KR20120081289A

KR20120081289A - 아이소리퀴리티게닌 함량이 증가된 감초 발효물을 함유하는 피부외용제 조성물

Info

Publication number: KR20120081289A
Application number: KR1020110002547A
Authority: KR
Inventors: 배준태; 이근수; 송민현; 강정욱; 강기춘; 표형배
Original assignee: 한불화장품주식회사
Priority date: 2011-01-11
Filing date: 2011-01-11
Publication date: 2012-07-19

Abstract

본 발명은 감초 추출물을 유효 미생물으로 발효시킨 감초 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부외용제 조성물에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로는 발효균주인 잎새버섯(Grifola frondosa KCTC 10337BP) 균사체 또는 잎새버섯(Grifola fronodosa KCTC 10337BP) 전 배양액을 혼합하여 감초 추출물을 발효시켜, 감초 추출물 내 리퀴리틴(liquiritin)과 아이소리퀴리틴(isoliquiritin) 성분을 아글리콘(aglycons) 형태로 전환시켜 리퀴리티게닌(liquiritigenin)과 아이소리퀴리티게닌(isoliquiritigenin)의 함량이 증강된 감초 발효물을 제조하고, 이를 유효성분으로 0.001 - 30.0중량%를 함유하는 피부 외용제 조성물을 제조하였다. 이 조성물은 피부흡수가 뛰어나며, 단순 열수 또는 유기용매 추출물 보다 활성산소 소거효과, 주름개선효과, 슬리밍효과, 미백효과, 보습효과, 피부자극 완화효과, 여드름방지효과, 아토피 개선효과 및 항염효과가 우수하다.

Description

아이소리퀴리티게닌 함량이 증가된 감초 발효물을 함유하는 피부외용제 조성물{A skin-care agent containing fermented licorice extracts}

본 발명은 감초 추출물을 유효 미생물로 발효시켜 아아이소리퀴리티게닌 함량을 증가시킨 감초 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부외용제 조성물에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로는 발효균주로서 잎새버섯(Grifola frondosa KCTC 10337BP) 균사체 또는 잎새버섯(Grifola fronodosa KCTC 10337BP) 전 배양액으로 감초 추출물을 발효시켜, 감초 추출물 내에 주로 배당체(glucosides) 형태로 존재하는 플라보노이드 화합물인 리퀴리틴(liquiritin)과 아아이소리퀴리틴(isoliquiritin) 성분을 아글리콘(aglycons) 형태로 전환시켜 리퀴리티게닌(liquiritigenin)과 아아이소리퀴리티게닌(isoliquiritigenin)의 함량을 증대시킨 감초 발효물 제조방법 및 이 감초 발효물을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부외용제 조성물에 관한 것이다.

자외선에 노출된 피부는 프리라디칼과 활성산소종을 생성시켜 피부암, 광독성, 자기면역장애, 광과민증과 피부노화 등을 유발하게 된다(Norins, J. Invest. Dermatol., 39:445, 1962; Cadenas, Ann. Rev. Biochem., 58:79, 1989). 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나, 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질 분해효소(Matrix Metalloproteinases; "MMP")의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 이러한 콜라겐 분해효소는 자외선 조사에 의해 활성화되기도 한다. 그러므로 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다.

인체 내에는 약 200억 개나 되는 지방세포가 존재하고 있으며, 이는 포유류의 생체 내에서 에너지를 축적하거나 방출하는 역할을 담당하고 있다. 이 세포 내에서는 에너지의 축적과 방출에 대한 복잡한 조절 원리가 존재하며, 에너지의 수요보다 공급이 월등히 많을 경우에는 지방세포 내에 중성지방으로 저장되었다가 에너지가 고갈되었을 때 다시 유리 지방산과 포도당으로 분해되어 사용된다. 비만은 이 과정의 불균형으로 인하여 과도한 에너지의 축적이 일어났을 때 발생하는 것으로, 지방세포의 크기가 커지거나 그 수가 증가하는 현상에 기인하는 것으로 보고 있다. 현대인의 약 30~40%가 비만으로 알려져 있으며 고혈압, 고지혈증, 동맥 경화증, 심장질환, 당뇨병 등의 다양한 성인병을 수반할 수 있으므로 비만은 사회적 관심의 대상으로 대두되고 있다. 그러나, 이는 비단 건강의 측면에서뿐만 아니라 여성의 사회적 지위 향상과 경제적 독립 등의 사회적인 환경 변화에 의해 삶의 질을 높이고자 하는 욕구가 증가하게 됨으로 미의 관점에서 아름다운 몸매에 대한 관심도 또한 급격히 증가하고 있는 추세이다. 따라서, 이러한 건강 및 미적 관점에서 비만을 개선하기 위한 방법도 다각적인 측면에서 시도되고 있는데, 종래에 알려져 있는 비만 해소방법은 성형수술 외 에너지의 섭취를 저해하거나, 에너지 소비를 증대시킬 목적으로 식이요법, 운동요법, 수술요법, 약물요법 등의 다양한 방법들이 현재 비만 치료를 위해 사용되고 있다. 그러나, 이러한 방법들이 비만을 완전하게 해결할 수는 없을 뿐만 아니라 요요 현상이나 심각한 부작용들이 보고되고 있어 아직은 안전성에 대한 명확한 보장이 없는 실정이다. 또한, 미적 관점에서 비만 해소에는 지방 분해와 더불어 피부에 대한 효능이 부가적으로 요구되므로 상기 요법들의 적용이 모든 필요충분 조건을 충족하기에는 아직 미비한 부분이 많다고 할 수 있다. 현재 많은 여성들이 성형수술에 대한 심리적 부담감, 비용, 부작용 등으로 인해 상대적으로 안전하고 저렴한 제품인 슬리밍(slimming) 및 안티 셀룰라이트(anti-celullite) 화장품에 대한 요구가 꾸준히 높아지고 있다. 하지만 기존의 슬리밍 바디 케어 제품들은 식욕억제 약물을 사용하거나 이뇨제를 사용하는 등의 일시적인 효과를 나타내고 어지러움, 구토, 불면증, 환각 증세 등의 부작용이 있는 단점이 있었다. 또한 종래에 알려진 카페인이나 테오필린 같은 메틸잔틴계 지방 분해 촉진 물질 역시 중독성 물질이라는 인식과 기관지 확장과 월경 전 증후군 현상 악화 등의 부작용이 보고되어 그 안전성에 대한 보장이 없다. 따라서 슬리밍제로서 효과가 우수하며 친자연적인 천연물 소재의 개발이 시급한 상황이다. 따라서, 종래의 물질과 동등하거나 그 이상의 효능을 나타내면서도 인체에 대해서는 좀더 안전한 새로운 물질을 개발해야 할 필요성이 대두되고 있다.

멜라닌은 색소 세포 내에 존재하는 티로시나제의 작용에 의해 티이로신으로부터 도파(dopa), 도파퀴논(dopaquinone)으로 변환되어 도파크롬(dopachrome) 등을 거처 생성된다. 이 멜라닌은 피부에 존재하여 자외선 등으로부터 신체를 보호하고 체내 호르몬 분비 조절에 중요한 기능을 가지고 있다. 그러나 멜라닌이 과잉생산됨으로써 기미, 주근깨 등을 형성하고, 피부노화를 촉진하며, 피부암 유발에 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 멜라닌 과잉생산을 예방하는 연구개발이 활발히 진행되고 있다.

이미 아스코르빈산(일본특개평 4-9320), 하이드로퀴논(일본특개평 6-192062), 코직산(일본특개소 56-7710), 알부틴(일본특개평 4-93150) 및 일부 추출물 등이 티로시나제 저해 활성을 가지고 있어 미백 화장료로 이용되고 있으나 화장품 제형 중에서의 안정성이 좋지 않아 분해되어 착색되거나, 이취가 발생하고, 생체 수준에서의 효능, 효과가 불분명하고 안전성이 문제가 되어 그 사용이 제한되고 있는 실정이다.

