KR20220092199A - 발효감초추출물을 유효성분으로 함유하는 미백 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 발효감초추출물을 유효성분으로 함유하는 미백 조성물에 관한 것이다. 상기 발효감초추출물은 감초분말 액상에 아스페르질루스 니게르(Aspergillus niger)에서 분리된 펙티나아제 효소를 첨가하여 발효시킨 발효물인 것을 특징으로 한다.

Description

발효감초추출물을 유효성분으로 함유하는 미백 조성물{Composition comprising fermented Glycyrrhiza uralensis extract for inhibitory effects on melanogenesis of B16F10 cells}

본 발명은 발효감초추출물을 유효성분으로 함유하는 미백 조성물에 관한 것이다. 상기 발효감초추출물은 감초분말 액상에 아스페르질루스 니게르(Aspergillus niger)에서 분리된 펙티나아제 효소를 첨가하여 발효시킨 발효물인 것을 특징으로 한다.

피부의 색은 표피에 존재하는 멜라닌(melanin) 색소량과 분포로 결정되며, 이 외에 진피의 혈관 속에 함유된 헤모글로빈과 피하조직의 카로틴과 같은 색소의 양, 피부 두께, 혈액의 혈류량의 영향을 받는다.

일반적으로 멜라닌은 자외선으로 인한 노화로부터 피부를 보호하는 역할을 하나 이의 과잉생산은 색소 침착으로 인한 기미, 주근깨, 피부암 등의 피부 질환을 유발하고 상대적으로 멜라닌이 부족할 경우에는 저색소 침착증을 유발하게 된다.

일차적으로 자외선은 피부 최외각 층에 존재하는 각질형성세포를 자극시켜 melanin 형성세포 자극 호르몬인 α-melanocyte stimulating hormone(α-MSH)의 합성을 유발해 세포 외부로 분비시키며 분비된 호르몬은 melanin형성세포를 활성화시켜 melanin 합성을 유발하게 된다.

세포외부로 분비된 α-MSH는 melanin 세포 표면에 위치하는 melanocortin 1 receptor(MC1R)에 결합하여 일차적으로 Gs단백질을 활성화시키고, 이차적으로 adenylate cyclase를 활성화시켜 이에 세포 내의 cAMP를 증가시키게 된다. 합성된 cAMP에 의해 순차적으로 protein kinase A (PKA: cAMP dependent protein kinase)가 활성화되고, 활성화 된 PKA는 핵안으로 이동하여 CREB을 활성화시킨다.

인산화 과정을 통해 활성화된 CREB는 L-tyrosine을 melanin으로 변환시키는 효소들의 mRNA발현을 조절하는 핵심 전사인자인 microphthalmia assaociated transcription factor(MITF)의 발현을 촉진한다.

L-tyrosine은 tyrosinase 효소 촉매반응을 통해 L-DOPA로 변화되며, L-DOPA는 tyrosinase-related protein 1(TRP-1), tyrosinase-related protein 2(TRP-2)에 의해서 최종 melanin으로 전환된다.

Melanin 생성을 조절하기 위하여 MITF가 중요한 역할을 한다는 것이 알려지면서 이의 조절에 관여하는 신호전달 경로들이 관심을 받고 있다. 따라서 개발되는 성분들에 대한 간접적인 melanin 합성 억제능과 MITF발현 관계에 대한 연구가 절대적으로 필요하다.

선행기술문헌을 살펴보면, 대한민국 등록특허공보 10-1072133 "피부 미백 효능을 상승시키는 화장료 조성물"에는 감초추출물, 홍삼추출물, 자작나무추출물, 파파인 효소를 함유한 화장료 조성물이 기재되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허공보 10-2018-0106155 "천연 혼합물의 발효물질을 포함하는 미백 및 보습기능성 조성물"에는 승마, 진피, 감초, 치자 및 오배자 혼합물의 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물이 기재되어 있다.

상기 문헌들은 감초를 미백 조성물에 활용하였다는 점에서 본 발명과 일부 유사점이 있으나 본 발명은 감초를 단독으로 발효하고 실험적으로 미백 효과를 검증하였다는 점에서 차별성이 있다고 하겠다.

대한민국 등록특허공보 10-1072133 (2011.10.04 등록) 대한민국 공개특허공보 10-2018-0106155 (2018.10.01 공개)

본 발명은 발효감초추출물을 이용하여 멜라닌 형성을 억제함으로써 미백 기능성을 보유하는 조성물을 제공하는 것을 기술적 과제로 한다.

