WO2018236007A1 - 유자씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물 - Google Patents

유자씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물 Download PDF

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WO2018236007A1
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extract
present
lipstick
cosmetic composition
limonoid
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황재호
김진영
신현재
최문희
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주식회사 마린테크노
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Definitions

  • the present invention relates to a cosmetic composition for whitening, and more particularly to a cosmetic composition having an antioxidative and whitening activity comprising an extract of yuzu or a limonoid aglycon derived from yuza seed as an active ingredient.
  • Skin is a very important tissue that has the biochemical and physical functions to protect the human body in direct contact with the external environment. This organization is divided into three major categories: epidermis, dermis, and subcutaneous tissue.
  • epidermis The skin color of a person varies depending on the number, size, type and distribution of melanosomes containing melanin mainly contained in skin cells.
  • Melanomas are produced by melanocytes, and melanin, a black pigment produced by the epidermis, is produced in cells called melanocytes. Melanin absorbs ultraviolet light energy in the sunlight, preventing deeper cells from being damaged by ultraviolet light. Such abnormal production of melanin causes skin lesions such as vitiligo. On the contrary, if melanin is excessively synthesized by ultraviolet rays or the like, it not only damages the skin but also forms spots and freckles, and furthermore it causes skin cancer.
  • the whitening composition can be prepared by various methods depending on which of the steps that can inhibit melanin formation.
  • the composition according to this method contains a component capable of blocking ultraviolet rays, which is a main cause of melanin production.
  • the composition according to this method contains a light scattering agent or a light blocking agent to reduce DNA damage or inflammation due to ultraviolet rays, By inhibiting the synthesis of core carbohydrates necessary to show activity, it is possible to inhibit melanin production (acting at the whitening A step).
  • the second is to use substances that interfere with the function of tyrosinase involved in melanin production, such as enzymatic acids (kojic acid), lucinol, eric acid, or arbutin (acting on the whitening B step).
  • a whitening ingredient in the conventional cosmetics field for example, substances inhibiting tyrosinase enzyme activity such as kojic acid and arbutin, hydroquinone, L-ascorbic acid, And derivatives thereof and various plant extracts have been used.
  • the substances inhibiting the tyrosinase enzyme activity are limited in their use due to degradation and coloration due to low stability in the prescription system, the generation of offensive odor, efficacy at a biological level, unclear effects and safety problems, to be.
  • the present inventor sought to find a material derived from a natural substance that is stable to the human body and capable of exhibiting excellent whitening effect.
  • the present inventors have completed the present invention by confirming that it is possible to effectively inhibit the synthesis of melanin by inhibiting melanin production in a concentration-dependent manner in a cell.
  • an object of the present invention is to provide a cosmetic composition which is stable to human body and is excellent in antioxidative activity and melanin inhibitory activity and is effective for skin whitening.
  • the present invention provides a whitening cosmetic composition comprising an extract of citrus peel as an active ingredient.
  • the extract may be at least one extract selected from the group consisting of citrus peel, sea bass and cetaceous.
  • the extract may be extracted with at least one solvent selected from the group consisting of lower alcohols having 1 to 4 carbon atoms, ethyl acetate, acetone, water and hexane.
  • the extract may be an ethanol extract.
  • the present invention provides a cosmetic composition for whitening comprising a limonoid aglycon derived from yuzu as an active ingredient.
  • the limonoid aglycon derived from Yuzu is selected from the group consisting of limonin, nomilin, obacunone, deacetylnomilin, Ring lactone (limonate A-ring lactone).
  • the cosmetic composition may be at least one selected from the group consisting of a soft lotion, a gel, a water-soluble liquid, a milk lotion, a nutritional cream, a massage cream, an essence, an oil in water emulsion, , Oil dispersions in aqueous phase using microspheres, ionic lipid vesicles, nonionic lipid vesicles, ointments, cleansing foams, cleansing waters, packs, body oils, oil-in-oil makeup bases, watershed makeup bases, foundations, skins And may be one type of formulation selected from the group consisting of a cover, a lipstick, a lip gloss, a face powder, a two-way cake, an eye shadow, a mascara, a cheek color and an eyebrow pencil.
  • the composition of the present invention containing it as an active ingredient can inhibit melanin pigment And thus can be usefully used as a functional cosmetic composition.
  • the yuzu seed extract of the present invention and the limonoid aglycon derived from yuza seed are natural materials, and the cosmetic composition of the present invention having the same has a safety advantage for long-term use.
  • FIG. 1 is a photograph showing Yuza of Goheung County in 2016.
  • FIG. 2 is a photograph showing a milking process for obtaining oil from citron seeds.
  • Fig. 3 is a photograph showing seed husks, seeds and seeds separated from yuzu seeds after milking.
  • FIG. 4 is a view showing the process of extracting citrus seeds according to the present invention.
  • Fig. 5 shows the result of analysis of a remoteonoid component contained in a limonoid aglycone derived from yuzu seeds (seed, bark, seed) of the present invention by HPLC.
  • Fig. 6 shows the result of analyzing the remoteonoid component contained in the yuza-derived limonoid aglycon of the present invention by HPLC / MS.
  • 7A is a graph showing the results of cytotoxicity evaluation of melanoma cells treated with yuza-derived limonoid aglycon of the present invention at different concentrations (25, 50, and 100 ⁇ g / ml), and 7b shows the results of yuza seed The results of cytotoxicity evaluation by treatment of melanoma cells with concentration of each of the radonoid glycosides (25, 50, and 100 ⁇ g / ml) are shown.
  • FIG. 8 shows the results of confirming melanin production inhibitory activity by treatment of melanoma cells with each of the melanoma cells (25, 50, and 100 ⁇ g / ml) according to the present invention.
  • FIG. 9 is a graph showing the amount of protein expression of whitening-related substances (tyrosinase, TRP1, TRP2) after treatment of melanoma cells with concentration (25, 50 ⁇ g / ml) Respectively.
  • Figure 10 shows the chemical formulas of limonin, nomilin, deacetylnomilin, obacunone and limonate A-ring lactone.
  • the present invention is characterized by providing a whitening cosmetic composition comprising an extract of Yuzu citrus as an active ingredient.
  • the extract may be at least one extract selected from the group consisting of citrus peel, sea bass and cetaceous.
  • the seed coat refers to the outermost coat of the seed of the seed.
  • the seed coat referred to herein means a brown coat between the seed coat and the seed coat, and may be referred to as a coating or an absorbent.
  • &quot seedling &quot
  • seedling &quot refers to a tissue that removes the shell and the bark of yuzu seeds and supplies the nutrients necessary for the germination of the seeds germinated to grow, and may be referred to as an endosperm or an endosperm.
  • yujia seed extract has excellent antioxidative and whitening activity and thus can be used as a material for functional cosmetics.
  • the extract of citrus peel according to the present invention can be obtained by extracting and separating from nature using a method of extraction and separation known in the art, and the extract defined in the present invention can be obtained by extracting from citrus seed using an appropriate solvent
  • citrus seed extract polar solvent-soluble extract, or non-polar solvent-soluble extract.
  • the yuzu seed extract may be a seed bark extract of yuzu seed, a yuzu seed extract, and a yuzu seed extract.
  • any pharmaceutically acceptable organic solvent may be used, and water or an organic solvent may be used,
  • alcohols having 1 to 4 carbon atoms such as purified water, methanol, ethanol, propanol, isopropanol, and butanol, acetone, ether
  • solvents such as benzene, chloroform, ethyl acetate, methylene chloride, hexane and cyclohexane may be used alone or in combination.
  • Water (distilled water) or ethanol (alcohol) may be preferably used in view of safety and the like.
  • any one of the methods such as hot water extraction method, cold extraction method, reflux cooling extraction method, solvent extraction method, steam distillation method, ultrasonic extraction method, elution method and compression method can be selected and used.
