WO2016167518A2 - 피뿌리풀 추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 상처를 치료하기 위한 조성물 및 개체의 상처를 치료하는 방법 - Google Patents

피뿌리풀 추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 상처를 치료하기 위한 조성물 및 개체의 상처를 치료하는 방법 Download PDF

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문길주
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    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations

Definitions

  • a composition for treating a wound comprising a blood extract or a fraction thereof, a method for treating a wound in an individual comprising administering to the individual an amount of the composition effective for treating the wound, for improving the wound, skin
  • the skin acts as a shield to protect the body from the outside.
  • the blood fills the wound site by the natural healing action of the living body, the granule reduction of platelets and activation of the hageman factor are initiated, and the wound healing process proceeds.
  • Blood clotting is a temporary protective action that protects exposed wound tissues and provides a base for cells to migrate during the healing process.
  • the Wound healing and / or healing occurs in three major stages.
  • the first stage is the inflammatory phase, characterized by inflammation at the traumatic site.
  • the inflammatory stages can usually progress briefly in the absence of a serious infection.
  • the second stage is the proliferative phase, which is characterized by epithelialization, angiogenesis, granulation tissue formation and collagen deposition.
  • Angiogenesis involving new capillary formation is used to deliver nutrients and maintain granulation tissue formation. Without the formation of new capillaries into the wound, essential nutrients do not reach the wound, creating a wound that is not chronically cured.
  • As the surface of the damaged wound is covered by a layer of keratinocytes, new epidermis is produced and re-epithelialization occurs where the epithelial layer is rebuilt.
  • a series of processes are performed in which the wound area is reduced through the increase and reorganization of connective tissue.
  • the final stage of wound healing is the maturational phase where fibroblasts differentiate into collagen.
  • the convoluted cells and capillaries of the recovering tissues gradually disappear, and scarring can occur if the cells and capillaries of these tissues are hyperplastic or do not degrade normally.
  • One aspect provides a composition for treating a wound comprising Blood Root Extract, or a fraction thereof, as an active ingredient.
  • Another aspect provides a method of treating a wound in a subject comprising administering to the subject an effective amount of the composition described above to treat the wound.
  • Another aspect provides a cosmetic composition for improving wounds, improving skin wrinkles, or preventing skin aging comprising the extract of the roots of the grass or a fraction thereof as an active ingredient.
  • Another aspect provides a cosmetic method for improving a wound, improving skin wrinkles, or preventing skin aging comprising applying the cosmetic composition to a subject.
  • One aspect provides a composition for treating a wound comprising the extract of Roots of Blood, or a fraction thereof, as an active ingredient, wherein the Roots of Grass extract is extracted from the ground portion of the Roots of Grass.
  • the roots extract may be an extract extracted by a solvent from the whole, part of the ground portion of the roots of the roots, or materials derived therefrom.
  • the portion may be a stem, leaf, flower, or petal of the roots.
  • the roots of grass may be grown in the mountainous region of Mongolia. The region may be in the vicinity of Ulan Bator. The roots of grass can grow to a height of about 30 to 40 cm.
  • the length of the leaves of the roots of the root is about 15 to 27mm and the leaves may be lanceolate.
  • the surface of the leaf may be green and its backside may be bluish gray. Both sides of leaves are hairless and petioles are short. All, part of, or material derived from the above-ground parts of the roots of the roots used for extraction may be ground or shredded or suitably dried.
  • the solvent may be water, acetone, alcohols such as C 1 -C 6 alcohols, or mixtures thereof.
  • the C1-C6 alcohol may be methanol, ethanol, propanol, isopropanol, 1,3-propanediol, butanol, pentanol, hexanol and the like.
  • the solvent may be, for example, a mixture of water and an alcohol, i.e. an aqueous solution of alcohol.
  • the alcohol concentration of the aqueous alcohol solution is 1 to 100 (v / v)%, for example, 1 to 99.5 (v / v)%, 10 to 100 (v / v)%, 20 to 100 (v / v)%, 30 to 100 (v / v)%, 40 to 100 (v / v)%, 50 to 100 (v / v)%, 60 to 100 (v / v)%, 70 to 100 (v / v)%, Or 75 to 100 (v / v)%.
  • the aqueous alcohol solution may be methanol, ethanol, or butanol aqueous solution.
  • the acetone may be 100% concentration.
  • the extraction comprises three to ten (volume / weight) times, for example three to seven (volume / weight) times, of the extraction solvent relative to the entirety, a portion of the above-ground portion of the roots of the grass, or a material derived therefrom. , 3 to 5 (volume / weight) times, 5 to 10 (volume / weight) times, or 4 to 10 times.
  • it may include adding 3 to 10 L of the extraction solvent with respect to all, part of, or 1 kg of material derived from the above-ground parts of the roots of the roots.
  • the extraction is performed by warmed liquid extraction, pressurized liquid extraction (PLE), ultrasonic assisted extraction (MAE), subcritical extraction (SE), or a combination thereof.
  • PLE pressurized liquid extraction
  • MAE ultrasonic assisted extraction
  • SE subcritical extraction
  • the subcritical extraction may be subcritical water extraction (SWE).
  • Subcritical water extraction is also referred to as superheated water extraction or pressurized hot water extraction (PHWE).
  • the warmed liquid extraction may be reflux extraction.
  • the extraction is 4 °C to 70 °C, for example, 4 °C to 50 °C, 4 °C to 40 °C, 4 °C to 30 °C, 10 °C to 70 °C, 15 °C to 70 °C, 20 °C to 70 °C, 4 It may be performed at °C to 50 °C, 10 °C to 50 °C, 4 °C to 40 °C, 4 °C to 30 °C, 10 °C to 40 °C, 10 °C to 35 °C, or 10 °C to 30 °C.
  • the extraction time may vary depending on the temperature selected: 1 hour to 2 months, for example 1 hour to 1 month, 1 hour to 15 days, 1 hour to 10 days, 1 hour to 5 days, 1 hour to 3 days , 1 hour to 2 days, 1 hour to 1 day, 5 hours to 1 month, 5 hours to 15 days, 5 hours to 10 days, 5 hours to 5 days, 5 hours to 3 days, 5 hours to 2 days, 5 Hour to 1 day, 10 hours to 1 month, 10 hours to 15 days, 10 hours to 10 days, 10 hours to 5 days, 10 hours to 3 days, or 10 hours to 2 days.
  • the extraction may comprise mixing all, part of, or material derived from the above-ground parts of the roots of the roots in the solvent and leaving them for a period of time. The neglect may include moderate agitation.
  • the extraction may be repeated one or more times, for example 1 to 5 times.
  • the extraction can separate plant residues and extracts by known methods such as filtration.
  • the extraction may also include removing the solvent from the extract obtained by known methods such as concentration under reduced pressure.
  • the extraction may also include preparing a dry extract by drying the obtained extract, such as lyophilization.
  • the term "fraction" refers to a substance in which the roots extract is divided into parts thereof, ie fractionated material.
  • the fraction may be obtained by solvent fractionation.
  • the solvent fractionation may be to mix the root extract with a solvent and to separate the substance present in the solvent.
  • the fraction may be a hexane fraction, ethyl acetate fraction, butanol fraction, or finally remaining water fraction obtained by suspending the extract of the roots in water and sequentially fractionating it with hexane, ethyl acetate, and butanol.
  • the hexane fraction is by mixing the roots of the extract with water, the mixture is mixed with hexane again and then left for a certain time to separate the hexane layer, by separating the fraction from the separated hexane layer It may be obtained. Separating the fractions may include removing hexanes from the hexane layer.
  • the ethyl acetate fraction may be obtained by separating the hexane fraction and mixing the remaining water layer with ethyl acetate, leaving for a certain time, separating the ethyl acetate layer, and separating the fraction from the separated ethyl acetate layer. have.
  • Separating the fractions may include removing ethyl acetate from the ethyl acetate layer.
  • the butanol fraction may be obtained by separating the ethyl acetate fraction and mixing the remaining water layer with butanol and then left for a certain time to separate the butanol layer, and separating the fraction from the separated butanol layer. Separating the fractions may include removing butanol from the butanol layer.
  • the conditions of the fractionation such as temperature conditions, pressure conditions, time, amount or concentration of solvent used, stirring, etc., may be as described for the extraction used to prepare the above-mentioned extract of the roots.
  • the fractionation may be repeated one or more times, for example 1 to 5 times.
  • the order of fractionation is exemplary, and fractionation with hexane, ethyl acetate, and butanol may be performed in any order.
  • Separation of the fraction may be accomplished by known methods such as filtration.
  • the fractionation can also include removing the solvent from the fraction obtained by known methods such as concentration under reduced pressure.
  • Said fractionation may also comprise concentrating and / or drying the obtained fractions.
  • the concentration may be reduced pressure concentration.
  • the drying may include vacuum drying, boiling drying, spray drying, room temperature drying or lyophilization.
  • the term "wound” means that the tissue is cut, torn, broken, burned, or traumatized. Damage to a human body arising from a disorder or disease causing injury.
  • tissue refers to a mass of cells in the human body that collectively form a specific function. Tissues can include eyes, mucus, lungs, kidneys, heart, intestines, tendons, vascular tissues, bones, skin, connective tissue, and nerves such as the spinal cord.
  • the wound may be an "open wound” with an open surface, or a closed wound with no open surface.
  • One example of such a wound may be an open wound in the skin.
  • the wound may include lesions, sores, necrosis, and ulcers.
  • the necrosis may be related to dead tissue resulting from infection, injury or infarction.
  • the ulcer may be a local defect or dent in the surface of an organ or tissue, produced by stripping of necrotic tissue.
  • wounds are an epidermis of the skin; Dermis; Epidermis and dermis; Or wounds with damaged epidermis, dermis and subcutaneous fat layers.
  • wounds include cuts, incisions (eg surgical incisions), abrasions, lacerations or lacerations, fractures, contusions, burns. Or amputations.
  • a “treat” provided by the present invention may be one that provides for the wound to heal at a shorter time compared to natural healing.
  • the treatment may include amelioration and / or alleviation of the wound.
  • the treatment may include both treatment of a wound and / or a disease associated with the wound. Said treatment may refer to healing and / or regeneration of damaged tissue resulting from the wound.
  • the wound treatment may include the meaning of skin regeneration.
  • the treatment may be to maintain the original composition of the damaged tissue.
  • the treatment may be to promote healing and / or regeneration of the damaged tissue while minimizing the complications and / or scarring of diseases associated with the wound.
  • the composition may be for promoting the previous stage of the wound healing process.
  • the composition may be to promote the proliferative and / or mature phase during the wound healing step.
  • the composition may be for treating a wound in the proliferative and / or mature phase.
  • the composition is 0.001% to 80% by weight, for example, 0.01% to 60%, 0.01% to 40%, 0.01% to 30%, 0.01% to 20% by weight relative to the total weight of the composition %, 0.01 wt% to 10 wt%, 0.01 wt% to 5 wt%, 0.05 wt% to 60 wt%, 0.05 wt% to 40 wt%, 0.05 wt% to 30 wt%, 0.05 wt% to 20 wt%, 0.05 wt% to 10 wt%, 0.05 wt% to 5 wt%, 0.1 wt% to 60 wt%, 0.1 wt% to 40 wt%, 0.1 wt% to 30 wt%, 0.1 wt% to 20 wt%, 0.1 wt% % To 10% by weight, or 0.1% to 5% by weight of the roots extract or fractions thereof.
  • the composition may be a pharmaceutical composition.
  • the composition may comprise a pharmaceutically acceptable diluent or carrier.
  • the diluent may be lactose, corn starch, soybean oil, microcrystalline cellulose, or mannitol, and magnesium stearate as a lubricant, talc, or a combination thereof.
  • the carrier may be an excipient, a disintegrant, a binder, a lubricant, or a combination thereof.
  • the excipient may be microcrystalline cellulose, lactose, low-substituted hydroxycellulose, or a combination thereof.
  • the disintegrant may be calcium carboxymethyl cellulose, sodium starch glycolate, calcium dihydrogen phosphate, or a combination thereof.
  • the binder may be polyvinylpyrrolidone, low-substituted hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, or a combination thereof.
  • the lubricant may be magnesium stearate, silicon dioxide, talc, or a combination thereof.
  • the composition may be formulated in a parenteral dosage form.
  • the parenteral dosage form may be an injection or an external dermal preparation.
  • the external skin preparation may be a cream, gel, ointment, skin emulsifier, skin suspension, transdermal patch, drug-containing bandage, lotion, or a combination thereof.
  • the external skin preparations are commonly used in external preparations for cosmetics and medicines, such as aqueous components, oily ingredients, powder ingredients, alcohols, humectants, thickeners, ultraviolet absorbers, whitening agents, preservatives, antioxidants, surfactants, and fragrances. , Colorants, various skin nutrients, or combinations thereof, as appropriate.
