WO2017119535A1 - 카노신, 대두 펩타이드 및 천심련 추출물을 포함하는 항노화용 조성물 - Google Patents
카노신, 대두 펩타이드 및 천심련 추출물을 포함하는 항노화용 조성물 Download PDFInfo
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- A61Q19/08—Anti-ageing preparations
Definitions
- the present invention relates to an anti-aging composition comprising carnosine, soybean peptide and cheonsimyeon extract, more specifically DEJ (Dermal epidermal junction) protein enhancement effect, ECM (Extracellular matrix) enhancement effect and oxidative stress It relates to an anti-aging cosmetic composition or a food composition comprising a carnosine, soybean peptide and cheonsimyeon extract exhibiting the effect of inhibiting cell aging and increasing the reactivity of skin activity growth factor.
- DEJ Dismal epidermal junction protein enhancement effect
- ECM Extracellular matrix enhancement effect
- oxidative stress It relates to an anti-aging cosmetic composition or a food composition comprising a carnosine, soybean peptide and cheonsimyeon extract exhibiting the effect of inhibiting cell aging and increasing the reactivity of skin activity growth factor.
- Skin is an organ in which aging occurs primarily, and many studies have been conducted in the cosmetic field to delay or prevent it. Normally, skin aging begins about 25 years of age, and skin aging proceeds in earnest around 40 years of age. Aging of the skin is divided into photoaging and endogenous aging. In the case of endogenous aging, it is a natural phenomenon due to degenerative change that occurs in proportion to the progress of time with age. Changes in the external form of the skin associated with aging of the skin include dry skin, sagging skin and wrinkles, and skin diseases include seborrheic keratosis and sunspots.
- DEJ Dermal epidermal junction
- ECM extracellular matrix
- GAG extracellular matrix
- DEJ-related proteins include collagen 4, collagen 7, collagen 17, and Lminin 5.
- Reactive oxygen a representative inducer of exogenous aging, occurs in ultraviolet light, pollution, inflammation, and the cell's own metabolism, and promotes cell aging.
- the present inventors have continued research to develop anti-aging compositions capable of simultaneously inhibiting the aging of epidermal-dermal junctions (DEJ) and dermal cells in natural derived compounds having high stability and safety without skin side effects.
- the present invention has been made by discovering that the complex compound of, carnosine, soybean peptide and cheonsimyeon extract can simultaneously exhibit the effect of inhibiting cell aging by oxidative stress, increasing the reactivity of skin active growth factor, as well as enhancing DEJ and ECM. Completed.
- the technical problem to be solved in the present invention is to provide a composition having an anti-aging activity.
- the present invention provides a cosmetic composition for anti-aging comprising a carnosine, soybean peptide and cheonsimyeon extract as an active ingredient.
- the present invention provides a food composition for anti-aging comprising a carnosine, soybean peptide and cheonsimyeon extract as an active ingredient.
- a method of preventing or preventing skin aging using a mixture of carnosine, soy peptide and cheonsimyeon extract is provided.
- Carnosine an active ingredient of the anti-aging composition of the present invention, is a dipeptide of ⁇ -alanyl-L-histidine composed of beta-alanine and histidine. Significant amounts are found, especially in the nonprotein part of vertebrate muscle cells, amounts to about 1-20 mM. Carnosine is an antioxidant that protects cells from oxidative stress and is known as a free radical scavenger that has an excellent effect on removing reactive oxygen species (Boldyrev et al., Neuroscience 94 ( 2): 571-577, 1999, USP 5,866,537; USP 5,503,776).
- cannosine has been mainly used as a cosmetic or therapeutic agent for skin diseases (USP 5,723,482; USP 5,710,177).
- This protective action of cannosine is achieved by inhibiting the modification of the biopolymers in the oxidative stress environment and maintaining their intrinsic function through proton buffering, heavy metal chelation and removal of free radicals and active sugar molecules. (Boldyrev et al., Biochemistry (Mosc) 65 (7): 751-756, 2000).
- Cheonsimyeon ( ⁇ , Andrographis paniculata is an annual vegetation of the Acanthaceae, growing mainly in shaded and moist areas throughout India, especially in southern fields or forests. The height is 0.3-1.0m, the stem is dark green, 2-6mm thick, the leaves are 8cm long, 2.5cm wide, willow-shaped, and the flowers have purple spots on the white or pale pink petals. Cheonsimyeon is known as 'Maha-tita' (King of bitters) because it is extremely bitter in all plant parts, and it is also called 'bhui-neem' due to its similar shape and bitterness. Such cheonsimyeon is known for anti-cancer, anti-inflammatory, antibacterial, antiviral action, etc., and has been used as a medicinal herb for immunity, edema, antipyretic effect.
- the cheonsimyeon extract of the present invention refers to a substance which has an anti-aging activity extracted from or separated from a conventional method of the cheonsimyeon lotus starch, leaves, roots, stems, flowers, and the like, and improves the skin condition.
- the extract refers to not only the extract extracted from the extract of Cheonsimyeon by the conventional method, but also its dry powder or any form formulated using the same.
- the cheonsimyeon extract can be extracted using water or an organic solvent, the extracted liquid can be used in liquid form or concentrated and / or dried.
- the organic solvent is methanol, ethanol, isopropanol, butanol, ethylene, acetone, hexane, ether, chloroform, ethyl acetate, butyl acetate, dichloromethane, N, N- dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), 1 , 3-butylene glycol, propylene glycol, or a mixed solvent thereof, and can be extracted at room temperature or warmed under conditions in which the active ingredient of the extract is not destroyed or minimized.
- the degree of extraction and loss of the active ingredient of the extract may vary, so select an appropriate organic solvent.
- the extraction method is not particularly limited, and examples thereof include cold needle extraction, ultrasonic extraction, reflux cooling extraction, and the like.
- cheonsimyeon extract includes all extracts, fractions and purified products obtained at each step of extraction, fractionation or purification, their dilutions, concentrates or dried products.
- Soybean peptide an active ingredient of the anti-aging composition of the present invention, is a hydrolyzed product of a protein that is partially hydrolyzed from soybean protein and has a physiological activity, and is composed of a peptide that is small in size without heat coagulation and is small in size, and protects against UV rays. It is reported to have DEJ increase potency together.
- the soybean peptide used in the present invention may be used in solution or in powder form, commercially available one, or may be directly separated from soybean by a known method.
- An example of a method of preparing a soybean peptide solution may include a mixing ratio of soybean peptide and water in a weight ratio of 5 to 10:90 to 100, and preferably a weight ratio of 5: 100. It is possible to use a product prepared by continuously stirring and dissolving in purified water heated to ⁇ 80 ° C., aging for 10 to 20 minutes, and cooling.
- the anti-aging cosmetic composition of the present invention can be used in combination with a carnosine, cheonsimyeon extract and soybean peptide in a weight ratio of 0.9 to 1.1: 0.4 to 0.6: 0.9 to 1.1, preferably a weight ratio of 1: 0.5: 1 It is preferable to mix with.
