KR101911442B1 - 신규한 바실러스 제주엔시스 hb-20 균주 및 이를 이용한 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 바실러스 제주엔시스(기탁번호 KCTC 12987BP) HB-20 균주 및 그 이용에 관한 것으로, 본 발명의 균주 및 그 균주의 배양물을 함유하는 조성물은 활성산소 소거효과와 콜라겐 분해효소 활성 조절효과, 피부 잔주름 개선 효과, 미백, 보습, 아토피 개선효과, 피부자극 완화효과 등 우수한 피부 외용제 효과를 나타낸다.

Description

신규한 바실러스 제주엔시스 HB-20 균주 및 이를 이용한 화장료 조성물{A novel Bacillus jejuensis HB-20 strain and a cosmetic composition using the same}

본 발명은 신규한 바실러스 제주엔시스 HB-20 균주 및 이를 이용한 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부의 환경과 항상 접하고 있는 기관으로 주로 외부의 물리적 손상 및 화학물질로부터 인체를 보호하고, 세균, 곰팡이, 바이러스 등이 피부로 침범하는 것을 방지하며, 수분 손실을 막는 보호장벽 역할을 한다. 피부의 구조를 보면 표피, 진피, 피하지방의 3개 층으로 구성되고 표피는 3개 층 중 가장 얇은 층으로 피부의 보습 및 보호를 담당하는 중요한 기능을 한다. 특히 표피의 각질층에 존재하는 수분에 의하여 피부가 탄력있고 부드럽게 되는데, 각질층의 탄력이 유지되려면 10% 이상의 수분함유가 필수적인 것으로 알려져 있다(O. K.Jacobi, Proc. Sci. Sec. Toilet Goods Assoc. 1959, 31, 22).

최근 들어, 환경오염 등의 이유로 강한 자외선에 노출되는 경우가 많아졌고, 이에 의한 피부의 수분 손실이 증가하면서 피부 노화가 가속화되고, 피부의 손상에 의한 관련 질병의 발병률이 증가함에 따라, 자외선에 노출된 피부의 보습력을 유지 및 주름개선 효과를 오랫동안 지속시켜주는 조성물에 대한 요구는 점점 증가하는 추세이다.

한편, 사람의 피부색을 결정하는 멜라닌(melanin)은 멜라노사이트(melanocyte)에서 생성이 되는데 이 멜라노사이트에는 티로시나제 등의 효소가 존재하며, 이들이 함께 작용하여, 생체 내에 항상 존재하는 티로신(tyrosine)이라는 아미노산을 기질로 중합화 산화반응을 함으로 흑갈색의 색소인 멜라닌을 형성하게 된다. 이렇게 형성된 멜라닌은 멜라노사이트의 수지상 돌기를 통하여 케라티노사이트(keratinocyte)라는 표피 세포로 이동한다. 여기서 멜라닌은 핵주변에 모자와 같은 구조를 형성하여 자외선으로부터 유전자를 보호하고 자유 라디칼(free radical)을 제거하여 세포 내 단백질을 보호하는 등 중요한 역할을 하게 된다. 생체 내에는 멜라닌을 분해하는 효소가 없고 다만 케라티노사이트가 노화되어 제 기능을 다하고 표피에서 떨어져나갈 때 케라티노사이트와 함께 피부로부터제거된다. 하지만 멜라닌이 필요 이상으로 과다하게 생성되면 기미나 주근깨, 점 등과 같은 과색소침착증을 유발한다.

이에 따라 멜라닌의 과도한 생성을 막아 피부에서 색소 침착을 억제하기 위한 미백제에 대한 연구가 이루어졌으며, 코직산(kojic acid), 알부틴(arbutin) 등과 같은 티로시나제 활성을 저해하는 억제제들, 하이드로퀴논(hydroquinone), 비타민 A등을 비롯하여 대표적인 항산화제인 비타민 C 및 이들의 유도체 등이 보고되었다.

그러나 상기와 같은 기존의 미백 물질들은 그 효능이 약하거나 세포 독성 등을 동반하는 경우가 많아 안전하고 미백 효능이 높은 천연물을 발굴하고자 하는 노력이 계속되고 있다.

또한 최근 생활방식의 변화에 의해 급성 전염성 질환에서 만성 염증질환으로 질병패턴이 바뀌고 있다. 염증은 외부에서 독소 등의 물질이 체내에 들어왔을 때, 우리 몸에서 일어나는 방어기작으로서, 환경 내 세균, 곰팡이 등이 단기간 침입으로 급성 염증이 발생하고, 환경 내에 존재하는 미생물, 알레르겐 등의 원인물질이 지속적으로 우리 몸에 흡수되면, 만성 염증이 발생하게 된다. 최근, 비감염성 원인 인자로 인식되었던 만성 염증질환의 발생에 감염성 원인 인자의 중요성이 부각되고 있다.

아토피피부염은 영유아기와 소아기에서 가장 흔히 볼 수 있는 피부질환으로, 천식이나 알레르기 비염으로 진행되는 알레르기 진행(atopic march)의 첫 신호이기도 하다. 또한, 아토피피부염은 만성적인 가려움증과 반복되는 피부 염증 소견으로 육체적, 정신적으로 환자 자신뿐만 아니라 가족의 삶의 질까지도 저하시키는 만성 염증질환이며, 최근 전 세계적으로 아토피피부염의 유병률이 증가하면서 이에 대한 관심도 증가하고 있다.