본 발명은, 감초분말 액상에 아스페르질루스 니게르(Aspergillus niger)에서 분리된 펙티나아제 효소를 첨가하여 발효시킨 발효물을 유효성분으로 함유하는 미백 조성물을 제공하여 기술적 과제를 해결하고자 한다.

상기에서, 감초분말 액상은 감초분말의 수용액, 감초분말의 열수추출물 또는 감초분말의 에탄올 추출물 중 하나인 것을 특징으로 한다.

상기에서, 상기 조성물에 포함된 발효물의 농도는, B16F10 멜라노마 세포 1Х10⁴ cells/well 기준으로 2~64 ul/mL 인 것을 특징으로 한다.

상기에서, 펙티나아제 효소의 농도는 1~5%(w/w)인 것을 특징으로 한다.

본 발명은, 감초분말 액상에 아스페르질루스 니게르(Aspergillus niger)에서 분리된 펙티나아제 효소를 첨가하여 발효시킨 발효물을 유효성분으로 함유하는 미백 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르는 조성물에 포함된 유효성분인 발효감초추출물은 2 μl/mL 농도에서부터 20%이상 시험관내 tyrosinase가 억제시키는 효과를 보유한다.

또한, 세포 내 티로시네이즈 실험에서는 낮은 농도에서부터 20%이상 활성 억제를 보였으며, 32 μl/mL에서부터 는 40%이상 활성 억제를 나타내는 효과를 보유한다.

또한, 2 μL/mL농도에부터 20%이상의 멜라닌 합성 억제를 나타내는 효과를 보유한다.

또한, MITF의 발현을 조절하여 tyrosinase와 TRP-1의 단백질 발현을 감소시킴으로써 melanin합성을 저해하는 효과를 보유한다.

또한, α-MSH를 처리하였을 때 ERK와 JNK의 단백질 발현이 농도의존적으로 증가되었으며, pCREB의 발현이 농도의존적으로 억제시키는 효과를 보유한다.

또한, α-MSH로 melanin 형성을 유도시킨 후 시료를 처리했을 때 농도의존적으로 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 그리고 MITF인자들의 mRNA 발현을 억제시키는 효과를 보유한다.

도 1은 감초추출물(GUE)과 발효감초추출물 (FGUE)의 세포독성 실험 결과 그래프이다.
도 2는 감초추출물(GUE)과 발효감초추출물 (FGUE)의 시험관내 티로시네이즈 활성 억제효과 실험 결과 그래프이다.
도 3은 감초추출물(GUE)과 발효감초추출물 (FGUE)의 세포내 Tyrosinase 활성 억제효과 실험 결과 그래프이다.
도 4a, 4b는 감초추출물(GUE)과 발효감초추출물 (FGUE)의 멜라닌 합성 억제효과 실험 결과 사진(4a) 및 그래프(4b)이다.
도 5는 감초추출물(GUE)과 발효감초추출물 (FGUE)의 Melanin 합성 관련 인자들의 단백질 발현 변화 실험 결과를 나타낸다.
도 6은 감초추출물(GUE)과 발효감초추출물 (FGUE)의 Melanin 합성 관련 인자 MAPKs 단백질 발현 변화 실험 결과를 나타낸다.
도 7은 감초추출물(GUE)과 발효감초추출물 (FGUE)의 mRNA수준에서의 melanin 합성 관련 인자의 변화 실험 결과 그래프이다.
도 8은 발효 효과를 검증하기 위한 HPLC 성분 분석 결과 표이다.

본 발명의 특징과 장점은 첨부된 도면에 의하여 설명되는 실시예에 의하여 보다 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 실시예에 기재되거나 도면에 도시된 구성요소들의 구성 및 배열에 의해 본 발명의 응용이 제한되는 것이 아니다. 본 발명은 다른 실시예 들로 구현될 수 있고, 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 또한 장치 또는 요소의 방향 등과 같은 용어들에 관하여 실시예에 사용된 표현 및 술어는 단지 본 발명의 설명을 단순화하기 위해 사용되며, 관련된 장치 또는 요소가 단순히 특정 방향을 가져야 함을 나타내거나 의미하지 않는다. 예를 들면, "제1", "제2"와 같은 용어가 본 발명을 설명하는 실시예와 청구항에 사용되는 경우, 이러한 용어가 상대적인 중요성 또는 취지를 나타내거나 의미하는 것으로 의도되지 않는다.

