극성을 시험하였다. 젊고 건강한 백색토끼 (2.0 ~ 3.0kg)를 사용하였으며, 시험동물의 양쪽 안구는 시험개시 24시간 전에 미리 안검사를 실시하여 안구손상 등 각막의 손상이 없다는 점을 확인하였다. 점안량은 0.1ml로 하여 시험물질을 9마리의 토끼 한쪽 눈에 점안한 후에, 그 중 3마리는 20 내지 30초 후 양쪽 눈에 미온 무균생리식염수 20ml 정도로 1분간 세안시켰으며, 나머지 6마리는 세안시키지 않았다. 시험물질을 투여하지 않은 다른 쪽 눈을 대조로 하여, 시험물질을 투여 후 72시간 동안의 사망률, 일반증상, 체중변화 및 안점막자극성을 평가하였다.

(표 2) 안구병변의 등급

평가결과, 시험기간 중 시험물질 적용으로 인한 사망동물은 관찰되지 않았으며, 모든 시험동물에서 특이할 만한 이상증상은 관찰되지 않았다. 체중측정 결과 모든 동물에서 정상적인 체중증가를 보였다. 시험물질 적용 후 적용부의 피부자극성을 상기 표 2에 따라 관찰한 결과를 토대로, 산출된 급성안점막자극지수 (I.A.O.I.)는 0.0으로 산출되어, 시험물질인 본 발명의 중간엽줄기세포 배양액은 무자극물로 판단되었다.

iii) 광감작성 시험

광감작성을 시험하는 방법으로는 Adjuvant and Strip Test, Harber Test, Morikawa Test, Horio Test, Jordan Test, Kochever Test, Maurer Test 및 Vinson Test 등이 알려져있다. 본 실시예에서는 시험물질의 감작유도를 증가시키기 위해 아쥬반트를 이용하는, 아쥬반트 스트립(Adjuvant and Strip) 테스트를 진행하였으며 실험대상으로는 기니픽을 사용하였다. 실험대상들을 시험물질투여군 및 대조군으로 나누어서 시험을 진행하였으며, 광원으로는 UV-A 영역의 램프 단독을 사용하였다. 본 발명의 중간엽줄기세포 배양액을 도포한 후에, 72시간 동안의 사망률, 일반증상, 체중변화 및 24, 48, 72 시간이 되었을 때의 피부반응을, 아쥬반트 스트립 테스트 판정기준에 따라 평가하였다.

평가결과, 시험기간 중 사망률을 관찰되지 않았으며, 시험물질 적용에 기인한 특이한 이상증상 또한 관찰되지 않았다. 시험기간 중 체중측정 결과는 모두 일반적인 체중 증가가 관찰되었다. 시험물질은 1,500 ㎍/㎖ 농도로 시험물질 처리 구획에 2시간 동안 첩포하고, UVA (320 ~ 420nm)를 10 J/cm²의 광량이 되도록 일정한 시간 동안 조사한 후, UVA 조사부위와 비조사부위의 피부반응을 24 시간, 48 시간 및 72 시간에 관찰한 결과, 양성대조군의 경우 광감작성 지수(Photo-allergic Index)가 각각 1.8, 0.8 및 0.5로 평가되었다. 반면에 시험물질투여군 및 음성대조군 경우에는, 24 시간, 48 시간 및 72 시간에 평가한 결과에서, 피부반응이 관찰되지 않아 광감작성 지수가 0.0로 산출되었다.

iv) 광독성 시험

광독성을 시험하는 방법으로는 Ison Test, Ljunggren Test, Morikawa Test, Sams Test 및 Stott Test 등이 알려져 있다. 본 실시예에서는 모리카와(Morikawa) 테스트를 진행하였으며 실험대상으로는 기니픽을 사용하였다. 실험대상들을 시험물질투여군 및 대조군으로 나누어서 시험을 진행하였으며, 광원으로는 UV-A 영역의 램프 단독을 사용하였다. 본 발명의 중간엽줄기세포 배양액을 도포한 후에, 72시간 동안의 사망률, 일반증상, 체중변화 및 24, 48, 72 시간이 되었을 때의 피부반응을, 모리카와 테스트 판정기준에 따라 평가하였다.