  • the external skin preparations include metal blockers such as disodium edetate, trisodium edetate, sodium citrate, sodium polyphosphate, sodium metaphosphate, and gluconic acid, caffeine, tannin, belafamil, licorice extract, glablidine, and caline.
  • metal blockers such as disodium edetate, trisodium edetate, sodium citrate, sodium polyphosphate, sodium metaphosphate, and gluconic acid, caffeine, tannin, belafamil, licorice extract, glablidine, and caline.
  • Fruit hot water extract, various herbal medicines, drugs such as tocopherol acetate, glytilinic acid, tranexamic acid and derivatives thereof or salts thereof, vitamin C, magnesium ascorbic acid phosphate, ascorbic acid glucoside, arbutin, kojic acid, glucose, fructose, Sugars, such as trehalose, can also be mix
  • the composition may be for promoting expression of collagen gene in cells.
  • the composition can increase the expression of collagen or can increase the activity of collagen produced by the composition.
  • the composition may also increase the activity or expression of up-stream enzymes or proteins that produce collagen.
  • the composition may be to increase the expression and / or activity of collagen to have wound healing efficacy.
  • the composition may be used for increasing the expression and / or activity of collagen to maintain or increase the elasticity of the tissue containing collagen.
  • the composition may be to maintain or promote the elasticity of the collagen-containing tissue, for example, the skin, thereby reducing wrinkle formation and removing wrinkles.
  • the collagen may be type 1 collagen (collagen, type I) or type 3 collagen (collagen, type III).
  • the gene encoding the collagen may be selected from the group consisting of COL1A1 and COL3A1.
  • the composition can increase the production of keratinocyte differentiation factors.
  • the composition may, for example, promote expression of a differentiation factor gene of keratinocytes.
  • the differentiation factor may be filaggrin (FLG), loricrin (LOR), or involucrin (IVL).
  • FLG filaggrin
  • LOR loricrin
  • IVL involucrin
  • the composition may promote migration of keratinocytes to the wound.
  • the composition can increase the expression of the collagen gene itself, or can increase the activity of the collagen produced by the composition.
  • the composition may also increase the activity or expression of upstream enzymes or proteins that produce collagen.
  • Another aspect provides a method of treating a wound in a subject comprising administering to the subject an effective amount of the composition described above to treat the wound.
  • the composition is the same as described above.
  • the administration can be administered by methods known in the art.
  • the administration can be administered directly to the subject by any means, for example by intravenous, intramuscular, transdermal, mucosal, intranasal, intratracheal or subcutaneous administration. have.
  • the administration can be administered systemically or locally.
  • the administration may be to be administered locally to the site where the wound is present.
  • the subject may be a mammal, for example a human, a cow, a horse, a pig, a dog, a sheep, a goat, or a cat.
  • the subject may have a wound.
  • the wound may be present on the skin.
  • the administration can be performed by using the extract of the roots of the extract 0.1 mg to 1,000 mg, for example, 0.1 mg to 500 mg, 0.1 mg to 100 mg, 0.1 mg to 50 mg, 0.1 mg to 25 mg, 0.1 mg to 5 mg, 1 mg to 1,000 mg, 1 mg to 500 mg, 1 mg to 100 mg, 1 mg to 50 mg, 1 mg to 25 mg, 5 mg to 1,000 mg, 5 mg to 500 mg, 5 mg to 100 mg, 5 mg to 50 mg, 1 mg to 5 mg, 5 mg to 25 mg, 10 mg to 1,000 mg, 10 mg to 500 mg, 10 mg to 100 mg, 10 mg to 50 mg, or 10 mg to 25 mg. .
  • Another aspect provides a cosmetic composition for improving wounds, improving skin wrinkles, or preventing skin aging comprising the extract of the roots of the grass or a fraction thereof as an active ingredient. It is the same as the above-mentioned about the roots extract.
  • the term “improving a wound” may include the use of lowering or alleviating the extent of a wound.
  • the wound amelioration may be to lower or alleviate the extent of a wound that has already occurred.
  • the term “improve skin wrinkles” includes maintaining the elasticity of the skin to prevent the formation of wrinkles or to remove the generated wrinkles.
  • the extract promotes the production of collagen in fibroblasts.
  • Collagen is a major component of the dermal layer of the skin. It is an elastic protein that has a strong binding property with moisture. That is, collagen has a property of imparting elasticity to the skin, and thus has an effect of preventing wrinkles from occurring. As a person ages, he experiences an aging process that reduces the amount of collagen in the skin and causes the skin to lose elasticity and wrinkles. Therefore, the claimed composition comprising the extract can be used as a cosmetic composition for improving skin wrinkles or preventing skin aging.
  • the cosmetic composition may be one containing no active ingredient having other anti-wrinkle or anti-aging effects other than the extract.
  • the cosmetic composition may be provided in any formulation suitable for topical application.
  • a formulation suitable for topical application for example, in the form of an emulsion obtained by dispersing an oil phase in a solution, an aqueous phase, an emulsion obtained by dispersing an aqueous phase in an oil phase, a suspension, a solid, a gel, a powder, a paste, a mask pack or a sheet, a foam, or an aerosol composition.
  • Compositions of such formulations may be prepared according to conventional methods in the art.
  • the cosmetic composition may further include a moisturizer, an emulsifier, a ultraviolet absorber, a preservative, a fungicide, an antioxidant, a pH adjuster, organic and inorganic pigments, fragrances, coolants or limiting agents.
  • a moisturizer an emulsifier, a ultraviolet absorber, a preservative, a fungicide, an antioxidant, a pH adjuster, organic and inorganic pigments, fragrances, coolants or limiting agents.
  • the blending amount of the additional components such as the moisturizing agent can be easily selected by those skilled in the art within the range that does not impair the object and effect of the present invention, the blending amount is 0.01 to 5% by weight, specifically 0.01 to 3 based on the total weight of the composition Weight percent.
  • the composition is 0.001% to 80% by weight, for example, 0.01% to 60%, 0.01% to 40%, 0.01% to 30%, 0.01% to 20% by weight relative to the total weight of the composition %, 0.01 wt% to 10 wt%, 0.01 wt% to 5 wt%, 0.05 wt% to 60 wt%, 0.05 wt% to 40 wt%, 0.05 wt% to 30 wt%, 0.05 wt% to 20 wt%, 0.05 wt% to 10 wt%, 0.05 wt% to 5 wt%, 0.1 wt% to 60 wt%, 0.1 wt% to 40 wt%, 0.1 wt% to 30 wt%, 0.1 wt% to 20 wt%, 0.1 wt% % To 10% by weight, or 0.1% to 5% by weight of the roots extract or fractions thereof.
  • Another aspect provides a method for making up skin, comprising applying a cosmetic composition for improving wounds, improving skin wrinkles, or preventing skin aging, on the skin of an individual.
  • the method may be to improve the wound, to improve skin wrinkles, or to prevent skin aging.
  • the cosmetic composition is applied in numerous treatments, in particular cosmetic treatments of the skin, lips and hair, including the scalp.
  • the step of applying to the skin includes contacting the composition with the skin to allow the components of the composition to penetrate into the skin. Applying to the skin can be combined with other means to help the composition to penetrate into the skin, such as an electrical or magnetic force such as iontophoris.
  • composition for treating a wound according to one aspect, it can be used to efficiently treat a wound in a subject.
  • the individual's wound can be efficiently treated.
  • the cosmetic composition for improving wounds, improving skin wrinkles, or preventing skin aging may be used to efficiently improve wounds, improve skin wrinkles, or prevent skin aging.
  • the method for making up the skin it is possible to efficiently improve the wound, improve the skin wrinkles, or prevent skin aging.
  • Figure 2 is a result confirming that the fraction of the ethanol extract of the roots of the roots of the roots promote the migration of keratinocytes.
  • Figure 3 is a result confirming that the ethanol extract of the root of the roots of the roots promote the expression of COL1A1 and COL3A1 gene in fibroblasts.
  • Figure 6 is a result confirming the effect of the presence of ethanol extract of the roots of the plant on the expression level of MMP-1.
  • Figure 7 shows the results of measuring the degree of the effect of the roots of ethanol extract on type 1 procollagen in UVB irradiated human fibroblasts.
  • FIG. 8 is a view showing the effect of the extract of the roots on the epithelialization (epithelialization) of the wound in the animal experiment.
  • 9 is a view showing the effect of the extract of the roots on the wound area of the wound in the animal experiments.
  • FIG. 15 is a result of clinically confirming that the extract of the roots of stems promotes the recovery of wounds that occurred in animal experiments.
  • the extract of the roots of the roots was prepared from Stellera chamaejasme , and the effect of the roots of the roots and the fractions on wound healing was confirmed.
  • the roots extract was grown near Ulaanbaatar, Mongolia, and collected only above the ground. The collected ground portion was washed with water and dried. Dried roots of grass roots were cut into 2 ⁇ 3cm using small beans. In a glass Erlenmeyer flask, 100 g of the ground roots of the cut root grass and 1 L of ethanol (95 / v)% in water were added and mixed. The mixture was extracted by stirring at 150 rpm for 48 hours at room temperature of about 20 °C.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • HaCaT human keratinocytes were placed in a well of a 24-well microtiter plate containing 1 ml of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Media: Hyclone) medium containing 2.5 (v / v) Fetal Bovine Serum. Added to 2 ⁇ 10 5 cells / well. Next, the keratinocytes were incubated in a 37 ° C. and 5% CO 2 incubator until the confluency reached 80%, and then the cell monolayer in the medium was scraped with a p10 pipette tip to induce “scratch-damage”. It was.
  • DMEM Dynamic Eagle's Media
  • Hyclone Hyclone
  • FIG. 1 is a result confirming that the ethanol extract of the root of the roots of the grass roots promotes the migration of keratinocytes.
  • Figure 2 is a result confirming that the fraction of the ethanol extract of the roots of the roots promote the migration of keratinocytes.
  • A, B, C, and D represent DMSO (negative control), 5 ⁇ g / ml piperoot extract, 10 ⁇ g / ml piperoot extract, and 10 ⁇ g / ml centella extract (positive control), respectively. Indicates.
  • FIG. 1 is a result confirming that the ethanol extract of the root of the roots of the grass roots promotes the migration of keratinocytes.
  • Figure 2 is a result confirming that the fraction of the ethanol extract of the roots of the roots promote the migration of keratinocytes.
  • A, B, C, and D represent DMSO (negative control), 5 ⁇ g / ml piperoot extract, 10 ⁇ g / ml piperoot extract
  • A, B, C, D, E, F, G, and H are DMSO (negative control), hexane fraction of ethanol extract of 5 ⁇ g / ml roots of ground grass, 5 ⁇ g / ml of roots of grass roots Ethyl acetate fraction of the ethanol extract of ethanol extract, 5 ⁇ g / ml of root ethanol extract of butanol fraction of ethanol extract, 5 ⁇ g / ml centella extract, 10 ⁇ g / ml of ethanol extract of ground root of ethanol extract, 10 ⁇ g / ml of blood Ethyl acetate fractions of the ethanol extracts of the roots of the roots of grass roots and butanol fractions of the ethanol extracts of the roots of 10 ⁇ g / ml of roots of grass roots are shown, respectively.
  • Human human fibroblasts in a well of a 6-well microtiter plate containing 2 ml of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Media: Hyclone) medium containing 2.5 (v / v) fetal calf serum dermal fibroblasts (HDF, American Type Culture Collection, USA) were added at 2 ⁇ 10 6 cells / well and cultured under the same conditions as above until confluency reached 80%.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Media: Hyclone
  • HDF American Type Culture Collection
  • the extract of the roots of the roots was added at concentrations of 1 ⁇ g / ml, 5 ⁇ g / ml, and 10 ⁇ g / ml, respectively, and cultured under the same conditions as described above for 24 hours.
  • a negative control the same amount of DMSO used to dissolve the extract was used, and as a positive control, Centella extract (Biospectrum, Korea) was used.
  • Centella extract Centella extract (Biospectrum, Korea) was used.
  • RT-PCR assay confirmed the collagen gene expression. Specifically, after 24 hours, total RNA was harvested and reverse-transcribed using TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) from the cells, and then RT-PCR was performed as follows. First, the RNA was reverse transcribed using reverse transcriptase for cDNA synthesis. RT-PCR was performed using the following specific primers as primers. Relative mRNA expression values of each gene were normalized to ⁇ -actin values.
  • Figure 3 is a result confirming that the ethanol extract of the root of the roots of the roots promote the expression of COL1A1 and COL3A1 gene in fibroblasts.
  • the ethanol extract of the roots of the roots of the roots of the tree was found to have a significant effect of activating the expression of one or more genes selected from the group consisting of collagen synthesis-related factors COL1A1 and COL3A1.
  • sample numbers 1,2,3,4,5,6, and 7 are acetone extract, acetone extract, 100% ethanol extract, 25% methanol extract, 50% methanol extract, 75% methanol extract, and 100% Methanol extract.
  • Sample Nos. 1,2,3, and 4 represent 25% butanol extract, 50% butanol extract, 75% butanol extract, and 100% butanol extract.