관련 선행 특허로, 한국공개특허 제1991-0019600호에 보습 및 활성 산소 제거 능이 있는 화장료용 유산균 배양액에 관한 기술이 개시되어 있으며, 한국공개특허 제2013-0096604호에 발아곡물의 발효 추출물을 주성분으로 하는 발효 화장품 및 그 제조방법에 관한 기술이 개시되어 있다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 항산화, 항노화, 항염, 미백 등의 효과를 가지는 신규한 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 신규한 주름개선, 미백, 여드름 및 아토피 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 신규한 바실러스 제주엔시스(기탁번호 KCTC 12987BP) HB-20 균주를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 균주, 그 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명자들은 인체에 유용한 미생물을 탐색하는 과정에서 피부에 안전하고 효능이 우수하며 화장품 안전성에 영향을 미치지 않는 화장품 원료를 개발하고자, 제주도 청정지역인 한라산 중산간 인근 습지로부터 신규 미생물을 분리 동정하게 되었다. 또한, 새롭게 발견된 미생물은 지금까지 전세계적으로 발견되지 않은 바실러스 속(genus)에 신종 미생물로 밝혀졌으며, 종(species)명은 제주도 지명을 사용하여 제주엔시스(jejuensis)라 명명하고, 이를 2016년 02월 26일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture, KCTC)에 바실러스 제주엔시스(Bacillus jejuensis) HB-20을 기탁하였다(기탁번호 KCTC 12987BP).

따라서, 본 발명자들은 상기 균주에서 배양한 배양물에서 유효성분의 함량증가를 확인하고, 또한, 이 배양물이 피부자극을 유발하지 않으면서 화장료 조성물로 탁월한 효과를 갖는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 따른 배양 방법은 바실러스 제주엔시스(Bacillus jejuensis) HB-20(KCTC 12987BP)을 배양하는 단계; 상기의 배양 후, 원심분리하여 배양액으로부터 균체를 제거하고 상등액을 회수하는 단계; 상기에서 회수한 상등액을 여과하여 균체를 완전히 제거하는 단계;를 통해 수득한 배양물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서 최종적으로 얻은 바실러스 제주엔시스(Bacillus jejuensis) HB-20(KCTC 12987BP) 균주 배양액은 화장료 조성물 전체에 대해 0.001~30.0중량% 함유되는 것이 바람직한데, 0.001중량% 미만으로 포함되는 경우에는 피부개선효과가 미미하고, 30.0중량%를 초과하는 경우에는 재료 투입량 대비 효율성이 떨어져 경제적이지 못하기 때문이다.

본 발명에서 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 균주의 배양은 바람직하게는 배양액의 pH를 5.0 내지 6.0으로 조정하고, 최적 배양 시간은 12시간 내지 48시간, 최적 배양 온도는 27 내지 37℃, 배양 배지의 최적 탄소원으로서 수크로오스를 배지 총부피 대비 0.5 내지 3%(W/V) 포함, 배양 배지의 최적 질소원으로서 효모추출물을 배지 총부피 대비 0.5 내지 2%(W/V) 포함, 및 배양 배지의 최적 미량원소원으로서 제일인산칼륨을 배지 총부피 대비 0.05 내지 0.1%(W/V), 황산마그네슘을 배지 총부피 대비 0.02 내지 0.05%(W/V), 염화칼슘을 배지 총부피 대비 0.02 내지 0.05%(W/V), 염화칼륨을 배지 총부피 대비 0.02 내지 0.05%(W/V) 포함하는 것을 특징으로 한다.

한편, 본 발명에서 "유효성분으로 포함된다"는 의미는 본 발명의 조성물로부터 피부 상태의 개선 효과를 나타낼 수 있는 정도로 조성물에 배양물 여과액이 첨가되는 것을 의미하고, 성분 전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 제형화하는 것을 포함하는 의미이다.

또한, 본 발명은 화장료의 유효성분으로 함유되는 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 균주의 배양물이 항산화 효과, 세포 내 활성산소 제거 효과, 기질 금속단백질분해효소(MMP-1) 활성 저해효과, 기질 금속단백질분해효소(MMP-1) 발현 억제효과, 프로콜라겐 생합성 촉진효과, 엘라스틴 생성 촉진효과, 미백효과, 염증유발 관련 효소(hyaluronidase) 활성 억제효과, 자외선 조사에 의한 세포독성 완화효과, 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과, 여드름균에 대한 항균효과, 아토피 피부염에 대한 항염증효과 및 수분 흡습성이 우수한 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 화장료 조성물이 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 기초 화장료 제형; 수중유형 또는 유중수형의 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬류 중에서 선택된 화장료 조성물임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 균주, 그 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 효능을 나타내는 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 균주, 그 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 항노화 기능성 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 균주, 그 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 피부자극 완화 효능을 나타내는 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 균주, 그 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부 개선 효능을 나타내는 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 균주, 그 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 여드름 예방 효능을 나타내는 조성물을 제공한다.

본 발명에서 조성물이란 바람직하게는 피부외용제 조성물을 의미하고, 피부외용제 조성물이란 일반적으로 피부에 적용되는 조성물 전부를 의미하고, 의약품,의약부외품, 화장료 등을 포함하는 것이다.

본 발명의 균주의 유효성분의 피부외용제에 대한 배합량은 조성물 총량을 기준으로 0.0001∼10% 로 하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.01∼1% 이다.

