KR20160132151A

KR20160132151A - 피부 외용제 조성물

Info

Publication number: KR20160132151A
Application number: KR1020150062886A
Authority: KR
Inventors: 배준태; 송민현; 강정욱; 홍준기; 이상길; 이근수; 김진화; 표형배
Original assignee: 한불화장품주식회사
Priority date: 2015-05-06
Filing date: 2015-05-06
Publication date: 2016-11-17

Abstract

본 발명은 길경, 감초, 두릅, 연교, 치자, 황백, 황금, 황련, 지황, 작약, 천궁, 당귀, 시호, 박하, 우방자 및 천화분으로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 생약재의 추출물을 추출하는 단계; 상기 추출물에 잎새버섯 균사체 또는 잎새버섯 균사체의 전 배양액을 혼합한 본 배양한 후, 본 배양액으로부터 잎새버섯 균사체를 제거하는 단계; 상기 수득한 여과액에 제주 오메기주를 혼합한 배양액으로부터 누룩균을 제거하는 단계;로부터 수득된 여과액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로, 항산화 효과, 콜라겐 합성 촉진효과, 피부 잔주름 개선효과, 미백효과, 보습효과, 피부자극 완화효과, 여드름 방지효과, 아토피 개선효과 및 항염 효과 등 피부개선에 우수한 효과를 발휘한다.

Description

피부 외용제 조성물{Skin agent composition}

본 발명은 피부 외용제 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 생약재 추출물에 잎새버섯 균사체를 첨가, 배양하여 수득한 생약재 발효 추출물에 오메기주를 재첨가하고 배양하여 수득한 여과액을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연 추출물로부터 얻어진 항산화, 주름완화, 미백, 가려움 완화 등의 기능을 가진 기능성 화장료(functional cosmetics)에 많은 관심이 집중되고 있다. 예를 들어, 미국 특허공보 US 5,972,341는 코미포라 무쿨(Commiphora mukul) 추출물의 주름 개선효과에 관하여, 일본특허공개 평9-672662는 히알우로니다제(Hyaluronidase)억제 효능을 가지는 해초류 추출물들에 관하여, 일본특허공개 평10-85905은 와카메(Wakame)로부터 추출된 푸코이단 (Fucoidan)의 피부감촉 개선효과에 관하여, 일본특허공개 평2-245087은 사르가숨(Sargassum)속 추출물의 항산화 효과에 관하여, 대한민국 특허 제0431076호는 백급, 자소, 에키나시아 및 발효대두 추출물을 포함하는 아토피 피부의 치유 개선용 화장료 조성물을, 대한민국 특허 제0511494호는 하수오, 시엽, 일라이트를 포함하는 아토피 피부염 치료를 위한 추출물 및 조성물을, 대한민국 특허출원 공개 제2004-0011584호는 감초, 창이자, 홍화, 돈지(돼지비계)와 같은 천연성분의 물질을 정제 혼합하여 구성된 아토피성 피부질환의 치료에 우수한 조성물에 관해 개시하고 있다.

한편, 한방 생약재의 유효성분은 체내흡수율과 생체이용률은 높으나, 이를 단순 추출한 추출물의 경우 생체 외에서는 유효한 효능을 나타내지만 이를 함유하는 피부 외용제의 경우는 그 효과가 만족스럽지 못한 문제점이 있어 실용성이 높지 않았다.

그러나, 발효액 추출물은 유기용매를 사용하지 않고, 인체에 유익한 미생물을 사용하여 생약재에 존재하는 당(glucose) 한 분자 이상이 결합되고 상대적으로 분자량이 큰 배당체(glycosides)를 저분자의 비배당체(aglycones)로 전환하여 유효성분이 각질층을 좀 더 쉽게 통과하고 효과적으로 피부로 흡수되는 효과를 얻을 수 있다.

따라서, 고유의 생약재가 가지는 독성을 낮추어 피부 자극이 없어 안전하고, 피부의 유효한 효능을 극대화한, 생약재 발효액 추출물을 이용한 새로운 피부 외용제 개발이 더욱 필요한 실정이다.

본 발명자들은 대한민국 특허 제10-1081913호에서 길경, 감초, 두릅, 연교, 치자, 황백, 황금, 황련, 지황, 작약, 천궁, 당귀, 시호, 박하, 우방자 및 천화분으로 이루어지는 생약혼합물로부터 추출한 추출물에 잎새버섯 균사체를 가하여 배양한 발효 생약추출물에서 효능효과를 나타내는 주요성분이 비배당체인 플라보노이드(Flavonoid)임을 확인하였다.

그러나, 상기 발효 생약추출물에 함유된 고점도의 수용성 다당체 성분은 염과 pH 등에 의한 점도 변화가 심하며, 알코올류와 만나 젤화(gelation) 되는 특징이 있어 화장료로 이용하기에 용이하지 않았다. 또한, 다당체는 친수성 고분자량인 분자구조로 인해 경피 투과가 어렵고 이로 인해 경구투여를 통해 기대할 수 있는 다양한 생리활성이 화장품의 사용 형태인 경피 도포를 통해 나타나기 어렵다는 단점이 있다.

이에 본 발명은 상기의 같은 문제점을 해결하기 위하여 화장품 안정성에 영향을 미치는 유기용매를 이용한 산분해 방법을 이용하지 않고, 제주 오메기주를 처리하게 되면 효소적 방법으로 오메기주의 누룩균으로부터 생성된 당 가수분해효소로 인하여 상기 발효 생약추출물의 다당체를 분해하여 저분자화할 경우, 화장품 원료로서 가지는 물리화학적 단점 및 상용성 문제를 해결할 수 있으며, 또한 친수성 고분자가 가지는 특성으로 인해 경피 도포 등에 의해 주목할 만한 생리활성이 나타나지 않는 단점을 극복할 뿐만 아니라, 발효 생약추출물의 생리활성성분인 비배당체 형태의 플라보노이드 함량이 더 증강될 수 있음을 알게 되었다.

즉, 본 발명은 길경, 감초, 두릅, 연교, 치자, 황백, 황금, 황련, 지황, 작약, 천궁, 당귀, 시호, 박하, 우방자 및 천화분으로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 생약재의 추출물에 잎새버섯 균사체를 첨가, 배양하여 수득한 생약재 발효 추출물에 오메기주를 재첨가, 배양하여 수득한 여과액을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 길경, 감초, 두릅, 연교, 치자, 황백, 황금, 황련, 지황, 작약, 천궁, 당귀, 시호, 박하, 우방자 및 천화분으로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 생약재의 추출물을 추출하는 단계; 상기 추출물에 잎새버섯 균사체 또는 잎새버섯 균사체의 전 배양액을 혼합하여 본 배양한 후, 본 배양액으로부터 잎새버섯 균사체를 제거하여 여과액을 얻는 단계; 상기 수득한 여과액에 제주 오메기주를 혼합하여 배양하는 단계; 상기 배양액으로부터 누룩균을 제거하는 단계;로부터 수득된 여과액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.

이하 본 발명의 과제 해결 수단에 대해 상세히 설명하고자 한다.

길경, 감초, 두릅, 연교, 치자, 황백, 황금, 황련, 지황, 작약, 천궁, 당귀, 시호, 박하, 우방자 및 천화분으로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 생약재로부터 단순추출한 추출물인 경우, 생체 외에서는 유효한 효능을 나타내지만, 이를 피부 외용제에 적용한 경우에는 실질적으로 그 효과가 만족스럽지 못한 문제점이 있다.

또한, 상기 생약추출물에서 잎새버섯 균사체를 배양한, 발효 생약추출물의 경우에는 고점도 수용성 다당체로 인한 화장료로 이용하기가 용이하지 않은 문제점과 경피투과가 어렵고 이로 인해 경구투여를 통해 기대할 수 있는 다양한 생리활성이 화장품의 사용 형태인 경피 도포를 통해 나타나기 어렵다는 단점을 가지고 있다.

