JP6561135B2 - 狼毒抽出物またはその分画物を含む、傷を治療するための組成物、及び個体の傷を治療する方法 - Google Patents

Description

本発明は、狼毒抽出物またはその分画物を含む、傷を治療するための組成物、傷を治療するのに有効な量の前記組成物を個体に投与する段階を含む、個体の傷を治療する方法、傷の改善用、皮膚しわ改善用または皮膚老化防止用の化粧料組成物、及び傷の改善、皮膚しわ改善または皮膚老化防止のための化粧方法に関する。

皮膚は、外部から身体を保護する防護膜としての役割を行う。皮膚に傷ができれば、生体の自然治癒作用により、傷口に血液が充填され、血小板の顆粒減少と、ハゲーマン因子（hageman factor）の活性化とが始まり、傷治癒過程が進められる。血液の凝固は、臨時防御作用であり、露出された傷組織を保護し、治癒過程の間、細胞が移動することができる基盤を提供する。

傷の治療及び／または治癒は、大きく見て、３段階でなされる。最初の段階は、外傷部位での炎症を特徴とする炎症期（inflammatory phase）である。炎症期は、重大な感染がない状態で、一般的に短く進められる。２番目の段階は、増殖期（proliferative phase）で、これは、上皮化、血管形成、肉芽組織形成及びコラーゲン沈着を特徴とする。新たな毛細管形成を伴う血管形成は、栄養素を伝達し、肉芽組織形成維持に使用される。傷内に新たな毛細管の形成なしに、必須栄養素が傷に逹することができず、慢性的に治癒されない傷を生成させる。損傷された傷の表面が、角質形成細胞（keratinocytes）層によって覆われながら、新たな表皮が生成され、上皮層が再建される再上皮化が起こる。再上皮化が完了すれば、結合組織の増加と再編とを介して、傷口面積が低減する一連の過程が進められる。傷治癒の最終段階は、線維芽細胞（fibroblast）がコラーゲンに分化する成熟期（maturational phase）である。成熟期の間、回復期組織の凝固した細胞と毛細血管とが少しずつなくなるが、かような組織の細胞と毛細血管とが過形成されたり、正常に分解されたりしない場合、傷痕が生じる。

傷治癒過程において、傷を迅速に治療するだけではなく、副作用や傷痕なしに治療することが重要であるために、かような効能を有する物質を探し出す努力が続けられている。

一様相は、狼毒抽出物またはその分画物を有効成分として含む、傷を治療するための組成物を提供する。

他の様相は、傷を治療するのに有効な量の前述の組成物を個体に投与する段階を含む、個体の傷を治療する方法を提供する。

他の様相は、狼毒抽出物またはその分画物を有効成分として含む傷の改善用、皮膚しわ改善用または皮膚老化防止用の化粧料組成物を提供する。

他の様相は、前記化粧料組成物を個体に適用する段階を含む傷の改善、皮膚しわ改善または皮膚老化防止のための化粧方法を提供する。

一様相は、狼毒抽出物またはその分画物を有効成分として含む、傷を治療するための組成物であって、前記狼毒抽出物は、前記狼毒の地上部から抽出されたものである組成物を提供する。

他の様相は、傷を治療するのに有効な量の前述の組成物を個体に投与する段階を含む、個体の傷を治療する方法を提供する。前記組成物については、前述のところと同一である。

他の様相は、狼毒抽出物またはその分画物を有効成分として含む、傷の改善用、皮膚しわ改善用または皮膚老化防止用の化粧料組成物を提供する。前記狼毒抽出物については、前述のところと同一である。

他の様相は、傷の改善用、皮膚しわ改善用または皮膚老化防止用の化粧料組成物を個体の皮膚に適用する段階を含む、皮膚を化粧するための方法を提供する。

一様相による傷を治療するための組成物によれば、個体の傷を効率的に治療するのに使用される。

一様相による個体の傷を治療する方法によれば、個体の傷を効率的に治療することができる。

一様相による傷の改善用、皮膚しわ改善用または皮膚老化防止用の化粧料組成物によって、傷を効率的に改善し、皮膚しわ改善または皮膚老化を防止するのに使用される。

一様相による皮膚を化粧するための方法によれば、効率的に傷を改善させたり、皮膚しわを改善させたり、または皮膚老化を防止したりすることができる。

狼毒地上部のエチルアルコール抽出物が、角質形成細胞の移動を促進させるところを確認した結果である。 狼毒地上部のエチルアルコール抽出物の分画物が、角質形成細胞の移動を促進させるところを確認した結果である。 狼毒地上部のエチルアルコール抽出物が、線維芽細胞において、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子及びＣＯＬ３Ａ１遺伝子の発現を促進させるところを確認した結果である。 狼毒地上部のさまざまな溶媒抽出物が、線維芽細胞において、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子及びＣＯＬ３Ａ１遺伝子の発現を促進させるところを確認した結果である。 狼毒地上部の、異なる濃度のブタノールを使用して抽出されたブタノール抽出物が、線維芽細胞において、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子及びＣＯＬ３Ａ１遺伝子の発現を促進させるところを確認した結果である。 狼毒エチルアルコール抽出物の存在が、ＭＭＰ−１の発現レベルに及ぼす影響を確認した結果である。 ＵＶＢ照射されたヒト線維芽細胞において、狼毒エチルアルコール抽出物が、タイプ−１プロコラーゲンの発現に及ぼす程度を測定した結果を現わす。 狼毒抽出物が、動物実験において、開いた傷の上皮化（epithelialization）に及ぼす影響を示した図面である。 狼毒抽出物が、動物実験において、開いた傷の傷口面積低減に及ぼす影響を示した図面である。 狼毒抽出物が、動物実験において、開いた傷の回復を促進させるところをＨ＆Ｅ染色法で確認した結果である。 狼毒幹抽出物が、角質形成細胞の移動を促進させるところを確認した結果である。 狼毒幹抽出物の分画物が、角質形成細胞の移動を促進させるところを確認した結果である。 狼毒幹抽出物が、線維芽細胞において、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子及びＣＯＬ３Ａ１遺伝子の発現を促進させるところを確認した結果である。 狼毒幹抽出物の分画物が、線維芽細胞において、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子及びＣＯＬ３Ａ１遺伝子の発現を促進させるところを確認した結果である。 狼毒幹抽出物が、動物実験において開いた傷の回復を促進させるところを臨床学的に確認した結果である。 狼毒幹抽出物が、動物実験において、開いた傷の回復を促進させるところを定量的に確認した結果である。

一様相は、狼毒（stellera chamaejasme）抽出物またはその分画物を有効成分として含む、傷を治療するための組成物であって、前記狼毒抽出物は、前記狼毒の地上部から抽出されたものである組成物を提供する。

前記狼毒抽出物は、前記狼毒地上部の全体、その一部分、またはそれらに由来する材料から、溶媒によって抽出された抽出物でもある。前記一部分は、狼毒の幹、葉、花または花びらでもある。前記狼毒は、モンゴルの山岳地域で生育されたものでもある。前記地域は、ウランバートル近郊でもある。前記狼毒は、約３０ないし４０ｃｍの高さに育つことができる。前記狼毒の葉の長さは、約１５ないし２７ｍｍであり、葉は皮針型（lanceolate）でもある。前記葉の表面は、緑色であり、その裏は、青色がかった灰色でもある。葉の両面いずれも毛がなく、葉柄が短い。抽出に使用された前記狼毒地上部の全体、その一部分、またはそれらに由来する材料は、粉砕されたり細切りされたりするか、あるいは適切に乾燥されたものでもある。