피부질환이란 사람을 포함한 포유동물의 머리털과 손톱, 발톱을 포함하는 모든 피부에 나타나는 이상 소견을 의미하는 것으로, 아토피 알러지를 가진 사람에게서 나타나는 아토피 피부염(atopic dermatitis)이 대표적인 질환이다. 아직까지 아토피 피부염의 원인은 명확히 밝혀지지 않았지만 아토피 피부염 환자의 약 70%에서 아토피의 병력이 있었으며, 알레르기성 체질인 사람에서 호발하고, 특히 다른 알러지 질환인 알러지성 비염, 천식 등을 동반하여 유전적 요인이나 면역 질환의 하나로 이해하고 있다. 이 질병은 초기의 심한 가려움증에 의해 대부분이 피부를 긁고 이에 따른 2차 감염이 일어나며, 특히 환자의 정신적 안정 및 감정의 상태에 따라 피부 상태가 더욱 악화될 수도 있다. 상당히 많은 사람들이 아토피 피부염을 앓고 있는데, 전 인구의 0.5~1%가, 어린이의 경우는 5~10%가 고통 받고 있다. 증상이 나타나는 시기는 대체로 생후 2~6개월 내이며, 특히 1세 미만의 영아에게서 가장 많이 나타나고, 85%가 만 다섯살 안에 나타난다. 아토피성 피부염은 주로 유아기에 자주 발생하지만, 최근에는 사춘기 이후의 환자가 증가하고 있고, 그 병력도 매우 길어지고 있다. 아토피성 피부염의 치료에는, 높은 약리효과를 기대할 수 있는 부신피질 호르몬 등의 약제가 사용되고 있다. 그러나, 이와 같은 부신피질 호르몬제의 부작용이 문제가 되고 있고, 환자는 치료기간 중에 부작용의 위험에 노출되어 있다. 더욱이, 부신피질 호르몬제의 사용 중지에 의하여 리바운드(약물의 사용정지 후에 일어나는 극적인 환부의 병세악화)가 생기는 것도 잘 알려져 있다. 이와 같은 부작용의 대책으로서, 부신피질 호르몬 등의 호르몬을 포함하지 않는 비스테로이드성 항염증제 또는 항히스타민제 등이 사용되고 있으나 완치가 어려운 상태이다. 따라서, 부작용이 없는 아토피 피부염의 경감 또는 치료제 개발이 매우 절실한 실정이다.

최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연 추출물로부터 얻어진 항산화, 주름완화, 미백, 가려움 완화등의 기능을 가진 기능성 화장료(functional cosmetics)에 많은 관심이 집중되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 늘어나고 있다.

예를 들어, 미국 특허공보 US 5,972,341는 코미포라(Commiphora)속 식물, 특히, 코미포라 무쿨(Commiphora mukul)추출물의 주름개선 효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평9-672662 는 히알우로니다제(Hyaluronidase)억제 효능을 가지는 해초류 추출물들에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평10-85905은 와카메(Wakame)로부터 추출된 푸코이단 (Fucoidan)의 피부감촉 개선효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평2-245087은 사르가숨(Sargassum)속 추출물의 항산화 효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평3-294384는 히지키아(Hizikia)속으로부터 추출된 항산화 조성물에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평7-10769호는 수렴효과(astringent effect)가 있는 페오피시에강(Phaeophyceae) 추출물에 관하여 기술하고 있다. 대한민국 특허 제 0431076 호는 백급, 자소, 에키나시아 및 발효대두 추출물을 포함하는 아토피 피부의 치유 개선용 화장료 조성물을 개시하고 있고, 대한민국 특허 제 0511494호는 하수오, 시엽, 일라이트를 포함하는 아토피 피부염 치료를 위한 추출물 및 조성물을 개시하고 있으며, 대한민국 특허출원 공개 제 2004-0065126호는 천연의 영지버섯, 유근피, 감초, 백봉령, 백지마 및 백년초 등으로부터 얻은 한방 식물 추출물을 포함하는 아토피 피부의 치유와 예방에 효과를 갖는 한방 화장료 조성물을 개시하고 있다. 또한, 대한민국 특허출원 공개 제 2004-0011584호는 감초, 창이자, 홍화, 돈지(돼지비계)와 같은 천연성분의 물질을 정제 혼합하여 구성된 아토피성 피부질환의 치료에 우수한 조성물에 관해 개시하고 있다.

한편, 한방 생약재의 유효성분은 체내흡수율과 생체이용률은 높으나, 이를 단순 추출한 추출물의 경우, 생체 외에서는 유효한 효능을 나타내지만, 이를 함유하는 피부 외용제 경우는 그의 효과가 만족스럽지 못한 문제점이 있다.

감초(Licorice, Glycyrrhizae radix)는 장미목 콩과에 속한 다년생 초본으로 목질로 덩굴져 있는 땅속 줄기와 땅속 깊이 길게 뻗어 있는 뿌리를 갖고 있다. 감초는 한약재로 널리 사용되고 있으며 음식, 음료수, 담배 등의 맛을 내는 성분으로 광범위하게 이용되고 있다. 위궤양, 십이지장 궤양, 후두염, 감기, 기관지염, 관절염, 부신병 그리고 알러지 등의 여러 가지 질병에 효과가 있음은 물론 다른 약품 제조시 맛을 내기 위해 많이 쓰이기 때문에 가장 많이 이용되는 약초 중의 하나이다.

감초의 주요성분은 사포닌, 플라보노이드, 아이소플라본, 쿠마린, 스틸베노이드 등의 계열로 구분되며, 글리시리진(glycyrrhizin), 리퀴리틴(liquiritin), 리퀴리틴 아피오사이드(liquiritin apioside), 아이소리퀴리틴(isoliquiritin), 리퀴리티게닌(liquiritigenin), 글리시레틴산(glycyrrhetinic acid) 등 14종의 화합물이 분리, 보고되었다.

이러한 감초 성분 중 소량 함유된 것으로 알려진 플라보노이드 화합물인 리퀴리티게닌(liquirigenin)과 아이소리퀴리티게닌(isoliquiritigenin)은 피부의 항노화와 관련된 항염증, 항산화, 미백, 에스테로겐 활성, 항균, 항치매, 항혈관신생, 항피부암, 카드뮴유발독성 제거 등에 다양한 생리활성을 나타내는 것으로 잘 알려져 있다.

감초로부터 리퀴리티게닌(liquiritigenin)을 정제하는 방법으로는 단순히 감초로부터 각종 용매를 이용하여 추출하거나 이온교환수지 등을 통하여 정제하는 방법과 감초로부터 추출한 리퀴리틴(liquiritin)과 리퀴리틴 아피오사이드(liquiritin apioside)와 같은 배당체(glycosides)를 가수분해할 수 있는 누룩곰팡이 및/또는 이로부터 얻은 조효소액을 이용한 생전환 방법[대한민국 특허등록 제10-0592482, 대한민국 특허공개 10-2010-0092808]으로 비배당체인 리퀴리티게닌(liquiritigenin)을 제조하는 방법에 대한 보고가 있으나, 상기 방법으로는 리퀴리티게닌의 수율이 낮으며, 유기용매의 유해성이 높은 추출과정, 그리고 고비용을 유발하는 정제과정 등의 단점이 있다. 특히, 생전환에 이용되는 누룩곰팡이를 배양하기 위하여 누룩을 만드는 제조 공정상의 불편함과 조효소액의 가수분해 활성이 만족스럽지 못한 문제를 야기할 수 있으며, 현재까지 천연물의 배당체를 비배당체로 생전환시킬 수 있는 미생물과 효소의 확보가 산업적인 측면에서 여전히 확립되어 있지 않은 상태이므로 활성이 우수한 당-가수분해 효소를 생산하는 미생물에 대한 탐색이 요구되고 있는 현실이다.

