WO2017138692A1 - 어리연꽃 속 식물의 추출물을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물 - Google Patents

어리연꽃 속 식물의 추출물을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물 Download PDF

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WO2017138692A1
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skin
improvement
extract
composition
lotus
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김유아
우지은
박병준
홍인기
김동희
손준호
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한국콜마 주식회사
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations

Definitions

  • the present invention relates to a composition for skin improvement comprising an extract of the plant of the genus Lotus, more specifically, the extract of the plant of the genus of lotus is an antioxidant, improve skin inflammation, prevent skin aging, improve skin moisturizing, skin whitening or wrinkles It relates to a composition for skin improvement comprising an extract of the plant of the genus Lotus, which can improve the skin by having an effect of preventing it.
  • Skin is the largest organ in the body and is always in direct contact with the external environment and acts as a protective shield to protect the living body from various irritation or dry environments. It is an organ that actively produces and destroys new cells compared to other organs. In addition, it plays a very important role in protecting the body from physical abrasions, preventing the loss of moisture inside the body, protecting it from the ultraviolet rays generated from the sun, and controlling the body temperature.
  • Patent Document Korean Registered Patent No. 10-1325464 (Nov. 2012.)
  • the present inventors have completed the present invention by finding that the extract of the plant belonging to the genus Lotus ( Nymphoides sp.) Can improve various problems of the skin while searching for a substance that can simultaneously solve various problems of the skin.
  • composition for skin improvement comprising the extract of the plant of the genus Lotus as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a use of the extract of the plant Nymphoides sp. For the preparation of the composition for skin improvement.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for improving skin, comprising applying to the skin an extract of a Nymphoides sp. Plant or a composition comprising the same.
  • the present invention provides a cosmetic composition for skin improvement comprising an extract of the plant Nymphoides sp. As an active ingredient.
  • the plant of the genus Lotus is Nymphoides indica ), Yellow Lotus ( Nymphoides) peltata ), Nymphoides coreana and a combination thereof may be one selected from the group consisting of.
  • the skin improvement may be selected from the group consisting of antioxidants, skin inflammation improvement, skin aging prevention or improvement, skin damage caused by ultraviolet light, skin moisturization improvement, skin whitening improvement, skin wrinkle prevention or improvement, and combinations thereof.
  • the extract may be extracted with a solvent selected from the group consisting of water, alcohol, methanol, hexane, methylene chloride, ethyl acetate, butanol, propylene glycol, butylene glycol, dipropylene glycol, chloroform, glycerin and combinations thereof.
  • a solvent selected from the group consisting of water, alcohol, methanol, hexane, methylene chloride, ethyl acetate, butanol, propylene glycol, butylene glycol, dipropylene glycol, chloroform, glycerin and combinations thereof.
  • the present invention provides a use of the extract of the genus Lotus (Nymphoides sp.) Plant for the production of a cosmetic composition for skin improvement.
  • the present invention provides a method for improving the skin, comprising applying to the skin a cosmetic composition comprising an extract of the plant Nymphoides sp.
  • Lotus according to the present invention has various effects such as antioxidant, skin inflammation improvement, skin aging prevention or improvement, skin damage caused by ultraviolet light, skin moisturization improvement, skin whitening improvement, skin wrinkle prevention or improvement, etc. It can improve skin.
  • Figure 2 shows the activity inhibitory activity of xanthine oxidase (XO, XO, Xanthine Oxidase) by concentration of Examples 1 and 3, vitamin C is a positive control group.
  • Figure 3 shows the SOD-like activity of each concentration of Examples 1 to 4 (meaning Example 2, Example 1, Example 4 and Example 3, in order of brightness (dark to light).
  • Figure 5 shows the elastase inhibitory ability by concentrations of Examples 1 and 3, EGCG (Epigallocatechin-3-gallate) is a positive control.
  • Figure 6 shows the cell protective effect against ultraviolet rays of Examples 3 and 4
  • EGCG Epigallocatechin-3-gallate
  • Blank control group not irradiated with UV A
  • Example or EGCG / UVA negative control irradiated with ultraviolet A and not treated with Examples or EGCG
  • Figure 7 shows the ability to inhibit nitric oxide production by concentrations of Examples 1 and 3, vitamin C is a positive control group.
  • Figure 8 shows the effect of inhibiting the expression of PGE2 (prostaglandin E2) at different concentrations of Examples 1 and 3, PDTC (Pyrrolidine dithiocarbamate) is a positive control group.
  • FIG. 9 and 10 are diagrams showing the ability to inhibit COX-2 expression by concentrations of Examples 1 and 3 (FIG. 9: protein expression measurement result, FIG. 10: mRNA expression measurement result).
  • Figure 11 shows the tyrosinase inhibitory ability by concentrations of Examples 1 and 3, vitamin C is a positive control group.
  • FIG. 12 shows the results of quantitative comparative analysis of electrophoresis photographs and tyrosinase protein expression levels analyzed by Western blot that Examples 1 and 3 inhibited tyrosinase protein expression (Nor: ⁇ -MSH and Examples Untreated control / Cont: negative control treated with ⁇ -MSH only, Example not treated).
  • FIG. 13 is a diagram showing the MITF expression inhibitory ability of Examples 1 and 3.
  • FIG. 14 is a diagram showing the inhibitory ability of tyrosinase mRNA and MITF mRNA expression of Examples 1 and 3 (Fig. 14a: tyrosinase mRNA expression inhibitory ability, Figure 14b: MITF mRNA expression inhibitory ability).
  • FIG. 15 is a graph showing the effects of Examples 1 and 3 on the expression of AQP3 at different concentrations (Nor: control group without any treatment / Cont: negative control group treated only with TNF- ⁇ and INF- ⁇ and the Example was not treated) ).
  • FIG. 16 is a diagram showing the hyaluronic acid synthesis promoting ability of Examples 1 and 3.
  • FIG. 16 is a diagram showing the hyaluronic acid synthesis promoting ability of Examples 1 and 3.
  • FIG. 17 is a diagram showing the filaggrin synthesis promoting ability of Examples 1 and 3.
  • FIG. 17 is a diagram showing the filaggrin synthesis promoting ability of Examples 1 and 3.
  • FIG. 18 is a diagram showing the ability to promote synthesis of hyaluronic acid synthase 2 (HAS2) of Examples 1 and 3.
  • HAS2 hyaluronic acid synthase 2
  • Fig. 19 shows the synthesis promoting ability of the filaggrin proteins of Examples 1 and 3;
  • FIG. 20 is a diagram showing mRNA expression promoting ability (FIG. 20A) and filaggrin mRNA expression promoting ability (FIG. 20B) of HAS2 of Examples 1 and 3.
  • FIG. 20A mRNA expression promoting ability
  • FIG. 20B filaggrin mRNA expression promoting ability
  • FIG. 21 is a view showing MMP-1 production inhibitory ability (FIG. 21A) and procollagen production promoting ability (FIG. 21B) of Examples 1 and 3.
  • FIG. 21A MMP-1 production inhibitory ability
  • FIG. 21B procollagen production promoting ability
  • the present invention has been studied with the support of the National Research and Development Project at Kolmar Korea, and the specific information is as follows:
  • the task unique number is HN15C0103
  • the ministry's name is the Ministry of Health and Welfare
  • the research and management institution is a global cosmetic research and development project group.
  • the project name is Global Cosmetics New Materials and New Technology R & D Support
  • the title of research project is the development of anti-aging cosmetics using aquatic plants of cultivated smart plants, the contribution rate is 1, and the host institution is Kolmar Korea. Is November 11, 2015 and October 31, 2015.
  • the present invention provides a composition for skin improvement comprising an extract of the genus Lotus ( Nymphoides sp.) As an active ingredient.
  • the composition may be a pharmaceutical composition, a food composition or a cosmetic composition.
  • the plants of the genus Lotus may be any of the genus of the genus of lotus, but is not limited to, Nymphoides indica , Yellow Nymphoides peltata), some young lotus (Nymphoides coreana ) and combinations thereof.
  • the cosmetic composition according to the present invention by containing the lotus flower extract and yellow lotus flower extract as an active ingredient, anti-oxidation, skin inflammation improvement, skin aging prevention or improvement, skin damage caused by UV light, skin moisturizing improvement, skin whitening improvement, Or it may have a synergistic effect in preventing or improving skin wrinkles.
  • the yellow lotus flower is known to have no skin improvement effect in Table 1 of US Patent Publication No. 2013-0243708, the present invention was found that the yellow lotus flower extract has a skin improvement effect.
  • Nymphoides indica has mud roots spread all over the mud, with one to three leaves at the end of long petioles. Leaves float on water, centrifugal, deeply split on one side, flat on edge. Flowers bloom in August, and the center is yellow on white background, and about 10 are wrapped around the bottom of petiole.
  • the lotus is called the herbal medicine name of gold and silver lotus, and it has traditionally been used to treat diseases such as gugal and gugun with the efficacy of jinjin and yangyi.
  • Yellow-eyed lotus ( Nymphoides peltata ) has a rhizome extending laterally in the soil under water and the stem grows long in a thread shape.
  • the leaf has long petiole and floats on water. It is wide oval with 5 ⁇ 10 cm in diameter, and its bottom part is divided into 2, but some are attached. Yellow flowers bloom in July-August. Two or three flower bands emerge from the leaf axles encountered by umbel inflorescences and 2-3 flowers bloom on the water.
  • Nymphoides coreana is a perennial herb that grows in water and vaginal soil, has long and thin stems, and leaves 1-2 leaves on water. Leaves are oval-shaped heart-shaped or centrifugal with a diameter of 2 ⁇ 6cm, deeply divided at the bottom, with flat edges, and lobes are 1 ⁇ 10cm long. Flower is white in June ⁇ July, and it grows on the base of the leaf disease. The tube is 1 ⁇ 3cm long. Calyxes are broad lanceolate, pointed at end, 3-4mm long, corolla divided into 4-5. In addition, there is short cilia at the edges, 5 stamens, fruit is granules, 4 ⁇ 5mm long, oval, and seeds are smooth and glossy.
  • the extract of the plant of the genus Lotus of the present invention is not limited thereto, but water, ethanol, methanol, hexane, methylene chloride, ethyl acetate, butanol, propylene glycol, butylene glycol, dipropylene glycol, chloroform, glycerin and combinations thereof It may be extracted with a solvent selected from the group consisting of, preferably ethanol, methanol or a mixed solvent thereof.
  • the extract may include 70 to 95% ethanol or methanol extract.
  • the extract of the plant of the genus Lotus of the present invention is not limited thereto, but may be extracted at one or more sites selected from the group comprising the flower, leaf, stem, fruit, seed, root and outpost of the plant, preferably Can be extracted from the outpost.
  • Extract of the plant of the genus Lotus according to the present invention can improve the skin, the skin improvement is antioxidant, skin inflammation improvement, skin aging or improvement, skin damage caused by ultraviolet light, skin moisturizing improvement, skin whitening improvement, skin Wrinkle prevention or amelioration and combinations thereof.
  • the plant extracts of the genus Lotus can act as an antioxidant by removing ABTS radicals, inhibiting the activity of Xanthine oxidase, and having SOD-like activity. Aerobic organisms in using oxygen proceed to energy metabolism, in vivo oxygen When various physical, chemical and biological stress O 2 - (superoxide), NO (nitric oxide), NO 2 (nitrogen dioxide), OH (hydroxyl ), Such as radicals such as ROO (proxyl), RO (alkoxyl), NO 3 (peroxynitrite), ABTS + and the like, become active oxygen species (radical), causing fatal physiological disorders in the human body.
  • Antioxidant enzymes such as superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT; catalase), glutathione peroxidase (GSHpx; glutathione peroxidase) as a means to defend the living body from such radicals, vitamin E, glutathione Antioxidants such as these are present to protect the living body from oxidative damage by removing free radicals.