前記溶媒は、水、アセトン、アルコール、例えば、Ｃ_１−Ｃ_６アルコール、またはそれらの混合物でもある。前記Ｃ_１−Ｃ_６アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、１，３−プロパンジオール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノールなどでもある。前記溶媒は、例えば、水とアルコールとの混合物、すなわち、アルコール水溶液でもある。該アルコール水溶液のアルコール濃度は、１ないし１００（ｖ／ｖ）％、例えば、１ないし９９．５（ｖ／ｖ）％、１０ないし１００（ｖ／ｖ）％、２０ないし１００（ｖ／ｖ）％、３０ないし１００（ｖ／ｖ）％、４０ないし１００（ｖ／ｖ）％、５０ないし１００（ｖ／ｖ）％、６０ないし１００（ｖ／ｖ）％、７０ないし１００（ｖ／ｖ）％、または７５ないし１００（ｖ／ｖ）％でもある。前記アルコール水溶液は、メタノール水溶液、エタノール水溶液またはブタノール水溶液でもある。前記アセトンは、１００％濃度でもある。

前記抽出は、前記狼毒地上部の全体、その一部分、またはそれらに由来する材料に対して、前記抽出溶媒を、３ないし１０（体積／重量）倍、例えば、３ないし７（体積／重量）倍、３ないし５（体積／重量）倍、５ないし１０（体積／重量）倍、または４ないし１０倍添加することを含んでもよい。例えば、前記狼毒地上部の全体、その一部分、またはそれらに由来する材料１ｋｇに対して、前記抽出溶媒を３ないし１０Ｌ添加することを含んでもよい。

前記抽出は、加温された液体抽出、加圧された液体抽出（ＰＬＥ：pressurized liquid extraction）、超音波支援の抽出（ＭＡＥ：microwave assisted extraction）、亜臨界抽出（ＳＥ：subcritical extraction）、またはそれらの組み合わせによっても行われる。前記亜臨界抽出は、亜臨界水抽出（ＳＷＥ：subcritical water extraction）でもある。該亜臨界水抽出は、超加熱水抽出（superheated water extraction）、または加圧熱水抽出（ＰＨＷＥ：pressurized hot water extraction：ＰＨＷＥ）ともいう。前記加温された液体抽出は、還流抽出でもある。

前記抽出は、４℃ないし７０℃、例えば、４℃ないし５０℃、４℃ないし４０℃、４℃ないし３０℃、１０℃ないし７０℃、１５℃ないし７０℃、２０℃ないし７０℃、４℃ないし５０℃、１０℃ないし５０℃、４℃ないし４０℃、４℃ないし３０℃、１０℃ないし４０℃、１０℃ないし３５℃、または１０℃ないし３０℃でも行われる。前記抽出時間は、選択された温度によって異なるが、１時間ないし２ヵ月、例えば、１時間ないし１ヵ月、１時間ないし１５日、１時間ないし１０日、１時間ないし５日、１時間ないし３日、１時間ないし２日、１時間ないし１日、５時間ないし１ヵ月、５時間ないし１５日、５時間ないし１０日、５時間ないし５日、５時間ないし３日、５時間ないし２日、５時間ないし１日、１０時間ないし１ヵ月、１０時間ないし１５日、１０時間ないし１０日、１０時間ないし５日、１０時間ないし３日、または１０時間ないし２日でもある。前記抽出は、前記溶媒中に、狼毒地上部の全体、その一部分、またはそれらに由来する材料を混合し、一定時間放置することを含んでもよい。前記放置は、適切な撹拌を含んでもよい。前記抽出は、１回以上、例えば、１ないし５回反復されてもよい。

前記抽出は、植物体残渣及び抽出液を濾過などの公知方法によって分離することができる。前記抽出はまた、得られた抽出液から、減圧濃縮のような公知方法によって溶媒を除去することを含んでもよい。前記抽出はまた、得られた抽出物を凍結乾燥のような乾燥によって、乾燥抽出物を製造することを含んでもよい。

前記組成物において、用語「分画物（fraction）」は、前記狼毒抽出物が、その一部の成分に分けられた物質、すなわち、分画された物質を示す。前記分画物は、溶媒分画化（fractionation）によって得られたものでもある。前記溶媒分画化は、該狼毒抽出物を溶媒と混合し、前記溶媒に存在する物質を分離することでもある。前記分画物は、前記狼毒抽出物を水に懸濁させた後、ヘキサン、酢酸エチル及びブタノールで順次に分画化して得られたヘキサン分画物、酢酸エチル分画物、ブタノール分画物、または最終的に残った水分画物でもある。

具体的には、前記ヘキサン分画物は、前記狼毒抽出物を水と混合し、該混合物をさらにヘキサンと混合した後、一定時間放置した後、ヘキサン層を分離し、分離されたヘキサン層から分画物を分離することによって得られたものでもある。該分画物の分離は、ヘキサン層からヘキサンを除去することを含んでもよい。また、前記酢酸エチル分画物は、前記ヘキサン分画物を分離して残った水層を、酢酸エチルと混合した後、一定時間放置した後、酢酸エチル層を分離し、分離された酢酸エチル層から分画物を分離することによって得られたものでもある。該分画物の分離は、酢酸エチル層から酢酸エチルを除去することを含んでもよい。また、前記ブタノール分画物は、前記酢酸エチル分画物を分離して残った水層を、ブタノールと混合した後、一定時間放置した後、ブタノール層を分離し、分離されたブタノール層から分画物を分離することによって得られたものでもある。該分画物の分離は、ブタノール層からブタノールを除去することを含んでもよい。温度条件、圧力条件、時間、使用された溶媒の量または濃度、撹拌のような前記分画化の条件は、前述の狼毒抽出物製造に使用された抽出について説明した通りである。前記分画化は、１回以上、例えば、１ないし５回反復されてもよい。前記分画化の順序は、例示的なものであり、ヘキサン、酢酸エチル及びブタノールを使用した分画化は、任意の順序でも実施される。

前記分画物の分離は、濾過などの公知方法によっても行われる。前記分画化はまた、得られた分画物から、減圧濃縮のような公知方法によって溶媒を除去することを含んでもよい。前記分画化はまた、得られた分画物を、濃縮及び／または乾燥することを含んでもよい。前記濃縮は、減圧濃縮でもある。前記乾燥は、減圧乾燥、沸騰乾燥、噴霧乾燥、常温乾燥または凍結乾燥を含んでもよい。

前記組成物において、用語「傷（wound）」は、組織が切られるか（cut）、破れるか（torn）、こわれるか（broken）、焼けるか（burned）、外傷を負うか（traumatized）、またはかような損傷を誘発する障害または疾患から発生した人体に対する損傷（injury）を意味する。用語「組織」は、共に集団をなし、特定機能を形成する人体中の細胞の集まりを示す。該組織には、目、粘液、肺、腎臓、心臓、内臓、筋（tendon）、血管組織、骨、皮膚、結合組織及び神経、例えば、脊髄が含まれてもよい。前記傷は、表面が開放された「開放された傷（open wound）」、または表面が開放されていない「閉鎖された傷（closed wound）」でもある。前記傷の一例は、皮膚にある開放された傷でもある。前記傷は、病変（lesion）、できもの（sore）、懐死（necrosis）及び潰瘍（ulcer）を含んでもよい。前記懐死は、感染、損傷または梗塞から生成される死んだ組織に係わるものでもある。前記潰瘍は、懐死組織の脱皮によって生成された、器官または組織の表面の局所的な欠陥またはくぼみでもある。

前記傷の一例は、皮膚の表皮（epidermis）；真皮（dermis）；表皮及び真皮；または表皮、真皮及び皮下脂肪層が損傷された傷でもある。

また、前記傷の例は、切れ（cut）、切開（incisions）（例：手術的切開）、擦過傷（abrasions）、裂傷または引き裂き（lacerations）、骨折（fracture）、打撲傷（contusions）、火傷（burns）または切断（amputations）を含んでもよい。