  • acetone, methanol, ethanol and butanol extracts from the roots of the roots of the roots of the collagen synthesis has a significant effect of activating the expression of one or more genes selected from the group consisting of COL1A1 and COL3A1 could know.
  • the level of MMP-1 in the supernatant was measured using the collagen MMP-1 ELISA kit (QIA55, Merck & Co., USA) from the supernatant.
  • the supernatant was added to a well of a 96-well plate uniformly coated with a mouse anti-MMP-1 antibody as a primary antibody, and incubated at room temperature for 2 hours to form an antigen-antibody complex. .
  • anti-MMP-1 antibody conjugated with horseradish peroxidase as a chromophore was placed in a well of a 96-well plate and incubated for 1 hour.
  • Figure 6 is a result confirming the effect of the presence of ethanol extract of the roots of the plant on the expression level of MMP-1. As a result, as shown in Figure 6, it was found that the extract of the roots of ethanol has an excellent effect on suppressing the expression of the MMP-1 gene.
  • Epicalocatechin (EGCG) was used as a positive control.
  • PIP Procollagen Type I C-Peptide
  • Cat. # MK101, Takara Bio Ink. , Japan was used to measure the level of procollagen type-I C-peptide (PIP) in the harvested supernatant.
  • PIP is a peptide that is cut off in the process of synthesizing collagen in vivo and converted from collagen to procollagen. Since PIP is proportional to the level of collagen, it is a peptide used in the art as an indicator for checking collagen level.
  • mouse anti-PIP monoclonal antibody (“antibody-POD conjugate) conjugated with horseradish peroxidase (POD) in a well of 96-hole plate uniformly coated with mouse anti-PIP monoclonal antibody. ), And then the cell culture and standard solution were added respectively and left at 37 ° C. for 3 hours. The wells were then washed and a substrate solution containing hydrogen peroxide and tetramethylbenzidine was added and incubated for 15 minutes at room temperature. Thereafter, a stop solution was added to the well to stop the reaction, and the absorbance was measured at 450 nm using a plate reader.
  • Figure 7 shows the results of measuring the degree of the effect of the roots of ethanol extract on type 1 procollagen in UVB irradiated human fibroblasts. As a result, as shown in Fig. 7, it was found that the extract of the roots of ethanol has an excellent effect in promoting the expression of type 1 procollagen.
  • Sprague-Dawley (SD) rats male, 7 weeks old were obtained from Coretech Co., Ltd., maintaining 25 ⁇ 1 °C, humidity 50 ⁇ 10% and the contrast was automatically adjusted to 12 hours of day and night.
  • the diet and water of the general diet was to be freely ingested, and all the experimental animals were used in the experiment after adapting to the animal room environment for one week.
  • the diet, dose and administration method administered to the experimental group are shown in Table 2 below.
  • Centella asiatica extracts 1% or 3% (v / v)
  • Centella asiatica extracts 1% or 3% (v / v)
  • Readings of wound tissue were evaluated by Nisbet et al. (Tissue Eng Part A. 2010, Sep; 16 (9): 2833-42) and Barati et al. (Diagn Pathol. 2013; 8: 120). Based on the scores, the criteria for findings are shown in Table 3 below.
  • FIG. 8 is a view showing the effect of the roots of ethanol extract on epithelialization of wounds in animal experiments.
  • G1, G2, G3, G4, and G5 on the abscissa represent the experimental groups as shown in Table 2, and the score on the ordinate is the value measured according to the epithelialization criteria defined in Table 3.
  • the roots extract G4 and G5 of the present invention significantly increased epithelialization compared to the control G1.
  • * indicates ANOVA by Scheffe's test p ⁇ 0.05.
  • FIG. 9 is a view showing the effect of the roots of ethanol extract of the roots of the wound area of the wound in the animal experiments.
  • the wound area shows the results of measuring the wound area on day 1, day 4, day 8, day 11, and day 15 after the application of the extract of the roots.
  • G1, G2, G3, G4, and G5 on the horizontal axis represent experimental groups as shown in Table 2, and the vertical axis represents the wound area.
  • the roots extract G4 and G5 of the present invention significantly reduced the wound area compared to the control G1.
  • the roots extract promoted re-epithelialization of wounds in animal experiments and markedly promoted recovery.
  • the above results are based on the results obtained using the ethanol extracts of the roots of the roots of grass, but the hexane, ethyl acetate or butanol fractions of the ethanol extracts of the roots of roots of grass, the acetone, methanol or butanol extracts of the roots of roots of grass, or hexane, Similar results were obtained for the ethyl acetate or butanol fractions.
  • the extract of the roots of the grass under the UV-irradiated condition reduced the expression of MMP-1 from human fibroblasts and promoted collagen expression. That is, the extract of the roots of the grass promoted the expression of collagen while reducing the expression of collagenase under the condition of UV irradiation in human fibroblasts. Accordingly, the extract of the roots of the grass can promote collagen synthesis in tissues including human fibroblasts, for example, in the skin, thereby maintaining and promoting elasticity of the tissues. Therefore, the extract of the roots of the extract is effective in improving tissues including human fibroblasts, for example, skin wrinkles, or preventing skin aging.
  • the extract of the roots of the roots and its fractions were prepared from Stellera chamaejasme , and the effect of the roots of the roots and the fractions on wound healing was confirmed.
  • the roots extract was grown near Ulaanbaatar, Mongolia, and only stems were collected from the ground. The collected stems were washed with water and dried. The dried roots of stems were cut into 2 ⁇ 3cm using small beans. In a glass Erlenmeyer flask, 100 grams of the sliced rootstalk stem and 1 L of 95% ethanol were added and mixed. The mixture was extracted by stirring at 150 rpm for 48 hours at room temperature (about 20 ° C).
  • the root extract and its fractions were dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) at a concentration of 20 mg / ml, and then used in the following experiment.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Media: Hyclone
  • HECaT human keratinocytes were placed in 2 ⁇ 10 5 cells / well. It was put to be.
  • the keratinocytes were incubated in a 37 ° C. and 5% CO 2 incubator until the confluency reached 80%, and then the cell monolayer in the medium was scraped with a p10 pipette tip to induce “scratch-damage”. It was.
  • GW represents GW501516.
  • the extracts of the roots of the roots of the roots of the roots were 1 ⁇ g / ml, 5 ⁇ g / ml, and 10 ⁇ g / ml, respectively, and the fractions of the roots of the roots of the roots were 5 ⁇ g / ml and 10 ⁇ g / ml.
  • As a negative control the same amount of DMSO used to dissolve the extract was treated.
  • Centella extract Centella extract (Biospectrum, Korea) was used. After 24 hours, RT-PCR assay confirmed the collagen gene expression.
  • Sprague-Dawley (SD) rats male, 7 weeks old were obtained from Coretech Co., Ltd. and maintained at 25 ⁇ 1 °C, humidity 50 ⁇ 10%, and the contrast was automatically stored for 12 hours of day and night.
  • the diet and water of the general diet was to be freely ingested, and all the experimental animals were used in the experiment after adapting to the animal room environment for one week.
  • the diet, dose and administration method administered to the experimental group are shown in Table 4 below.
  • centella asiatica extract is the same as described in Example 2 2. Wound sites were photographed on day 1, 4, 8, 11, and 14, respectively, of each test substance applied to the wound, and the area of the wound was measured and analyzed using ImageJ (NIH, USA).
  • Readings of wound tissues were performed by scoring using evaluation methods known in the art (Tss Eng et A. 2010, Sep; 16 (9): 2833-42) and Barati et al. (Diagn Pathol. 2013; 8: 120)).
  • the criteria for each finding in reading were as shown in Table 5 below, and the reading results are shown in Table 6.
  • FIG. 15 is a result of clinically confirming that the extract of the roots of stems promotes the recovery of wounds that occurred in animal experiments.
  • 16 is a result of quantitatively confirming that the extract of the roots of stems promotes the recovery of wounds that have occurred in animal experiments.
  • the extract of the roots of the roots can be seen that the effect of promoting the re-epithelialization of the wound and repairing the open wound is remarkable.
  • 150 mg of bark root stem ethanol extract or fraction, palm oil 2 mg, palm hardened oil 8 mg, lead 4 mg and lecithin 6 mg were mixed and 400 mg per capsule was prepared according to a conventional method to prepare a soft capsule.
  • Root Stem Ethanol Extract or Fraction 100 mg of Glucose, 50 mg of Red Ginseng Extract, 96 mg of Starch and 4 mg of Magnesium Stearate were mixed and 40 mg of 30% Ethanol was added to form granules. Tablets were prepared by drying and tableting into tablets using a tablet press.
  • Root Stem Ethanol Extract or Fraction 100 mg of Glucose, 50 mg of Red Ginseng Extract and 600 mg of Starch were mixed and 100 mg of 30% Ethanol was added to form granules, and then dried at 60 ° C. to form granules. Filled with guns. The final weight of the content was 1 g.
  • the extract of the roots used in this formulation example is the ethanol extract of the stem.
  • Root Extract or Fraction 0.1 glycerin 3.0 Butylene glycol 2.0 Propylene glycol 2.0 Carboxy Vinyl Polymer 0.1 Fiji-12 nonylphenyl ether 0.2 Polysorbate 80 0.4 ethanol 10.0 Triethanolamine 0.1 Preservative, coloring, flavoring Quantity Purified water Remaining amount
  • Table 8 Compounding ingredient Content (% by weight) Root Extract or Fraction 0.1 glycerin 3.0 Butylene glycol 3.0 Propylene glycol 3.0 Carboxy Vinyl Polymer 0.1 Beeswax 4.0 Polysorbate 60 1.5 Caprylic / Capric Triglycerides 5.0 Squalane 5.0 Sorbitassquioleate 1.5 Liquid paraffin 0.5 Cetearyl Alcohol 1.0 Triethanolamine 0.2 Preservative, coloring, flavoring Quantity Purified water Remaining amount

Abstract

피뿌리풀 추출물을 유효성분으로서 포함하는 상처를 치료하기 위한 조성물, 개체의 상처를 치료하는 방법, 상처의 개선용, 피부 주름 개선, 또는 피부 노화 방지용 화장료 조성물, 및 상처의 개선, 피부 주름 개선, 또는 피부 노화 방지를 위한 화장 방법을 제공한다.

Description

피뿌리풀 추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 상처를 치료하기 위한 조성물 및 개체의 상처를 치료하는 방법
피뿌리풀 추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 상처를 치료하기 위한 조성물, 상처를 치료하기에 유효한 양의 상기 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상처를 치료하는 방법, 상처의 개선용, 피부 주름 개선, 또는 피부 노화 방지용 화장료 조성물, 및 상처의 개선, 피부 주름 개선, 또는 피부 노화 방지를 위한 화장 방법에 관한 것이다.
피부는 외부로부터 신체를 보호하는 방어막으로서 역할을 한다. 피부에 상처가 생기면 생체의 자연 치유 작용에 의해 상처자리를 혈액이 채우게 되고 혈소판의 과립감소와 하게만 인자(hageman factor)의 활성화가 시작되어 상처 치유 과정이 진행된다. 혈액의 응고는 임시 방어 작용으로서, 노출된 상처 조직들을 보호하고 치유 과정 동안 세포들이 이동할 수 있는 기반을 제공한다.
상처 치료 및/또는 치유는 크게 3개의 단계로 일어난다. 첫 번째 단계는 외상 부위에서의 염증을 특징으로 하는 염증기(inflammatory phase)이다. 염증기는 중대한 감염이 없는 상태에서 일반적으로 짧게 진행될 수 있다. 두 번째 단계는 증식기(proliferative phase)이며, 이는 상피화, 혈관형성, 육아 조직 형성 및 콜라게 침착을 특징으로 한다. 새로운 모세관 형성을 수반하는 혈관형성은 영양소를 전달하고 육아조직 형성을 유지하는데 사용된다. 상처 내로 새로운 모세관의 형성 없이 필수 영양소가 상처에 도달하지 못하여 만성적으로 치유되지 않는 상처를 생성시킨다. 손상된 상처의 표면이 각질형성세포(keratinocytes) 층에 의해 덮이면서 새로운 표피가 생성되고 상피층이 재건되는 재상피화가 일어난다. 재상피화가 완료되면 결합조직의 증가와 재편성을 통해 상처 면적이 감소되는 일련의 과정이 진행된다. 상처 치유의 최종 단계는 섬유아세포(fibroblast)가 콜라겐으로 분화하는 성숙기(maturational phase)이다. 성숙기 동안 회복기 조직의 엉긴 세포와 모세혈관이 조금씩 사라지게 되는데, 이러한 조직의 세포와 모세혈관이 과형성되거나 정상적으로 분해되지 않는 경우 흉터가 생길 수 있다.
상처 치유과정에서 상처를 신속하게 치료할 뿐만 아니라 부작용이나 흉터 없이 치료하는 것이 중요하기 때문에, 이러한 효능을 가지는 물질을 찾고자 하는 노력이 계속되고 있다.
