KR101802341B1 - 어리연꽃 속 식물의 추출물을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 어리연꽃 속 식물의 추출물을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 어리연꽃 속 식물의 추출물이 피부 염증 개선, 피부 노화 방지, 피부 보습 개선, 피부 미백 또는 주름을 방지하는 효과를 가짐으로서 피부를 개선시킬 수 있는, 어리연꽃 속 식물의 추출물을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화장료 조성물은 어리연꽃 속 식물의 추출물을 유효성분으로 포함함으로서, 항산화, 피부 염증 개선, 피부 노화 방지, 자외선으로부터 피부 보호, 피부 보습 개선, 피부 미백 개선, 피부 주름 개선 등의 다양한 효과를 가지는바, 피부를 현저히 개선시킬 수 있다.

Description

어리연꽃 속 식물의 추출물을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION COMPRISING EXTRACT OF PLANT BELONGING TO THE GENUS NYNPHOIDES FOR IMPROVING SKIN}

본 발명은 어리연꽃 속 식물의 추출물을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 어리연꽃 속 식물의 추출물이 항산화, 피부 염증 개선, 피부 노화 방지, 피부 보습 개선, 피부 미백 또는 주름을 방지하는 효과를 가짐으로서 피부를 개선시킬 수 있는, 어리연꽃 속 식물의 추출물을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 신체 중 가장 큰 기관으로 항상 외부환경과 직접 접하고 있으면서 여러가지 자극이나 건조한 환경으로부터 생체를 보호하는 보호막의 역할을 하고 있으며, 다른 기관에 비하여 새로운 세포의 생성과 소멸이 활발히 일어나는 기관이다. 또한, 물리적인 찰과상으로부터 신체를 보호하고, 신체 내부의 수분의 손실을 막아주며 태양에서 발생되는 자외선으로부터 보호해주고, 몸의 체온을 조절해주는 데 매우 중요한 역할을 담당하고 있다.

그러나 최근 들어, 환경오염으로 인해 지표면에 도달하는 자외선 양의 증가와 함께 야외 활동시간의 증가, 서구화된 생활습관 및 스트레스와 같이 피부건강을 위협하는 요인들이 증가하고 있다. 이러한 요인들은 피부에 오염, 건조, 트러블, 또는 피부면역체계 이상을 가져오며, 결국 피부염, 거칠음, 급격한 노화 등을 야기한다.

피부 보호에 대한 중요성이 커지면서 기능성 화장품에 대한 수요가 증가하고 있는데, 피부 보습, 주름, 노화, 염증, 미백 등 너무 많은 보호 작용이 필요하기 때문에 각 보호 작용을 하는 기능성 화장품을 각 기능별로 개별적으로 준비해야 하는 불편함이 있다. 개별적으로 준비해야 할 경우 비용도 많이 들고, 보관 및 사용이 번거로워 불편함이 있으며, 피부에 덧발라야 하는 제품의 수가 늘어나기 때문에 나중에 바르는 제품의 성분은 흡수가 제대로 안될 수도 있다. 한국등록특허 제10-1325464호 같이 미백 또는 주름 개선 효과를 복합적으로 가지는 특허가 있으나, 가장 기본적인 효과인 보습 기능이 없고, 최근 들어 급증하고 있는 피부 염증을 개선시킬 수 없다.

따라서, 피부 미백, 주름 개선 뿐 만 아니라, 피부 보습 개선, 피부 염증 개선 등 다양한 효과를 지니는 새로운 물질을 개발할 필요가 있다.

한국등록특허 제10-1325464호 (2012.11.06. 공개)

이에 본 발명자는 피부의 다양한 문제점을 동시에 해결할 수 있는 물질을 찾던 중, 어리연꽃 속에 속하는 식물의 추출물이 피부의 다양한 문제를 개선시킬 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 어리연꽃 속 식물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 어리연꽃 속(Nymphoides sp.) 식물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 어리연꽃 속 식물은 어리연꽃(Nymphoides indica), 노랑어리연꽃(Nymphoides peltata), 좀어리연꽃(Nymphoides coreana) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나일 수 있다.

상기 피부 개선은 항산화, 피부 염증 개선, 피부 노화 방지, 자외선으로부터 피부 보호, 피부 보습 개선, 피부 미백 개선, 피부 주름 개선 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 추출물은 물, 알코올, 메탄올, 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 클로로포름, 글리세린 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 용매로 추출될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 어리연꽃 속 식물의 추출물을 유효성분으로 포함함으로서, 항산화, 피부 염증 개선, 피부 노화 방지, 자외선으로부터 피부 보호, 피부 보습 개선, 피부 미백 개선, 피부 주름 개선 등의 다양한 효과를 가지는바, 피부를 현저히 개선시킬 수 있다.