  • xanthine oxidase is an enzyme that oxidizes purines hypoxanthine and xanthine to form uric acid, which is also a cause of a disease known as gout. Gout is an inflammation accompanied by pain due to the deposition of uric acid on the joints. Therefore, inhibition of xanthine oxidase calms gout (Chiang et al ., Journal of Enzyme Inhibition , 8, pp 61-71, 1994). Xanthine oxidase is a biological cause of oxygen-derived free radicals that act on oxidative damage in living cells.
  • the plant extract of the genus Lotus inhibits the expression of nitric oxide and prostaglandin E2.
  • An inflammatory response is a mechanism for repairing and repairing a damaged area when an invasion that causes any organic change, such as a physical action, chemical, or bacterial infection, occurs in a living body or tissue. It also modulates acute or chronic inflammatory responses, and prostaglandin E2 is an inflammatory mediator. Therefore, inhibiting the production of nitric oxide or prostaglandin E2 can alleviate the inflammatory response.
  • the plant extract of the genus Lotus is inhibited elastase activity, protects the skin from ultraviolet rays, and these actions can prevent skin aging and wrinkles, and may also improve wrinkles.
  • Elastin is an elastic fiber that has rubber-like elasticity, so it is easily deformed even with a small force and returns to its original form when the force is removed. Therefore, elastin is a very important substance for improving skin elasticity and wrinkles. Therefore, inhibiting the activity of the elastase that degrades allestin can improve skin elasticity and wrinkles.
  • Aquaporin is a type of membrane protein known to play a role as a water channel (Proc. Nadl. Acad. Sci. USA 91: 6255 (1994). The first aquaporin was precisely identified by Peter Agre in 1991. Agre won the Nobel Prize in 2003 (Proc Natl Acad Sci US A. 1991 Dec 15; 88 (24): 11110). It is known that it plays an important role, and research on a substance that activates aquaporin-3 is active because the substance that activates aquaporin-3 is related to the moisturizing function of the skin (Journal of Investigative Dermatology 131: 865 , 2011).
  • the plant extract of the genus Lotus inhibits the activity and expression of tyrosinase.
  • tyrosine in the cell is used as a substrate, and an enzyme called tyrosinase generates dopaquinone, which is a copolymer of melanin through autooxidation and enzymatic reaction from dopaquinone.
  • the melanin produced in this way is transferred to keratinocytes through a melanosomal pouch, which is released from the keratinocytes during the 28-day keratinization process.
  • melanin is excessively produced by a factor that promotes melanin production and melanin is not completely eliminated by keratinization, pigmentation occurs. Therefore, in order to prevent the pigmentation phenomenon, it can be suppressed by controlling some processes in the melanogenesis process.
  • Important enzymes involved in the biosynthesis of melanin include tyrosinase, tyrosinase related protain 1 (TRP1), and dopachrome tautomerase, but enzymes that play a crucial role in melanin synthesis Is tyrosinase.
  • the cosmetic composition according to the present invention comprises an extract of the plant of the genus Lotus as an active ingredient, and with a dermatologically acceptable excipient, a basic cosmetic composition (washing agent such as cosmetic water, cream, essence, cleansing foam and cleansing water, pack, body Oil), color cosmetic composition (foundation, lipstick, mascara, makeup base), hair or scalp product composition (shampoo, rinse, hair conditioner, hair gel) and soap and the like.
  • a basic cosmetic composition such as cosmetic water, cream, essence, cleansing foam and cleansing water, pack, body Oil
  • color cosmetic composition foundation, lipstick, mascara, makeup base
  • hair or scalp product composition shampoo, rinse, hair conditioner, hair gel
  • the excipients include, but are not limited to, emollients, skin penetration enhancers, colorants, fragrances, emulsifiers, thickeners and solvents.
  • fragrances, pigments, fungicides, antioxidants, preservatives and moisturizing agents may be further included, and may include thickeners, inorganic salts, synthetic polymer materials and the like for the purpose of improving the properties.
  • the biarylamide derivative of the present invention can be easily prepared by adding the face wash and the soap base.
  • the cream When the cream is prepared, it can be prepared by adding the biarylamide derivative of the present invention to a cream base of general oil-in-water type (O / W).
  • a cream base of general oil-in-water type O / W.
  • synthetic or natural materials such as proteins, minerals, vitamins, etc., for the purpose of improving physical properties, such as flavors, chelating agents, pigments, antioxidants, and preservatives, may be added.
  • the content of the plant of the genus Lotus contained in the cosmetic composition of the present invention is not limited thereto, it is preferably 0.001 to 10% by weight, more preferably 0.01 to 5% by weight based on the total weight of the total composition. If the content is less than 0.001% by weight, the desired effect of the present invention cannot be expected, and if it is more than 10% by weight, there may be difficulties in safety or formulation formulation.
  • the formulation of the cosmetic composition of the present invention is not limited thereto, but skin lotion, skin softener, skin toner, astringent longevity, softening longevity, nourishing longevity, astringent, lotion, milk lotion, moisturizing lotion, nutrition lotion, body cream, massage cream, Nourishing Cream, Moisture Cream, Hand Cream, Essence, Nourishing Essence, Pack, Soap, Shampoo, Cleansing Foam, Cleansing Lotion, Cleansing Cream, Body Lotion, Body Cleanser, Treatment, Serum, Latex, Press Powder, Loose Powder, Eye Shadow Formulations, and the like.
  • the present invention provides a method for improving skin by administering to the skin a cosmetic composition comprising the extract of the plant of the genus Lotus.
  • the cosmetic composition may be administered at least once a day, preferably up to three times a day, and topical administration may be preferred.
  • the specified dosage or frequency of administration can be adjusted according to the body weight, the individual response to the active ingredient, the type of preparation, and the time or interval at which administration is performed.
  • the improvement in skin appearance usually appears after 1 day to 6 months, depending on the skin condition, the concentration of the active ingredient used in the method of the present invention, the amount of the composition used, or the frequency of application.
  • a lotus lotus methanol extract was prepared in the same manner as in Example 1, except that 80% methanol was used as the extraction solvent.
  • An ethanol extract of the yellow lotus was prepared in the same manner as in Example 1, except that the yellow lotus ( Nymphoides peltata ) was used.
  • a yellow lotus flower methanol extract was prepared in the same manner as in Example 3, except that 80% methanol was used as the extraction solvent.
  • Antioxidant activity using ABTS radical was measured by ABTS + cation decolorization assay method 40).
  • 7 mM 2,2-azino-bis (3-ethyl-benthiazoline-6-sulfonic acid) and 2.4 mM potassium persulfate were mixed and left at room temperature for 24 hours to form ABTS +, diluted with ethanol and 100 uL of sample in 100 uL of ABTS +. After leaving for 1 minute, the absorbance was measured at 732 nm. With the scavenging ability of the group treated with vitamin C at a concentration of 1000 ⁇ g / ml as 100%, the results of the other experimental groups were relatively calculated, and the results are shown in FIG. 1.
  • Xanthine oxidase inhibitory activity was expressed by the decrease in absorbance of the sample solution added and unadded.
  • vitamin C was prepared by the same concentration as in Example and compared by measuring the absorbance in the same manner. Inhibition of NBT reduction according to the concentration-specific samples was calculated by the following equation.
  • Example 1 and 3 both showed better inhibition than vitamin C, and in particular, the XO inhibition of Example 2 was significantly better than Example 1 and vitamin C.
  • WU of the Superoxide Dismutase Assay Kit was added to 20 ⁇ l of each sample solution in each of Examples 1 to 4 at concentrations of 1 ⁇ g / ml, 10 ⁇ g / ml and 100 ⁇ g / ml.
  • 200 ⁇ l of working solution (WST working solution) was added thereto, followed by stirring.
  • 20 ⁇ l of enzyme working solution was added thereto, followed by mixing for 20 minutes in an incubator at 37 ° C. and absorbance at 450 nm using a microplate counter. was measured.
  • Superoxide dismutase 100 units was used as an experimental control, and superoxide dismutase-like activity was expressed as a decrease in absorbance of the sample solution added compared to the superoxide dismutase treatment group. The measurement results are shown in FIG. 3.
  • the inhibitory effect of elastase which promotes wrinkle formation by decomposing elastin, which is involved in dermal tissue flexibility, was tested and tested by the following method.
  • N-succinyl- (L-Ala) 3 -p-nitroanilide as the substrate, the amount of p-nitroanilide produced from the substrate was measured at 445 nm for 20 minutes at 37 ° C. That is, each test solution was prepared to a certain concentration, 0.5ml each was taken in a test tube, 0.5ml porcine pancreas elastase (2.5U / ml) solution dissolved in 50mM tris-HCl buffer (pH 8.6) was added, and then 50mM tris- as a substrate.
  • Human fibroblasts were cultured in a 37 ° C., CO 2 incubator. Thereafter, the culture medium was removed, washed with HBSS (Hank's Balanced Salt Solution), HBSS was added again, and the UV A was sufficiently irradiated using an UV irradiator system, followed by Examples 3 and 4 by concentration. Treatment was incubated for 21 hours under the same culture conditions. After incubation, MTT 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-Diphenyltetrazolium Bromide solution reagent was added to the well and incubated again at 37 ° C. for 3 hours.
  • Example 3 showed a cell protective effect against ultraviolet rays, and in particular, Example 4 showed an excellent effect similar to that of the positive control group.
  • PGE2 prostaglandin E2
  • Examples 1 and 3 inhibit PGE2 expression as a substance that plays an important role in inducing inflammation.
  • HaCaT cells were seeded in 60 mm tissue culture dishes and cultured for 24 hours to stabilize the cells. Thereafter, TNF- ⁇ (10 ng / ml) and INF- ⁇ (10 ng / ml) were pretreated, and Examples 1 and 3 were treated by concentration to remove the culture medium for 24 hours, followed by Example 1 or Example 3 The extracts were incubated for 24 hours in a concentration-treated medium, and then the medium was removed again and washed twice with PBS. Dissolve 100 ⁇ l of complete mini 1 tab in 10 ml of RIPA buffer and centrifuge for 20 min at 12,000 rmp.
  • the supernatant obtained by centrifugation was quantified by Bradford assay, and 30ul of protein was separated by electrophoresis on 10% SDS-PAGE.
  • the separated proteins were transferred to PVDF membrane using a semi dry transfer cell instrument (Hofer, USA) and incubated in blocking buffer (5% skim milk in TBST) for 1 hour at room temperature.
  • the primary antibody was diluted and over night at 4 ° C., followed by three washes with TBST at 10 minute intervals, followed by diluting each secondary antibody of mouse anti-rabbit IgG HRP and bovine anti-goat IgG HRP to 1: 1,000. Incubated at room temperature for 2 hours. After washing three times, the expression level was analyzed by checking the band using an LAS 4,000 device.
  • RNA extracted from the cells was quantified by measuring the absorbance at 260nm and 280nm. Quantified RNA was mixed with 5 ⁇ g, Oligo (dT) 15 0.5 ⁇ g / reaction, Nuclease-Free Water (promega kit, USA) and reacted for 5 minutes on ice at 70 °C for 5 minutes. The reaction mixture was prepared by mixing 10 times RT buffer, MgCl 2 DTT, and RNase.
  • Tyrosinase inhibitory activity was measured by modifying a method such as Yagi, which measures dopa chromium produced by the action of tyrosinase by colorimetry.
  • the reaction zone was prepared by adding 0.2 ml of mushroom tyrosinase (110U / ml) to a mixture of 0.2 ml of substrate solution dissolved in 10 mM L-DOPA in 0.5 ml of 0.175 M sodium phosphate buffer (pH 6.8) and 0.1 ml of sample solution. The reaction was carried out for a minute to measure the DOPA chrome produced in the reaction solution at 475nm. Relative tyrosinase inhibitory activity of each experimental group was measured based on the control group treated with no substance, and the results are shown in FIG. 11.
