KR100858917B1 - 한방 생약재 발효액을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 B16 멜라노마 세포(B16 Melanoma cell)에서 멜라닌 생성량 억제 효과가 있는 백출, 닥나무, 상백피, 작약의 한방 약제와 그리고 티로시나제(Tyrosinase) 활성 저해능을 갖는 복령, 천궁, 당귀, 감초의 한방 약제를 혼합한 한방 생약재를 열수 추출한 추출물에 아스퍼질루스 속(Aspergillus sp.) 당화균을 이용하여 발효시킨 발효액을 포함하는 것을 특징으로 하는 한방 생약재 발효액을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물로서, 단순히 한방 생약재를 추출하여 제조한 종래의 피부 미백용 화장료 조성물에 비해 멜라노마 세포에서 뛰어난 독성 경감 효과는 물론 멜라닌 생합성 과정 중에 핵심적으로 작용하는 티로시나제 단백질 발현 및 티로시나제 활성 염색 모두를 효과적으로 저해하여 세포 내의 멜라닌 생성을 억제하는 효과가 뛰어나므로 근본적으로 피부의 멜라닌 생성을 억제하여 피부의 색조, 기미, 주근깨 개선에 의한 피부 미백의 개선효과가 향상된 것이 장점이며, 또한 한방 생약재 추출물에 당화균을 사용하여 발효시킴으로써 세포독성 경감효과로 인하여 안전성이 확보되어 피부에 바르는 화장품은 물론 향후 식용 화장품 개발에도 적용 가능한 소재로서 기대된다.

피부 미백용, 화장료, 당화균, 아스퍼질루스 속(Aspergillus sp.), 백출, 닥나무, 상백피, 작약, 복령, 천궁, 당귀, 감초, 멜라닌, 생약재 발효액

Description

한방 생약재 발효액을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물{Cosmetic composition for skin whitening comprising fermentation solution of traditional oriental herbs}

본 발명은 B16 멜라노마 세포(B16 Melanoma cell)에서 멜라닌 생성량 억제 효과가 있는 백출, 닥나무, 상백피, 작약과 그리고 티로시나제(Tyrosinase) 활성 저해능을 갖는 복령, 천궁, 당귀, 감초를 혼합한 한방 생약재를 열수 추출한 추출물에 당화균을 이용하여 발효시킨 발효액을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제조함으로써, 인체에 해가 없으면서도 근본적으로 피부의 색소침착 방지와 피부의 멜라닌 생성을 억제하여 피부의 색조, 기미, 주근깨 개선에 의한 피부 미백의 개선효과가 뛰어난 것을 특징으로 하는 한방 생약재 발효액을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 산업의 급격한 발달로 대기가 오염되고, 오존층이 심하게 파괴됨에 따라 지표면에 강한 자외선이 조사되어 현대인들의 피부가 심한 스트레스를 받아 쉽 게 노화되며, 피부에 멜라민 색소가 침작되어 피부가 검게 변하거나 또는 모공이 미세한 먼지 등에 의해 막혀 기미, 주근깨, 여드름 등과 같은 피부 질환이 빈번하게 유발됨에 따라 이러한 피부 질환의 예방과 자외선으로부터 피부를 보호하기 위한 다양한 종류의 피부 미백용 화장품들이 개발되고 있고 있으며, 가능한 피부의 자극을 최대한 줄이기 위한 방법으로 각종 한방 생약 약제들을 소재로 한 피부 미백용 화장품의 개발이 붐을 이루고 있다.

일반적으로 피부, 머리카락, 눈동자 등 인간을 비롯한 생물체에 널리 분포되어 있는 색소 성분인 멜라닌은 인체 표피층의 멜라노사이트(Melanocyte)라는 색소세포 내의 멜라노좀(Melanosome)에서 합성되는데, 아미노산의 일종인 티로신을 시발 물질로 하여 티로시나제 효소에 의해 DOPA(3,4-dihydroxy-phenylalanine) 또는 DOPA 퀴논(quinone)으로 산화된 후 비효소적 반응과 자동 산화 과정을 거쳐 단백질 또는 그 구성 아미노산과 중합 반응으로 멜라닌이 합성된다 [Lee et al., Kor. J. Pharmacogn. 34(1) 33-39, 2003]. 이때 생성된 멜라닌은 피부의 색을 검게 하므로 티로시나제의 활성을 효과적으로 저해하는 실험이 미백효과를 찾아내려는 매우 유용한 연구방법으로 평가받고 있다.