또, 본 발명의 피부외용제에는 상기 유효성분 이외에 타르계 색소, 디메틸폴리실록산, 메틸페닐폴리실록산, 고리상 실리콘 등의 실리콘오일, 루테인, 아스타크산틴, 푸코크산틴 등의 카로티노이드계 색소, 산화철 등의 착색 안료, 파라벤, 페녹시에탄올 등의 방부제, 파라핀, 바세린 등의 탄화수소류, 올리브 스쿠알렌, 쌀 스쿠알렌, 쌀 배아오일, 호호바오일, 피마자유, 홍화유, 올리브오일, 마카다미아너트오일, 해바라기유 등의 식물유, 밀랍, 목랍, 카르나바납 등의 납류, 밀리스트산옥틸도데실, 팔미트산세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 밀리스트산이소프로필 등의 에스테르오일, 에탄올 등의 저급 알콜류, 세탄올, 베헤닐알콜, 스테아릴알콜, 장쇄 분지 지방족 알콜 등의 고급 알콜류, 콜레스테롤, 피토스테롤,분지 지방산콜레스테롤에스테르, 마카다미아너트 지방산피토스테릴에스테르 등의 스테롤류 및 유도체, 경화오일 등의 가공오일류, 스테아르산, 밀리스트산, 이소스테아르산, 올레산, 이소형 장쇄 지방산, 안테이소형 장쇄 지방산등의 고급 지방산, 리모넨, 수소첨가 비사보롤 등의 텔펜류, 트리카프릴, 카프린산글리세릴, 2-에틸헥산산글리세릴, 트리이소형 장쇄 지방산글리세릴, 트리팔미트산글리세릴 등의 트리글리세리드, 세틸황산나트륨, N-스테아로일-L-글루타민산염 등의 음이온 계면활성제, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르, 폴리옥시에틸렌 지방산에스테르, 폴리옥시에틸렌 다가 알콜 지방산에스테르, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 다가 알콜 지방산에스테르, 폴리옥시에틸렌 편성 실리콘 등의 변성 실리콘, 폴리글리세린 지방산에스테르, 자당 에스테르 등의 비이온 계면활성제, 테트라알킬암모늄염 등의 양이온 계면활성제, 베타인형, 술포베타인형, 술포아미노산형 등의 양성 계면활성제, 레시틴, 리소포스파티딜콜린, 세라미드, 셀레브로시드 등의 천연계 계면활성제, 산화티탄, 산화아연 등의 안료, 디부틸히드록시톨루엔 등의 항산화제,염화나트륨, 염화마그네슘, 황산나트륨, 질산칼륨, 황산나트륨, 메타규산나트륨, 염화칼슘 등의 무기염류, 시트르산나트륨, 아세트산칼륨, 숙신산나트륨, 아스파라긴산나트륨, 락트산나트륨, 디클로로아세트산, 메발론산, 글리틸리틴산 등의 유기산 및 그 염, 염산에탄올아민, 질산암모늄, 염산아르기닌, 디이소프로필아민염, 우레아, 데카르복시카르노신 등의 유기 아민류 및 그 염, 에디트산 등의 킬레이트제, 크산탄검, 카르복시비닐폴리머, 카라기닌, 펙틴, 알킬 변성 카르복시비닐폴리머, 한천 등의 증점제, 수산화칼륨, 디이소프로판올아민, 트리에탄올아민 등의 중화제, 히드록시메톡시벤조페논술폰산염 등의 자외선 흡수제, 디프로필렌글리콜, 말피톨, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 프로필렌글리콜,소르비톨, 디글리세린, 라피노오스 등의 다가 알콜, 각종 아미노산, 아스코르브산, 비오틴, 토코페롤 등의 비타민류 및 아스코르브산황산에스테르염, 아스코르브산인산에스테르염, 니코틴산토코페롤 등의 비타민 유도체 등을 본 발명의 목적을 달성하는 범위 내에서 적절하게 배합할 수 있다.

본 발명을 통하여 알 수 있는 것과 같이, 본 발명의 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 균주의 배양물은 피부 흡수력이 뛰어나고, 피부자극이 없으면서도, 기존의 단순 추출물보다 기미, 주근깨 및 피부 색소 침착의 원인이 되는 물질인 멜라닌 생성억제 효과 등 미백작용을 나타내었다.

또한, 본 발명의 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 균주의 배양물은 활성산소 소거효과와 MMP 저해효과와 자외선 조사에 의한 MMP 발현 조절효과 등 우수한 항노화 효과와 자외선 조사 후 야기되는 피부 자극을 완화시켜 주는 효과를 나타내었다.

또한 본 발명의 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 균주의 배양물은 염증매개 물질에 의한 피부자극 완화 및 아토피 개선효과를 나타내었다.

따라서, 이러한 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 균주의 배양물을 함유하는 화장수, 크림, 유액, 팩, 파우더 등의 화장료 조성물은 활성산소 소거효과와 콜라겐 분해효소 활성 조절효과, 피부 잔주름 개선 효과, 미백, 보습, 아토피 개선효과, 피부자극 완화효과 등 우수한 피부 외용제 효과를 나타낸다.

도 1은 본 발명 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 균주의 형태학적 특성을 주사전자현미경을 이용하여 촬영한 사진도이다.
도 2는 본 발명 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP)의 동정 결과 16S rRNA 서열이다.
도 3은 본 발명 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 균주의 동정 결과를 나타낸 균주 계통도이다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 균주 분리동정

<균주의 분리>

본 발명자들은 균주 채집을 위하여 제주 한라산 중산간 인근 습지로부터 시료들을 별도 용기에 분리하여 채집하였다. 상기 시료들은 각각 멸균 생리식염수에 현탁 및 희석하고, 이를 TSA(tryptic soy agar) 배지에 평판 배양법(spread plate method)을 사용하여 배양하였으며, 배양 후 단일 집락(single colony)을 획선 배양법(streak plate method)을 이용하여 연속 분리 과정을 거쳐 최종적으로 TSA 배지에 순수 분리하였다.