따라서 본 발명은 피부투과율이 용이하여 피부 외용제로서의 효과적인 역할을 하는 피부 외용제 조성물을 제공하기 위해 길경, 감초, 두릅, 연교, 치자, 황백, 황금, 황련, 지황, 작약, 천궁, 당귀, 시호, 박하, 우방자 및 천화분으로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 생약재의 추출물을 추출하는 단계; 상기 추출물에 잎새버섯 균사체 또는 잎새버섯 균사체의 전 배양액을 혼합한 본 배양한 후, 본 배양액으로부터 잎새버섯 균사체를 제거하는 단계; 상기 수득한 여과액에 제주 오메기주를 혼합한 배양액으로부터 누룩균을 제거하는 단계;로부터 수득된 여과액을 유효성분으로 함유하는데, 상기의 단계를 통해 수득된 여과액은 생약혼합물로부터 추출한 추출물 또는 잎새버섯 균사체로부터 배양한 발효 생약추출물보다 총 페놀함량 및 총 플라보노이드 함량이 증가한 것과 고분자 다당체의 저분자화된 것을 본 실험예에서 확인하였다.

한편, 본 발명에 유효성분으로 함유되는 여과액은 항산화 효과, 세포내 활성산소 제거 효과, 기질 금속단백질분해효소(MMP-1) 활성 저해효과, 기질 금속단백질분해효소(MMP-1) 발현 억제효과, 프로콜라겐 생합성 촉진효과, 엘라스틴 생성 촉진효과, 미백효과, 염증유발관련 효소(hyaluronidase) 활성 억제효과, 자외선 조사에 의한 세포독성 완화효과, 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과, 여드름균에 대한 항균효과, 아토피 피부염에 대한 항염증효과, 수분흡습성이 우수하다는 사실을 확인할 수 있었고, 그로부터 제조된 본 발명의 피부 외용제 조성물은 주름개선효과, 미백효과, 아토피성 피부염 개선효과, 피부자극 완화효과가 우수하다는 사실도 확인할 수 있었다.

한편, 생약혼합물은 바람직하게 길경, 감초, 두릅, 연교, 치자, 황백, 황금, 황련, 지황, 작약, 천궁, 당귀, 시호, 박하, 우방자 및 천화분이 각각 1~30 중량부로 조성된 것이 좋다.

한편, 본 발명에서 여과액은 바람직하게 피부 외용제 조성물 전체에 대해 0.001~30.0 중량% 함유되는 것이 좋은데, 0.001 중량% 미만으로 포함되는 경우에는 피부개선효과가 미미하고, 30.0 중량%를 초과하는 경우에는 재료 투입량 대비 효율성이 떨어져 경제적이지 못하기 때문이다.

한편, 본 발명에서 추출물은 바람직하게 추출 후, 감압농축 또는 동결건조된 것이 좋고, 이때, 감압농축 또는 동결건조된 추출물은 가장 바람직하게 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜 중 선택되는 어느 하나 이상의 용매에 용해된 것이 좋으며, 이때, 감압농축 또는 동결건조된 추출물은 가장 바람직하게 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜 중 선택되는 어느 하나 이상의 용매에 0.001~30.0 중량% 용해된 것이 좋다.

한편, 본 발명에서 잎새버섯 균사체(KCTC 10337BP) 배양은 바람직하게 배양액의 pH를 5.0~6.0으로 조정하고, 잎새버섯 균사체를 4~6%(v/v)되도록 접종한 후, 온도 22~32, 회전수 120~180rpm, 통기량 1.2~1.8vm 조건에서 5~7일간 배양하는 것이 좋다.

한편, 본 발명에서 제주 오메기주 배양은 바람직하게 상기 발효 생약재추출물에 제주 오메기주를 1~50%(v/v)되도록 접종한 후, 온도 25~35℃, 회전수 120~180rpm, 통기량 1.2~1.8vm 조건에서 3~6일간 배양하는 것이 좋다.

한편, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 바람직하게 화장료 조성물인 것이 좋은데, 화장료 조성물의 제형으로는 일예로 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 기초화장료 제형; 수중유형 또는 유중수형의 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 색조화장료 제형;이 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물은 피부 미백용, 노화방지용, 피부자극완화용, 아토피 피부 개선용 또는 여드름 예방용으로 이용 가능하다.

본 발명은

(가) 길경, 감초, 두릅, 연교, 치자, 황백, 황금, 황련, 지황, 작약, 천궁, 당귀, 시호, 박하, 우방자 및 천화분으로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 생약재를 추출하는 단계;

(나) 상기 추출물에 잎새버섯 균사체 또는 잎새버섯 균사체의 전 배양액을 혼합하여 1차 배양한 후, 배양액으로부터 잎새버섯 균사체를 제거하는 단계;

(다) 상기 균사체가 제거된 1차 배양액에 제주 오메기주를 혼합하여 2차 배양하는 단계; 및

(라) 2차 배양액으로부터 누룩균을 제거하는 단계;를 거쳐 얻어진 여과액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 생약재는 길경, 감초, 두릅, 연교, 치자, 황백, 황금, 황련, 지황, 작약, 천궁, 당귀, 시호, 박하, 우방자 및 천화분이 각각 1~30 중량부임을 특징으로 한다.

본 발명에서 상기 여과액은 화장료 조성물 전체에 대해 0.001~30.0 중량% 함유되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 상기 화장료 조성물의 제형은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 기초화장료 제형; 수중유형 또는 유중수형의 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 색조화장료 제형; 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 상기 화장료 조성물은 피부 미백용, 노화 방지용, 피부자극 완화용, 아토피 피부 개선용, 여드름 예방 또는 개선용 기능성 화장품으로 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은

(라) 2차 배양액으로부터 누룩균을 제거하는 단계;를 거쳐 얻어진 여과액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 아토피 피부 및 여드름 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 약학 조성물의 제형은 경고제(PLASTERS), 로션제(LPTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPESIONS), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 첩부제, 서방화제제 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

오메기주 발효추출물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물은 약학 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 주사형태 또는 도포제 등으로 제형화할 수 있다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.

이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 비경구 방식 즉, 피하 투여, 근육 투여 또는 국소적용(topical application)할 수 있으며, 용량은 일일 투여량이 0.001㎍~10㎎/㎏의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

또한, 본 발명의 도포제 제형 약학 조성물은 통상적인 제조방법에 따라 어떤 형태로든 용이하게 제조할 수 있다. 일례로서 크림형 도포제를 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W) 또는 유중수형(W/O)의 크림 베이스에 본 발명의 오메기주 발효추출물을 함유하고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 필요에 따라 사용하는 한편, 물성개선을 목적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 병용할 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 오메기주 발효추출물을 함유하는 화장료 조성물 또는 약학 조성물은 항산화, 콜라겐 합성 촉진, 피부 잔주름 개선, 미백, 보습, 피부자극 완화, 여드름 방지, 아토피 개선 및 항염증의 효과를 갖는 생약혼합물로부터 추출된 추출물을 발효시켜 제조한 여과액을 함유함으로써 우수한 피부 개선효과를 발휘한다.

도 1은 잎새버섯 균사체 발효추출물(비교예 2)과 오메기주 발효추출물(실시예 1)의 다당체 분자량을 겔 투과 크로마토그래프를 이용한 분자량 분포 확인 시험 결과이다.