  • the desired extract may be further subjected to a conventional fractionation process or may be purified using a conventional purification method.
  • the method for producing the citron extract of the present invention there is no limitation on the method for producing the citron extract of the present invention, and any known method can be used.
  • the citrus seed extract contained in the composition of the present invention can be prepared into a powdery state by an additional process such as vacuum distillation, freeze-drying, or spray drying, have.
  • the primary extract can be further purified by using various chromatographies such as silica gel column chromatography, thin layer chromatography, high performance liquid chromatography and the like, You can get it.
  • the citron extract is a concept including all of the extract, fraction and purified product obtained in each step of extraction, fractionation or purification, a diluted solution thereof, a concentrate or a dried product.
  • the remaining solid part of the citron was dried, and then the seed husks (yellowish white), the septum (brown film between the shell and the seed milk) and the cecum were separated. ) Can be added and extracted with hot water or ethanol, and the extract can be used by lyophilization.
  • the yuzu seed extract of the present invention has an excellent antioxidative activity and particularly has an antioxidative activity remarkably superior to the extract of other parts (bark, catechol) in extracts of citrus peel part, and is useful as a functional material for skin whitening Can be used.
  • the present invention provides a cosmetic composition for whitening comprising a limonoid aglycon derived from yuzu as an active ingredient.
  • the limonoid aglycon derived from yuza of the present invention may be selected from the group consisting of limonin, nomilin, obacunone, deacetylnomilin and limonate A-ring lactone).
  • the limonoid aglycon derived from yuzu seeds of the present invention has safety because it does not show cytotoxicity even at a high concentration and has excellent melanin production inhibitory effect against limonin which is known in the prior art whitening function and is useful as a functional material for skin whitening .
  • the yuzu seed extract or the yuza seed-derived limonoid aglycon may be contained in the cosmetic composition at a concentration of 0.001 to 10,000 ⁇ g / ml.
  • Examples of products to which the cosmetic composition of the present invention can be added include cosmetics such as astringent lotion, softening longevity lotion, nutrition lotion, various creams, essences, packs, foundation and the like, cleansing, cleanser, soap, .
  • Specific formulations of the cosmetic composition of the present invention may include, but are not limited to, softening lotion, gel, water-soluble liquid, milk lotion, nutritional cream, massage cream, essence, oil in water emulsion, water in oil type emulsion, facial anhydrous product, A lipid, a lipid, a lipid, a lipid, a lipid, a lipid, a lipid, a lipid, a lipid, a lipid, Lipstick, lip gloss, face powder, two-way cake, eye shadow, mascara, cheek color, and eyebrow pencil.
  • the content of the active ingredient of the present invention is 0.00001-40 wt%, preferably 0.0005-40 wt% By weight, and more preferably 0.0005 to 20% by weight. If the content of the active ingredient is less than 0.00001% by weight, the effect of skin whitening is greatly reduced. If the content of the active ingredient is more than 20% by weight, skin irritation may be caused.
  • the cosmetic composition according to the present invention can be formulated by stabilizing the active ingredient (containing yuza seed extract or yuza seed-derived limonoid aglycon) in the nanoliposome.
  • the active ingredient the yuza seed extract or the yuza seed-derived limonoid aglycon
  • the active ingredient is contained in the inside of the nanoliposome, the active ingredient is stabilized and the problems such as precipitation formation, discoloration, and deterioration upon formulation can be solved,
  • the transdermal absorption rate can be increased and the efficacy expected from the extract can be maximally expressed.
  • nanoliposome refers to a liposome having a typical liposome form and having an average particle diameter of 10 to 500 nm.
  • the average particle diameter of the nanoliposome is 50 to 300 nm, more preferably 100 to 200 nm.
  • improvement of skin penetration and improvement of formulation stability is very weak among technical effects to be achieved in the present invention.
  • the nanoliposome used for stabilizing the active ingredient is prepared by a mixture comprising a polyol, an oily component, a surfactant, a phospholipid, a fatty acid and water .
  • the polyol used in the nanoliposome of the present invention is not particularly limited and is preferably a polyol such as propylene glycol, dipropylene glycol, 1,3-butylene glycol, glycerin, methylpropanediol, isopropylene glycol, pentylene glycol, erythritol, , Sorbitol, and mixtures thereof.
  • the amount thereof is 10 to 80% by weight, preferably 30 to 70% by weight, based on the total weight of the nanoliposome.
  • the oil component used in the preparation of the nanoliposome of the present invention may be selected from a variety of oils known in the art and is preferably a hydrocarbon oil such as hexadecane and paraffin oil, Vegetable oils such as silicon oil such as dimethicone and cyclomethicone, sunflower oil, corn oil, soybean oil, avocado oil, sesame oil and fish oil, ethoxylated alkyl ether oils, propoxylated alkyl ether oils 40 is a fatty alcohol, and mixtures thereof -, phytosphingosine, sphingosine, and scan non-ping the same scan pinggo cannabinoid lipid, cholesterol side-by celebrity, sitosterol cholesteryl sulfate, cholesteryl sulfate, cytokines, C 10.
  • the amount thereof may be 1.0 to 30.0% by weight, and preferably 3.0 to 20.0% by weight based on the total weight of the nanoliposome.
  • any surfactant known in the art may be used as the surfactant used in the preparation of the nanoliposome of the present invention.
  • anionic surfactants cationic surfactants, amphoteric surfactants and nonionic surfactants can be used.
  • Preferred are anionic surfactants and nonionic surfactants.
  • Specific examples of anionic surfactants include alkyl acyl glutamates, alkyl phosphates, alkyl lactylates, dialkyl phosphates and trialkyl phosphates.
  • Specific examples of nonionic surfactants include alkoxylated alkyl ethers, alkoxylated alkyl esters, alkyl polyglycosides, polyglyceryl esters and sugar esters.
  • Particularly preferred surfactants are polysorbates belonging to nonionic surfactants. The amount thereof may be 0.1 to 10% by weight, preferably 0.5 to 5.0% by weight, based on the total weight of the nanoliposome.
  • the phospholipid is a lipophilic lipid that is used with both affinity lipids and is composed of natural phospholipids (e.g., egg yolk lecithin or soy lecithin, sphingomyelin) Dipalmitoyl phosphatidylcholine or hydrogenated lecithin), preferably lecithin.
  • natural phospholipids e.g., egg yolk lecithin or soy lecithin, sphingomyelin
  • lecithin unsaturated lecithin or saturated lecithin derived from natural origin extracted from soybean or egg yolk is preferable.
  • the amount of phosphatidylcholine is 23 to 95% and the amount of phosphatidylethanolamine is 20% or less in natural derived lecithin.
  • the amount of the phospholipid to be used is 0.5 to 20.0% by weight, preferably 2.0 to 8.0% by weight based
  • Fatty acid to be used in nano-liposome preparation of the present invention is a higher fatty acid, preferably a C 12 - 22 as a saturated or unsaturated fatty acid of the alkyl chain, e.g., lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid and linoleic acid .
  • the amount thereof may be 0.05 to 3.0% by weight, preferably 0.1 to 1.0% by weight, based on the total weight of the nanoliposome.
  • the water used in the preparation of the nanoliposome of the present invention is generally deionized distilled water, and the amount thereof may be 5.0-40 wt% based on the total weight of the nanoliposome.
  • the preparation of nanoliposomes can be accomplished through a variety of methods known in the art, but most preferably is made by applying a mixture comprising the ingredients to a high pressure homogenizer.
  • the preparation of a nanoliposome by a high pressure homogenizer can be carried out under various conditions (for example, pressure, number of times, etc.) depending on a desired particle size, and preferably at a high pressure homogenizer So that the nanoliposome can be produced.
  • the cosmetic composition of the present invention may be used alone or in combination, or it may be used in combination with other cosmetic compositions other than the present invention.