<균주의 동정>

상기 분리된 균주를 동정하기 위해 먼저 현미경을 통해 균주의 형태학적 모양을 관찰하였다. 관찰 결과, 동정된 균주의 세포는 조건적 혐기성 균주로서 세포 크기가 0.9-1.0 × 2.6-3.8 μm이며, 단일 집락의 모양은 반투명 연갈색에 막대모양을 이루는 형태를 띄는 것으로 확인하고 도 1에 나타냈다.

분자생물학적 특징을 조사하기 위해 상기 형태학적 분석을 수행한 균주를 대상으로, DNeasy powersoil kit(QIAGEN, 12888)를 이용하여 DNA를 추출하였으며, 이렇게 얻어진 염색체 DNA는 미생물 동정을 위하여 16s rRNA gene을 27F (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG; 서열번호 2)와 1492R(TACGGYTACCTTGTTACGACTT; 서열번호 3) 프라이머로 일반적인 조건 하에서 중합효소 연쇄반응을 이용하여 증폭하였다. 증폭된 DNA는 아가로즈 겔 전기영동을 이용하여 그 길이를 확인 후 27F, 337F, 518F, 785F, 518R, 800R, 1492R 염기서열 분석 프라이머를 이용하여 16s rRNA gene의 전체 염기서열 분석을 하였다. 또한, 진화계통상 본 발명의 신 균주가 어디에 속하는지 확인하기 위하여 nucleotide BLAST(NCBI, NIH, USA) 프로그램을 이용하여 염기서열의 상동성을 비교하였다.

그 결과, 본 발명의 신균주는 Bacillus algeriensis EB01(HG964497)과 상동성이 97.7%로 나타났으며, 이후 이러한 결과를 토대로 보다 정확한 분류를 확인하기 위하여 EzBioCloud (Chunlab, SNU, Korea)를 사용하여 최종적인 분자동정을 하였다. 또한, 상동성을 토대로 MEGA6를 이용하여 분자계통 분석을 진행한 결과, 본 발명에서 동정한 균주는 바실러스(Bacillus sp.) 속(genus)에 속하는 균주인 것으로 나타났으며, 본 발명자들은 상기 동정한 균주의 염기서열을 분석하였다. 그 결과 본 발명에 사용된 신균주와 동일한 염기서열을 갖는 균주는 기존에 존재하지 않는 바실러스 속(genus)의 신규 종(species)임을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 상기 본 발명에서 분리 및 동정한 신규한 바실러스의 종(species)명은 제주도 지명을 사용하여 제주엔시스(jejuensis)라 명명하였고, 2016년 02월 26일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture, KCTC)에 최종 “바실러스 제주엔시스(Bacillus jejuensis) HB-20”으로 기탁하여 기탁번호 KCTC 12987BP를 부여받았다.

실시예 2: 바실러스 제주엔시스 HB -20 배양물 제조

실시예 1로부터 순수 분리한 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 균주의 종균배양(seed culture)은 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지에 단일 콜로니(colony)를 접종하여 35℃ 배양기에 24시간 동안 배양하여 사용하였다.

바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 균주의 성장이 최적화된 배지조성은 수크로오스 2%, 효모추출물 1%, 제일인산칼륨 0.5%, 황산마그네슘 0.05%, 염화칼슘 0.025%, 염화칼륨 0.025%를 함유한 최적화된 배지로 하며 pH 5.5로 조정한 배지에 상기 종균배양액을 1%(V/V)되게 접종한 후, 온도 35℃, 회전수 120rpm 조건으로 24시간 배양하였다. 배양 후 원심분리하여 배양액으로부터 균체를 제거하고 상등액을 여과하여 균체를 완전히 제거한 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물을 수득하였다.

실험예 1: 자유라디칼 소거활성 측정 실험

실시예 2에서 수득한 시료의 자유라디칼 소거활성을 측정하기 위해 실험실 조건에서 녹차추출물 같은 우수한 항산화활성을 갖는 추출물을 비교샘플로 하고 DPPH법을 이용하여 자유라디칼 소거 활성을 측정하였다.

DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-1picrylhydrazyl free radical)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 자유라디칼 소거활성을 측정한다. 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정하였다.

DPPH 자유라디칼 소거활성 측정을 위하여 0.2%, 0.1%, 0.05%, 0.005% 농도의 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물을 준비하였다. 상기 농도의 배양물을 96웰 플레이트에 각각 넣고, 여기에 100uM 메탄올용액으로 제조된 DPPH를 첨가하여 용액의 총 부피가 200㎕가 되도록 하였다. 이것을 37℃에서 30분간 방치한 후 560nm에서 흡광도를 측정하였다.

<수학식 1>

자유라디칼 소거활성(%)= {100-(B/A)}X100

A: 본 발명의 시료를 처리하지 않은 대조군 웰의 흡광도,

B: 본 발명의 시료를 처리한 실험군 웰의 흡광도,

표 1와 같이, 실시예 2의 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물은 항산화 활성이 우수한 녹차추출물보다 더 우수한 항산화 효과를 나타냄을 알 수 있다.