일 양상은 피뿌리풀 추출물, 또는 그의 분획물을 유효 성분으로서 포함하는 상처를 치료하기 위한 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상처를 치료하기에 유효한 양의 상기한 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상처를 치료하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 피뿌리풀 추출물 또는 그 분획물을 유효성분으로 포함하는 상처의 개선용, 피부 주름 개선, 또는 피부 노화 방지용 화장료 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기 화장료 조성물을 개체에 적용하는 단계를 포함하는 상처의 개선, 피부 주름 개선, 또는 피부 노화 방지를 위한 화장 방법을 제공한다.
일 양상은 피뿌리풀 추출물, 또는 그의 분획물을 유효 성분으로서 포함하는 상처를 치료하기 위한 조성물로서, 상기 피뿌리풀 추출물은 상기 피뿌리풀의 지상부로부터 추출된 것인 조성물을 제공한다.
상기 피뿌리풀 추출물은 상기 피뿌리풀의 지상부의 전체, 그 일부분, 또는 이들로부터 유래된 재료로부터 용매에 의하여 추출된 추출물일 수 있다. 상기 일부분은 피뿌리풀의 줄기, 잎, 꽃, 또는 꽃잎일 수 있다. 상기 피뿌리풀은 몽골의 산악 지역에서 생육된 것일 수 있다. 상기 지역은 움란바토르 근교일 수 있다. 상기 피뿌리풀은 약 30 내지 40cm의 높이로 자랄수 있다. 상기 피뿌리풀의 잎의 길이는 약 15 내지 27mm이고 잎은 피침형(lanceolate)일 수 있다. 상기 잎의 표면은 녹색이고 그 뒷면은 푸른 빛이 도는 회색일 수 있다. 잎의 양면 모두 털이 없고 잎자루가 짧다. 추출에 사용된 상기 피뿌리풀의 지상부의 전체, 그 일부분, 또는 이들로부터 유래된 재료는 분쇄 또는 세절되거나 적당하게 건조된 것일 수 있다.
상기 용매는 물, 아세톤, 알콜, 예를 들면, C1-C6 알콜, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 C1-C6 알콜은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 1,3-프로판디올, 부탄올, 펜탄올, 헥산올 등일 수 있다. 상기 용매는 예를 들면, 물과 알콜의 혼합물 즉 알콜 수용액일 수 있다. 알콜 수용액의 알콜 농도는 1 내지 100(v/v)%, 예를 들면, 1 내지 99.5(v/v)%, 10 내지 100(v/v)%, 20 내지 100(v/v)%, 30 내지 100(v/v)%, 40 내지 100(v/v)%, 50 내지 100(v/v)%, 60 내지 100(v/v)%, 70 내지 100(v/v)%, 또는 75 내지 100(v/v)%일 수 있다. 상기 알콜 수용액은 메탄올, 에탄올, 또는 부탄올 수용액일 수 있다. 상기 아세톤은 100 % 농도일 수 있다.
상기 추출은 상기 피뿌리풀의 지상부의 전체, 그 일부분, 또는 이들로부터 유래된 재료에 대하여 상기 추출 용매를 3 내지 10(부피/중량)배, 예를 들면, 3 내지 7(부피/중량)배, 3 내지 5(부피/중량)배, 5 내지 10(부피/중량)배, 또는 4 내지 10배 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 피뿌리풀의 지상부의 전체, 그 일부분, 또는 이들로부터 유래된 재료 1kg에 대하여 상기 추출 용매를 3 내지 10 L 첨가하는 것을 포함할 수 있다.
상기 추출은 가온된 액체 추출, 가압된 액체 추출(pressurized liquid extraction: PLE), 초음파 도움을 받은 추출(microwave assisted extraction: MAE), 아임계 추출(subcritical extraction: SE), 또는 이들의 조합에 의하여 수행될 수 있다. 상기 아임계 추출은 아임계 수추출(subcritical water extraction: SWE)일 수 있다. 아임계 수추출은 초가열된 수추출(superheated water extraction) 또는 가압된 열수 추출(pressurized hot water extraction: PHWE)이라고도 한다. 상기 가온된 액체 추출은 환류 추출일 수 있다.
상기 추출은 4℃ 내지 70℃, 예를 들면, 4℃ 내지 50℃, 4℃ 내지 40℃, 4℃ 내지 30℃, 10℃ 내지 70℃, 15℃ 내지 70℃, 20℃ 내지 70℃, 4℃ 내지 50℃, 10℃ 내지 50℃, 4℃ 내지 40℃, 4℃ 내지 30℃, 10℃ 내지 40℃, 10℃ 내지 35℃, 또는 10℃ 내지 30℃에서 수행하는 것일 수 있다. 상기 추출 시간은 선택된 온도에 따라 달라질 수 있는데 1 시간 내지 2개월, 예를 들면, 1 시간 내지 1개월, 1 시간 내지 15일, 1 시간 내지 10일, 1 시간 내지 5일, 1 시간 내지 3일, 1 시간 내지 2일, 1 시간 내지 1일, 5 시간 내지 1개월, 5 시간 내지 15일, 5 시간 내지 10일, 5 시간 내지 5일, 5 시간 내지 3일, 5 시간 내지 2일, 5 시간 내지 1일, 10 시간 내지 1개월, 10 시간 내지 15일, 10 시간 내지 10일, 10 시간 내지 5일, 10 시간 내지 3일, 또는 10 시간 내지 2일일 수 있다. 상기 추출은 상기 용매 중에 피뿌리풀의 지상부의 전체, 그 일부분, 또는 이들로부터 유래된 재료를 혼합하고 일정 시간 동안 방치하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방치는 적당한 교반을 포함할 수 있다. 상기 추출은 1회 이상, 예를 들면, 1 내지 5회 반복될 수 있다.
상기 추출은 식물체 잔사 및 추출액을 여과 등의 알려진 방법에 의하여 분리할 수 있다. 상기 추출은 또한 얻어진 추출액으로부터 감압 농축과 같은 알려진 방법에 의하여 용매를 제거하는 것을 포함할 수 있다. 상기 추출은 또한 얻어진 추출물을 동결건조와 같은 건조에 의하여 건조 추출물을 제조하는 것을 포함할 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 용어 "분획물(fraction)"은 상기 피뿌리풀 추출물이 그 일부의 성분으로 나누어진 물질 즉 분획된 물질을 나타낸다. 상기 분획물을 용매 분획화(fractionation)에 의하여 얻어진 것일 수 있다. 상기 용매 분획화는 피뿌리풀 추출물을 용매와 혼합하고 상기 용매에 존재하는 물질을 분리하는 것일 수 있다. 상기 분획물은 상기 피뿌리풀 추출물을 물에 현탁시킨 후 헥산, 에틸아세테이트, 및 부탄올로 순차적으로 분획화하여 얻어진 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물, 또는 최종적으로 남은 물 분획물일 수 있다.
구체적으로, 상기 헥산 분획물은 상기 피뿌리풀 추출물을 물과 혼합하고, 이 혼합물을 다시 헥산과 혼합한 후 일정 시간 동안 방치한 후 헥산층을 분리하고, 분리된 헥산층으로부터 분획물을 분리하는 것에 의하여 얻어진 것일 수 있다. 분획물을 분리하는 것은 헥산층으로부터 헥산을 제거하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 상기 에틸아세테이트 분획물은 상기 헥산 분획물을 분리하고 남은 물층을 에틸아세테이트와 혼합한 후 일정 시간 동안 방치한 후 에틸아세테이트층을 분리하고, 분리된 에틸아세테이트층으로부터 분획물을 분리하는 것에 의하여 얻어진 것일 수 있다. 분획물을 분리하는 것은 에틸아세테이트층으로부터 에틸아세테이트를 제거하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 상기 부탄올 분획물은 상기 에틸아세테이트 분획물을 분리하고 남은 물층을 부탄올과 혼합한 후 일정 시간 동안 방치한 후 부탄올층을 분리하고, 분리된 부탄올층으로부터 분획물을 분리하는 것에 의하여 얻어진 것일 수 있다. 분획물을 분리하는 것은 부탄올층으로부터 부탄올을 제거하는 것을 포함할 수 있다. 온도 조건, 압력 조건, 시간, 사용된 용매의 양 또는 농도, 교반 등과 같은 상기 분획화의 조건은 상기한 피뿌리풀 추출물을 제조하는데 사용된 추출에 대하여 설명한 바와 같을 수 있다. 상기 분획화는 1회 이상, 예를 들면, 1 내지 5회 반복될 수 있다. 상기 분획화의 순서는 예시적인 것이며, 헥산, 에틸아세이트, 및 부탄올을 사용한 분획화는 임의의 순서로 실시될 수 있다.
상기 분획물을 분리하는 것은 여과 등의 알려진 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 분획화는 또한 얻어진 분획물으로부터 감압 농축과 같은 알려진 방법에 의하여 용매를 제거하는 것을 포함할 수 있다. 상기 분획화는 또한 얻어진 분획물을 농축 및/또는 건조하는 것을 포함할 수 있다. 상기 농축은 감압 농축일 수 있다. 상기 건조는 감압 건조, 비등 건조, 분무 건조, 상온 건조 또는 동결건조를 포함할 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 용어 "상처(wound)"는 조직이 잘려지거나(cut), 찢어지거나(torn), 부서지거나(broken), 타거나(burned), 또는 외상을 입거나(traumatized), 또는 이러한 손상을 유발하는 장애 또는 질환으로부터 발생된 인체에 대한 손상(injury)을 의미한다. 용어 "조직"은 함께 집단을 이루어 특정 기능을 형성하는 인체 중의 세포의 덩어리를 나타낸다. 조직에는 눈, 점액, 폐, 신장, 심장, 내장, 힘줄(tendon), 혈관조직, 뼈, 피부, 결합조직, 및 신경, 예컨대 척수가 포함될 수 있다. 상기 상처는 표면이 개방된 "개방된 상처(open wound)", 또는 표면이 개방되지 않은 폐쇄된 상처(closed wound)일 수 있다. 상기 상처의 일예는 피부에 있는 개방된 상처일 수 있다. 상기 상처는 병변(lesion), 헌데(sore), 괴사(necrosis), 및 궤양(ulcer)을 포함할 수 있다. 상기 괴사는 감염, 손상 또는 경색으로부터 생성되는 죽은 조직과 관련된 것일 수 있다. 상기 궤양은 괴사 조직의 탈피에 의해 생성된, 기관 또는 조직의 표면의 국소적인 결함 또는 패임일 수 있다.
상기 상처의 일 예는 피부의 표피(epidermis); 진피(dermis); 표피 및 진피; 또는 표피, 진피 및 피하지방층이 손상된 상처일 수 있다.
또한, 상기 상처의 예는 베임(cut), 절개(incisions)(예, 수술적 절개), 찰과상(abrasions), 열상 또는 찢김(lacerations), 골절(fracture), 타박상(contusions), 화상(burns), 또는 절단(amputations)을 포함할 수 있다.
본 발명에 의하여 제공되는 "치료(treat)"는 자연 치유에 비하여 단축된 시간에 상처가 치유되는 것을 제공하는 것일 수 있다. 상기 치료는 상처의 개선 및/또는 완화를 포함할 수 있다. 또한, 상기 치료는 상처 및/또는 상처와 관련된 질환의 치료를 모두 포함하는 것일 수 있다. 상기 치료는 상처로부터 유발되는 손상된 조직의 치유 및/또는 재생을 의미할 수 있다. 상기 상처 치료는 피부 재생의 의미를 포함할 수 있다. 또한, 상기 치료는 상기 손상된 조직의 원래 조성을 유지하는 것일 수 있다. 또한, 상기 치료는 상처와 관련된 질환의 합병증 및/또는 흉터를 최소화하면서 상기 손상된 조직을 치유 및/또는 재생을 촉진하는 것일 수 있다.
상기 조성물은 상처 치유 과정의 전단계를 촉진하기 위한 것일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 상처 치유 단계 중 증식기 및/또는 성숙기를 촉진하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 증식기 및/또는 성숙기에 있는 상처를 치료하기 위한 것일 수 있다.
상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.01 중량% 내지 60 중량%, 0.01 중량% 내지 40 중량%, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 60 중량%, 0.05 중량% 내지 40 중량%, 0.05 중량% 내지 30 중량%, 0.05 중량% 내지 20 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 5 중량%의 피뿌리풀 추출물 또는 그 분획물을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함할 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미정질 셀룰로오스, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오스, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분 글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 조성물은 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제, 또는 피부외용제일 수 있다. 상기 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다.
상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류도 적절하게 배합할 수 있다.