- the anti-aging complex compound including the carnosine, cheonsimyeon extract and soybean peptide which is an active ingredient of the composition of the present invention is expressed as "AC" (Anti-ageing complex).
- the concentration of carnosine, cheonsimyeon extract and soybean peptide showed no intracellular toxicity, and as a result, 50 ppm, 20 ppm, and 50 ppm were observed, respectively, and the cytotoxicity was not mixed.
- Compounds were prepared and their reactive oxygen species (ROS) scavenging ability, collagen synthesis test, and DEJ related protein expression levels were measured.
- ROS reactive oxygen species
- the complex compound containing carnosine, cheonsimyeon extract and soybean peptide inhibited at least 20% or more of the increased ROS activity by external oxidative stress (rotenone) and untreated collagen synthesis, one of the main components of ECM At least 30% increase compared to the group, DEJ-related protein expression was confirmed to increase at least 50% or more.
- the complex compound (AC) of carnosine, cheonsimyeon extract and soybean peptide is 0.0001 to 20% by weight, preferably 0.001 to 10% by weight, more preferably 0.01 to 10% by weight, based on the total weight of the composition. 5% by weight.
- the weight of AC is less than 0.0001% by weight, the anti-aging effect of the skin is weak, and when the weight of the complex compound is more than 20% by weight, there is a problem in that the increase in the effect of increasing the content is very weak.
- the anti-aging composition of the present invention may be added to EGF (Epidermal Growth Factor), FGF (Fibroblast Growth Factor), etc. to increase the anti-aging activity.
- EGF Epimal Growth Factor
- FGF Fibroblast Growth Factor
- composition containing AC of the present invention exhibits an anti-inflammatory effect and has little cytotoxicity as a natural substance.
- a cosmetic composition comprising AC as an active ingredient is provided.
- Cosmetic compositions according to one embodiment of the invention include ingredients commonly added to cosmetic compositions in addition to AC as active ingredients, such as conventional auxiliaries such as anti-inflammatory agents, antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavors, and Carriers may be further added.
- auxiliaries such as anti-inflammatory agents, antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavors, and Carriers may be further added.
- the cosmetic composition of the present invention may be prepared in any formulation commonly prepared in the art, for example, solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, soaps, surfactant-containing cleansing , Oils, powder foundations, emulsion foundations, wax foundations and sprays, and the like, but are not limited thereto. More specifically, it may be prepared in the form of a nourishing cream, astringent lotion, a flexible lotion, a lotion, an essence, a nourishing gel or a massage cream.
- the formulation of the present invention is a paste, cream or gel, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant gum, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide are used as carrier components.
- animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant gum, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide are used as carrier components.
- animal oil vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant gum, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide
- tracant gum cellulose derivative
- polyethylene glycol silicone
- bentonite silica
- talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as the carrier component when the formulation of the present invention is a powder or a spray, and in particular in the case of a spray, additionally chlorofluorohydrocarbon, propane Propellant such as butane or dimethyl ether.
- a solvent, solubilizer or emulsifier is used as the carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1 Fatty acid esters of, 3-butylglycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or sorbitan.
- liquid carrier diluents such as water, ethanol or propylene glycol
- suspending agents such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, microcrystals Castle cellulose, aluminum metahydroxy, bentonite, agar or tracant gum can be used.
- the carrier component is an aliphatic alcohol sulfate, an aliphatic alcohol ether sulfate, a sulfosuccinic acid monoester, an isethionate, an imidazolinium derivative, a methyltaurate, a sarcosinate, a fatty acid amide.
- Ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters and the like can be used.
- the food composition according to one embodiment of the present invention as an active ingredient, in addition to AC, as well as ingredients conventionally added during food production, such as proteins, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings and flavoring agents It may include.
- Such carbohydrates are monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides and the like; And sugars such as conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin and the like and xylitol, sorbitol, erythritol.
- natural flavoring agents tauumatin, stevia extract (for example rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be used.
- citric acid liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, fruit juice, tofu extract, jujube extract, licorice extract, and the like may be further included. .
- the composite compound is a natural material harmless to the human body. Therefore, the complex compound prepared by mixing the carnosine, cheonshimyeon extract and soybean peptide of the present invention is harmless to the human body, and has little toxicity and side effects, so it can be used safely even for long-term use, especially the cosmetics and foods as described above. It can be applied safely to the composition.
- the anti-aging composition comprising the carnosine, soybean peptide and cheonsimyeon extract of the present invention as an active ingredient inhibits cell aging by oxidative stress, increases the reactivity of skin activity growth factors, as well as enhances DEJ and ECM. At the same time, it is expected to be able to effectively improve skin aging and to be useful as an anti-aging cosmetic composition and food composition because it is not toxic to cells.
- Figure 1 is a graph showing the effect of increasing the collagen production of carnosine, cheonsimyeon extract and soybean peptide single treatment group and their complex compound (AC).
- Figure 2 is a graph showing the effect of increasing DEJ protein expression of the carnosine, cheonshimyeon extract and soybean peptide single treatment group and their complex compound (AC).
- Figure 3 shows the effect of increasing the collagen production in fibroblasts induced cell senescence by oxidative stress of carnosine, cheonsimyeon extract and soybean peptide single treatment group and their complex compound (AC).
- Figure 4 is a graph showing the complex of the compound (AC) of carnosine, cheonshimyeon extract and soybean peptides for the improvement of wrinkles in a short-term clinical trial.
- Kanosine, cheonsimyeon extract and soybean peptide were mixed at a weight ratio of 1: 0.5: 1 to prepare a composition containing a complex compound (AC) of carnosine, cheonshimyeon extract and soybean peptide.
- AC complex compound
- Cytotoxicity experiments (MTT) of the composition were performed using human derived fibroblasts. Fibroblasts were treated with 0, 10, 25, and 50 ⁇ g / ml of carnosine, cheonshimyeon extract and soybean peptide, respectively, and the cytotoxic effect of the cells after 2 days of culturing was MTT (3- (4 , 5-dimetylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazolium bromide) analysis method. Cell viability was expressed in percentage compared to the negative control group and the results are shown in Table 1.
- the complex compound treatment concentration proceeded by fixing the carnosine 50 ⁇ g / ml, Cheonsimyeon extract 25 ⁇ g / ml, soybean peptide 50 ⁇ g / ml.
- Human normal fibroblasts (Azo dermatology) were seeded in 24-well microplates containing DMEM medium to approximately 3 ⁇ 10 4 cells and incubated at 5 ° C. in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours. Incubated for Thereafter, the test material was treated and further incubated for 24 hours. After further treatment with 100 mM of H2DCFDA (H2DCFDA (Molecular Probe, USA)) capable of measuring intracellular ROS levels and rotenone (200 mM) capable of inducing intracellular oxidative stress, the cells were re-incubated for 30 minutes.
- H2DCFDA H2DCFDA (Molecular Probe, USA)
- the ROS scavenging ability of the carnosine, cheonshimyeon extract, soybean peptide was 20%, 8%, 28%, respectively, and in the case of using a mixture of these substances, the ROS scavenging ability was increased to 41%. It was confirmed. This means that efficacy can be enhanced when the main constituents of the present invention are combined at concentrations that are not cytotoxic.