  • the cosmetic composition having excellent antioxidative and whitening effect according to the present invention can be used according to a conventional method of use, and the use frequency of the cosmetic composition can be changed according to a user's skin condition or taste.
  • Yuza seeds (shells, seeds, seeds) prepared
  • the yuza seeds used in this experiment were separated from the citron produced in November 2015 in Goheung, Jeollanam province.
  • the separated yuza seeds were cleaned twice or three times in flowing water to remove foreign matter and dried overnight at 50 ° C (See Fig. 1).
  • the oil obtained by high pressure milking process was milked and the oil acquisition yield was measured in order to secure the oil component including the specific flavor of citron and the water solubility and the fat soluble component of citron seed oil.
  • the pressure was set at 600kg / cm2 during the milking process and the pressure was applied for 1 hour.
  • the yuza seeds were firstly filtered at 600mesh (23 ⁇ m) for the milking process of Yuza, Secondary filtration was performed at 1,200 mesh (12 ⁇ ).
  • the final yield was determined by sedimentation for 100 hours in order to finally confirm the suspended solids eluted in the filtered citrus seed oil.
  • the final yield of yuza seed oil was about 11.6% of dry matter weight.
  • the remaining solid portion of the yuzu seed was dried and then separated into a shell (yellowish white), a seam (brown film between the skin and the seed), and catechin.
  • Residues (residual shell, residual sebum, residual seed) from the filtration (filtration) of Example ⁇ 2-1> were washed with water and dried in the shade at room temperature.
  • 100 g of the dried residue (shell, seed, and seed) was added 1000 mL of distilled water and the mixture was shaken at 100 rpm at room temperature for 24 hours with a shaker.
  • the filtrate was lyophilized for 3 to 4 days using a freeze dryer.
  • the lyophilized concentrate was washed three times with 100% ethanol, and the ethanol was removed using a vacuum concentrator to finally obtain limonoid glucoside.
  • the weight of the yuzu seed coat, the seed coat, and the cirrhotic limonoid glucoside were 8.12 g, 6.10 g, and 7.32 g, respectively, and the yield of the final remarnoide glucoside was 21.54%.
  • Example 2 the antioxidant effect of the limonoid aglycon (peel, bark, seedling) obtained in Example 2 was examined. Antioxidant activity was investigated by ABTS radical scavenging activity and DPPH radical scavenging activity, and total polyphenol contents were further investigated.
  • the IC 50 value of remote solenoid aglycone extract from the bark were the antioxidant activity was the highest in 1000 ⁇ g / mL
  • the remote solenoid IC 50 value of the extracted aglycone from ssijeot As shown in Table 1 is 15585 ⁇ g / mL showed the lowest antioxidant activity.
  • DPPH has a characteristic absorption spectrum at 517 nm due to the odd electrons it possesses. When it reacts with an electron donor providing hydrogen atom, it gets hydrogen radical to generate phenoxy radical. DPPH is purple in the radical state, and when it is reduced, it is converted to yellow 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine (DPPH-H). DPPH, a stable radical, converts to non-radical when it is supplied with electrons or hydrogen from antioxidants. The DPPH method is widely used as a method for measuring the antioxidative activity of a water-soluble or organic solvent extract of a natural product.
  • the antioxidant activity of Blois was modified to measure the radical scavenging ability of the sample.
  • 800 ⁇ l of 0.1 mM DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, Sigma, USA) dissolved in 95% ethanol and 200 ⁇ l of each test group were placed in an EP tube and vortexed for 3 minutes in a dark room for 30 minutes.
  • the remaining concentrations of the radicals were measured at 517 nm using a UV-Visible spectrophotometer (SCINCO, Seoul, Korea) and ascorbic acid (Sigma, USA) was used as a positive control.
  • the scavenging ability (IC 50 ) of the sample against DPPH was expressed as the concentration required to reduce the absorbance of the control using only the solvent by 50%.
  • the IC 50 value of the limonoid aglycone extracted from the skin was 4648 ⁇ g / mL, which was the highest antioxidative activity
  • the IC 50 value of the limonoid aglycon extracted from the sesame seeds was 57157 ⁇ g / mL showed the lowest antioxidant activity.
  • Total polyphenol content was determined using the modified Folin-Denis method. Each sample was diluted by concentration, and 1 mL of the sample was mixed with 1 mL of 0.2 N Folin & Ciocalteus phenol reagent and 1 mL of 2% Na 2 CO 3, and the mixture was reacted at room temperature for 30 minutes. Absorbance was measured at 750 nm using a UV-VIS spectrophotometer. As the reference material, gallic acid was used to obtain the calibration curve, and the total polyphenol content was measured from the calibration curve.
  • the total polyphenol content of the limonoid aglycon extracted from the skin was the highest at 7.0842 GAE * mg / g, and the total polyphenol content of the limonoid aglycone extracted from the beef tallow was 1.4099 GAE * mg / g.
  • the antioxidant activities of the limonoid aglycone by the parts of the yuza seeds were found to be higher in order of shell> sheep> sperm.
  • HPLC analysis was carried out using a limonoid aglycon derived from yuza seed obtained in Example ⁇ 2-1> to analyze the reference material, and the retention time of the reference material was compared to confirm the content and content.
  • the conditions are summarized in the table below.
  • limonin, nomilin, deacetylnomilin, obacunone, and limonate A-glucuronide were detected by HPLC / MS analysis using a limonoid aglycone derived from Yuza seed obtained in Example ⁇ 2-1> ring lactone, and the analysis conditions are summarized in the table below.
  • Example 2 The cytotoxicity of the yuza seed-derived limonoid aglycon / limonoid glucoside obtained through Example 2 was evaluated.
  • the cell line B16 / F10 (murine melanoma) used in the experiment was distributed at the Korean Cell Line Bank (KCLB).
  • the cells were cultured in a 4% CO 2 incubator at 37 ° C with 5% FBS, 1% penicillin streptomycin, and 1 ⁇ g / mL ⁇ -MSH ( ⁇ -Melanocytestimulating hormone).
  • MTT assay is a method for measuring the change in color of NAD (P) H-dependent oxidoreductase enzymes of cells using Tetrazolium dye, which measures the growth or death of cells. That is, when the cells are alive, MTT is reduced to change the color, but when the cell is dying or stops growing, the dye is not reduced. Using this principle, the toxicity of the extract containing the yuiza seeded limonoid aglycon / limonoid glucoside was examined, and the change in color was indirectly measured.
  • the cell lines were inoculated into 12 well plates at 1 ⁇ 10 4 cells / well and cultured for 24 hours.
  • the MTT stock solution (5 mg / mL) was added to the culture medium to a final volume of 1/10 to the cultured cells after the sample was treated with the concentration (25 ⁇ g / mL, 50 ⁇ g / mL, 100 ⁇ g / mL) Lt; 0 > C for 4 hours.
  • the culture supernatant was removed, 200 ⁇ L of DMSO was added to each well to dissolve the MTT-formazan crystals produced in the cells, and the absorbance was measured at 570 nm on an ELISA readeer.
  • the limonoid aglycon derived from yuza seed of the present invention had no cytotoxicity up to a concentration of 100 ⁇ g / mL.
  • the ulceroid glycosides derived from yuza seeds of the present invention did not show cytotoxicity up to a concentration of 50 ⁇ g / mL, and the cell survival rate was slightly reduced at a concentration of 100 ⁇ g / mL (see FIG.
  • the limonoid aglycone derived from yuza seed of the present invention having excellent cell safety was used.
  • B16 / F10 melanoma cells were seeded at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / well in a 6-well plate and cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for one day. Subsequently, samples were treated with ⁇ -MSH (1 ⁇ g / ml) and concentrations (25 ⁇ g / ml, 50 ⁇ g / ml, 100 ⁇ g / ml) and cultured for 3 days. The cultured cells were centrifuged for 5 minutes and the resulting cell suspension was dissolved in 1 mL of PBS.