도 1은 실시예 1 및 3의 농도별 ABTS 라디칼 소거능을 나타내고, 비타민 C는 양성대조군이다.
도 2는 실시예 1 및 3의 농도별 잔틴산화효소(XO, Xanthine Oxidase)의 활성 저해능을 나타내고, 비타민 C는 양성대조군이다.
도 3은 실시예 1 내지 4의 농도별 SOD 유사 활성능을 나타낸다(명도 순(밝음에서 어두움)에 따라, 실시예 2, 실시예 1, 실시예 4 및 실시예 3을 의미함).
도 4는 실시예 1 및 3의 농도별 DPPH 라디칼 소거능을 나타내고, 비타민 C는 양성대조군이다.
도 5는 실시예 1 및 3의 농도별 엘라스타제 저해능을 나타내고, EGCG(Epigallocatechin-3-gallate)는 양성대조군이다.
도 6은 실시예 3 및 4의 자외선에 대한 세포 보호 효과를 나타내고, EGCG(Epigallocatechin-3-gallate)는 양성대조군이다(Blank : 자외선 A를 조사하지 않고, 실시예 또는 EGCG를 처리하지 않은 대조군 / UVA : 자외선 A를 조사하고, 실시예 또는 EGCG를 처리하지 않은 음성 대조군).
도 7은 실시예 1 및 3의 농도별 일산화질소 생성 억제능을 나타내고, 비타민 C는 양성대조군이다.
도 8은 실시예 1 및 3의 농도별 PGE2(프로스타글란딘 E2)의 발현 억제 효과를 나타내고, PDTC(Pyrrolidine dithiocarbamate)는 양성대조군이다.
도 9는 실시예 1 및 3의 농도별 티로시나제 저해능을 나타내고, 비타민 C는 양성대조군이다.
도 10은 실시예 1 및 3이 티로시나제 단백질 발현을 억제하는 것을 웨스턴 블랏(Western Blot)으로 분석한 전기영동 사진 및 티로시나제 단백질 발현량을 정량ㅇ비교 분석한 결과이다(Nor : α-MSH 및 실시예를 처리하지 않은 대조군 / Cont : α-MSH만 처리하고 실시예는 처리하지 않은 음성 대조군).
도 11은 실시예 1 및 3이 농도별로 AQP3의 발현에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다(Nor : 아무것도 처리하지 않은 대조군 / Cont : TNF-α와 INF-γ만 처리하고 실시예는 처리하지 않은 음성 대조군).

본 발명은 어리연꽃 속(Nymphoides sp.) 식물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 어리연꽃 속 식물은 모든 어리연꽃 속 식물일 수 있고, 이에 한정되지 않으나, 어리연꽃(Nymphoides indica), 노랑어리연꽃(Nymphoides peltata), 좀어리연꽃(Nymphoides coreana) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 어리연꽃 추출물 및 노랑어리연꽃 추출물을 유효성분으로 포함함으로서 항산화, 피부 염증 개선, 피부 노화 방지, 자외선으로부터 피부 보호, 피부 보습 개선, 피부 미백 개선, 또는 피부 주름 개선 등에 있어서 상승 효과를 가질 수 있다.

어리연꽃(Nymphoides indica)은 진흙 속에서 잔뿌리가 사방으로 퍼지고 긴 잎자루 끝에 1~3개의 잎이 달려있다. 잎은 물 위에 뜨고 원심형이며 한쪽이 깊게 갈라지고 가장자리가 밋밋하다. 꽃은 8워에 피고 흰 바탕에 중심부는 황색이며 10여개가 잎자루의 밑부분으로 싸여서 달려있다. 어리연꽃은 금은련화라는 생약명으로 불리우기도 하며, 전통적으로 생진(生津), 양위(養胃) 등의 효능으로 구갈(口渴), 구건(口乾) 등의 병을 치료하는데 사용됐었다.

노랑어리연꽃(Nymphoides peltata)은 뿌리줄기가 물밑의 흙속에서 옆으로 뻗고 줄기는 실 모양으로 길게 자란다. 잎은 긴 잎자루가 있고 물 위에 뜨며, 넓은 타원형으로 지름 5~10 cm 이고, 밑부분이 2개로 갈라지지만 붙어 있는 것도 있다. 7~8월에 노란색 꽃이 피는데, 산형꽃차례(傘形花序)로 마주난 잎겨드랑이에서 2~3개의 꽃대가 나와 2~3 송이가 물 위에 핀다.

좀어리연꽃(Nymphoides coreana)은 다년생 수초로 물 및 질흙에 나고, 줄기가 가늘고 길며, 1~2개의 잎이 물 위에 뜬다. 잎은 타원상 심장형 또는 지름 2~6cm의 원심형으로 밑은 깊이 갈라지며 가장자리는 밋밋하고 엽병은 길이가 1~10cm이다. 꽃은 6~7월에 백색으로 피고 엽병 기부 마디에 속생하며 소화경은 길이가 1~3cm이다. 꽃받침 조각은 넓은 피침형으로 끝이 뾰족하고 길이가 3~4mm이며 화관은 4~5개로 갈라진다. 또한, 가장자리에 짧은 연모(緣毛)가 있고 수술은 5개이며 과실은 삭과로 길이 4~5mm의 타원형이고, 종자는 평활하고 광택이 있다.

본 발명의 어리연꽃 속 식물의 추출물은 이에 한정되지 않지만, 물, 에탄올, 메탄올, 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 클로로포름, 글리세린 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 용매로 추출될 수 있고, 바람직하게는 에탄올, 메탄올 또는 이의 혼합 용매일 수 있다.