또한, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정하여 해석되어서는 아니되며, 발명자가 발명의 용어와 개념을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념에 입각하여 기재한 것으로 해석하여야 한다.

따라서, 본 발명은 제시되는 실시예에 한정되지 않으며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 특허청구범위에 기재된 기술사상의 균등한 범위 내에서 다양한 수정 및 변경이 가능하다.

본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 바람직한 실시예를 중심으로 기술되었지만 당업자라면 이러한 기재로부터 기술적 범주를 벗어남이 없이 다양한 변형이 가능하다는 것은 명백하다. 따라서 본 발명의 범주는 이러한 많은 변형예 들을 포함할 수 있다.

감초(Glycyrrhizae Radix, Licorice, Glycrrhiza)는 학명(scientific name)이 Glycyrrhizae uralensis Fisch Et, D.C로 알려져 있고, 콩과(Leguminosae)류에 속하는 다년생 초본으로 Glycyrrhizae uralensis Fisch., Glycyrrhizae inlata Bat., Glycyrrhizae glabra L. 등이 있다. 감초는 주로 소염성궤양, C형간염 및 폐, 피부질환의 치료를 위해 사용되어왔으며, 항염증, 항바이러스, 항균, 항산화, 항암활성, 면역조절, 간보호 및 심장 보호효과를 가지는 것으로 알려져 있다.

감초의 주요 활성 성분으로는 glycyrrhizin을 대표적 성분으로 하는 triterpenoid계 saponin과 saponin이 가수분해에 의해 생기는 glabric acid, gabrolide 등의 saponin이 있으며, flavonoid류로서 flavonoid배당체인 liquiritin, 이에 대응하는 chalcone배당체인 isoliquiritin 및 그 aglycone체들이 있다.

flavon류로서 licoflavone, isoflavon류로서 licoricone, isoflavan류로서 licoricidin, coumestan류로서 glycyrol, isoglycyrol등과 이외에 coumarin, 계피산유도체, 아미노산, 당류 등이 보고되어 있다.

그 중에서도 감초의 dermatological과 관련된 연구에 따르면 감초의 주요성분 중 licuraside, isoliquiritin, licochalcone A, glabridin과 같은 flavonoid계 성분들이 tyrosinase를 억제함으로써 depigmenting agents로써의 잠재력을 가지고 있는 것으로 알려져 있다.

발효를 통해 감초를 효과적으로 활용하기 위한 연구는 지금까지 다양하게 이루어져 왔으며, 대표적으로 잎새버섯 HB0071 균사체 발효배양을 통한 플라보노이드 생성과 항염 활성에 관한 연구, 동충하초균주로 발효한 감초의 주요성분 함량변화 및 NO생성 억제에 관한 연구, 식물 유래 조효소에 의한 감초 liquiritin의 liquiritigenin의 함량변화, 수치에 의한 감초 중 glycyrrhizin의 변화, 누룩을 이용한 발효로부터 감초의 liquiritin의 liquiritigenin으로의 생물전환에 관한 연구, 발효법제에 의한 감초의 Flavonoid 무배당체의 생산 등이 있다.

본 발명은 감초의 생리활성을 증대시키기 위하여 아스페르질루스 니게르( Aspergillus niger )에서 분리된 펙티나아제(crude pectinase) 효소로 감초를 발효시킨 후 High performance liquid chromatography를 이용하여 발효 전후 감초 내 주요 성분 변화를 확인하고, 발효감초추출물 (FGUE)의 미백 효과를 위한 tyrosinase 저해활성 및 melanin생성 억제메커니즘의 분자수준에서 규명하였다.

실시예 1. 발효감초추출물을 유효성분으로 함유하는 미백 조성물

본 발명에 따르는 발효감초추출물의 제조방법은 다음과 같다.

1단계 : 자연 건조한 후 분말화

2단계 : 감초분말의 5%(w/w) 수용액에 농도 1~5%(w/w)의 펙티네이즈 효소(Aspergillus niger에서 분리된 crude pectinase) 를 첨가한 후 pH 4.5으로 조절한 후 55℃에서 150rpm에서 1~3시간동안 진탕배양

3단계 : 원심분리하여 상층액을 확보

설계조건에 따라서, 감초분말 수용액의 농도는 변경될 수 있고, 또한 감초분말 수용액을 감초 분말의 열수 추출물 또는 감초 분말의 에탄올 추출물로 변경할 수 있다.