  • the pellet thus obtained was dissolved in 200 uL of 1 N NaOH (+ 10% DMSO) solution and absorbance was measured at 405 nm.
  • the untreated group was used as a control group, and the arbutin-treated group (arbutin 100 ⁇ g / ml) was used as a positive control.
  • B16F10 cell suspension was added to each well at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / ml per well in a 100 ⁇ tissue culture dish, followed by culturing for 24 hours to stabilize the cells. Then, the limonoid aglycon of the present invention , 50 [mu] g / mL). After incubation, cells were washed 2-3 times with PBS, lysed with lysis buffer, and centrifuged at 13,000 rpm for 10 min. Quantitation of protein was measured by Bradford method.
  • ⁇ g of protein is denatured by 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) and transferred to a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane.
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • the primary antibody is added to Tris-buffered saline with 0.2% Tween-20 (TBST) containing 2.5% nonfat dry milk and allowed to react at room temperature for 1 hour 30 minutes or at 4 ° C for 24 hours.
  • TST Tween-20
  • the membrane reacted with the primary antibody was washed 3 times with PBST, reacted with the secondary antibody at room temperature for 1 hour and 30 minutes, and washed three times with PBST.
  • the patterns of each band were confirmed by ECL advance detection system.

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Abstract

본 발명은 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 유자씨 추출물 또는 유자씨 유래의 리모노이드 아글리콘을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 미백 활성을 갖는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 유자씨 추출물 및 유자씨 유래의 리모노이드 아글리콘은 우수한 안전성, 항산화 활성과 더불어 멜라닌 생성을 효과적으로 억제할 수 있으므로, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 피부에 자극 없이 멜라닌 색소 억제를 통한 우수한 미백 효과를 나타낼 수 있어 기능성 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 유자씨 추출물 및 유자씨 유래의 리모노이드 아글리콘은 천연 소재로서, 이를 포함하는 본 발명의 화장료 조성물은 장기간 사용에도 안전한 이점을 가진다.

Description

유자씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물
본 발명은 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 유자씨 추출물 또는 유자씨 유래의 리모노이드 아글리콘을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 미백 활성을 갖는 화장료 조성물에 관한 것이다.
피부는 외부 환경과 직접 접하면서 인체를 보호하며 생화학적 및 물리적인 기능을 가지고 있는 아주 중요한 조직이다. 이 조직은 크게 3가지, 즉, 표피, 진피, 그리고 피하조직으로 나누어진다. 사람의 피부색은 주로 피부 세포속에 들어있는 멜라닌을 함유하는 멜라노좀의 숫자, 크기, 종류 및 분포도에 따라 다르게 나타난다.
멜라노좀은 멜라닌 세포에 의해 생산되고, 표피에서 생성되는 검은 색소인 멜라닌은 멜라노사이트라는 세포에서 생산된다. 멜라닌은 햇빛 중 자외선의 빛 에너지를 흡수하여 더 깊숙이 있는 세포들이 자외선에 의해 손상되는 것을 막아주는 역할을 한다. 이러한 멜라닌이 비정상적으로 적게 생산되면 백반증과 같은 피부병변이 유발되고 반대로 자외선 등에 의해 멜라닌이 과도하게 합성되면 피부에 손상을 줄 뿐만 아니라 기미, 주근깨를 형성하게 되고, 더 나아가 피부암의 원인이 되기도 한다.
멜라닌 형성과정에서 가장 중요한 역할을 하는 것은 티로시나아제 효소로 알 려져 있으며, 이 효소는 조직 중에 존재하는 티로신이라고 하는 아미노산에 작용하는 도파퀴논을 생성시키며 이 도파퀴논으로부터 여러 단계의 자동 산화과정을 거쳐 흑색 색소인 멜라닌이 생성된다. 따라서 멜라닌 생성을 억제할 수 있는 단계의 어느 과정 중에 작용하느냐에 따라 다음과 같은 여러 방법으로 미백용 조성물을 만들 수 있다.
첫 번째로는 멜라닌 생성의 주원인인 자외선을 차단할 수 있는 성분을 함유시키는 것으로, 이 방법에 의한 조성물은 광 산란제 또는 광 차단제를 함유함으로써 자외선에 의한 DNA 손상 또는 염증을 줄여 글루코사민과 같은 티로시나아제가 활성을 나타내기 위해 필요한 코어 탄수화물의 합성을 저해함으로써 멜라닌 생성을 억제시킬 수 있다(미백 A 단계에 작용). 두 번째는 효소산(코직산), 루시놀, 에릭산 또는 알부틴과 같이, 멜라닌 생성에 관여하는 티로시나아제의 기능을 방해하는 물질을 사용하는 것이다(미백 B 단계에 작용). 세 번째로는 도파크롬을 안정화하여 흑색 멜라닌인 유-멜라닌(Eu-Melanin)으로의 진행을 저지할 수 있는 방법이 있다(미백 C 단계에 작용). 네 번째는 티로신이 도파와 도파크롬을 거쳐 복잡한 산화와 축합 반응을 거치는 동안에, 강한 항산화 효과를 발휘하여 미백효과를 낼 수 있는 비타민 C와 같은 물질을 사용하는 것이다(미백 D 단계에 작용). 다섯 번째로는, 효소 또는 AHA(Alpha Hydroxy Acid)등을 사용하여, 생성된 멜라닌을 각질층에서 제거 및 환원시켜 줄 수 있는 방법도 있다(미백 E 단계에 작용).
종래의 화장품 분야에서는 미백 성분으로서, 예를 들면, 코지산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin) 등과 같은 티로시나아제 효소활성을 억제하는 물질, 하이드로퀴논(Hydroquinone), 비타민 C(L-Ascorbic acid) 및 이들의 유도체와 각종 식물 추출물이 사용되어 왔다. 그러나 상기 티로시나아제 효소활성을 억제하는 물질은 처방계 중에서의 안정성이 낮기 때문에 분해되어 착색되거나, 이취의 발생, 생체 레벨에서의 효능, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다.
이에 본 발명자는 천연물질로부터 유래되어 인체에 안정하면서도, 탁월한 미백 효과를 나타낼 수 있는 소재를 찾고자 모색하던 중, 유자씨 추출물의 화장품 소재로서의 효과를 실험한 결과, 유자씨 추출물과 유자씨로부터 분리되는 리모노이드 아글리콘이 세포 내에서 멜라닌 생성을 농도 의존적으로 저해함으로써 멜라닌의 합성을 효과적으로 억제할 수 있다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
(선행기술문헌)
(특허문헌)
한국공개특허 제10-2012-0054375호
한국공개특허 제10-2008-0022010호
따라서 본 발명의 목적은 인체에 안정하면서 항산화 활성과 멜라닌 억제 활성이 우수하여 피부 미백에 효과적인 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,
본 발명은 유자씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 유자 씨껍질, 씨박 및 씨젖으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 추출물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 물 및 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매로 추출될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 에탄올 추출물일 수 있다.
또한, 본 발명은 유자씨 유래의 리모노이드 아글리콘을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유자씨 유래의 리모노이드 아글리콘은 리모닌(limonin), 노미린(nomilin), 오바쿠논(obacunone), 디아세틸노미린(deacetylnomilin) 및 리모네이트 에이-링 락톤(limonate A-ring lactone)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 밀크로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 수중유 형 에멀젼, 유중수 형 에멀젼, 페이스크성 무수 생성물, 고체 무수 생성물, 소구체를 사용한 수성 상에서의 오일 분산물, 이온성 지질 소포체, 비이온성 지질 소포체, 연고, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 보디오일, 수중유 형 메이크업베이스, 유중수 형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이섀도우, 마스카라, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종의 제형일 수 있다.