- Fibroblasts present in the dermis are cells that produce ECM, the major component of dermis, and among the ECM components, a protein known to be related to skin wrinkles is type-1 procollagen. Wrinkle improvement efficacy of the test substance was observed through type 1 procollagen collagen biosynthesis.
- Human normal fibroblasts (Azo dermatology) were inoculated into 24-well microplates containing DMEM medium (2 x 10 5 cells / well) and in a 2% CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours. Incubated for After 24 hours, the medium was removed from each well, samples were treated by concentration and then incubated again for 24 hours. After 24 hours, cell media were collected to prepare samples.
- the amount of collagen synthesis was measured by using a collagen measurement kit (Procollagen Type I C-peptide EIA kit MK101, Takara, Japan) to measure the amount of procollagen type I C-peptide (Type I C-peptide: PICP). Specific test method was performed according to the kit instructions of Takara Co., Ltd. Collagen synthesis ability results are shown in FIG.
- Collagen 4, 7, 17, laminin production was measured using an ELISA measurement kit (Cloud-Clone Corp., USA). Detailed test method was performed according to Cloud-Clone Corp.'s analysis kit manual. The synthesis result of DEJ protein production is shown in FIG. 2.
- the expression level of the protein was synergistically increased when the AC-containing composition of the present invention was treated with collagen-7, 17 and laminin-5 except collagen-4. In particular, increased expression of collagen-7 and collagen-17 was observed.
- Fibroblasts were treated repeatedly with 0.5 ⁇ M of the oxidative stress inducer rotenone for 2 weeks to induce cell premature aging. Two weeks after the test material was treated with rotenone, the degree of cell aging was observed by SA- ⁇ gal analysis. SA- ⁇ gal assay was analyzed by FACS via C12FDG staining. The results are shown in FIG. As a result, it was observed that the anti-aging complex mixture significantly inhibited cell aging induced by oxidative stress.
- Rotenone 2-week treatment group (early aging induction group) Rotenone + anti-aging complex compound 2 weeks treatment group Cell Proliferation Increase with EGF 5 ng / mL 29% 8% 21%
- the rate of increase in cell proliferation for EGF of the group treated with the anti-aging complex compound according to the present invention is significantly higher than the rate of increase in cell proliferation following treatment of EGF of fibroblasts induced by premature aging with oxidative stress. It was observed to be visible.
- Wrinkle improvement effect of the cosmetic containing the anti-aging complex compound was measured through clinical trials.
- a nourishing cream prepared in Production Example 1 (nourishing cream containing 0.05% of the anti-aging complex compound) was used.
- Wrinkle improvement effect was analyzed skin roughness factor by Fringe projector (DermaTOP system, Ecotech company, France). Skin roughness factors are expressed as Ra, Rz, Rt parameters. Skin wrinkle improvement measurement was carried out in 23 healthy women (35 to 60 years old) in a condition of constant temperature 24 to 26 °C, humidity 38 to 40% Preparation Example 1 Nutrition cream on the face of each subject After 28 days of use twice, the degree of improvement of the peripheral eye wrinkles was measured. The test results are shown in FIG.
- the composition of the nourishing cream containing an anti-aging complex compound is shown in Table 4 below.
- the aqueous phase purified water, triethanol amine and propylene glycol were heated and dissolved at 70 ⁇ ⁇ , and the oily fatty acid, oil component, emulsifier, and preservative were heated to 70 ⁇ ⁇ to dissolve the solution. After emulsification was completed, the solution was cooled to 45 ° C., an anti-aging composite compound and flavor were added and dispersed, and then cooled to 30 ° C.
- Anti-Aging Compound 0.05 Jojoba oil 5.0 Floating paraffin 7.0 Cetylaryl alcohol 2.0 Polyglyceryl-3 Methyl Glucose Disteare 2.0 Glyceryl Stearate 0.5 Squalane 3.0 Propylene glycol 4.0 glycerin 5.0 Triethanol amine 0.3 Carboxy Vinyl Polymer 0.3 Tocopheryl acetate 0.2 Preservative, incense a very small amount Purified water Remaining amount Sum 100
- a skin external preparation containing the compound compound (AC) was prepared using the ingredients and contents shown in Table 5 below, and then skin stability and clinical efficacy assays were performed.
- purified water, glycerin and butylene glycol were mixed and dissolved at 70 ° C. (water part), and the remaining components except the three components and trimethanolamine were dissolved at 70 ° C. (oil part).
- the oil part was added to the water part and stirred first with a homomixer (Tokushu Kika, Japan), and trimethanolamine was finally added thereto.
- trimethanolamine was finally added thereto.
- the skin external preparation prepared by the method 1-1 above was applied to the upper forearm area every nine days for a total of nine times every other day for 24 hours to determine whether the complex compound (AC) irritated the skin. Measured.
- a skin external preparation containing no complex compound (AC) was used as a squalane base.
- a fin chamber (Finn chamber, Epitest Ltd, Finland) was used, and 15 ⁇ l of each of the external preparations for skin was added dropwise to the chamber, and the patch was performed.
- the degree of response to the skin each time was scored using Equation 1 below, and the results are shown in Table 6 below.
- ⁇ 1 point, + 2 points and + + 4 points in the reactivity it is determined as a safe composition when the average reactivity is less than 3.
- test group 1 and test group 2 As shown in Table 6, in the case of the control group, test group 1 and test group 2, the number of people corresponding to ⁇ , +, ++ was 0, 0, 0, respectively, the response did not appear. As a result of calculation according to the above-described formula, the average reactivity of the control group, test groups 1 and 2 were all 0.00 and all 3 or less, which was determined to be a safe composition.
- a flexible lotion containing a complex compound (AC) as an active ingredient was prepared according to a conventional method as shown in Table 7 below.
- a nutritional lotion containing a complex compound (AC) as an active ingredient was prepared according to a conventional method.
- Compound Compound (AC) 0.1 Beeswax 4.0 Polysorbate 60 1.5 Sorbitan sesquioleate 0.5 Liquid paraffin 5.0 Squalane 5.0 Caprylic / Capric Triglycerides 5.0 glycerin 3.0 Butylene Glycol 3.0 Propylene glycol 3.0 Carboxy Vinyl Polymer 0.1 Triethanolamine 0.2 Preservatives, Micro Pigments, Micro-Fragrances and Micro-Purified Water Remaining amount sum 100.0
- a nutritive cream containing a complex compound (AC) as an active ingredient was prepared according to a conventional method.
- Compound Compound (AC) 0.1 Beeswax 10.0 Polysorbate 60 1.5 Sorbitan sesquioleate 0.5 Liquid paraffin 10.0 Squalane 5.0 Caprylic / Capric Triglycerides 5.0 glycerin 5.0 Butylene Glycol 3.0 Propylene glycol 3.0 Triethanolamine 0.2 Preservatives, Micro Pigments, Micro-Fragrances and Micro-Purified Water Remaining amount sum 100.0
- a massage cream containing a complex compound (AC) as an active ingredient was prepared according to a conventional method as shown in Table 10 below.
