KR101889471B1

KR101889471B1 - 앵무새나무 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101889471B1
Application number: KR1020150188114A
Authority: KR
Inventors: 권순우; 오정영; 배준태; 김진화; 이근수; 표형배
Original assignee: (주)잇츠한불
Priority date: 2015-12-29
Filing date: 2015-12-29
Publication date: 2018-08-20
Also published as: KR20170078900A

Abstract

과제: 화장품 제형 중에서의 안정성이 나빠 분해되어 착색되거나, 이취가 발생하거나, 생체 수준에서의 효능, 효과가 불분명한 문제점 및 안전성 문제를 개선한 앵무새나무 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것.
또한, 피부 미백, 노화 방지, 피부자극 완화 및 염증 개선에 효과를 나타내는 앵무새나무 발효 추출물을 제공하는 것.
해결수단: 본 발명은 (가) 앵무새나무를 추출하는 단계; (나) 상기 앵무새나무 추출물에 동충하초, 표고버섯, 잎새버섯, 영지버섯 및 치마버섯 중 1종 이상을 포함하는 균사체의 전 배양액을 혼합하여 본 배양한 후, 배양액으로부터 상기에 사용한 균사체를 제거하여 앵무새나무 발효 추출물을 얻는 단계;로부터 얻어진 앵무새나무 발효 추출물을 유효성분으로 하여 화장료로 이용하는 경우 상기 과제를 해결할 수 있음을 발견하였다.

Description

앵무새나무 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 {Cosmetic composition containing Butea monosperma fermented extracts}

본 발명은 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 장미목 콩과에 속하는 앵무새나무의 전초 추출물을 발효시켜 수득한 앵무새나무 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

피부는 다양한 외부 요인들로부터 물리적, 화학적 상해를 직접 받는 부위인 동시에 또한 이들의 기능적, 구조적 손상을 치유할 수 있는 능력을 가진 우리가 사살아 가는데 없어서는 안 될 조직이다. 그러나 우리의 피부는, 예를 들어, 각종 오염물질과 스트레스 등으로 인해 손상을 입게 되는데, 이와 같은 손상으로 피부의 세포 증식이 제대로 이루어지지 않게 되면 피부는 더욱더 큰 손상을 입게 되고 피부 탄력이 저하되며, 주름이 생성된다. 피부가 노화되면, 피부 탄력에 중요한 역할을 하고 있는 매트릭스(Matrix) 안의 콜라겐(collagen), 뮤코다당류(mucopolysaccharide) 및 히알루론산(hyaluronic acid)의 양이 줄어들고, 불용성 콜라겐의 양이 증가한다. 이에 따라, 진피는 피부의 수분을 유지하기 어렵게 되고, 피부는 거칠게 된다. 나아가 피지샘과 땀샘의 기능도 감소하여 피지와 땀의 양이 점차로 줄어들게 된다. 이로 인해 피지막은 적당히 생성되지 못하고, 피부 수화에 대한 보호막을 잃게 되어, 결국 피부는 건조하게 되고, 투명성을 잃게 되어 피부단백질의 탄력이 감소 되고 주름이 생성된다.

한편, 멜라닌은 색소 세포 내에 존재하는 티로시나제의 작용에 의해 타이로신으로부터 도파(dopa), 도파퀴논(dopaquinone)으로 변환되어 도파크롬(dopachrome) 등을 거처 생성된다. 멜라닌은 피부에 존재하여 자외선 등으로부터 신체를 보호하고 체내 호르몬 분비 조절에 중요한 기능을 나타낸다. 그러나, 멜라닌이 과잉생산되면 기미, 주근깨 등을 형성하고 피부노화를 촉진하며 피부암 유발에 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 멜라닌 과잉생산을 예방하기 위한 연구개발이 활발히 진행되고 있다. 이미 아스코르빈산(일본특개평 4-9320), 하이드로퀴논(일본특개평 6-192062), 코직산(일본특개소 56-7710), 알부틴(일본특개평 4-93150) 및 식물 추출물 등이 티로시나제 저해 활성을 나타내어 미백 화장료로 이용되고 있으나 화장품 제형 중에서의 안정성이 나빠 분해되어 착색되거나, 이취가 발생하거나, 생체 수준에서의 효능, 효과가 불분명하거나 또는 안전성이 문제가 되어 그 사용이 제한되고 있는 실정이다.