아래에서는 본 발명의 구성 및 작용에 대해 실시예에서 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

비교예 1: 생약 혼합물로부터 추출물 제조

세절하여 음건한 길경 30g, 감초 30g, 두릅 30g, 연교 30g, 치자 30g, 황백 30g, 황금 10g, 황련 10g, 지황 30g, 작약 30g, 천궁 30g, 당귀 30g, 시호 30g, 박하 10g, 우방자 30g, 천화분 30g을 95%(v/v) 에탄올 수용액으로 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조시킨 후, 수득한 동결 건조물을 15 중량% 함유되도록 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜 혼합용매에 용해하여 생약 혼합물로부터 추출물(이하, '생약 혼합추출물'이라 함)을 제조하였다.

비교예 2: 비교예 1의 생약 혼합추출물을 발효하여 여과액 제조

잎새버섯 KCTC 10337BP 균사체를 효모-맥아즙 한천배지가 든 시험관에 사면배양하여 4℃에 보관하고 1개월마다 계대배양하여 사용하였다. 상기 사면배지에서 계대배양된 균사체를 무균적으로 균질화하여 비교예 1에서 수득한 생약 혼합추출물과 당이 혼합된 최적화된 합성배지(대한민국 특허: 10-0461960)로 제조하였으며, pH 5.5로 조정한 액체배지에 잎새버섯 균사체가 5%(v/v)되도록 접종한 후 발효조 내에서 온도 27℃, 회전수 150rpm, 통기량 1.5vvm의 조건으로 6일간 배양하였다. 배양 후 배양액으로부터 잎새버섯 균사체를 제거한 다음 1차 여과액(이하 '발효 생약추출물'이라 함)을 수득하였다.

실시예 1: 비교예 2로부터 얻은 발효 생약추출물을 2차 발효하여 여과액 제조

제주도 전통주인 오메기주는 제조 직후 공급받아 4℃에 보관하고 누룩균 또는 당 가수분해효소의 활성이 우수한 5일 이내의 오메기주를 사용하였다. 비교예 2에서 수득한 발효 생약추출물에 제주 오메기주가 10%(v/v) 되도록 접종한 후, 발효조 내에서 온도 32℃, 회전수 150rpm, 통기량 1.5vvm의 조건으로 5일간 배양하였다. 배양 후 배양액으로부터 누룩균을 제거한 다음 2차 여과액(이하 '오메기주 발효추출물'이라 함)을 수득하였다.

실험예 1: 발효추출물에 함유된 성분 분석 및 함량 측정

본 실험예 1에서는 상기 비교예 1 내지 2에서 제조된 생약 혼합추출물과 발효 생약추출물 그리고, 실시예 1에서 제조된 오메기주 발효추출물의 주요성분 중 페놀성 물질, 플라보노이드, 플라보노이드 배당체 등을 정성분석하고, 페놀함량과 총 플라보노이드 함량을 비교하였다.

먼저 페놀성 물질, 플라보노이드, 플라보노이드 배당체 등의 정성분석은 아래와 같이 수행하였다.

(1) 페놀성 물질, 플라보노이드의 정성분석

비교예 1(생약 혼합추출물), 비교예 2(잎새 발효추출물)와 실시예 1(오메기주 발효추출물)에 각각 2.5% FeCl₃ 에탄올 용액을 1-2 방울 떨어뜨려 방치할 때, 암녹색으로 정색하거나 침전의 생성 여부를 관찰하였다

(2) 플라보노이드 배당체의 정성분석

진한 황산법을 이용, 비교예 1 내지 2와 실시예 1에서 얻은 시료에 각각 5㎖의 진한 황산을 점적하여 황색 및 황적색 침전의 생성을 관찰하였다.

(3) 당의 정성분석

비교예 1 내지 2와 실시예 1에 각각 5% a-나프톨 알콜 시액 2-3 방울을 넣은 후 농황산을 기벽을 통하여 가할 때 경계면에 적자색이 나타나는지 관찰하였다.

정성분석을 수행한 결과, 비교예 1 내지 2와 실시예 1에서 얻은 산물에 페놀성 물질, 플라보노이드, 플라보노이드 배당체가 함유되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

총 페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량 측정은 아래와 같이 수행하였다.

(4) 총 페놀함량 측정

비교예 1 내지 2, 실시예 1에서 얻은 시료 1㎖에 각각 증류수 10㎖을 첨가한 후, 2의 Folin-Ciocalteu phenol reagent(Sigma)를 첨가하여 혼합한 다음, 실온에서 5분간 반응시켰다. 이 반응물에 20% 소듐 카보네이트를 2㎖ 첨가하여 혼합한 다음, 상온에서 1시간 반응시킨 후 680nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 지표물질은 갈릭산(gallic acid)을 사용하였다.

(5) 총 플라보노이드 함량 측정

비교예 1 내지 2와 실시예 1에서 얻은 시료 1.5㎖에 각각 동량의 메탄올에 용해된 2% AlCl₃·6H₂O을 혼합한 다음, 상온에서 10분간 반응을 시킨 후 367nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 지표물질은 카테킨(catechin)을 사용하였다.

시료명	총 페놀 함량 (ug/mg of extract)	총 플라보노이드 함량 (ug/mg of extract)
비교예 1	427.3	32.1
비교예 2	518.7	53.2
실시예 1	541.5	62.8

총 페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량 측정 결과(표 1), 실시예 1이 비교예 1 내지 2보다 총 페놀함량 및 총 플라보노이드 함량이 높은 것을 확인할 수 있었는데, 특히, 플라보노이드 함량은 비교예 1에 비해 95%, 비교예 2에 비해 18% 이상 증가한 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 단순 추출에 의해 제조된 생약 혼합추출물과 잎새버섯 균사체를 발효시킨 여액에 제주 오메기주를 가하여 발효시킴으로써 총 페놀함량 및 총 플라보노이드 함량을 증가시킬 수 있다는 사실을 확인하였고, 이를 바탕으로 오메기주 발효추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 피부 외용제 조성물을 제조하였다.

실험예 2: 오메기주 발효추출물의 다당체 분자량 확인

상기 비교예 2와 실시예 1에서 수득한 다당체의 분자량 분포를 확인하기 위해 겔 투과 크로마토그래피(Gel permeation chromatography)를 이용한 분자량 분포 확인 시험을 수행하였다. Waters (USA)사의 2695 시스템을 이용하였으며, 겔 투과 크로마토그래피 컬럼은 Shodex (Japan)사의 Asahipak GF-150 HQ (7.6mm ID X 300mm)를 사용하였다. 이동상은 pH 4.75 초산 완충액 100%를 이용하였다. 컬럼 온도 50, 0.6 ml/min의 등용매 조건으로 전개, ELSD (Evaporative Light Scattering Detector) 탐지기로 확인하였다. 분자량은 말토스와 덱스트란 표준품을 사용하여 체류시간(retention time)과의 관계를 확인하였으며, 글루코스 단위(glucose unit)로 구성되어 있는 글루코스, 말토스와 덱스트란은 분자량에 따라 일정한 속도로 GPC 컬럼으로부터 용출되는 것을 확인하였다.

시료명	주피크 추정 분자량(daltons)
비교예 2	1,108,622
실시예 1	19,237

도 1 및 표 2에서 확인할 수 있듯이, 비교예 2에서 수득한 발효 생약추출물의 추정 분자량은 약 1,100,000 dalton으로 고분자의 특성을 나타낸다. 실시예 1에서 수득한 오메기주 발효추출물의 경우, 비교예 2에서 수득한 잎새버섯으로 발효한 생약추출물의 고분자 다당체가 오메기주를 가하여 배양함으로써 19,000 dalton으로 가수분해되었음을 확인할 수 있었다.

실험예 3: NBT 법을 이용한 항산화 효과 측정

상기 비교예 1 내지 2와 실시예 1에서 수득된 추출물의 항산화 수준을 확인하기 위해 항산화제로 잘 알려진 BHT(Butylated hydroxy toluene)를 비교시료로 사용하였고, 항산화 측정은 NBT법을 이용하였다.