- Compound Compound (AC) 0.1 Beeswax 10.0 Polysorbate 60 1.5 Sorbitan sesquioleate 0.8 Liquid paraffin 40.0 Squalane 5.0 Caprylic / Capric Triglycerides 4.0 glycerin 5.0 Butylene Glycol 3.0 Propylene glycol 3.0 Triethanolamine 0.2 Preservatives, Micro Pigments, Micro-Fragrances and Micro-Purified Water Remaining amount sum 100.0
- a pack containing a complex compound (AC) as an active ingredient was prepared according to a conventional method.
- Compound Compound (AC) 0.1 Polyvinyl alcohol 13.0 Sodium Carboxymethylcellulose 0.2 Allantoin 0.1 ethanol 5.0 Nonylphenyl Ether 0.3 Preservatives, Micro Pigments, Micro-Fragrances and Micro-Purified Water Remaining amount sum 100.0
- the anti-aging composition comprising the carnosine, soybean peptide and cheonsimyeon extract of the present invention as an active ingredient inhibits cell aging by oxidative stress, increases the reactivity of skin activity growth factors, as well as enhances DEJ and ECM. At the same time, it is expected to be able to effectively improve skin aging and to be useful as an anti-aging cosmetic composition and food composition because it is not toxic to cells.
Abstract
본 발명의 카노신, 대두 펩타이드 및 천심련 추출물을 유효성분으로 포함하는 항노화용 화장료 조성물은 산화스트레스에 의한 세포노화 억제효과, 피부활성 성장인자 반응성 증대효과 뿐만 아니라 DEJ 증진효과 및 ECM 증진효과를 동시에 가져 피부노화를 효과적으로 개선할 수 있을 뿐만 아니라 세포에 대한 독성이 없어 항노화용 화장료 조성물 및 식품 조성물로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 카노신(carnosine), 대두 펩타이드 및 천심련 추출물을 포함하는 항노화용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 DEJ(Dermal epidermal junction) 단백질 증진효과, ECM (Extracellular matrix) 증진효과 및 산화스트레스에 의한 세포노화 억제효과 및 피부활성 성장인자 반응성 증대효과를 나타내는 카노신, 대두 펩타이드 및 천심련 추출물을 포함하는 항노화용 화장료 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이다.
피부는 노화가 일차적으로 나타나는 기관으로 이를 지연 또는 예방하기 위하여 화장품 영역에서도 많은 연구가 진행되어 왔다. 통상적으로 피부노화는 25세를 전후하여 진행되기 시작하여 40세를 전후한 시기에 본격적으로 피부노화가 진행된다. 피부의 노화는 광노화와 내인성 노화로 나누어지며 내인성 노화의 경우 나이가 들어감에 따라 시간의 진행에 비례하여 일어나는 퇴행성 변화로 자연스런 현상이다. 피부의 노화와 관련된 피부의 외적 형태 변화로는 피부 건조, 피부 늘어짐 및 주름 등이 있으며, 피부 질환으로는 지루 각화증이나 흑점 등이 있다. 피부노화에 따라 피부 각층에서 일어나는 현상으로 진피내 콜라겐, GAG를 포함한 ECM(extracellular matrix) 생성의 감소로 인해 진피가 위축되며, 피부표피 역시 얇아지면서 건조해진다. 진피와 표피 접합을 담당하는 표피-진피 접합부(DEJ, Dermal epidermal junction) 단백질 역시 노화가 진행됨에 따라 발현이 감소하면서 표피-진피 접합부가 평평해지고 연결이 약해져 피부가 쉽게 손상을 받고 영영공급이 원활히 이루어지지 않게 되어 피부노화가 촉진되게 된다. 또한 자외선과 같은 외부요인에 의해서도 감소되기도 한다. DEJ 관련 단백질로는 collagen 4, collagen 7, collagen 17, Lminin 5가 있다. 외인성 노화의 대표적인 유발인자인 활성산소는 자외선, 공해, 염증 그리고 세포 자체적인 대사과정에서 발생하며 세포노화를 촉진하는 작용을 한다.
세포노화가 촉진되면 세포 재생력과 콜라겐, 엘라스틴, 하이알루론산 등 피부구성 물질의 합성능이 저하된다. 뿐만 아니라 노화에 따른 성장인자 수용기(growth factor receptor) 감소로 외부 성장인자에 대한 반응성도 떨어져, 세포를 활성화 하는 성장인자가 제대로 작용하지 못하는 경우가 많다. 실제로 세포노화가 진행된 섬유모세포는 대표적인 피부활성인자인 EGF(epidermal growth factor)에 대한 수용기가 감소하면서 EGF를 처리하여도 반응을 나타내지 않는다는 연구결과가 계속 보고되고 있다 (Hidenori Shiraha et al, JBC, 275;19343-19351, 2000). 따라서 EGF와 같은 세포활성인자에 적절히 반응하기 위해서는 세포노화를 억제하는 것이 주요한 항노화용 전략임을 유추할 수 있다.
이에 본 발명자들은 안정성 및 안전성이 높아 피부 부작용이 없는 천연유래 화합물을 대상으로 표피-진피 접합부(DEJ) 및 진피세포의 노화를 동시에 억제할 수 있는 항노화용 조성물을 개발하기 위하여 계속 연구를 진행한 결과, 카노신, 대두 펩타이드 및 천심련 추출물의 복합 화합물이 산화스트레스에 의한 세포노화 억제효과, 피부활성 성장인자 반응성 증대 뿐만 아니라 DEJ 증진효과 및 ECM 증진효과를 동시에 나타낼 수 있다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 항노화용 활성을 가지는 조성물을 제공하기 위한 것이다.
상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 카노신, 대두 펩타이드 및 천심련 추출물을 유효성분으로 포함하는 항노화용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 카노신, 대두 펩타이드 및 천심련 추출물을 유효성분으로 포함하는 항노화용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 구체적인 하나의 실시양태에 따르면, 카노신, 대두 펩타이드 및 천심련 추출물의 혼합물을 이용하여 피부 노화를 예방 또는 방지하는 방법을 제공한다.
본 발명의 항노화용 조성물의 유효성분인 카노신(carnosine)은 베타알라닌(β-alanin)과 히스티딘(histidine)으로 이루어진 β-알라닐-L-히스티딘의 다이펩타이드 (dipeptide)로 수명이 긴 조직에서 상당히 많은 양이 발견되고, 특히 척추동물 근육 세포의 비단백질 부분에 많이 존재하는데 그 양은 약 1∼20 mM에 달한다. 카노신은 세포를 산화적 스트레스로부터 보호하는 항산화제로서, 활성 산소종 (reactive oxygen species)을 제거하는데 뛰어난 효과를 갖는 자유 라디칼 소거제 (free radical scavenger)로 알려져 있다 (Boldyrev et al., Neuroscience 94(2):571-577, 1999, USP 5,866,537; USP 5,503,776). 이와 같은 항산화제로서의 기능을 이용하여 카노신은 주로 화장품이나 피부질환 치료제로서 이용되어 왔다 (USP 5,723,482; USP 5,710,177). 이러한 카노신의 보호 작용은 프로톤 완충효과 (proton buffering), 중금속 킬레이트화 (chelating) 및 자유 라디칼과 활성 당분자의 제거를 통해 산화적 스트레스 환경에서 생체 고분자의 변형을 억제하고 이들의 고유 기능을 유지시킴으로써 이루어진다 (Boldyrev et al., Biochemistry (Mosc) 65(7):751-756, 2000).