상기 조성물은 세포 중의 콜라겐 유전자의 발현을 촉진하기 위한 것일 수 있다. 상기 조성물은 콜라겐의 발현을 증가시킬 수 있거나, 또는 상기 조성물에 의해 생성된 콜라겐의 활성을 증가시킬 수 있다. 상기 조성물은 또한 콜라겐을 생성시키는 상류(up-stream)의 효소 또는 단백질의 활성 또는 발현을 증가시킬 수 있다. 일 구체예에서, 상기 조성물은 콜라겐의 발현 및/또는 활성을 증가시켜 상처 치료 효능을 갖는 것일 수 있다. 상기 조성물은 콜라겐의 발현 및/또는 활성을 증가시켜 콜라겐을 포함하는 조직의 탄력성을 유지 또는 증가시키는 용도로 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 콜라겐을 포함하는 조직, 예를 들면 피부의 탄력성을 유지 또는 촉진하여 조직의 주름 생성을 감소시키고 주름을 제거하는 것일 있다. 상기 콜라겐은 1형 콜라겐(collagen, type I) 또는 3형 콜라겐(collagen, type III)일 수 있다. 상기 콜라겐을 코딩하는 유전자는 COL1A1 및 COL3A1로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 조성물은 각질세포(keratinocyte) 분화 인자의 생성을 증가시킬 수 있다. 상기 조성물은 예를 들면, 각질형성세포의 분화 인자 유전자의 발현을 촉진할 수 있다. 상기 분화 인자는 필라그린(filaggrin: FLG), 로리크린(loricrin: LOR), 또는 인볼루크린(involucrin: IVL)일 수 있다. 상기 조성물은 각질형성세포의 상처로의 이동을 촉진할 수 있다.
상기 조성물은 콜라겐 유전자 자체의 발현을 증가시킬 수 있거나, 또는 상기 조성물에 의해 생성된 콜라겐의 활성을 증가시킬 수 있다. 또한 상기 조성물은 콜라겐을 생성시키는 상류의 효소 또는 단백질의 활성 또는 발현을 증가시킬 수 있다.
다른 양상은 상처를 치료하기에 유효한 양의 상기한 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상처를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 조성물에 대해서는 상술한 바와 동일하다.
상기 투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 상기 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경피(transdermal), 점막, 코안(intranasal), 기관내(intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 상처가 존재하는 부위에 국소적으로 투여하는 것일 수 있다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 상처를 갖는 것일 수 있다. 상기 상처는 피부에 존재하는 것일 수 있다.
상기 투여는 피뿌리풀 추출물을 개체당 0.1 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 500 mg, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 25 mg, 0.1 mg 내지 5 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 5 mg,5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg을 투여하는 것일 수 있다.
다른 양상은 피뿌리풀 추출물 또는 그 분획물을 유효성분으로 포함하는 상처의 개선용, 피부 주름 개선, 또는 피부 노화 방지용 화장료 조성물을 제공한다. 상기 피뿌리풀 추출물에 대해서는 상술한 바와 동일하다.
용어 "상처의 개선용"은 상처의 정도를 낮추어주거나 완화시키는 용도를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 상처 개선은 이미 발생한 상처의 정도를 낮추거나 완화시키는 것일 수 있다. 용어 "피부 주름 개선"이란 피부의 탄력성을 유지하여 주름이 생성되는 것을 방지하거나 생성된 주름을 제거하는 것을 포함한다.
상기 추출물은 섬유아세포에서 콜라겐의 생성을 촉진한다. 콜라겐은 피부 진피층의 주요 성분으로서 탄력 단백질로 수분과 결합하는 힘이 강한 성질을 가지고 있다. 즉, 콜라겐은 피부에 탄력성을 부여하는 성질을 가지고 있고, 그에 따라 주름이 생기는 것을 방지하는 효과를 가진다. 사람이 나이가 들어감에 따라서, 피부의 콜라겐의 양을 줄어들고 피부는 탄력성을 잃고 주름이 생기게 되는 노화 과정을 거치게 된다. 따라서, 상기 추출물을 포함하는 청구된 발명의 조성물은 피부 주름 개선, 또는 피부 노화 방지용 화장료 조성물로서 사용될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 상기 추출물 외의 다른 주름 개선 또는 노화 방지 효과를 갖는 활성 성분을 포함하지 않는 것일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 국소 적용에 적합한 모든 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 용액, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 유상에 수상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 고체, 겔, 분말, 페이스트, 마스크 팩 또는 시트, 포말(foam) 또는 에어로졸 조성물의 제형으로 제공될 수 있다. 이러한 제형의 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 보습제, 에몰리언트제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 및 무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한제를 더 포함할 수 있다. 상기 보습제 등의 추가 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선정 가능하며, 그 배합량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01 내지 5 중량%, 구체적으로 0.01 내지 3 중량%일 수 있다.
상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.01 중량% 내지 60 중량%, 0.01 중량% 내지 40 중량%, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 60 중량%, 0.05 중량% 내지 40 중량%, 0.05 중량% 내지 30 중량%, 0.05 중량% 내지 20 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 5 중량%의 피뿌리풀 추출물 또는 그 분획물을 포함할 수 있다.
다른 양상은 상처의 개선용, 피부 주름 개선, 또는 피부 노화 방지용 화장료 조성물을 개체의 피부에 적용하는 단계를 포함하는, 피부를 화장하기 위한 방법을 제공한다.
상기 방법은 상처를 개선시키거나, 피부 주름을 개선시키거나, 또는 피부 노화를 방지하는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 화장료 조성물은 두피를 포함하여 피부, 입술 및 모발의 수많은 처리, 특히 미용 처리에서 적용된다.
상기 방법에 있어서, 피부에 적용하는 단계는 피부에 상기 조성물을 접촉시켜 상기 조성물의 성분이 피부 내로 침투되도록 하는 것을 포함한다. 피부에 적용하는 단계는 상기 조성물이 피부 내로 침투되도록 하는 것을 돕는 다른 수단, 예를 들면, 이온토포리스와 같은 전기적 또는 자기적 힘과 같은 수단과 조합되어질 수 있다.
일 양상에 따른 상처를 치료하기 위한 조성물에 의하면, 개체의 상처를 효율적으로 치료하는데 사용될 수 있다.
일 양상에 따른 개체의 상처를 치료하는 방법에 의하면, 개체의 상처를 효율적으로 치료할 수 있다.
일 양상에 따른 상처의 개선용, 피부 주름 개선, 또는 피부 노화 방지용 화장료 조성물에 의하여, 상처를 효율적으로 개선하고, 피부 주름 개선, 또는 피부 노화를 방지하는데 사용될 수 있다.
일 양상에 따른 피부를 화장하기 위한 방법에 의하면, 효율적으로 상처를 개선시키거나, 피부 주름을 개선시키거나, 또는 피부 노화를 방지할 수 있다.
도 1은 피뿌리풀 지상부의 에탄올 추출물이 각질형성세포의 이동을 촉진함을 확인한 결과이다.
도 2는 피뿌리풀 지상부의 에탄올 추출물의 분획물이 각질형성세포의 이동을 촉진함을 확인한 결과이다.
도 3은 피뿌리풀 지상부의 에탄올 추출물이 섬유아세포에서 COL1A1 및 COL3A1 유전자의 발현을 촉진함을 확인한 결과이다.
도 4는 피뿌리풀 지상부의 여러 용매 추출물이 섬유아세포에서 COL1A1 및 COL3A1 유전자의 발현을 촉진함을 확인한 결과이다.
도 5는 피뿌리풀 지상부의 다른 농도의 부탄올을 사용하여 추출된 부탄올 추출물이 섬유아세포에서 COL1A1 및 COL3A1 유전자의 발현을 촉진함을 확인한 결과이다.
도 6은 피뿌리풀 에탄올 추출물의 존재가 MMP-1의 발현 수준에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 7은 UVB 조사된 사람 섬유아세포에서 피뿌리풀 에탄올 추출물이 타입-1 프로콜라겐의 발현에 미치는 정도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 8은 피뿌리풀 추출물이 동물실험에서 벌어진 상처의 상피화(epithelialization)에 미치는 영향을 나타낸 도면이다.
도 9은 피뿌리풀 추출물이 동물실험에서 벌어진 상처의 상처 면적 감소에 미치는 영향을 나타낸 도면이다.
도 10은 피뿌리풀 추출물이 동물실험에서 벌어진 상처의 회복을 촉진함을 H&E 염색법으로 확인한 결과이다.
도 11은 피뿌리풀 줄기 추출물이 각질형성세포의 이동을 촉진함을 확인한 결과이다.
도 12는 피뿌리풀 줄기 추출물의 분획물이 각질형성세포의 이동을 촉진함을 확인한 결과이다.
도 13은 피뿌리풀 줄기 추출물이 섬유아세포에서 COL1A1 및 COL3A1 유전자의 발현을 촉진함을 확인한 결과이다.
도 14는 피뿌리풀 줄기 추출물의 분획물이 섬유아세포에서 COL1A1 및 COL3A1 유전자의 발현을 촉진함을 확인한 결과이다.
도 15는 피뿌리풀 줄기 추출물이 동물실험에서 벌어진 상처의 회복을 촉진함을 임상학적으로 확인한 결과이다.
도 16은 피뿌리풀 줄기 추출물이 동물실험에서 벌어진 상처의 회복을 촉진함을 정량적으로 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 피뿌리풀 추출물 및 그의 분획물의 제조
본 실시예에서는 피뿌리풀(Stellera chamaejasme)로부터 피뿌리풀 추출물을 제조하고, 피뿌리풀 추출물 및 상기 분획물이 상처 치료에 미치는 효과를 확인하였다.
1. 피뿌리풀 추출물 및 그의 분획물의 제조
(1) 피뿌리풀 에탄올 추출물의 제조
피뿌리풀 추출물은 몽골 울란바토르 근교에서 생육한 것으로서 지상부만을 채집하였다. 채집된 지상부를 물로 세척하고 건조하였다. 건조된 피뿌리풀 지상부는 작두를 이용하여 2~3cm로 세절하여 사용하였다. 유리 삼각플라스크에 상기 세절된 피뿌리풀 지상부 100g과 물 중 95(v/v)%의 에탄올 1L을 넣고 혼합하였다. 이 혼합물을 약 20℃의 상온에서 48시간 동안 150 rpm으로 교반하여 추출하였다.
다음으로, 혼합물을 여과지(Whatman, NO.2, 8㎛)에 통과시켜 얻어진 여과액을 얻었다. 얻어진 여과액을 회전식 감압농축기(EYELA, N-1100)를 사용하여 감압 농축하였으며, 남아있는 용매를 제거하기 위하여 48시간 동안 동결건조(Operon, FDCF-12003)를 실시하여 용매가 제거된 건조된 피뿌리풀 추출물 3g을 얻었다.
(2) 피뿌리풀 에탄올 추출물의 분획물의 제조
(2.1) 에탄올 추출물의 분획물
건조된 피뿌리풀 에탄올 추출물 3g과 물 100 mL를 삼각플라스크에 넣어 현탁한 후 250 mL 분별깔때기에 넣고 여기에 n-헥산(Extra pure grade, 100(v/v)%) 100 mL를 첨가하고 충분히 흔들어 준 후, 상온에서 3 시간 동안 방치하였다. 상기 혼합물을 분별깔때기를 이용하여 헥산층만을 취하고, 위와 같은 과정을 3회 반복하여 실시하였으며, 얻어진 헥산층은 감압농축(EYELA, N-1100)을 하여 헥산 분획물을 얻었다.
또한, 동일한 방법으로 상기 헥산 분획물 분리과정에서 남은 물층에 대하여 100(v/v)% 에틸아세테이트를 첨가하고 혼합한 후 동일한 과정을 거쳐 에틸아세테이트 분획을 얻었다.
또한, 동일한 방법으로 상기 에틸아세테이트 분획물 분리과정에서 남은 물층에 수포화 부탄올을 첨가하고 혼합한 후 동일한 과정을 거쳐 부탄올 분획을 얻었다. 그 후 남은 것을 물 분획물로 사용하였다.
상기 피뿌리풀 에탄올 추출물과 그의 분획물은 디메틸술폭시드(Dimethyl sulfoxide: DMSO)에 20 mg/ml 농도로 녹인 후, 하기 실험에 이용했다.
(2.2) 다른 용매 추출물 및 그 분획물
(2.1)에서 용매로서 에탄올 대신 100(v/v)% 아세톤, 지정된 농도의 메탄올, 또는 부탄올을 사용한 것을 제외하고는 동일한 과정에 의하여 다른 용매를 사용한 추출물 및 그 분획물을 얻었다.
2. 인체 각질형성세포의 이동 증가
상기 피뿌리풀 추출물 또는 그 분획물이 인체 각질형성세포가 이동(migration)하는 것을 증가시키는지 여부를 아래와 같이 확인하였다.
우태아 혈청이 2.5(v/v)%로 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media: Hyclone) 배지 1 ml이 들어있는 24-웰 평판 배양기(24-well microtiter plate)의 웰에 HaCaT 인체 각질형성세포를 2×105 세포/웰이 되도록 넣었다. 다음으로, 상기 각질형성세포를 컨플루언시가 80%로 될 때까지 37℃ 및 5% CO2 배양기에서 배양시킨 후, 배지 중의 세포 단일층을 p10 피펫 팁으로 긁어서 "긁힘-손상"을 유도하였다.