시료명	항산화효과(%)
실시예 2 (0.005중량%)	75
실시예 2 (0.05중량%)	84
실시예 2 (0.1중량%)	95
실시예 2 (0.2중량%)	98
녹차 추출물 (0.2중량%)	92

실험예 2: 시료의 세포독성

실시예 2에서 수득한 시료의 피부세포에 대한 세포독성을 평가하였다. 96-웰 시험 플레이트에 세포배양 배지(DMEM에 10% FBS가 첨가된 것)에 희석된 섬유아세포(fibroblast)를 1x10⁵ cells/mL개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 실시예 2에서 수득한 시료를 각 웰에 적절한 농도로 희석하여 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 용액(2.5mg/㎖)이 함유된 세포배양 배지 200㎕를 넣은 후 2시간 동안 37℃ CO₂배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 100㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시킨 후 마이크로플레이트 판독기에서 565nm 흡광도를 측정하였다. 수학시 2와 같이 세포생존율(%)을 정하였으며, 세포의 생존에 영향을 미치지 않는 시료의 농도를 결정하였다.

<수학식 2>

세포생존율(%)={(St-Bo)/(Bt-Bo)}X 100

Bo: 세포배양배지만을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광값,

Bt: 시료를 처리하지 않고 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광값,

St: 시료를 처리하고 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광값.

시료명	100% 세포 생존 농도
실시예 2	2%
실시예 2	1%
실시예 2	0.5%
실시예 2	0.05%

상기 표 2과 같이, 피부 섬유아세포의 100% 생존 처리농도는 실시예 2의 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물이 2% 이하로, 이는 일반적으로 화장품에 사용되는 농도를 고려하였을 때 피부 자극 유발 가능성이 적은 안전한 시료인 것을 말해준다.

실험예 3: 자외선 조사 후 MMP -1 발현억제 평가

UV 조사 후 실시예 2에서 수득한 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하기 위해서 효소면역 시험법(ELISA)을 실시하였다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에서 UVA를 6.3J/㎠의 에너지로 조사하였다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 전사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96웰에 코팅하였다. 일차항체(MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 60분간 반응시켰다. 이차항체인 항마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 가하여 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질용액(1㎎/㎖ p-나이트로페닐인산을 포함하는 다이에탄올아민 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 판독기로 405nm 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였다.

표 3에서 확인할 수 있듯이, 자외선 조사시 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여 실시예 2의 시료를 가하면 MMP-1 억제율이 증가되었고, 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 72% 이상의 억제율을 보였다. 이는 대조군으로 사용한 레티놀의 억제율에 비해 상당히 우수한 결과이다.

시험군	MMP-1 발현억제율 (%)
음성 대조군	-
실시예 2 (0.02중량%)	72
실시예 2 (0.01중량%)	45
실시예 2 (0.005중량%)	25
레티놀	39

실험예 4: 엘라스타제 활성 억제효과 측정

본 실험예 4에서는 실시예 2에서 수득된 시료의 엘라스틴 생성 촉진효과를 측정하기 위해, 사람으로부터 직접 채취하거나 상업적으로 구입한 사람의 섬유 아세포에 발효 생약추출물을 처리하여 엘라스타제(elastase) 활성 억제효과를 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 사람의 섬유 아세포를 배양용 플라스크에 넣고 약 70～80 % 정도 자랄 때까지 배양하였다. 이후, 발효 생약추출물을 1일간 처리한 후 세포배양액을 채취하여 상업적으로 이용 가능한 엘라스틴 측정기구를 이용하여 엘라스틴 생성정도를 측정하였다[Bieth J: Biochem med ., 11, 350-357(1974), Schwartz DE: J.Invest Dermatol., 86, 63-68(1986)]. 즉, 엘라스타제의 기질인 Suc-(Ala) 3 NA를 이용하여, NA가 분해되면서 생기는 색의 변화를 흡광도를 이용하여, 엘라스타제의 활성도를 측정하였다. 이때 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물을 처리하지 않은 군을 대조군으로 사용하였다.

시료명	엘라스타제 활성 억제율(엘라스틴 생성 촉진효과; %)
실시예 2 (0.02 중량%)	38
실시예 2 (0.01 중량%)	21
실시예 2 (0.005 중량%)	10
대조군	0

엘라스타제 활성 억제율을 측정한 결과(표 4), 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물은 농도의존적으로 엘라스타제의 활성 억제율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

상기의 결과로부터 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물의 우수한 노화 방지 및 탄력 증진 효과를 확인할 수 있었다.

실험예 5: 티로시나제 활성 억제 실험

상기 실시예 2에서 수득한 시료의 티로시나제 활성 저해효과를 확인하기 위해 미백제로 잘 알려진 알부틴을 비교시료로 사용하였다. 티로시나제는 버섯에서 분리 및 정제된 것으로 Sigma 사에서 구입하여 사용하였다. 기질인 L-티로신(Sigma)은 0.05M 인산나트륨 완충용액(pH 6.8)에 용해하여 0.1㎎/㎖ 용액으로 만들어 사용하였다. 실시예 2의 시료는 0.05M 인산나트륨 완충용액(pH 6.8)에 적당한 농도로 조절하여 용해한 후 사용하였다. L-티로신 용액 0.5㎖를 시험관에 넣고 여기에 시료 0.5㎖을 가하고 37℃에서 25분간 반응시켰다. 이 반응액이 든 시험관을 얼음 위에 놓고 급냉시켜 반응을 중지시킨 후 파장 475nm 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 상기 시료 대신 완충용액 0.5㎖를 넣은 것을 사용하였다.

상기 각 시료의 티로시나아제 활성 저해율은 수학식 3에 따라 계산하였다.

<수학식 3>

티로시나제 활성 저해율(%) = 100-[(비교군 흡광도/대조군 흡광도)]X100

시료명	티로시나제 활성 저해율(%)
대조군	-
실시예 2 (0.02 중량%)	56
실시예 2 (0.01 중량%)	47
실시예 2 (0.005 중량%)	30
알부틴 0.2 중량%	59

티로시나제의 활성 저해효과를 측정한 결과(표 5), 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물을 0.02 중량% 처리 시 알부틴 0.2 중량%와 유사한 티로시나제 활성 저해율이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

상기의 결과로부터 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물의 우수한 티로시나제 활성 저해효과를 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명의 우수한 미백효과를 추론할 수 있었다.