평가결과, 시험기간 중 사망률을 관찰되지 않았으며, 시험물질 적용에 기인한 특이한 이상증상 또한 관찰되지 않았다. 시험기간 중 체중측정 결과는 모두 일반적인 체중 증가가 관찰되었다. 시험물질은 1,500 ㎍/㎖ 농도로 시험물질 처리 구획에 2시간 동안 첩포하고, UVA (320 ~ 420nm)를 15 J/cm²의 광량이 되도록 일정한 시간 동안 조사한 후, UVA 조사부위와 비조사부위의 피부반응을 24 시간, 48 시간 및 72 시간에 관찰한 결과, 양성대조군의 경우 광독성 지수 (Phototoxic Index)가 각각 5.2, 4.7 및 3.7로 평가되었다. 반면에 시험물질투여군 및 음성대조군 경우에는, 24 시간, 48 시간 및 72 시간에 평가한 결과에서, 피부반응이 관찰되지 않아 광독성 지수가 0.0로 산출되었다.

v) 피부 감작성 시험

피부 감작성 여부를 시험하는 방법으로, Adjuvant and Patch Test, Buehler Test, Draize Test, Freund's Complete Adjuvant Test, Open Epicutaneous Test, Optimization Test, 및 Split Adjuvant Test가 알려져 있다. 본 실시예에서는, 시험물질의 피부 감작성 여부를 시험하는 방법 중 가장 널리 사용되고 있는 멕시미제이션 (Maximization) 테스트의 판정기준에 따라 평가하였다.

기니픽을 1주정도 순화하여 사용하며, 암컷의 경우에는 임신하지 않은 것 또는 임신의 경험이 없는 것을 사용하였다. 실험대상은 시험물질군, 용매대조군 및 양성대조군으로 나누어졌으며, 제모한 시험동물의 등부위 피부(약 2×4cm)에 다음과 같은 3종의 시료를 좌우 대칭으로 피내주사하여 1차 감작을 유도하였다.

1) 증류수(또는 생리식염수)와 Freund's Complete Adjuvant(FCA)의 유화물(1:1 혼합물)

2) 시험물질

3) 시험물질과 FCA의 유화물(1:1 혼합물)

1차 감작 1주 후 시험물질을 피내주사 했던 부위에 시험물질을 포함하는 패취(2×4cm)를 부착하여 48시간 동안 폐색첩포하여 2차 감작을 유도하였다. 폐색첩포 2주 후 시험동물의 등부위 혹은 측복부(감작부위와는 다른 부위)를 제모하고 시험물질을 포함하는 패취(2×2cm)를 부착하여 24시간 동안 폐색첩포하였다.

평가결과, 시험기간 중 음성대조군 및 양성대조군에서 사망동물은 관찰되지 않았다. 다만, 시험물질 투여군의 경우 1 개체는 2차 감작유도 당일에 폐색첩포 제거시 쇠약증상(weakening)이 관찰되었고, 2차 감작 유도 후 1일 (1차 감작유도 후 8일)에 사망한 채로 발견되었다. 시험물질 적용에 기인한 특이한 이상증상이 관찰되지 않았으며, 시험기간 중 체중측정 결과, 시험물질 투여군의 모든 시험동물에서 정상적인 체중증가를 보였다. 시험물질을 1,500 ㎍/㎖ 농도로 야기한 후 24시간 및 48 시간의 피부반응을 평가한 결과, 양성대조군의 경우 1차 감작 및 2차 감작의 감작지수 (평균피부반응 점수)는 각각 2.0 및 1.4이며 빈도지수 (감작률)은 각각 100% 및 100%로 산출되었다. 반면에 시험물질투여군에서 감작지수 및 빈도지수는 1차 및 2차 모두 각각 0.0 및 0.0%로 산출되었다.

4. 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액 함유 화장료 조성물 임상평가

본 발명의 일 실시예로 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액을 함유하는 화장료를 제조하여, 생산된 화장료 제품을 인체의 피부 상에 국소도포하여 광노화된 피부의 탄력, 주름 및 보습 측면에서의 개선이 있는지 등을 시험 및 평가하였다. 평가인원은 연령대별로 30대 2명, 40대 16명, 50대 3명으로 평균 연령은 45.6 세였다. 주름의 개선 정도를 평가하기 위하여 PRIMOS를 이용하여 피부치밀도를 평가하였으며, Cutometer를 사용하여 피부의 탄력을 평가하였고, Corneometer를 사용하여 피부의 수분도를 평가하였다. 평가는 4주에 걸쳐서 총 3회 (0주, 2주, 4주) 평가하였다.

i) 주름개선율 평가

(표 3)

상기 표 3은, 인체지방조직 유래 무항생제 무혈청 중간엽줄기세포배양액을 포함하는 화장료의 피부노화완화 임상실험에서의 피험자 주름개선율을 나타낸 것이다.

도 6은 인체지방조직 유래 무항생제 무혈청 중간엽줄기세포배양액을 포함하는 화장료의 피부노화완화 임상에 의한 눈가주름개선 정도를 나타낸 것이다.