本発明によって提供される「治療（treat）」は、自然治癒に比べて短縮された時間に傷が治癒されることを提供するものでもある。前記治療は、傷の改善及び／または緩和を含んでもよい。また、前記治療は、傷、及び／または傷に係わる疾患の治療をいずれも含むものでもある。前記治療は、傷から誘発される損傷された組織の治癒及び／または再生を意味する。前記傷治療は、皮膚再生の意味を含んでもよい。また、前記治療は、前記損傷された組織の本来組成を維持することでもある。また、前記治療は、傷に係わる疾患の余病及び／または傷痕を最小化しながら、前記損傷された組織の治癒及び／または再生を促進させることでもある。

前記組成物は、傷治癒過程の全段階を促進させるためのことでもある。また、前記組成物は、傷治癒段階のうち、増殖期及び／または成熟期を促進させるものもある。従って、前記組成物は、増殖期及び／または成熟期にある傷を治療するためのものでもある。
前記組成物は、組成物総重量に対して、０．００１重量％ないし８０重量％、例えば、０．０１重量％ないし６０重量％、０．０１重量％ないし４０重量％、０．０１重量％ないし３０重量％、０．０１重量％ないし２０重量％、０．０１重量％ないし１０重量％、０．０１重量％ないし５重量％、０．０５重量％ないし６０重量％、０．０５重量％ないし４０重量％、０．０５重量％ないし３０重量％、０．０５重量％ないし２０重量％、０．０５重量％ないし１０重量％、０．０５重量％ないし５重量％、０．１重量％ないし６０重量％、０．１重量％ないし４０重量％、０．１重量％ないし３０重量％、０．１重量％ないし２０重量％、０．１重量％ないし１０重量％、または０．１重量％ないし５重量％の狼毒抽出物またはその分画物を含んでもよい。

前記組成物は、薬学的組成物でもある。前記組成物は、薬剤学的に許容可能な希釈剤または担体を含んでもよい。前記希釈剤は、乳糖、とうもろこし澱粉、大豆油、微晶質セルロースまたはマンニトール、滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはその組み合わせでもある。前記担体は、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、またはその組み合わせでもある。前記賦形剤は、微晶質セルロース、乳糖、低置換度ヒドロキシセルロース、またはその組み合わせでもある。前記崩壊剤は、カルボキシメチルセルロースカルシウム、澱粉グリコール酸ナトリウム、無水リン酸一水素カルシウム、またはその組み合わせでもある。前記結合剤は、ポリビニルピロリドン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、またはその組み合わせでもある。前記滑沢剤は、ステアリン酸マグネシウム、二酸化ケイ素、タルク、またはその組み合わせでもある。

前記組成物は、非経口投与剤形にも剤形化される。該非経口投与剤形は、注射剤または皮膚外用剤でもある。前記皮膚外用剤は、クリーム、ゲル、軟膏、皮膚乳化剤、皮膚懸濁液、経皮伝達性パッチ、薬物含有包帯、ローション、またはその組み合わせでもある。
前記皮膚外用剤は、一般的に、化粧品や医薬品などの皮膚外用剤に使用される成分、例えば、水性成分、油性成分、粉末成分、アルコール類、保湿剤、増粘剤、紫外線吸収剤、美白剤、防腐剤、酸化防止剤、界面活性剤、香料、色剤、各種皮膚栄養剤、またはそれらの組み合わせと、必要によって適切に配合されてもよい。

前記皮膚外用剤は、エデト酸二イナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸などの金属封鎖剤；カフェイン、タンニン、ベラパミル、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物；各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸、トラネキサム酸及びその誘導体、またはその塩などの薬剤；ビタミンＣ；アスコルビン酸リン酸マグネシウム；アスコルビン酸グルコシド；アルブチン；コウジ酸；グルコース、フラクトース、トレハロースなどの糖類も適切に配合することができる。

前記組成物は、細胞中のコラーゲン遺伝子の発現を促進させるためのものでもある。前記組成物は、コラーゲン発現を増大させることができるか、または前記組成物によって生成されたコラーゲンの活性を上昇させることができる。前記組成物はまた、コラーゲンを生成させる上流（up-stream）の酵素またはタンパク質の活性または発現を増大させることができる。一具体例において、前記組成物は、コラーゲンの発現及び／または活性を上昇させ、傷治療効能を有するものでもある。前記組成物は、コラーゲンの発現及び／または活性を上昇させ、コラーゲンを含む組織の弾力性を維持または上昇させる用途に使用される。例えば、前記組成物は、コラーゲンを含む組織、例えば、皮膚の弾力性を維持または促進させ、組織のしわ生成を低減させ、しわを除去するものでもある。前記コラーゲンは、１型コラーゲン（collagen type Ｉ）または３型コラーゲン（collagen type ＩＩＩ）でもある。前記コラーゲンをコーディングする遺伝子は、ＣＯＬ１Ａ１及びＣＯＬ３Ａ１から構成された群からも選択される。

前記組成物は、角質細胞（keratinocyte）分化因子の生成を増大させることができる。前記組成物は、例えば、角質形成細胞の分化因子遺伝子の発現を促進させることができる。前記分化因子は、フィラグリン（ＦＬＧ：filaggrin）、ロリクリーン（ＬＯＲ：loricrin）またはインボルクリン（ＩＶＣ：involucrin）でもある。前記組成物は、角質形成細胞の傷への移動を促進させることができる。

前記組成物は、コラーゲン遺伝子自体の発現を増大させることができるか、あるいは前記組成物によって生成されたコラーゲンの活性を上昇させることができる。また、前記組成物は、コラーゲンを生成させる上流の酵素またはタンパク質の活性または発現を増大させることができる。

他の様相は、傷を治療するのに有効な量の前述の組成物を個体に投与する段階を含む、個体の傷を治療する方法を提供する。前記組成物については、前述のところと同一である。

前記投与は、当業界に公知の方法によって投与される。前記投与は、例えば、静脈内、筋肉内、経皮（transdermal）、粘膜、鼻内（intranasal）、器官内（intratracheal）または皮下投与のような経路で、任意の手段によって、個体に直接にも投与される。前記投与は、全身的または局所的にも投与される。前記投与は、傷が存在する部位に局所的に投与するものでもある。

前記個体は、哺乳動物、例えば、ヒト、牛、馬、豚、犬、羊、ヤギまたは猫でもある。前記個体は、傷を有するものでもある。前記傷は、皮膚に存在するものでもある。

前記投与は、狼毒抽出物を個体当たり、０．１ｍｇないし１，０００ｍｇ、例えば、０．１ｍｇないし５００ｍｇ、０．１ｍｇないし１００ｍｇ、０．１ｍｇないし５０ｍｇ、０．１ｍｇないし２５ｍｇ、０．１ｍｇないし５ｍｇ、１ｍｇないし１，０００ｍｇ、１ｍｇないし５００ｍｇ、１ｍｇないし１００ｍｇ、１ｍｇないし５０ｍｇ、１ｍｇないし２５ｍｇ、５ｍｇないし１，０００ｍｇ、５ｍｇないし５００ｍｇ、５ｍｇないし１００ｍｇ、５ｍｇないし５０ｍｇ、１ｍｇないし５ｍｇ、５ｍｇないし２５ｍｇ、１０ｍｇないし１，０００ｍｇ、１０ｍｇないし５００ｍｇ、１０ｍｇないし１００ｍｇ、１０ｍｇないし５０ｍｇ、または１０ｍｇないし２５ｍｇを投与するものでもある。