현재까지 천연물로부터 분리된 티로시나제 활성 억제물질은 월귤나무 유래의 알부틴 (Arbutin) , 상백피 유래의 옥시레스베라톨 (Oxyresveratrol), 인삼 유래의 페눌산 (Ferulic acid), 대두 유래의 이소플라보노이드류 (Isoflavonoids) 등이 있 고, 이중 알부틴은 이미 기능성 미백 제품의 성분으로 상용화되고 있다. 또한, 미생물 유래의 티로시나제 활성 억제제에 관한 연구는 당화 곰팡이 균주인 아스퍼질루스 속(Aspergillus oryzae) 유래의 코직산(kojic acid)[Cabanes J. et al. Kojic acid, a cosmetic skin whitening agent, is a slow binding inhibitor of catecholase activity of tyrosinase. J. Pharm. Pharmacol. 46, 982-985, 1994]이 있지만 생성량이 많지 않아 합성된 코직산이 미백화장품에 사용되어 오다 부작용이 있어 현재는 사용되지 않고 있으며, 페니실리움 속(Penicillium sp.) 20135 유래의 테레인(terrein)[Kim WO et al. Terrein, a melanin biosynthesis inhibitor, from Penicillium sp. 20135. J. Microbiol. Biotechnol. 15(4) 891-894, 2005]은 멜라닌 색소 조절의 신경전달 경로를 조절하는데, 특히 MITF(microphthalmia associated transcription factor)라는 티로시나제 생성에 중요한 전사인자의 발현을 조절하여 미백효과를 나타낸다고 하였고, 효모 배양액 추출물인 멜라노스톤(melanoston)[이승선 외, 효모에서 분리한 멜라닌 생성 억제 물질의 작용 기전. 한국생물공학회지 19(2) 118-124, 2004], Streptococcus thermophilus YIT 2001 배양 생산물[Yakult 1993], 사카로미세스 속(Saccharomyces sp.) 활성 추출물[대한민국 등록특허 제616445호], 해양 미생물 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) KCTC 11119BP 균주의 배양액 및 배양액 추출물을 유효성분으로 하는 피부 미백용 조성물 특허가 등록되어 있다.

한편 국내에서 미백 화장품 원료로 사용되고 있는 한방 생약재 중에서 멜라 닌 생성억제 및 티로시나제 활성억제 효과를 나타내는 소재로는 대한민국 특허등록 제535875호에 감초, 상백피, 녹차, 백작약, 백강잠, 자완 및 지유 식물 혼합 추출물을 함유하는 미백용 화장료 조성물과 그리고 대한민국 특허등록 제566933호에 매실, 율무, 오미자, 도토리, 행인, 목향, 백지, 고본, 당귀, 천궁, 감초, 작약, 황귀, 백목련, 박하, 약쑥, 해초류(말의전초 또는 다시마) 및 노간주의 잎과 열매 19가지를 사용하여 항아리에서 자연 숙성시키고, 이를 가열하여 얻어지는 증류액을 한방 기능성 화장품 원료로 사용하는 것에 관한 특허가 제안되어 있지만 상기와 같은 특허들의 경우에는 한방 생약재들의 혼합물을 단순 추출하여 화장품에 사용함으로써, 코직산, 알부틴 및 하이드로퀴논(Hydroquinone)과 몇몇 천연 물질은 티로시나제 활성 억제 작용이 미약하거나 또는 부작용이 있다는 한계성이 있었다.

따라서 상기와 같은 문제점들을 해결하기 위한 본 발명은 B16 멜라노마 세포(B16 Melanoma cell) 처리에서 멜라닌(Melanin) 생성량 억제 효과가 있는 백출, 닥나무, 상백피, 작약과 그리고 또한 버섯 티로시나제(Mushroom Tyrosinase) 활성 저해효과가 있는 복령, 천궁, 당귀, 감초를 혼합하여 열수 추출한 추출물에 당화균을 이용하여 발효시킨 발효액을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공함에 그 목적이 있다.

특히, 본 발명은 이전부터 양조 제조자의 손이 곱고 하얗다는 경험과 청주를 이용해 목욕을 한다는 것에 착안해 발효주 제조시 증미 당화에 사용되고 있는 천연 코직산을 생산하는 균주로 알려진 아스퍼질루스 속 당화균을 이용하여 한방 생약재 추출물을 발효시킨 것이 특징이다.