본 발명에 따르는 조성물에서 발효감초추출물의 농도는, B16F10 멜라노마 세포 1Х10⁴ cells/well 기준으로 2~64 ul/mL 포함되도록 한다.

본 발명은 상기 발효감초추출물을 유효성분으로 포함하고 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제 등을 추가하여 약제학적 단위 투여형으로 제형화 된 면역증강 및 항염증 질환의 예방 및 치료제를 제공할 수 있다. 여기에서, 담체, 부형제, 희석제로는 토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

또한 상기 약제학적 투여 형태는 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 또한 상기 유효성분을 제제화 할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면 활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 또한 상기 약제학적 투여 형태는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제, 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 경구 투여를 위한 고형 제제에는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분은 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 상기 비 수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 연령, 성별, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 0.001 내지 300 mg/kg으로 투여하는 것이 좋고, 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 유효성분에 식품 보조 첨가제를 추가하여 멜라닌 형성을 억제하는 미백 건강기능식품 조성물을 제공할 수 있다.

상기 유효성분을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

식품 또는 음료 중의 상기 유효성분의 양은 전체 식품 또는 음료 중량의 0.01 내지 20 중량% 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ml를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 상기 추출물을 함유하는 외의 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외에 향미제로써 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

그 밖에 본 발명의 추출물들은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한 본 발명의 유효성분을 포함하는 미백 화장료 조성물로도 제공 가능하다.

실험예 1. 실험 준비 및 방법

1. 시료 추출

감초는 전라북도 진안군에서 공급받아 세척 후 자연 건조한 후 분말화하였다. 분말화된 감초 5%에 Aspergillus niger에서 분리된 crude pectinase 1.25%를 첨가한 후 pH 4.5으로 조절한 후 55℃에서 150rpm에서 1~3시간동안 진탕배양한 후 원심분리하여 상층액을 확보하였다.

발효하지 않은 감초 (GUE)도 상기 방법과 같이 추출하여 발효감초추출물 (FGUE)의 대조군으로 사용하였다.

이러한 발효추출물은 불활성화 시킨 후 동결 건조하여 -20℃에서 보관하며 시료로 사용하였다.

2. 시약

Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM), fetal bovine serum (FBS)은 Gibco (NY, USA)사 제품을, tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF는 Santa Cruz(CA, USA)사 제품을, MAPKs, pCREB, pMEK, anti-Goat, anti-Rabbit, anti-Mouse IgG HRP conjugate antibody는 cell signaling (CA, USA)사 제품을, hybond-ECL nitrocellulose membrane는 Amersham Biosciences(Buckinghanshire, England)사 제품을, western blotting detection reagent는 iNtRON(seongnam, korea)사 제품을, non-fat skim milk는 Becton(Le Pont de Claix, France)사 제품을, dimethylsulfoxide(DMSO), phosphatase inhibitor and protase inhibitor cocktail, N,N,N',N'tetrametylethylenediamine (TEMED), thiazolyl blue tetrazolium bromide(MTT), L-3,4-dihydroxyphenyl alanine(L-DOPA)은 Sigma사 제품을, 단백질 정량 시약 (Bicinchoninic acid (BCA) kit) 은 Pierce (Rockford, IL, USA)사 제품을 사용하였다.

3. 세포주 배양

B16F10 세포(멜라노마 세포)는 5% fetal bovine serum(FBS)과 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 0.25 μg/mL amphotericin B를 첨가한 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)을 사용하여 37℃5% CO2에서 배양하였다.

4. 세포 생존율 측정

세포생존율 측정은 96-well 배양 용기에 B16F10 세포를 1×10⁴/mL개씩 분주하고 24시간 배양 후 GUE와 FGUE를 여러 농도로 처리한 다음 37℃5% CO₂ 배양기에서 24~48시간동안 배양하였다. 배양 후 최종 농도 0.5 mg/mL로 MTT 용액을 처리한 후 3시간 동안 배양한 다음 상층액을 제거하고, 형성된 formazan을 DMSO로 녹여서 ELISA reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

5. 시험관 내 tyrosinase 활성 억제율 측정

Tyrosinase 활성 억제에 미치는 효과는 농도 10 mM L-DOPA 용액 0.2 mL와 0.175 M sodium phosphate buffer (SPB, pH 6.5) 0.5 mL를 더하고 buffer에 녹인 시료를 다양한 농도 0.1 mL를 가한 후 mushroom tyrosinase (110 unit/mL) 0.2 mL를 첨가하여 37.0℃ 에서 15 분간 처리하였다. 이후 microplate reader를 이용하여 475 ㎚의 filter에서 흡광도를 측정하고, tyrosinase 활성 억제율은 다음과 같이 계산하였다.