NBT법은 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 활성산소를 생성시키고, 생성된 활성산소와 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)가 반응하여 생성된 청색을 파장 560nm에서 측정하는 방법으로, 활성산소 소거율을 측정하였으며, 측정방법은 아래와 같다.

바이엘병에 0.05M의 Na₂CO₃ 2.4, 3mM의 크산틴 용액 0.1, 3mM의 EDTA 용액 0.1, BSA 용액 0.1, 0.72mM의 NBT 용액 0.1를 가하고 여기에 시료용액을 각각 첨가한 후, 25에서 10분간 방치하였다. 방치 후, 크산틴 옥시다제 용액 0.1를 가하여 빠르게 교반한 다음, 25에서 20분간의 배양을 하였고, 여기에 6mM의 CuCl₂용액 0.1을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도(St)를 측정하였다. 공시험은 시료용액 대신 증류수를 사용한 것으로 상기와 동일한 방법으로 흡광도(Bt)를 측정하였다. 시료용액의 블랭크(Blank)는 크산틴 옥시다제 용액 대신 증류수를 사용해 상기와 동일한 방법으로 흡광도(Bo)를 측정하였다.

측정 결과는 수학식 1에 의하여 산출하였다.

<수학식 1>

활성산소 소거율(%) = [1-(St-So)/(Bt-Bo)] × 100

St : 시료용액의 효소 반응 후의 560에서의 흡광도,

Bt : 공시험용액의 효소 반응 후의 560에서의 흡광도,

So : 효소 무첨가 시료용액의 효소 반응 전의 560에서의 흡광도,

Bo : 효소 무첨가 공시험용액의 효소 반응 전의 560에서의 흡광도

시료명	활성산소 소거율(항산화 효과;%)
비교예 1 (0.1 중량%)	75
비교예 2 (0.1 중량%)	92
실시예 1 (0.1 중량%)	98
BHT (0.1 중량%)	85

NBT법을 이용한 항산화 효과를 측정한 결과(표 3), 오메기주 발효추출물은 발효 생약추출물이나 양성 대조군인 BHT에 비해 같은 농도에서 좀 더 우수한 항산화효과를 발휘하는 것을 확인할 수 있었다.

위의 결과로부터 본 발명의 유효성분인 오메기주 발효추출물의 우수한 항산화효과를 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명의 현저한 효과를 추론할 수 있었다.

실험예 4: DPPH 법을 이용한 항산화 효과 측정

본 비교예 1 내지 2와 실시예 1에서 수득된 추출물의 항산화 수준을 확인하기 위해 항산화제로 잘 알려진 BHT를 비교샘플로 사용하였고, 항산화 측정은 DPPH법을 이용하였다. DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 자유라디칼 소거활성을 측정하는 것이다. 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정한다.

각 시료를 0.1% 농도로 준비한 후, 각각 96-웰 플레이트에 넣었다. 여기에 100uM 메탄올용액으로 제조된 DPPH를 첨가하여 용액의 총 부피가 200㎕가 되도록 하였다. 이것을 37℃에서 30분간 방치한 후 560nm에서 흡광도(St)를 측정하였다.

자유라디칼 소거활성(%)은 다음의 수학식 2로 산출하였다.

<수학식 2>

자유라디칼 소거활성(%)= {100-(B/A)}X100

A: 본 발명의 추출물을 처리하지 않은 대조군 웰의 흡광도,

B: 본 발명의 추출물을 처리한 실험군 웰의 흡광도.

시료명	자유라디칼 소거율 (항산화 효과; %)
비교예 1 (0.1 중량%)	71
비교예 2 (0.1 중량%)	90
실시예 1 (0.1 중량%)	97
BHT (0.1 중량%)	81

DPPH 법을 이용하여 항산화 효과를 측정한 결과(표 4), 오메기주 발효추출물은 발효 생약추출물이나 양성 대조군인 BHT에 비해 우수한 항산화 효과를 발휘하는 것을 확인할 수 있었다.

위 결과로부터 오메기주 발효추출물의 우수한 항산화 효과를 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명의 현저한 효과를 추론할 수 있었다.

실험예 5: 세포내 활성산소 소거 효과 측정

본 비교예 1 내지 2와 실시예 1에서 수득된 추출물에 대하여 자외선에 의해 세포 내에서 생성되는 활성산소의 소거 효과를 측정하기 위해 EGCG(epigallocatechin gallate)를 비교샘플로 사용하였고, 형광물질을 이용하여 아래와 같은 실험을 수행하였다.

본 실험예 5에서 사용한 세포주는 독일 암연구센터의 퓌세니그 박사(Dr. Fusenig)로부터 분양받은 인간 각질세포 HaCaT 세포주(Human keratinocytes HaCaT cell line)로서 이를 형광측정용 96-웰 블랙 플레이트(well black plate)에 웰당 2.0 × 10⁴개로 분주하고 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 첨가된 DMEM(Dulbeccos Modification of Eagles Medium, FBS 10%, Gibco, USA) 배지를 사용하여 37, 5% CO₂ 조건에서 1일간 배양한 후, 각각의 시료를 0.01% 농도로 처리하였다.

시험 시료를 넣고 24시간 배양한 후, HCSS(HEPES-buffered control salt solution)로 세척하여 남아있는 배지를 제거하고 HCSS에 20μM로 준비된 DCFH-DA (2',7'- dichlorodihydro-fluorescein diacetate, Molecular Probes, USA)를 100㎕ 가하고 37℃, 5% CO₂ 조건에서 20분간 배양한 후, HCSS로 세척하였다. 이후 농도별로 처리된 HCSS를 100㎕ 가한 후, 초기에 활성산소로 산화된 DCF(dichlorofluorescein)의 형광도를 형광플레이트리더(Ex;485 nm, Em;530nm)로 측정하였다. 이후 UVB(20mJ/cm²)를 조사하고 각 시료를 처리한 후, 형광도를 형광플레이트 리더(Ex;485 nm, Em;530nm)로 측정하였다.

시료명	활성산소 소거 효과(%)
비교예 1 (0.01 중량%)	37
비교예 2 (0.01 중량%)	42
실시예 1 (0.01 중량%)	50
EGCG 0.01 중량%	43

활성산소의 소거 효과를 측정한 결과(표 5), 오메기주 발효추출물은 EGCG와 동일한 농도에서 EGCG보다 높은 활성산소 소거율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

위 결과로부터 오메기주 발효추출물의 우수한 활성산소 소거 효과를 확인할 수 있었다.

실험예 6: 인 비트로에서 금속단백질분해효소 ( MMP -1) 활성 저해율 측정

노화가 진행되면 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포 외 기질의 합성이 감소하고, 콜라겐을 분해하는 효소인 금속단백질분해효소(MMP-1)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하될 뿐만 아니라, 주름도 형성된다.

실험예 6에서는 비교예 1 내지 2와 실시예 1에서 수득한 추출물에 대하여 인 비트로에서 금속단백질분해효소(MMP-1) 활성 저해율을 측정하기 위해 녹차추출물을 비교시료로 사용하였고, 형광분석법을 이용하였다.