또한, 본 발명의 어리연꽃 속 식물의 추출물은 이에 한정되지 않으나, 식물의 꽃, 잎, 줄기, 열매, 종자, 뿌리 및 전초를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부위에서 추출될 수 있고, 바람직하게는 전초에서 추출될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 피부를 개선시킬 수 있는데, 상기 피부 개선은 항산화, 피부 염증 개선, 피부 노화 방지, 자외선으로부터 피부 보호, 피부 보습 개선, 피부 미백 개선, 피부 주름 개선 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

어리연꽃 속 식물 추출물은 ABTS 라디칼을 제거하고, 잔틴산화효소(Xanthine oxidase)의 활성을 억제하며, SOD 유사 활성을 가짐으로써 항산화 작용을 할 수 있다. 호기성 생물체는 산소를 이용하여 에너지 대사를 진행하는데, 생체 내 산소가 각종 물리적, 화학적 및 생물학적인 스트레스를 받으면 O₂ ^-(superoxide), NO·(nitric oxide), NO₂·(nitrogen dioxide), OH·(hydroxyl), ROO·(proxyl), RO·(alkoxyl), NO₃·(peroxynitrite), ABTS⁺ 등의 라디칼(radical) 같은 유해한 활성 산소종(active oxygen species)으로 변하여 인체에 치명적인 생리적 장애를 일으킨다. 상기와 같은 활성 산소종은 세포생체막의 구성성분인 불포화 지방산을 공격하여 과산화 반응을 일으키고 이러한 과산화 반응을 막는 것을 항산화(antioxidation) 작용이라 한다. 상기와 같은 라디칼로부터 생체를 방어하기 위한 수단으로써 수퍼옥사이드 디스무타제(SOD, superoxide dismutase), 카탈라제(CAT; catalase), 글루타치온 퍼옥시다제(GSHpx; glutathione peroxidase) 등의 항산화 효소나 비타민 E, 글루타치온 등의 항산화 물질이 존재하여 유리기를 제거함으로써 생체를 산화적 손상으로부터 보호한다. 또한, 크산틴 산화효소(Xanthine oxidase, XO)는 퓨린 크산틴 (purines hypoxanthine)과 크산틴(xanthine)을 산화시켜 요산(uric acid)을 형성하는 효소로써 통풍으로 알려진 질환의 원인이기도 하다. 통풍은 관절부위에 요산의 침착으로 동통을 동반한 염증이라고 할 수 있다. 그러므로 크산틴 산화효소의 저해는 통풍을 진정시킨다(Chiang et al., Journal of Enzyme Inhibition, 8, pp 61-71, 1994). 크산틴 산화효소는 살아 있는 세포에서 산화적인 손상에 작용되는 산소 파생 자유라디칼의 생물학적 원인이 된다. 이와 같이 다양한 산화적인 손상은 염증, 동맥경화, 암 그리고 노화를 포함한 많은 병리학적 질환을 일으킨다(Cos P et al., Journal of Natural Products, 61, pp71-76, 1998). 크산틴 산화효소의 저해는 통풍이나 다른 크산틴 산화효소-유도 질환의 치료에 이용될 수 있는 가능성이 증명되었다(Goodman Gilman A et al., Pharmacological Basis of Therapeutics (eighth edition), pp 674-681, 1990).

어리연꽃 속 식물 추출물은 일산화질소 및 프로스타글란딘 E2의 발현을 억제한다. 염증 반응은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균 감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상 부위를 수복 재생하려는 기전으로서, 일산화질소는 감염 초기에 생체 방어에 중요한 역할을 하고, 급성 또는 만성 염증반응을 조절하기도 하며, 프로스타글란딘 E2는 염증매개물질이다. 따라서, 일산화질소 또는 프로스타글란딘 E2의 생성을 억제하면 염증반응을 완화할 수 있다.

어리연꽃 속 식물 추출물은 엘라스타아제 활성을 억제하고, 자외선으로부터 피부를 보호하며, 이러한 작용들로 인해 피부 노화 및 주름을 방지할 수 있고, 주름을 개선시킬 수도 있다.

주름은 특정 방향으로의 근육 운동과 이 운동의 장기적 누적에 의해 형성되고 가속화되며, 이 밖에 노화, 환경적인 영향, 특히 자외선에의 노출 등의 다양한 인자들에 의해 더욱 촉진된다. 엘라스틴은 탄성 섬유로서 고무와 같은 탄성을 지니고 있어, 작은 힘에도 쉽게 변형되고 그 힘이 제거되면 다시 원래의 형태로 돌아오는 특성이 있다. 따라서 엘라스틴은 피부 탄력 및 주름 개선에 매우 중요한 물질이다. 따라서 알레스틴을 분해하는 엘라스타제의 활성을 억제하면 피부 탄력 및 주름을 개선시킬 수 있다.

어리연꽃 속 식물 추출물은 아쿠아포린의 발현을 증가시킨다. 아쿠아포린은 막 단백질의 일종으로 수분통로 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다(Proc. Nadl. Acad. Sci. USA 91:6255 (1994). 최초의 아쿠아포린은 1991년 피터 아그레에 의해서 정확하게 규명되었고 이로 인해 아그레는 2003년 노벨상을 수상하였다(Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Dec 15;88(24):11110). 아쿠아포린 패밀리는 여러 종류가 알려졌으나 이들 중 아쿠아포린-3가 수분 통로에 가장 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있어서 아쿠아포린-3를 활성화시키는 물질에 대한 연구가 활발하다. 아쿠아포린-3를 활성화시키는 물질은 피부의 보습기능과 연관이 있기 때문이다(Journal of Investigative Dermatology 131:865, 2011).