최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연 추출물로부터 얻어진 항산화, 주름완화, 미백, 가려움 완화 등의 기능을 가진 기능성 화장료(functional cosmetics)에 많은 관심이 집중되고 있다. 예를 들어, 미국 특허공보 US 5,972,341는 코미포라 무쿨(Commiphora mukul)추출물의 주름 개선효과에 관하여, 일본특허공개 평9-672662는 히알우로니다제(Hyaluronidase)억제 효능을 가지는 해초류 추출물들에 관하여, 일본특허공개 평10-85905는 와카메(Wakame)로부터 추출된 푸코이단(Fucoidan)의 피부감촉 개선효과에 관하여, 일본특허공개 평2-245087은 사르가숨(Sargassum)속 추출물의 항산화 효과에 관하여, 대한민국 특허 제0431076호는 백급, 자소, 에키나시아 및 발효대두 추출물을 포함하는 아토피 피부의 치유 개선용 화장료 조성물을, 대한민국 특허 제0511494호는 하수오, 시엽, 일라이트를 포함하는 아토피 피부염 치료를 위한 추출물 및 조성물을, 대한민국 특허출원 공개 제2004-0011584호는 감초, 창이자, 홍화, 돈지(돼지비계)와 같은 천연성분의 물질을 정제 혼합하여 구성된 아토피성 피부질환의 치료에 우수한 조성물에 관해 개시하고 있다.

앵무새나무(Butea monosperma)는 비교적 건조한 평원 들판에서 많이 자라는 콩과식물로 높이는 6 ~ 12m 정도이다. 잎이 떨어진 가지에 불타는 듯한 주황색의 조밀하게 붙은 꽃 모양이 먼 곳에서 보면 마치 불꽃과 같다고 해서 숲의 불꽃(Flame of forest) 이라는 영명으로 불리기도 한다. 앵무새나무는 부위에 따라 다양한 효능을 나타낸다. 뿌리는 야맹증, 치핵, 궤양, 종양, 진통효과 등을 나타내며, 꽃은 체내 노폐물 정화, 강장제, 나병, 피부질환, 통풍, 화상 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있고, 목질부는 소화불량, 설사, 이질, 인후염, 영양흡수부전, 수종 등에 효과가 있다. 또한, 앵무새나무는 항균작용, 항진균성, 구충제, 식후혈당상승억제, 지사제, 항생제, 경련예방, 피임제 및 간독성 저해 효과에 대해 활발한 연구가 진행되고 있다.

최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연 추출물로부터 얻어진 항산화, 주름완화, 미백, 가려움 완화 등의 기능을 가진 기능성 화장료(functional cosmetics)에 많은 관심이 집중되고 있다. 예를 들어, 미국 특허공보 US 5,972,341는 코미포라 무쿨(Commiphora mukul)추출물의 주름 개선효과에 관하여, 일본특허공개 평9-672662는 히알우로니다제(Hyaluronidase)억제 효능을 가지는 해초류 추출물들에 관하여, 일본특허공개 평10-85905는 와카메(Wakame)로부터 추출된 푸코이단 (Fucoidan)의 피부감촉 개선효과에 관하여, 일본특허공개 평2-245087은 사르가숨(Sargassum)속 추출물의 항산화 효과에 관하여, 대한민국 특허 제0431076호는 백급, 자소, 에키나시아 및 발효대두 추출물을 포함하는 아토피 피부의 치유 개선용 화장료 조성물을 대한민국 특허 제0511494호는 하수오, 시엽, 일라이트를 포함하는 아토피 피부염 치료를 위한 추출물 및 조성물을 대한민국 특허출원 공개 제2004-0011584호는 감초, 창이자, 홍화, 돈지(돼지비계)와 같은 천연성분의 물질을 정제 혼합하여 구성된 아토피성 피부질환의 치료에 우수한 조성물에 관해 개시하고 있다.