  • the tyrosine-EDTA solution was added to collect the cells, and the cells were separated and obtained from a microtube, followed by centrifugation to remove the supernatant.
  • the separated pellet was washed with 1 ⁇ PBS ( ⁇ ) and centrifuged, and then the pellet was treated with RIPA buffer (Thermo, USA) for 15 minutes at -20 ° C. After centrifugation, the supernatant was transferred to a tube and stored at -20 ° C.
  • the protein purified by the above method was subjected to electrophoresis using 8% SDS-PAGE and transferred to the PVDF membrane. After blocking for 1 hour in Tris buffer solution containing 5% skim milk, the solution was reacted with tyrosinase and GAPDH antibodies.
  • the protein purified by the above method was subjected to electrophoresis using 8% SDS-PAGE and transferred to the PVDF membrane. After 5% reaction, donkey anti-goat lgG-HRP bound antibody was added and Immobilon TM Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore) using a reaction for a certain time and then developed. The expression level of tyrosinase in each experimental group was quantitatively analyzed using the LAS 4000 image analyzer, and the results are shown in FIG. 12.
  • B16F10 cell line was stabilized by incubating for 24 hours after cell seeding in a 60mm tissue culture dish. After removing the medium, the extract was incubated for 48 hours with the medium treated with the concentration, and then the medium was removed again and washed twice with PBS. Complete mini 1 tab is added to 10 ml of RIPA buffer. Dissolve in 100 uL and centrifuge for 20 min at 12,000 rmp. The supernatant obtained by centrifugation was quantified by Bradford assay, and 30ul of protein was separated by electrophoresis on 10% SDS-PAGE.
  • the separated proteins were transferred to PVDF membrane using a semi dry transfer cell instrument (Hofer, USA) and incubated in blocking buffer (5% skim milk in TBST) for 1 hour at room temperature. After diluting the primary antibody and over night at 4 ° C., washing with TBST three times at 10 minute intervals and diluting each secondary antibody of mouse anti-rabbit IgG HRP and bovine anti-goat IgG HRP to 1: 1,000. Incubate for 2 hours at room temperature. After washing three times, the band was quantified by using a LAS 4,000 device. The only group treated with the medium was the negative control group (Nor), and the positive control group (Cont) with only the stimulus source was treated.
  • blocking buffer 5% skim milk in TBST
  • RNA extracted from the cells was quantified by measuring the absorbance at 260nm and 280nm. Quantitative RNA was mixed with 5 ⁇ g, Oligo (dT) 15 0.5 ⁇ g / reaction, Nuclease-Free Water (promega kit, USA) and cooled using ice at 70 ° C. for 5 minutes.
  • the reaction mixture was prepared by mixing 10 times RT buffer, MgCl 2 DTT, and RNase. It was inactivated by heating at 25 ° C. for 10 minutes at 42 ° C. for 50 minutes at 70 ° C. for 15 minutes and cooling with ice.
  • the cDNA, 2X SYBR green mix, primer, and ROX were added to the ABI step one plus (Applied biosystem, USA) device for real-time quantitative analysis, and the results were analyzed using an analysis program.
  • Aquaporins are a family of transdermal proteins that form channels that facilitate the diffusion of water and small molecules, such as glycerol and urea, in solution.
  • AQP3 is aquaglyceroporin, and plays an important role in maintaining tissue hydration levels, such as glycerol, urea, purine and pyrimidines.
  • Human Aquaporin 3, Gill Blood Group ELISA kit is purchased from Mybiosource (USA) to determine the amount of AQP-3 in cell culture. By seeding a 5 X 10 5 cells in 6 well plate and cultured for 24 hours.
  • TNF- ⁇ (10 ng / ml) and INF- ⁇ (10 ng / ml) were pretreated and Examples 1 and 3 were incubated for 24 hours. After 24 hours of incubation, cell cultures are obtained and used for AQP-3 determination. AQP-3 was measured according to the protocol of Human Aquaporin 3, Gill Blood Group ELISA kit.
  • an ELISA assay kit is purchased from echelon bioscience (Salt Lake City, UT) LSBio (Seattle, WA). The cells were pretreated with extracts and treated with 10ng / ml TNF ⁇ and IFN ⁇ . After 24 hours, cell cultures were obtained and used for the measurement of HA and filaggrin. After carrying out the protocol of each kit, absorbance at 450 nm was measured.
  • HAS 2 Hyaluronic acid synthase -2
  • HAS and filaggrin protein activity in HaCat cells cells were stabilized by incubating for 24 hours after cell seeding in a 60 mm tissue culture dish. After the medium was removed, the extracts were incubated with the medium treated with the concentration for 24 hours, and then the medium was removed again and washed twice with PBS. Complete mini 1 tab was added to 10 ml of RIPA buffer, dissolved in 100 uL, and centrifuged at 12,000 rmp for 20 minutes. The supernatant obtained by centrifugation was quantified by Bradford assay and 30ul of protein was separated by electrophoresis at 10% SDS-PAGE.
  • the separated proteins were transferred to PVDF membrane using a semi dry transfer cell instrument (Hofer, USA) and incubated in blocking buffer (5% skim milk in TBST) for 1 hour at room temperature. After diluting the primary antibody over night at 4 °C, washed three times with TBST again every 10 minutes, the mouse anti-rabbit IgG HRP secondary antibody diluted 1: 1,000 and incubated for 1 hour at room temperature. After washing three times, the band was identified and quantified using an LAS 4,000 device.
  • blocking buffer 5% skim milk in TBST
  • RNA extracted from the cells was quantified by measuring the absorbance at 260nm and 280nm. Quantitative RNA was mixed with 5 ⁇ g, Oligo (dT) 15 0.5 ⁇ g / reaction, Nuclease-Free Water (promega kit, USA) and cooled on ice at 70 ° C. for 5 minutes. The reaction mixture was prepared by mixing 10 times RT buffer, MgCl 2 DTT, and RNase.
  • MMP-1 Mestrix metalloproteinase-1
  • procollagen which is a precursor of collagen
  • CCD-986sk cells were inoculated into 6-well plates at a concentration of 5 X 10 4 cells / well and stabilized for 24 hours. After 24 hours of irradiation with UV-B (312 nm), to increase the activity of MMP-1, TNF- ⁇ was added at a concentration of 10 ng / ml, and extracts and fractions at concentrations of 5, 10, 25 ⁇ g / ml Treated for 48 hours. Cell cultures were collected and used for experiments. Using the Matrix Metalloproteinase-1 assay kit (Abcam) and TIMP-1 assay kit (GE healthcare), the absorbance was measured at 450 nm with a plate reader and the cell was calculated using a standard curve. MMP-1 and TIMP-1 expression in culture was quantified.
  • CCD-986sk cells were inoculated into 6-well plates at a concentration of 5 X 10 4 cell / well and stabilized for 24 hours. After 24 hours, UV-B (312 nm) was irradiated, and the extracts and ethyl acetate fractions were incubated for 48 hours by treatment at concentrations of 5, 10, 25 ⁇ g / ml. Cell cultures were collected and used for the experiments.
  • PIP Pro-collagen type-I C peptide
  • Takara the absorbance was measured at 450 nm with a plate reader and the equations were calculated using standard curves. The amount of peptide was measured.
  • sodium hyaluronate was prepared in a 1% solution by dispersing in purified water with a propeller mixer (3000 rpm).
  • Raw materials 1 to 8, except for sodium hyaluronate were homogenized at 500 rpm in an aqueous phase dissolution tank using a propeller mixer, completely dissolved by heating at 75 ° C, and then cooled to room temperature. Then, after completely dissolving the raw materials 9 to 11 in a separate dissolution tank, it was added to the aqueous phase dissolution tank and stirred and mixed.
  • the extracts of Examples 1 and 3 were added thereto and sufficiently stirred and mixed to prepare a flexible cosmetic water.
  • the carbomer was dispersed at 4000 rpm using a propeller mixer to prepare a 2% solution.
  • the raw materials 1-6 were thrown into the aqueous phase dissolution tank, it stirred with the homomixer (2000rpm), and dispersed, and it heated up to 75 degreeC.
  • the raw materials 7-14 were thrown into the oil phase dissolution tank, and it melt
  • the oil phase dissolved in the aqueous phase dissolution tank was introduced to emulsify (3000 rpm / 5 minutes), and then cooled to room temperature.
  • the extracts of Examples 1 and 3 were added thereto, followed by sufficiently stirring and mixing to prepare nutritive cosmetic water.
  • Nutritional Cosmetics ingredient Content (% by weight) One Each extract of Examples 1 and 3 0.01 2 glycerin 7.0 3 Sorbitan stearate sucrose cocoate 2.0 4 Mineral oil 4.0 5 Trioctanoine 1.0 6 Stearic acid 1.0 7 Glyceryl Stearate 0.5 8 Sorbitan monostearate 1.0 9 Dimethicone 0.5 10 Antioxidant 0.3 11 Triethanolamine 0.1 12 Carbomer 0.2 13 EDTA 0.1 14 antiseptic Quantity 15 Purified water Remaining amount
  • sodium hyaluronate and hydroxyethyl cellulose were each dispersed in purified water with a propeller mixer (2000 rpm) to prepare a 1 wt% containing solution.
  • Carbomer was also dispersed in purified water with a propeller mixer (4000rpm) to prepare a 2% by weight containing solution.
  • raw materials 1-12 were thrown into the water phase dissolution tank, and it stirred and dispersed by the homomixer (2000 rpm), heated to 75 degreeC, and the warmed water phase was cooled to room temperature again. After completely dissolving the raw materials 13 to 15 in a separate dissolution tank, the mixture was added to the aqueous phase dissolution tank and stirred and mixed.
  • the essence containing each extract of Example 1, 3 as an active ingredient was prepared.
  • the raw materials 1 to 8 were added to the aqueous phase dissolution tank, stirred and dispersed with a homomixer (2000 rpm), and then heated to 75 ° C.
  • Raw materials 9 to 16 were added to a separate oil phase dissolution tank to dissolve it at 80 ° C., and the oil phase dissolved in the aqueous phase dissolution tank was added to emulsify (3000 rpm / 10 minutes), and then cooled to room temperature.
  • Each extract of Examples 1 and 3 was added thereto, followed by sufficiently stirring and mixing to prepare a nourishing cream.
  • Nutrition Cream ingredient Content (% by weight)
  • One extract of Examples 1 and 3 0.01 2 1,3-butylene glycol 3.0 3 glycerin 3.0 4 Hydrogenated Lecithin 1.0 5 Octyldodecanol 3.0 6 Trioctanoine 2.0 7 Stearic acid 1.5 8 Cetostearyl alcohol 2.0 9 Polysorbate 60 1.5 10 Sorbitan sesquioleate 2.0 11 Dimethicone 3.0 12 Antioxidant 0.3 13 Xanthan Gum 0.2 14 Triethanolamine 0.1 15 EDTA 0.1 16 antiseptic Quantity 17 Purified water Remaining amount
  • the raw materials 1 to 8 were completely dissolved in a separate dissolution tank and stirred and mixed, and each extract of Examples 1 and 3 was added thereto, followed by sufficiently stirring and mixing to prepare a pack.
  • composition of the ointment ingredient Content (% by weight)
  • glycerin 8.0 3 1,3-butylene glycol 4.0 4
  • Floating paraffin 15.0 5
  • Beta Glucan 7.0 6
  • Carbomer 0.1 7
  • Caprylic / Capric Triglycerides 3.0 Squalane 1.0 9 Cetylaryl glucoside 1.5
  • Sorbitan stearate 0.4 11

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Abstract

본 발명은 어리연꽃 속 식물의 추출물을 포함하는 피부 개선용 조성물에 관한 것이다.본 발명에 따른 조성물은 어리연꽃 속 식물의 추출물을 유효성분으로 포함함으로서, 항산화, 피부 염증 개선, 피부 노화 방지 또는 개선, 자외선으로인한 피부 손상 개선, 피부 보습 개선, 피부 미백 개선, 피부 주름 예방 또는 개선 등의 다양한 효과를 가지는바, 피부를 현저히 개선시킬 수 있다.