감초에 함유된 또 하나의 플라보노이드 화합물인 아이소리퀴리티게닌(isoliquiritigenin)의 생리작용에 관한 다수의 연구 결과가 보고되어 왔으나 아직까지 감초로부터 미생물을 이용한 생물학적 발효법을 통해 다량으로 존재하는 배당체 아이소리퀴리틴(isoliquiritin)을 생체내 흡수능과 생체 이용률이 우수한 아글리콘 형태인 아이소리퀴리티게닌(isoliquiritigenin)으로 전환하는 기술과 이의 대량 순수 분리 및 정제에 관한 연구는 거의 없는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 감초에 함유되어 있는 플라보노이드 화합물의 상기와 같은 우수한 효능을 인식하고, 산업적면에서 좀 더 효율적이며 다양하게 이용 가능하도록 하기 위하여 감초 추출물로부터 생체내 흡수능이 우수한 아글리콘 형태의 리퀴리티게닌(liquiritigenin)과 아이소리퀴리티게닌(isoliquiritigenin)을 제조하는 방법에 대하여 다각도로 연구하였다. 이 결과, 본 발명자들에 의해 선행보고[대한민국 특허등록 제0461960호, 2004]된 바 있는 잎새버섯(Grifola frondosa KCTC 10337BP) 균사체를 이용하여 감초 추출물을 발효시키면 상기 균주가 플라보노이드 화합물 배당체(리퀴리틴,아이소리퀴리틴)의 당부분과 아글리콘 부분을 연결하는 알파-1,4-글루코시드 결합을 절단하는 글루코시다아제(β-glucosidase)의 활성이 우수하여 플라보노이드 화합물 배당체를 아글리콘(리퀴리티게닌, 아이소리퀴리티게닌)으로 용이하게 전환할 수 있음을 확인하였다. 또한, 감초 발효 배양액을 분리 및 정제하여 구성성분을 분석한 결과 피부 활성이 우수한 다량의 리퀴리티게닌과 아이소리퀴리티게닌을 얻을 수 있음을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 종래의 정제수 또는 유기용매를 이용한 감초 추출물로부터 화학적인 산/알카리처리법 또는 종래 효소처리법으로 비배당체를 제조하는 공정보다 화학물질 사용에 대한 거부감을 해소하고, 공정비용을 크게 감소시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 기존의 단순 감초 추출물보다 피부 활성이 우수한 리퀴리티게닌과 아이소리퀴리티게닌 함량을 월등히 증강시킨 감초 발효물을 제공할 수 있다. 또한, 아이소리퀴리티게닌 함량이 증가된 감초 발효물은 피부 안전성이 우수하고 활성산소 소거효과, 주름개선효과, 미백효과, 보습효과, 피부자극 완화효과, 여드름방지효과, 아토피 개선효과 및 항염효과가 우수하여 화장료로서의 효능을 기대할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명의 목적은 피부 화장료에 적용 가능하고 화장료에 함유시 활성산소 소거효과, MMP-1 생합성 감소 및 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진효과, 피부 주름 개선효과, 함염효과 등 우수한 항노화 효과를 나타내는 감초 발효물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 피부화장료에 적용시 자외선 조사 등에 의한 미백효과와 염증매개 물질에 의한 피부자극 완화효과를 나타내는 감초 발효물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 피부화장료에 적용시 보습효과 및 아토피 피부 개선에 효과를 나타내는 감초 발효물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 피부화장표에 적용시 우수한 여드름 방지효과를 갖는 감초 발효물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 감초 추출물을 잎새버섯 균사체 발효배양을 통해 플라보노이드 화합물인 리퀴리티게닌과 아이소리퀴리티게닌이 증가된 감초 발효물을 제조하는 방법 및 그 성분이 함유된 화장료를 제공하고자 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 피부 개선 효과가 있는 감초 추출물을 잎새버섯 균사체 배양을 통해 발효시켜 얻은 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부외용제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 본 출원인이 발명한 잎새버섯(대한민국 특허등록: 10-0461960) 추출물에서 감초 추출물을 발효처리하여 리퀴리티게닌과 아이소리퀴리티게닌 함량이 증가한 감초 발효물을 주요성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다. 이때 발효시 감초 추출물은 1~30중량% 범위에서 부가해 주어야 발효가 효과적으로 일어난다. 발효 화장료를 제조하기 위한 발효 균주로서 다양한 균주들이 이용되고 있으나, 본 발명에서 이용하는 잎새버섯 균사체는 다른 잎새버섯 균주나 유산균주 등의 기타 다른 발효 균주로 발효시킨 것에 비하여 플라보노이드 화합물 비배당체로의 전환율이 2~3배 이상 현저히 높게 나타나 KCTC 10337BP 잎새버섯 균주를 이용하였다(데이터 나타내지 않음).

또한, 본 발명은 잎새버섯 균사체(Grifoal frondosa KCTC 10337BP, 대한민국 특허등록: 10-0461960)로 감초 추출물을 발효배양하여 리퀴리티게닌과 아이소리퀴리티게닌 함량이 증가된 감초 발효물이 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 30중량% 함유되는 것을 특징으로 하는 피부외용제 조성물을 제공한다. 상기 감초 발효물의 함량이 0.001중량% 미만인 경우에는 피부개선 효과가 거의 없으며, 30.0중량% 이상인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하여 경제적이지 못하다.

또한, 본 발명은 상기 피부외용제 조성물이 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형의 제형 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 감초 발효물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물을 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 피부외용제 조성물이 화장료 조성물 또는 약학 조성물인 것을 특징으로 한다.

감초 발효물은 캡슐제, 액상제, 연고제, 첩부제 또는 약학적으로 허용되는 담체를 이용한 서방화제제 등의 약학 조성물로 제제화 할 수 있으며, 약리학적으로 허용되는 기제, 운반제, 부형제, 결합제(예: 전분, 트래거캔스 고무, 젤라틴, 당밀, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐에테르, 폴리비닐 피롤리돈, 히드록시프로필 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 카르복시메틸 셀룰로오스), 분쇄제(예: 한천, 전분, 벨라틴 가루, 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 카르복시메틸 셀룰로오스 칼슘, 결정 셀룰로오스, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨 및 알긴산 나트륨), 윤활제(예: 스테아린산 마그네슘, 활석, 수첨 식물유) 및 착색제 등을 포함한다. 상기 운반제 및 부형제로는 젖당, 글루코오스, 수크로오스, 만니톨, 감자녹말, 옥수수녹말, 탄산칼슘, 인산칼슘 및 셀룰로오스 등을 사용한다. 상기 외에도 안정화제, 용해보조제, 경피흡수 촉진제 등의 보조제 방향제, 방부제 등의 첨가제가 더 첨가될 수 있다. 이와 같이 제조되는 약학 조성물은 증상에 따라 일일 1회 내지 수회 피부에 적용할 수 있으며 증상의 호전정도에 따라 적용을 조절할 수 있다.

본 발명은 잎새버섯 균사체 배양을 통해 얻어진 감초 발효물이 리퀴리티게닌과 아이소리퀴리티게닌 함량이 증가되고, 이에 따라 피부 흡수력이 뛰어나고, 기존의 단순 추출물 보다 부작용이 없으면서, 활성산소 소거효과와 MMP 저해 효과, 자외선 조사에 의한 MMP 발현 조절효과, 피부 잔주름 개선효과 등 우수한 항노화 효과와 자외선 조사후 야기되는 피부 자극을 완화시켜 주는 효과를 나타내었다.

또한, 본 발명의 아아이소리퀴리티게닌 함량이 증가된 감초 발효물은 기미, 주근깨 및 피부 색소 침착의 원인이 되는 물질인 멜라닌 생성억제 효과등의 미백작용을 나타내었다.

또한, 본 발명의 아아이소리퀴리티게닌 함량이 증가된 감초 발효물은 염증매개 물질에 의한 피부자극 완화 및 아토피 개선효과를 나타내었다.

또한, 본 발명의 아아이소리퀴리티게닌 함량이 증가된 감초 발효물은 우수한 여드름방지 효과를 갖는 여드름균 항균활성 억제 효과를 나타내었다.