실험예 6: B16F1 멜라닌 세포를 이용한 멜라닌 합성억제 실험

본 실험예 6에서는 실시예 2에서 수득한 시료의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라닌 세포에 대한 멜라닌 합성억제 효과를 측정하였다.

B16F1 멜라닌 세포의 멜라닌 합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라닌 세포를 6웰 플레이트에 각 웰당 2 x 10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신(trypsin)-EDTA로 떼어낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포 내 멜라닌의 정량은 로탄[Lotan : Cancer Res., 40, 3345-3350(1980)]의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 완충용액(50mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)) 1㎖를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,00 rpm, 10분)하여 얻은 세포여액에 1N NaOH(10% DMSO(Dimethyl Sulfoxide))를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라닌 세포의 멜라닌 생성 저해율(%)은 수학식 4에 의하여 계산하였다.

<수학식 4>

멜라민 합성 저해율(%) = [(A-B)/A] × 100

A: 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B: 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

시료명	멜라닌 합성 저해율(%)
음성 대조군	-
실시예 2 (0.02 중량%)	36
실시예 2 (0.01 중량%)	21
실시예 2 (0.005 중량%)	11
알부틴 0.2 중량%	37

B16F1 멜라닌 세포를 이용한 멜라닌 합성 억제효과를 측정한 결과(표 6), 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물 0.02 중량%는 알부틴 0.2 중량% 일 때와 유사한 멜라닌 합성 저해율을 나타내었다.

상기의 결과로부터 발효 생약추출물의 우수한 멜라닌 합성 저해율을 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명의 우수한 미백효과를 추론할 수 있었다.

실험예 7: 자외선 조사에 의한 세포독성 완화 효과

본 실험예 7에서는 실시예 2에서 수득한 시료의 자외선 조사에 의한 세포독성의 완화 효과를 평가하였다. 섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1x10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500ul의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model: F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 10% FBS가 첨가된 것) 1㎖을 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 시료를 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500㎕배지와 MTT 용액(2.5㎎/㎖) 60㎕를 넣은 후 2시간 동안 37℃ CO2배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04N)을 500㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565nm 흡광도를 측정하였다. 수학식 5와 같이 세포생존율(%)을 측정하고 자외선에 의한 세포독성 완화율은 수학식 6에 의하여 계산하였다.

<수학식 5>

세포생존율(%) ={(St-Bo)/(Bt-Bo)}X 100

Bo: 세포배양배지 만을 발색 반응한 웰의 565nm 흡광도,

Bt: 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 565nm 흡광도,

St: 시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의 565nm 흡광도.

<수학식 6>

자외선에 의한 세포독성 완화율(%) =1-(St-Bo)/(Bt-Bo)X 100

Bo: 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율,

Bt: 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율,

St: 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포생존율.

시료명	처리농도(%)	세포독성 완화율(%)
실시예 2	0.02	43
	0.01	29
	0.005	18

자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과를 측정한 결과(표 7), 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물은 자외선에 의한 세포 독성을 0.02% 농도에서 43%의 세포독성을 완화하여 자외선에 의한 세포독성을 효과적으로 방어함을 알 수 있었다.

상기의 결과로부터 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물의 자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과가 우수함을 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명의 자외선에 의한 피부자극 완화효과를 추론할 수 있었다.

실험예 8: 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과

본 실험예 8은 실시예 2에서 수득한 시료의 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 평가하기 위하여 사람의 표피조직에서 분리한 섬유아세포(Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5×10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 시료를 처리한 후 5시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 150㎕ 취하여 IL-1α를 정량함으로써 시료의 염증성 사이토카인 발현억제효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소면역분석법 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)를 이용하여 정량화하였으며, IL-1α의 생성율은 수학식 7에 의해 계산하였다.

<수학식 7>

염증성 사이토카인 발현 억제율(%) =1-(St-Bo)/(Bt-Bo)X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량,

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량,

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α생성량.

실험 결과, 실시예 2의 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물은 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1α의 생성을 0.02% 농도에서 41% 억제하여, 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있다(표 8).

시료명	염증성 사이토카인 발현 억제율(%)
실시예 2 (0.02 중량%)	41
실시예 2 (0.01 중량%)	22
실시예 2 (0.005 중량%)	11

실험예 9: 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진 효과

본 실험예 9에서는 실시예 2에서 수득한 시료를 첨가한 후 피부기질 성분인 타입 1 프로콜라겐의 생합성을 촉진시키는 효과를 알아보기 위하여 프로콜라겐 분석(procollagen assay)을 아래와 같은 방법으로 실시하였다.

신생아의 포피조직에서 분리한 사람진피섬유아세포(human dermal fibroblast)는 Modern Tissue Technology(MTT, Korea)로부터 분양받아 DMEM/F-12(3:1)배지에 10% 우태아혈청(FBS)을 첨가하여 1×10⁴ cell/㎠ 농도로 배양하였다. 70-80% 정도 자라면 1:3의 비율로 분주하여 계대 배양하였고, 3~4차 계대배양된 세포를 실험에 이용하였다. 프로콜라겐의 양을 측정하는 실험을 위해서 섬유아세포를 48 웰 플레이트(well plate)에 90% 이상 배양한 후 실시예 1 시료를 0.25% 농도로 가하고, 24시간 후에 배지 중에 유리된 프로콜라겐의 양을 프로콜라겐타입-1C-펩타이드 EIA 키트(procollagen type-1 C-peptide EIA kit)(MK101, Takara, Japan)를 사용하여 측정하였다.