본 발명에서, 천심련(穿心蓮, Andrographis
paniculata)은 쥐꼬리망초과(Acanthaceae)의 일년생 초목으로 인도 전역, 특히 남부의 들판이나 숲속의 그늘지고 수분이 충분한 곳에서 주로 자라는 식물이다. 키는 0.3-1.0미터, 줄기는 진한 녹색으로 굵기 2-6mm이며, 잎은 길이 8cm, 폭 2.5cm의 버들잎 모양으로 뽀족하고, 꽃은 흰색 또는 연분홍빛 꽃잎에 자색 반점이 있다. 천심련은 모든 식물 부위의 맛이 극히 쓰므로, 'Maha-tita'(King of bitters)라고 알려져 있으며, 님나무보다 크기는 훨씬 작지만 모양이 비슷하고 쓴 맛으로 인해 'bhui-neem'이라고도 불린다. 이러한 천심련은 항암, 항염증, 항균, 항바이러스 작용 등이 알려져 있으며 민간약재로서 면역증, 이담, 해열 작용 등에 사용되어 왔다.
본 발명의 천심련 추출물은 상기한 천심련의 전초, 잎, 뿌리, 줄기, 꽃 등을 통상의 방법에 의하여 추출하거나 이로부터 분리된 항노화용 활성을 가지고, 피부 상태를 개선하는 물질을 말한다. 또한, 상기 추출물은 통상의 방법에 의하여 천심련 추출물로부터 추출한 추출액뿐만 아니라 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 말한다.
본 발명에서 천심련 추출물은 물 또는 유기 용매를 사용하여 추출할 수 있는데, 추출한 액은 액체 형태로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매이며, 추출물의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 추출물의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다.
본 발명에 있어서, 천심련 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함한다.
본 발명의 항노화용 조성물의 유효성분인 대두 펩타이드는 대두 단백질로부터 부분적으로 가수분해되어 생리활성을 갖는 단백질의 분해 산물로서 수용성이며, 열에 응고하지 않고, 크기가 작게 부숴진 펩타이드로 이루어져 있으며 자외선 보호효과와 함께 DEJ 증가 효능을 가지고 있는 것으로 보고되어 있다. 본 발명에 사용되는 대두 펩타이드는 용액 또는 분말상태로 이용할 수 있으며, 시판되는 것을 사용하거나, 공지의 방법으로 직접 대두로부터 분리시켜 이용할 수 있다. 대두 펩타이드 용액의 제조방법의 예는 대두 펩타이드 및 물의 혼합 비율은 5~10:90~100의 중량비로 혼합될 수 있으며, 바람직하게는 5:100의 중량비이며, 본 발명에서는 시판용 액상 대두 펩타이드를 70~80℃로 승온한 정제수에 교반을 지속하여 투입, 용해하여 10~20분간 숙성하여 냉각하여 제조한 것을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 카노신, 천심련 추출물 또는 대두 펩타이드를 각각 사용할 때보다 카노신, 천심련 추추물 및 대두 펩타이드를 혼합하여 사용할 경우 산화스트레스에 의한 세포노화 억제효과, 피부활성 성장인자 반응성 증대효과 뿐만 아니라 DEJ 증진효과 및 ECM 증진효과가 현저하게 상승될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 항노화용 화장료 조성물은 카노신, 천심련 추출물 및 대두 펩타이드가 0.9 내지 1.1 : 0.4 내지 0.6 : 0.9 내지 1.1의 중량비로 혼합 사용될 수 있으며, 바람직하게는 1 : 0.5 : 1의 중량비로 혼합된 것이 바람직하다. 이하에서는, 본 발명의 조성물의 유효성분인 카노신, 천심련 추출물 및 대두 펩타이드를 포함하는 항노화용 복합 화합물을 "AC"(Anti-ageing complex)이라고 표현한다.
하나의 구체적 실시양태에 따르면, 카노신, 천심련 추출물 및 대두 펩타이드가 세포내 독성을 보이지 않는 농도를 구하였고 그 결과 각각 50ppm, 20ppm, 50ppm으로 관찰되었고, 세포독성을 보이지 않는 중량비로 혼합하여 복합 화합물을 제조하고, 이들의 ROS (reactive oxygen species) 소거능, 콜라겐합성시험, DEJ 관련 단백질 발현량을 측정하였다. 그 결과, 카노신, 천심련 추출물 및 대두 펩타이드가 포함된 복합 화합물은 외부 산화스트레스(로테논)에 의해 증가된 ROS 활성을 적어도 20% 이상 억제시켰고, ECM 주요성분중 하나인 콜라겐 합성을 무처리군에 비하여 적어도 30%이상 증가시키며, DEJ관련 단백질 발현은 적어도 50% 이상 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 조성물에는 카노신, 천심련 추출물 및 대두 펩타이드의 복합 화합물(AC)가 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 0.0001 내지 20중량%, 바람직하게는 0.001 내지 10중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 5중량%이다. 상기 AC의 중량이 0.0001중량% 미만일 경우 피부노화 방지 효능이 미약하고, 복합 화합물의 중량이 20중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 매우 미약하다는 문제점이 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 하나의 실시양태에 따르면, 본 발명의 항노화용 조성물에는 항노화용 활성을 증대시키기 위하여 EGF(Epidermal Growth Factor), FGF(Fibroblast Growth Factor) 등을 추가로 첨가할 수 있다.