도 1은 단순 감초 추출물 중 리퀴리틴(A)과 잎새버섯 균사체 발효배양 후 감초 발효물 중 리퀴리티게닌(B)의 함량 변화를 비교한 고속액체크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 단순 감초 추출물 중 아이소리퀴리틴(A)과 잎새버섯 균사체 발효배양 후 감초 발효물 중 아이소리퀴리티게닌(B)의 함량 변화를 비교한 고속액체크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 감초 추출물 제조

세절하여 음건한 감초 2kg을 정제수로 80℃에서 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #2 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물은 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조시켜, 감압농축물 및 동결건조물이 0.001~30.0중량% 함유되게 정제수를 사용하여 감초 추출물을 제조하였다.

실시예 2: 잎새버섯을 이용한 감초 발효물 제조

잎새버섯 KCTC 10337BP 균사체를 효모-맥아즙 한천배지가 든 시험관에 사면배양하여 4℃에 보관하고 1개월마다 계대배양하여 사용하였다. 상기 사면배지에서 계대배양된 균사체를 무균적으로 균질화하여, 실시예 1에서 수득한 감초 추출물과 당이 혼합된 최적화된 합성배지(대한민국 특허등록: 10-0461960)로 하며 pH 5.5로 조정한 액체배지에 5%(v/v)되게 접종한 후, 발효조 내에서 온도 27℃, 회전수 150rpm, 통기량 1.5vvm의 조건으로 6일간 배양 후, 균사체를 제거한 감초 발효물을 제조하였다.

실시예 3: 감초 발효물의 성분 확인 실험

실시예 1과 2에서 수득한 감초 추출물과 감초 발효물에 함유되어 있는 주요성분을 HPLC법에 의한 분석방법으로 감초 추출물과 감초 발효물의 리퀴리티게닌과 아이소리퀴리티게닌 성분의 변화량을 측정하여 그 결과를 도 1과 도 2에 나타내었다. 또한, 분획 콜렉터(fraction collector)를 이용하여 컬럼 크로마토그래프로부터 얻어진 상기 2가지 성분에 대한 기기분석 자료는 다음과 같으며 기기분석을 통해 감초 발효물에 포함된 성분이 리퀴리티게닌과 아이소리퀴리티게닌임을 정확히 알 수 있었다.

분석장비는 Waters사의 Alliance 2695와 C-18 컬럼(Xterra)을 사용하였으며, 이동상 용매로는 메탄올과 완충액(20mM 초산 완충액)을 농도구배로 변화시키며(메탄올:완충액 = 20:80 → 60:40) 분리하였다. 표준품은 각각 크로마덱스(arctiin; Chromadex, USA)와 시그마-알드리치(arctigenin, caffeic acid; Sigma-Aldrich, USA)에서 구입하였으며, 표준품과 분획물의 확인은 자외선 흡광도 280nm로 고정하여 PDA(photodiode array) 분석기로 확인하였다.

리퀴리티게닌(liquiritigenin)

ESI-MS (m/z) (negative): 255[M]

¹H NMR (500 ㎒ (DMSO-d₆)), δ: 10.56 (br s, 7-OH), 9.57 (br s, 4′-OH), 5.46 (1H, dd, J = 12.8, 2.8 Hz, H-2), 3.12 (1H, dd, J = 16.8, 12.8 Hz, H-3), 2.62 (1H, dd, J = 16.8, 2.8 Hz, H-3), 7.64 (1H, d, J = 8.6 Hz, H-5), 6.50 (1H, dd, J = 8.6, 2.1 Hz, H-6), 6.33 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-8), 7.31 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2′, H-6′), 6.79 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3′, H-5′),

¹³C NMR (125 ㎒, DMSO-d₆), δ: 190.1 (C=O), 79.0 (C-2), 43.1 (C-3), 128.4 (C-5), , 110.5 (C-6), 164.6 (C-7), 102.5 (C-8), 163.2 (C-9), 113.5 (C-10), , 129.3 (C-1′), 157.6 (C-4′) , 128.2 (C-2′, C-6′), 115.1 (C-3′, C-5′).

아이소리퀴리티게닌(isoliquiritigenin)

ESIMS (m/z) (negative): 257 [M].

1H NMR (500 ㎒, Pyridine), δ: 14.4 (8-OH), 8.22 (1H, d, J = 15.3 Hz, H-1), 8.19 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-4), 7.90 (1H, d, J = 15.3 Hz, H-2), 7.76 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2′, H-6′), 7.19 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3′, H-5′), 6.89(1H, d, J = 2.1 Hz, H-8), 6.78 (1H, dd, J = 8.8, 2.1 Hz, H-6).

¹³C NMR (125 ㎒, Pyridine), δ: 192.5 (C=O), 167.5 (C-7), 166.7 (C-9), 161.9 (C-4′), 144.9 (C-2), 132.9 (C-5), 131.5 (C-2′, C-6′), 126.7 (C-1′), 117.9 (C-1), 117.0 (C-3′, C-5′), 114.2 (C-4), 109.1 (C-6), 104.0 (C-8).

시료명	리퀴리티게닌	아이소리퀴리티게닌
실시예 1 (감초 추출물) (ug/mg of extract)	0.11	0.08
실시예 2 (감초 발효물) (ug/mg of extract)	40.3	32.8

실시예 4: NBT 법을 이용한 항산화 효과 측정 실험

실시예 2에서 수득한 감초 발효물의 항산화 효과를 확인하기 위해 실험실 조건에서 항산화제로 잘 알려진 BHT(Butylated hydroxytoluene)를 비교샘플로 하고 NBT(Nitro Blue Tetrazolium) 법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다.

항산화 효과를 측정하기 위해서 잔틴과 잔틴옥시다제에 의해 생성되는 활성산소를 NBT 법에 의해 측정하고 피검물질이 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소 소거효과를 평가한다. 잔틴과 잔틴옥시다제에 의해 활성산소를 생성시킨다. 이 활성산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)과 반응하여 이것에 의해 생성되는 청색을 파장 560nm에서 측정하는 것으로 활성산소 소거율을 측정한다.

측정방법으로서

1. 0.05M Na₂CO₃ ------------------------------------- 2.4ml

2. 3mM 잔틴 용액---------------------------------- 0.1ml

3. 3mM EDTA 용액------------------------------------ 0.1ml

4. BSA 용액----------------------------------------- 0.1ml

5. 0.72mM NBT 용액---------------------------------- 0.1ml

6. 잔틴 옥시다제 용액----------------------------- 0.1ml

7. 6mM CuCl₂ 용액----------------------------------- 0.1ml

① 바이엘병에 1,2,3,4,5를 가하고 여기에 시료용액 0.1ml을 첨가하고 25℃에서 10분간 방치한다.

② 6을 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 20분간의 배양을 개시한다.

③ 그 후 7을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

④ 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다.

⑤ 역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 6 대신에 증류수를 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

효과는 수학식 1에 의하여 산출하였으며, 그 결과는 표 1에 나타내었다.

표 2에서 확인할 수 있듯이 감초 발효물은 BHT보다 우수한 항산화력을 갖고 있음이 확인되었다.

시료명	세포내 항산화효과(%)
감초 발효물 0.25중량%	99%
감초 발효물 0.1중량%	95%
감초 발효물 0.05중량%	85%
감초 발효물 0.025중량%	70%
BHT 0.1중량%	86%

실시예 5: 자유라디칼 소거활성 측정 실험

실시예 2에서 수득한 감초 발효물의 자유라디칼 소거활성을 측정하기 위해 실험실 조건에서 BHT와 같은 항산화제를 비교샘플로 하고 DPPH법을 이용하여 자유라디칼 소거활성을 측정하였다.

DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 자유라디칼 소거활성을 측정한다. 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공 시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정한다.

DPPH 자유라디칼 소거활성 측정을 위하여 각각 0.25, 0.1, 0.05, 0.025% 농도의 감초 발효물을 준비하였다. 상기 농도의 추출물을 96 웰 플레이트에 각각 넣고, 여기에 100uM 메탄올 용액으로 제조된 DPPH를 첨가하여 용액의 총 부피가 200㎕가 되도록 하였다. 이것을 37℃에서 30분간 방치한 후 560nm에서 흡광도를 측정하였다. 자유라디칼 소거활성(%)은 다음의 수학식 2로 산출하였다.