他の様相は、狼毒抽出物またはその分画物を有効成分として含む、傷の改善用、皮膚しわ改善用または皮膚老化防止用の化粧料組成物を提供する。前記狼毒抽出物については、前述のところと同一である。

用語「傷の改善用」は、傷の程度を低くしたり緩和させたりする用途を含んでもよい。例えば、前記傷改善は、すでに発生した傷の程度を低くしたり緩和させたりするものでもある。用語「皮膚しわ改善」とは、皮膚の弾力性を維持し、しわが生成されることを防止するか、あるいは生成されたしわを除去することを含む。

前記抽出物は、線維芽細胞において、コラーゲンの生成を促進させる。該コラーゲンは、皮膚真皮層の主要成分であり、弾力タンパク質として、水分と結合する力が強い性質を有している。すなわち、該コラーゲンは、皮膚に弾力性を付与する性質を有しており、それにより、しわが生じることを防止する効果を有する。人間が、加齢により、皮膚のコラーゲン量が減り、皮膚は、弾力性を失い、しわが生じる老化過程を経る。従って、前記抽出物を含む、請求された発明の組成物は、皮膚しわ改善用または皮膚老化防止用の化粧料組成物として使用される。前記化粧料組成物は、前記抽出物以外の、他のしわ改善防止効果または老化防止効果を有する活性成分を含まないものでもある。

前記化粧料組成物は、局所適用に適する全ての剤形として提供される。例えば、溶液、水相に油相を分散させて得たエマルジョン、油相に水相を分散させて得たエマルジョン、懸濁液、固体、ゲル、粉末、ペースト、マスクパック、シート、泡沫（foam）またはエアゾール組成物の剤形でも提供される。かような剤形の組成物は、当分野の一般的な方法によっても製造される。

前記化粧料組成物は、保湿剤、エモリエント剤、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、有機顔料及び無機顔料、香料、冷感剤または制汗剤をさらに含んでもよい。前記保湿剤などの追加成分の配合量は、本発明の目的及び効果を損傷させない範囲内で、当業者が容易に選定可能であり、その配合量は、組成物全体重量を基準に、０．０１ないし５重量％、具体的には、０．０１ないし３重量％でもある。

前記組成物は、組成物総重量に対して、０．００１重量％ないし８０重量％、例えば、０．０１重量％ないし６０重量％、０．０１重量％ないし４０重量％、０．０１重量％ないし３０重量％、０．０１重量％ないし２０重量％、０．０１重量％ないし１０重量％、０．０１重量％ないし５重量％、０．０５重量％ないし６０重量％、０．０５重量％ないし４０重量％、０．０５重量％ないし３０重量％、０．０５重量％ないし２０重量％、０．０５重量％ないし１０重量％、０．０５重量％ないし５重量％、０．１重量％ないし６０重量％、０．１重量％ないし４０重量％、０．１重量％ないし３０重量％、０．１重量％ないし２０重量％、０．１重量％ないし１０重量％、または０．１重量％ないし５重量％の狼毒抽出物またはその分画物を含んでもよい。

他の様相は、傷の改善用、皮膚しわ改善用または皮膚老化防止用の化粧料組成物を個体の皮膚に適用する段階を含む、皮膚を化粧するための方法を提供する。
前記方法は、傷を改善させたり、皮膚しわを改善させたり、皮膚老化を防止したりするものでもある。

前記方法において、前記化粧料組成物は、頭皮を含み、皮膚、唇及び毛髪の多くの処理、特に、美容処理で適用される。

前記方法において、皮膚に適用する段階は、皮膚に前記組成物を接触させ、前記組成物の成分を皮膚内に浸透させることを含む。皮膚に適用する段階は、前記組成物を皮膚内に浸透させることの一助となる他の手段、例えば、イオントフォレーシスのような電気的力または磁気的力のような手段とも組み合わされる。

以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。

実施例１：狼毒抽出物及びその分画物の製造
本実施例においては、狼毒から狼毒抽出物を製造し、狼毒抽出物及び前記分画物が傷治療に及ぼす効果を確認した。

１．狼毒抽出物及びその分画物の製造
（１）狼毒エタノール抽出物の製造
狼毒抽出物は、モンゴル・ウランバートル近郊で生育したものであり、地上部のみを採集した。採集された地上部を水で洗浄して乾燥させた。乾燥された狼毒地上部は、押し切り（straw cutter）を利用して、２〜３ｃｍに細切りして使用した。ガラス三角フラスコに、前記細切りされた狼毒地上部１００ｇと、水内９５（ｖ／ｖ）％のエタノール１Ｌとを入れて混合した。該混合物を約２０℃の常温で、４８時間１５０ｒｐｍで撹拌して抽出した。

次に、該混合物を濾過紙（Whatman、ＮＯ．２、８μｍ）に通過させて得られた濾過液を得た。得られた濾過液を、回転式減圧濃縮機（EYELA、Ｎ−１１００）を使用して減圧濃縮し、残っている溶媒を除去するために、４８時間凍結乾燥（Operon、ＦＤＣＦ−１２００３）を実施し、溶媒が除去された乾燥された狼毒抽出物３ｇを得た。

（２）狼毒エタノール抽出物分画物の製造
（２．１）エタノール抽出物の分画物
乾燥された狼毒エタノール抽出物３ｇ、及び水１００ｍＬを三角フラスコに入れて懸濁した後、２５０ｍＬ分別漏斗に入れ、そこにｎ−ヘキサン（extra pure grade、１００（ｖ／ｖ）％）１００ｍＬを添加し、十分に振った後、常温で３時間放置した。前記混合物を、分別漏斗を利用して、ヘキサン層のみを取り、前述のような過程を３反復して実施し得られたヘキサン層は、減圧濃縮（EYELA、Ｎ−１１００）を行い、ヘキサン分画物を得た。

また、同一方法により、前記ヘキサン分画物分離過程で残った水層に対して、１００（ｖ／ｖ）％酢酸エチルを添加して混合した後、同一過程を経て、酢酸エチル分画を得た。
また、同一方法により、前記酢酸エチル分画物分離過程で残った水層に、水泡化ブタノールを添加して混合した後、同一過程を経て、ブタノール分画を得た。その後、残ったものを水分画物として使用した。

前記狼毒エタノール抽出物とその分画物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯdimethylsulfoxide）に、２０ｍｇ／ｍｌ濃度で溶かした後、下記実験に利用した。

（２．２）他の溶媒抽出物、及びその分画物
（２．１）における溶媒としてのエタノールの代わりに、１００（ｖ／ｖ）％アセトン、指定された濃度のメタノール、またはブタノールを使用したことを除いては、同一過程によって、他の溶媒を使用した抽出物及びその分画物を得た。

２．ヒト角質形成細胞の移動増加
前記狼毒抽出物またはその分画物が、ヒト角質形成細胞が移動（migration）することを増大させるか否かということを、下記のように確認した。

牛胎児血清が２．５（ｖ／ｖ）％に含有されたＤＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Dulbecco’s Modified Eagle’s Media）培地１ｍｌが入っている２４ウェル平板培養器（２４−well microtiter plate）のウェルに、ＨａＣａＴヒト角質形成細胞を２×１０^５細胞／ウェルになるように入れた。次に、前記角質形成細胞を、コンフルエンスが８０％になるまで、３７℃及び５％ ＣＯ_２培養器で培養させた後、培地中の細胞単一層をｐ１０ピペットチップで引っ掻き、「引っ掻き損傷」を誘導した。