한편, 한방 생약재를 단순 추출한 추출물의 경우 생체 외에서는 유효한 효능을 나타내지만, 이를 함유하는 피부 외용제는 그 효과가 만족스럽지 못한 문제점이 있다.

따라서, 본 발명은 앵무새나무 추출물을 동충하초, 표고버섯, 잎새버섯, 영지버섯 및 치마버섯 중 1종 이상의 균사체로 발효시켜 수득한 앵무새나무 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 화장품 제형 중에서의 안정성이 나빠 분해되어 착색되거나, 이취가 발생하거나, 생체 수준에서의 효능, 효과가 불분명한 문제점 및 안전성 문제를 개선한 앵무새나무 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 화장료에 적용시 피부 미백, 노화 방지, 피부자극 완화 및 염증 개선에 효과를 나타내는 앵무새나무 발효 추출물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 (가) 앵무새나무를 추출하는 단계; (나) 상기 앵무새나무 추출물에 동충하초, 표고버섯, 잎새버섯, 영지버섯 및 치마버섯 중 1종 이상을 포함하는 균사체 또는 균사체의 전 배양액을 혼합하여 본 배양한 후, 본 배양액으로부터 상기에 사용한 균사체를 제거하여 앵무새나무 발효 추출물을 얻는 단계;를 거쳐 얻어진 앵무새나무 발효 추출물을 유효성분으로 하여 화장료 및 피부외용제 조성물로 이용하는 경우 상기 목적을 달성할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

이하 본 발명의 앵무새나무 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 대해 상세히 설명하고자 한다.

본 발명자들은 상기 앵무새나무로부터 추출한 앵무새나무 추출물에서 효능 효과를 나타내는 주요성분이 플라보노이드(Flavonoid)임을 확인하였다. 식물에 풍부한 페놀성 화합물(Polyphenols)인 플라보노이드, 탄닌(tannins) 및 안토시아닌(anthocyanins) 등은 자외선으로 인해 손상된 피부를 보호할 수 있는 우수한 항산화 후보물질이며(Shibamot, American Chem. Soc., 564:247-256, 1994), 특히, 플라보노이드 또는 이들의 유도체 성분들은 항염증, 항알레르기, 항암 및 당뇨병 등의 약리학적 효능이 알려져 있을 뿐만 아니라(Middleton et al., Pharmacol. Rev., 52:673, 2000) 자외선으로 인해 발생한 라디칼 소거능, 지질과산화생성 억제능 등의 항산화력과 미백작용인 티로시나제 활성 억제능이 우수한 것으로 보고되고 있다(Nijveldt et al., Am. J. Clin. Nutr., 74:418, 2001).

일반적으로, 친수성 물질보다는 소수성 물질이 피부투과에 효과적인데, 각질층 중에 분포되어 있는 성분이 세라마이드라는 소수성 물질로, 친수성 물질보다는 소수성 물질과의 상호작용에 더 효과적이며 소수성 물질이 좀더 용이하게 피부 최외각 층을 통과할 수 있기 때문이다.

한편, 플라보노이드는 대부분 당(sugar) 한 분자 이상이 결합된 배당체(glycosides)로서 자연계에 존재하고 분자량은 상대적으로 크며, 수용성의 성질도 일부 지니기 때문에 각질층을 쉽게 통과하지 못하고 이에 따라 피부 내부로의 유입이 어렵게 되어 효과적으로 흡수가 어렵다는 문제점이 있다.

따라서 본 발명은 피부투과율이 용이하여 피부 외용제로서의 효과적인 역할을 하는 피부 외용제 조성물을 제공하기 위해 앵무새나무를 추출하는 단계; 상기 추출물에 동충하초, 표고버섯, 잎새버섯, 영지버섯 및 치마버섯 중 1종 이상을 포함하는 균사체 및 균사체의 전 배양액을 혼합하여 본 배양한 후, 본 배양액으로부터 상기에 사용한 균사체를 제거하여 앵무새나무 발효 추출물을 얻는 단계;를 거쳐 얻어진 앵무새나무 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는데, 상기의 단계를 통해 얻어진 앵무새나무 발효 추출물은 통상의 방법으로 추출한 앵무새나무 추출물보다 총 페놀함량 및 총 플라보노이드 함량이 증가한 것을 본 실험예에서 확인하였다.