따라서 본 발명은 멜라노마 세포에 대해 독성 경감 효과와 더불어 멜라닌 생합성 억제 효과와 이에 관여하는 티로시나제 단백질 발현 억제 효과, 티로시나제 활성 염색 억제 및 항산화 효과까지 증가시킴으로써 자외선에 의한 피부의 색소침착 방지와 피부의 멜라닌 생성을 억제하여 피부의 색조, 기미, 주근깨 개선에 의한 피부 미백의 개선효과를 증가시키는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공함에 다른 목적이 있다.

상기의 과제를 해결하기 위한 본 발명은 백출, 닥나무, 상백피, 작약, 복령, 천궁, 당귀, 감초를 혼합한 한방 생약재 혼합물을 열수 추출한 추출물을 발효시킨 발효액을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물을 과제 해결 수단으로 한다.

단, 상기 발효액은 아스퍼질루스 속(Aspergillus sp.) 당화균을 이용하여 발효시킨 것을 특징으로 한다.

상기의 과제 해결 수단에 의한 본 발명은 백출, 닥나무, 상백피, 작약, 복령, 천궁, 당귀, 감초를 혼합한 한방 생약재를 열수 추출하여 발효주 제조시 증미 당화에 사용되고 있는 아스퍼질루스 속 당화균을 이용하여 발효시킨 발효액을 이용하여 피부 미백용 한방 생약재 화장료 조성물을 제조함으로써, 단순히 한방 생약재를 열수 추출하여 제조한 종래의 피부 미백용 화장료 조성물에 비해 멜라노마 세포에서 뛰어난 독성 경감 효과는 물론 멜라닌 생합성 과정 중에 핵심적으로 작용하는 티로시나제 단백질 발현 및 티로시나제 활성 염색 모두를 효과적으로 저해하여 세포내의 멜라닌 생성을 억제하는 효과가 뛰어나므로 근본적으로 피부의 멜라닌 생성을 억제하여 피부의 색조, 기미, 주근깨 개선에 의한 피부 미백의 개선효과가 뛰어나며, 세포독성 경감효과로 인하여 안전성이 확보되어 피부에 바르는 화장품은 물론 향후 식용 화장품 개발에도 적용 가능한 소재로서 기대된다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명은 백출, 닥나무, 상백피, 작약, 복령, 천궁, 당귀, 감초를 혼합한 한방 생약재 혼합물을 열수 추출한 추출물을 발효시킨 발효액을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 특징은 한방 생약재 추출물을 발효시킨 발효액을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물로써, B16 멜라노마 세포 독성 경감 효과, 멜라닌 생성 억제 효과, 이에 관여하는 티로시나제 단백질 발현 억제 효과 및 티로시나제 활성 염색 억제 효과가 일반적인 종래의 한방 생약재 혼합 추출물을 사용한 피부 미백용 화장료 조성물보다 향상된 것이 특징이다.

이하, 본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물에 사용하는 한방 생약재 혼합물의 구성 약제를 구체적으로 살펴보면 아래의 내용과 같다.

백출은 휘발성 정유와 비타민 A류가 함유되어 있어 피부각질화를 치료하여 피부탄력을 유지시키는데 효과가 있고, '약성론'에서는 피부를 윤택하게 해주고, 얼굴에 화색이 돌게 하며, 기미를 제거 효과가 있다고 하였다.

그리고 닥나무(Broussonetia kanzinoki Siebold)는 한방에서 성질은 냉하고 맛은 달다고 하고 있다. 동의보감에서는 닥나무의 부드러운 지엽(枝葉), 수즙(樹汁) 또는 근피(根皮)를 구피마(構皮麻)라 하여 약용으로 사용하며, 약리작용으로는 거습(祛濕), 이뇨, 부종냉증, 피부염 등을 치료하는데 주로 사용되고 있다. 오래전부터 한지를 만드는 사람들은 손이 하얗다는 점을 발견하고, 한지의 원료인 닥나무에 많이 함유된 아이피-플라보노이드(IP-Flavonoid) 구조가 미백효과를 나타내는 것으로 알려져 현재 미백 화장품 제품의 생약 소재로서 상용화되고 있다.