Tyrosinase inhibition(%) = 〔1-{(B-C)/(A-D)}]×100

A : 효소만 첨가된 반응 용액

B : 효소와 시료가 모두 첨가된 반응 용액

C : 시료만 첨가된 반응 용액

D : 효소와 시료가 모두 첨가되지 않은 반응 용액

6. 세포내 Tyrosinase 활성 측정

세포내 tyrosinase 활성은 6-well 배양용기에 B16F10 세포를 1×10 ⁴ /mL 개씩 분주하여 24시간 배양한 후, GUE와 FGUE를 농도별로 처리한 용기에 α-MSH (200nM)를 처리하여 1~3일간 배양한 후 PBS로 2회 세척하고, 5 mM EDTA가 포함된 0.1 M sodium phosphate buffer (SPB, pH 6.8) 1 mL에 1%(V/V) Triton X-100과 0.1%(V/V)의 0.1 M PMSF가 혼합된 lysis buffer를 200 μL씩 분주하고 세포를 수거하여 얼음에서 30분간 방치후 4℃15,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 얻은 상층액을 tyrosinase 활성 측정에 사용하였다.

단백질 정량은 BCA 시약으로 575 nm에서 흡광도를 측정하여 동량의 단백질 양을 계산하였으며, 계산된 단백질과 0.1 M SPB의 총량이 150 μL가 되도록 분주 하고 0.1%(W/V) L-DOPA를 50 μL씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응시켰으며, 30분 간격으로 475 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다.

7. 멜라닌 생합성율 측정

멜라닌 생성 측정은 B16F10 세포주를 배양하여 각 well당 24 well plate에 1Х10 ⁴ cells/well의 농도로 분주하고, 37℃, 5% CO₂ incubator에서 부착 및 안정화를 위해 24시간 배양하였다. 그 후 GUE와 FGUE를 농도별로 처리한 세포에 α-MSH (200nM) 를 첨가한 후37℃, 5% CO₂ incubator에서 1~3일간 배양하였다. 배양한 후 PBS로 각 well을 세척하고, 1 N NaOH 용액 400 ㎕을 첨가하여 1 시간 동안 80℃에서 용해한 후, 475 ㎚에서 Microplate Reader를 사용하여 측정하였다.

8. Western blot 분석

배양된 세포를 모두 수거하여 lysis buffer (1Х RIPA buffer 1 mL, 100Х phosphatase inhibitor and protase inhibitor cocktail 10μL)로 30분간 용해시킨 후, 13,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 상층액을 취하였다. 단백질은 BCA 시약을 이용하여 정량하였고, 40μg/μL 단백질을 10-12% SDS polyacrylamide gel에서 전기영동 하였다. Polyvinylidene fluoride (PVDF)로 전이시키고 5% non-fat skim milk로blocking 시킨 후, tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF, CREB, p-CREB, ERK, pERK, JNK, pJNK, p38, pp38 antibody를 1:500으로 희석하여 각각 냉장에서 하루밤 동안 반응시켰다. TBST로 3회 세척한 후, 2차 antibody를 1:2000으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. TBST로 세척한 후 ECL 용액으로 발색후 ChemiDoc을 이용하여 band의 사진을 촬영하였다.

9. Real time-reverse transcription-polymerase chain reaction

Total RNA 분리는 시료가 처리된 세포를 PBS로 세척한 후, 800 μL TRIZOL reagent처리하여 cell을 용해시켰다. 용해된 세포 용약에 200μL 의 chloroform을 첨가하고 15 초간 vortexing한 후 4.0℃, 13,000 rpm에서 5분간 원심분리한다. 상층액만 분리한 다음 500μL의 isopropanol을 첨가하여 실온 상태에서 5분간 보관 후, 4.0℃, 13,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리에 의해 생성된 pellet에 70% cold ethanol과 DEPC-treated water(Biosolution, Korea)를 넣고 4.0℃, 13,000rpm에서 5 분간 원심분리 후 pellet만 남기고 모두 제거하였다. Pellet에 남은 ethanol은 실온에서 건조시킨 후, RNA의 순도 농도는 DEPC-treated water에 녹여 biophotometer (Eppendorf, Germany)에서 260 ㎚에서 OD260 값을 읽어 정량하였다. Total RNA는 사용시까지 -20.0℃에서 보관하였다.