또한, 상기 본 발명에 유효성분으로 함유되는 앵무새나무 발효 추출물의 제조과정에 있어서, 앵무새나무 추출물에 동충하초, 표고버섯, 잎새버섯, 영지버섯 및 치마버섯 중 1종 이상을 포함하는 균사체 또는 균사체의 전 배양액을 혼합한 후, 본 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 여기서 전 배양은 본 배양 전에 동충하초, 표고버섯, 잎새버섯, 영지버섯 및 치마버섯 중 발명에 사용된 균사체의 양을 증가시키기 위한 배양을 의미하고, 본 배양은 전 배양을 통해 양이 증가된 균사체를 이용하여 앵무새나무 추출물을 원활하게 발효시키는 과정이다.

한편, 본 발명에서 "유효성분으로 포함된다"는 의미는 본 발명의 화장료 조성물로부터 피부 상태의 개선 효과를 나타낼 수 있는 정도로 발효 추출물이 첨가되는 것을 의미하고, 성분 전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 제형화하는 것을 포함하는 의미이다.

또한, 본 발명은 화장료의 유효성분으로 함유되는 앵무새나무 발효 추출물이 항산화 효과, 미백효과, 염증유발관련 효소(hyaluronidase) 활성 억제효과기 우수한 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 앵무새나무 발효 추출물은 화장료 조성물 전체에 대해 0.001~30.0 중량%인 것을 특징으로 하는 앵무새나무 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 상기 앵무새나무 발효 추출물의 함량이 0.001 중량% 미만으로 포함되는 경우에는 피부개선효과가 거의 없으며, 30.0 중량% 이상인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하여 경제적이지 못하다.

또한, 본 발명은 상기 앵무새나무 추출시 추출용매로 에탄올이 50~90(v/v) 함유된 수용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 앵무새나무 추출물 배양시 본 배양은 배양액의 pH를 5.0~6.0으로 조정하고, 동충하초, 표고버섯, 잎새버섯, 영지버섯 및 치마버섯 중 1종 이상의 균사체를 1~10%(v/v)되도록 접종한 후, 온도 22~32℃, 회전수 120~180rpm, 통기량 1.2~1.8vm 조건에서 5~7일간 배양하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 앵무새나무 발효 추출물을 함유하는 피부 미백 효능을 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 앵무새나무 발효 추출물을 함유하는 노화 방지 효능을 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 앵무새나무 발효 추출물을 함유하는 염증 완화 효능을 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 화장료 조성물이 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 기초 화장료 제형; 수중유형 또는 유중수형의 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬류 중에서 선택된 화장료 조성물임을 특징으로 한다.

본 발명의 앵무새나무 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 피부 노화 방지, 염증 완화, 피부 미백 효과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

비교예 1 : 앵무새나무로부터 추출물 제조(단순 추출)

건조 및 분쇄된 앵무새나무 10kg을 70%(v/v) 에탄올 수용액으로 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 얼지 않는 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조시킨 후, 수득된 동결 건조물을 15중량% 함유되도록 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜 혼합용매에 용해시킴으로써 앵무새나무 추출물을 제조하였다.

실시예 1 : 앵무새나무 발효 추출물 제조

동충하초, 표고버섯, 잎새버섯, 영지버섯 및 치마버섯 중 1종 이상의 균사체를 효모-맥아즙 한천배지가 든 시험관에 사면배양하여 4℃에 보관하고 1개월마다 계대배양하여 사용하였다. 상기 사면배지에서 계대배양된 균사체를 무균적으로 균질화하여 비교예 1에서 수득한 앵무새나무 추출물과 당이 혼합된 최적화된 합성배지를 제조하였으며, pH 5.5로 조정한 액체배지에 동충하초, 표고버섯, 잎새버섯, 영지버섯 및 치마버섯 중 1종 이상의 균사체가 5%(v/v)되도록 접종한 후, 발효조 내에서 온도 27℃, 회전수 150rpm, 통기량 1.5vvm의 조건으로 6일간 배양하였다. 배양 후 배양액으로부터 상기에 사용된 균사체를 제거한 다음 여과액(이하 '앵무새나무 발효 추출물'이라고 칭함)을 수득하였다.