또한 상백피(桑白皮, Mori Cortex Radicis)는 뽕나무의 뿌리 껍질로 플라본(flovone)계인 쿠와논(kuwanone) C, A∼Z, 후와놀(huwanol) A∼B, 상계논(sanggenone) A∼Q, 모라세린(moracerin) C∼D, 알바푸란(albafuran) A∼C 등의 약효성분이 함유되어 있고, 약리 작용으로는 이뇨, 혈압강하, 심장억제, 진통, 항균작용 효과 이외에도 멜라닌 생성 억제, 미백 효과와 함께 보습 효과까지 뛰어난 것으로 알려져 있다.

또한 백작약은 반점 치료제, 색소침착 치료제 및 티로시나제 활성억제 효과가 있어 미백효과를 가지고 있으며, 자극이 없어 장시간 사용해도 무방하여 남녀 모두에게 사용할 수 있고 부작용도 없어 가장 이상적인 미백제로서 반점 치료제로 사용되고 있는 한방약제이다.

그리고 복령(茯笭, Hoelen)은 소나무를 벌채한 후 4~5년 지난 뒤 땅속의 뿌리에 기생하는 구멍장이 버섯과의 균핵으로 지름이 5~20 cm 정도의 덩어리이다. 그 내부가 백색과 연분홍 색으로서 각각 백복령과 적복령으로 구분하고 있다. 복령에는 β-파키만(pachyman), 트리테르페노이드(triterpenoid) 화합물, 당, 아미노산, 효소, 무기질이 함유되어 있고, 주요 작용으로는 이뇨, 면역증강, 항암, 항위궤양 및 심혈관계에 대한 보호작용 이외에도 반점억제 작용과 피부 개선효과가 있는 것으로 알려져 있다.

또한 천궁은 여드름과 각종 반점의 생성을 예방하고 얼굴의 피부를 하얗고 매끄럽게 해주는 작용이 있는 것으로 알려져 있다.

또한 감초(甘草, Glycyrrhiza Radix)는 다년생 초본으로 약용식물의 뿌리를 이용한다. 감초의 유효 성분으로 기퀴리친, 글루쿠로닉산, 글리씰하이직산, 글리씰하이진 등을 함유하고 있고, 일반 약리작용으로 진해 거담작용, 항알러지 작용, NK 세포 활성화 작용, 항염작용, 항궤양 작용이 있으며, 모든 약의 독을 풀어 중화 및 완화시키는 작용을 하므로 한방 처방에서는 필수불가결한 묘약으로 유용성 감초 추출물은 천연 미백 원료로서 사용되고 있으며, 피부에 대한 부작용이 없는 것으로 알려져 있다.

그리고 당귀는 티로시나제 활성을 억제하여 멜라닌의 형성을 억제하는 미백 생약재로 알려져 있고, 갈색 반점 등의 색소성 피부병을 치료하는데 비교적 효과가 뛰어나다고 알려져 있다. 당귀복방은 피부를 희고 부드럽게 하며 피부의 건강상태를 개선한다. 이러한 복방은 당귀를 위주로 하여 도라지, 속수자, 토사자, 사간, 마황추출물을 혼합한 것으로 미용제품으로서 안정성이 있어 팩, 영양크림, 화장수, 목욕제품 등에도 사용되고 있다.

이하, 본 발명에 적용되는 한방 생약재 혼합물을 열수 추출하는 방법은 다음과 같다.

상기 한방 생약재 혼합물은 물 100 중량부에 1~3 중량부 첨가하여 열수 추출하는 것이 바람직하다.

한방 생약재는 각각의 약제를 적절한 크기로 절편화 시킨 생약재를 사용한다. 그리고 한방 생약제 혼합물의 첨가량은 물 100 중량부에 1~3 중량부 첨가하는 것이 바람직하며, 2 중량부를 첨가하는 것이 더욱 바람직하다. 한방 생약재의 첨가량이 적을 경우에는 한방 생약재의 유효성분이 적어 기대하는 효과를 얻을 수 없고, 그리고 한방 생약재의 첨가량이 많을 경우에는 한방 생약재 혼합물로부터 유효성분을 추출하기 위한 물의 양이 상대적으로 부족하여 한방 생약재 혼합물로부터 유효성분을 충분하게 추출하지 못해 비경제적인 문제가 있다.

본 발명에서 사용하는 한방 생약재의 중량은 「대한약전외한약(생약)규격집」에서 규정한 기준에 따라 60℃이하에서 말린 상태의 생약 중량을 의미한다.