본 발명의 유자씨 추출물 및 유자씨 유래의 리모노이드 아글리콘은 우수한 안전성, 항산화 활성과 더불어 멜라닌 생성을 효과적으로 억제할 수 있으므로, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 피부에 자극 없이 멜라닌 색소 억제를 통한 우수한 미백 효과를 나타낼 수 있어 기능성 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 유자씨 추출물 및 유자씨 유래의 리모노이드 아글리콘은 천연 소재로서, 이를 포함하는 본 발명의 화장료 조성물은 장기간 사용에도 안전한 이점을 가진다.
도 1은 2016년 발생한 고흥군 유자씨를 나타낸 사진이다.
도 2는 유자씨로부터 오일을 얻기 위한 착유공정을 나타낸 사진이다.
도 3은 착유 후 유자씨로부터 분리된 씨껍질, 씨박 및 씨젖을 나타낸 사진이다.
도 4는 본 발명의 유자씨 추출 공정도이다.
도 5는 본 발명의 유자씨(씨껍질, 씨박, 씨젖) 유래 리모노이드 아글리콘에 포함된 리모노이드 성분을 HPLC를 이용하여 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명의 유자씨 유래 리모노이드 아글리콘에 포함된 리모노이드 성분을 HPLC/MS을 이용하여 분석한 결과이다.
도 7a는 본 발명의 유자씨 유래 리모노이드 아글리콘을 멜라노마 세포에 농도별(25, 50, 100μg/ml) 처리에 따른 세포독성평가에 대한 결과를 나타낸 것이며, 7b는 본 발명의 유자씨 유래 리모노이드 글리코사이드를 멜라노마 세포에 농도별(25, 50, 100μg/ml) 처리에 따른 세포독성평가에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 유자씨 유래 리모노이드 아글리콘을 멜라노마 세포에 농도별(25, 50, 100μg/ml) 처리에 따른 멜라닌 생성저해능을 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명의 유자씨 유래 리모노이드 아글리콘을 멜라노마 세포에 농도별(25, 50μg/ml) 처리 후 미백 관련 물질들(티로시나아제, TRP1, TRP2)의 단백질 발현량을 웨스턴 블랏 분석으로 측정한 결과이다.
도10은 limonin, nomilin, deacetylnomilin, obacunone 및 limonate A-ring lactone 화학식이다.
본 발명은 유자씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명의 일구체예에서, 상기 추출물은 유자 씨껍질, 씨박 및 씨젖으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 추출물일 수 있다.
본 명세서에서 언급하는 씨껍질은 유자씨의 가장 겉에 있는 껍질을 의미한다.
본 명세서에서 언급하는 씨박은 씨껍질과 씨젖 사이의 갈색 막을 의미하며, 피막 또는 피박이라고 명칭될 수 있다.
본 명세서에서 언급하는 씨젖은 유자씨의 껍질 및 씨박을 제거하고 나오는 조직으로서 씨앗이 발아하여 배가 생장하는데 필요한 양분을 공급하는 조직을 의미하며, 배젖 또는 배유라고도 명칭될 수 있다.
본 발명에서는 유자씨 추출물의 항산화 기능성과 더불어 미백 활성이 우수하여 기능성 화장품의 소재로 사용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따른 유자씨 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된추출물은 적절한 용매를 이용하여 유자씨로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 유자씨 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 유자씨 추출물은 유자씨의 씨껍질 추출물, 유자 씨박 추출물 및 유자 씨젖 추출물일 수 있다.
상기 유자씨(씨껍질, 씨박, 씨젖)로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 안전성 등을 고려하여 바람직하게는 물(증류수) 또는 에탄올(주정)을 사용할 수 있다.
추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 유자씨 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 유자씨 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다.
따라서 본 발명에 있어서 유자씨 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.
본 발명의 일실시예에 따른 유자씨 추출물을 제조하는 방법을 조금 더 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.
착유(오일을 추출함) 과정을 거치고 남은 유자씨 고형 부분을 건조한 후 씨껍질(노란빛을 띈 흰색), 씨막(껍질과 씨젖 사이의 갈색 막), 씨젖으로 분리한 다음, 이들 각각에 물(증류수)을 가하여 열수추출하거나 에탄올을 가하여 용매 추출할 수 있으며, 추출물은 동결건조하여 사용될 수 있다.
본 발명의 유자씨 추출물은 항산화 활성이 우수하며, 특히, 유자씨 껍질 부분의 추출물이 다른 부위(씨박, 씨젖)의 추출물 대비 두드러지게 우수한 항산화 활성을 갖는바, 피부 미백을 위한 기능성 소재로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 유자씨 유래의 리모노이드 아글리콘을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 유자씨 유래의 리모노이드 아글리콘은 리모닌(limonin), 노미린(nomilin), 오바쿠논(obacunone), 디아세틸노미린(deacetylnomilin) 및 리모네이트 에이-링 락톤(limonate A-ring lactone)을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 유자씨 유래의 리모노이드 아글리콘은 높은 농도에서도 세포독성이 나타나지 않아 안전성이 있으며, 종래 미백 기능이 알려진 리모닌 대비 멜라닌 생성 억제 효과가 우수하여 피부 미백을 위한 기능성 소재로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 상기 유자씨 추출물 또는 유자씨 유래의 리모노이드 아글리콘은 화장료 조성물에 0.001 내지 10000μg/ml의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 유연 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 밀크로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 수중유 형 에멀젼, 유중수 형 에멀젼, 페이스크성 무수 생성물, 고체 무수 생성물, 소구체를 사용한 수성 상에서의 오일 분산물, 이온성 지질 소포체, 비이온성 지질 소포체, 연고, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 보디오일, 수중유 형 메이크업베이스, 유중수 형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이섀도우, 마스카라, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종의 제형을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유효성분(유자씨 추출물 또는 유자씨 유래의 리모노이드 아글리콘)의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 0.00001-40중량%이며, 바람직하게는 0.0005-40%이며, 보다 바람직하게는 0.0005-20중량%이다. 상기 유효성분의 함량이 0.00001중량% 미만이면 피부 미백 효과가 크게 감소되고, 20중량%를 초과하는 경우에는 피부 자극을 초래할 수 있으며, 제형상의 문제점이 발생할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 상기 화장료 조성물은 유효성분(유자씨 추출물 또는 유자씨 유래의 리모노이드 아글리콘)을 나노리포좀 내부에 함유시켜 안정화하여 제형화할 수도 있다. 상기 유효성분(유자씨 추출물 또는 유자씨 유래의 리모노이드 아글리콘)을 나노리포좀 내부에 함유시키면, 유효성분이 안정화되어 제형화시 침전형성, 변색, 변취 등의 문제점을 해결할 수 있으며, 성분의 용해도 및 경피흡수율을 높일 수 있어 상기 추출물로부터 기대되는 효능을 최대로 발현시킬 수 있다.
본 발명에서 나노리포좀은 통상적인 리포좀의 형태를 갖는 것으로서 평균 입자 지름이 10~500nm인 리포좀을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 나노리포좀의 평균 입자 지름은 50~300nm이며, 더욱 바람직하게는 100~200nm이다. 나노리포좀의 평균 입자 지름이 500nm를 초과하는 경우에는 본 발명에서 달성하고자 하는 기술적 효과 중 피부침투의 개선 및 제형 안정성의 개선이 매우 미약하다.
본 발명에 따라 상기 유효성분(유자씨 추출물 또는 유자씨 유래의 리모노이드 아글리콘)을 안정화하는데 사용되는 나노리포좀은 폴리올, 유성성분, 계면활성제, 인지질, 지방산 및 물을 포함하는 혼합물에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 나노리포좀에 이용되는 폴리올은 특히 제한되지 않으며, 바람직하게는 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 메틸프로판디올, 이소프로필렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 에리스리톨, 자일리톨, 솔비톨 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 10~80중량%, 바람직하게는 30~70중량%이다.
