KR101054903B1

KR101054903B1 - 오미자 종자로부터 리그난의 추출방법

Info

Publication number: KR101054903B1
Application number: KR1020090085386A
Authority: KR
Inventors: 최영환
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2009-09-10
Filing date: 2009-09-10
Publication date: 2011-08-05
Also published as: KR20110027339A

Abstract

본 발명은 오미자 종자로부터 리그난 또는 이를 함유한 추출물의 추출방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 오미자 종자를 헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 메탄올 및 30 내지 100%의 에탄올로 이루어진 그룹으로부터 선택된 용매로 추출하는 단계를 포함하는 오미자 종자로부터 리그난 또는 이를 함유한 추출물의 추출방법에 관한 것이다.

오미자 종자, 리그난, 시산드린, 시산드린 C, 고미신 A, 고미신 N

Description

오미자 종자로부터 리그난의 추출방법{Method for Extraction of Lignan from Seed of Schisandra chinensis}

오미자(Schisandra chinensis)는 전통 중국 의학에서 잘 알려진 역사를 가지고 있다. 오미자는 시베리아의 동부 지역, 중국, 일본 및 한국에 넓게 분포되어 있다. 지난 20년 이상, 이 식물로부터 고미신(gomisin) A, B, C, D, E, F, G, K3, N, J, 시산드롤(schisandrol) B, 시산드린(schisandrin) 및 시산드린 C를 포함한 많은 활성의 리그난(lignan)을 분리하였다.

상기 리그난은 치료 특성에 따라 4개의 주요 카테고리로 분류할 수 있다: 어답토겐(adaptogenic) 작용, 간 보호, 간 안정화 및 간 재생. 첫 번째 카테고리인 어답토겐 작용은 특이한 작용 메커니즘을 갖는 것으로, 에너자이저(energizer), 신경계 촉진제, 산소공급기(oxygenator), 면역조절제, 항산화제 및 피부보호제로서 작용하는 리그난을 포함한다. 상기 리그난은 고지혈증을 감소시키고 동맥경화의 진행을 현저하게 억제하는 것으로 규명되었다. 두 번째 카테고리는 간 보호이다. 상기 리그난은 간의 아스코르브산 수치 증가, NADPH 산화와 지질 과산화의 억제 및 간의 마이크로좀 시토크롬 P-450 효소의 유도 효과와 밀접하게 관련되어 있다. 간 보호 리그난은 독성 물질에 의해 유도되는 담즙울체(cholestasis)로부터 간을 보호하는 것으로 알려져 있다. 세 번째 카테고리인 간 안정화와 관련하여, 이들 화합물이 간세포 성장 인자 mRNA 전사의 유도, 간세포 증식의 촉진 및 간으로 혈류의 증가를 통해 간의 재생 과정에 기여한다는 것을 입증하였다. 또한, 이러한 리그난은 간 글루코겐의 합성과 글루타치온의 감소를 통한 재생능력을 증진시키 위하여, 미토콘드리아 환원효소 글루타치온의 활성과 미토콘드리아 간 글루타치온의 수준의 증가를 유도한다는 것으로 알려져 있다.

이와 같이 리그난의 효능이 입증되면서 그에 대한 수요가 증가하고 있어, 경제적이면서도, 간편하게, 고수율로 리그난을 추출할 수 있는 방법이 필요한 상황이다.

본 발명자는 이러한 조건에 부합하는 리그난의 추출방법을 연구하던 중 오미 자 종자를 특정 용매로 추출한 결과 다량의 리그난을 추출할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은, 오미자 종자를 헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 메탄올 및 30 내지 100%의 에탄올로 이루어진 그룹으로부터 선택된 용매로 추출하는 단계를 포함하는 오미자 종자로부터 리그난 또는 이를 함유한 추출물의 추출방법을 제공하는데 있다.

본 발명자는 오미자 종자로부터 리그난을 다량 추출할 수 있다는 것을 규명하였다.

본 발명에서 '오미자 종자'는 가공되지 않은, 천연의 신선한 오미자 과실, 건조된 오미자 과실 또는 오미자 가공 부산물로부터 분리된 것일 수 있다.