실험에 사용한 기질은 형광물질이 표지된 DQ-콜라겐이고, 효소(collagenase)는 Molecular probe사(Eugene, OR, USA)에서 시판중인 제품을 사용하였으며, 반응완충액(0.5 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl, 50 mM CaCl₂, 2 mM sodium azide, pH 7.6)은 10배 희석 후 사용하였다. 반응완충액 100㎕에 0.25㎎/㎖로 반응완충액에 용해한 DQ 콜라겐 20㎕와 시료(0.1중량%) 40㎕를 첨가하고 0.5단위로 희석한 콜라게네이즈 40㎕을 첨가하였다. 암소, 실온에서 20분 경과 후, 형광 분광광도계(Perkin Elmer, UK)를 이용하여 흡수파장 495 nm, 방출파장 515 nm로 형광값을 측정하였다. 대조군은 효소액 대신 반응완충액을 효소와 동량 첨가한 후 형광값을 측정하였으며 시료 자체의 형광값도 측정하여 효소활성 계산시 보정하였다.

시료명	금속단백질분해효소(MMP-1) 활성 저해율(%)
비교예 1 (0.1 중량%)	62
비교예 2 (0.1 중량%)	72
실시예 1 (0.1 중량%)	89
녹차 추출물 (0.1 중량%)	74

인 비트로에서 금속단백질분해효소(MMP-1) 활성 저해율을 측정한 결과(표 6), 오메기주 발효추출물은 녹차 추출물에 비해 금속단백질분해효소(MMP-1) 활성을 효과적으로 저해하는 것을 확인할 수 있었다.

위의 결과로부터 오메기주 발효추출물의 금속단백질분해효소(MMP-1) 활성 저해효과가 우수하다는 사실을 확인할 수 있었고, 이를 바탕으로 본 발명의 피부 외용제 조성물은 금속단백질분해효소를 효과적으로 저해함으로써 피부의 탄력 저하 및 주름 형성을 예방할 수 있음을 추론할 수 있다.

실험예 7: 자외선 조사 후 금속단백질분해효소 ( MMP -1) 발현억제 정도 측정

콜라겐을 분해하여 피부의 탄력 저하 및 주름 형성에 영향을 미치는 금속단백질분해효소(MMP-1)는 자외선 조사에 의해 활성화되기도 한다. 본 실험예 7에서는 비교예 1 내지 2와 실시예 1에서 수득한 추출물에 대하여 자외선 조사 후 금속단백질분해효소(MMP-1) 발현억제 정도를 측정하기 위해 레티놀을 비교시료로 사용하였다.

UV 조사 및 시료 첨가 후, 금속단백질분해효소(MMP-1) 농도를 측정하기 위해서 효소면역 시험법(ELISA)를 수행하였다. UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 6.3J/㎠의 에너지로 조사하였고, 자외선 조사량과 배양시간은 예비 실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP-1 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간 유지하였고, UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사한 후, 시료가 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후, 배지를 회수하여 96-웰 플레이트에 코팅하였다. 일차항체(MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 60분 반응시켰다. 이차항체인 항마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질 용액(1mg/㎖ ρ-nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 리더로 405nm 에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였다.

시험군	MMP-1 발현억제율(%)
대조군	-
비교예 1 (0.01 중량%)	16
비교예 2 (0.01 중량%)	29
실시예 1 (0.01 중량%)	54
레티놀 (0.01 중량%)	33

자외선 조사 후 금속단백질분해효소(MMP-1) 발현억제 정도를 측정한 결과(표 7), 시료를 처리하지 않은 대조군에 비해 오메기주 발효추출물은 54% 이상의 억제율을 보였는데, 이는 비교시료로 사용한 레티놀의 억제율에 비해서도 상당히 우수한 결과였다.

위의 결과로부터 오메기주 발효추출물의 금속단백질분해효소(MMP-1) 발현 억제효과가 우수하다는 사실을 확인할 수 있었고, 이를 바탕으로 본 발명의 피부 외용제 조성물은 금속단백질분해효소의 발현을 효과적으로 억제함으로써 피부의 탄력 저하 및 주름 형성을 예방할 수 있음을 추론할 수 있었다.

실험예 8: 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진효과 측정

본 실험예 8에서는 비교예 1 내지 2와 실시예 1에서 수득된 추출물의 피부기질 성분인 타입 1 프로콜라겐의 생합성을 촉진하는 효과를 확인하기 위하여 TGF-β를 양성대조군으로 사용하였고, 프로콜라겐 분석(procollagen assay)을 아래와 같이 수행하였다.

신생아의 포피조직에서 분리한 사람진피섬유아세포(human dermal fibroblast)는 Modern Tissue Technology(MTT, Korea)로부터 분양받아 DMEM/F-12(3:1) 배지에 10% 우태아혈청(FBS)을 첨가하여 1×10⁴cell/㎠ 농도로 배양하였다. 70-80% 정도 자라면 1:3의 비율로 분주하여 계대 배양하였고, 3~4차 계대배양된 세포를 실험에 이용하였다.

프로콜라겐의 양을 측정하는 실험을 위해서 섬유아세포를 48 웰 플레이트(well plate)에 90% 이상 배양한 후, 각각의 시료를 0.02% 농도로 가하고, 24시간 후에 배지 중에 유리된 프로콜라겐의 양을 프로콜라겐타입-1C-펩타이드 EIA 키트(procollagen type-1 C-peptide EIA kit)(MK101, Takara, Japan)를 사용하여 측정하였다.

시료명	프로콜라겐 생합성 촉진효과(%)
비교예 1 (0.02 중량%)	13
비교예 2 (0.02 중량%)	20
실시예 1 (0.02 중량%)	36
TGF-β(0.001 중량%)	35

프로콜라겐 생합성 촉진효과를 측정한 결과(표 8), 오메기주 발효추출물을 0.02% 처리한 경우 프로콜라겐의 생합성은 36% 촉진되었으며, 세포신호전달 물질 TGF-β와 유사한 효과를 나타내었다.

위 결과로부터 오메기주 발효추출물의 우수한 프로콜라겐 생합성 촉진효과를 확인할 수 있었고, 그로부터 제조된 본 발명 오메기주 발효추출물의 피부 개선효과를 추론할 수 있었다.

실험예 9: 티로시나제 활성 억제효과 측정

본 실험예 9에서는 상기 비교예 1 내지 2와 실시예 1에서 수득한 추출물의 티로시나제 활성 저해효과를 확인하기 위해 미백제로 잘 알려진 알부틴을 비교시료로 사용하였다.

티로시나제는 생체 내에서 티로신(tyrosine)이라는 물질의 산화과정을 촉진하여 멜라닌이 생성되도록 하는 효소이다. 티로시나제는 버섯에서 분리 및 정제된 것으로 Sigma 사에서 구입하여 사용하였다. 기질인 L-티로신(Sigma)은 0.05M 인산나트룸 완충용액(pH 6.8)에 용해하여 0.1㎎/㎖ 용액으로 만들어 사용하였다. 각각의 시료는 0.05M 인산나트륨 완충용액(pH 6.8)에 적당한 농도로 조절하여 용해한 후 사용하였다. L-티로신 용액 0.5㎖를 시험관에 넣고 여기에 시료액 0.5㎖를 가하고 37℃ 항온기에서 10분간 방치하였다. 그 후, 시료액에 200unit/㎖ 티로시나제 0.5㎖를 첨가하고 37℃에서 10분간 반응시켰다. 이 반응액이 든 시험관을 얼음 위에 놓아 급냉시켜 반응을 중지한 후, 분광광도계로 파장 475nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 상기 시료 대신 완충용액 0.5㎖를 넣은 것을 사용하였다.

상기 각 시료의 티로시나아제 활성 저해율은 수학식 3에 따라 계산하였다.

<수학식 3>

티로시나제 활성 저해율(%) = 100-[(비교군흡광도/대조군흡광도)]X100

시료명	티로시나제 활성 저해율(%)
대조군	-
비교예 1 (0.02 중량%)	25
비교예 2 (0.02 중량%)	42
실시예 1 (0.02 중량%)	57
알부틴 (0.2 중량%)	58

티로시나제의 활성 저해효과를 측정한 결과(표 9), 오메기주 발효추출물 0.02 중량% 처리시, 알부틴 0.2 중량%와 유사한 티로시나제 활성 저해율이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

위 결과로부터 오메기주 발효추출물의 우수한 티로시나제 활성 저해효과를 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명에 의한 오메기주 발효 추출물의 우수한 미백효과를 추론할 수 있었다.