어리연꽃 속 식물 추출물은 티로시나제(tyrosinase)의 활성 및 발현을 억제한다. 멜라닌 생성 메커니즘은 세포 내의 티로신(tyrosine)을 기질로 하여 티로시나제(tyrosinase)라는 효소가 도파퀴논(DOPAquinone)을 생성시키며, 도파퀴논으로부터 자동산화 반응과 효소 반응을 거쳐 공중합체인 멜라닌이 생성된다. 이렇게 생성된 멜라닌은 멜라노좀이라는 주머니를 통해 케라티노사이트(keratinocyte)로 옮겨지게 되고 케라티노사이트에서 28일간의 각화 과정을 거치면서 피부표면으로 나오게 된다. 그러나 이 과정에서 멜라닌 생성을 촉진하는 요인에 의해서 멜라닌이 과량 생성되고 각화에 의해 멜라닌이 완전히 없어지지 않으면 색소침착(pigmentation) 현상이 나타나게 된다. 따라서 이러한 색소 침착 현상을 막아주기 위해서는 멜라닌 생성 과정에서의 일부 과정을 조절해 줌으로써 억제할 수가 있다. 멜라닌의 생합성에 관여하는 중요한 효소로는 티로시나제(tyrosinase), 티로시나제 관련 단백질 1(tyrosinase related protain 1, TRP1), 도파크롬 타우토메라제(dopachrome tautomerase) 등이 있으나, 멜라닌 합성에 결정적인 역할을 하는 효소는 티로시나제이다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 어리연꽃 속 식물의 추출물을 유효성분으로 포함하며, 피부학적으로 허용가능한 부형제와 함께 기초 화장품 조성물 (화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼 및 클렌징 워터와 같은 세안제, 팩, 보디오일), 색조 화장품 조성물 (화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스), 두발 또는 두피 제품 조성물(샴푸, 린스, 헤어컨디셔너, 헤어젤) 및 비누 등의 형태로 제조될 수 있다.

상기 부형제로는 이에 한정되지는 않으나 예를 들어, 피부연화제, 피부 침투 증강제, 착색제, 방향제, 유화제, 농화제 및 용매를 포함할 수 있다. 또한, 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제 및 보습제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 물성개선을 목적으로 점증제, 무기염류, 합성 고분자 물질 등을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화장료 조성물로 세안제 및 비누를 제조하는 경우에는 통상의 세안제 및 비누 베이스에 본 발명의 바이아릴아미드 유도체를 첨가하여 용이하게 제조할 수 있다. 크림을 제조하는 경우에는 일반적인 수중유적형 (O/W)의 크림베이스에 본 발명의 바이아릴아미드 유도체를 첨가하여 제조할 수 있다. 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등과 물성개선을 목적으로 한 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 추가로 첨가할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 함유되는 어리연꽃 속 식물 추출물의 함량은 이에 한정되지 않지만, 전체 조성물 총중량에 대하여 0.001 내지 10 중량%인 것이 바람직하고, 0.01 내지 5 중량%인 것이 더욱 바람직하다. 상기 함량이 0.001중량% 미만에서는 목적하는 본 발명의 효과를 기대할 수 없고, 10중량% 초과에서는 안전성 또는 제형상의 제조에 어려움이 있을 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형은 이에 한정되는 것은 아니나 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 바디크림, 마사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 트리트먼트, 미용액, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예의 제조 >

실시예 1 : 어리연꽃 에탄올 추출물의 제조

어리연꽃(Nymphoides indica)전초 50g에 500ml의 70% 에탄올을 넣고, 상온에서 24시간 동안 침지 시킨 후, 추출액을 거름종이로 여과하였다. 여과된 여과액을 농축기를 통하여 용매를 휘발시킨 뒤 동결 건조하여 어리연꽃의 에탄올 추출물을 제조하였다.

실시예 2 : 어리연꽃 메탄올 추출물의 제조

추출용매로 80% 메탄올을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 어리연꽃 메탄올 추출물을 제조하였다.

실시예 3 : 노랑어리연꽃 에탄올 추출물의 제조

노랑어리연꽃(Nymphoides peltata)을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 노랑어리연꽃의 에탄올 추출물을 제조하였다.

실시예 4 : 노랑어리연꽃 메탄올 추출물의 제조

추출용매로 80% 메탄올을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 노랑어리연꽃 메탄올 추출물을 제조하였다.

< 실험예 : 피부 개선 효과 검증 >

실험예 1. 항산화 활성 검증

< 1-1 > ABTS 라디칼 소거능 측정

ABTS radical을 이용한 항산화력 측정은 ABTS+· cation decolorization assay방법40)에 의하여 측정하였다. 7mM 2,2 - azino - bis (3 - ethyl - benthiazoline - 6 - sulfonic acid)와 2.4mM potassium persulfate를 혼합하여 실온에서 24시간 동안 방치하여 ABTS+·를 형성시킨 후 ethanol로 희석하여 ABTS+· 100uL에 시료 100uL를 가하여 1분 동안 방치한 후 732nm에서 흡광도를 측정하였다. 1000 ㎍/㎖ 농도로 비타민 C를 처리한 군의 소거능을 100%로 하여, 다른 실험군들의 결과를 상대적으로 계산하였고, 그 결과를 도 1에 기재하였다.

상기 도 1에서, 농도 의존적으로 실시예 1 및 3의 ABTS 라디칼 소거능이 증가하는 것을 확인할 수 있고, 1000 ㎍/㎖ 농도에서는 비타민 C와 비슷한 수준으로 소거능을 갖는 것을 알 수 있다.