본 발명에서 '오미자 가공 부산물'은 오미자의 가공 과정에서 발생하는 부산물을 의미하며, 예를 들면, 오미자로부터 오미자유, 오미자차, 오미자주 또는 오미자 음료 등을 제조한 후 남은 오미자 과실의 종자일 수 있다.

본 발명의 추출방법에 따라 오미자 종자로부터 추출되는 '리그난'은 이에 제한되는 것은 아니지만, 고미신 N(gomisin N), 시산드린(schisandrin), 시산드린 C(schisandrin C) 또는 고미신 A(gomisin A)일 수 있다. 본 발명에서 리그난을 함유하는 추출물은 오미자유일 수 있다.

본 발명의 추출방법에 이용할 수 있는 '용매'는 헥산, 클로로포름, 에틸 아 세테이트, 메탄올 및 30~100%의 에탄올로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 추출방법에 따라 추출된 리그난 또는 이를 함유한 추출물 중 시산드린 C 및 고미신 N의 함량을 높이기 위해서는, 오미자 종자를 헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 메탄올 또는 60% 이상의 에탄올을 용매로 이용하여 추출하는 것이 바람직하다(실시예 2-2 참조).

본 발명의 추출방법에 따라 추출된 리그난 또는 이를 함유한 추출물 중 고미신 A의 함량을 높이기 위해서는, 오미자 종자를 헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 메탄올 또는 40% 이상의 에탄올을 용매로 이용하여 추출하는 것이 바람직하다(실시예 2-2 참조).

본 발명의 추출방법에 의하면, 오미자 종자로부터 다량의 리그난을 추출할 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1: 재료 및 방법>

1-1. 리그난의 추출방법

신선 오미자 또는 가공 부산물로부터 리그난을 추출하기 위하여, 헥산, 클로로포름(CHCl₃), 에틸 아세테이트, 메탄올과 100%, 80%, 60%, 40%, 30%, 20%, 15%, 0%의 에탄올 또는 30%의 소주로 리그난을 추출하였다. 추출방법은 오미자 과실 또는 가공 부산물을 종자와 과육으로 분리하여 분쇄한 다음 2.5 ml의 용매를 첨가하여 볼텍싱(vortexing)한 후, 1시간 동안 소니케이션(sonication)하여 3000 rpm에서 15분 동안 원심분리한 상등액을 회수하였다. 위와 같은 방법으로 3회 반복 추출한 다음 용액을 10 ml로 맞춘 다음 20 ㎛ 필터(filter)로 여과해서 10배로 희석하였다. 최적의 추출 용매를 규명하기 위하여 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 메탄올과, 에탄올을 전통적으로 오미자주를 제조할 때 이용하는 소주의 농도에 맞추어서 주요 리그난 성분을 추출하여 HPLC로 정량하였다. 이 때 사용한 리그난 표준물질은 아래와 같이 본 실험실에서 순수 분리한 물질을 이용하였다.

1-2. 추출 및 화합물 구조식의 예측

오미자 건조 열매(2.5kg)를 미세 분말로 갈아서 실온에서 n-헥산, EtOAC 및 MeOH 순서로 추출하였다. 헥산 추출물(308g)을 진공 하에서 증발시키고 실리카 겔(40㎕; J.T. Baker, NJ, USA) 컬럼(70 x 8.0cm) 상에서 (각각 1ℓ의) 헥산에 녹 인 0, 5, 10, 20 및 30% EtOAc의 스텝 그레디언트(step gradient)로 크로마토그래피를 실시하였다. 이 추출물 중 분획물 11(3,476mg)을 실리카 겔 컬럼(100 x 3.0cm) 상에서 CHCl₃에 녹인 25% 헥산으로 추출하여 38개의 분획물을 생성하였다. 분획물 11로부터 유래된 38개의 아분획물(subfraction) 중 하나인 분획물 11IA를 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피로 추가로 정제하고 CHCl₃-아세톤(19:1)으로 용출하여 고미신 N(774mg)을 생산하였다. 분획물 8(1.579mg)을 실리카 겔 컬럼(100x 3.0cm) 상에서 CH₂Cl₂로 분리하여 시산드린 C(501mg)를 생산하였다. 분획물 29(1,992mg)를 실리카 겔 컬럼 상에서 아세톤에 녹인 15% CHCl₃로 분리하여 고민신 A(973mg)를 생산하였다. 분획물 36, 37 및 38(10,533mg)을 실리카 겔 컬럼(100x 3.0cm) 상에서 아세톤에 녹인 5% CH₂Cl₂로 분리하여 시산드린(4,606mg)을 생산하였다.