다음으로, 상기 긁어진 세포 단일층 상에 무혈청 DMEM 200㎕와 상기 피뿌리풀 추출물 또는 그 분획물을 5 ㎍/ml 배지 및 10 ㎍/ml 배지의 농도로 첨가하였다. 그 후, 상기한 배양 조건과 동일한 조건에서 인체 각질형성세포를 24시간 동안 배양시켰다. 음성 대조군으로는 상기 추출물을 녹이는데 사용한 DMSO를 동량 처리하였고, 양성 대조군으로는 병풀 추출물(10 ㎍/ml)을 지정된 농도로 사용하였다. 이 후, 크리스탈 비올렛(crystal violet) 시약으로 세포층을 염색한 후 긁힘 상처가 회복되는 정도를 확인하였다. 상기 병풀 추출물은 바이오스펙트럼(한국)으로부터 구입한 것이다.
도 1은 피뿌리풀 지상부의 에탄올 추출물이 각질형성세포의 이동을 촉진함을 확인한 결과이다. 도 2는 피뿌리풀 지상부의 에탄올 추출물의 분획물이 각질형성세포의 이동을 촉진함을 확인한 결과이다. 도 1에서, A, B, C, 및 D는 DMSO(음성 대조군), 5 ㎍/ml 피뿌리풀 추출물, 10 ㎍/ml 피뿌리풀 추출물, 및 10 ㎍/ml 병풀 추출물 (양성 대조군)을 각각 나타낸다. 도 2에서, A, B, C, D, E, F, G, 및 H는 DMSO(음성 대조군), 5 ㎍/ml 피뿌리풀 지상부의 에탄올 추출물의 헥산 분획물, 5 ㎍/ml 피뿌리풀 지상부의 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물, 5 ㎍/ml 피뿌리풀 지상부의 에탄올 추출물의 부탄올 분획물, 5 ㎍/ml 병풀 추출물,10 ㎍/ml 피뿌리풀 지상부의 에탄올 추출물의 헥산 분획물, 10 ㎍/ml 피뿌리풀 지상부의 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물, 및 10 ㎍/ml 피뿌리풀 지상부의 에탄올 추출물의 부탄올 분획물을 각각 나타낸다.
도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군이 처리된 세포의 긁힘 손상은 24시간 후에 상대적으로 치유되지 않은 채로 남아 있었는데 반해, 피뿌리풀 지상부의 에탄올 추출물이 처리된 세포에서는 상처 가장자리의 세포 증식과 이동으로 긁힘-손상이 치유되어 24시간 후 긁힌 면적이 감소되었다.
3. 섬유아세포에서 COL1A1 및 COL3A1 유전자의 발현 증가
상기 피뿌리풀 추출물이 인간 섬유아세포에서 콜라겐 유전자의 발현을 촉진하는지 여부를 아래와 같이 확인하였다.
우태아 혈청이 2.5(v/v)%로 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media: Hyclone) 배지 2 ml이 들어있는 6-웰 평판 배양기(6-well microtiter plate)의 웰에 인체의 섬유아세포(Human dermal fibroblasts: HDF, American Type Culture Collection, USA)를 2×106 세포/웰이 되도록 넣고 컨플루언시가 80%가 될 때까지 상기한 바와 동일한 조건에서 배양하였다.
이렇게 배양한 세포에 상기 피뿌리풀 추출물을 각각 1㎍/ml, 5㎍/ml, 및 10㎍/ml 농도로 첨가하고 24 시간 동안 상기한 바와 동일한 조건에서 배양시켰다. 음성 대조군으로는 상기 추출물을 녹이는데 사용한 DMSO를 동량 사용하였고, 양성 대조군으로는 병풀 추출물(바이오스펙트럼, 한국)을 사용하였다. 24시간 후, RT-PCR 어세이를 통해 콜라겐 유전자 발현되는지를 확인하였다. 구체적으로, 24시간 경과한 다음 세포로부터 TRIzol시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 총 RNA를 수확하여 역전사시킨 후, RT-PCR을 다음과 같이 수행하였다. 먼저 cDNA 합성을 위해 상기 RNA를 역전사 효소(reverse transcriptase)를 사용하여 역전사시켰다. RT-PCR은 다음의 특정 프라이머를 프라이머로 사용하여 수행하였다. 각 유전자의 상대적인 mRNA 발현량 값은 β-액틴 값으로 표준화하였다.
도 3은 피뿌리풀 지상부의 에탄올 추출물이 섬유아세포에서 COL1A1 및 COL3A1 유전자의 발현을 촉진함을 확인한 결과이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 피뿌리풀 지상부의 에탄올 추출물은 콜라겐 합성 관련 인자인 COL1A1 및 COL3A1으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상 유전자의 발현을 활성화시키는 효과가 현저하다는 것을 알 수 있었다.
도 4는 피뿌리풀 지상부의 여러 용매 추출물이 섬유아세포에서 COL1A1 및 COL3A1 유전자의 발현을 촉진함을 확인한 결과이다. 도 4에서, 시료 번호 1,2,3,4,5,6, 및 7은 아세톤 추출물, 아세톤 추출물, 100% 에탄올 추출물, 25% 메탄올 추출물, 50% 메탄올 추출물, 75% 메탄올 추출물, 및 100% 메탄올 추출물을 나타낸다.
도 5는 피뿌리풀 지상부의 다른 농도의 부탄올을 사용하여 추출된 부탄올 추출물이 섬유아세포에서 COL1A1 및 COL3A1 유전자의 발현을 촉진함을 확인한 결과이다. 도 5에서, 시료 번호 1,2,3, 및 4는 25% 부탄올 추출물, 50% 부탄올 추출물, 75% 부탄올을 추출물, 및 100% 부탄올 추출물을 나타낸다.
도 4 및 5에 나타낸 바와 같이, 피뿌리풀 지상부의 아세톤, 메탄올, 에탄올 및 부탄올 추출물은 콜라겐 합성 관련 인자인 COL1A1 및 COL3A1으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상 유전자의 발현을 활성화시키는 효과가 현저하다는 것을 알 수 있었다.
표 1
β-액틴 COL1A1 COL3A1
정방향 프라이머 서열번호 1 서열번호 3 서열번호 5
역방향 프라이머 서열번호 2 서열번호 4 서열번호 6
4. UV 조사에 의하여 노화가 유도된 섬유아세포에서 콜라겐 분해효소-1 분비 억제 측정 실험
상기 피뿌리풀 에탄올 추출물의 콜라겐 분해효소-1(Matrix Metalloproteinase-1, MMP-1)의 생성을 억제하는 효능을 측정하였다.
먼저, 2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM 배지가 들어있는 24-공 평판배양기에 사람 섬유아세포를 1×105 세포/ 공(well)이 되도록 넣고, 90% 정도 컨플루언시로 자랄 때까지 배양하였다. 그 후 무혈청 DMEM 배지에 녹여진 상기 피뿌리풀 에타올 추출물을 1, 5, 및 10 μg/ml 농도로 첨가하고 24시간 동안 배양한 후, UV 조사기를 이용하여 UVB 즉 15 mJ을 조사하였다. 그 후 무혈청 DMEM 배지에 녹여진 상기 피뿌리풀 에탄올 추출물을 1, 5, 및 10 μg/ml 농도로 추가로 첨가하였다. 24시간 경과한 다음 세포 배양액을 채취하여 원심분리하고 상등액만 수확하였다.
이후, 채취한 상등액으로부터 콜라겐 MMP-1 ELISA 키트(QIA55, Merck & Co., 미국)를 이용하여 상기 상등액 중 MMP-1의 수준을 측정하였다. 먼저, 1차 항체로 마우스 항-MMP-1 항체가 균일하게 도포된 96-공 평판(96-well plate)의 웰에 상기 상등액을 넣고 2시간 동안 상온에서 인큐베이션하여 항원-항체 복합체가 형성되도록 하였다. 2시간 후 발색단으로서 호스래디스 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)가 접합된 항-MMP-1 항체를 96-공 평판의 웰에 넣고 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 1시간 후 발색 기질로서 테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine)을 넣어 실온에서 30분간 인큐베이션시켜 발색을 유발시킨 후 다시 종결 버퍼를 넣어 반응을 중지시키면 반응액의 색깔은 노란색을 띄며 반응 진행의 정도에 따라 노란색의 정도가 다르게 나타났다. 노란색을 띠는 96-공 평판의 웰의 흡광도를 흡광계를 이용하여 450/540 nm에서 측정하였다.
도 6은 피뿌리풀 에탄올 추출물의 존재가 MMP-1의 발현 수준에 미치는 영향을 확인한 결과이다. 그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, 피뿌리풀 에탄올 추출물이 MMP-1 유전자의 발현을 억제하는데 뛰어난 효과를 가짐을 알 수 있었다. 양성 대조군으로는 에피칼로카테킨(epigallocatechin gallate: EGCG)을 사용하였다.
5. UV에 의하여 노화가 유도된 섬유아세포에서 콜라겐 생성 증진 측정 실험
상기 피뿌리풀 에탄올 추출물의 타입-1 프로콜라겐(Type-1 procollagen)의 발현을 촉진하는지를 확인하였다.
먼저, 2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM 배지가 들어있는 24-공 평판배양기에 사람 섬유아세포를 1×105 세포/ 공(well)이 되도록 넣고, 90% 정도 컨플루언시까지 자랄 때까지 배양하였다. 그 후 무혈청 DMEM 배지에 녹여진 상기 피뿌리풀 에탄올 추출물을 1, 5, 및 10 μg/ml 농도로 24시간 동안 처리한 후, UV 조사기를 이용하여 UVB 즉 15 mJ을 조사하였다. 그 후 무혈청 DMEM 배지에 녹여진 상기 피뿌리풀 추출물을 1, 5, 및 10 μg/ml 농도로 추가로 첨가하고 동일하게 배양하였다. 24시간 경과한 다음 세포 배양액을 채취하여 원심분리하고 상등액만 수확하고, 프로콜라겐 타입 I C-펩티드 EIA 키트(Procollagen Type I C-Peptide (PIP)EIA Kit)(Cat. #MK101, Takara Bio Ink., 일본)를 사용하여 수확된 상등액 중 프로콜라겐 타입-I C-펩티드(procollagen type-I C-peptide, PIP)의 수준을 측정하였다. PIP는 생체 내에서 콜라겐을 합성하는 과정에서 프로콜라겐으로부터 콜라겐으로 전환되는 과정에서 잘려 나오는 펩티드로서 PIP의 수준은 콜라겐의 수준과 비례하기 때문에 당업계에서 콜라겐 수준을 확인하는데 지표로서 사용되고 있는 펩티드이다.
구체적으로 보면, 마우스 항-PIP 단클론 항체가 균일하게 코팅된 96-공 평판의 웰에 호스래디쉬 페록시다제(horseradish peroxidase)(POD)가 접합된 마우스 항-PIP 단클론 항체("항체-POD 접합체"라고도 함)를 첨가하고, 그 후 상기 세포 배양액 및 표준 용액(standard solution)을 각각 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 두었다. 그 후 웰을 세척하고 히드로겐 퍼옥시드와 테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine)을 포함한 기질 용액을 첨가하고 실온에서 15분 인큐베이션하였다. 그 후 웰에 반응 중지 용액(stop solution)을 넣어 반응을 중지시키고 흡광계(plate reader)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 7은 UVB 조사된 사람 섬유아세포에서 피뿌리풀 에탄올 추출물이 타입-1 프로콜라겐의 발현에 미치는 정도를 측정한 결과를 나타낸다. 그 결과 도 7에 나타낸 바와 같이, 피뿌리풀 에탄올 추출물이 타입-1 프로콜라겐의 발현을 촉진하는데뛰어난 효과를 가짐을 알 수 있었다.
6. 동물실험에서 상처 회복 증진
상기 피뿌리풀 추출물이 동물실험에서 상처 부위의 회복를 촉진하는지 여부를 아래와 같이 확인하였다.
(1) 실험동물
Sprague-Dawley(SD) 랫트(수컷, 7주령)를 ㈜코아텍에서 입수하여 25 ±1℃, 습도 50 ± 10%를 유지하고 명암은 주야 12시간으로 자동 조절하며 유지하였다. 또한, 일반식이의 사료와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 모든 실험동물은 1주 동안 동물실 환경에 적응시킨 후, 실험에 사용하였다. 실험군에 투여한 식이와 투여 용량, 투여 방법은 하기 표 2에 나타내었다.