시료가 처리된 세포를 PBS로 1 회 세척한 후 TRI reagent (TRIZol)를 이용하여 세포를 깨서 모은 후 CHCl3를 첨가하여 10 초간 vortexing 하였다. 10 분간 상온에서 방치하고 12,000 rpm 4°C 15 분 원심분리 후 가장 위 층에 분리되어 있는 투명한 RNA 층을 추출하여 isopropyl alcohol을 이용하여 침전시켰다. RNA 침전물을 70% 에탄올로 세척한 후 공기 중에서 완전히 건조시키고 nuclease-free water를 이용하여 RNA pellet을 현탁 시켰다. RNA의 용해를 높이기 위해 55°C에서 10 분간 가열하고, 70°C에서 5 분간 가열하여 RNA가 single strand 상태로 존재하게 하였다.

그 후 재빨리 얼음에서 식히고 total RNA를 nano drop을 이용하여 정량 후 1 μg/μL로 희석하여 avian myeloblastosis virus (AMV) reverse transcriptase과 oligo(dT)15 primer를 이용하여 역전사하여 cDNA를 만들었다. cDNA 5 μL에 Table 3의 primer, probe를 각각 0.5 μL넣은 후 최종 부피를 20μL로 한 다음 PCR 반응으로 생성되는 형광 강도를 측정하였다. 첫 cycle이 시작되기 전 cDNA를 single strand 상태로 만들어 주기 위해 95°C에서 5 분을 방치 후 95°C에서 20 초간 denaturation, 56°C에서 20초간 annealing, 72°C에서 30 초간 elongation을 40 cycle 반복하였다. cycle 종료 후 95°C에서 1 분, 55°C에서 1 분, 30°C에서 1 분으로 생성된 strand를 extension 하는 과정을 거친 후 실험을 완료하였다. 각 well의 증폭된 target gene의 양이 역치에 도달하였을 때의 cycle값을 Threshold Cycle (CT)로 나타내며, 각 시료에서의 CT 값을 MJ Opticon Monitor software를 이용하여 분석하였다. 각 시료의 평균 CT를 시료에 대응하는 β-actin의 평균 CT로 나눠 표준화 한 다음 (△ CT), 각 시료의 △ CT 를 대조군의 △ CT으로 나눠 (△△ CT) 상대적인 유전자 발현 정도를 2- △△ CT method를 이용하여 구하였다.

10. HPLC를 통한 감초 발효 추출물의 성분 분석

감초의 발효 전 후 주요 지표성분의 변화를 확인하기 위해 High performance liquid chromatography를 통해 함량을 분석하였다. 감초의 주요 지표성분인 Liquiritin, Isoliquiritin, Isoliquiritigenin, Glycyrrhizic acid, Licochalcone A 및 Glabridin의 정량분석을 위해 0.45μm syringe filter(Millipore, USA)로 여과하였다. 본 실험에서 사용한 HPLC는 Waters 1525이다. 분석조건은 표 1과 같이 칼럼은 역상(reverse phase)칼럼인 Cadenza-CL C18(4.6ⅹ3μm), UV detector(254nm)를 사용하였다. 이동상은 A:1% acetic acid, B:acetonitrile을 사용하였고 유속은 0.8ml/min로 하였다. 준비된 샘플은 5μL씩 주입하여 분석하였다.

Detector	UV 254nm
Column	Cadenza-CL C18(4.6x100mm, 3um)
Mobile phase	A: 1% acetic acid, B: acetonitrile
Analytical condition	0-1min(80-20), 1-37min(20-80)
Flow rate	0.8mL/min
Injection	5uL

11. 통계처리

실험 결과는 student's t-test를 이용하여 p-value를 구하였으며, p<0.05인 경우 *, p<0.01인 경우 **로 유의성이 있다고 표시하였다.

실험예 1. 세포독성 검사

발효하지 않은 감초 (GUE)와 발효감초추출물 (FGUE)이 B16F10 세포에 미치는 생존율을 조사하기 위하여 128 μl/mL농도까지 처리하여 세포 생존율을 측정하였다. 미백 성분으로 활용되는 알부틴도 동일한 방법으로 측정하였다. 이하 실험예들에서도 각 실험예의 방법대로 알부틴을 실험하여 그 결과를 함께 제시하였다.