본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 유성(oil) 성분은 당업계에 공지된 다양한 오일이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 헥사데칸 및 파라핀 오일과 같은 하이드로카본계 오일, 에스테르계의 합성오일, 디메치콘 및 사이크로메치콘계와 같은 실리콘 오일, 해바라기유, 옥수수유, 대두유, 아보카도유, 참깨유 및 어유와 같은 동식물성 오일, 에톡시레이티드 알킬에테르계오일, 프로폭시레이티드 알킬에테르계오일, 피토스핑고신, 스핑고신 및 스핑가닌과 같은 스핑고노이드 지질, 세레브로사이드 콜레스테롤, 시토스테롤 콜레스테릴설페이트, 시토스테릴설페이트, C10-40 지방알콜 및 이의 혼합물이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여1.0~30.0중량%일 수 있으며, 바람직하게는 3.0~20.0중량%이다.
본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 계면활성제는 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용할 수 있다. 예를 들어, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용될 수 있다. 바람직하게는 음이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제이다. 음이온성 계면활성제의 구체적인 예는 알킬아실글루타메이트, 알킬포스페이트, 알킬락틸레이트, 디알킬포스페이트 및 트리알킬포스페이트를 포함한다. 비이온성 계면활성제의 구체적인 예는 알콕시레이티드 알킬에테르, 알콕시레이티드 알킬에스테르, 알킬폴리글리코사이드, 폴리글리세릴에스테르 및 슈가에스테르를 포함한다. 특히 바람직한 계면활성제는 비이온성 계면활성제에 속하는 폴리솔베이트류이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.1~10중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.5~5.0중량%이다.
본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 또 다른 성분인 인지질은 양쪽친화성 지질이 이용되며, 천연 인지질(예를 들어, 난황 레시틴 또는 대두 레시틴, 스핑고마이엘린) 및 합성 인지질(예를 들어, 디팔미토일포스파티딜콜린 또는 수첨 레시틴)을 포함하며, 바람직하게는 레시틴이다. 특히, 대두 또는 난황에서 추출한 천연 유래의 불포화 레시틴 또는 포화 레시틴이 바람직하다. 통상적으로 천연 유래의 레시틴은 포스파티딜콜린의 양이 23~95%, 그리고 포스파디딜에탄올아민의 양이 20% 이하이다. 본 발명의 나노리포좀의 제조에 있어서, 인지질의 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.5~20.0중량%이며, 바람직하게는 2.0~8.0중량%이다.
본 발명의 나노리포좀 제조에 이용되는 지방산은 고급 지방산으로서, 바람직하게는 C12-22 알킬 체인의 포화 또는 불포화 지방산으로서, 예컨대, 라우린산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아린산, 올레산 및 리놀레산을 포함한다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.05~3.0중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.1~1.0중량%이다.
본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 물은 일반적으로 탈이온화된 증류수이며, 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 5.0~40중량%일 수 있다.
나노리포좀의 제조는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있으나, 가장 바람직하게는 상기 성분들을 포함하는 혼합물을 고압 호모게나이저에 적용하여 제조된다. 고압 호모게나이저에 의한 나노리포좀의 제조는 소망하는 입자 크기에 따라 다양한 조건(예: 압력, 횟수 등)으로 실시할 수 있으며, 바람직하게는 600~1200bar의 압력 하에서 1~5회 고압 호모게나아저를 통과하도록 하여 나노리포좀을 제조할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물을 단독 또는 중복 도포하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복 도포하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 항산화 및 미백 효과가 우수한 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
유자씨 부위별(껍질, 씨막, 씨젖) 준비
<1-1> 유자씨 확보
본 실험에서 사용된 유자씨는 전남 고흥지방에서 2015년 11월에 생산된 유자로부터 분리하였으며, 분리된 유자씨는 흐르는 물에 2~3회 깨끗이 세척하여 이물질을 제거하고 50℃에서 하루밤 동안 건조시켜 사용하였다(도 1 참조).
<1-2> 유자씨 오일 착유
유자의 특유의 향미와 유자씨 오일의 수용성과 지용성 성분을 포함한 오일성분을 확보하기 위하여 고압의 착유공정을 통하여 확보한 오일을 착유하여 오일 획득수율을 측정하였다. 착유시 압력은 최대 600kg/㎠으로 설정하여 1시간 동안 압력을 가하였고, 유자씨의 원할한 착유공정을 위하여 600mesh(23㎛)로 압축기에서 유자씨를 1차 여과하였으며, 착유되어 나오는 유자씨의 정제를 위하여 2차 여과 1,200mesh(12㎛)를 실시하였다. 여과된 유자씨 오일에 용출되어 나온 부유물을 최종 확인하기 위하여 100시간 동안 침전시켜 최종 수율을 측정하였다. 최종 수율은 건중량 대비 11.6% 정도의 유자씨 오일을 획득하였다.
<1-3> 착유 후 유자씨 분리
착유 과정을 거치고 남은 유자씨 고형 부분을 건조한 후 껍질(노란빛을 띈 흰색), 씨막(껍질과 씨젖 사이의 갈색 막), 씨젖으로 분리하였다.
착유 과정을 거치고 남은 유자씨 고형 부분에 일정량의 수분을 공급한 뒤 20℃에서 24시간 냉동보관한 후 온풍기를 사용하여 건조하였다. 발삭기를 사용하여 유자씨를 분리하기 쉬운 형태로 세절한 뒤 마찰력을 이용하여 유자씨 껍질, 씨막, 씨젖으로 박리하고 채를 사용하여 좌우로 흔들어서 분리하였다.
<실시예 2>
유자씨 유래의 리모노이드 아글리콘 및 글루코사이드 추출
<2-1> 리모노이드 아글리콘 추출
상기 실시예 <1-3>에서 수득한 유자씨 껍질, 씨막, 씨젖을 각각 분쇄한 분쇄물(200g)에 3배 (600mL)의 에탄올을 붓고 상온에서 100 rpm으로 24시간 동안 교반하면서 추출하였다. 각각의 추출물은 여과(필터)한 후 여과액은 감압농축기를 이용하여 농축하여 리모노이드 아글리콘을 얻었다. 유자씨 껍질, 씨막, 씨젖에서 추출된 리모노이드 아글리콘은 각각 12.35g, 11.16g, 14.73g 이었으며, 최종 리모노이드 아글리콘 수율은 15.44% 이었다.
<2-2> 리모노이드 글루코사이드 분리정제
상기 실시예 <2-1>의 여과(필터) 과정에서 남은 잔류물(잔류 껍질, 잔류 씨막, 잔류 씨젖)을 물로 세척하여 각각 상온에서 그늘 건조시켰다. 건조된 잔류물(껍질, 씨막, 씨젖) 100g에 1000mL 3차 증류수를 붓고 상온에서 100rpm으로 24시간동안 shaker로 교반하였다. 교반 후 여과한 다음 여과액은 동결건조기를 이용하여 3~4일 동안 동결건조 하였다. 동결건조 된 농축물을 에탄올 100%를 사용하여 3회 세척하였으며, 감압 농축기를 사용하여 에탄올을 제거하고 최종적으로 리모노이드 글루코사이드를 얻었다. 이때, 유자씨 껍질, 씨막, 씨젖의 리모노이드 글루코사이드의 무게는 각각 8.12g, 6.10g, 7.32g 이었으며, 최종 리모노이드 글루코사이드 수율은 21.54% 으로 확인되었다.
<실험예 1>
유자씨 부위별 리모노이드 아글리콘의 항산화 효과
본 실험에서는 상기 실시예 2에서 수득한 유자씨 부위별(껍질, 씨박, 씨젖) 리모노이드 아글리콘의 항산화 효과를 살펴보았다. 항산화 활성은 ABTS 라디칼 소거 활성 및 DPPH 라디칼 소거 활성을 통해 살펴보았으며, 추가적으로 각각의 총 폴리페놀 함량을 조사하였다.