순수한 고미신 A는 Phenomenex Luna C18 컬럼(Phenomenex: 150 x 4.6mm I.D., 5-㎛ 입자크기)을 이용한 고성능 액체 크로마토그래피로 동정되었다. 본 실시예에서 이용된 모든 리그난의 화학 구조식은 LC-MS(liquid chromatography-mass spectrometry)(Bruker Bio-Apex FT Mass Spectromter) 및 NMR(nuclear magnetic resonance)(Varian Inova 500 Spectrometer) 분석을 통해 확인되었다. 최적의 회전(rotation)은 Jasco DIP-370 Digital Polarimeter로 기록하였다. IR 스펙트럼은 AATI Mattson Genesis Series FTIR로 기록하였다. 오미자로부터 순수분리한 리그난 은 CDCl₃에 녹인 후 Varian Inova 500 NMR 기기를 이용하여 ¹H은 500 MHz, ¹³C은 125 MHz에서 측정하였다. 고해상도 질량 스펙트럼은 Bruker Bio-Apex FT Mass Spectrometer로 기록하였다.

1-3. 리그난 성분 분석을 위한 HPLC 분석

분석기기는 고속액체크로마토그라피 (HPLC)를 이용하였으며 컬럼은 Phenomenex Luna C18 column (Phenomenex, 150 4.6 mm ID; 5 lm particle size), 이동상은 acetonitrile-water, 유속은 1.0 ml/분으로 하였다.

<실시예 2 : 결과>

2-1. 오미자로부터 4종 리그난의 분리

오미자로부터 n-헥산, EtOAc 및 MeOH에 의해 다양한 화합물을 추출하였고, 다른 리그난에 비해 다량으로 추출되는 4종의 리그난을 회수하였다. 이 리그난의 구조식은 LC-MS 및 NMR 분석으로 결정하고, 이 리그난을 고미신 N, 시산드린, 시산드린 C 및 고미신 A로 동정하였다(도 1). 상기 4종의 리그난이 본 실시예에서 이용하기에 충분히 순수한지 크로마토그래피를 이용하여 검증하였다(도 2). 이로써, 오미자 가공 부산물로부터 리그난 함량을 검사하기 위해 4종의 리그난을 오미자로부터 성공적으로 분리하였고, 후속 실시예에 이용하였다.

2-2. 오미자로부터 리그난의 다량분리를 위한 용매 조건 규명

오미자의 주요 생리활성 물질인 4가지 리그난 성분의 효율적인 추출방법을 규명하기 위하여, 신선 오미자 또는 가공 부산물의 과육과 종자를 헥산, 클로로포름, 에틸 아세티이트, 메탄올 용매, 100, 80, 60, 40, 30, 20, 15와 0%의 에탄올 및 30%와 20%의 과실 제조용 소주로 추출하여 오미자의 주요 리그난 성분인 시산드린, 시산드린 C, 고미신 A 및 고미신 N의 농도를 측정하였다. 도 3은 신선 오미자의 종자로부터 상기 용매를 이용하여 추출된 주요 리그난의 함량, 도 4는 신선 오미자의 과육으로부터 상기 용매를 이용하여 추출된 주요 리그난의 함량을, 도 5는 신선 오미자 또는 가공 부산물의 종자와 과육으로부터 상기 용매를 이용하여 추출된 리그난의 함량을 각각 나타낸 것이다. 도면에 나타난 바와 같이, 시산드린은 헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 메탄올 용매와 100%, 80%, 60%, 40%의 에탄올에서는 약 1.4% 이상의 고 농도로 추출되었으나, 30% 이하로 에탄올의 농도가 감소할수록 추출량도 감소하였다. 시중에서 판매되고 있는 30%와 20%의 소주는 30%와 20% 농도의 에탄올과 유사하다. 시산드린 C는 헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 메탄올 용매와 100%의 에탄올로 추출하였을 때에는 0.4% 이상이 추출되었으나, 60% 이하의 알코올에서는 급격하게 감소하였으며, 30%의 알코올에서는 전혀 추출되지 않았다. 고미신 A의 추출량은 40% 이하의 에탄올에서 급격하게 감소하였다. 고미신 N도 시산드린 C와 유사한 경향으로서 30% 이하의 에탄올에서는 거의 추출되지 않았다.