결과는 표 9에 나타냈으며, 실시예 2 시료를 0.02% 처리 시 프로콜라겐의 생합성이 46%를 촉진되었으며 이는 세포신호전달 물질인 TGF-β와 유사한 효과였다.

상기의 결과로부터 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물의 우수한 프로콜라겐 생합성 촉진효과를 확인할 수 있었고, 그로부터 제조된 본 발명의 피부 개선효과를 추론할 수 있었다.

시료명	프로콜라겐 생합성촉진효과
실시예 2 (0.02 중량%)	46
실시예 2 (0.01 중량%)	22
실시예 2 (0.005 중량%)	14
TGF-β (0.001 중량%)	43

실험예 10: 여드름균에 대한 항균력 측정

본 실험예 10에서는 실시예 2에서 수득한 시료에 대한 항균력을 확인하기 위한 페이퍼 디스크 테스트(Paper Disc Test)를 실시하였다.

먼저, 여드름 발생원인의 피부 상재균인 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes)를 활성화시키기 위하여 BHI액체배지(Brain-Heart Infusion Broth; 3.7%)에서 48시간 전배양하였다. 이렇게 준비한 균 배양액을 BHI고체배지(Brain-Heart Infusion Broth; 3.7%;agar 1.5%)에 0.1㎖씩 도말한 후, 건조시켰다. 실시예 1에서 수득한 발효 생약추출물을 95% 에탄올 수용액에 12%(w/v)로 희석하여 직경 8㎜의 paper disc에 50㎕씩 점적한 후 앞서 준비한 고체배지 위에 올려 놓은 후 이것을 35℃ 혐기 배양조에서 3일간 배양하였다. 'Paper disc' 주변에 생긴 균 성장 저지 영역을 관찰하고 저지환의 크기를 측정함으로써 항균력을 평가하였다.

여드름륜에 대한 항균력을 측정한 결과, 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물의 균 성장 저지환의 크기는 24㎜인 것으로 나타났다.

실험예 11;피부 탄력 개선 효과 및 주름 개선

실시예 2에서 수득한 시료를 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 비교예 1과 비교실험을 행하여 피부 탄력 개선 효과 및 주름 개선 효과를 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 10과 같다. 우선 표 10에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 3, 비교예 1)을 제조한다. 실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 3에서 제조된 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

실험완료 후 피부 탄력 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부탄력측정기(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하였다. 실험결과는 하기 표 11에 Cutometer SEM 575의 △R7 값으로 기재하였는데 R7 값은 피부의 점탄성(viscoelasticity)을 나타낸다. 표 11와 같이 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 피부 탄력개선 효과가 우수함을 알 수 있다.

원료		실시예 3	비교예 1
가	스테아릴 알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부가)알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산 아스테르	2	2
나	실시예 2	1	-
	프로필렌글리콜	5	5
	정제수	잔량	잔량

주)단위: 중량%

실험제품	피부탄력효과(△R7)
실시예 3	0.36
비교예 1	0.13

n=20, p<0.05

실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 3에서 제조된 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

실험완료 후 피부 주름 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부의 주름개선효과를 알아보기 위하여 실리콘 재질의 모사판(replica)을 제작하여 지정 부위의 주름의 상태를 화상분석기인 비지오미터(visiometer: SV60, C+K Electronic Co., Germany)로 측정하였다. 그 결과를 하기 표 12에서 나타내었으며, 이 결과는 2개월 후의 각각의 파라미터(parameter) 값에서 2개월 전 파라미터 값을 뺀 것의 평균을 나타낸 것이다. 즉, 이 값이 음수가 나올수록 주름 개선 효과가 높다는 것을 의미한다. 따라서 표 12에서 나타나듯 실시예 2의 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물을 함유한 실시예 3의 피부 주름 개선 효과가 크게 증진되었음을 확인할 수 있었다.

실험제품	R1	R2	R3	R4	R5
실시예 3	-0.22	-0.17	-0.12	-0.07	-0.09
비교예 1	-0.11	-0.06	-0.05	-0.04	-0.02
R1: 주름 등고선의최고치와 최저치의 차이값 R2: 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값 들의 평균 R3: 5개씩 나눈 R1값 중 최고치 R4: 주름 등고선의 기선(baseline)에서 각각의 꼭대기와 계곡의 값을 뺀 평균값 R5: 주름 등고선의 기선에서 각각의 주름 윤곽을 뺀 값의 평균값

실험예 12;피부 미맥 실험

실시예 2에서 수득한 시료를 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 미백효과를 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 10(실시예 3, 비교예 1)에 나타낸 바와 같다. 실험자 (20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 3에서 제조된 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 시험 완료 후 얼굴 좌우 양편의 도포 부위 피부를 화상분석기 및 피부색의 변화를 크로마메타(Minolta CR300)를 이용하여 색의 밝기변화(ΔL)를 측정하고, 복수의 숙련자에 의한 객관적 육안 관찰과 피검자에 의한 주관적 육안관찰을 실시하여 하기 등급 분류에 따라 효과를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 13에 나타내었다. 이때 미백효능 정도를 다음의 7등급으로 분류하여 평가하였다.

미백효능 평가 기준; -3: 매우 악화, -2: 악화, -1: 약간 악화, 0:변화 없음, 1: 약간 개선, 2: 개선, 3: 매우 개선.

표 13에서 나타낸 바와 같이 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 피부에서 미백효과가 우수함을 알 수 있다.