< 1-2 > xanthine oxidase(XO, 잔틴산화효소)의 활성 저해능

Xanthine oxidase에 의해 생성된 superoxide radials 소거 활성은 NBT(nitro-blue tetrazolium) 환원법을 사용하여 분석하였다. 각 시료용액 0.1ml와 0.1M potassium phosphate buffer(pH 7.5) 0.6ml에 xanthine(2mM)을 녹인 기질액 0.2ml를 첨가하고 xanthine oxidase(0.2U/ml) 0.1ml를 가하여 37℃에서 15분간 반응시킨 후 1N HCl 1ml를 가하여 반응을 종료시킨 다음 반응액 중에 생성된 uric acid의 양을 292nm에서 흡광도를 측정하였다. Xanthine oxidase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. 한편, 비타민 C는 실시예와 같은 농도로 조제하여 동일한 방법으로 흡광도를 측정함으로써 비교하였다. 농도별 시료에 따른 NBT 환원에 대한 저해능은 다음과 같은 식으로 계산하였다.

* B(Blank) : 0.8mM xanthine 포함한 0.1 mM buffer(pH 8.0)와 69mM SDS만 첨가한 반응액의 흡광도

* C(control) : 시료(실시예, 비타민 C) 대신 0.48mM NBT를 첨가한 반응액의 흡광도

* S(Sample) : 실시예 1, 실시예 3, 또는 비타민 C를 첨가한 반응액의 흡광도

상기 측정된 흡광도를 도 2에 기재하였다. 실시예 1 및 3은 모두 비타민 C보다 더 우수한 저해능을 보였고, 특히 실시예 2의 XO 저해능은 실시예 1 및 비타민 C보다 현저히 우수하였다.

< 1-3 > SOD 유사 활성능

각각의 실시예 1~4가 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖의 농도로 있는 각 시료 용액 20㎕에 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 분석 키트(SOD assay kit-WST)의 더블류에스티 작업용액(WST working solution) 200㎕을 넣어 교반한 후, 다시 효소작업용액(Enzyme working solution) 20㎕를 넣어 혼합한 후, 37℃ 인큐베이터에서 20분간 반응시키고, 마이크로플레이트 계수기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험 대조구로는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide dismutase, 100 units)을 사용하였으며, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 유사활성은 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 처리 그룹 대비 시료용액의 첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. 측정 결과는 도 3에 기재하였다.

상기 도 3에서 어리연꽃 속 식물 추출물의 농도 의존적으로 SOD 유사 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 특히 100 ug/ml 처리 시 SOD 처리 구와 거의 동일한 효능을 나타내었으며, 어리연꽃 추출물이 노랑어리연꽃 추출물보다 SOD 활성이 더 높은 편이었고, 추출 용매 간에 활성의 차이는 크지 않았다.

< 1-4 > DPPH 라디칼 소거능

실시예 1 및 3의 농도별 용액 100㎕ 에 5×10^-4 M의 DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 100㎕를 넣고, 1분간 교반한 후, 25℃ 인큐베이터에서 30분간 반응시켜 마이크로플레이트 계수기를 이용하여 517nm에서 흡광도를 측정하는 방법으로 진행하였다. 양성 대조군으로 비타민 C를 사용하였으며, DPPH 라디칼 소거능은 시료(실시예, 비타민 C)를 넣지 않은 대조구의 흡광도를 기준으로, 흡광도의 감소율로 나타내었다. 결과는 도 4에 기재하였다.

실험예 2. 주름개선 및 자외선으로 인한 손상 복구 활성 검증

< 2-1 > 엘라스타아제(elastase) 활성 억제 시험

진피조직의 유연성에 관여하는 엘라스틴(elastin)을 분해하여 주름생성을 촉진시키는 엘라스타아제의 활성억제 효과를 시험하였으며, 하기의 방법으로 시험하였다. 기질로서 N-succinyl- (L-Ala)₃-p-nitroanilide를 사용하여 37℃에서 20분간 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 445nm에서 측정하였다. 즉, 각 시험용액을 일정 농도가 되도록 조제하여 0.5ml씩 시험관에 취하고, 50mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 porcine pancreas elastase (2.5U/ml)용액 0.5ml을 가한 후 기질로 50mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 N-succinyl-(L-Ala)₃-p-nitroanilide (0.5㎎/ml)을 첨가하여 20분간 반응시켜 측정한다. Elastase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. 도 5에 음성대조군으로 주름개선 원료가 첨가되지 않았을 때와 비교하여, 실시예 및 양성대조군의 농도 증가에 따른 엘라스타아제 억제효율(%)을 나타내었다.

상기 도 5에서, 실시예 1 및 3이 농도 의존적으로 엘라스타제 활성을 저해하는 것을 확인할 수 있다.

< 2-2 > 자외선에 대한 세포 보호 효과

사람 섬유아세포를 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 그 후, 배양액을 제거하고 HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)로 세척한 후, 다시 HBSS를 넣고 자외선조사기기(UV irradiator system)를 이용하여 자외선 A를 충분히 조사한 다음 상기 실시예 3 및 4를 각각 농도별로 처리, 같은 배양 조건에서 21시간 배양하였다. 배양이 끝나고, MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide solution 시약을 well에 넣고 37℃에서 다시 3시간 배양하였다. 그 후 배양액을 제거하고 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 넣고 적당히 흔들어 준 뒤 마이크로플레이트계수기(Microplate reader)를 이용하여 흡광도 결과를 측정하였다. 또한 시험결과의 비교를 위해, 실시예를 처리하지 않고 자외선만 조사한 음성대조군, 및 EGCG(Epigallocatechin-3-gallate)를 10uM 농도로 처리한 양성대조군을 사용하였다. 흡광도 측정 결과는 도 6에 기재하였다.

실시예 3 및 4 모두 자외선에 대해 세포 보호 효과를 보였고, 특히 실시예 4는 양성대조군과 비슷한 수준으로 뛰어난 효과를 보였다.