次に、前記引っ掻かれた細胞単一層上に、無血清ＤＭＥＭ ２００μｌと、前記狼毒抽出物またはその分画物とを、５μｇ／ｍｌ培地及び１０μｇ／ｍｌ培地の濃度に添加した。その後、前述の培養条件と同一条件で、ヒト角質形成細胞を２４時間培養させた。陰性対照群としては、前記抽出物を溶かすのに使用したＤＭＳＯを同量処理し、陽性対照群としては、壺草抽出物（１０μｇ／ｍｌ）を指定された濃度で使用した。その後、クリスタルバイオレット（crystal violet）試薬で細胞層を染色した後、引っ掻き傷が回復する程度を確認した。前記壺草抽出物は、バイオスペクトラム（韓国）から購入したものである。

図１は、狼毒地上部のエタノール抽出物が、角質形成細胞の移動を促進させるところを確認した結果である。図２は、狼毒地上部のエタノール抽出物の分画物が、角質形成細胞の移動を促進させるところを確認した結果である。図１において、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、ＤＭＳＯ（陰性対照群）、５μｇ／ｍｌ狼毒抽出物、１０μｇ／ｍｌ狼毒抽出物及び１０μｇ／ｍｌ壺草抽出物（陽性対照群）をそれぞれ示す。図２において、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨは、ＤＭＳＯ（陰性対照群）、５μｇ／ｍｌ狼毒地上部のエタノール抽出物のヘキサン分画物、５μｇ／ｍｌ狼毒地上部のエタノール抽出物の酢酸エチル分画物、５μｇ／ｍｌ狼毒地上部のエタノール抽出物のブタノール分画物、５μｇ／ｍｌ壺草抽出物、１０μｇ／ｍｌ狼毒地上部のエタノール抽出物のヘキサン分画物、１０μｇ／ｍｌ狼毒地上部のエタノール抽出物の酢酸エチル分画物、及び１０μｇ／ｍｌ狼毒地上部のエタノール抽出物のブタノール分画物をそれぞれ示す。

図１及び図２に示されているように、陰性対照群が処理された細胞の引っ掻き損傷は、２４時間後、相対的に治癒されていないまま残っているのに対し、狼毒地上部のエタノール抽出物が処理された細胞においては、傷端の細胞増殖及び細胞移動により、引っ掻き損傷が治癒され、２４時間後、引っ掻き面積が低減した。

３．線維芽細胞における、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子及びＣＯＬ３Ａ１遺伝子の発現増大
前記狼毒抽出物がヒト線維芽細胞において、コラーゲン遺伝子の発現を促進させるか否かということを下記のように確認した。

牛胎児血清が２．５（ｖ／ｖ）％に含有されたＤＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ：Dulbecco’s Modified Eagle’s Media）培地２ｍｌが入っている６ウェル平板培養器（６−well microtiter plate）のウェルに、ヒト線維芽細胞（ＨＤＦ：human dermal fibroblasts、American Type Culture Collection、米国）を、２×１０^６細胞／ウェルになるように入れ、コンフルエンスが８０％になるまで、前述のところと同一条件で培養した。

かように培養した細胞に、前記狼毒抽出物を、それぞれ１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、２４時間、前述のところと同一条件で培養させた。陰性対照群としては、前記抽出物を溶かすのに使用したＤＭＳＯを同量使用し、陽性対照群としては、壺草抽出物（バイオスペクトラム、韓国）を使用した。２４時間後、ＲＴ−ＰＣＲアッセイを介して、コラーゲン遺伝子が発現されるか否かということを確認した。具体的には、２４時間経過後、細胞から、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen、Carlsbad、ＣＡ、米国）を使用して、総ＲＮＡを収穫して逆転写させた後、ＲＴ−ＰＣＲを次のように行った。まず、ｃＤＮＡ合成のために、前記ＲＮＡを逆転写酵素（reversetranscriptase）を使用して逆転写させた。ＲＴ−ＰＣＲは、次の特定プライマーをプライマーとして使用して行った。各遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現量値は、β−アクチン値で標準化した。

図３は、狼毒地上部のエタノール抽出物が、線維芽細胞において、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子及びＣＯＬ３Ａ１遺伝子の発現を促進させるところを確認した結果である。

図３に示されているように、狼毒地上部のエタノール抽出物は、コラーゲン合成関連因子であるＣＯＬ１Ａ１及びＣＯＬ３Ａ１から構成された群のうちから選択される１以上遺伝子の発現を活性化させる効果が顕著であるということが分かった。

図４は、狼毒地上部のさまざまな溶媒抽出物が、線維芽細胞において、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子及びＣＯＬ３Ａ１遺伝子の発現を促進させるところを確認した結果である。図４において、試料番号１，２，３，４，５，６及び７は、アセトン抽出物、アセトン抽出物、１００％エタノール抽出物、２５％メタノール抽出物、５０％メタノール抽出物、７５％メタノール抽出物及び１００％メタノール抽出物を示す。

図５は、狼毒地上部の、異なる濃度のブタノールを使用して抽出されたブタノール抽出物が、線維芽細胞において、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子及びＣＯＬ３Ａ１遺伝子の発現を促進させるところを確認した結果である。図５において、試料番号１，２，３及び４は、２５％ブタノール抽出物、５０％ブタノール抽出物、７５％ブタノールを抽出物及び１００％ブタノール抽出物を示す。

図４及び図５に示されているように、狼毒地上部のアセトン抽出物、メタノール抽出物、エタノール抽出物及びブタノール抽出物は、コラーゲン合成関連因子であるＣＯＬ１Ａ１及びＣＯＬ３Ａ１から構成された群のうちから選択される１以上遺伝子の発現を活性化させる効果が顕著であるということが分かった。

４．ＵＶ照射によって老化が誘導された線維芽細胞におけるコラーゲン分解酵素−１分泌抑制測定実験
前記狼毒エタノール抽出物のコラーゲン分解酵素−１（ＭＭＰ−１：matrix metalloproteinase−１）の生成を抑制する効能を測定した。

まず、２．５％の牛胎児血清が含有されたＤＭＥＭ培地が入っている２４孔平板培養器にヒト線維芽細胞を、１×１０^５細胞／孔（well）になるように入れ、９０％ほどのコンフルエンスに育つまで培養した。その後、無血清ＤＭＥＭ培地に溶解された前記狼毒エタノール抽出物を、１，５及び１０μｇ／ｍｌ濃度で添加し、２４時間培養した後、ＵＶ照射機を利用して、ＵＶＢ、すなわち、１５ｍＪを照射した。その後、無血清ＤＭＥＭ培地に溶解された前記狼毒エタノール抽出物を、１，５及び１０μｇ／ｍｌ濃度で追加して添加した。２４時間経過後、細胞培養液を採取し、遠心分離し、上澄み液だけ収穫した。

その後、採取した上澄み液から、コラーゲンＭＭＰ−１ ＥＬＩＳＡキット（ＱＩＡ５５、Merck ＆ Ｃｏ．、米国）を利用して、前記上澄み液中のＭＭＰ−１のレベルを測定した。まず、一次抗体として、マウス抗ＭＭＰ−１抗体が均一に塗布された９６孔平板（９６−well plate）のウェルに、前記上澄み液を入れ、２時間常温でインキュベーションし、抗原・抗体複合体を形成させた。２時間後、発色団として、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）が接合された抗ＭＭＰ−１抗体を、９６孔平板のウェルに入れ、１時間インキュベーションさせた。１時間後、発色基質として、テトラメチルベンジジン（tetramethylbenzidine）を入れ、室温で３０分間インキュベーションさせ、発色を誘発させた後、さらに終結バッファを入れて反応を中止させれば、反応液の色は、黄色を帯び、反応進行の程度によって、黄色の程度が異なって示された。黄色を帯びる９６孔平板ウェルの吸光度を、吸光計を利用して、４５０／５４０ｎｍで測定した。