도 1은 감초추출물(GUE)과 발효감초추출물 (FGUE)의 세포독성 실험 결과 그래프이다. 실험 결과, FGUE에서는 64 μl/mL 농도까지는 독성이 없는 것으로 확인되었으며, GUE에서는 128 μl/mL 농도에서도 독성이 나타나지 않았다.

실험예 2. 시험관 내 tyrosinase 활성 억제효과

발효하지 않은 감초 (GUE)와 발효감초추출물 (FGUE)에서의 시험관내 Tyrosinase 활성 억제를 확인하였다.

도 2는 감초추출물(GUE)과 발효감초추출물 (FGUE)의 시험관내 티로시네이즈 활성 억제 효과 실험 결과 그래프이다. 실험 결과, FGUE에서 2 μl/mL 농도에서부터 20%이상 tyrosinase가 억제되는 것을 확인하였으며, 농도의존적으로 억제율이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, GUE에서도 농도의존적으로 억제율이 증가하는 것을 확인하였으며, arbutin처리시에도 16mM농도에서 50%가까이 억제율을 나타내었다.

실험예 3. 세포내 Tyrosinase 활성 억제효과

발효하지 않은 감초 (GUE)와 발효감초추출물 (FGUE)의 세포내 tyrosinase 활성을 확인하였다.

도 3은 감초추출물(GUE)과 발효감초추출물 (FGUE)의 세포내 Tyrosinase 활성 억제효과 실험 결과 그래프이다. 실험결과, FGUE에서 낮은 농도에서부터 20%이상 활성 억제를 보였으며, 32 μl/mL에서부터 는 40%이상 활성 억제를 나타내었다.

GUE와 FGUE의 억제효과를 비교한 결과, FGUE에서 tyrosinase 활성억제가 더 높게 나타나는 것을 확인하였다.

실험예 4. 멜라닌 합성 억제 효과

세포내의 멜라닌 합성양의 변화를 측정하기 위하여 α-MSH로 멜라닌 합성을 유도한 후 GUE와 FGUE를 농도별로 처리하고 3일간 배양 후 세포를 수집한 다음 세포를 용해하여 멜라닌 합성양의 변화를 측정하였다.

도 4a, 4b는 감초추출물(GUE)과 발효감초추출물 (FGUE)의 멜라닌 합성 억제효과 실험 결과 사진(4a) 및 그래프(4b)이다. 실험결과, GUE와 FGUE 그리고 arbutin 모두에서 농도의존적으로 멜라닌 합성이 억제되는 것을 확인하였으며, 특히 FGUE 2 μL/mL농도에부터 20%이상의 멜라닌 합성 억제를 나타내었으며, GUE보다 FGUE에서 더 높은 억제 효과를 나타내었다 (도 4b). 멜라닌색소 침착을 육안으로 관찰한 결과 또한 확실한 색의 변화를 보였다(도 4a).

실험예 5. Melanin 합성 관련 인자들의 단백질 발현 변화

Melanin 합성은 매우 다양한 신호전달 체계를 가지며 많은 신호 전달 물질이 관여하고 있다. 그 중 대표적인 melanin 생성 주 효소인 tyrosinase, TRP-1, TRP-2와 melanin 생합성에 필요한 효소 활성을 촉진시키며, melanin 합성 과정 중 중요한 기능을 수행하는 전사인자인 MITF의 발현 정도를 mouse melanoma B16F10 cell을 이용해 측정하였다.

도 5는 감초추출물(GUE)과 발효감초추출물 (FGUE)의 Melanin 합성 관련 인자들의 단백질 발현 변화 실험 결과를 나타낸다. 실험결과, GUE와 FGUE에서 MITF, tyrosinase, TRP-1 인자들의 발현을 측정한 결과 농도의존적으로 단백질 발현이 억제된 것을 확인 할 수 있었다.

Melanin 합성 과정에서 TRP-2는 dopachrome을 carboxylated derivative인 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid (DHICA)로 전환시키는 기능을 한다고 보고되어 있지만, 본 실험 결과 TRP-2 단백질 발현이 농도와 관련이 없는 것을 확인하였다.