Description

어리연꽃 속 식물의 추출물을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물
본 발명은 어리연꽃 속 식물의 추출물을 포함하는 피부 개선용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 어리연꽃 속 식물의 추출물이 항산화, 피부 염증 개선, 피부 노화 방지, 피부 보습 개선, 피부 미백 또는 주름을 방지하는 효과를 가짐으로서 피부를 개선시킬 수 있는, 어리연꽃 속 식물의 추출물을 포함하는 피부 개선용 조성물에 관한 것이다.
피부는 신체 중 가장 큰 기관으로 항상 외부환경과 직접 접하고 있으면서 여러가지 자극이나 건조한 환경으로부터 생체를 보호하는 보호막의 역할을 하고 있으며, 다른 기관에 비하여 새로운 세포의 생성과 소멸이 활발히 일어나는 기관이다. 또한, 물리적인 찰과상으로부터 신체를 보호하고, 신체 내부의 수분의 손실을 막아주며 태양에서 발생되는 자외선으로부터 보호해주고, 몸의 체온을 조절해주는 데 매우 중요한 역할을 담당하고 있다.
그러나 최근 들어, 환경오염으로 인해 지표면에 도달하는 자외선 양의 증가와 함께 야외 활동시간의 증가, 서구화된 생활습관 및 스트레스와 같이 피부건강을 위협하는 요인들이 증가하고 있다. 이러한 요인들은 피부에 오염, 건조, 트러블, 또는 피부면역체계 이상을 가져오며, 결국 피부염, 거칠음, 급격한 노화 등을 야기한다.
피부 보호에 대한 중요성이 커지면서 기능성 화장품에 대한 수요가 증가하고 있는데, 피부 보습, 주름, 노화, 염증, 미백 등 너무 많은 보호 작용이 필요하기 때문에 각 보호 작용을 하는 기능성 화장품을 각 기능별로 개별적으로 준비해야 하는 불편함이 있다. 개별적으로 준비해야 할 경우 비용도 많이 들고, 보관 및 사용이 번거로워 불편함이 있으며, 피부에 덧발라야 하는 제품의 수가 늘어나기 때문에 나중에 바르는 제품의 성분은 흡수가 제대로 안될 수도 있다.
따라서 피부 미백, 주름 개선 뿐 만 아니라, 피부 보습 개선, 피부 염증 개선 등 다양한 효과를 지니는 새로운 물질을 개발할 필요가 있다.
(특허문헌) 한국등록특허 제10-1325464호 (2012.11.06. 공개)
이에 본 발명자는 피부의 다양한 문제점을 동시에 해결할 수 있는 물질을 찾던 중, 어리연꽃 속(Nymphoides sp.)에 속하는 식물의 추출물이 피부의 다양한 문제를 개선시킬 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 어리연꽃 속 식물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 피부 개선용 조성물의 제조를 위한, 어리연꽃 속(Nymphoides sp.) 식물의 추출물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 어리연꽃 속(Nymphoides sp.) 식물의 추출물 또는 이를 포함하는 조성물을 피부에 적용하는 단계를 포함하는, 피부를 개선하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 어리연꽃 속(Nymphoides sp.) 식물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 어리연꽃 속 식물은 어리연꽃(Nymphoides indica), 노랑어리연꽃(Nymphoides peltata), 좀어리연꽃(Nymphoides coreana) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나일 수 있다.
상기 피부 개선은 항산화, 피부 염증 개선, 피부 노화 방지 또는 개선, 자외선으로인한 피부 손상 개선, 피부 보습 개선, 피부 미백 개선, 피부 주름 예방 또는 개선 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 추출물은 물, 알코올, 메탄올, 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 클로로포름, 글리세린 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 용매로 추출될 수 있다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 피부 개선용 화장료 조성물의 제조를 위한, 어리연꽃 속(Nymphoides sp.) 식물의 추출물의 용도를 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 어리연꽃 속(Nymphoides sp.) 식물의 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 피부에 적용하는 단계를 포함하는, 피부를 개선하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 어리연꽃 속 식물의 추출물은 항산화, 피부 염증 개선, 피부 노화 방지 또는 개선, 자외선으로 인한 피부 손상 개선, 피부 보습 개선, 피부 미백 개선, 피부 주름 예방 또는 개선 등의 다양한 효과를 가지므로 피부를 개선시킬 수 있다.
도 1은 실시예 1 및 3의 농도별 ABTS 라디칼 소거능을 나타내고, 비타민 C는 양성대조군이다.
도 2는 실시예 1 및 3의 농도별 잔틴산화효소(XO, Xanthine Oxidase)의 활성 저해능을 나타내고, 비타민 C는 양성대조군이다.
도 3은 실시예 1 내지 4의 농도별 SOD 유사 활성능을 나타낸다(명도 순(밝음에서 어두움)에 따라, 실시예 2, 실시예 1, 실시예 4 및 실시예 3을 의미함).
도 4는 실시예 1 및 3의 농도별 DPPH 라디칼 소거능을 나타내고, 비타민 C는 양성대조군이다.
도 5는 실시예 1 및 3의 농도별 엘라스타제 저해능을 나타내고, EGCG(Epigallocatechin-3-gallate)는 양성대조군이다.
도 6은 실시예 3 및 4의 자외선에 대한 세포 보호 효과를 나타내고, EGCG(Epigallocatechin-3-gallate)는 양성대조군이다(Blank : 자외선 A를 조사하지 않고, 실시예 또는 EGCG를 처리하지 않은 대조군 / UVA : 자외선 A를 조사하고, 실시예 또는 EGCG를 처리하지 않은 음성 대조군).
도 7은 실시예 1 및 3의 농도별 일산화질소 생성 억제능을 나타내고, 비타민 C는 양성대조군이다.
도 8은 실시예 1 및 3의 농도별 PGE2(프로스타글란딘 E2)의 발현 억제 효과를 나타내고, PDTC(Pyrrolidine dithiocarbamate)는 양성대조군이다.
도 9와 10은, 실시예1 및 3의 농도별 COX-2 발현 저해능을 보이는 도이다(도 9: 단백질 발현 측정 결과, 도 10: mRNA 발현 측정 결과).
도 11은 실시예 1 및 3의 농도별 티로시나제 저해능을 나타내고, 비타민 C는 양성대조군이다.
도 12는 실시예 1 및 3이 티로시나제 단백질 발현을 억제하는 것을 웨스턴 블랏(Western Blot)으로 분석한 전기영동 사진 및 티로시나제 단백질 발현량을 정량비교 분석한 결과이다(Nor : α-MSH 및 실시예를 처리하지 않은 대조군 / Cont : α-MSH만 처리하고 실시예는 처리하지 않은 음성 대조군).
도 13은 실시예 1 및 3의 MITF 발현 저해능을 나타내는 도이다.
도 14는 실시예1 및 3의 티로시나아제 mRNA와 MITF mRNA의 발현 억제능을 보이는 도이다(도 14a:티로시나아제 mRNA 발현 억제능, 도 14b: MITF mRNA 발현 억제능).
도 15는 실시예 1 및 3이 농도별로 AQP3의 발현에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다(Nor : 아무것도 처리하지 않은 대조군 / Cont : TNF-α와 INF-γ만 처리하고 실시예는 처리하지 않은 음성 대조군).
도 16은, 실시예 1 및 3의 히알루론산 합성 촉진능을 보이는 도이다.
도 17은, 실시예 1 및 3의 필라그린 합성 촉진능을 보이는 도이다.
도 18은, 실시예 1 및 3의 히알루론산 합성효소 2(HAS2)의 합성 촉진능을 보이는 도이다.
도 19는, 실시예 1 및 3의 필라그린 단백질의 합성 촉진능을 보이는 도이다.
도 20은 실시예 1 및 3의 HAS2의 mRNA 발현 촉진능(도 20a)과, 필라그린 mRNA 발현 촉진능(도 20b)을 보이는 도이다.
도 21은 실시예 1 및 3의 MMP-1 생성 저해능(도 21a)과 프로콜라겐 생성 촉진능(도 21b)를 보이는 도이다.
본 발명은 ㈜한국콜마에서 국가연구개발사업의 지원을 받아 연구된 것으로, 구체적인 정보는 아래와 같다: 과제고유번호는 HN15C0103이고, 부처명은 보건복지부이며, 연구관리 전문기관은 글로벌코스메틱연구개발사업단이고, 연구사업명은 글로벌화장품신소재·신기술연구개발지원이고, 연구과제명은 스마트 식물공장 재배 어리연꽃속 수생식물을 이용한 항노화 화장품 개발이며, 기여율은 1이고, 주관기관은 한국콜마(주)이고, 연구기간은 2015. 11. 01 2018. 10. 31.이다.
본 발명은 어리연꽃 속(Nymphoides sp.) 식물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 약학적 조성물, 식품 조성물 또는 화장료 조성물일 수 있다.
상기 어리연꽃 속 식물은 모든 어리연꽃 속 식물일 수 있고, 이에 한정되지 않으나, 어리연꽃(Nymphoides indica), 노랑어리연꽃(Nymphoides peltata), 좀어리연꽃(Nymphoides coreana) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 어리연꽃 추출물 및 노랑어리연꽃 추출물을 유효성분으로 포함함으로서 항산화, 피부 염증 개선, 피부 노화 방지 또는 개선, 자외선으로 인한 피부 손상 개선, 피부 보습 개선, 피부 미백 개선, 또는 피부 주름 예방 또는 개선 등에 있어서 상승 효과를 가질 수 있다.
특히, 노랑어리연꽃은 미국공개특허 제2013-0243708호의 표 1에 아무런 피부 개선 효과가 없는 것으로 공지되어 있으나, 본 발명은 노랑어리연꽃 추출물이 피부 개선 효과가 있는 것을 발견하였다.
어리연꽃(Nymphoides indica)은 진흙 속에서 잔뿌리가 사방으로 퍼지고 긴 잎자루 끝에 1~3개의 잎이 달려있다. 잎은 물 위에 뜨고 원심형이며 한쪽이 깊게 갈라지고 가장자리가 밋밋하다. 꽃은 8워에 피고 흰 바탕에 중심부는 황색이며 10여개가 잎자루의 밑부분으로 싸여서 달려있다. 어리연꽃은 금은련화라는 생약명으로 불리우기도 하며, 전통적으로 생진(生津), 양위(養胃) 등의 효능으로 구갈(口渴), 구건(口乾) 등의 병을 치료하는데 사용됐었다.
노랑어리연꽃(Nymphoides peltata)은 뿌리줄기가 물밑의 흙속에서 옆으로 뻗고 줄기는 실 모양으로 길게 자란다. 잎은 긴 잎자루가 있고 물 위에 뜨며, 넓은 타원형으로 지름 5~10 cm 이고, 밑부분이 2개로 갈라지지만 붙어 있는 것도 있다. 7~8월에 노란색 꽃이 피는데, 산형꽃차례(傘形花序)로 마주난 잎겨드랑이에서 2~3개의 꽃대가 나와 2~3 송이가 물 위에 핀다.
좀어리연꽃(Nymphoides coreana)은 다년생 수초로 물 및 질흙에 나고, 줄기가 가늘고 길며, 1~2개의 잎이 물 위에 뜬다. 잎은 타원상 심장형 또는 지름 2~6cm의 원심형으로 밑은 깊이 갈라지며 가장자리는 밋밋하고 엽병은 길이가 1~10cm이다. 꽃은 6~7월에 백색으로 피고 엽병 기부 마디에 속생하며 소화경은 길이가 1~3cm이다. 꽃받침 조각은 넓은 피침형으로 끝이 뾰족하고 길이가 3~4mm이며 화관은 4~5개로 갈라진다. 또한, 가장자리에 짧은 연모가 있고 수술은 5개이며 과실은 삭과로 길이 4~5mm의 타원형이고, 종자는 평활하고 광택이 있다.