図６は、狼毒エタノール抽出物の存在が、ＭＭＰ−１の発現レベルに及ぼす影響を確認した結果である。その結果、図６に示されているように、狼毒エタノール抽出物が、ＭＭＰ−１遺伝子発現の抑制にすぐれた効果を有するということが分かった。陽性対照群としては、エピカルロカテキン（ＥＧＣＧ：epigallocatechin gallate）を使用した。

５．ＵＶによって老化が誘導された線維芽細胞におけるコラーゲン生成増進測定実験
前記狼毒エタノール抽出物のタイプ−１プロコラーゲン（type−１ procollagen）の発現を促進させるか否かということを確認した。

まず、２．５％の牛胎児血清が含有されたＤＭＥＭ培地が入っている２４孔平板培養器に、ヒト線維芽細胞を１×１０^５細胞／孔（well）になるように入れ、９０％ほどのコンフルエンスまで育つまで培養した。その後、無血清ＤＭＥＭ培地に溶解された前記狼毒エタノール抽出物を、１，５及び１０μｇ／ｍｌ濃度で２４時間処理した後、ＵＶ照射機を利用して、ＵＶＢ、すなわち、１５ｍＪを照射した。その後、無血清ＤＭＥＭ培地に溶解された前記狼毒抽出物を、１，５及び１０μｇ／ｍｌ濃度で追加して添加し、同一に培養した。２４時間経過後、細胞培養液を採取して遠心分離し、上澄み液だけ収穫し、プロコラーゲンタイプＩＣ−ペプチドＥＩＡキット（ ＰＩＰ（Procollagen Type ＩＣ−Peptide） ＥＩＡ Kit）（Ｃａｔ．＃ＭＫ１０１、Takara Bio Ｉｎｃ．、日本）を使用して、収獲された上澄み液のうちプロコラーゲンタイプ−ＩＣ−ペプチド（ＰＩＰ：procollagen type−Ｉ Ｃ−peptide）のレベルを測定した。ＰＩＰは、生体内でコラーゲンを合成する過程において、プロコラーゲンからコラーゲンに転換される過程において切られて出るペプチドであり、ＰＩＰのレベルは、コラーゲンのレベルと比例するために、当業界において、コラーゲンレベル確認に指標として使用されているペプチドである。

具体的に見れば、マウス抗ＰＩＰダンクロン抗体が均一にコーティングされた９６孔平板のウェルに、ホースラディッシュペルオキシダ、ムゼ（horseradish peroxidase）（ＰＯＤ）が接合されたマウス抗ＰＩＰダンクロン抗体（「抗体・ＰＯＤ接合体」ともいう）を添加し、その後、前記細胞培養液及び標準溶液（standard solution）をそれぞれ添加し、３７℃で３時間置いた。その後、ウェルを洗浄し、過酸化水素とテトラメチルベンジジン（tetramethylbenzidine）とを含んだ基質溶液を添加し、室温で１５分インキュベーションした。その後、ウェルに反応中止溶液（stop solution）を入れ、反応を中止させ、吸光計（plate reader）を利用して、４５０ｎｍで吸光度を測定した。

図７は、ＵＶＢ照射されたヒト線維芽細胞において、狼毒エタノール抽出物が、タイプ−１プロコラーゲンの発現に及ぼす程度を測定した結果を示す。その結果、図７に示されているように、狼毒エタノール抽出物が、タイプ−１プロコラーゲンの発現を促進させるのにすぐれた効果を有するということが分かった。

６．動物実験での傷回復増進
前記狼毒抽出物が、動物実験において、傷部位の回復を促進するか否かということを下記のように確認した。

（１）実験動物
ＳＤ（Sprague-Dawley）ラット（雄、７週齢）を（株）コアテックから入手し、２５±１℃、湿度５０±１０％を維持し、明暗は、昼夜１２時間で自動調節しながら維持した。また、一般食餌の飼料及び水は、自由に摂取するようにし、全ての実験動物は、１週間動物室環境に適応させた後、実験に使用した。実験群に投与した食餌、投与用量及び投与方法は、下記表２に示した。

（２）傷誘発及び処置
ＳＤラットを、麻酔前２４時間節食させ、１００ｍｌの水を供給した。全ての実験群に傷を誘発させる１時間前、１００％のゾレチルと１００％のロムプンとを１：２比率で混合し、全ての実験群に対して、得られた混合物を０．１ｃｃ／ｋｇ使用して、筋肉注射で麻酔させた。その後、全ての実験群に対して、電気除毛機でラット背部位の毛を除去した。背部位に、それぞれ１０％のポビドン・ヨードと、７０（ｖ／ｖ）％のエタノールとを塗布して消毒した後、背部位に、消毒された手術用はさみを利用して、直径２ｃｍｘ２ｃｍの正方形サイズに、真皮層を含んだ全層欠損傷（full-thickness excisional wound）を誘発させた。

（３）肉眼的傷変化の観察
それぞれの前記狼毒抽出物（１％あるいは３％（ｖ／ｖ））、及び傷治癒に効能があると知られている壺草抽出物（１％あるいは３％（ｖ／ｖ））を、２週間１日１回傷ついた皮膚に塗布した。該壺草抽出物は、実施例１の２に記載されたところと同一である。それぞれの試験物質を傷に塗布して、それぞれ１日目、４日目、８日目、１１日目及び１５日目に傷部位を撮影し、ImageＪ（ＮＩＨ、米国）を利用して、傷口面積を測定して分析した。

（４）組織学的検査
それぞれの試験物質投与後１４日目、全ての実験群をエーテルで吸入麻酔させ、試験物質の投与部位を、１０％中性緩衝ホルマリン溶液で固定した。病理組織学的検査のために、傷口面を等しく検査することができるように、固定が完了した皮膚組織を、傷口面の長軸を基準に、縦横２ｃｍｘ２ｃｍの正方形サイズにそれぞれ１部位ずつ切断した。切断された組織を、一般的な組織処理方法によって、パラフィンで包埋した後、約３〜４μｍ厚に組織切片を製作し、スライドガラスに付着させた。付着が完了した切片に、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行い、染色された切片を、光学顕微鏡（Olympus ＢＸ５３、日本）で検査した。傷組織（例：創傷）に対する判読は、Nisbetら（Tissue Eng Part A. 2010, Sep; 16 (9): 2833-42）とBaratiら（Diagn Pathol. 2013; 8: 120）とが評価した方法を基に点数を決め、それぞれ所見に係る基準は、下表３の通りである。

図８は、狼毒エタノール抽出物が、動物実験において、開いた傷の上皮化（epithelialization）に及ぼす影響を示した図面である。図８において、横軸のＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４及びＧ５は、表２に示されているような実験群を示し、縦軸の点数（score）は、表３に定義される上皮化基準によって測定された値である。

図８に示されているように、本願発明の狼毒抽出物Ｇ４及びＧ５は、対照群Ｇ１に比べ、有意に上皮化を増大させた。図８及び図９において、＊は、シェッフェ試験（Scheffe’s test）ｐ＜０．０５によるＡＮＯＶＡを示す。

図９は、狼毒エタノール抽出物が、動物実験において、開いた傷の傷口面積低減に及ぼす影響を示した図面である。図９において、傷口面積は、狼毒抽出物を傷に塗布した後、１日目、４日目、８日目、１１日目及び１５日目に傷口面積を測定した結果を示す。図９において、横軸のＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４及びＧ５は、表２に示されているような実験群を示し、縦軸は、傷口面積を示す。図９に示されているように、本願発明の狼毒抽出物Ｇ４及びＧ５は、対照群Ｇ１に比べ、傷口面積を顕著に低減させた。