실험예 3. 항염증 활성 검증

< 3-1 > NO(Nitric oxide) 생성 억제 효과

마우스 대식세포 Raw 264.7 cell을 5×10³ cells/ml 농도로 하여 96well plate에 100㎕씩 분주하여 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 이때 배지는 소혈청 10%와 항생제 1%가 포함된 DMEM 배지를 이용하였다. 배양한 후 소혈청과 항생제가 배제된 DMEM 배지로 교체한 후, 실시예 1 및 3을 각각 농도 별로 첨가한 후, 같은 배양조건에서 10분 배양한 후 1㎍/㎖의 LPS를 1㎕씩 넣고 24시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 Griess reagent 시약 Ⅰ과 Ⅱ를 동량 섞은 후 배양한 배지와 100㎕씩 96well plate에 넣고, 상온에서 10분 반응시켜 마이크로플레이트계수기(Micro plate reader) 540nm 에서 결과값을 측정하였다. 양성대조군으로서 비타민 C를 사용하였고, 실시예를 처리하지 않은 음성 대조군의 결과를 기준으로 하여 NO 생성률(%)을 측정하였으며, 그 결과는 도 7에 기재하였다.

상기 도 7에서, 실시예 1 및 3이 농도 의존적으로 NO의 생성량을 줄이는 것을 확인할 수 있다.

< 3-2 > PGE2 발현 억제 효과

PGE2(프로스타글란딘 E2)는 염증 유발에 중요한 역할을 하는 물질로서 실시예 1 및 3이 PGE2 발현을 억제하는 것을 확인해보았다.

인간 각질형성세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 5×10⁵ cell/well로 조절한 후 6 well plate에 접종하고, 실시예 1 및 3을 농도별로 각각 처리하고 30분 배양 후 LPS(Lipopolysaccharide, 1㎍/㎖)를 첨가하여 18시간 배양하였으며, 양성대조군로서 항산화제인 Pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC)를 사용하였다. 생성된 PGE2의 양은 PGE2 ELISA kit (R&D systems, Inc, USA)를 이용하여 측정하였고, 실시예 또는 PDTC를 처리하지 않은 음성 대조군의 PGE2 생성량을 기준으로 하여 PGE2 발현 억제율(%)을 측정하였으며, 결과를 도 8에 기재하였다.

상기 도 8에서, 실시예 1 및 3이 농도 의존적으로 PGE2의 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있다.

실험예 4. 미백 활성 검증

< 4-1 > 티로시나제(Tyrosinase) 저해 활성

티로시나제(Tyrosinase) 저해활성 측정은 티로시나제의 작용 결과 생성되는 도파크롬(DOPA chrome)을 비색법에 의해 측정하는 야기(Yagi) 등의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉, 반응구는 0.175M sodium phosphate buffer (pH 6.8) 0.5ml에 10mM L-DOPA를 녹인 기질액 0.2ml 및 시료용액 0.1ml의 혼합액에 mushroom tyrosinase (110U/ml) 0.2ml을 첨가하여 25℃에서 2분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 475nm에서 측정하였다. 아무런 물질을 처리하지 않은 대조군을 기준으로 하여 각 실험군의 상대적인 티로시나제 저해 활성을 측정하였고, 그 결과는 도 9에 기재하였다.

도 9에서 실시예 1 및 3이 농도 의존적으로 티로시나제를 저해하는 것을 확인할 수 있다.

< 4-2 > 웨스턴 블럿(Western Blot)을 통한 티로시나제 단백질 발현량 측정

실시예 1 및 3이 멜라닌 생합성을 매개하는 티로시나아제의 단백질 발현에 미치는 효과를 알아보기 위해 웨스턴 블럿 분석을 실시하였다. B16F1 멜라노마 셀(melanoma cell)을 소혈청 10%와 항생제 1%가 첨가된 DMEM/high glucose(Dulbeco's Modified Eagle Medium Hyclone)에서 배양하고, 96-웰 플레이트에 적정 농도로 분주 후 37℃에서 5% CO₂ 조건으로 24시간 배양한 후 실시예 1 및 3을 각각 농도별로 B16F10 멜라노마 셀의 배양액에 넣어 3일 배양하였다. 동시에, 멜라닌 합성을 유도하기 위하여 α-MSH(melanicyte stimulating hormone)를 10nM 농도로 처리하였다.

배양을 완료한 후, 세포를 회수하기 위하여 티로신-EDTA 용액을 넣고 세포를 분리하여 마이크로튜브에서 획득한 후 원심분리하여 상등액을 제거하였다.

분리된 펠렛을 1×PBS(-)로 세척하고 원심분리한 후, 펠렛에 RIPA buffer (Thermo, USA)을 처리하여 -20℃에서 15분 반응시켰다. 원심분리 진행 후, 상등액을 튜브로 옮겨 -20℃에 보관하였다. 상기 방법으로 정제한 단백질을 8% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동을 실행하고 이를 PVDF 막으로 이전하였다. 5% 스킴 밀크(skim milk)가 함유된 트리스 완충용액에서 1시간 블로킹(blocking) 과정을 거친 후에 티로시나아제, GAPDH 항체와 각각 반응시켰다.