실험예 1 : NBT법을 이용한 항산화 효과 측정

상기 실시예 1에서 수득된 앵무새나무 발효 추출물의 항산화 수준을 확인하기 위해 항산화제로 잘 알려진 BHT(Butylated hydroxytoluene)를 비교샘플로 사용하였고, 항산화 측정은 NBT법을 이용하였다.

NBT법은 잔틴과 잔틴옥시다제에 의해 활성산소를 생성시키고, 생성된 활성산소와 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)가 반응하여 생성된 청색을 파장 560㎚에서 측정하는 방법으로, 활성산소 소거율을 측정하였으며, 측정방법은 하기와 같다.

바이엘병에 0.05M의 Na₂CO₃ 2.4㎖, 3mM의 잔틴 용액 0.1㎖, 3mM의 EDTA 용액 0.1㎖, BSA 용액 0.1㎖, 0.72mM의 NBT 용액 0.1㎖를 가하고 여기에 시료용액을 각각 첨가한 후, 25℃에서 10분간 방치하였다. 방치 후, 잔틴 옥시다제 용액 0.1㎖를 가하여 빠르게 교반한 다음, 25℃에서 20분간의 배양을 하였고, 여기에 6mM의 CuCl₂용액 0.1㎖을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도(St)를 측정하였다. 공시험은 시료용액 대신 증류수를 사용한 것으로 상기와 동일한 방법으로 흡광도(Bt)를 측정하였다. 시료용액의 블랭크(Blank)는 잔틴 옥시다제 용액 대신 증류수를 사용해 상기와 동일한 방법으로 흡광도(Bo)를 측정하였다.

측정 결과는 수학식 1에 의하여 산출하였다.

시료명	활성산소 소거율(항산화 효과;%)
앵무새나무 발효 추출물 0.1 중량%	89.23
앵무새나무 추출물 0.1 중량%	59.51
BHT 0.1 중량%	87.15

NBT법을 이용한 항산화 효과를 측정한 결과(표 1), 앵무새나무 발효 추출물은 앵무새 추출물과 BHT와 같은 농도에서 좀 더 우수한 항산화효과를 발휘하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 본 발명의 유효성분인 앵무새나무 발효 추출물의 우수한 항산화효과를 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명 조성물의 우수한 항산화 효과를 추론할 수 있었다.

실험예 2 : DPPH법을 이용한 항산화 효과 측정

본 실험예 2에서는 실시예 1에서 수득된 앵무새나무 발효 추출물의 항산화 수준을 확인하기 위해 항산화제로 잘 알려진 BHT를 비교시료로 사용하였고, 항산화 측정은 DPPH법을 이용하였다.

DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 자유라디칼 소거활성을 측정하는 것이다. 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정한다.

0.1% 농도의 앵무새나무 발효 추출물, 앵무새나무 추출물, BHT를 준비한 후, 각각의 시료를 96-웰 프레이트에 넣었다. 여기에 100㎛ 메탄올용액으로 제조된 DPPH를 첨가하여 용액의 총 부피가 200㎕ 되도록 하였다. 이것을 37℃에서 30분간 방치한 후 560nm에서 흡광도(St)를 측정하였다.

자유라디칼 소거활성(%)은 다음의 수학식 2로 산출하였다.

A: 본 발명의 앵무새나무 발효 추출물을 처리하지 않은 대조군 웰의 흡광도

B: 본 발명의 앵무새나무 발효 추출물을 처리한 실험군 웰의 흡광도

시료명	자유라디칼 소거율(항산화 효과; %)
앵무새나무 발효 추출물 0.1 중량%	88.63
앵무새나무 추출물 0.1 중량%	59.93
BHT 0.1 중량%	82.52

DPPH 법을 이용하여 항산화 효과를 측정한 결과(표 2), 앵무새나무 발효 추출물은 앵무새나무 추출물과 BHT보다 우수한 항산화 효과를 발휘하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 앵무새나무 발효 추출물의 우수한 항산화 효과를 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명 조성물의 우수한 항산화 효과를 추론할 수 있었다.