본 발명의 어리연꽃 속 식물의 추출물은 이에 한정되지 않지만, 물, 에탄올, 메탄올, 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 클로로포름, 글리세린 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 용매로 추출될 수 있고, 바람직하게는 에탄올, 메탄올 또는 이의 혼합 용매일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 추출물은, 70~95%의 에탄올 또는 메탄올 추출물을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 어리연꽃 속 식물의 추출물은 이에 한정되지 않으나, 식물의 꽃, 잎, 줄기, 열매, 종자, 뿌리 및 전초를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부위에서 추출될 수 있고, 바람직하게는 전초에서 추출될 수 있다.
본 발명에 따른 어리연꽃 속 식물의 추출물은 피부를 개선시킬 수 있는데, 상기 피부 개선은 항산화, 피부 염증 개선, 피부 노화 방지 또는 개선, 자외선으로인한 피부 손상 개선, 피부 보습 개선, 피부 미백 개선, 피부 주름 예방 또는 개선 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
어리연꽃 속 식물 추출물은 ABTS 라디칼을 제거하고, 잔틴산화효소(Xanthine oxidase)의 활성을 억제하며, SOD 유사 활성을 가짐으로써 항산화 작용을 할 수 있다. 호기성 생물체는 산소를 이용하여 에너지 대사를 진행하는데, 생체 내 산소가 각종 물리적, 화학적 및 생물학적인 스트레스를 받으면 O2 -(superoxide), NO(nitric oxide), NO2(nitrogen dioxide), OH(hydroxyl), ROO(proxyl), RO(alkoxyl), NO3(peroxynitrite), ABTS+ 등의 라디칼(radical) 같은 유해한 활성 산소종(active oxygen species)으로 변하여 인체에 치명적인 생리적 장애를 일으킨다. 상기와 같은 활성 산소종은 세포생체막의 구성성분인 불포화 지방산을 공격하여 과산화 반응을 일으키고 이러한 과산화 반응을 막는 것을 항산화(antioxidation) 작용이라 한다. 상기와 같은 라디칼로부터 생체를 방어하기 위한 수단으로써 수퍼옥사이드 디스무타제(SOD, superoxide dismutase), 카탈라제(CAT; catalase), 글루타치온 퍼옥시다제(GSHpx; glutathione peroxidase) 등의 항산화 효소나 비타민 E, 글루타치온 등의 항산화 물질이 존재하여 유리기를 제거함으로써 생체를 산화적 손상으로부터 보호한다. 또한, 크산틴 산화효소(Xanthine oxidase, XO)는 퓨린 크산틴 (purines hypoxanthine)과 크산틴(xanthine)을 산화시켜 요산(uric acid)을 형성하는 효소로써 통풍으로 알려진 질환의 원인이기도 하다. 통풍은 관절부위에 요산의 침착으로 동통을 동반한 염증이라고 할 수 있다. 그러므로 크산틴 산화효소의 저해는 통풍을 진정시킨다(Chiang et al., Journal of Enzyme Inhibition, 8, pp 61-71, 1994). 크산틴 산화효소는 살아 있는 세포에서 산화적인 손상에 작용되는 산소 파생 자유라디칼의 생물학적 원인이 된다. 이와 같이 다양한 산화적인 손상은 염증, 동맥경화, 암 그리고 노화를 포함한 많은 병리학적 질환을 일으킨다(Cos P et al., Journal of Natural Products, 61, pp71-76, 1998). 크산틴 산화효소의 저해는 통풍이나 다른 크산틴 산화효소-유도 질환의 치료에 이용될 수 있는 가능성이 증명되었다(Goodman Gilman A et al., Pharmacological Basis of Therapeutics (eighth edition), pp 674-681, 1990).
어리연꽃 속 식물 추출물은 일산화질소 및 프로스타글란딘 E2의 발현을 억제한다. 염증 반응은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균 감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상 부위를 수복 재생하려는 기전으로서, 일산화질소는 감염 초기에 생체 방어에 중요한 역할을 하고, 급성 또는 만성 염증반응을 조절하기도 하며, 프로스타글란딘 E2는 염증매개물질이다. 따라서, 일산화질소 또는 프로스타글란딘 E2의 생성을 억제하면 염증반응을 완화할 수 있다.
어리연꽃 속 식물 추출물은 엘라스타아제 활성을 억제하고, 자외선으로부터 피부를 보호하며, 이러한 작용들로 인해 피부 노화 및 주름을 방지할 수 있고, 주름을 개선시킬 수도 있다.
주름은 특정 방향으로의 근육 운동과 이 운동의 장기적 누적에 의해 형성되고 가속화되며, 이 밖에 노화, 환경적인 영향, 특히 자외선에의 노출 등의 다양한 인자들에 의해 더욱 촉진된다. 엘라스틴은 탄성 섬유로서 고무와 같은 탄성을 지니고 있어, 작은 힘에도 쉽게 변형되고 그 힘이 제거되면 다시 원래의 형태로 돌아오는 특성이 있다. 따라서 엘라스틴은 피부 탄력 및 주름 개선에 매우 중요한 물질이다. 따라서 알레스틴을 분해하는 엘라스타제의 활성을 억제하면 피부 탄력 및 주름을 개선시킬 수 있다.
어리연꽃 속 식물 추출물은 아쿠아포린의 발현을 증가시킨다. 아쿠아포린은 막 단백질의 일종으로 수분통로 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다(Proc. Nadl. Acad. Sci. USA 91:6255 (1994). 최초의 아쿠아포린은 1991년 피터 아그레에 의해서 정확하게 규명되었고 이로 인해 아그레는 2003년 노벨상을 수상하였다(Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Dec 15;88(24):11110). 아쿠아포린 패밀리는 여러 종류가 알려졌으나 이들 중 아쿠아포린-3가 수분 통로에 가장 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있어서 아쿠아포린-3를 활성화시키는 물질에 대한 연구가 활발하다. 아쿠아포린-3를 활성화시키는 물질은 피부의 보습기능과 연관이 있기 때문이다(Journal of Investigative Dermatology 131:865, 2011).
어리연꽃 속 식물 추출물은 티로시나제(tyrosinase)의 활성 및 발현을 억제한다. 멜라닌 생성 메커니즘은 세포 내의 티로신(tyrosine)을 기질로 하여 티로시나제(tyrosinase)라는 효소가 도파퀴논(DOPAquinone)을 생성시키며, 도파퀴논으로부터 자동산화 반응과 효소 반응을 거쳐 공중합체인 멜라닌이 생성된다. 이렇게 생성된 멜라닌은 멜라노좀이라는 주머니를 통해 케라티노사이트(keratinocyte)로 옮겨지게 되고 케라티노사이트에서 28일간의 각화 과정을 거치면서 피부표면으로 나오게 된다. 그러나 이 과정에서 멜라닌 생성을 촉진하는 요인에 의해서 멜라닌이 과량 생성되고 각화에 의해 멜라닌이 완전히 없어지지 않으면 색소침착(pigmentation) 현상이 나타나게 된다. 따라서 이러한 색소 침착 현상을 막아주기 위해서는 멜라닌 생성 과정에서의 일부 과정을 조절해 줌으로써 억제할 수가 있다. 멜라닌의 생합성에 관여하는 중요한 효소로는 티로시나제(tyrosinase), 티로시나제 관련 단백질 1(tyrosinase related protain 1, TRP1), 도파크롬 타우토메라제(dopachrome tautomerase) 등이 있으나, 멜라닌 합성에 결정적인 역할을 하는 효소는 티로시나제이다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 어리연꽃 속 식물의 추출물을 유효성분으로 포함하며, 피부학적으로 허용가능한 부형제와 함께 기초 화장품 조성물 (화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼 및 클렌징 워터와 같은 세안제, 팩, 보디오일), 색조 화장품 조성물 (화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스), 두발 또는 두피 제품 조성물(샴푸, 린스, 헤어컨디셔너, 헤어젤) 및 비누 등의 형태로 제조될 수 있다.
상기 부형제로는 이에 한정되지는 않으나 예를 들어, 피부연화제, 피부 침투 증강제, 착색제, 방향제, 유화제, 농화제 및 용매를 포함할 수 있다. 또한, 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제 및 보습제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 물성개선을 목적으로 점증제, 무기염류, 합성 고분자 물질 등을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화장료 조성물로 세안제 및 비누를 제조하는 경우에는 통상의 세안제 및 비누 베이스에 본 발명의 바이아릴아미드 유도체를 첨가하여 용이하게 제조할 수 있다. 크림을 제조하는 경우에는 일반적인 수중유적형 (O/W)의 크림베이스에 본 발명의 바이아릴아미드 유도체를 첨가하여 제조할 수 있다. 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등과 물성개선을 목적으로 한 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 추가로 첨가할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에 함유되는 어리연꽃 속 식물 추출물의 함량은 이에 한정되지 않지만, 전체 조성물 총중량에 대하여 0.001 내지 10 중량%인 것이 바람직하고, 0.01 내지 5 중량%인 것이 더욱 바람직하다. 상기 함량이 0.001중량% 미만에서는 목적하는 본 발명의 효과를 기대할 수 없고, 10중량% 초과에서는 안전성 또는 제형상의 제조에 어려움이 있을 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형은 이에 한정되는 것은 아니나 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 바디크림, 마사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 트리트먼트, 미용액, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 어리연꽃 속 식물의 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 피부에 투여함으로써 피부를 개선시키는 방법을 제공한다. 상기 화장료 조성물은 하루에 1회 이상, 바람직하게는 3회까지 투여될 수 있고, 국소 투여가 바람직할 수 있다. 또한, 체중, 활성 성분에 대한 개인별 반응, 제제의 유형, 및 투여가 수행되는 시간 또는 간격에 따라 명시된 투여량 또는 투여횟수를 조절할 수 있다. 피부 외관의 개선 효과는, 피부 상태, 본 발명의 방법에 사용된 활성 성분의 농도, 조성물의 사용량, 또는 적용 빈도에 따라 통상적으로 1일 내지 6개월 후에 나타난다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
< 실시예의 제조 >
실시예 1 : 어리연꽃 에탄올 추출물의 제조
어리연꽃(Nymphoides indica)전초 50g에 500ml의 70% 에탄올을 넣고, 상온에서 24시간 동안 침지 시킨 후, 추출액을 거름종이로 여과하였다. 여과된 여과액을 농축기를 통하여 용매를 휘발시킨 뒤 동결 건조하여 어리연꽃의 에탄올 추출물을 제조하였다.
실시예 2 : 어리연꽃 메탄올 추출물의 제조
추출용매로 80% 메탄올을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 어리연꽃 메탄올 추출물을 제조하였다.
실시예 3 : 노랑어리연꽃 에탄올 추출물의 제조
노랑어리연꽃(Nymphoides peltata)을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 노랑어리연꽃의 에탄올 추출물을 제조하였다.
실시예 4 : 노랑어리연꽃 메탄올 추출물의 제조
추출용매로 80% 메탄올을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 노랑어리연꽃 메탄올 추출물을 제조하였다.
< 실험예 : 피부 개선 효과 검증 >
실험예 1. 항산화 활성 검증
< 1-1 > ABTS 라디칼 소거능 측정
ABTS radical을 이용한 항산화력 측정은 ABTS+ cation decolorization assay방법40)에 의하여 측정하였다. 7mM 2,2 - azino - bis (3 - ethyl - benthiazoline - 6 - sulfonic acid)와 2.4mM potassium persulfate를 혼합하여 실온에서 24시간 동안 방치하여 ABTS+를 형성시킨 후 ethanol로 희석하여 ABTS+ 100uL에 시료 100uL를 가하여 1분 동안 방치한 후 732nm에서 흡광도를 측정하였다. 1000 ㎍/㎖ 농도로 비타민 C를 처리한 군의 소거능을 100%로 하여, 다른 실험군들의 결과를 상대적으로 계산하였고, 그 결과를 도 1에 기재하였다.