따라서 FGUE는 TRP-2와 상관없이 tyrosinase와 TRP-1의 단백질 발현을 감소시킴으로써 melanin합성을 저해하는 것으로 여겨진다. 또한, 전사인자인 MITF의 단백질 발현변화를 확인한 결과, 농도의존적으로 발현이 억제되는 것을 확인하였다. 이는 FGUE가 MITF의 발현을 조절하므로서 melanin 합성 관련 단백질인 tyrosianse과 TRP-1의 발현이 조절되는 것으로 판단된다.

실험예 6. Melanin 합성 관련 인자 MAPKs 단백질 발현 변화

Melanin 합성 발현에 관여하는 MAPKs, ERK, JNK, p38의 단백질 발현 변화를 확인하였다.

도 6은 감초추출물(GUE)과 발효감초추출물 (FGUE)의 Melanin 합성 관련 인자 MAPKs 단백질 발현 변화 실험 결과를 나타낸다. 실험결과, α-MSH를 처리하였을 때 ERK와 JNK의 단백질 발현이 농도의존적으로 증가되었으며, pCREB의 발현이 농도의존적으로 억제되는 것을 확인하였다. p38은 단백질 발현 변화가 관찰되지 않았다.

실험예 7. mRNA수준에서의 melanin 합성 관련 인자의 변화

GUE와 FGUE에 대한 melanin 합성 관련 인자들의 mRNA 발현 변화를 알아보기 위해 mouse melanoma B16F10 세포에 다양한 농도를 적용하여 1-3일간 배양 한 후에 RT-PCR을 통해 확인하였다.

도 7은 감초추출물(GUE)과 발효감초추출물 (FGUE)의 mRNA수준에서의 melanin 합성 관련 인자의 변화 실험 결과 그래프이다. α-MSH로 melanin 형성을 유도시킨 후 시료를 처리했을 때 농도의존적으로 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 그리고 MITF인자들의 mRNA 발현이 유의적으로 억제되는 것을 확인하였다.

실험예 8. HPLC를 통한 감초 발효 추출물의 성분 분석

도 8은 발효 효과를 검증하기 위한 HPLC 성분 분석 결과 표이다. 실험예 1의 시료 추출방법을 채용하되, 감초분말 수용액(GUP), 감초분말 열수 추출물(GUE, 실험예 1 내지 실험예 7과 기호는 같으나 다른 물질) 및 감초분말 에탄올 추출물(GUEE)을 각각 발효하지 않거나 발효한 후에 지표성분을 분석한 결과이다.

즉 실험예 1의 FGUE는 도 8에서의 GUP를 발효한 것이라고 볼 수 있다. 감초 분말 열수 추출물과 감초분말 에탄올 추출물은 비교차원에서 실험한 것이다.

FGUE(GUP의 3시간 배양)를 HPLC로 분석한 결과, liquiritigenin함량이 효소처리 시간의존적으로 함량이 10배이상 증가하는 것을 확인하였으며, glycyrrhizic acid함량은 감소하는 것을 확인하였다.(실험예 1 내지 7의 GUE는 GUP를 배양하지 않은 것에 해당됨)

지금까지 본 발명에 대하여 바람직한 실시예를 중심으로 살펴보았다.

본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 하나의 실시예에 관련된 것이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형된 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

따라서 본 발명은 제시되는 실시예에 한정되지 않으며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 특허청구범위에 기재된 기술사상의 균등한 범위 내에서 다양한 수정 및 변경이 가능한 실시예가 있을 수 있다.

Claims (5)

1. 감초분말 액상에 아스페르질루스 니게르(Aspergillus niger)에서 분리된 펙티나아제 효소를 첨가하여 발효시킨 발효물을 유효성분으로 함유하는 미백 조성물.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 감초분말 액상은 감초분말의 수용액, 감초분말의 열수추출물 또는 감초분말의 에탄올 추출물 중 하나인 것을 특징으로 하는 미백 조성물.
   
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 조성물에 포함된 발효물의 농도는,
   B16F10 멜라노마 세포 1Х10⁴ cells/well 기준으로 2~64 ul/mL 인 것을 특징으로 하는 미백 조성물.
   
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 펙티나아제 효소의 농도는 1~5%(w/w)인 것을 특징으로 하는 미백 조성물.
   
5. 감초분말 액상에 아스페르질루스 니게르(Aspergillus niger)에서 분리된 펙티나아제 효소를 첨가하여 발효시킨 발효물을 유효성분으로 함유하는 미백 화장료 조성물.
   
   
   

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