표 3에서 확인할 수 있듯이 감초 발효물은 항산화제로 많이 이용되고 있는 BHT보다 우수한 항산화 효과를 갖고 있음을 알 수 있었다.

시료명	항산화효과(%)
감초 발효물 0.25중량%	99%
감초 발효물 0.1중량%	96%
감초 발효물 0.05중량%	95%
감초 발효물 0.025중량%	90%
BHT 0.1중량%	84%

실시예 6: 세포내 활성산소 소거효과

실시예 2에서 수득한 감초 발효물의 자외선에 의해 세포내에서 생성되는 활성산소 생성 억제효과 즉, 활성산소 소거효과를 알아보기 위하여 비교시료로서 EGCG(Epigallocatechin gallate)를 선택하고, 형광물질을 이용하여 아래와 같은 실험을 수행하였다.

실험에 사용한 세포주는 독일 암연구센터의 퓌세니그 박사(Dr. Fusenig)로부터 분양 받은 인간 각질세포 HaCaT 세포주(Human keratinocytes HaCaT cell line)로서, 이를 형광측정용 96웰 블랙 플레이트(well black plate)에 웰당 2.0 × 10⁴개로 분주하고 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 첨가된 DMEM(Dulbeccos Modification of Eagles Medium, FBS 10%, Gibco, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂조건에서 1일간 배양한 후, 각각 0.02, 0.01, 0.005% 농도로 감초 발효물을 처리하였다.

시험시료를 넣고 24시간 배양한 후 HCSS(HEPES-buffered control salt solution)로 세척하여 남아있는 배지를 제거하고 HCSS에 20μM로 준비된 DCFH-DA (2',7'- dichlorodihydro-fluorescein diacetate, Molecular Probes, USA)를 100㎕ 가하고 37℃, 5% CO₂조건에서 20분간 배양한 후, HCSS로 세척하였다. 이 후 농도별로 처리된 HCSS를 100㎕ 가한 후 초기에 활성산소로 산화된 DCF(dichlorofluorescein)의 형광도를 형광 플레이트 판독기(Ex;485 nm, Em;530nm)로 측정하였다. 이후 UVB(20mJ/cm²)를 조사하고 감초 발효물 처리 후 형광도를 형광 플레이트 판독기(Ex;485 nm, Em;530nm)로 측정하였다.

표 4와 같이, 감초 발효물은 비교시료로 이용되고 있는 EGCG보다 우수한 활성산소 소거 효과를 나타낸다는 사실을 알 수 있었다.

시료명	활성산소 소거효과(%)
감초 발효물 0.02중량%	58
감초 발효물 0.01중량%	47
감초 발효물 0.005중량%	29
EGCG 0.01중량%	43

실시예 7: 시험관 내 MMP-1 활성저해 실험

MMP-1 활성 저해 효과를 측정하기 위하여 형광 분석법을 이용하였다. 실험에 사용한 기질은 형광물질이 표지된 DQ-콜라겐, 효소(collagenase)는 Molecular probe사 (Eugene, OR, USA)에서 시판중인 제품을 사용하였으며, 반응완충액(0.5 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl, 50 mM CaCl₂, 2 mM sodium azide, pH 7.6)은 10배 희석 후 사용하였다. 반응완충액 100 ㎕에 0.25 ㎎/㎖로 용해한 DQ-콜라겐 20 ㎕와 시료(각각 0.02, 0.01, 0.005중량%) 40 ㎕을 첨가하고 0.5 단위(unit)로 희석한 콜라게네이즈 40 ㎕을 첨가한다. 암소, 실온에서 20분 경과 후 형광 분광광도계(Perkin Elmer, UK)를 이용하여 흡수파장 495 nm, 방출파장 515 nm로 형광값을 측정하며, 대조군으로서 효소액 대신 반응완충액을 효소와 동량 첨가하여 형광값을 측정하였으며, 시료 자체의 형광값도 측정하여 효소활성 계산시 보정하였다.

결과는 표 5에 나타냈으며 감초 발효물을 0.02% 처리시 클로스트리디움 콜라게네이즈의 콜라겐 분해활성을 94% 억제하였으며 이는 녹차추출물의 저해 효과보다 우수한 결과이다.

시료명	저해율(%)
감초 발효물 0.02중량%	94
감초 발효물 0.01중량%	68
감초 발효물 0.005중량%	45
녹차추출물 0.2중량%	68

실시예 8: 자외선 조사 후 감초 발효물에 의한 MMP-1 발현억제 평가

실시예 2에서 수득한 감초 발효물의 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하기 위해서 효소면역 시험법(ELISA)을 실시하였다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 6.3J/㎠의 에너지로 조사하였다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간을 유지시켰다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96 웰에 코팅하였다. 일차항체(MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 60분간 반응시켰다. 이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질용액(1㎎/㎖ ρ-nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 판독기로 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였다.

자외선 조사시에 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여 시료를 처리하지 않은 음성 대조군에 비하여 감초 발효물은 79% 이상의 억제율을 보였으며 이는 비교 대조군으로 사용한 레티놀의 억제율에 비해 상당히 우수한 결과를 나타내었다.

시험군	MMP-1 발현억제율(%)
음성 대조군	-
감초 발효물 0.02중량%	79
감초 발효물 0.01중량%	40
감초 발효물 0.005중량%	28
레티놀	38

실시예 9: 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진 효과

실시예 2에서 수득한 감초 발효물 첨가 후 피부기질 성분인 타입 1 프로콜라겐의 생합성을 촉진시키는 효과를 알아보기 위하여 프로콜라겐 분석(procollagen assay)을 아래와 같은 방법으로 실시하였다.

신생아의 포피조직에서 분리한 사람진피섬유아세포(human dermal fibroblast)는 Modern Tissue Technology(MTT, Korea)로부터 분양받아 DMEM/F-12(3:1) 배지에 10% 우태아혈청(FBS)을 첨가하여 1× 10⁴cell/㎠ 농도로 배양하였다. 70-80% 정도 자라면 1:3의 비율로 분주하여 계대 배양하였고, 3~4차 계대배양된 세포를 실험에 이용하였다.

프로콜라겐의 양을 측정하는 실험을 위해서 섬유아세포를 48 웰 플레이트에 90% 이상 배양한 후 감초 발효물을 각각 0.02%, 0.01%, 0.005% 농도로 가하고, 24시간 후에 배지 중에 유리된 프로콜라겐의 양을 프로콜라겐타입-1C-펩타이드 EIA 키트(procollagen type-1 C-peptide EIA kit)(MK101, Takara, Japan)를 사용하여 측정하였다.

결과는 표 7에 나타냈으며 감초 발효물을 0.02% 처리시 프로콜라겐의 생합성은 39% 촉진되었으며, 이는 세포신호전달 물질인 TGF-β와 유사한 결과였다.

시료명	프로콜라겐 생합성촉진효과(%)
감초 발효물 0.02중량%	39%
감초 발효물 0.01중량%	17%
감초 발효물 0.005중량%	11%
TGF-β 0.001중량%	37%

실시예 10: 감초 발효물의 엘라스틴 생성 촉진 효과

감초 발효물의 엘라스틴 생성 촉진 효과를 알아보기 위하여, 사람으로부터 직접 채취하거나 상업적으로 구입한 사람의 섬유 아세포에 상기 실시예 2의 감초 발효물을 처리하여 엘라스타제(elastase) 활성의 억제효과를 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 사람의 섬유 아세포를 배양용 플라스크에 넣고 약 70~80% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 이후 감초 발효물을 1일간 처리한 후 세포배양액을 채취하여 상업적으로 이용 가능한 엘라스틴 측정기구를 이용하여 엘라스틴 생성 정도를 측정하였다[Bieth J: Biochem med., 11, 350-357(1974), Schwartz DE: J.Invest Dermatol., 86, 63-68(1986)]. 즉, 엘라스타제의 기질인 Suc-(Ala) 3 NA를 이용하여, NA가 분해되면서 생기는 색의 변화를 흡광도를 이용하여, 엘라스타제의 활성도를 측정하였다. 이때 감초 발효물을 처리하지 않은 군을 음성 대조군으로 사용하였다.