<1-1> ABTS 라디칼 소거 활성
본 실험에서는 Jeong 등의 방법 (Jeong et al., 2009)을 변형하여 측정하였다. 증류수에 용해한 7mM의 ABTS potassium persulfate 2.45mM을 1:1로 넣어 흡광도 값이 1.10±0.02이 되도록 PBS (pH 7.4)로 희석하였다. 12-16시간 동안 암소에 방치하고 라디칼 스톡 솔루션(Radical stock solution)은 희석된 용액 800μl에 농도별로 제조된 시료 200μl씩을 가하여 15분 동안 방치 후 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 아스코르브산(Sigma, USA)를 사용하였다. 추출물의 ABTS 에 대한 소거능 (IC50)은 용매만을 사용한 대조군의 흡광도를 50% 감소시키는데 필요한 농도로 나타내었다.
시료 껍질 씨박 씨젖
IC50(㎍/mL) 1000 1245 15585
유자씨 부위별 리모노이드 아글리콘의 ABTS IC50 결과
그 결과 상기 표 1에서 나타낸 바와 같이, 껍질에서 추출된 리모노이드 아글리콘의 IC50 값은 1000㎍/mL으로 항산화 활성이 가장 높았으며, 씨젖에서 추출된 리모노이드 아글리콘의 IC50 값은 15585㎍/mL로 항산화 활성이 가장 낮은 것을 확인할 수 있었다.
<1-2> DPPH 라디칼 소거 활성
DPPH는 자신이 가지는 홀수 전자 때문에 517nm에서 특징적인 흡수 스펙트럼을 가지는데 이것이 수소 원자를 제공해 주는 전자 공여체와 반응하면 hydrogen radical을 받아 phenoxy radical을 생성하게 된다. DPPH는 라디칼 상태에서 보라색을 띄고, 환원이 되면 노란색의 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine(DPPH-H)으로 변환된다. 안정한 라디칼인 DPPH는 산화방지물질로부터 전자 혹은 수소를 제공받으면 non-radical로 전환된다. DPPH법은 천연물의 수용성 혹은 유기용매 추출물의 항산화 활성 측정법으로 널리 사용하는 방법이다.
본 실험에서는 항산화 활성 측정방법 중 Blois의 (Blois, 1958) 방법을 변형하여 sample의 radical 소거능을 측정하였다. 95% 에탄올에 용해시킨 0.1 mM DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, Sigma, USA) 800μl와 각 실험군 200μl을 E.P tube 에 넣고 3분간 볼텍싱하여 암실에서 30분간 반응시켰다. 남아 있는 라디칼의 농도를 UV-Visible spectrophotometer (SCINCO, Seoul, Korea)를 사용하여 517nm에서 측정하였으며, 양성 대조군으로는 아스코르브산(Sigma, USA)를 사용하였다. 시료의 DPPH에 대한 소거능 (IC50)은 용매만을 사용한 대조군의 흡광도를 50% 감소시키는데 필요한 농도로 나타내었다.
시료 껍질 씨박 씨젖
IC50(㎍/mL) 4648 6257 57157
유자씨 부위별 리모노이드 아글리콘의 DPPH IC50 결과
그 결과 상기 표 2에서 나타낸 바와 같이, 껍질에서 추출된 리모노이드 아글리콘의 IC50 값은 4648㎍/mL으로 항산화 활성이 가장 높았으며, 씨젖에서 추출된 리모노이드 아글리콘의 IC50 값은 57157㎍/mL로 항산화 활성이 가장 낮은 것을 확인할 수 있었다.
<1-3> 유자씨 부위별 리모노이드 아글리콘의 총 폴리페놀의 활성
총 폴리페놀 함량은 수정된 Folin-Denis법을 사용하여 측정하였다. 각 시료를 농도별로 희석시켜, 시료 1mL에 0.2N Folin & Ciocalteus phenol reagent 1 mL, 2% Na2CO3 1mL을 가하여 혼합한 후 실온에서 30분간 반응시켰다. UV-VIS spectrophotometer을 사용하여 750nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 gallic acid를 사용하여 검량선을 얻은 후, 검량선으로부터 total polyphenol 함량을 측정하였다. 농도별로 준비된 시료 0.125 mL에 증류수를 0.5ml와 folin-ciocalteu's phenol reagent 0.125 mL 첨가하여 6분간 반응시켰다. 반응 후 7% sodium carbonate solution 1.25 mL과 증류수 3ml 첨가하여 90분간 반응시킨 후 분광광도계를 사용하여 760nm에서 OD값을 측정하였다. 갈산(Gallic acid)를 사용하여 작정한 standard curve으로부터 총 폴리페놀 함량을 계산하였다.
시료 껍질 씨박 씨젖
(GAE* mg/g) 7.0842 5.7348 1.4099
유자씨 부위별 리모노이드 아글리콘의 총 폴리페놀 함량
그 결과 상기 표 3에서 나타낸 바와 같이, 껍질에서 추출된 리모노이드 아글리콘의 총 폴리페놀 함량은 7.0842 GAE*mg/g으로 가장 높았으며, 씨젖에서 추출된 리모노이드 아글리콘의 총 폴리페놀 함량은 1.4099 GAE*mg/g으로 가장 낮은 것을 확인할 수 있었다.
상기와 같은 실험 결과를 통해 유자씨 부위별 리모노이드 아글리콘의 항산화 활성은 껍질>씨박>씨젖 순으로 높은 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 2>
유자씨 유래의 리모노이드 아글리콘의 HPLC 분석
상기 실시예 <2-1>을 통해 수득한 유자씨 유래의 리모노이드 아글리콘을 이용 HPLC 분석을 실시하여 기준물질을 분석하였고, 기준물질의 retention time을 비교하여 함량 및 함유 여부를 확인하였으며, 분석 조건은 아래 표에 정리하였다.
Column XBridge C18 5μm (4.6 x 150mm)
Flow rate 1.0 ml/min
Solvent A Water (0.01% Phosphoric acid)
Solvent B Methanol (0.01% Phosphoric acid)
Mobile phase 20-70% B 50min
Time 50 min
Temperature R.T.
Detection Wavelength 220nm
Injection volume 20 μl
리모노이드 아글리콘 HPLC 분석기준
그 결과 하기 표 5 및 도 5에서 나타낸 바와 같이, Limonin과 nomilin으로 만든 standard mixture를 HPLC 분석 결과 limonin은 29분에, nomilin은 35분에 확인되었다. 유자 씨껍질, 씨박, 씨젖에서 추출된 리노모이드 아글리콘에서 limonin과 nomilin 모두 29분, 35분에 확인되었다.
No. Standard 씨껍질 씨박 씨젖
Name R. Time ppm R. Time ppm R. Time ppm R. Time ppm
1 Limonin 29.546 100 29.439 641.4 29.845 315.5 29.347 595.1
2 Nomilin 35.142 100 35.119 538.7 35.519 690.7 35.014 1725.8
리모노이드 아글리콘 정량 결과
<실험예 3>
유자씨 유래의 리모노이드 아글리콘의 HPLC/MS 분석
상기 실시예 <2-1>을 통해 수득한 유자씨 유래의 리모노이드 아글리콘을 이용 HPLC/MS 분석을 실시하였으며, 그 결과 도 6에서 나타낸 바와 같이, limonin, nomilin, deacetylnomilin, obacunone 및 limonate A-ring lactone 물질 함유 여부를 확인하였으며, 분석 조건은 아래 표에 정리하였다.