실험예 3 : 염증유발관련 효소( hyaluronidase ) 활성 억제효과 측정

본 실험에 3에서는 실시예 1에서 수득한 앵무새나무 발효 추출물과 비교예 1에서 수득한 앵무새나무 추출물의 항염증 효과를 측정하기 위해 컴프리 추출물, 시소 추출물, 유용성 감초 추출물을 양성 대조군으로 사용하였고, 염증유발효소인 히아루로니디아제(hyaluronidase) 활성 억제효과를 측정하였다.

히아루로니디아제(hyaluronidase)는 히아루론산을 가수분해하는 효소로 염증유발하는 효소이다. 본 실험예에서는 히아루로니디아제(hyaluronidase)의 활성을 억제하여 항염증효과를 측정하는 방법(Kakegawa Y: Japanese J. of Inflammation, 4, 437-438, 1984)을 응용해 항염증 효과를 판정하였다.

시료 100㎕와 히아루로니디아제 용액(type Ⅳ-S, Sigma, 400U/㎖) 50㎕를 넣고 37℃에서 20분간 반응시킨 후, 효소활성화용액(compound 48/80 CaCl₂2H₂O, Sigma, 0.1㎎/㎖)을 100㎕를 첨가하고 다시 37℃에서 20분간 반응시켰다. 히아루론산(hyaluronic acid) 용액(0.4㎎/㎖)을 250㎕ 넣고 37℃에서 40분간 반응시키고, 0.4N NaOH 100㎕를 넣어 반응을 종결시켰다. 포타슘보레이트 용액을 100㎕ 첨가하여 95℃에서 3분간 반응시키고 냉각시킨 다음 ρ-디메틸아미노벤즈알데히드 용액을 3㎎ 넣고 다시 20분간 37℃에서 반응시킨 후 발색시켰다. 585㎚에서 흡광도를 측정하여 히아루로니디아제 활성 저해율을 측정하였다.

히아루로니디아제의 활성 저해율(%)은 수학식 3에 의하여 계산하였으며, IC₅₀ 값은 히아루로니디아제 효소 활성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

시료명	히아루로니디아제 활성 저해효과 (IC50)
앵무새나무 발효 추출물	0.26%
앵무새나무 추출물	0.17%
컴프리 추출물	0.25%
시소 추출물	0.54%
유용성 감초 추출물	0.22%

히아루로니디아제(hyaluronidase)의 활성 저해효과를 측정한 결과(표 3), 앵무새나무 발효 추출물의 IC₅₀값이 0.26%로 나타나 항염증제로 잘 알려진 컴프리 추출물 및 유용성 감초 추출물과 유사한 효과를 나타내었다.

상기 결과로부터 앵무새나무 발효 추출물의 우수한 항염증 효과를 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명 조성물의 우수한 항염증 효과를 추론할 수 있었다.

실험예 4 : 티로시나제 활성 억제효과 측정

본 실험예 4에서는 상기 실시예 1에서 수득된 앵무새나무 발효 추출물의 티로시나제 활성 저해효과를 확인하기 위해 미백제로 잘 알려진 알부틴을 비교샘플로 사용하였다.