실험예 10: B16F1 멜라닌 세포를 이용하여 멜라닌 합성 억제효과 측정

본 실험예 10에서는 비교예 1 내지 2와 실시예 1에서 수득된 추출물의 멜라닌 합성 억제효과를 확인하기 위해 미백제로 알려진 알부틴을 비교샘플로 사용하였고, B16F1 멜라닌 세포를 이용하였다.

실험에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. B16F1 멜라닌 세포의 멜라닌 합성 억제효과 측정은 다음과 같이 수행하였다. B16F1 멜라닌 세포를 6-웰 플레이트에 각 웰당 2×10⁶농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후, 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신-EDTA로 떼어낸 후, 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포 내 멜라닌의 정량은 로탄(R Lotan and D Lotan, Cancer Res, 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후, 균질화 완충액(50mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2mM PMSF) 1㎖를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH(10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후, 마이크로 플레이트 판독기로 405㎚에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음, 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다.

B16F1 멜라닌 세포의 멜라닌 생성 저해율(%)은 수학식 4에 의하여 계산하였다.

<수학식 4>

멜라민 합성 저해율(%) = [(A-B)/A] × 100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

시료명	멜라닌 합성 저해율(%)
대조군	-
비교예 1 (0.02 중량%)	15
비교예 2 (0.02 중량%)	24
실시예 1 (0.02 중량%)	35
알부틴 0.2 중량%	37

B16F1 멜라닌 세포를 이용하여 멜라닌 합성 억제효과를 측정한 결과(표 10), 오메기주 발효추출물 0.02 중량%는 알부틴 0.2 중량% 일 때와 유사한 멜라닌 합성 저해율을 나타내었다.

위의 결과로부터 오메기주 발효추출물의 우수한 멜라닌 합성 저해율을 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명의 우수한 미백효과를 추론할 수 있었다.

실험예 11: 자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과 측정

본 실험예 11에서는 실시예 1에서 수득한 오메기주 발효추출물의 자외선 조사에 의한 세포독성의 완화효과를 측정하였다.

섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1x10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 10% FBS가 첨가된 것) 1㎖를 첨가하였다. 여기에 평가대상 오메기주 발효추출물을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500㎕와 MTT 용액(2.5㎎/㎖) 60㎕를 넣은 후, 2시간 동안 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04 N)을 500㎕씩 넣어주었다. 그리고 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565nm 흡광도를 측정하였다.

수학식 5에 의해 세포생존율(%)을 측정하고 자외선에 의한 세포독성 완화율은 수학식 6에 의하여 계산하였다.

<수학식 5>

세포생존율(%) =(St-Bo)/(Bt-Bo)X 100

Bo : 세포배양배지만을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

Bt : 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

St : 시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

<수학식 6>

자외선에 의한 세포독성 완화율(%) =1-(St-Bo)/(Bt-Bo)X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포생존율

시료명	처리농도(%)	세포독성 완화율(%)
오메기주 발효추출물	0.02	49
	0.01	35
	0.005	21

자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과를 측정한 결과(표 11), 오메기주 발효추출물은 0.02% 농도에서 자외선에 의한 세포 독성을 49% 완화하여 자외선에 의한 세포독성에 대하여 세포를 효과적으로 방어함을 알 수 있었다.

위의 결과로부터 오메기주 발효추출물의 자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과가 우수함을 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명의 자외선에 의한 피부자극 완화효과를 추론할 수 있었다.

실험예 12: 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과 측정

본 실험예 12에서는 실시예 1에서 수득한 오메기주 발효추출물의 항염증효과를 측정하기 위해 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제 정도를 측정하였다.

사람의 표피조직에서 분리한 섬유아세포(Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5X10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후, PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350㎕를 첨가하였다. 여기에 평가대상 오메기주 발효추출물을 처리한 후, 5시간 동안 배양하였다. 배양을 한 후, 배양 상층액을 150㎕ 취하여 IL-1α를 정량함으로써 오메기주 발효추출물의 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소면역분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)을 이용하여 정량하였으며, IL-1α의 생성율은 수학식 7에 의해 계산하였다.

<수학식 7>

염증성 사이토카인 발현 억제율(%) =1-(St-Bo)/(Bt-Bo)X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α 생성량

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α 생성량

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α 생성량

시료명	처리농도(%)	염증성 사이토카인 발현 억제율(%)
오메기주 발효추출물	0.02	43
	0.01	25.2
	0.005	18

자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 측정한 결과(표 12), 0.02% 농도에서 43% 억제하여, 오메기주 발효추출물은 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 확인할 수 있었다. 위의 결과로부터 본 발명 추출물의 항염증 효과를 추론할 수 있었다.

실험예 13: 자외선 조사에 의한 프로스타글란딘 생합성 억제효과 측정

본 실험예 13에서는 실시예 1에서 수득한 오메기주 발효추출물의 프로스타글란딘(prostaglandin E₂;이하, PGE₂ 로 칭함) 생합성 억제효과를 평가하기 위하여 사람의 표피 조직에서 분리한 각질형성세포(Keratinocyte)를 24-웰 시험 플레이트에 5x10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하고 18시간 동안 배양한 다음, 상기 각질형성세포에 최종농도가 50μM이 되도록 아스피린(aspirin)을 처리하여 각질형성세포에 존재하는 프로스타글란딘 생합성 효소(prostaglandin E₂ synthetase, 또는 cyclooxygenase, 이하 COX) 활성을 제거하였다. 아스피린 처리 2시간 후에 각질형성세포가 들어있는 각 웰을 PBS로 2회 세척하고 각 웰에 100㎕의 PBS를 넣었다. 이 각질형성세포에 UVB 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 30mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 각 웰에 각질형성세포 배양액(keratinocyte growth media, Clonetics, Biowhittacker사, MD, USA) 250㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 추출물 시료를 처리한 후 16시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 적당량 취하여 16시간 동안 생합성된 PGE₂(prostaglandin E₂)를 정량함으로서 오메기주 발효추출물의 프로스타글란딘 억제효과를 판단하였다. PGE₂의 양은 효소면역분석법(enzyme immunoassay)을 이용하여 정량하였다.

시료명	PGE₂ 억제율(%)
(-)UV B	대조군
(+)UV B	-
(+)UV B + 오메기주 발효추출물 0.02 중량%	61
(+)UV B + 오메기주 발효추출물 0.01 중량%	38
(+)UV B + 오메기주 발효추출물 0.005 중량%	17

자외선조사에 의한 프로스타글란딘 생합성 억제효과를 측정한 결과(표 13), 오메기주 발효추출물은 자외선에 의한 프로스타글란딘의 생성을 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었다. 특히 생성되는 PGE₂는 주로 COX-2 효소에 의해 만들어지는 것으로 알려져 있으므로 상기 실험을 통해 오메기주 발효추출물이 COX-2 효소의 유도작용 또는 활성을 억제함을 추론할 수 있었다.

상기 결과로부터 오메기주 발효추출물의 우수한 프로스타글란딘 생합성 억제효과를 확인할 수 있었다.