표 2
실험군 시험물질 투여 용량 및 방법
G1 부형제(vehicle) -
G2 병풀 추출물 1%(v/v), 1일 1회
G3 병풀 추출물 3%(v/v), 1일 1회
G4 피뿌리풀 에탄올 추출물 1%(v/v), 1일 1회
G5 피뿌리풀 에탄올 추출물 3%(v/v), 1일 1회
(2) 상처 유발 및 처치
SD 랫트를 마취 전 24시간 동안 절식시켰고, 100 ml의 물을 공급하였다. 모든 실험군에 상처를 유발하기 1 시간 전에 100%의 졸레틸과 100%의 럼푼을 1:2 비율로 혼합하고, 모든 실험군을 수득된 혼합물을 0.1 cc/kg 사용하여 근육 주사로 마취시켰다. 그 후, 모든 실험군을 전기 제모기로 랫트의 등 부위 털을 제거하였다. 등 부위에 각각 10%의 포비돈-요오드와 70 (v/v)%의 에탄올을 도포하여 소독한 후, 등 부위에 소독된 수술용 가위를 이용하여 직경 2 cm x 2 cm의 정사각형 크기로 진피층을 포함한 전층 결손 상처(full-thickness excisional wound)를 유발하였다.
(3) 육안적 상처 변화의 관찰
각각의 상기 피뿌리풀 추출물(1% 혹은 3%(v/v)), 및 상처 치유에 효능이 있는 것으로 알려져 있는 병풀 추출물(1% 혹은 3%(v/v))을 2주간 1일 1회 상처난 피부에 도포하였다. 병풀 추출물은 실시예 1의 2에 기재된 것과 동일하다. 각각의 시험물질을 상처에 도포한지 각각 1일, 4일, 8일, 11일, 및 15일째에 상처 부위를 촬영하였고 ImageJ(NIH, 미국)를 이용하여 상처의 면적을 측정하고 분석하였다.
(4) 조직학적 검사
각각의 시험물질 투여 후 14일째 모든 실험군을 에테르로 흡입 마취하고, 시험물질의 투여 부위를 10 %의 중성 완충 포르말린 용액으로 고정하였다. 병리조직학적 검사를 위하여 상처면을 고루 검사할 수 있도록, 고정이 완료된 피부 조직을 상처면의 장축을 기준으로 가로와 세로로 2 cm x 2 cm의 정사각형 크기로 각각 1 부위씩 절단하였다. 절단된 조직을 일반적인 조직처리 방법에 따라 파라핀으로 포매한 후, 약 3~4 ㎛의 두께로 조직의 절편을 제작하여 슬라이드 글라스에 부착하였다. 부착이 완료된 절편에 헤마톡실린-에오신 (H&E) 염색을 하고, 염색된 절편을 광학현미경 (Olympus BX53, Japan)으로 검사하였다. 상처 조직 (예, 창상)에 대한 판독은 Nisbet 등(Tissue Eng Part A. 2010, Sep;16(9):2833-42)과 Barati 등(Diagn Pathol. 2013;8:120)이 평가한 방법을 토대로 점수를 정하였고, 각각 소견에 대한 기준은 아래 표 3과 같다.
표 3
조직병리학적 파라미터(histopathological parameter) 점수
0 1 2 3
상피화 (epithelialization) 없음 부분적 완전하지만, 미성숙(immature) 또는 얇음 완전하고 성숙함(complete and mature)
도 8은 피뿌리풀 에탄올 추출물이 동물실험에서 벌어진 상처의 상피화(epithelialization)에 미치는 영향을 나타낸 도면이다. 도 8에서, 가로축의 G1, G2, G3, G4, 및 G5는 표 2에 나타낸 바와 같은 실험군을 나타내고, 세로축의 점수(score)는 표 3에 정의되는 상피화 기준에 따라 측정된 값이다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 본원발명의 피뿌리풀 추출물 G4 및 G5는 대조군 G1에 비하여 유의하게 상피화를 증가시켰다. 도 8 및 도 9에서, *는 쉐페 시험(Scheffe's test) p<0.05에 의한 ANOVA를 나타낸다.
도 9는 피뿌리풀 에탄올 추출물이 동물실험에서 벌어진 상처의 상처 면적 감소에 미치는 영향을 나타낸 도면이다. 도 9에서, 상처 면적은 피뿌리풀 추출물을 상처에 도포한 후 1일, 4일, 8일, 11일, 및 15일에 상처 면적을 측정한 결과를 나타낸다. 도 9에서, 가로축의 G1, G2, G3, G4, 및 G5는 표 2에 나타낸 바와 같은 실험군을 나타내고, 세로축은 상처면적을 나타낸다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 본원발명의 피뿌리풀 추출물 G4 및 G5는 대조군 G1에 비하여 상처 면적을 현저하게 감소시켰다.
도 10은 피뿌리풀 에탄올 추출물이 동물실험에서 벌어진 상처의 회복을 촉진함을 H&E 염색법으로 확인한 결과이다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 본원발명의 피뿌리풀 추출물은 대조군에 비하여 상처의 재상피화를 촉진하였다. 도 8의 H&E 조직 염색에 의하면, 두 가지 층을 확인할 수 있는데, 위 층의 진한핑크색이 표피이고 아래 층의 옅은 핑크색이 진피이다. 대조군과 시료를 처리한 군을 비교해보았을 때, 위 층의 표피의 두께나 갈라짐이 시료 처리군에서 회복되는 것을 확인할 수 있다.
이상의 결과로부터, 피뿌리풀 추출물은 동물실험에서 벌어진 상처의 재상피화를 촉진하고 회복을 현저하게 촉진하였다. 이상의 결과는 피뿌리풀 지상부의 에탄올 추출물을 사용하여 얻어진 결과에 근거한 것이나, 피뿌리풀 지상부의 에탄올 추출물의 헥산, 에틸아세테이트 또는 부탄올 분획물, 피뿌리풀 지상부의 아세톤, 메탄올 또는 부탄올 추출물 또는 그의 헥산, 에틸아세테이트 또는 부탄올 분획물에 대하여도 유사한 결과를 얻었다.
또한, 상기한 실시예에 의하면, 자외선이 조사된 조건에서 피뿌리풀 추출물은 사람 섬유아세포로부터 MMP-1의 발현을 감소시키고 콜라겐 발현을 촉진시키는 것으로 확인되었다. 즉, 상기 피뿌리풀 추출물은 사람 섬유아세포에서 자외선이 조사된 조건에서 콜라겐 분해 효소의 발현은 감소시키면서 콜라겐의 발현은 촉진하였다. 따라서, 상기 피뿌리풀 추출물은 사람 섬유아세포를 포함하는 조직에서, 예를 들면 피부에서 콜라겐 합성을 촉진하여 그 조직의 탄력성을 유지하고 촉진할 수 있다. 따라서, 상기 피뿌리풀 추출물은 사람 섬유아세포를 포함하는 조직, 예를 들면, 피부 주름을 개선시키거나, 또는 피부 노화를 방지하는데 효과가 있다.
실시예 2: 피뿌리풀 줄기 추출물 및 그의 분획물의 제조
본 실시예에서는 피뿌리풀(Stellera chamaejasme)로부터 피뿌리풀 줄기 추출물 및 그의 분획물을 제조하고, 피뿌리풀 줄기 추출물 및 상기 분획물이 상처 치료에 미치는 효과를 확인하였다.
1. 피뿌리풀 줄기 추출물 및 그의 분획물의 제조
(1) 피뿌리풀 줄기 추출물의 제조
피뿌리풀 추출물은 몽골 울란바토르 근교에서 생육한 것으로서 지상부 중 줄기만을 채집하였다. 채집된 줄기를 물로 세척하고 건조하였다. 건조된 피뿌리풀 줄기는 작두를 이용하여 2~3cm로 세절하여 사용하였다. 유리 삼각플라스크에 상기 세절된 피뿌리풀 줄기 100g과 95%의 에탄올 1L을 넣고 혼합하였다. 이 혼합물을 상온(약 20℃)에서 48시간 동안 150 rpm으로 교반하여 추출하였다.
다음으로, 혼합물을 여과지 (Whatman, NO.2, 8㎛)에 통과시켜 얻어진 여과액을 얻었다. 얻어진 여과액을 회전식 감압농축기 (EYELA, N-1100)를 사용하여 감압 농축하였으며, 남아있는 용매를 제거하기 위하여 48시간 동안 동결건조 (Operon, FDCF-12003)를 실시하여 용매가 제거된 건조된 피뿌리풀 추출물 3g을 얻었다.
(2) 피뿌리풀 줄기 추출물의 분획물의 제조
건조된 피뿌리풀 추출물 3 g과 물 100 mL를 삼각플라스크에 넣어 현탁 후 분별깔때기 (250 mL)에 넣고 여기에 n-헥산 (Extra pure grade, 95% 이상) 100 mL를 첨가하고 충분히 흔들어 준 후, 상온에서 3 시간 동안 방치하였다. 상기 혼합물을 분별깔때기를 이용하여 헥산층만을 취하고, 위와 같은 과정을 3회 반복하여 실시하였으며, 얻어진 헥산 분획은 감압농축 (EYELA, N-1100)을 하여 헥산 분획을 얻었다.
또한, 동일한 방법으로 상기 헥산 분획이 제거된 물 분획에 대하여 에틸아세테이트를 첨가하고 혼합한 후 동일한 과정을 거쳐 에틸아세테이트 분획을 얻었다.
또한, 동일한 방법으로 상기 에틸아세테이트 분획이 제거된 물 분획에 수포화 부탄올을 첨가하고 혼합한 후 동일한 과정을 거쳐 부탄올 분획을 얻었다.
상기 피뿌리풀 추출물과 그의 분획물은 디메틸술폭시드(Dimethyl sulfoxide: DMSO)에 20 mg/ml 농도로 녹인 후, 하기 실험에 이용했다.
2. 인체 각질형성세포의 이동 증가
상기 피뿌리풀 줄기 추출물 또는 그 분획물이 인체 각질형성세포가 이동(migration)하는 것을 증가시키는지 여부를 아래와 같이 확인하였다.
우태아 혈청이 2.5 (v/v)%로 함유된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Media: Hyclone) 배지 1 ml이 들어있는 24-웰 평판 배양기의 웰에 HaCaT 인체 각질형성세포를 2×105 세포/웰이 되도록 넣었다. 다음으로, 상기 각질형성세포를 컨플루언시가 80%로 될 때까지 37℃ 및 5% CO2 배양기에서 배양시킨 후, 배지 중의 세포 단일층을 p10 피펫 팁으로 긁어서 "긁힘-손상"을 유도하였다.
다음으로, 상기 긁어진 세포 단일층 상에 무혈청 DMEM 200㎕와 상기 피뿌리풀 추출물 또는 그 분획물을 5 ㎍/ml 배지 및 10 ㎍/ml 배지의 농도로 첨가하였다. 그 후, 상기한 배양 조건과 동일한 조건에서 인체 각질형성세포를 24시간 동안 배양시켰다. 음성 대조군으로는 상기 추출물을 녹이는데 사용한 DMSO를 동량 처리하였고, 양성 대조군으로는 PPARδ 활성체인 GW501516 (시그마알드리치, 미국) 또는 병풀 추출물을 지정된 농도로 사용하였다. 이 후, 크리스탈 비올렛(crystal violet) 시약으로 세포층을 염색한 후 긁힘 상처가 회복되는 정도를 확인하였다. 상기 병풀 추출물은 바이오스펙트럼(한국)으로부터 구입한 것이다.
도 11은 피뿌리풀 줄기 추출물이 각질형성세포의 이동을 촉진함을 확인한 결과이다.
도 12는 피뿌리풀 줄기 추출물의 분획물이 각질형성세포의 이동을 촉진함을 확인한 결과이다.
도 11 및 도 12에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군이 처리된 세포의 긁힘 손상은 24시간 후에 상대적으로 치유되지 않은 채로 남아 있었는데 반해, 피뿌리풀 줄기 추출물 또는 분획물이 처리된 세포에서는 상처 가장자리의 세포 증식과 이동으로 긁힘-손상이 치유되어 24시간 후 긁힌 면적이 감소되었다. 도 11에서, GW는 GW501516를 나타낸다.
3. 섬유아세포에서 COL1A1 및 COL3A1 유전자의 발현 증가
상기 피뿌리풀 줄기 추출물 또는 그 분획물이 인간 섬유아세포에서 콜라겐 유전자의 발현을 촉진하는지 여부를 아래와 같이 확인하였다.
우태아 혈청이 2.5 (v/v)%로 함유된 DMEM 배지 2 ml이 들어있는 6-웰 평판 배양기의 웰에 인체의 섬유아세포 (Human dermal fibroblasts: HDF, American Type Culture Collection, USA)를 2×106 세포/웰이 되도록 넣고 컨플루언시가 80%가 될 때까지 상기한 바와 동일한 조건에서 배양하였다.