상기 도 1에서, 농도 의존적으로 실시예 1 및 3의 ABTS 라디칼 소거능이 증가하는 것을 확인할 수 있고, 1000 ㎍/㎖ 농도에서는 비타민 C와 비슷한 수준으로 소거능을 갖는 것을 알 수 있다.
< 1-2 > xanthine oxidase(XO, 잔틴산화효소)의 활성 저해능
Xanthine oxidase에 의해 생성된 superoxide radials 소거 활성은 NBT(nitro-blue tetrazolium) 환원법을 사용하여 분석하였다. 각 시료용액 0.1ml와 0.1M potassium phosphate buffer(pH 7.5) 0.6ml에 xanthine(2mM)을 녹인 기질액 0.2ml를 첨가하고 xanthine oxidase(0.2U/ml) 0.1ml를 가하여 37℃에서 15분간 반응시킨 후 1N HCl 1ml를 가하여 반응을 종료시킨 다음 반응액 중에 생성된 uric acid의 양을 292nm에서 흡광도를 측정하였다. Xanthine oxidase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. 한편, 비타민 C는 실시예와 같은 농도로 조제하여 동일한 방법으로 흡광도를 측정함으로써 비교하였다. 농도별 시료에 따른 NBT 환원에 대한 저해능은 다음과 같은 식으로 계산하였다.
Figure PCTKR2016014380-appb-I000001
* B(Blank) : 0.8mM xanthine 포함한 0.1 mM buffer(pH 8.0)와 69mM SDS만 첨가한 반응액의 흡광도
* C(control) : 시료(실시예, 비타민 C) 대신 0.48mM NBT를 첨가한 반응액의 흡광도
* S(Sample) : 실시예 1, 실시예 3, 또는 비타민 C를 첨가한 반응액의 흡광도
상기 측정된 흡광도를 도 2에 기재하였다. 실시예 1 및 3은 모두 비타민 C보다 더 우수한 저해능을 보였고, 특히 실시예 2의 XO 저해능은 실시예 1 및 비타민 C보다 현저히 우수하였다.
< 1-3 > SOD 유사 활성능
각각의 실시예 1~4가 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖의 농도로 있는 각 시료 용액 20㎕에 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 분석 키트(SOD assay kit-WST)의 더블류에스티 작업용액(WST working solution) 200㎕을 넣어 교반한 후, 다시 효소작업용액(Enzyme working solution) 20㎕를 넣어 혼합한 후, 37℃ 인큐베이터에서 20분간 반응시키고, 마이크로플레이트 계수기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험 대조구로는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide dismutase, 100 units)을 사용하였으며, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 유사활성은 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 처리 그룹 대비 시료용액의 첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. 측정 결과는 도 3에 기재하였다.
상기 도 3에서 어리연꽃 속 식물 추출물의 농도 의존적으로 SOD 유사 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 특히 100 ug/ml 처리 시 SOD 처리 구와 거의 동일한 효능을 나타내었으며, 어리연꽃 추출물이 노랑어리연꽃 추출물보다 SOD 활성이 더 높은 편이었고, 추출 용매 간에 활성의 차이는 크지 않았다.
< 1-4 > DPPH 라디칼 소거능
실시예 1 및 3의 농도별 용액 100㎕ 에 5×10-4 M의 DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 100㎕를 넣고, 1분간 교반한 후, 25℃ 인큐베이터에서 30분간 반응시켜 마이크로플레이트 계수기를 이용하여 517nm에서 흡광도를 측정하는 방법으로 진행하였다. 양성 대조군으로 비타민 C를 사용하였으며, DPPH 라디칼 소거능은 시료(실시예, 비타민 C)를 넣지 않은 대조구의 흡광도를 기준으로, 흡광도의 감소율로 나타내었다. 결과는 도 4에 기재하였다.
실험예 2. 주름개선 및 자외선으로 인한 손상 복구 활성 검증
< 2-1 > 엘라스타아제( elastase ) 활성 억제 시험
진피조직의 유연성에 관여하는 엘라스틴(elastin)을 분해하여 주름생성을 촉진시키는 엘라스타아제의 활성억제 효과를 시험하였으며, 하기의 방법으로 시험하였다. 기질로서 N-succinyl- (L-Ala)3-p-nitroanilide를 사용하여 37℃에서 20분간 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 445nm에서 측정하였다. 즉, 각 시험용액을 일정 농도가 되도록 조제하여 0.5ml씩 시험관에 취하고, 50mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 porcine pancreas elastase (2.5U/ml)용액 0.5ml을 가한 후 기질로 50mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide (0.5㎎/ml)을 첨가하여 20분간 반응시켜 측정한다. Elastase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. 도 5에 음성대조군으로 주름개선 원료가 첨가되지 않았을 때와 비교하여, 실시예 및 양성대조군의 농도 증가에 따른 엘라스타아제 억제효율(%)을 나타내었다.
상기 도 5에서, 실시예 1 및 3이 농도 의존적으로 엘라스타제 활성을 저해하는 것을 확인할 수 있다.
< 2-2 > 자외선에 대한 세포 보호 효과
사람 섬유아세포를 37℃, CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 그 후, 배양액을 제거하고 HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)로 세척한 후, 다시 HBSS를 넣고 자외선조사기기(UV irradiator system)를 이용하여 자외선 A를 충분히 조사한 다음 상기 실시예 3 및 4를 각각 농도별로 처리, 같은 배양 조건에서 21시간 배양하였다. 배양이 끝나고, MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide solution 시약을 well에 넣고 37℃에서 다시 3시간 배양하였다. 그 후 배양액을 제거하고 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 넣고 적당히 흔들어 준 뒤 마이크로플레이트계수기(Microplate reader)를 이용하여 흡광도 결과를 측정하였다. 또한 시험결과의 비교를 위해, 실시예를 처리하지 않고 자외선만 조사한 음성대조군, 및 EGCG(Epigallocatechin-3-gallate)를 10uM 농도로 처리한 양성대조군을 사용하였다. 흡광도 측정 결과는 도 6에 기재하였다.
실시예 3 및 4 모두 자외선에 대해 세포 보호 효과를 보였고, 특히 실시예 4는 양성대조군과 비슷한 수준으로 뛰어난 효과를 보였다.
실험예 3. 항염증 활성 검증
< 3-1 > NO(Nitric oxide) 생성 억제 효과
마우스 대식세포 Raw 264.7 cell을 5×103 cells/ml 농도로 하여 96well plate에 100㎕씩 분주하여 37℃, CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 이때 배지는 소혈청 10%와 항생제 1%가 포함된 DMEM 배지를 이용하였다. 배양한 후 소혈청과 항생제가 배제된 DMEM 배지로 교체한 후, 실시예 1 및 3을 각각 농도 별로 첨가한 후, 같은 배양조건에서 10분 배양한 후 1㎍/㎖의 LPS를 1㎕씩 넣고 24시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 Griess reagent 시약 Ⅰ과 Ⅱ를 동량 섞은 후 배양한 배지와 100㎕씩 96well plate에 넣고, 상온에서 10분 반응시켜 마이크로플레이트계수기(Micro plate reader) 540nm 에서 결과값을 측정하였다. 양성대조군으로서 비타민 C를 사용하였고, 실시예를 처리하지 않은 음성 대조군의 결과를 기준으로 하여 NO 생성률(%)을 측정하였으며, 그 결과는 도 7에 기재하였다.
상기 도 7에서, 실시예 1 및 3이 농도 의존적으로 NO의 생성량을 줄이는 것을 확인할 수 있다.
< 3-2 > PGE2 발현 억제 효과
PGE2(프로스타글란딘 E2)는 염증 유발에 중요한 역할을 하는 물질로서 실시예 1 및 3이 PGE2 발현을 억제하는 것을 확인해보았다.
인간 각질형성세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 5×105 cell/well로 조절한 후 6 well plate에 접종하고, 실시예 1 및 3을 농도별로 각각 처리하고 30분 배양 후 LPS(Lipopolysaccharide, 1㎍/㎖)를 첨가하여 18시간 배양하였으며, 양성대조군로서 항산화제인 Pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC)를 사용하였다. 생성된 PGE2의 양은 PGE2 ELISA kit (R&D systems, Inc, USA)를 이용하여 측정하였고, 실시예 또는 PDTC를 처리하지 않은 음성 대조군의 PGE2 생성량을 기준으로 하여 PGE2 발현 억제율(%)을 측정하였으며, 결과를 도 8에 기재하였다.
상기 도 8에서, 실시예 1 및 3이 농도 의존적으로 PGE2의 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있다.
< 3-3 > COX-2 단백질 발현량 측정
HaCaT 세포를 60mm 조직배양 디쉬에 시딩한 후 24시간 동안 배양하여 세포를 안정화 시켰다. 그 후 TNF-α(10 ng/ml)와 INF-γ(10 ng/ml)을 전처리하고, 실시예 1 과 3을 농도별로 처리하여 24시간 배양배지를 제거한 후 실시예 1 또는 실시예 3의 추출물을 농도별로 처리한 배지로 24시간 배양한 후 다시 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척해주었다. RIPA buffer 10ml에 complete mini 1 tab를 가한 100μl로 용해해서 4℃ 12,000rmp에서 20분간 원심 분리 한다. 원심 분리하여 얻은 상층액은 Bradford assay로 정량하여 30ul의 단백질을 10%의 SDS-PAGE사에서 전기 영동하여 분리한다. 분리된 단백질은 semi dry transfer cell 기기 (Hofer, USA)를 이용하여 PVDF membrane에 옮긴 다음 실온에서 1시간 blocking buffer (5% skim milk in TBST)에서 incubation 시켰다. 1차 항체를 희석하여 4℃에서 over night한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST로 3회 워싱하고 mouse anti-rabbit IgG HRP, bovine anti-goat IgG HRP의 각각의 2차 항체를 1:1,000로 희석하여 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 3회 워싱한 뒤 LAS 4,000 기기를 이용하여 밴드를 확인하여 발현량을 분석하였다.
그 결과, 어리연 꽃 및 노랑 어리연꽃 추출물의 경우 모두 농도 의존적으로 염증과 관련된 인자인 COX-2의 발현을 저해 시켰으며 특히 최고 농도인 50 μg/ml의 경우 대조군에 비해 20%에 가까운 저해능을 나타내었다(도 9 참조)
< 3-4 > COX-2 mRNA 발현량 측정
세포를 60mm dish에 cell seeding한 뒤 24시간 동안 배양한 후 샘플을 농도별로 처리 하여 24시간 동안 배양하였다. 배지 상등액을 제거한 후 trizol lysis buffer를 각 well에 1ml씩 분주하여 세포를 lysis한 후 -70℃에 보관하였다. 세포로부터 추출되어진 RNA를 260nm과 280nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 정량한 RNA를 5μg, Oligo(dT)15 0.5μg/reaction, Nuclease-Free Water(promega kit, USA)와 혼합한 뒤 70℃에서 5분 ice에서 5분 반응 시켰다. Reaction mixture로 10배의 RT buffer, MgCl2 DTT, RNase를 섞어 준비 하였다. 25℃에서 10분 42℃에서 50분간 70℃에서 15분간 가열하여 불활성(inactivate)시키고 얼음을 이용하여 식혔다. cDNA와 2X SYBR green mix, primer, ROX를 각각 넣어 ABI step one plus (Applied biosystem, USA) 기기를 이용하여 실시간 정량 분석을 한 뒤 분석프로그램을 이용하여 결과를 분석하였다.
상기 실험에 사용된 프라이머의 서열은 아래 표 A에 기재된 바와 같다.