실험예 14: 여드름균에 대한 항균력 측정

본 실험예 14에서는 실시예 1에서 수득한 오메기주 발효추출물의 여드름균에 대한 항균력을 확인하기 위한 페이퍼 디스크 테스트(Paper Disc Test)를 실시하였다. 먼저, 여드름 발생원인인 피부 상재균 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes)를 활성화하기 위하여 BHI 액체배지(Brain-Heart Infusion Broth;3.7%)에서 48시간 전배양하였다. 이렇게 준비한 균 배양액을 BHI 고체배지(Brain-Heart Infusion Broth;3.7%;agar1.5%)에 0.1㎖씩 도말한 후, 건조했다. 실시예 1에서 수득한 오메기주 발효추출물을 95% 에탄올 수용액에 12%(w/v)로 희석하여 직경 8㎜의 페이퍼 디스크에 50㎕씩 점적한 후 앞서 준비한 고체배지 위에 올려놓은 후 이것을 35℃ 혐기 배양조에서 3일간 배양하였다. 페이퍼 디스크 주변에 생긴 균 성장 저지 영역을 관찰하고 저지환의 크기를 측정함으로써 항균력을 평가하였다.

여드름균에 대한 항균력을 측정한 결과, 오메기주 발효추출물의 균 성장 저지환의 크기는 20㎜인 것으로 나타났다.

실험예 15: Compound 48/80에 의한 아토피 피부염 유발 후 오메기주 발효추출물의 항염증 효과 측정

BALB/c 마우스(5주령, 웅성)의 등쪽 목부위 피부의 진피 내로 마리당 30㎕의 compound 48/80(Sigma, Co.; 1/ in saline)을 주사한 후 케이지에 집어넣고 60분 동안 마우스가 목을 긁는 행동을 관찰하였다. 오메기주 발효추출물의 항염 치료 효능을 검정하기 위하여 compound 48/80을 주사하기 5일 전부터 오메기주 발효추출물을 250㎕/㎖의 농도로 마리당 100㎕씩 마우스의 등쪽 목 부위에 도포하였다. 도포방법은 5일 동안 하루에 두 번씩 총 10회에 걸쳐 마우스의 등쪽 목 부위에 도포하여 전처리 한 다음 compound 48/80을 주사한 후 총 1시간 동안 5분 간격으로 마우스가 뒷발로 목을 긁는 시간을 측정하여 소양증 정도를 측정하였다.

	Number of scratching (in 5min)
	5	10	15	20	25	30	35	40	45	50	55	60
오메기 발효추출물	21	23	29	33	35	37	40	43	45	24	20	16
대조군	38	41	49	61	83	94	97	69	58	52	41	38

아토피 피부염 유발 후 오메기주 발효추출물의 항염증 효과를 측정한 결과(표 14), 오메기주 발효추출물은 compound 48/80에 의한 아토피 피부염 (피부 소양증) 유발을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 오메기주 발효추출물의 아토피 예방 효과를 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명의 아토피 예방효과를 추론할 수 있었다.

실험예 16: 수분 흡습성 측정

본 실험예 16에서는 오메기주 발효추출물의 수분 흡습성을 측정하기 위하여, 인간으로부터 직접 채취하거나 또는 상업적으로 구입한 사람의 건조 표피세포에 상기 실시예 1에서 수득한 오메기주 발효추출물과 증류수를 각각 포화 흡수시키고 흡수된 물의 양을 측정한 후, 48시간 건조 후 질량변화를 측정하였다.

각각의 측정된 질량의 변화로부터 피부세포 단위 질량당 흡수된 물의 양을 비교하였다. 이러한 실험은 표피세포에 흡습되는 물의 양을 비교하기 위한 방법으로 실제 사람의 피부에 있어서도 그 보습효과를 예상할 수 있는 한 가지 방법으로 사용되고 있다.

구체적으로, 사람의 표피세포를 건조시켜 단위질량당 함유된 수분의 양을 일정하게 만든 후 각각의 표피세포 시료의 무게와 함유된 물의 양을 카이저 방법(Kaiser method)을 사용하여 측정하였다. 물의 함량이 측정된 표피세포를 오메기주 발효추출물, 정제수에 각각 24시간 담지하여 포화 흡수시켜준 뒤, 세포 내에 물이 포화흡수된 표피세포를 꺼내서 무게를 달고, 일부를 채취하여 카이저 수분측정기로 함유되어 있는 단위질량당 수분의 양을 측정하였다. 이후 다시 48시간 감압건조시키고 무게를 달고난 후, 일부를 채취하여 카이저 방법에 의해 수분량을 측정하여 함유되어 있는 단위질량당 수분의 양을 측정하였다.

표피세포에 대한 수분공급능력(수분 mg/표피세포 질량 g)

	수분함량
	초기 건조상태	포화상태	재건조 후
오메기주 발효추출물	400	820	550
정제수	400	790	400

수분 흡습성을 측정한 결과(표 15), 오메기주 발효추출물로 포화 흡습시킨 표피세포가 정제수에 의하여 포화흡습된 표피세포보다 재건조 후 훨씬 많은 물을 함유하고 있음을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 오메기주 발효추출물의 우수한 피부 흡습성을 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명의 우수한 보습 효과를 추론할 수 있었다.

실시예 2: 오메기주 발효추출물을 함유하는 화장료 제조

본 실시예 2에서는 실시예 1에서 수득한 오메기주 발효추출물을 함유하는 화장료를 제조하였다. 제조된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 16에 나타낸 바와 같다. 우선 표 16에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존하였고, 나)상에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 서서히 냉각하여 크림(실시예 2, 비교예 3)을 제조하였다.

(단위: 중량%)

원료		실시예 2	비교예 3
가	스테아릴 알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부가)알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산 아스테르	2	2
나	오메기주 발효추출물	1	-
	프로필렌글리콜	5	5
	적량	100에 대한 나머지	100에 대한 나머지

실험예 17: 화장료의 피부 탄력 개선효과 측정

상기 실시예 2 및 비교예 3의 피부 탄력 개선효과를 측정하기 위해 실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 2를 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 3을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

피부 탄력 개선효과를 확인하기 위해 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부탄력측정기(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하였다. 실험결과는 아래 표 17에 Cutometer SEM 575의 R7값으로 기재하였는데 R7 값은 피부의 점탄성(viscoelasticity)을 나타낸다.

실험제품	피부탄력효과(R7)
실시예 2	0.23
비교예 3	0.11

n=20, p<0.05

화장료의 피부 탄력 개선효과를 측정한 결과(표 17), 발효 생약추출물을 함유하는 실시예 2를 도포한 실험자의 피부 탄력개선효과가 비교예 3보다 우수한 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터 본 발명인 피부 외용제 조성물의 우수한 피부 탄력 개선효과를 확인할 수 있었다.

실험예 18: 화장료의 피부 주름 개선효과 측정

상기 실시예 2에서 제조된 실시예 2 및 비교예 3의 피부 주름 개선효과를 측정하기 위해 실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 2를, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 3을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

피부의 주름개선효과를 알아보기 위하여 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 실리콘 재질의 모사판(replica)을 제작하여 지정 부위의 주름의 상태를 화상분석기인 비지오미터(visiometer: SV60, C+K Electronic Co., Germany)로 측정하였다. 그 결과를 아래 표 18에서 나타내었으며, 표 18은 2개월 후의 각각의 파라미터(parameter) 값에서 2개월 전 파라미터 값을 뺀 것의 평균을 나타낸 것이다. 즉, 값이 음수가 나올수록 주름 개선효과가 높다는 것을 의미한다.