티로시나제는 생체 내에서 티로신(tyrosine)이라는 물질의 산화과정을 촉진하여 멜라닌이 생성되도록 하는 효소이다. 티로시나제는 버섯에서 분리 및 정제된 것으로 Sigma 사에서 구입하여 사용하였다. 기질인 L-티로신(Sigma)은 0.05M 인산나트룸 완충용액(pH 6.8)에 용해하여 0.1㎎/㎖ 용액으로 만들어 사용하였다. 앵무새나무 발효 추출물, 앵무새나무 추출물, 알부틴은 0.05M 인산나트륨 완충용액(pH 6.8)에 적당한 농도로 조절하여 용해한 후 사용하였다. L-티로신 용액 0.5㎖를 시험관에 넣고 여기에 각각의 시료액 0.5를 가하고 37℃ 항온기에서 10분간 방치하였다. 그 후, 시료액에 200unit/㎖ 티로시나제 0.5㎖를 첨가하고 37℃에서 10분간 반응시켰다. 이 반응액이 든 시험관을 얼음 위에 놓아 급냉시켜 반응을 중지시킨 후, 분광광도계를 파장 475nm에서의 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 상기 시료 대신 완충용액 0.5㎖를 넣은 것을 사용하였다.

티로시나제에 대한 저해율(%)은 수학식 4에 따라 계산하였으며, IC₅₀값은 티로시나제 효소 활성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

A : 시료를 넣은 웰의 반응 전 흡광도

B : 시료를 넣은 웰의 반응 후 흡광도

C : 시료를 넣지 않은 웰의 반응 전 흡광도

D : 시료를 넣지 않은 웰의 반응 후 흡광도

시료명	티로시나제 저해 효과 (IC₅₀)
대조군	-
앵무새나무 발효 추출물	0.18
앵무새나무 추출물	0.31
알부틴	0.45

티로시나제 활성 억제효과를 시험한 결과, 표 4에서 확인할 수 있듯이 앵무새나무 발효 추출물의 IC₅₀값은 0.18%로 티로시나제 활성 억제 효과를 나타내어 앵무새나무 추출물의 IC₅₀값인 0.31%보다 우수한 티로시나제 활성 억제효과를 확인할 수 있었다(표 4).

상기 결과로부터 앵무새나무 발효 추출물의 우수한 티로시나제 활성 저해효과를 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명 조성물의 우수한 미백효과를 추론할 수 있었다.

실험예 5 : B16F1 멜라닌 세포를 이용한 멜라닌 합성 억제효과 측정

본 실험예 5에서는 실시예 1에서 수득된 앵무새나무 발효 추출물의 멜라닌 합성 억제효과를 확인하기 위해 미백제로 알려진 알부틴을 비교시료로 사용하였고, B16F1 멜라닌 세포를 이용하였다.

본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공배양 중에 시료를 처리하여 멜라닌색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC(American Type Culture Collection, 기탁번호: 6323)로부터 분양받아 사용하였다. B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라노싸이트를 6웰 플레이트에 각 웰당 2 x 10⁶cells/㎖ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신(trypsin)-EDTA로 떼어낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포 내 멜라닌의 정량은 로탄[Lotan : Cancer Res., 40, 3345-3350(1980)]의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS(phosphate buffered saline)로 1회 세척한 후 균질화 완충액(50mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2mM PMSF(phenylmethanesulphonylfluoride)) 1㎖를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000 rpm, 10분)하여 얻은 세포여액에 1N NaOH10% DMSO(Dimethyl sulfoxide) 포함를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405㎚에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 저해율(%)은 수학식 5에 의하여 계산하였다.

시료명	멜라닌 합성 저해효과(IC₅₀)
음성 대조군	-
앵무새나무 발효 추출물	0.09
앵무새나무 추출물	0.14
알부틴	0.24

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 합성 억제효과를 시험한 결과, 앵무새나무 발효추출물의 IC₅₀은 0.09%로 앵무새나무 추출물의 IC₅₀값인 0.14%보다 우수한 멜라닌 합성 저해 효과를 나타내었다(표 5).

상기의 결과로부터 앵무새나무 발효 추출물의 우수한 멜라닌 합성 저해율을 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명 조성물의 우수한 미백효과를 추론할 수 있었다.

실시예 2 : 앵무새나무 발효 추출물을 함유하는 화장료 제조

본 실시예 2에서는 실시예 1에서 수득한 앵무새나무 발효 추출물을 함유하는 화장료를 제조하였다. 제조된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 6에 나타낸 바와 같다.

우선 표 6에 기재되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존하였고, 나)상에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 서서히 냉각하여 크림(실시예 2, 비교예 2)을 제조하였다.