[표 A]
Figure PCTKR2016014380-appb-I000002
실험예 4. 미백 활성 검증
< 4-1 > 티로시나제 ( Tyrosinase ) 저해 활성
티로시나제(Tyrosinase) 저해활성 측정은 티로시나제의 작용 결과 생성되는 도파크롬(DOPA chrome)을 비색법에 의해 측정하는 야기(Yagi) 등의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉, 반응구는 0.175M sodium phosphate buffer (pH 6.8) 0.5ml에 10mM L-DOPA를 녹인 기질액 0.2ml 및 시료용액 0.1ml의 혼합액에 mushroom tyrosinase (110U/ml) 0.2ml을 첨가하여 25℃에서 2분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 475nm에서 측정하였다. 아무런 물질을 처리하지 않은 대조군을 기준으로 하여 각 실험군의 상대적인 티로시나제 저해 활성을 측정하였고, 그 결과는 도 11에 기재하였다.
도 11에서 실시예 1 및 3이 농도 의존적으로 티로시나제를 저해하는 것을 확인할 수 있다.
< 4-2 > 웨스턴 블럿(Western Blot)을 통한 티로시나제 단백질 발현량 측정
실시예 1 및 3이 멜라닌 생합성을 매개하는 티로시나아제의 단백질 발현에 미치는 효과를 알아보기 위해 웨스턴 블럿 분석을 실시하였다. B16F1 멜라노마 셀(melanoma cell)을 소혈청 10%와 항생제 1%가 첨가된 DMEM/high glucose(Dulbeco's Modified Eagle Medium Hyclone)에서 배양하고, 96-웰 플레이트에 적정 농도로 분주 후 37℃에서 5% CO2 조건으로 24시간 배양한 후 실시예 1 및 3을 각각 농도별로 B16F10 멜라노마 셀의 배양액에 넣어 3일 배양하였다. 동시에, 멜라닌 합성을 유도하기 위하여 α-MSH(melanicyte stimulating hormone)를 10nM 농도로 처리하였다.
배양을 완료한 후, 세포를 회수하기 위하여 티로신-EDTA 용액을 넣고 세포를 분리하여 마이크로튜브에서 획득한 후 원심분리하여 상등액을 제거하였다.
분리된 펠렛을 1×PBS(-)로 세척하고 원심분리한 후, 펠렛에 RIPA buffer (Thermo, USA)을 처리하여 -20℃에서 15분 반응시켰다. 원심분리 진행 후, 상등액을 튜브로 옮겨 -20℃에 보관하였다. 상기 방법으로 정제한 단백질을 8% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동을 실행하고 이를 PVDF 막으로 이전하였다. 5% 스킴 밀크(skim milk)가 함유된 트리스 완충용액에서 1시간 블로킹(blocking) 과정을 거친 후에 티로시나아제, GAPDH 항체와 각각 반응시켰다.
상기 방법으로 정제한 단백질을 8% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동을 실행하고 이를 PVDF 막으로 이전하였다. 5% 반응 후, donkey anti-goat lgG-HRP가 결합된 항체를 가하고, ImmobilonTM Western Chemiluminescent HRP Substrate(Millipore)를 사용하여 일정 시간 동안 반응시킨 후 현상하였다. 각 실험군에서 티로시나제의 발현량은 LAS 4000이미지 분석장치를 이용하여 정량ㅇ비교 분석하였으며, 그 결과는 도 12에 기재하였다.
상기 도 12에서, 실시예 1 및 3이 농도의존적으로 티로시나제 단백질 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있다.
< 실험예4 -3 > MITF ( Microphthalmia -associated transcription factor) 발현량 측정
MITF의 활성을 확인하기 위하여 B16F10 세포주를 60mm tissue culture dish에 cell seeding 후 24시간 동안 배양하여 cell을 안정화 시켰다. 배지를 제거한 후 추출물을 농도별로 처리한 배지로 48시간 배양한 후 다시 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척해주었다. RIPA buffer 10ml에 complete mini 1 tab를 가함 100uL로 용해해서 4℃ 12,000rmp에서 20분간 원심 분리 한다. 원심 분리하여 얻은 상층액은 Bradford assay로 정량하여 30ul의 단백질을 10%의 SDS-PAGE사에서 전기 영동하여 분리한다. 분리된 단백질은 semi dry transfer cell 기기 (Hofer, USA)를 이용하여 PVDF membrane에 옮긴 다음 실온에서 1시간 blocking buffer (5% skim milk in TBST)에서 incubation 시켰다. 1차 항체를 희석하여 4℃에서 over night한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST로 3회 washing 하고 mouse anti-rabbit IgG HRP, bovine anti-goat IgG HRP의 각각의 2차 항체를 1:1,000로 희석하여 실온에서 2시간 동안 배양한다. 3회 washing한 뒤 LAS 4,000 기기를 이용하여 밴드를 확인하여 정량하였다. 배지만 처리한 군을 음성대조군(Nor)으로 하고, 자극원만 처리한 양성대조군(Cont)으로 하였다.
그 결과, 어리연 꽃 및 노랑 어리연꽃 추출물의 경우 모두 농도 의존적으로 MITF 단백질의 발현을 저해 시키는 것을 확인하였다(도 13).
< 실험예 4-4 > HaCaT 세포에서의 티로시나아제 및 MITF의 mRNA 발현여부 확인
세포를 60mm dish에 cell seeding한 뒤 24시간 동안 배양한 후 실시예1 및 실시예3의 추출물을 농도별로 처리 하여 24시간 동안 배양하였다. 배지 상등액을 제거한 후 trizol lysis buffer를 각 well에 1ml씩 분주하여 세포를 lysis한 후 70℃에 보관하였다. 세포로부터 추출되어진 RNA를 260nm과 280nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 정량한 RNA를 5μg, Oligo(dT)15 0.5μg/reaction, Nuclease-Free Water(promega kit, USA)와 혼합한 뒤 70℃에서 5분 동안 얼음을 이용하여 식혔다. Reaction mixture로 10배의 RT buffer, MgCl2 DTT, RNase를 섞어 준비 하였다. 25℃에서 10분 42℃에서 50분간 70℃에서 15분간 가열하여 비활성화시키고 얼음을 이용하여 식혔다. cDNA와 2X SYBR green mix, primer, ROX를 각각 넣어 ABI step one plus (Applied biosystem, USA) 기기를 이용하여 실시간 정량 분석을 한 뒤 분석 프로그램을 이용하여 결과를 분석하였다.
상기 분석에 이용된 프라이머의 서열은 아래 표 B와 같다.
[표 B]
Figure PCTKR2016014380-appb-I000003
그 결과, 어리연 꽃 및 노랑 어리연꽃 추출물의 경우 모두 농도 의존적으로 mRNA 발현을 저해 시키는 것을 확인하였으며, 특히 tyrosinase mRNA 발현의 경우 노랑어리연 추출물의 우수한 저해 활성을 확인 할 수 있었다(도 14a 및 도 14b).
실험예 5. 보습 활성 측정
< 5-1 > 아쿠아포린 -3
아쿠아포린류(AQPs)는 물 및 용액내의 작은 분자들, 예를 들어, 글리세롤과 우레아(urea)의 확산을 용이하게 하는 채널을 형성시키는 경피 단백질의 일족이다. 그 중 AQP3은 아쿠아글리세로포린으로서, 글리세롤, 우레아, 퓨린 및 피리미딘류과 같이, 조직의 수화 수준을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 세포 배양액 내의 AQP-3 양을 측정하기 위해 Human Aquaporin 3, Gill Blood Group ELISA kit를 Mybiosource (USA)에서 구입하여 실험한다. 5 X 105 세포를 6 well plate에 seeding하여 24시간 배양 시켰다. 그 후 TNF-α(10 ng/ml)와 INF-γ(10 ng/ml)을 전처리 하고 실시예 1 과 3을 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 세포 배양액을 얻어 AQP-3 측정에 사용한다. AQP-3의 측정은 Human Aquaporin 3, Gill Blood Group ELISA kit의 protocol에 따라 측정하였다.
도 15에서 실시예 1 및 3이 농도 의존적으로 AQP-3의 발현을 증가시키는 것을 확인할 수 있다.
< 5-2 >Hyaluronic acid(HA) 와 filaggrin 함량 측정
세포 배양액 내의 HA와 filaggrin 양을 측정하기 위해 ELISA assay kit를 echelon bioscience (Salt Lake City, UT) LSBio (Seattle, WA)에서 구입하여 실험한다. 세포에 추출물을 전처리 하고 10ng/ml의 TNFα와 IFNγ를 처리하였다. 24시간 후 세포 배양액을 얻어 HA와 filaggrin 측정에 사용하였다. 각 키트사의 protocol에 의해 수행한 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 세포내 보습에 중요한 역할을 하는 HA와 filaggrin의 발현을 측정한 결과 대조군에 비해 15%이상의 HA와 filaggrin의 합성능을 확인할 수 있었다(도 16 및 17).
< 5-3 > 세포내에서의 Hyaluronic acid synthase -2(HAS 2)와 filaggrin protein 발현 측정
HaCat 세포내에서 HAS와 filaggrin protein 활성을 보기 위하여 60mm tissue culture dish에 cell seeding 후 24시간 동안 배양하여 cell을 안정화 시켰다. 배지를 제거한 후 추출물을 농도별로 처리한 배지로 24시간 배양한 후 다시 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척해주었다. RIPA buffer 10ml에 complete mini 1 tab를 가하고 100uL로 용해해서 4℃ 12,000rmp에서 20분간 원심 분리 하였다. 원심 분리하여 얻은 상층액은 Bradford assay로 정량하여 30ul의 단백질을 10%의 SDS-PAGE사에서 전기 영동하여 분리하였다. 분리된 단백질은 semi dry transfer cell 기기 (Hofer, USA)를 이용하여 PVDF membrane에 옮긴 다음 실온에서 1시간 blocking buffer (5% skim milk in TBST)에서 incubation 시켰다. 1차 항체를 희석하여 4℃에서 over night한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST로 3회 washing 하고 mouse anti-rabbit IgG HRP 2차 항체를 1:1,000로 희석하여 실온에서 1시간 동안 배양한다. 3회 washing한 뒤 LAS 4,000 기기를 이용하여 밴드를 확인하고 정량하였다.
그 결과, 어리연 꽃 및 노랑 어리연꽃 추출물의 경우 모두 농도 의존적으로 합성 시키는 것을 확인하였으며, 특히 노랑어리연 추출물의 filaggrin 합성능이 우수함을 확인할 수 있었다(도 18 및 도 19).
<5-4> Hacat 세포내에서의 HAS-2와 filaggrin mRNA 발현 측정
세포를 60mm dish에 cell seeding한 뒤 24시간 동안 배양한 후 샘플을 농도별로 처리 하여 24시간 동안 배양하였다. 배지 상등액을 제거한 후 trizol lysis buffer를 각 well에 1ml씩 분주하여 세포를 lysis한 후 -70℃에 보관하였다. 세포로부터 추출되어진 RNA를 260nm과 280nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 정량한 RNA를 5μg, Oligo(dT)15 0.5μg/reaction, Nuclease-Free Water(promega kit, USA)와 혼합한 뒤 70℃에서 5분동안 얼음을 이용하여 식혔다. Reaction mixture로 10배의 RT buffer, MgCl2 DTT, RNase를 섞어 준비 하였다. 25℃에서 10분 42℃에서 50분간 70℃에서 15분간 가열하여 inactivate 시키고 얼음으로 식혔다. cDNA와 2X SYBR green mix, primer, ROX를 각각 넣어 ABI step one plus (Applied biosystem, USA) 기기를 이용하여 실시간 정량 분석을 한 뒤 분석프로그램을 이용하여 결과를 분석하였다.
상기 실험에 사용된 프라이머의 서열은 다음 표 C와 같다.