Column Agilent EclipsePluseC18 RRHD column (50mm x 2.1 mm, 1.8 μm)
Flow rate 0.300 mL/min
Solvent A Water (0.1% Formic acid)
Solvent B Acetonitrile (0.1% Formic acid)
Mobile phase 2% B 0min, 2% B 2min, 60% B 13min, 60% B 16min, 2% B 18min, 2% B 20min
Time 20 min
Temperature 40℃
Injection volume 3 μl
Ion Source Dual AJS ESI
Polarity (kV) (+) 4.0, (-) 3.5
Mass Rages (m/z) 20 - 1000
Scan Rate (spectra/sec) 1 spectra/sec
Reference masses (m/z) 112.9856 and 966.0007
리모노이드 아글리콘 HPLC/MS 분석기준
<실험예 4>
유자씨 유래 리모노이드의 세포독성 평가
상기 실시예 2를 통해 수득한 유자씨 유래 리모노이드 아글리콘/ 리모노이드 글루코사이드의 세포독성을 평가하였다.
실험에서 사용한 세포주인 B16/F10(murine melanoma) 세포주는 한국세포주은행(KCLB)에서 분양받았다. 구입한 세포는 5% FBS, 1% penicillin streptomycin, 1μg/mL 농도의 α-MSH(α-Melanocytestimulating hormone)를 첨가하여 37℃, 4 % CO2 배양기에서 배양하였다.
MTT assay는 Tetrazolium dye를 이용하여 세포의 NAD(P)H-dependent oxidoreductase enzymes 에 환원되어 색이 변하는 것을 측정하는 방법으로서 세포의 성장 또는 사멸을 측정하는 방법이다. 즉, 세포가 살아있으면 염색약 MTT를 환원시켜 색이 변하게 되지만, 세포가 죽어 있거나 성장을 멈추게 되면 염색약을 환원시키지 않게 된다. 이러한 원리를 이용하여 유자씨 유래 리모노이드 아글리콘/ 리모노이드 글루코사이드를 함유하는 추출물의 독성을 검사할 있으며, 색깔의 변화를 간접적으로 측정하였다.
세포독성평가를 위해 세포주를 12 웰 플레이트에 각각 1×104 cells/well을 접종하고 24시간 동안 배양하였다. 농도별(25μg/mL 50μg/mL, 100μg/mL)로 시료를 처리하고 24시간 배양 후 배양이 끝난 세포에 MTT stock용액 (5mg/mL)을 배양배지 부피에 최종적으로 1/10 되게 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응 후 배양 상등액을 제거하고 각각의 웰(well)에 DMSO 200 uL를 첨가하여 세포에서 생성된 MTT-formazan 결정체를 용해시킨 후 ELISA readeer 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 도 7a에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 유자씨 유래 리모노이드 아글리콘의 경우 100μg/mL의 농도까지 세포독성이 전혀 없는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 본 발명의 유자씨 유래 리모노이드 글리코사이드의 경우 50μg/mL의 농도까지 세포독성이 없었으며, 100μg/mL 농도에서 세포생존률이 다소 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 7b 참조).
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 유자씨 유래 리모노이드 아글리콘이 세포독성이 거의 없어, 안전성 면에서 우수한 것을 확인할 수 있었다.
이에, 하기 미백 활성 실험에서는 세포 안전성이 우수한 본 발명의 유자씨 유래 리모노이드 아글리콘을 이용하였다.
<실험예 5>
유자씨 유래 리모노이드 아글리콘의 미백활성 평가
상기 실시예 2를 통해 수득한 유자씨 유래 리모노이드 아글리콘의 미백활성을 평가하기 위하여, 본 발명의 리모노이드 아글리콘 처리에 따른 세포 내 멜라닌 함량 분석 및 세포 내 미백활성 관련 단백질(티로시나아제, TRP-1, TRP-2)의 발현량의 변화를 확인하였다.
<5-1> 멜라닌 함량 분석
생성된 멜라닌을 정량하기 위해 6-웰 플레이트에 B16/F10 멜라노마 세포를 1×105 cell/well의 농도로 분주하고 37℃, 5％ CO2 조건에서 하루 동안 배양하였다. 이어서 자극제인 α-MSH (1μg/ml)과 농도별(25μg/mL 50μg/mL, 100μg/mL) 시료를 처리하고 3일간 배양하였다. 배양한 세포를 5분간 원심분리하여 얻은 세포 침전물을 1mL의 PBS로 용해시켰다. 여기서 얻은 펠렛(pellet)에 1 N NaOH(+10% DMSO) 용액을 200uL를 첨가하여 용해시킨 후 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 무처리군을 대조군으로 하였으며, 알부틴 처리군(arbutin 100μg/ml)은 양성대조군으로 사용하였다.
그 결과 도 8a에서 나타낸 바와 같이, 1000 nM α-MSH를 처리한 경우 무처리군(100%)에 비해 멜라닌 양이 63.79% 증가하였으며, α-MSH 1000 nM을 유자씨에서 추출한 리모노이드 아글리콘을 농도별(25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL)로 처리한 실험군에서는 무처리군 기준으로 각각 14.1%와 39.3%로 감소하는 것을 확인하였다.
<5-2> 미백활성 관련 단백질(티로시나아제, TRP-1, TRP-2)의 발현량 변화
B16F10 cell suspension을 100 π tissue culture dish에 각 웰(well)당 1×105 cells/㎖ cells로 가한 후 24시간 동안 배양하여 세포를 안정화시킨 후, 본 발명의 리모노이드 아글리콘을 농도별(25, 50μg/mL)로 처리하였다. 배양이 끝난 세포를 2~3회 PBS로 세척 후 용해 버퍼(lysis buffer)를 첨가해 새포를 용해시킨 후 13,000 rpm 에서 10분간 원심분리 하였다. 단백질의 정량은 Bradford법을 이용해 측정하였다. 간략하게는, 20㎍의 단백질을 10% sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE)로 변성 분리하고, 이를 polyvinyildene difluoride (PVDF) membrane에 transfer 시킨다. membrane을 blocking 시킨 후, 2.5% nonfat dry milk가 함유된 Tris-buffered saline with 0.2% Tween-20 (TBST)에 1 차 항체를 넣고 상온에서 1시간 30분 혹은 4℃에서 24시간 반응시킨다. 1차 항체와 반응시킨 membrane을 PBST로 3회 세척하고 2차 항체와 상온에서 1시간 30분 반응시킨 뒤에 PBST로 3회 세척하여 ECL advance detection system으로 각 band의 양상을 확인하였다.
그 결과 도 9에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 리모노이드 아글리콘을 세포에 처리한 경우 미백활성의 핵심 단백질 마커인 티로시나아제, TRP-1, TRP-2 모두 처리 농도에 의존적으로 단백질 발현량이 감소하는 것을 확인하였으며, 이와 같은 결과로 보았을 때 본 발명의 리모노이드 아글리콘는 미백활성이 매우 높은 것으로 판단되었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (7)

  1. 유자씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 유자 씨껍질, 씨박 및 씨젖으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 추출물인 것을 특징으로 미백용 화장료 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 물 및 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매로 추출된 것을 특징으로 미백용 화장료 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
  5. 유자씨 유래의 리모노이드 아글리콘을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 유자씨 유래의 리모노이드 아글리콘은 리모닌(limonin), 노미린(nomilin), 오바쿠논(obacunone), 디아세틸노미린(deacetylnomilin) 및 리모네이트 에이-링 락톤(limonate A-ring lactone)을 포함하는 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 밀크로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 수중유 형 에멀젼, 유중수 형 에멀젼, 페이스크성 무수 생성물, 고체 무수 생성물, 소구체를 사용한 수성 상에서의 오일 분산물, 이온성 지질 소포체, 비이온성 지질 소포체, 연고, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 보디오일, 수중유 형 메이크업베이스, 유중수 형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이섀도우, 마스카라, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종의 제형인 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
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