표 8에 나타낸 바와 같이, 감초 발효물은 음성 대조군에 비하여 엘라스타제의 활성을 뛰어나게 억제함을 알 수 있으며, 활성 억제율은 감초 발효물의 농도가 증가할수록 높아짐을 확인하였다. 이를 통하여 감초 발효물이 우수한 노화 방지 및 탄력 증진 효과를 나타냄을 알 수 있다.

시료명	엘라스타제 활성 억제율 (%)
감초 발효물 0.02중량%	40%
감초 발효물 0.01중량%	21%
감초 발효물 0.005중량%	15%
음성 대조군	0%

실시예 11: 티로시나제 활성 억제 실험

티로시나제는 버섯에서 분리 및 정제된 것으로 Sigma 사에서 구입하여 사용하였다. 기질인 L-티로신(Sigma)은 0.05M 인산나트룸 완충용액(pH 6.8)에 용해하여 0.1㎎/㎖ 용액으로 만들어 사용하였다. 감초 발효물은 0.05M 인산나트륨 완충용액(pH 6.8)에 적당한 농도로 조절하여 용해한 후 사용하였다. L-티로신 용액 0.5 ㎖를 시험관에 넣고 여기에 감초 발효물 시료액 0.5㎖을 가하고 37℃ 항온기에서 10분간 방치하였다. 그 후 각 시료액에 200unit/㎖ 티로시나제 0.5㎖를 첨가하고 37℃에서 10분간 반응시켰다. 이 반응액이 든 시험관을 얼음 위에 놓아 급냉시켜 반응을 중지시킨 후 분광광도계로 475nm 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 상기 시료 대신 완충용액 0.5㎖를 넣은 것을 사용하였다.

상기 각 시료의 티로시나아제 활성 저해율은 수학식 3에 따라 계산하였다.

결과는 표 9에 나타냈으며 감초 발효물을 0.02% 처리시 티로시나아제 저해율은 알부틴과 유사한 정도였다.

시료명	티로시나제 저해율(%)
대조군	-
감초 발효물 0.02중량%	61%
감초 발효물 0.01중량%	52%
감초 발효물 0.005중량%	47%
알부틴 0.2중량%	59%

실시예 12: B16F1 멜라닌 세포를 이용한 멜라닌 합성억제 실험

실시예 2에서 수득한 감초 발효물의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라닌 세포에 대한 멜라닌 합성억제 효과를 측정하였다.

B16F1 멜라닌 세포의 멜라닌 합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라닌 세포를 6웰 플레이트에 각 웰당 2 x 10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신-EDTA로 떼어 낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포내 멜라닌의 정량은 로탄[Lotan : Cancer Res., 40, 3345-3350(1980)]의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 완충액(50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 1㎖를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000 rpm, 10분)하여 얻은 세포여액에 1N NaOH(10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라닌 세포의 멜라닌 생성 저해율(%)은 수학식 4에 의하여 계산하였다.

B16F1 멜라닌 세포의 멜라닌 합성 억제효과를 시험한 결과 감초 발효물은 0.02%에서 45%의 멜라닌 생성 억제효과를 나타내어 알부틴과 유사한 생성억제 효과를 나타내었다(표 10).

시료명	멜라닌 합성 저해효과(%)
음성 대조군	-
감초 발효물 0.02중량%	45%
감초 발효물 0.01중량%	37%
감초 발효물 0.005중량%	19%
알부틴 0.2중량%	42%

실시예 13: 염증유발관련 효소(hyaluronidase) 활성 억제효과 측정 실험

실시예 2에서 수득한 감초 발효물의 항염증 효과를 확인하기 위해 염증유발관련 효소인 히아루로니디아제 활성 저해 정도를 시험하였다.

히아루로니디아제(hyaluronidase)는 히아루론산을 가수분해하는 효소로 염증을 유발한다. 본 실시예에서는 이 효소의 활성을 억제하여 항염증효과를 측정하는 방법[Kakegawa Y: Japanese J. of Inflammantion, 4, 437-438(1984)]을 응용해 항염증효과를 판정하였다.

컴프리, 시소, 유용성 감초 추출물, 감초 발효물을 시료로 사용하여 히아루로니디아제 활성 억제 효과를 조사하였다.

각 시료들의 히아루로니디아제에 대한 저해활성은 다음과 같이 행하였다.

시료 100㎕와 히아루로니디아제 용액(type Ⅳ-S, Sigma사, 400U/ml) 50㎕를 넣고 37℃에서 20분간 반응시킨 후, 효소활성화 용액(화합물 48/80 CaCl₂2H₂O, Sigma사, 0.1㎎/㎖) 100㎕를 첨가하고 다시 37℃에서 20분간 반응시킨다. 히아루론산(hyaluronic acid) 용액(0.4㎎/㎖)을 250㎕ 넣고 37℃에서 40분간 반응시키고, 0.4N NaOH 100㎕를 넣어 반응을 종결시킨다. 포타슘보레이트 용액을 100㎕ 첨가하여 95℃에서 3분간 반응시키고 냉각시킨 다음 ρ-디메틸아미노벤즈알데히드 용액을 3㎖ 넣고 다시 20분간 37℃에서 반응시켜 발색시킨다. 585nm에서 흡광도를 측정하여 히아루로니디아제에 대한 저해율을 측정하였다. 히아루로니디아제에 대한 저해율(%)은 수학식 5에 의하여 계산하였으며, IC₅₀값은 히아루로니디아제 효소 활성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

히아루로니디이제 효소 활성 억제 효과를 시험한 결과 감초 발효물의 IC₅₀값은 0.23%로 나타나 히아루로니디아제 저해효과가 뛰어나다고 알려진 기존의 항염증제인 유용성 감초 추출물, 컴프리 추출물, 시소 추출물 등에 비해 우수하거나 유사한 효과를 나타내었다(표 11).

시료	히아루로니디아제 활성 억제효과(IC₅₀)
컴프리 추출물	0.23%
시소 추출물	0.54%
유용성 감초 추출물	0.20%
감초 발효물	0.44%

실시예 14: 자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과

본 실시예는 실시예 2에서 수득한 감초 발효물의 자외선 조사에 의한 세포독성의 완화 효과를 평가하기 위하여 실시되었다. 섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1x10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 10% FBS가 첨가된 것) 1 ㎖을 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 감초 발효물을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500㎕ 배지와 MTT 용액(2.5㎎/㎖) 60㎕를 넣은 후 2시간동안 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 아이소프로판올-HCl(0.04 N)을 500㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565nm 흡광도를 측정하였다. 수학식 6에 의해 세포생존율(%)을 측정하고 자외선에 의한 세포독성 완화율은 수학식 7에 의하여 계산하였다.

실험결과 감초 발효물은 0.02% 농도에서 자외선에 의한 세포독성을 51% 완화하여 자외선에 의한 세포독성을 효과적으로 방어함을 알 수 있었다. 상기 실험을 통해 본 발명의 감초 발효물을 포함한 조성물이 자외선에 의한 세포손상을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 예측할 수 있다(표 12).

시료명	처리농도(%)	세포독성 완화율(%)
감초 발효물	0.02	51
	0.01	45
	0.005	27

실시예 15: 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과

실시예 2에서 수득한 감초 발효물의 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 평가하기 위하여 사람의 표피조직에서 분리한 섬유아세포(Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5X10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500 ㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350 ㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 감초 발효물을 처리한 후 5시간동안 배양하였다. 배양 상층액을 150 ㎕ 취하여 IL-1α를 정량함으로서 감초 발효물의 염증성 사이토카인 발현억제효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소면역분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)을 이용하여 정량화하였으며, IL-1α의 생성율은 수학식 8에 의해 계산하였다.