[표 C]
Figure PCTKR2016014380-appb-I000004
그 결과, 어리연 꽃 및 노랑 어리연꽃 추출물의 경우 모두 농도 의존적으로 HAS-2와 filaggrin mRNA를 합성 시키는 것을 확인하였으며, 특히 filaggrin 합성능이 우수함을 확인할 수 있었다(도 20a 및 20b).
실험예6. 피부 탄력 개선 효과 확인
어리연꽃 추출물 및 노랑어리언꽃 추출물의, 콜라게나아제의 활성억제와 관련된 인자인 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1)과, 콜라겐의 전구체인 프로콜라겐의 합성 촉진 여부를 확인하였다.
CCD-986sk 세포를 5 X 104 cell/well 농도로 6-well plate에 접종한 후 24시간 안정화 시켰다. 24시간 후 UV-B(312 nm)를 조사 한 뒤 MMP-1의 활성을 높이기 위하여 TNF-α를 10 ng/ml의 농도로 첨가하였으며, 추출물 및 분획물을 5, 10, 25 μg/ml의 농도로 처리하여 48시간 배양하였다. 세포의 배양액을 수거하여 실험에 사용하였으며 Matrix Metalloproteinase-1 assay kit(Abcam), TIMP-1 assay kit(GE healthcare)을 이용하여 plate reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하고 표준곡선을 통해 계산식을 구하여 세포 배양액 내 MMP-1 및 TIMP-1 발현을 수치화 하였다.
그 결과, 어리연꽃속식물의 MMP-1저해능과 pro-collagen 활성능을 측정한결과 어리연 추출물의 우수한 MMP-1 발현저해능과 pro-collagen 활성능을 확인 할 수 있었다(도 21a).
또한, CCD-986sk 세포를 5 X 104 cell/well 농도로 6-well plate에 접종한 후 24시간 안정화 시켰다. 24시간 후 UV-B(312 nm)를 조사 한 뒤 추출물 및 에틸아세테이트 분획물을 5, 10, 25 μg/ml의 농도로 처리하여 48시간 배양하였다. 세포의 배양액을 수거하여 실험에 사용하였으며 Pro-collagen type-Ⅰ C peptide(PIP) EIA kit (Takara)을 이용하여 plate reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하고 표준곡선을 통해 계산식을 구하여 세포 배양액 내 프로펩타이드의 양을 측정하였다.
그 결과, 어리연 추출물 및 노랑어리연 추출물 모두 대조군에 비하여 20%이상 높은 프로콜라겐 활성능이 있음을 확인할 수 있었다(도 21b).
< 처방예 >
처방예 1. 유연화장수의 제조
상기 실시예 1, 3의 각 추출물을 유효성분으로 함유하는 유연화장수의 처방은 하기 표 1과 같다.
구체적으로, 소듐히알루로네이트는 프로펠러믹서(3000rpm)로 정제수에 분산하여 1% 용액상태로 준비하였다. 소듐히알루로네이트를 제외한 원료 1내지8은 프로펠러믹서를 사용하여 수상 용해조에 500rpm으로 균일화시키고 75℃에서 가온하여 완전 용해한 후, 실온으로 냉각하였다. 이후, 별도의 용해조에 원료 9 내지 11을 완전 용해시킨 후, 상기 수상 용해조에 투입하고 교반 혼합하였다. 여기에 실시예 1, 3의 각 추출물을 투입하여 충분히 교반 혼합하여, 유연화장수를 제조하였다.
유연화장수 제조
성분 함량(중량%)
1 실시예 1, 3의 각 추출물 0.01
2 폴리옥시에틸렌경화피마자유 0.5
3 글리신 3.3
4 디포타슘글리시리제이트 0.1
5 1,3-부틸렌 글리콜 3.0
6 소듐히아루로네이트 0.1
7 에탄올 5.0
8 항산화제 0.1
9 트리에탄올아민 0.1
10 EDTA 0.1
11 방부제 적량
12 정제수 잔량
처방예 2. 영양화장수의 제조
상기 실시예 1, 3의 각 추출물을 유효성분으로 함유한 영양화장수의 처방은 하기 표 2와 같다.
구체적으로, 프로펠러믹서를 이용하여 카보머를 4000rpm으로 분산하여 2% 용액상태로 준비하였다. 수상 용해조에 원료 1 내지 6을 투입하여 호모믹서(2000rpm)로 교반하여 분산한 후, 75℃까지 가온하였다. 유상 용해조에 원료 7 내지 14를 투입하여 75℃까지 가온 용해하였다. 그 다음 수상 용해조에 용해된 유상을 투입하여 유화(3000rpm/5분)시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 여기에 실시예 1, 3의 각 추출물을 투입하여 충분히 교반 혼합하여, 영양화장수를 제조하였다.
영양화장수 제조
성분 함량(중량%)
1 실시예 1, 3의 각 추출물 0.01
2 글리세린 7.0
3 소르비탄스테아레이트 슈크로오즈코코에이트 2.0
4 미네랄 오일 4.0
5 트리옥타노인 1.0
6 스테아릭에씨드 1.0
7 글리세릴 스테아레이트 0.5
8 소르비탄모노스테아레이트 1.0
9 디메치콘 0.5
10 항산화제 0.3
11 트리에탄올아민 0.1
12 카보머 0.2
13 EDTA 0.1
14 방부제 적량
15 정제수 잔량
처방예 3. 에센스의 제조
상기 실시예 1, 3의 각 추출물을 유효성분으로 함유한 에센스의 처방은 하기 표 3과 같다.
구체적으로, 소듐히알루로네이트, 히드록시에틸셀룰로이즈는 각각 정제수에 프로펠러믹서(2000rpm)로 분산하여 1중량% 함유용액으로 준비하였다. 또한 카보머는 정제수에 프로펠러믹서(4000rpm)로 분산하여 2중량% 함유용액으로 준비하였다. 한편, 수상 용해조에 원료 1 내지 12를 투입하여 호모믹서(2000rpm)로 교반하여 분산한 후, 75℃까지 가온하고, 가온된 수상을 다시 실온으로 냉각하였다. 별도의 용해조에 원료 13 내지 15를 완전 용해시킨 후, 상기 수상 용해조에 투입하여 교반 혼합하였다. 이에, 실시예 1, 3의 각 추출물을 유효성분으로 함유한 에센스를 제조하였다.
에센스 제조
성분 함량(중량%)
1 실시예 1, 3의 각 추출물 0.01
2 글리세린 5.0
3 1,3-부틸렌 글리콜 2.0
4 폴리에틸렌 글리콜 2.0
5 카보머 1.0
6 소듐히아루로네이트 0.1
7 글리신 3.0
8 폴리아크릴아마이드 2.0
9 히드록시에틸셀룰로이즈 0.2
10 에탄올 3.0
11 항산화제 0.3
12 트리에탄올아민 0.1
13 폴리옥시에틸렌경화피마자유 1.0
14 EDTA 0.1
15 방부제 적량
16 정제수 잔량
처방예 4. 영양크림의 제조
상기 실시예 1, 3의 각 추출물을 유효성분으로 함유한 영양크림의 처방은 하기 표 4와 같다.
구체적으로, 수상 용해조에 원료 1 내지 8을 투입하여 호모믹서(2000 rpm)로 교반하여 분산한 후, 75℃까지 가온하였다. 별도의 유상 용해조에 원료 9 내지 16을 투입하여 80℃까지 가온 용해한 후 상기 수상 용해조에 용해된 유상을 투입하여 유화(3000 rpm/10분)시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 여기에 실시예 1, 3의 각 추출물을 투입하여 충분히 교반 혼합하여, 영양크림을 제조하였다.
영양크림 조성
성분 함량(중량%)
1 실시예 1, 3의 각 추출물 0.01
2 1,3-부틸렌글리콜 3.0
3 글리세린 3.0
4 하이드로제네이티드 레시친 1.0
5 옥틸도데카놀 3.0
6 트리옥타노인 2.0
7 스테아릭에씨드 1.5
8 세토스테아릴알콜 2.0
9 폴리솔베이트60 1.5
10 소르비탄세스퀴올레이트 2.0
11 디메치콘 3.0
12 항산화제 0.3
13 산탄검 0.2
14 트리에탄올아민 0.1
15 EDTA 0.1
16 방부제 적량
17 정제수 잔량
처방예 5. 팩의 제조
상기 실시예 1, 3의 각 추출물을 유효성분으로 함유한 팩의 처방은 하기 표 5와 같다.
구체적으로, 별도의 용해조에 원료1내지8을 완전 용해시켜 교반 혼합하고, 여기에 실시예 1, 3의 각 추출물을 투입하여 충분히 교반 혼합하여 팩을 제조하였다.
팩의 조성
성분 함량(중량%)
1 실시예 1, 3의 각 추출물 0.01
2 글리세린 7.0
3 1,3-부틸렌글리콜 3.0
4 스쿠알렌 3.0
5 디메치콘 3.0
6 소듐히알루로네이트 0.1
7 글리신 2.0
8 폴리아크릴아마이드 5.0
9 항산화제 0.3
10 트리에탄올아민 0.1
11 EDTA 0.1
12 방부제 적량
13 정제수 잔량
처방예 6. 연고의 제조
상기 실시예 1, 3의 각 추출물을 유효성분으로 함유한 연고의 처방은 하기 표 6과 같다.
연고의 조성
성분 함량(중량%)
1 실시예 1, 3의 각 추출물 0.01
2 글리세린 8.0
3 1,3-부틸렌글리콜 4.0
4 유동 파라핀 15.0
5 베타글루칸 7.0
6 카보머 0.1
7 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 3.0
8 스쿠알란 1.0
9 세틸아릴 글루코사이드 1.5
10 소르비탄 스테아레이트 0.4
11 세테아릴 알코올 1.0
12 방부제 적량
13 향 적량
14 색소 적량
15 정제수 잔량
처방예 7. 패취제의 제조
상기 실시예 1, 3의 각 추출물을 유효성분으로 함유한 패취제의 처방은 하기 표 7과 같다.
패취제의 조성
성분 함량(중량%)
1 실시예 1, 3의 각 추출물 0.01
2 헥실렌글리콜 20
3 디에킬아민 0.7
4 폴리아크릴산 1.0
5 아황산나트륨 0.1
6 폴리옥시에틸렌라우릴에테르 1.0
7 폴리히드록시에틸렌세틸스테아릴에테르 1.0
8 점성의 파라핀 오일 2.5
9 카프릴산에스테르/카프르산에스테르 2.5
10 폴리에틸렌글리콜-400 3.0
11 정제수 잔량
이상에서 설명된 본 발명의 실시예는 예시적인 것에 불과하며, 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 잘 알 수 있을 것이다. 그러므로 본 발명은 상기의 상세한 설명에서 언급되는 형태로만 한정되는 것은 아님을 잘 이해할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다. 또한, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 정신과 그 범위 내에 있는 모든 변형물과 균등물 및 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (8)

  1. 어리연꽃 속(Nymphoides sp.) 식물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 어리연꽃 속 식물은 어리연꽃(Nymphoides indica), 노랑어리연꽃(Nymphoides peltata)및 좀어리연꽃(Nymphoides coreana)으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 피부 개선용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 피부 개선이 항산화, 피부 염증 개선, 피부 노화 방지 또는 개선, 자외선으로인한 피부 손상 개선, 피부 보습 개선, 피부 미백 개선, 피부 주름 예방 또는 개선; 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는, 피부 개선용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 추출물의 추출용매는 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 피부 개선용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 유기용매는, 에탄올, 메탄올, 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 클로로포름, 글리세린 및 이들 중 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 피부 개선용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 추출물은 70~95%의 에탄올 또는 메탄올 추출물을 포함하는, 피부 개선용 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 어리연꽃 속 식물의 추출물을 0.001~10 중량%로 포함하는, 피부 개선용 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적 조성물, 식품 조성물 또는 화장료 조성물인, 피부 개선용 조성물.
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