본 발명의 AC를 함유하는 조성물은 항염증 효과를 나타내며, 천연 물질로서 세포독성이 거의 없다. 본 발명의 하나의 실시양태에 따르면, AC를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 하나의 실시양태에 따른 화장료 조성물에는 유효성분으로서의 AC 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 첨가되는 성분, 예컨대 항염증제, 항산화제, 안정화제, 가용화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 추가로 첨가할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트 검, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 가용화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 검등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 하나의 실시양태에 따른 식품 조성물에는 유효성분으로서 AC뿐만 아니라 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 AC 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
한편, 본 발명의 구체적 실시예에서 복합 화합물의 피부자극시험 결과, 복합 화합물은 천연물질로서 인체에 무해한 물질임이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 카노신, 천심련 추출물 및 대두 펩타이드를 혼합되어 제조된 복합 화합물은 인체에 무해하며, 독성 및 부작용이 거의 없으므로 장기간 사용시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같은 화장료 및 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 카노신, 대두 펩타이드 및 천심련 추출물을 유효성분으로 포함하는 항노화용 조성물은 산화스트레스에 의한 세포노화 억제효과, 피부활성 성장인자 반응성 증대효과 뿐만 아니라 DEJ 증진효과 및 ECM 증진효과를 동시에 가져 피부노화를 효과적으로 개선할 수 있을 뿐만 아니라 세포에 대한 독성이 없어 항노화용 화장료 조성물 및 식품 조성물로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 카노신, 천심련 추출물 및 대두 펩타이드 단일 처리군과 이들의 복합 화합물(AC)의 콜라겐 생성 증가 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 카노신, 천심련 추출물 및 대두 펩타이드 단일 처리군과 이들의 복합 화합물(AC)의 DEJ 단백질 발현 증가 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 카노신, 천심련 추출물 및 대두 펩타이드 단일 처리군과 이들의 복합 화합물(AC)이 산화스트레스로 세포노화가 유도된 섬유모세포에서 콜라겐 생성 증가 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 카노신, 천심련 추출물 및 대두 펩타이드의 복합 화합물(AC)이 단기간 임상시험에서 주름개선 효능을 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<제조예 1> 천심련 추출물 제조
천심련 전초를 깨끗이 세척한 후 음건하고 마쇄한 다음, 건조된 시료 1kg과 보조용매 에탄올(99.5%) 500 내지 700 ㎖를 초임계 유체 추출반응기 (Natex, Austria)에 넣고 반응기 내의 온도가 40℃, 압력이 10MPa, S/F 비(Supercritical fluid kg / Feed kg) 35가 되는 조건하에서 총 40kg의 이산화탄소를 사용하여 추출하였다. 이어서, 이산화탄소, 에탄올 및 원료의 혼합물을 분리 장치를 통과시키고, 혼합물의 압력과 온도를 변화시켜 이산화탄소로부터 추출물을 분리하였다. 얻어진 추출물의 에탄올을 제거하기 위하여 감압 농축하여 천심련 추출물 121.4g을 제조하였다.
<제조예 2> 카노신, 천심련 추출물 및 대두 펩타이드를 함유하는 조성물 제조
카노신, 천심련 추출물 및 대두 펩타이드를 1 : 0.5 : 1의 중량비로 혼합하여 카노신, 천심련 추출물 및 대두 펩타이드의 복합 화합물(AC)을 함유하는 조성물을 제조하였다.
<실시예 1> 조성물 세포독성 시험
인체유래 섬유모세포를 이용하여 조성물의 세포독성 실험(MTT)을 수행하였다. 섬유모세포에 카노신, 천심련 추출물 및 대두 펩타이드를 각각 0, 10, 25, 50 ㎍/ml의 농도로 처리하고, 2일 배양 후 세포의 세포독성효과(cytotoxic effect)를 MTT(3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석 방법을 이용하여 측정하였다. 세포생존력은 음성대조군 대비 백분율로 환산하여 그 결과를 표 1에 나타내었다.
유의미한 세포수 변화는 나타나지 않았다. 각 처리물질별로 세포독성을 나타나지 않는 최대농도를 함께 처리한 결과 세포 생존에 유의미한 변화는 관찰되지 않았다. 이를 통해 이후 진행되는 복합 화합물 처리농도는 카노신 50 ㎍/㎖, 천심련 추출물 25 ㎍/㎖, 대두 펩타이드 50 ㎍/㎖로 고정하여 진행하였다.
<실시예 2> ROS 소거능 측정
인간의 정상 섬유아세포(Human normal fibroblast, 아주대 피부과)를 DMEM 배지가 들어 있는 24-웰 마이크로 플레이트에 약 3 x 104 개의 세포가 되도록 접종시키고, 5% 농도의 CO2 배양기에 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 시험물질을 처리하고 24시간 추가 배양하였다. 세포내 ROS 수준을 측정할 수 있는 H2DCFDA(H2DCFDA (Molecular Probe, USA)) 100mM와 세포내 산화스트레스를 유도할 수 있는 로테논(rotenone, 200mM)을 추가로 처리한 후 30분 동안 다시 배양하였다. 이어서, 1N NaOH로 세포를 분쇄시킨 후 세포 lysate에 존재하는 형광정도를 플루오르미터(fluorometer) 기기 (Infinite M200, Tecan, Switzerland)를 통해 측정하였다. ROS 소거능 결과는 표 2에 나타내었다.
| 처리물질 | (-) | 카노신50㎍/ml | 천심련추출물25㎍/ml | 대두펩타이드50㎍/ml | (카노신+천심련+대두펩타이드)복합물(AC) |
| ROS 소거능 | 0 | 20% | 8% | 28% | 41% |
상기 표 2에서 보듯이, 카노신, 천심련 추출물, 대두 펩타이드의 ROS 소거능이 각각 20%, 8%, 28%로 나타났으며, 이들 물질을 혼합 사용한 조성물의 경우 41%로 ROS 소거능이 증대되는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 주요구성성분을 세포독성이 없는 농도로 조합하였을 때 효능이 상승될 수 있음을 의미한다.
<실시예 3> in vitro 콜라겐 합성능 측정
진피 내 존재하는 섬유모세포는 진피주요 구성성분인 ECM을 생산하는 세포로 ECM 구성성분 중 피부 주름에 관계하는 것으로 알려진 단백질은 타입-1 프로콜라겐(type-1 procollagen)이다. 시험물질의 주름개선 효능을 타입-1 프로콜라겐 콜라겐 생합성능을 통해 관찰하였다. 인체유래 정상 섬유아세포(human normal fibroblast, 아주대 피부과)를 DMEM 배지가 들어 있는 24-웰 마이크로 플레이트에 접종시키고(2 x 105 세포/웰), 5% 농도의 CO2 배양기에 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 각 웰에서 배지를 제거하고 농도별로 시료를 처리한 다음 24시간 동안 다시 배양하였다. 24시간 후, 세포배지를 수집하여 샘플을 제조하였다. 콜라겐 합성량은 콜라겐 측정 키트(Procollagen Type I C-peptide EIA kit MK101, Takara, Japan)를 이용하여 프로콜라겐(procollagen) 타입 I C-펩타이드(Type I C-peptide: PICP)의 양을 측정하였다. 구체적인 시험방법은 (주)다카라의 키트 설명서에 따라 수행하였다. 콜라겐 합성능 결과는 도 1에 나타내었다.
실험결과, 처리된 농도범위에서 카노신, 천심련 추출물의 유의한 효능은 관찰되지 않았으며 대두 펩타이드는 타입-1 프로콜라겐 콜라겐 합성능을 16%로 증가시키는 것으로 관찰되었다. 이들 물질을 복합적으로 사용 시 콜라겐 합성능이 35% 증가하는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 주요구성성분을 세포독성이 없는 농도로 조합하였을 때 효능이 상승될 수 있음을 의미한다.