실험결과 감초 발효물은 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1α의 생성을 0.02% 농도에서 57% 억제하여, 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있다(표 13).

시료명	처리농도(%)	염증성 사이토카인 발현 억제율(%)
감초 발효물 (실시예 2)	0.02	57
	0.01	32.6
	0.005	18

실시예 16: 자외선 조사에 의한 프로스타글란딘 생합성 억제 효과

실시예 2에서 수득한 감초 발효물의 프로스타글란딘 생합성 억제 효과를 평가하기 위하여 사람의 표피 조직에서 분리한 각질형성세포(Keratinocyte)를 24-웰 시험 플레이트에 5x10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하고, 18시간 동안 배양한 다음, 상기 각질형성세포에 최종농도가 50 uM이 되도록 아스피린(aspirin)을 처리하여 각질형성세포에 존재하는 프로스타글란딘 생합성 효소(prostaglandin E₂ synthetase, 또는 cyclooxygenase, 이하 COX) 활성을 제거하였다. 아스피린 처리 2시간 후에 각질형성세포가 들어있는 각 웰을 PBS로 2회 세척하고 각 웰에 100 ㎕의 PBS를 넣었다. 이 각질형성세포에 UVB 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 30 mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 각 웰에 각질형성세포 배양액(keratinocyte growth media, Clonetics, Biowhittacker사, MD, USA) 250 ㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 감초 발효물을 처리한 후 16시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 적당량 취하여 16시간 동안 생합성된 PGE₂(prostaglandin E₂)를 정량함으로서 생약 혼합 추출물의 프로스타글란딘 억제효과를 판단하였다. PGE₂의 양은 효소면역분석법(enzyme immunoassay)을 이용하여 정량화하였으며, 실험 결과 감초 발효물은 자외선에 의한 프로스타글란딘의 생성을 효과적으로 억제함을 알 수 있었다. 특히 생성되는 PGE₂는 주로 COX-2 효소에 의해 만들어지는 것으로 알려져 있으므로 상기 실험을 통해 감초 발효물이 COX-2 효소의 유도작용 또는 활성을 억제함을 알 수 있다(표 14).

시료명	PGE₂ 억제율(%)
(-) UV B	대조군
(+) UV B	-
(+) UV B + 감초 발효물 0.02중량%	61%
(+) UV B + 감초 발효물 0.01중량%	39%
(+) UV B + 감초 발효물 0.005중량%	17%

실시예 17: 여드름균에 대한 항균력 시험

실시예 2에서 수득한 감초 발효물의 여드름균에 대한 항균력을 확인하기 위한 페이퍼 디스크 테스트(Paper Disc Test)를 실시하였다. 먼저, 여드름 발생원인의 피부 상재균인 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes)를 활성화시키기 위하여 BHI 액체배지 (Brain-Heart Infusion Broth;3.7%)에서 48시간 전배양하였다. 이렇게 준비한 균배양액을 BHI 고체배지(Brain-Heart Infusion Broth 3.7%;agar 1.5%)에 0.1㎖씩 도말한 후 건조시켰다. 실시예 2에서 수득한 감초 발효물을 95% 에탄올 수용액에 12%(w/v)로 희석하여 직경 8㎜의 페이퍼 디스크에 50㎕씩 점적한 후 앞서 준비한 고체배지 위에 올려 놓은 후 이것을 35℃ 혐기 배양조에서 3일간 배양하였다. 페이퍼 디스크 주변에 생긴 균 성장 저지 영역을 관찰하고 저지환의 크기를 측정함으로써 항균력을 평가하였다. 그 결과, 감초 발효물의 균 성장 저지환의 크기는 24㎜인 것으로 나타났다.

실시예 18: 화합물 48/80에 의한 아토피 피부염 유발 후 감초 발효물의 항염증 실험

BALB/c 마우스(5wks, male)의 등쪽 목부위 피부의 진피 내로 마리당 30㎕의 화합물 48/80 (Sigma, Co.; 1㎎/㎖ in saline)을 주사한 후 케이지에 집어넣고 60분 동안 마우스가 목을 긁는 행동을 관찰하였다. 감초 발효물의 항염 치료 효능을 검정하기 위하여 화합물 48/80을 주사하기 5일전부터 감초 발효물들을 250㎕/㎖의 농도로 마리 당 100㎕씩 마우스의 등쪽 목 부위에 도포하였다. 도포방법은 5일 동안 하루에 두 번씩 총 10회에 걸쳐 마우스의 등쪽 목 부위에 도포하여 전처리한 다음 화합물 48/80을 주사한 후 총 1시간 동안 5분 간격으로 마우스가 뒷발로 목을 긁는 시간을 측정하여 소양증 정도를 측정하였다.

표 15에서 알 수 있듯이, 감초 발효물을 사용하는 경우 화합물 48/80에 의한 아토피 피부염 (피부 소양증) 유발을 억제하는 효과를 나타내었다.

	긁는 횟수(5분간)
	5	10	15	20	25	30	35	40	45	50	55	60
감초 발효물	23	22	29	31	34	37	42	45	45	24	21	18
음성 대조군	39	44	52	60	82	93	97	71	58	53	41	36

실시예 19: 수분 흡습성 실험

감초 발효물의 수분 흡습성을 실험하기 위하여, 인간으로부터 직접 채취하거나 또는 상업적으로 구입한 사람의 건조 표피세포에 상기 실시예 2의 감초 발효물과 증류수를 각각 포화 흡수시키고 흡수된 물의 양을 측정한 후, 48시간 건조 후의 질량변화를 측정하였다. 각각의 측정된 질량의 변화로부터 피부세포 단위 질량 당 흡수된 물의 양을 비교하였다. 이러한 실험은 표피세포에 흡습되는 물의 양을 비교하기 위한 방법으로 실제 사람의 피부에 있어서도 그 보습효과를 예상할 수 있는 한가지 방법으로 사용되고 있다.

구체적으로, 사람의 표피세포를 건조시켜 단위질량 당 함유된 수분의 양을 일정하게 만든 후, 각각의 표피세포 시료의 무게와 함유된 물의 양을 카이저 방법(Kaiser method)을 사용하여 측정하였다. 물의 함량이 측정된 표피세포를 감초 발효물(A), 정제수(B)에 각각 24시간 담지하여 포화 흡수시켜준 뒤, 세포 내에 물이 포화흡수된 표피세포를 꺼내서 중량을 측정하고, 일부를 채취하여 카이저 수분측정기로 함유되어 있는 단위질량 당 수분의 양을 측정하였다. 이후 다시 48시간 감압건조시키고 중량을 측정한 후, 일부를 채취하여 카이저 방법에 의해 수분량을 측정하여 함유되어 있는 단위질량 당 수분의 양을 측정하였다.

표 16에 나타낸 바와 같이, 감초 발효물로 포화 흡습시킨 표피세포가 정제수에 의하여 포화흡습된 표피세포보다 훨씬 많은 물을 함유하고 있음을 확인할 수 있었으며, 이로부터 감초 발효물의 우수한 피부 흡습성을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 감초 발효물이 우수한 보습 효과를 나타냄을 알 수 있다.

	수분함량
	초기 건조상태	포화상태	건조 후
미세결합수	400	800	540
정제수	400	790	400

실시예 20 및 비교예 1

본 실시예는 실시예 2에서 수득한 감초 발효물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 탄력 개선 효과 및 주름 개선 효과를 비교예 1과 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 17에 나타낸 바와 같다. 우선 표 17에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 20, 비교예 1)을 제조한다. 실험자(20세~35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 20에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

실험완료 후 피부 탄력 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부탄력측정기(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하였다. 실험결과는 표 18에 Cutometer SEM 575의 △R7값으로 기재하였는데 R7값은 피부의 점탄성(viscoelasticity)을 나타낸다. 표 18에서 나타난 바와 같이 감초 발효물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 피부 탄력개선 효과가 우수함을 알 수 있다.