이렇게 배양한 세포에 상기 피뿌리풀 줄기 추출물을 각각 1㎍/ml, 5㎍/ml, 및 10㎍/ml, 피뿌리풀 줄기 추출물의 분획물을 각각 5㎍/ml 및 10 ㎍/ml의 농도로 첨가하고 24 시간 동안 상기한 바와 동일한 조건에서 배양시켰다. 음성 대조군으로는 상기 추출물을 녹이는데 사용한 DMSO를 동량 처리하였고, 양성 대조군으로는 병풀 추출물 (바이오스펙트럼, 한국)을 사용하였다. 24시간 후, RT-PCR 어세이를 통해 콜라겐 유전자 발현되는지를 확인하였다. 구체적으로, 24시간 경과한 다음 세포로부터 TRIzol시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 총 RNA를 수확하여 역전사시킨 후, RT-PCR을 다음과 같이 수행하였다. 먼저 cDNA 합성을 위해 상기 RNA를 역전사 효소(reverse transcriptase)를 사용하여 역전사시켰다. RT-PCR은 표1의 특정 프라이머를 프라이머로 사용하여 수행하였다. 각 유전자의 상대적인 mRNA 발현량 값은 β-액틴 값으로 표준화하였다.
도 13은 피뿌리풀 줄기 추출물이 섬유아세포에서 COL1A1 및 COL3A1 유전자의 발현을 촉진함을 확인한 결과이다.
도 14는 피뿌리풀 줄기 추출물의 분획물이 섬유아세포에서 COL1A1 및 COL3A1 유전자의 발현을 촉진함을 확인한 결과이다.
도 13 및 도 14에 나타낸 바와 같이, 피뿌리풀 줄기 추출물 또는 그 분획물은 콜라겐 합성 관련 인자인 COL1A1 및 COL3A1으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상 유전자의 발현을 활성화시키는 효과가 현저하다는 것을 알 수 있었다.
4. 동물실험에서 상처 회복 증진
상기 피뿌리풀 줄기 추출물이 동물실험에서 상처 부위의 회복를 촉진하는지 여부를 아래와 같이 확인하였다.
(1) 실험동물
Sprague-Dawley(SD) 랫트(수컷, 7주령)를 ㈜코아텍에서 입수하여 25 ±1℃, 습도 50 ± 10%를 유지하고 명암은 주야 12시간으로 자동 조절하며 보관하였다. 또한, 일반식이의 사료와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 모든 실험동물은 1주 동안 동물실 환경에 적응시킨 후, 실험에 사용하였다. 실험군에 투여한 식이와 투여 용량, 투여 방법은 하기 표 4에 나타내었다.
표 4 실험군 구성 및 시험물질의 투여 용량, 투여 방법
실험군 시험물질 투여 용량 및 방법
G1 없음 -
G2 부형제(vehicle) -
G3 피뿌리풀 추출물 3%(v/v), 1일 1회
G4 병풀 추출물 3%(v/v), 1일 1회
(2) 상처 유발 및 처치
SD 랫트를 마취 전 24시간 동안 절식시켰고, 100 ml의 물을 공급하였다. 모든 실험군에 상처를 유발하기 1 시간 전에 100%의 졸레틸과 100%의 럼푼을 1:2 비율로 혼합하고, 모든 실험군을 수득된 혼합물을 0.1 cc/kg 사용하여 근육 주사로 마취시켰다. 그 후, 모든 실험군을 전기 제모기로 랫트의 등 부위 털을 제거하였다. 등 부위에 각각 10%의 포비돈-요오드와 70%의 에탄올을 도포하여 소독한 후, 등 부위에 소독된 수술용 가위를 이용하여 직경 2 cm x 2 cm의 정사각형 크기로 진피층을 포함한 전층 결손 상처(full-thickness excisional wound)를 유발하였다.
(3) 육안적 상처 변화의 관찰
각각의 상기 피뿌리풀 줄기 추출물, 및 상처 치유에 효능이 있는 것으로 알려져 있는 병풀 추출물을 2주간 3%(v/v)로 1일 1회 상처난 피부에 도포하였다. 병풀 추출물은 실시예 1의 2에 기재된 것과 동일하다. 각각의 시험물질을 상처에 도포한지 각각 1일, 4일, 8일, 11일, 및 14일째에 상처 부위를 촬영하였고 ImageJ(NIH, 미국)를 이용하여 상처의 면적을 측정하고 분석하였다.
(4) 조직학적 검사
각각의 시험물질 투여 후 14일째 모든 실험군을 에테르로 흡입 마취하고, 시험물질의 투여 부위를 10 %의 중성 완충 포르말린 용액으로 고정하였다. 병리조직학적 검사를 위하여 상처면을 고루 검사할 수 있도록, 고정이 완료된 피부 조직을 상처면의 종방향(longitudinal)으로 가로와 세로로 2 cm x 2 cm의 정사각형 크기로 각각 1 부위씩 절단하였다. 절단된 조직을 일반적인 조직처리 방법에 따라 파라핀으로 포매한 후, 약 3~4 ㎛의 두께로 조직의 절편을 제작하여 슬라이드 글라스에 부착하였다. 부착이 완료된 절편에 헤마톡실린-에오진 염색을 하고, 염색된 절편을 광학현미경 (Olympus BX53, Japan)으로 검사하였다. 상처 조직에 대한 판독은 해당 기술 분야에 알려진 평가 방법으로 점수를 정하여 수행하였다(Nisbet 등(Tissue Eng Part A. 2010, Sep;16(9):2833-42)과 Barati 등(Diagn Pathol. 2013;8:120)). 판독시 각각의 소견에 대한 기준은 하기 표 5에 나타낸 바와 같고, 그 판독 결과를 표 6에 나타내었다.
표 6에 나타낸 바와 같이, 피뿌리풀 줄기 추출물은 섬유조직 형성, 혈관 형성 및 상피화가 현저하다는 것을 알 수 있다.
도 15는 피뿌리풀 줄기 추출물이 동물실험에서 벌어진 상처의 회복을 촉진함을 임상학적으로 확인한 결과이다. 도 16은 피뿌리풀 줄기 추출물이 동물실험에서 벌어진 상처의 회복을 촉진함을 정량적으로 확인한 결과이다. 또한, 도 15 및 16에 나타낸 바와 같이, 피뿌리풀 추출물은 상처부위의 재상피화를 촉진시키고 벌어진 상처를 회복하는 효과가 현저하다는 것을 알 수 있다.
표 5
조직병리학적 파라미터(histopathological parameter) 점수
0 1 2 3
염증 없음 약간(mild) 중간(moderate) 현저함(marked)
섬유조직 형성 없거나 최소의 섬유아세포(fibroblast) 소수의 (few)섬유아세포 많은 섬유아세포 대부분에 섬유아세포
혈관형성 (angiogenesis) 없음 high power field (HPF) 당 5이하 혈관 HPF 당 6~10 혈관 HPF 당 10 초과 혈관
상피화 (epithelialization) 없음 부분적 focal defective 완료
표 6
실험군 조직병리학적 파라미터
염증 섬유조직 형성 혈관형성 상피화
G1 2.6 2.4 2.3 1.6
G2 2.5 2.4 2.2 1.7
G3 2.4 2.6 2.5 1.8*
G4 2.3* 2.7* 2.5 1.6
*는 P < 0.05로 G1과의 통계적 유의성 여부를 의미한다.
제제예 1: 약학적 제제의 제조
1. 연질캡슐제의 제조
피뿌리풀 줄기 에탄올 추출물 또는 분획물 150 mg, 팜유 2 mg, 팜경화유 8 mg, 황납 4 mg 및 레시틴 6 mg을 혼합하고, 통상의 방법에 따라 1 캡슐당 400 mg씩 충진하여 연질캅셀제를 제조하였다.
2. 정제의 제조
피뿌리풀 줄기 에탄올 추출물 또는 분획물 150 mg, 포도당 100 mg, 홍삼추출물 50 mg, 전분 96 mg 및 마그네슘 스테아레이트 4 mg을 혼합하고, 30% 에탄올을 40 mg 첨가하여 과립을 형성한 후, 60℃에서 건조하고 타정기를 이용하여 정제로 타정하여 정제를 제조하였다.
3. 과립제의 제조
피뿌리풀 줄기 에탄올 추출물 또는 분획물 150 mg, 포도당 100 mg, 홍삼추출물 50 mg 및 전분 600 mg을 혼합하고 30% 에탄올을 100 mg 첨가하여 과립을 형성한 후, 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후, 포에 충진하였다. 내용물의 최종 중량은 1 g으로 하였다.
제제예 2: 화장료 조성물의 제조
본 제제예에 사용된 피뿌리풀 추출물은 줄기의 에탄올 추출물이다.
1. 유연화장수(스킨로션)의 제조
표 7
배합 성분 함량 (중량 %)
피뿌리풀 추출물 또는 분획물 0.1
글리세린 3.0
부틸렌글리콜 2.0
프로필렌글리콜 2.0
카르복시비닐폴리머 0.1
피이지-12 노닐페닐에테르 0.2
폴리솔베이트 80 0.4
에탄올 10.0
트리에탄올아민 0.1
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 잔량
2. 영양화장수(밀크로션)의 제조
표 8
배합 성분 함량 (중량 %)
피뿌리풀 추출물 또는 분획물 0.1
글리세린 3.0
부틸렌글리콜 3.0
프로필렌글리콜 3.0
카르복시비닐폴리머 0.1
밀납 4.0
폴리솔베이트 60 1.5
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 5.0
스쿠알란 5.0
솔비타세스퀴올레이트 1.5
유동파라핀 0.5
세테아릴 알코올 1.0
트리에탄올아민 0.2
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 잔량
3. 영양크림의 제조
표 9
배합 성분 함량(중량%)
피뿌리풀 추출물 또는 분획물 0.1
글리세린 3.0
부틸렌글리콜 3.0
유동파라핀 7.0
베타글루칸 7.0
카보머 0.1
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 3.0
스쿠알란 5.0
세테아릴 글루코사이드 1.5
소르비탄 스테아레이트 0.4
폴리솔베이트 60 1.2
트리에탄올아민 0.1
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 잔량
4. 마사지 크림의 제조
표 10
배합 성분 함량(중량%)
피뿌리풀 추출물 또는 분획물 0.1
글리세린 8.0
부틸렌글리콜 4.0
유동파라핀 45.0
베타글루칸 7.0
카보머 0.1
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 3.0
밀납 4.0
세테아릴 글루코사이드 1.5
세스퀴 올레인산 소르비탄 0.9
바세린 3.0
파라핀 1.5
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 잔량
5. 팩의 제조
표 11
배합 성분 함량(중량%)
피뿌리풀 추출물 또는 분획물 0.1
글리세린 4.0
폴리비닐알콜 15.0
히알루론산 추출물 5.0
베타글루칸 7.0
알란토인 0.1
노닐 페닐에테르 0.4
폴리솔베이트 60 1.2
에탄올 방부제 6.0적량
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 잔량
6. 연고의 제조
표 12
배합 성분 함량(중량%)
피뿌리풀 추출물 또는 분획물 0.1
글리세린 8.0
부틸렌글리콜 4.0
유동파라핀 15.0
베타글루칸 7.0
카보머 0.1
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 3.0
스쿠알란 1.0
세테아릴 글루코사이드 1.5
소르비탄 스테아레이트 0.4
세테아릴 알코올 1.0
밀납 4.0
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 잔량

Claims (12)

  1. 피뿌리풀 추출물, 또는 그의 분획물을 유효 성분으로서 포함하는 상처를 치료하기 위한 약학적 조성물로서, 상기 피뿌리풀 추출물은 상기 피뿌리풀의 지상부로부터 추출된 것인 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 피뿌리풀 추출물은 물, 아세톤, C1-C6 알콜, 또는 이들의 조합 중에서 추출된 것인 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 피뿌리풀 추출물은 75(v/v)% 내지 100(v/v)% 에탄올, 75(v/v)% 내지 100(v/v)% 메탄올, 75(v/v)% 내지 100(v/v)% 부탄올 또는 이들의 조합 중에서 추출된 것인 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 분획물은 상기 피뿌리풀 추출물을 물에 현탁시킨 후 헥산, 에틸아세테이트, 및 부탄올로 순차적으로 분획화하여 얻어진 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 상처는 피부에 있는 것인 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 피뿌리풀 추출물, 또는 그의 분획물은 조성물 중량에 대하여 0.001 중량 내지 80 중량%인 것인 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 더 포함하는 것인 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 세포 중의 콜라겐 유전자의 발현을 촉진하는 것인 조성물.
  9. 상처를 치료하기에 유효한 양의 청구항 1 내지 8 중 어느 하나의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상처를 치료하는 방법.
  10. 피뿌리풀 추출물, 또는 그의 분획물을 유효 성분으로서 포함하는 상처의 개선용, 피부 주름 개선, 또는 피부 노화 방지용 화장료 조성물로서, 상기 피뿌리풀 추출물은 상기 피뿌리풀의 지상부로부터 추출된 것인 조성물.
  11. 청구항 10의 화장료 조성물을 개체의 피부에 적용하는 단계를 포함하는, 피부를 화장하기 위한 방법.
  12. 청구항 10에 있어서, 상처를 개선시키거나, 피부 주름을 개선시키거나, 또는 피부 노화를 방지하는 것인 방법.
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