원료		실시예 2	비교예 2
가	스테아릴 알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부가)알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산 아스테르	2	2
나	앵무새나무 발효 추출물	1	-
	앵무새나무 추출물	-	1
	프로필렌글리콜	5	5
	정제수	100에 대한 나머지	100에 대한 나머지

(단위: 중량%)

실험예 6 : 화장료의 미백효과 측정

본 실험예 6에서는 실시예 2 및 비교예 2의 미백효과를 측정하기 위해 실험자(20세~35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 2를, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 2를 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

2개월 후, 얼굴 좌우 양편의 도포 부위 피부를 화상분석기 및 피부색의 변화를 크로마메타(Minolta CR300)를 이용하여 색의 밝기변화(L)를 측정하고, 복수의 숙련자에 의한 객관적 육안 관찰과 피검자에 의한 주관적 육안 관찰을 실시하여 하기 등급 분류에 따라 효과를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 7에 나타내었고, 미백 효능 정도를 7등급으로 분류하여 평가하였다(-3: 매우 악화, -2: 악화, -1: 약간 악화, 0: 변화 없음, 1: 약간 개선, 2: 개선, 3: 매우 개선).

	피부색의 밝기 변화(L)		숙련자의 객관적 평가		피검자의 주관적 평가
	실시예 2	비교예 2	실시예 2	비교예 2	실시예 2	비교예 2
평균값	4.29	3.15	4.6	3.8	4.7	3.6

화장료의 미백효과를 측정한 결과(표 7), 앵무새나무 발효 추출물을 함유하는 실시예 2가 비교예 2보다 미백효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 본 발명 피부 외용제 조성물의 우수한 미백효과를 확인할 수 있었다.

실시예 3 : 앵무새나무 발효 추출물을 함유한 화장수 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합용해 하였다. 실시예 1에서 수득한 앵무새나무 발효 추출물 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 피부개선효과가 있는 화장수를 얻었다.

실시예 4 : 앵무새나무 발효 추출물을 함유한 유액 제조

세틸알콜 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰 부가)모노올레이트 1g및 향료 0.1g을 70℃에서 가열혼합용해하고, 실시예 1에서 수득한 앵무새나무 발효 추출물 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열해서 용해시킨다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형의 피부개선효과가 있는 유액을 얻었다.

실시예 5 : 앵무새나무 발효 추출물을 함유한 미용액 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히아루론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 실시예 1에서 수득한 앵무새나무 발효 추출물 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 피부개선효과가 있는 미용액을 얻었다.

이상, 본 발명의 바람직한 실시예를 들어 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 본 발명이 속하는 기술분야에서 보통의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 변형이 가능하다.

Claims

(가) 앵무새나무를 추출하는 단계;
(나) 상기 앵무새나무 추출물에 동충하초, 표고버섯, 잎새버섯, 영지버섯 및 치마버섯 중 1종 이상의 균사체 또는 균사체의 전 배양액을 혼합하여 본 배양한 후, 본 배양액으로부터 상기 사용된 균사체를 제거하여 앵무새나무 발효 추출물을 얻는 단계;를 거쳐 얻어진 앵무새나무 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 앵무새나무 발효 추출물은 화장료 조성물 전체에 대해 0.001~30.0 중량%인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 (가) 단계의 앵무새나무 추출시 추출용매로 에탄올이 50~90%(v/v) 함유된 수용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 (나) 단계의 본 배양은 배양액의 pH를 5.0~6.0으로 조정하고, 동충하초, 표고버섯, 잎새버섯, 영지버섯, 치마버섯 중 1종 이상의 균사체를 4~6%(v/v)되도록 접종한 후, 온도 22~32℃, 회전수 120~180rpm, 통기량 1.2~1.8vvm 조건에서 5~7일간 수행하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 화장료 조성물은 피부 미백용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 화장료 조성물은 항산화와 자유라디칼의 소거에 의한 피부 노화의 방지용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 화장료 조성물은 염증 완화용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 화장료 조성물은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 기초 화장료 제형; 수중유형 또는 유중수형의 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류 중에서 선택되어 화장료로 사용하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.