PRIMOS (Phaseshift Rapid In-vivo Measurement Of Skin)를 이용한 측정 결과, 제품 사용 2주 후, 제품 사용 4주 후 통계적으로 유의한 수준의 눈가 주름 개선 효과를 확인할 수 있었다 (p<0.05).

ii) 탄력 개선율 평가

(표4)

상기 표 4는, 인체지방조직 유래 무항생제 무혈청 중간엽줄기세포배양액을 포함하는 화장료의 피부노화완화 임상실험에서의 피험자 탄력개선율을 나타낸 것이다.

Cutometer (Courage and Khazaka Electronic, Germany)를 이용한 분석 결과, R2 (총체적인 탄성) 는 제품 사용 2주 후 3.3%, 제품사용 4주 후 4.9% 증가하였고, R5 (순수탄력) 는 제품 사용 2주 후 4.9%, 제품사용 4주 후 25.1% 증가하여 통계적으로 유의한 수준의 탄력 개선 효과가 관찰되었다 (p<0.05).

iii) 보습개선율 평가

(표 5)

상기 표 5는, 인체지방조직 유래 무항생제 무혈청 중간엽줄기세포배양액을 포함하는 화장료의 피부노화완화 임상실험에서의 피험자 보습개선율을 나타낸 것이다.

Corneometer (Courage and Khazaka Electronic, Germany)를 이용한 측정 결과, 제품 사용 2주 후 보습이 7.7%, 제품 사용 4주 후 12.9% 증가하여 통계적으로 유의한 수준의 보습개선 효과가 관찰되었다 (p<0.05).

iv) 피부재생력 평가

본 발명의 일 실시예로 인체지방조직 유래 무항생제 무혈청 중간엽줄기세포 배양액을 함유하는 화장료를 제조하여, 생산된 화장료 제품을 인체의 피부 상에 국소도포하여 장벽 강화 (피부재생)에 대하여 시험 및 평가하였다. 평가인원은 연령대별로 다양하게 분포되었으며, 평균 연령은 27.3세였다. 피부재생 정도를 평가하기 위하여 Tewameter를 이용한 경피수분손실량 (TEWL) 측정하였다. 평가는 2주에 걸쳐서 하루에 2회씩 평가하였다.

도 7은, 인체지방조직 유래 무항생제 무혈청 중간엽줄기세포배양액을 포함하는 화장료의 피부장벽강화 임상에 의한 경피수분손실량 개선율을 나타낸 것이다.

평가방법에 따라서 제품도포 부위와 무도포 부위를 기기로 측정하였을 때, 제품 사용 1주 후의 경피수분손실량(TEWL) 개선율은 제품도포 부위89.95%, 무도포 부위 86.05%로 나타났고, 제품 사용 2주 후의 경피수분손실량(TEWL) 개선율은 제품도포 부위 97.45%, 무도포 부위 93.57%로 통계적으로 유의한 수준의 차이가 나타났다(p<0.05).

Claims

녹-아웃 혈청대체제를 포함하는 무혈청 무항생제 배지에서 인체 지방조직 유래 중간엽줄기세포를 배양한 후, 배지의 상층액을 회수하여 수득하는 중간엽줄기세포 배양액을 포함하는 화장료 조성물로서,
드레이즈(Draize) 테스트에 따른 피부자극시험에서의 피부자극지수가 1 미만, 드레이즈(Draize) 테스트에 따른 안점막 자극시험에서의 안점막 자극지수가 0.1 미만, 아쥬반트 스트립(Adjuvant and Strip) 테스트에 따른 광감작성 피부반응 시험에서의 광감작성 지수가 0.1 미만, 모리카와(Morikawa) 테스트에 따른 광독성 피부반응 시험에서의 광독성 지수가 0.1 미만, 멕시미제이션(Maximization) 테스트에 따른 피부 감작성 시험에서의 감작지수가 0.1 미만이고,
상기 무혈청 무항생제 배지는 DMEM 또는 DMEM/F12 배지인, 화장료 조성물.
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인체 지방조직 유래 중간엽줄기세포를 준비하는 단계;
녹-아웃 혈청대체제를 포함하는 무혈청 무항생제 배지를 준비하는 단계;
상기 중간엽줄기세포를 배지에 접종하는 단계;
상기 중간엽줄기세포를 배양억제제로 전처리하는 단계;
상기 무혈청 무항생제 배지에서 전처리 된 중간엽줄기세포를 배양하는 단계; 및
상기 중간엽줄기세포를 배양한 배지로부터 상층액을 회수하여 수득하는 단계;
를 포함하고,
상기 무혈청 무항생제 배지는 DMEM 또는 DMEM/F12 배지인, 중간엽줄기세포 배양방법.
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