<실시예 4> DEJ 관련 단백질 합성능 측정
표피와 진피의 경계부위(DEJ: dermalepider-mal junction)에서의 피부노화 억제 물질에 대한 연구가 각광을 받고 있는데 표피와 진피 경계부위에 많이 존재하는 단백질인 콜라겐-4, 7, 17, 라미닌-5 등이 피부노화에 영향을 준다는 연구결과 때문이다. DEJ 단백질생합성능 실험의 경우 인체유래 정상 섬유아세포(human normal fibroblast, 아주대 피부과)를 DMEM 배지가 들어 있는 24-웰 마이크로 플레이트에 접종시키고(2 x 105 세포/웰), 5% 농도의 CO2 배양기에 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 각 웰에서 배지를 제거하고 농도별로 시료를 처리한 다음 24시간 동안 다시 배양하였다. 24시간 후, 세포배지를 수집하여 샘플을 제조하였다. 콜라겐 4, 7, 17, 라미닌 생성량은 ELISA 측정 키트(Cloud-Clone Corp., USA)를 이용하여 측정하였다. 자세한 시험방법은 Cloud-Clone Corp.사 분석 키트 설명서에 따라 수행하였다. DEJ 단백질 생성 종합 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에서 보듯이, 콜라겐-4를 제외한 콜라겐-7, 17 및 라미닌-5에서 본 발명의 AC 함유 조성물을 처리했을 때 단백질 발현양이 상승적으로 증가하는 것으로 나타났다. 특히 콜라겐-7과 콜라겐-17의 발현양 증가가 현저한 것으로 관찰되었다.
<실시예 5> 항노화용 복합 화합물의 세포노화 억제능 측정
항산화 효능을 가진 물질들은 산화스트레스로부터 유도되는 세포노화를 억제할 수 있는 효능을 함께 가지는 경우가 많으며, 이에 따라 상기 실시예 2를 통해 ROS 소거능을 확인한 항노화용 조성물이 실제 세포노화를 억제할 수 있는지 살펴보았다.
섬유모세포에 산화스트레스 유도물질인 로테논 0.5 μM을 2주동안 반복적으로 처리하여 세포 조기노화를 유도하였다. 시험물질을 로테논과 함께 처리하고 2주 후 세포노화정도를 SA-βgal 분석을 통해 관찰하였다. SA-βgal 분석은 C12FDG 염색을 통해 FACS로 분석하였다. 결과는 도 3에 나타내었다. 그 결과 항노화용 복합 혼합물이 산화스트레스에 의해 유도된 세포노화를 유의하게 억제하는 것으로 관찰되었다.
<실시예 6> 항노화용 복합 화합물의 성장인자 반응성 증대효과 측정
세포노화가 진행되면 세포성장인자에 대한 수용기가 감소하면서 세포성장인자에 대한 반응성도 감소한다. 즉 피부분야에서 항노화용 인자로 많이 사용되는 EGF, FGF 등을 피부에 적용해도 노화된 세포는 제대로 반응하지 않아 기대되는 효과를 누리기 어렵다. 본 실험에서는 세포노화를 억제한 항노화용 복합 화합물이 피부성장인자 반응성도 증가시킬 수 있는 지 산화스트레스로 조기노화가 유도된 섬유모세포에서 그 효능을 살펴보았다. 로테논을 2주간 반복적으로 처리하여 얻어진 세포와 로테논과 항노화용 복합물질을 동시에 처리한 세포군을 24웰 마이크로플레이트에 1 x 105 세포/웰로 접종하고 대표적인 피부세포 성장인자인 EGF를 처리하고 세포증식능을 확인하였다. 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
| 무처리군 | 로테논 2주처리군(세포조기노화 유도군) | 로테논+항노화 복합 화합물 2주처리군 | |
| EGF 5 ng/mL 처리시 세포증식 증가율 | 29% | 8% | 21% |
상기 표 3에서 보듯이, 본 발명에 따른 항노화용 복합 화합물이 처리된 군의 EGF에 대한 세포증식 증가율이 산화스트레스로 조기노화가 유도된 섬유모세포의 EGF 처리에 따른 세포증식 증가율보다 현저히 높은 수치를 보이는 것으로 관찰되었다.
<실시예 7> 항노화용 복합 화합물을 포함하는 화장료의 주름개선 효과 측정
항노화용 복합 화합물을 포함하는 화장료의 주름 개선효과를 임상 시험을 통하여 측정하였다. 제조예 1(항노화용 복합 화합물을 각 0.05% 함유한 영양 크림)에서 제조한 영양 크림을 사용하였다.
주름개선 효과는 Fringe projector (DermaTOP system, Ecotech company, France)를 통해 피부거칠기 인자를 분석하였다. 피부거칠기 인자는 Ra, Rz, Rt 파라미터로 나타내었다. 피부 주름개선 측정은 온도 24 내지 26℃, 습도 38 내지 40%로 일정하게 유지되는 조건에서 건강한 여성 23명(35세 내지 60세)을 대상으로 제조예 1 영양 크림을 각각 피검자의 얼굴에 1일 2회씩 28일간 사용하게 한 후, 눈가주변 주름의 개선정도를 측정하였다. 시험결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에서 보듯이, 항노화용 복합 화합물이 적용된 크림을 1달간 적용하였을 때 피부거칠기를 의미하는 파라미터의 값이 유의미한 감소하였다. 이를 통해 항노화 복합 화합물이 피부 주름개선에 효능을 나타내는 것으로 판단할 수 있다.
<제제예 1> 항노화용 복합 화합물을 함유한 크림의 제조
항노화용 복합 화합물을 포함하는 영양 크림의 조성은 하기 표 4와 같다. 수상인 정제수, 트리에탄올 아민 및 프로필렌글리콜을 70℃로 가열하고 용해시키고, 여기에 유상인 지방산, 유성성분, 유화제 및 방부제를 70℃로 가열하여 용해한 액을 첨가하여 유화시켰다. 유화가 완료된 후 상기 용액을 45℃로 냉각시키고 항노화용 복합 화합물 및 향을 첨가하고 분산시킨 다음 30℃로 냉각하였다.
| 성분 | 함량 (중량%) |
| 항노화용 복합 화합물 | 0.05 |
| 호호바 오일 | 5.0 |
| 유동 파라핀 | 7.0 |
| 세틸아릴 알코올 | 2.0 |
| 폴리글리세릴-3 메칠 글루코스 디스테아레이 | 2.0 |
| 글리세릴 스테아레이트 | 0.5 |
| 스쿠알란 | 3.0 |
| 프로필렌글리콜 | 4.0 |
| 글리세린 | 5.0 |
| 트리에탄올 아민 | 0.3 |
| 카르복시 비닐폴리머 | 0.3 |
| 토코페릴 아세테이트 | 0.2 |
| 방부제, 향 | 미량 |
| 정제수 | 잔량 |
| 합계 | 100 |
<시험예 1> 항노화용 복합 조성물의 인체 피부에 대한 안전성 확인 실험
항노화용 복합 조성물이 실제 인체피부에도 안전한지 여부를 확인하기 위하여 피부 안전성 검증 실험을 수행하였다. 시험방법으로는 통상의 피부누적자극시험을 실시하였다.