실험제품	R1	R2	R3	R4	R5
실시예 2	-0.22	-0.18	-0.12	-0.07	-0.06
비교예 3	-0.10	-0.07	-0.06	-0.03	-0.02
R1: 주름 등고선의최고치와 최저치의 차이값 R2: 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값 들의 평균 R3: 5개씩 나눈 R1값 중 최고치 R4: 주름 등고선의 기선(baseline)에서 각각의 꼭대기와 계곡의 값을 뺀 평균값 R5: 주름 등고선의 기선에서 각각의 주름 윤곽을 뺀 값의 평균값

화장료의 피부 주름 개선효과를 측정한 결과(표 18), 오메기주 발효추출물을 함유한 실시예 2의 피부 주름 개선효과가 비교예 3보다 우수함을 확인할 수 있었다. 상기의 결과로부터 본 발명인 피부 외용제 조성물의 우수한 주름 개선효과를 확인할 수 있었다.

실험예 19: 화장료의 미백효과 측정

본 실험예 19에서는 실시예 2에서 제조된 실시예 2 및 비교예 3의 미백효과를 측정하기 위해 실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 2를, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 3을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

2개월 후, 얼굴 좌우 양편의 도포 부위 피부를 화상분석기 및 피부색의 변화를 크로마미터(Minolta CR300)를 이용하여 색의 밝기변화(L)를 측정하고, 복수의 숙련자에 의한 객관적 육안 관찰과 피검자에 의한 주관적 육안관찰을 실시하여 하기 등급 분류에 따라 효과를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 19에 나타내었고, 미백효능 정도를 7등급으로 분류하여 평가하였다(-3: 매우 악화, -2: 악화, -1: 약간 악화, 0: 변화 없음, 1: 약간 개선, 2: 개선, 3: 매우 개선).

	피부색의 밝기 변화(L)		숙련자의 객관적 평가		피검자의 주관적 평가
	실시예 2	비교예 3	실시예 2	비교예 3	실시예 2	비교예 3
평균값	4.49	1.87	3.4	2.1	2.8	1.4

화장료의 미백효과를 측정한 결과(표 19), 오메기주 발효추출물을 함유하는 실시예 2가 비교예 3보다 미백효과가 우수함을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터 본 발명인 피부 외용제 조성물의 우수한 미백효과를 확인할 수 있었다.

실험예 20: 화장료의 아토피성 피부염에 대한 개선효과 측정

본 실험예 20에서는 실시예 2와 비교예 3의 아토피성 피부염에 대한 개선효과를 비교측정하기 위해 다음과 같이 임상실험을 실시하였다.

5-30세의 아토피 환자로서, 2년 이상 아토피성 피부염을 앓고 있는 환자 30명에 대하여 아토피성 피부염 개선효과를 조사하였다. 동일인에게 왼쪽 손에는 실시예 2를, 오른쪽 손에는 비교예 3을 매일 저녁 세정 후, 피부에 1일 1회 60일간 도포하고 아토피성 피부염 상태 개선 정도를 측정하였다. 측정은 설문조사에 의한 관능평가로 실시하였다. 그 결과는 아래 표 20에 나타내었다.

	매우 좋다	좋다	그저 그렇다
실시예 2	80% (24명)	20% (6명)	0%
비교예 3	10% (3명)	20% (6명)	70% (21명)

화장료 아토피성 피부염에 대한 개선효과를 측정한 결과(표 20), 오메기주 발효추출물을 첨가하여 제조한 실시예 2가 비교예 3보다 아토피성 피부개선효과가 우수하다는 사실을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 본 발명의 피부 외용제 조성물의 우수한 아토피성 피부염 개선효과를 확인할 수 있었다.

실험예 21: SLS 에 의한 피부 자극 완화효과 측정

본 실험예 21에서는 실시예 1에서 수득한 오메기주 발효추출물을 함유한 화장료의 자극 완화 효과를 인체 첩포 실험으로 평가하였다.

일반적 화장품 처방(크림, 로션, 스킨, 에센스)에 자극을 일으키는 SLS(sodium lauryl sulfate) 1%와 실시예 2를 혼용하여 24시간, 48시간, 72시간 동안 첩포한 후, 자극 유발지수를 바탕으로 자극완화 효과를 평가한 것이다.

20-50세의 건강한 남녀 50명의 팔 상박 부위에 FINN CHAMBER(FINLAND)를 이용하여 제품을 0.3mg씩 첩포하고, 24시간 후 급성 자극 지수를 평가하였다. 평가 후 재차 동일한 부위에 동량의 제품을 첩포하고 48시간 및 72시간 후의 지연성 자극 지수를 평가하였다.

SLS에 의한 피부 자극 완화효과를 측정한 결과, SLS를 단독으로 첩포한 부분은 24시간 후부터 피부에 붉게 자극이 나타났으나, 오메기주 발효추출물을 함유하는 실시예 2는 첩포하고 24시간, 48시간, 72시간 경과 후에도 아무런 피부 발작을 일으키지 않았다.

상기 결과로부터 오메기주 발효추출물이 화장료에 혼용되었을 때 자극을 유발시키는 기재(계면 활성제, 향, 알콜 등)에 의한 피부 자극을 감소시킬 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 오메기주 발효추출물을 함유하는 화장수 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합 용해하였다. 실시예 1에서 수득한 오메기주 발효추출물 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 오메기주 발효추출물을 함유하는 화장수를 제조하였다.

실시예 4: 오메기주 발효추출물을 함유하는 유액 제조

세틸알콜 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰 부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70℃에서 가열, 혼합, 용해하고, 실시예 1에서 수득한 오메기주 발효추출물 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열해서 용해시켰다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형 유액을 제조하였다.

실시예 5: 오메기주 발효추출물을 함유하는 미용액 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히알루론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 실시예 1에서 수득한 오메기주 발효추출물 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 미용액을 제조하였다.

Claims

(가) 길경, 감초, 두릅, 연교, 치자, 황백, 황금, 황련, 지황, 작약, 천궁, 당귀, 시호, 박하, 우방자 및 천화분으로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 생약재를 추출하는 단계;
(나) 상기 추출물에 잎새버섯 균사체 또는 잎새버섯 균사체의 전 배양액을 혼합하여 1차 배양한 후, 배양액으로부터 잎새버섯 균사체를 제거하는 단계;
(다) 상기 균사체가 제거된 1차 배양액에 제주 오메기주를 혼합하여 2차 배양하는 단계; 및
(라) 2차 배양액으로부터 누룩균을 제거하는 단계;를 거쳐 얻어진 여과액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 생약재는 길경, 감초, 두릅, 연교, 치자, 황백, 황금, 황련, 지황, 작약, 천궁, 당귀, 시호, 박하, 우방자 및 천화분이 각각 1~30 중량부임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 여과액은 화장료 조성물 전체에 대해 0.001~30.0 중량% 함유되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물의 제형은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 기초화장료 제형; 수중유형 또는 유중수형의 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 색조화장료 제형; 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
화장료 조성물은 피부 미백용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
화장료 조성물은 노화 방지용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
화장료 조성물은 피부자극 완화용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
화장료 조성물은 아토피 피부 개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
화장료 조성물은 여드름 예방 또는 개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
(가) 길경, 감초, 두릅, 연교, 치자, 황백, 황금, 황련, 지황, 작약, 천궁, 당귀, 시호, 박하, 우방자 및 천화분으로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 생약재를 추출하는 단계;
(나) 상기 추출물에 잎새버섯 균사체 또는 잎새버섯 균사체의 전 배양액을 혼합하여 1차 배양한 후, 배양액으로부터 잎새버섯 균사체를 제거하는 단계;
(다) 상기 균사체가 제거된 1차 배양액에 제주 오메기주를 혼합하여 2차 배양하는 단계; 및
(라) 2차 배양액으로부터 누룩균을 제거하는 단계;를 거쳐 얻어진 여과액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 아토피 피부 및 여드름 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제10항에 있어서,
약학 조성물의 제형은 경고제(PLASTERS), 로션제(LPTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPESIONS), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 첩부제, 서방화제제 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 아토피 피부 및 여드름 예방 또는 치료용 약학 조성물.