도 1은 오미자로부터 추출된 리그난의 화학 구조식을 나타낸 것이다(A: 고미 신 N, B: 고미신 A, C: 시산드린, D: 시산드린 C).

도 2는 오미자의 리그난에 대한 HPLC(high performance liquid chromatography) 프로필을 나타낸 것이다.

도 3은 신선 오미자의 종자로부터 여러 용매를 이용하여 추출된 주요 리그난의 함량을 나타낸 것이다.

도 4는 신선 오미자의 과육으로부터 여러 용매를 이용하여 추출된 주요 리그난의 함량을 나타낸 것이다.

도 5는 신선 오미자 또는 가공 부산물의 종자와 과육으로부터 여러 용매를 이용하여 추출된 리그난의 함량을 나타낸 것이다(신선 오미자의 종자(SF), 신선 오미자의 과육(FF), 가공 부산물의 종자(ES), 가공 부산물의 과육(EF)).

Claims

a) 오미자 종자를 분쇄(grinding)하는 단계;

b) 상기 분쇄된 오미자 종자를 헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 및 30~100%의 에탄올로 이루어진 그룹으로부터 선택된 용매를 2.5ml 첨가하여 볼텍싱(vortexing) 하는 단계;

c) 상기 볼텍싱된 오미자 용액을 음파처리(sonication)하여 3000rpm에서 15분 동안 원심분리한 상등액을 회수하는 단계;

d) 상기 a)에서 c) 까지의 단계를 3회 반복하여 행한 뒤, 오미자 용액을 추출하고 그 양을 10ml로 조정하는(adjusting) 단계;

e) 상기 조정된 오미자 용액을 20㎛ 필터로 여과(filtering)해서 10배로 희석하는 단계;를 포함하는, 오미자 종자로부터, 고미신 N(gomisin N), 시산드린(schisandrin), 시산드린 C(schisandrin C) 및 고미신 A(gomisin A)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 리그난 또는 이를 함유한 추출물의 추출방법.
제 1항에 있어서,

상기 오미자 종자는 신선한 오미자 과실, 건조된 오미자 과실 또는 오미자 가공 부산물로부터 분리된 종자인 것을 특징으로 하는 추출방법.
제 2항에 있어서,

상기 오미자 가공 부산물은 오미자로부터 오미자유, 오미자차, 오미자주 또는 오미자 음료 등을 제조한 후 남은 오미자 과실의 종자인 것을 특징으로 하는 추출방법.
삭제
제 1항에 있어서,

상기 추출물은 오미자유인 것을 특징으로 하는 추출방법.
제 1항에 있어서,

상기 리그난이 시산드린 C인 경우에는 오미자 종자를 헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 메탄올 및 60~100%의 에탄올로 이루어진 그룹으로부터 선택된 용매로 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 추출방법.
제 1항에 있어서,

상기 리그난이 고미신 A 경우에는 오미자 종자를 헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 메탄올 및 40~100%의 에탄올로 이루어진 그룹으로부터 선택된 용매로 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 추출방법.
제 1항에 있어서,

상기 리그난이 고미신 N인 경우에는 오미자 종자를 헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 메탄올 및 60~100%의 에탄올로 이루어진 그룹으로부터 선택된 용매로 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 추출방법.