원료		실시예 20	비교예 1
가	스테아릴 알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부 가)알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산 아스테르	2	2
나	감초 발효물	1	-
	프로필렌글리콜	5	5
	정제수	잔량	잔량

주)단위: 중량%

실험제품	피부탄력효과(△R7)
실시예 20	0.23
비교예 1	0.14

n=20, p＜0.05

실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 20에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

실험완료 후 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부의 주름개선효과를 알아보기 위하여 실리콘 재질의 모사판(replica)을 제작하여 지정 부위의 주름의 상태를 화상분석기인 비지오미터(visiometer: SV60, C+K Electronic Co., Germany)로 측정하였다. 그 결과를 하기 표 19에서 나타내었으며, 이 결과는 2개월 후의 각각의 파라미터(parameter)값에서 2개월 전 파라미터 값을 뺀 것의 평균을 나타낸 것이다. 즉, 이 값이 음수로 나올수록 주름 개선 효과가 높다는 것을 의미한다. 따라서 표 19와 같이, 감초 발효물을 함유한 실시예 20의 피부 주름 개선 효과가 현저함을 확인할 수 있었다.

실험제품	R1	R2	R3	R4	R5
실시예 20	-0.21	-0.16	-0.13	-0.09	-0.06
비교예 1	-0.13	-0.07	-0.05	-0.05	-0.02
R1: 주름 등고선의 최고치와 최저치의 차이값 R2: 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값 들의 평균 R3: 5개씩 나눈 R1값 중 최고치 R4: 주름 등고선의 기선(baseline)에서 각각의 꼭대기와 계곡의 값을 뺀 평균값 R5: 주름 등고선의 기선에서 각각의 주름 윤곽을 뺀 값의 평균값

실시예 21: 감초 발효물 함유 화장료 조성물의 미백효과 비교실험

실시예 21의 감초 발효물을 함유한 화장료와 비교예 1의 화장료에 대하여 사람을 대상으로 피부 미백효과 비교실험을 행하여 평가하였다.

실험자 (20세~35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 20의 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1의 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 시험 완료 후 얼굴 좌우 양편의 도포 부위 피부를 화상분석기 및 크로마메타(Minolta CR300)를 이용하여 색의 밝기변화(ΔL)를 측정하고, 복수의 숙련자에 의한 객관적 육안 관찰과 피검자에 의한 주관적 육안관찰을 실시하여 하기 등급 분류에 따라 효과를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 20에 나타내었다. 이때 미백효능 정도를 다음의 7등급으로 분류하여 평가하였다.

?미백효능 평가 기준 :

-3: 매우 악화-2: 악화-1: 약간 악화0: 변화 없음

1: 약간 개선 2: 개선 3: 매우 개선

표 21에서 나타낸 바와 같이 감초 발효물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 피부에서 미백효과가 우수함을 알 수 있다.

	피부색의 밝기 변화(ΔL)		숙련자의 객관적 평가		피검자의 주관적 평가
	실시예 21	비교예 2	실시예 21	비교예 2	실시예 21	비교예 2
평균값	4.51	1.87	3.4	2.3	2.4	1.2

실시예 22: 감초 발효물 함유 화장료 조성물의 피부염 개선효과 비교실험

실시예 20의 감초 발효물을 함유한 화장료와 비교예 1의 화장료에 대하여 사람을 대상으로 아토피성 피부염 개선효과 비교실험을 행하여 평가하였다.

아토피 피부 개선효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 임상실험을 실시하였다. 5~30세의 아토피 환자로서, 2년 이상 아토피성 피부염을 앓고 있는 환자 30명에 대하여 아토피성 피부염 개선효과를 조사하였다. 동일인에게 왼쪽 손에는 실시예 22의 크림을, 오른쪽 손에는 비교예 3의 크림을 매일 저녁 세정 후, 피부에 1일 1회 60일간 도포하고 아토피성 피부염 상태 개선 정도를 측정하였다. 측정은 설문조사에 의한 관능평가로 실시하였다. 그 결과는 하기 표 21에 나타내었다.

표 21에 나타난 바와 같이 감초 발효물을 첨가하여 제조한 실시예 20의 크림이 상기 추출물이 첨가되지 않은 비교예 1의 화장료보다 우수한 아토피성 피부개선 효과가 있다는 것을 알 수 있다.

	매우 좋다	좋다	그저 그렇다
실시예 22	72%(21명)	28%(9명)	0%
비교예 3	12% (3명)	19% (6명)	69% (21명)

실시예 23: SLS에 의한 피부자극 완화 효과

실시예 2에서 수득한 감초 발효물을 함유한 화장료의 자극 완화 효과를 인체 첩포 실험으로 평가하였다.

일반적 화장품 처방(크림, 로션, 스킨, 에센스)에 자극을 일으키는 SLS(sodium lauryl sulfate) 1%와 실시예 20에서 제조된 제품을 혼용하여 24시간, 48시간, 72시간 동안 첩포하여 자극 유발지수를 바탕으로 자극완화 효과를 평가한 것이다.

20~50세의 건강한 남녀 50명의 팔 상박 부위에 FINN CHAMBER(FINLAND)를 이용하여 각각의 제품을 0.3mg씩 첩포하고, 24시간 후 급성 자극 지수를 평가하였다. 평가 후 재차 동일한 부위에 동량의 제품을 첩포하고 48시간 및 72시간 후의 지연성 자극 지수를 평가하였다.

시험 결과 SLS를 단독으로 첩포한 부분은 24시간 후부터 피부에 붉게 자극이 나타났으나, 감초 발효물을 함유하는 제품을 첩포하고 24시간, 48시간, 72시간 경과 후에도 아무런 피부 발작을 일으키지 않았다.

이 평가 결과는 감초 발효물이 화장료에 혼용되었을 때 자극을 유발시키는 기재(계면 활성제, 향, 알콜)에 의한 피부 자극을 감소시킬 수 있는 유의한 효과가 있음을 나타내었다.

이하에 그 외의 실시예를 나타내었다. 즉, 실시예 2에서 수득한 감초 발효물을 함유한 화장수, 유액 및 미용액을 실시예 24 내지 26에서 제조하였다. 이들 감초 발효물을 함유한 화장수, 유액 및 미용액은 항산화 효과, 콜라겐 합성 촉진 효과, 피부 잔주름 개선 효과, 미백효과, 보습효과, 피부자극 완화효과, 여드름 방지효과, 아토피 개선효과 및 항염효과등 피부개선에 우수한 효과를 나타내었다.

실시예 24: 감초 발효물을 함유한 화장수의 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합, 용해한다. 실시예 2에서 수득한 감초 발효물 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 피부개선효과가 있는 화장수를 얻었다.

실시예 25: 감초 발효물을 함유한 유액의 제조

세틸알콜 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70℃에서 가열, 혼합, 용해하고, 실시예 2에서 수득한 감초 발효물 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열해서 용해시킨다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형의 피부개선효과가 있는 유액을 얻었다.

실시예 26: 감초 발효물을 함유한 미용액의 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히야론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 실시예 2에서 수득한 감초 발효물 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 피부개선효과가 있는 미용액을 얻었다.

Claims

감초 추출물을 잎새버섯(Grifola frondosa KCTC 10337BP) 균사체 또는 잎새버섯(Grifola frondosa KCTC 10337BP) 배양액에 부가하여 발효시켜 얻은 감초 발효물을 조성물 전체에 대해서 0.001 ~ 30.0 중량% 함유하는 것을 특징으로 하는, 리퀴리티게닌 및 아이소리퀴리티게닌 함량이 증가된 감초 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부외용제 조성물.
제1항에 있어서,
상기 피부외용제 조성물은 노화 방지 효과를 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 피부외용제 조성물은 미백효과를 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 피부외용제 조성물은 자극완화 기능을 지니는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 피부외용제 조성물은 아토피 피부 개선 효과를 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 피부외용제 조성물은 여드름 예방 효과를 특징으로 하는 조성물.