図１０は、狼毒エタノール抽出物が、動物実験において、開いた傷の回復を促進させるところを、Ｈ＆Ｅ染色法で確認した結果である。図１０に示されているように、本願発明の狼毒抽出物は、対照群に比べ、傷の再上皮化を促進した。図８のＨ＆Ｅ組織染色によれば、２層を確認することができるが、上層の濃いピンク色が表皮であり、下層の薄いピンク色が真皮である。対照群と、試料と処理した群とを比較したとき、上層の表皮の厚みや割れが、試料処理群において、回復するということを確認することができる。

以上の結果から、狼毒抽出物は、動物実験において、開いた傷の再上皮化を促進し、回復を顕著に促進した。以上の結果は、狼毒地上部のエタノール抽出物を使用して得られた結果に基づいたものであるが、狼毒地上部のエタノール抽出物のヘキサン分画物、酢酸エチル分画物またはブタノール分画物、狼毒地上部のアセトン抽出物、メタノール抽出物またはブタノール抽出物、またはそのヘキサン分画物、酢酸エチル分画物またはブタノール分画物についても、類似した結果を得た。

また、前述の実施例によれば、紫外線が照射された条件で狼毒抽出物は、ヒト線維芽細胞から、ＭＭＰ−１の発現を低減させ、コラーゲン発現を促進させると確認された。すなわち、前記狼毒抽出物は、ヒト線維芽細胞において、紫外線が照射された条件で、コラーゲン分解酵素の発現は低減させながら、コラーゲンの発現を促進させた。従って、前記狼毒抽出物は、ヒト線維芽細胞を含む組織において、例えば、皮膚において、コラーゲン合成を促進させ、その組織の弾力性を維持して促進させることができる。従って、前記狼毒抽出物は、ヒト線維芽細胞を含む組織、例えば、皮膚しわを改善させるか、あるいは皮膚老化を防止するのに効果がある。

実施例２：狼毒幹抽出物及びその分画物の製造
本実施例においては、狼毒から、狼毒幹抽出物及びその分画物を製造し、狼毒幹抽出物及び前記分画物が傷治療に及ぼす効果を確認した。

１．狼毒幹抽出物及びその分画物の製造
（１）狼毒幹抽出物の製造
狼毒抽出物は、モンゴルウランバートル近郊で生育したものであり、地上部のうち幹のみを採集した。採集された幹を水で洗浄して乾燥させた。乾燥された狼毒幹は、押し切りを利用して、２〜３ｃｍに細切りして使用した。ガラス三角フラスコに、前記細切りされた狼毒幹１００ｇと、９５％のエタノール１Ｌとを入れて混合した。該混合物を常温（約２０℃）で４８時間１５０ｒｐｍで撹拌して抽出した。

次に、該混合物を濾過紙（Whatman、ＮＯ．２、８μｍ）に通過させて得られた濾過液を得た。得られた濾過液を、回転式減圧濃縮機（EYELA、Ｎ−１１００）を使用して、減圧濃縮し、残っている溶媒を除去するために、４８時間凍結乾燥（Operon、ＦＤＣＦ−１２００３）を実施し、溶媒が除去された乾燥された狼毒抽出物３ｇを得た。

（２）狼毒幹抽出物分画物の製造
乾燥された狼毒抽出物３ｇと水１００ｍＬとを三角フラスコに入れて懸濁した後、分別漏斗（２５０ｍＬ）に入れ、ここに、ｎ−ヘキサン（extra pure grade、９５％以上）１００ｍＬを添加して十分に振った後、常温で３時間放置した。前記混合物から、分別漏斗を利用してヘキサン層のみを取り、前述のような過程を３反復して実施し得られたヘキサン分画は、減圧濃縮（EYELA、Ｎ−１１００）を行い、ヘキサン分画を得た。

また、同一方法により、前記ヘキサン分画が除去された水分画に対して、酢酸エチルを添加して混合した後、同一過程を経て、酢酸エチル分画を得た。

また、同一方法により、前記酢酸エチル分画が除去された水分画に、水泡化ブタノールを添加して混合した後、同一過程を経て、ブタノール分画を得た。

前記狼毒抽出物とその分画物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に２０ｍｇ／ｍｌ濃度で溶かした後、下記実験に利用した。

２．ヒト角質形成細胞の移動増加
前記狼毒幹抽出物またはその分画物が、ヒト角質形成細胞が移動することを増大させるか否かということを下記のように確認した。

牛胎児血清が２．５（ｖ／ｖ）％に含有されたＤＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ：Dulbecco’s Modified Eagle’s Media）培地１ｍｌが入っている２４ウェル平板培養器のウェルに、ＨａＣａＴヒト角質形成細胞を２×１０^５細胞／ウェルになるように入れた。次に、前記角質形成細胞を、コンフルエンスが８０％になるまで、３７℃及び５％ ＣＯ_２培養器で培養させた後、培地中の細胞単一層をｐ１０ピペットチップで引っ掻き、「引っ掻き損傷」を誘導した。

次に、前記引っ掻かれた細胞単一層上に、無血清ＤＭＥＭ ２００μｌと、前記狼毒抽出物またはその分画物とを、５μｇ／ｍｌ培地及び１０μｇ／ｍｌ培地の濃度で添加した。その後、前述の培養条件と同一条件で、ヒト角質形成細胞を２４時間培養させた。陰性対照群としては、前記抽出物を溶かすのに使用したＤＭＳＯを同量処理し、陽性対照群としては、ＰＰＡＲδ活性体であるＧＷ５０１５１６（Sigma Aldrich、米国）または壺草抽出物を、指定された濃度で使用した。その後、クリスタルバイオレット（crystal violet）試薬で細胞層を染色した後、引っ掻き傷が回復する程度を確認した。前記壺草抽出物は、バイオスペクトラム（韓国）から購入したものである。

図１１は、狼毒幹抽出物が角質形成細胞の移動を促進させるところを確認した結果である。

図１２は、狼毒幹抽出物の分画物が、角質形成細胞の移動を促進させるところを確認した結果である。

図１１及び図１２に示されているように、陰性対照群が処理された細胞の引っ掻き損傷は、２４時間後に相対的に治癒されていないまま残っているのに対し、狼毒幹抽出物または分画物が処理された細胞においては、傷端の細胞増殖及び細胞移動で引っ掻き損傷が治癒され、２４時間後、引っ掻き面積が低減した。図１１において、ＧＷは、ＧＷ５０１５１６を示す。

３．線維芽細胞における、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子及びＣＯＬ３Ａ１遺伝子の発現増大
前記狼毒幹抽出物またはその分画物が、ヒト線維芽細胞において、コラーゲン遺伝子の発現を促進させるか否かということを下記のように確認した。

牛胎児血清が２．５（ｖ／ｖ）％に含有されたＤＭＥＭ培地２ｍｌが入っている６ウェル平板培養器のウェルに、ヒト線維芽細胞（ＨＤＦ：human dermal fibroblasts、American Type Culture Collection、米国）を２×１０^６細胞／ウェルになるように入れ、コンフルエンスが８０％になるまで、前述のところと同一条件で培養した。

かように培養した細胞に、前記狼毒幹抽出物を、それぞれ１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、及び１０μｇ／ｍｌ、狼毒幹抽出物の分画物を、それぞれ５μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、２４時間、前述のところと同一条件で培養させた。陰性対照群としては、前記抽出物を溶かすのに使用したＤＭＳＯを同量処理し、陽性対照群としては、壺草抽出物（バイオスペクトラム、韓国）を使用した。２４時間後、ＲＴ−ＰＣＲアッセイを介して、コラーゲン遺伝子が発現されるか否かということを確認した。具体的には、２４時間経過後、細胞から、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen、Carlsbad、ＣＡ、米国）を使用して、総ＲＮＡを収穫して逆転写させた後、ＲＴ−ＰＣＲを、次のように行った。まず、ｃＤＮＡ合成のために、前記ＲＮＡを逆転写酵素（reverse transcriptase）を使用して逆転写させた。ＲＴ−ＰＣＲは、表１の特定プライマーをプライマーとして使用して行った。各遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現量値は、β−アクチン値で標準化した。