피부색의 밝기 변화(ΔL)		숙련자의객관적 평가		피검자의 주관적 평가
실험예 3	비교예 1	실험예 3	비교예 1	실험예 3	비교예 1
3.68	1.74	2.47	1.95	2.87	1.4

실험예 13: SLS에 의한 피부자극 완화 효과

본 실험에서는 실시예 2에서 수득한 시료를 함유한 화장료의 자극 완화 효과를 인체 첩포 시험으로 평가하였다.

일반적 화장품 처방(크림, 로션, 스킨, 에센스)에 자극을 일으키는 SLS(Sodium lauryl sulfate) 1%와 실시예 3에서 제조된 제품을 혼용하여 24시간, 48시간, 72시간 동안 첩포하여 자극 유발지수를 바탕으로 자극완화 효과를 평가한 것이다.

20-50세의 건강한 남녀 50명의 팔 상박 부위에 FINN CHAMBER(FINLAND)를 이용하여 각각의 제품을 0.3 mg씩 첩포하고, 24시간 후 급성 자극 지수를 평가하였다. 평가 후 재차 동일한 부위에 동량의 제품을 첩포하여 48시간 및 72시간 후의 지연성 자극 지수를 평가하였다.

시험 결과 SLS를 단독으로 첩포한 부분은 24시간 후부터 피부에 붉게 자극이 나타났으나, 본 발명의 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물을 함유하는 제품을 첩포한 경우에는 24시간, 48시간, 72시간 경과 후에도 아무런 피부 발작을 일으키지 않았다.

이 결과는 본 발명의 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물이 화장료에 혼용되었을 때 자극을 유발시키는 기재(계면 활성제, 향, 알콜)에 의한 피부 자극을 감소시킬 수 있는 유의한 효과가 있음을 나타내는 것이다.

이하에 그 외의 실시예를 나타내었다. 즉, 실시예 2에서 수득한 본 발명의 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물을 함유한 화장수, 유액 및 미용액을 실시예 4 내지 6와 같이 제조하였다. 이들 본 발명의 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물을 함유한 화장수, 유액 및 미용액은 항산화 효과, 콜라겐 합성 촉진 효과, 피부 잔주름 개선 효과, 미백효과, 보습효과, 피부자극 완화효과, 아토피 개선효과 및 항염효과 등 피부개선에 우수한 효과를 나타내었다.

실시예 4: 본 발명의 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물을 함유하는 화장수 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합하였다. 실시예 2에서 수득한 본 발명의 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물 10g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 피부개선효과가 있는 화장수를 얻었다.

실시예 5: 본 발명의 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물을 함유한 유액 제조

세틸알콜1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰 부가)모노올레이트 1g및 향로 0.1g을 70℃에서 가열혼합하여 용해하고, 실시예 2에서 수득한 본 발명의 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열해서 용해하였다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형의 피부개선효과가 있는 유액을 얻었다.

실시예 6: 본 발명의 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물을 함유한 미용액 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히아루론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 실시예 2에서 수득한 본 발명의 바실러스 제주엔시스 HB-20(KCTC 12987BP) 배양물 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 피부개선효과가 있는 미용액을 얻었다.

[기탁 번호]

기탁기관명 : 한국생명공학연구원

수탁번호 : KCTC12987BP

수탁일자 : 20160226

<110> It'S HANBUL <120> A novel Bacillus jejuensis HB-20 strain and a cosmetic composition using the same <130> P17-0183IP <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1505 <212> DNA <213> Bacillus jejuensis HB-20 <400> 1 catggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggggttttaa 60 aagcttgctt ttgaaaccta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggcaa cctgcctgta 120 agactgggat aacaccggga aaccggtgct aataccggat aatccttctt ctcacatgag 180 aggaagctga aagacggttt cggctgtcac ttacagatgg gcccgcggcg cattagctag 240 ttggtggggt aacggcccac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc 300 cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg 360 caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagcga agaaggcctt cgggtcgtaa 420 agctctgttg tcagggaaga acaagtaccg gagtaactgc cggtaccttg acggtacctg 480 accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt 540 tgtccggaat tattgggcgt aaagcgcgcg caggcggtcc tttaagtctg atgtgaaagc 600 ccacggctca accgtggagg gtcattggaa actgggggac ttgagtgcag aagaggagag 660 cggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg 720 cggctctctg gtctgtaact gacgctgagg cgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag 780 ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttagagggt ttccgccctt 840 tagtgctgca gcaaacgcat taagcactcc gcctggggag tacggccgca aggctgaaac 900 tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac 960 gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgacactcc tagagatagg atdttcccct 1020 tcgggggaca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1080 gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc cagcattcag ttgggcactc 1140 taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc 1200 cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggatggtac aaagggcagc gaagccgcga 1260 ggtgaagcca atcccataaa accattctca gttcggattg caggctgcaa ctcgcctgca 1320 tgaagccgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc 1380 ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tggggtaacc 1440 gcaaggggcc agccgcctaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcgta acaaggtaaa 1500 ccgta 1505 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 2 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 3 tacggytacc ttgttacgac tt 22

Claims (8)

1. 신규한 바실러스 제주엔시스(기탁번호 KCTC 12987BP) HB-20 균주.
2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 균주.
3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항의 균주, 그 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
4. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항의 균주, 그 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물.
5. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항의 균주, 그 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물.
6. 삭제
7. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항의 균주, 그 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 여드름 치료 또는 완화용 조성물.
8. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항의 균주, 그 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 아토피 예방 및 개선용 화장료 조성물.
   
   

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