1-1. 복합 화합물(AC)을 포함한 피부 외용제의 제조
복합 화합물(AC)이 인체 피부에 안전한지 확인하기 위하여, 하기 표 5의 성분 및 함량으로 복합 화합물(AC)을 함유한 피부 외용제를 제조한 다음 피부 안정성과 임상효능 검정 실험을 수행하였다. 먼저, 정제수, 글리세린, 부틸렌글리콜을 혼합하고 70℃에서 용해하였으며(물 파트), 상기 세 성분과 트리메탄올아민을 제외한 나머지 성분을 70℃에서 용해하였다(오일 파트). 상기 오일 파트를 물 파트에 첨가하고 호모믹서(일본 Tokushu Kika사)로 교반하여 1차 유화하였고, 여기에 트리메탄올아민을 최종 첨가하였다. 다음으로, 상기 혼합액에 생성된 기포를 제거한 후, 실온으로 냉각시켜 피부 외용제를 제조하였다.
1-2. 피부누적 자극 실험
상기 1-1의 방법으로 제조한 피부 외용제를 건강한 30명의 성인을 대상으로 윗팔뚝 부위에 격일로 총 9회, 24시간 누적 첩포를 시행하여 복합 화합물(AC)이 피부에 자극을 주는지의 여부를 측정하였다. 대조군으로는 스쿠알란 베이스로 복합 화합물(AC)이 함유되지 않은 피부 외용제를 사용하였다.
첩포 방법은 핀 챔버 (Finn chamber, Epitest Ltd, 핀란드)를 이용하였으며, 챔버에 상기 각 피부 외용제를 15 ㎕씩 적하한 후 첩포를 실시하였다. 매회 피부에 나타난 반응의 정도를 하기 수학식 1을 이용하여 점수화 하였으며, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
이 때, 반응도에서 ± 는 1점, +는 2점 및 ++는 4점의 점수를 부여하며, 평균반응도가 3 미만일 때 안전한 조성물로 판정된다.
상기 표 6에서 보듯이, 대조군, 시험군 1 및 시험군 2의 경우, ±, +, ++에 해당하는 사람의 수가 각각 0명, 0명, 0명으로 반응이 나타나지 않았다. 상기 기재된 식에 따라 계산한 결과 대조군, 시험군 1 및 2의 평균 반응도는 모두 0.00으로 모두 3이하로 나타나 안전한 조성물로 판단되었다.
<제제예 2> 화장료의 제제
2-1. 유연 화장수의 제조
하기 표 7과 같이 복합 화합물(AC)을 유효성분으로 포함하는 유연 화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.
| 성분 | 함량(중량%) |
| 복합 화합물(AC) | 0.1 |
| 글리세린 | 3.0 |
| 부틸렌 글리콜 | 2.0 |
| 프로필렌 글리콜 | 2.0 |
| 카복시비닐폴리머 | 0.1 |
| 에탄올 | 10.0 |
| 트리에탄올아민 | 0.1 |
| 방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수 | 잔량 |
| 총계 | 100.0 |
2-2. 영양 화장수의 제조
하기 표 8과 같이 복합 화합물(AC)을 유효성분으로 포함하는 영양 화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.
| 성분 | 함량(중량%) |
| 복합 화합물(AC) | 0.1 |
| 밀납 | 4.0 |
| 폴리소르베이트 60 | 1.5 |
| 소르비탄세스퀴올레이트 | 0.5 |
| 유동파라핀 | 5.0 |
| 스쿠알란 | 5.0 |
| 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 | 5.0 |
| 글리세린 | 3.0 |
| 부틸렌 글리콜 | 3.0 |
| 프로필렌 글리콜 | 3.0 |
| 카복시비닐폴리머 | 0.1 |
| 트리에탄올아민 | 0.2 |
| 방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수 | 잔량 |
| 총계 | 100.0 |
2-3. 영양 크림의 제조
하기 표 9와 같이 복합 화합물(AC)을 유효성분으로 포함하는 영양 크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.
| 성분 | 함량(중량%) |
| 복합 화합물(AC) | 0.1 |
| 밀납 | 10.0 |
| 폴리소르베이트 60 | 1.5 |
| 소르비탄세스퀴올레이트 | 0.5 |
| 유동파라핀 | 10.0 |
| 스쿠알란 | 5.0 |
| 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 | 5.0 |
| 글리세린 | 5.0 |
| 부틸렌 글리콜 | 3.0 |
| 프로필렌 글리콜 | 3.0 |
| 트리에탄올아민 | 0.2 |
| 방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수 | 잔량 |
| 총계 | 100.0 |
2-4. 맛사지 크림의 제조
하기 표 10과 같이 복합 화합물(AC)을 유효성분으로 포함하는 맛사지 크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.
| 성분 | 함량(중량%) |
| 복합 화합물(AC) | 0.1 |
| 밀납 | 10.0 |
| 폴리소르베이트 60 | 1.5 |
| 소르비탄세스퀴올레이트 | 0.8 |
| 유동파라핀 | 40.0 |
| 스쿠알란 | 5.0 |
| 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 | 4.0 |
| 글리세린 | 5.0 |
| 부틸렌 글리콜 | 3.0 |
| 프로필렌 글리콜 | 3.0 |
| 트리에탄올아민 | 0.2 |
| 방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수 | 잔량 |
| 총계 | 100.0 |
2-5. 팩의 제조
하기 표 11과 같이 복합 화합물(AC)을 유효 성분으로 포함하는 팩을 통상의 방법에 따라 제조하였다.
| 성분 | 함량(중량%) |
| 복합 화합물(AC) | 0.1 |
| 폴리비닐알콜 | 13.0 |
| 소듐카복시메틸셀룰로스 | 0.2 |
| 알란토인 | 0.1 |
| 에탄올 | 5.0 |
| 노닐페닐에테르 | 0.3 |
| 방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수 | 잔량 |
| 총계 | 100.0 |
이와 같이, 본 발명의 카노신, 대두 펩타이드 및 천심련 추출물을 유효성분으로 포함하는 항노화용 조성물은 산화스트레스에 의한 세포노화 억제효과, 피부활성 성장인자 반응성 증대효과 뿐만 아니라 DEJ 증진효과 및 ECM 증진효과를 동시에 가져 피부노화를 효과적으로 개선할 수 있을 뿐만 아니라 세포에 대한 독성이 없어 항노화용 화장료 조성물 및 식품 조성물로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
Claims (4)
- 카노신, 대두 펩타이드 및 천심련 추출물을 유효성분으로 포함하는 항노화용 화장료 조성물.
- 카노신, 대두 펩타이드 및 천심련 추출물을 유효성분으로 포함하는 항노화용 식품 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,상기 카노신, 대두 펩타이드 및 천심련 추출물이 0.9 내지 1.1 : 0.4 내지 0.6 : 0.9 내지 1.1의 중량비로 혼합된 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,EGF(Epidermal Growth Factor) 또는 FGF(Fibroblast Growth Factor)가 추가로 첨가된 것을 특징으로 하는 조성물.
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