상기 방법으로 정제한 단백질을 8% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동을 실행하고 이를 PVDF 막으로 이전하였다. 5% 반응 후, donkey anti-goat lgG-HRP가 결합된 항체를 가하고, Immobilon^TM Western Chemiluminescent HRP Substrate(Millipore)를 사용하여 일정 시간 동안 반응시킨 후 현상하였다. 각 실험군에서 티로시나제의 발현량은 LAS 4000이미지 분석장치를 이용하여 정량ㅇ비교 분석하였으며, 그 결과는 도 10에 기재하였다.

상기 도 10에서, 실시예 1 및 3이 농도의존적으로 티로시나제 단백질 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있다.

실험예 5. 보습 활성 측정

아쿠아포린류(AQPs)는 물 및 용액내의 작은 분자들, 예를 들어, 글리세롤과 우레아(urea)의 확산을 용이하게 하는 채널을 형성시키는 경피 단백질의 일족이다. 그 중 AQP3은 아쿠아글리세로포린으로서, 글리세롤, 우레아, 퓨린 및 피리미딘류과 같이, 조직의 수화 수준을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 세포 배양액 내의 AQP-3 양을 측정하기 위해 Human Aquaporin 3, Gill Blood Group ELISA kit를 Mybiosource (USA)에서 구입하여 실험한다. 5 X 10⁵ 세포를 6 well plate에 seeding하여 24시간 배양 시켰다. 그 후 TNF-α(10 ng/ml)와 INF-γ(10 ng/ml)을 전처리 하고 실시예 1 과 3을 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 세포 배양액을 얻어 AQP-3 측정에 사용한다. AQP-3의 측정은 Human Aquaporin 3, Gill Blood Group ELISA kit의 protocol에 따라 측정하였다.

도 11에서 실시예 1 및 3이 농도 의존적으로 AQP-3의 발현을 증가시키는 것을 확인할 수 있다.

< 처방예 >

처방예 1. 유연화장수의 제조

상기 실시예 1, 3의 각 추출물을 유효성분으로 함유하는 유연화장수의 처방은 하기 표 1과 같다.

구체적으로, 소듐히알루로네이트는 프로펠러믹서(3000rpm)로 정제수에 분산하여 1% 용액상태로 준비하였다. 소듐히알루로네이트를 제외한 원료 1내지8은 프로펠러믹서를 사용하여 수상 용해조에 500rpm으로 균일화시키고 75℃에서 가온하여 완전 용해한 후, 실온으로 냉각하였다. 이후, 별도의 용해조에 원료 9 내지 11을 완전 용해시킨 후, 상기 수상 용해조에 투입하고 교반 혼합하였다. 여기에 실시예 1, 3의 각 추출물을 투입하여 충분히 교반 혼합하여, 유연화장수를 제조하였다.

유연화장수 제조

	성분	함량(중량%)
1	실시예 1, 3의 각 추출물	0.01
2	폴리옥시에틸렌경화피마자유	0.5
3	글리신	3.3
4	디포타슘글리시리제이트	0.1
5	1,3-부틸렌 글리콜	3.0
6	소듐히아루로네이트	0.1
7	에탄올	5.0
8	항산화제	0.1
9	트리에탄올아민	0.1
10	EDTA	0.1
11	방부제	적량
12	정제수	잔량

처방예 2. 영양화장수의 제조

상기 실시예 1, 3의 각 추출물을 유효성분으로 함유한 영양화장수의 처방은 하기 표 2와 같다.

구체적으로, 프로펠러믹서를 이용하여 카보머를 4000rpm으로 분산하여 2% 용액상태로 준비하였다. 수상 용해조에 원료 1 내지 6을 투입하여 호모믹서(2000rpm)로 교반하여 분산한 후, 75℃까지 가온하였다. 유상 용해조에 원료 7 내지 14를 투입하여 75℃까지 가온 용해하였다. 그 다음 수상 용해조에 용해된 유상을 투입하여 유화(3000rpm/5분)시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 여기에 실시예 1, 3의 각 추출물을 투입하여 충분히 교반 혼합하여, 영양화장수를 제조하였다.

영양화장수 제조

	성분	함량(중량%)
1	실시예 1, 3의 각 추출물	0.01
2	글리세린	7.0
3	소르비탄스테아레이트 슈크로오즈코코에이트	2.0
4	미네랄 오일	4.0
5	트리옥타노인	1.0
6	스테아릭에씨드	1.0
7	글리세릴 스테아레이트	0.5
8	소르비탄모노스테아레이트	1.0
9	디메치콘	0.5
10	항산화제	0.3
11	트리에탄올아민	0.1
12	카보머	0.2
13	EDTA	0.1
14	방부제	적량
15	정제수	잔량

처방예 3. 에센스의 제조

상기 실시예 1, 3의 각 추출물을 유효성분으로 함유한 에센스의 처방은 하기 표 3과 같다.

구체적으로, 소듐히알루로네이트, 히드록시에틸셀룰로이즈는 각각 정제수에 프로펠러믹서(2000rpm)로 분산하여 1중량% 함유용액으로 준비하였다. 또한 카보머는 정제수에 프로펠러믹서(4000rpm)로 분산하여 2중량% 함유용액으로 준비하였다. 한편, 수상 용해조에 원료 1 내지 12를 투입하여 호모믹서(2000rpm)로 교반하여 분산한 후, 75℃까지 가온하고, 가온된 수상을 다시 실온으로 냉각하였다. 별도의 용해조에 원료 13 내지 15를 완전 용해시킨 후, 상기 수상 용해조에 투입하여 교반 혼합하였다. 이에, 실시예 1, 3의 각 추출물을 유효성분으로 함유한 에센스를 제조하였다.