図１３は、狼毒幹抽出物が線維芽細胞において、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子及びＣＯＬ３Ａ１遺伝子の発現を促進させるところを確認した結果である。

図１４は、狼毒幹抽出物の分画物が、線維芽細胞において、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子及びＣＯＬ３Ａ１遺伝子の発現を促進させるところを確認した結果である。

図１３及び図１４に示されているように、狼毒幹抽出物またはその分画物は、コラーゲン合成関連因子であるＣＯＬ１Ａ１及びＣＯＬ３Ａ１から構成された群のうちから選択される１以上遺伝子の発現を活性化させる効果が顕著であるということが分かった。

４．動物実験での傷回復増進
前記狼毒幹抽出物が、動物実験において、傷部位の回復を促進するか否かということを下記のように確認した。

（１）実験動物
ＳＤ（Sprague-Dawley）ラット（雄、７週齢）を（株）コアテックから入手し、２５±１℃、湿度５０±１０％を維持し、明暗は、昼夜１２時間で自動調節しながら保管した。また、一般食餌の飼料及び水は自由に摂取するようにし、全ての実験動物は、１週間動物室環境に適応させた後、実験に使用した。実験群に投与した食餌、投与用量及び投与方法は、下記表４に示した。

（２）傷誘発及び処置
ＳＤラットを、麻酔前２４時間節食させ、１００ｍｌの水を供給した。全ての実験群に、傷を誘発する１時間前、１００％のゾレチルと１００％のロムプンとを１：２比率で混合し、全ての実験群に対して、得られた混合物を０．１ｃｃ／ｋｇ使用して、筋肉注射で麻酔させた。その後、全ての実験群に対して、電気除毛機でラットの背部位毛を除去した。背部位に、それぞれ１０％のポビドン・ヨードと７０％エタノールとを塗布して消毒した後、背部位に、消毒された手術用はさみを利用して、直径２ｃｍｘ２ｃｍの正方形サイズに真皮層を含んだ全層欠損傷（full-thickness excisional wound）を誘発させた。

（３）肉眼的傷変化の観察
それぞれの前記狼毒幹抽出物及び傷治癒に効能があると知られている壺草抽出物を、２週間３％（ｖ／ｖ）で、１日１回傷ついた皮膚に塗布した。壺草抽出物は、実施例１の２に記載されたところと同一である。それぞれの試験物質を傷に塗布して、それぞれ１日目、４日目、８日目、１１日目及び１４日目に傷部位を撮影し、ImageＪ（ＮＩＨ、米国）を利用して、傷口面積を測定して分析した。

（４）組織学的検査
それぞれの試験物質投与後１４日目、全ての実験群に対して、エーテルで吸入麻酔し、試験物質の投与部位を１０％の中性緩衝ホルマリン溶液で固定した。病理組織学的検査のために、傷口面を等しく検査することができるように、固定が完了した皮膚組織を、傷口面の縦方向（longitudinal）に、縦横で２ｃｍｘ２ｃｍの正方形サイズに、それぞれ１部位ずつ切断した。切断された組織を、一般的な組織処理方法によって、パラフィンで包埋した後、約３〜４μｍ厚に組織の切片を製作し、スライドガラスに付着させた。付着が完了した切片に、ヘマトキシリン・エオシン染色を行い、染色された切片を光学顕微鏡（Olympus ＢＸ５３、日本）で検査した。傷組織に対する判読は、当該技術分野に公知の評価方法で点数を決めて行った（Nisbetら（Tissue Eng Part A. 2010, Sep; 16 (9): 2833-42））及びBaratiら（Diagn Pathol. 2013; 8: 120））。判読時、それぞれの所見に係る基準は、下記表５に示されている通りであり、その判読結果を表６に示した。

表６に示されているように、狼毒幹抽出物は、線維組織形成、血管形成及び上皮化が顕著であるということが分かる。

図１５は、狼毒幹抽出物が、動物実験において、開いた傷の回復を促進させるところを臨床学的に確認した結果である。図１６は、狼毒幹抽出物が、動物実験において、開いた傷の回復を促進させるところを定量的に確認した結果である。また、図１５及び図１６に示されているように、狼毒抽出物は、傷部位の再上皮化を促進させ、開いた傷を回復する効果が顕著であるということが分かる。

製剤１：薬学的製剤の製造
１．軟質カプセル制の製造
狼毒幹エタノール抽出物または分画物１５０ｍｇ、パーム油２ｍｇ、パーム硬化油８ｍｇ、黄蝋４ｍｇ及びレシチン６ｍｇを混合し、一般的な方法によって、１カプセル当たり４００ｍｇずつ充填し、軟質カプセル剤を製造した。

２．錠剤の製造
狼毒幹エタノール抽出物または分画物１５０ｍｇ、ブドウ糖１００ｍｇ、紅参抽出物５０ｍｇ、澱粉９６ｍｇ及びステアリン酸マグネシウム４ｍｇを混合し、３０％エタノールを４０ｍｇ添加して顆粒を形成した後、６０℃で乾燥させ、打錠機を利用して、錠剤に打錠して錠剤を製造した。

３．顆粒剤の製造
狼毒幹エタノール抽出物または分画物１５０ｍｇ、ブドウ糖１００ｍｇ、紅参抽出物５０ｍｇ及び澱粉６００ｍｇを混合し、３０％エタノールを１００ｍｇ添加し、顆粒を形成した後、６０℃で乾燥させて顆粒を形成した後、包みに充填した。内容物の最終重量は、１ｇにした。

製剤２：化粧料組成物の製造
本製剤例に使用された狼毒抽出物は、幹のエタノール抽出物である。

１．柔軟化粧水（スキンローション）の製造

２．栄養化粧水（ミルクローション）の製造

３．栄養クリームの製造

４．マッサージクリームの製造

５．パックの製造

６．軟膏の製造

Claims (8)

1. 狼毒抽出物またはその分画物を有効成分として含む、皮膚しわ改善用または皮膚老化防止用の化粧料組成物であって、前記狼毒抽出物は、前記狼毒の地上部から抽出されたものであり、前記狼毒抽出物は、水抽出物、アセトン抽出物、Ｃ _１ −Ｃ _６ アルコール抽出物、水とアセトンとの抽出物、または水とＣ _１ −Ｃ _６ アルコールとの抽出物であり、
   細胞中のコラーゲン遺伝子の発現を促進させる、組成物。
2. 前記狼毒抽出物は、水抽出物、Ｃ₁−Ｃ₆アルコール抽出物、または水とＣ _１ −Ｃ _６ アルコールとの抽出物である、請求項１に記載の組成物。
3. 前記狼毒抽出物は、７５（ｖ／ｖ）％ないし１００（ｖ／ｖ）％エタノール抽出物、７５（ｖ／ｖ）％ないし１００（ｖ／ｖ）％メタノール抽出物、または７５（ｖ／ｖ）％ないし１００（ｖ／ｖ）％ブタノール抽出物である,請求項１に記載の組成物。
4. 前記分画物は、ヘキサン分画物、酢酸エチル分画物、ブタノール分画物、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の組成物。
5. 前記狼毒抽出物またはその分画物は、組成物重量に対して、０．００１重量ないし８０重量％である、請求項１に記載の組成物。
6. 化粧料として許容可能な賦形剤または担体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
7. 請求項１ないし６のうちのいずれか１項に記載の化粧料組成物を個体の皮膚に適用する段階を含む、皮膚を化粧するための方法。
8. 皮膚しわを改善させたり、または皮膚老化を防止したりする、請求項７に記載の方法。