에센스 제조

	성분	함량(중량%)
1	실시예 1, 3의 각 추출물	0.01
2	글리세린	5.0
3	1,3-부틸렌 글리콜	2.0
4	폴리에틸렌 글리콜	2.0
5	카보머	1.0
6	소듐히아루로네이트	0.1
7	글리신	3.0
8	폴리아크릴아마이드	2.0
9	히드록시에틸셀룰로이즈	0.2
10	에탄올	3.0
11	항산화제	0.3
12	트리에탄올아민	0.1
13	폴리옥시에틸렌경화피마자유	1.0
14	EDTA	0.1
15	방부제	적량
16	정제수	잔량

처방예 4. 영양크림의 제조

상기 실시예 1, 3의 각 추출물을 유효성분으로 함유한 영양크림의 처방은 하기 표 4와 같다.

구체적으로, 수상 용해조에 원료 1 내지 8을 투입하여 호모믹서(2000 rpm)로 교반하여 분산한 후, 75℃까지 가온하였다. 별도의 유상 용해조에 원료 9 내지 16을 투입하여 80℃까지 가온 용해한 후 상기 수상 용해조에 용해된 유상을 투입하여 유화(3000 rpm/10분)시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 여기에 실시예 1, 3의 각 추출물을 투입하여 충분히 교반 혼합하여, 영양크림을 제조하였다.

영양크림 조성

	성분	함량(중량%)
1	실시예 1, 3의 각 추출물	0.01
2	1,3-부틸렌글리콜	3.0
3	글리세린	3.0
4	하이드로제네이티드 레시친	1.0
5	옥틸도데카놀	3.0
6	트리옥타노인	2.0
7	스테아릭에씨드	1.5
8	세토스테아릴알콜	2.0
9	폴리솔베이트60	1.5
10	소르비탄세스퀴올레이트	2.0
11	디메치콘	3.0
12	항산화제	0.3
13	산탄검	0.2
14	트리에탄올아민	0.1
15	EDTA	0.1
16	방부제	적량
17	정제수	잔량

처방예 5. 팩의 제조

상기 실시예 1, 3의 각 추출물을 유효성분으로 함유한 팩의 처방은 하기 표 5와 같다.

구체적으로, 별도의 용해조에 원료1내지8을 완전 용해시켜 교반 혼합하고, 여기에 실시예 1, 3의 각 추출물을 투입하여 충분히 교반 혼합하여 팩을 제조하였다.

팩의 조성

	성분	함량(중량%)
1	실시예 1, 3의 각 추출물	0.01
2	글리세린	7.0
3	1,3-부틸렌글리콜	3.0
4	스쿠알렌	3.0
5	디메치콘	3.0
6	소듐히알루로네이트	0.1
7	글리신	2.0
8	폴리아크릴아마이드	5.0
9	항산화제	0.3
10	트리에탄올아민	0.1
11	EDTA	0.1
12	방부제	적량
13	정제수	잔량

처방예 6. 연고의 제조

상기 실시예 1, 3의 각 추출물을 유효성분으로 함유한 연고의 처방은 하기 표 6과 같다.

연고의 조성

	성분	함량(중량%)
1	실시예 1, 3의 각 추출물	0.01
2	글리세린	8.0
3	1,3-부틸렌글리콜	4.0
4	유동 파라핀	15.0
5	베타글루칸	7.0
6	카보머	0.1
7	카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
8	스쿠알란	1.0
9	세틸아릴 글루코사이드	1.5
10	소르비탄 스테아레이트	0.4
11	세테아릴 알코올	1.0
12	방부제	적량
13	향	적량
14	색소	적량
15	정제수	잔량

처방예 7. 패취제의 제조

상기 실시예 1, 3의 각 추출물을 유효성분으로 함유한 패취제의 처방은 하기 표 7과 같다.

패취제의 조성

	성분	함량(중량%)
1	실시예 1, 3의 각 추출물	0.01
2	헥실렌글리콜	20
3	디에킬아민	0.7
4	폴리아크릴산	1.0
5	아황산나트륨	0.1
6	폴리옥시에틸렌라우릴에테르	1.0
7	폴리히드록시에틸렌세틸스테아릴에테르	1.0
8	점성의 파라핀 오일	2.5
9	카프릴산에스테르/카프르산에스테르	2.5
10	폴리에틸렌글리콜-400	3.0
11	정제수	잔량

이상에서 설명된 본 발명의 실시예는 예시적인 것에 불과하며, 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 잘 알 수 있을 것이다. 그러므로 본 발명은 상기의 상세한 설명에서 언급되는 형태로만 한정되는 것은 아님을 잘 이해할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다. 또한, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 정신과 그 범위 내에 있는 모든 변형물과 균등물 및 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (6)

1. 어리연꽃(Nymphoides indica) 및 노랑어리연꽃(Nymphoides peltata)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 어리연꽃 속(Nymphoides sp.) 식물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 염증 개선용 화장료 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 추출물은 물, 에탄올, 메탄올, 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 클로로포름, 글리세린 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 용매로 추출된 것을 특징으로 하는, 피부 염증 개선용 화장료 조성물.
   
5. 어리연꽃(Nymphoides indica) 및 노랑어리연꽃(Nymphoides peltata)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 어리연꽃 속(Nymphoides sp.) 식물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 개선용 화장료 조성물.
   
6. 어리연꽃(Nymphoides indica) 및 노랑어리연꽃(Nymphoides peltata)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 어리연꽃 속(Nymphoides sp.) 식물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습 개선용 화장료 조성물.

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