그리고 한방 생약재 혼합물의 열수 추출은 100~121℃에서 1~3시간 동안 가열 추출하는 것이 바람직하다. 열수 추출 조건이 상기에서 한정한 범위 미만이 될 경우에는 한방 생약재 혼합물에 함유되어 있는 각 유효성분들이 충분하게 추출되지 않을 우려가 있고, 열수 추출 조건이 상기에서 한정한 범위를 초과할 경우에는 한방 생약재 혼합물에 함유되어 있는 각 유효성분들이 파괴되어 그 효능들이 상실할 우려가 있다.

그리고 상기 한방 생약재 혼합물의 첨가량 결정은 한방 생약재 혼합물의 각 약제들을 균등한 양으로 혼합함으로써, 각 약제들에 함유되어 있는 유효성분들의 상호보완작용에 의해 피부의 미백효과를 높일 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 한방 생약재 혼합물의 추출물을 발효시키는 방법은 다음과 같다.

본 발명에 따른 발효액은 한방 생약재 혼합물을 추출한 추출물 100 중량부에 대하여 YMB 배지 조성물로 사용하는 영양성분인 효모 추출물(Yeast extract) 0.2~0.5 중량부, 맥아 추출물(Malt extract) 0.2~0.5 중량부, 펩톤(Peptone) 0.4~0.7 중량부, 글루코스(Glucose) 0.8~1.2 중량부를 각각 첨가하여 20~30℃에서 5~15 일간 당화균을 이용하여 발효시키는 것이 바람직하다. 상기에서 YMB 배지 조성물로 사용되는 성분들의 첨가량은 당화균이 활발하게 발효작용을 할 수 있도록 하기 위해 첨가하는 것으로서, 그 첨가량은 상기의 첨가량에만 반드시 한정되지 않고 필요에 따라서는 적절히 조정되어 질 수 있다. 그리고 발효조건은 상기에서 한정한 범위 미만이 될 경우에는 추출물이 충분히 발효되지 아니하여 멜라닌 생합성 억제 효과와 이에 관여하는 티로시나제 단백질 발현 억제 효과, 티로시나제 활성 염색 억제 효과 등이 저하되어 피부 미백 효과가 제대로 나지 않을 우려가 있고, 상기에서 한정한 발효조건의 범위를 초과할 경우에는 티로시나제 활성 저해 작용이 나타나지 않아 미백효과를 기대할 수 없다.

그리고 상기 발효액은 아스퍼질루스 속(Aspergillus sp.) 당화균을 이용하여 발효시키는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 한방 생약재 추출물을 발효시키는데 사용되는 당화균은 본 출원인의 부설연구소에서 발효주 제조에 사용되는 균주로서, 이를 YMA 배지의 페트리 접시에 평판배양 시키면서 액체 종균으로 사용하였다.

그리고 상기에서 발효시킨 한방 발효액은 미백용 화장료 조성물에 2~4 중량%가 함유되는 것이 바람직하며, 발효액의 함량이 2 중량% 미만이 될 경우에는 피부의 색조, 기미, 주근깨 개선에 의한 피부 미백의 개선효과 등이 저하할 우려가 있고, 발효액의 함량이 4 중량%를 초과할 경우에는 세포독성 등의 부작용이 나타날 우려가 있다.

이상 상기에서 설명한 바와 같은 본 발명에 따른 피부 미백용 화장료 조성물은 피부 미백용 화장품, 피부 노화방지용 화장품, 자외선 차단용 화장품, 피부 손상 방지용 화장품 등을 제조하는데 유용하게 사용될 수 있다.

이하 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예에만 반드시 한정되는 것은 아니다.

1. 본 발명에 적용할 한방 생약 약제의 선택

가. 30 종의 한방 생약재 약제의 탐색

문헌을 근거로, 도 1에 도시된 바와 같은 티로시나제 활성 저해 효과 및 멜라닌 생성량 저해 효과가 있는 것으로 알려진 한방 생약재 30 종을 선택하고, 이들 각각의 추출물보다 저해 효과가 있는 한방 생약재 발효액의 탐색을 위해 아래의 방법에 따라 발효시켰다.

먼저, 각각의 한방 생약재의 약제를 적절한 크기로 절편한 다음 증류수 100 중량부에 대하여 각각의 생약을 약제별로 구분하여 각각 2 중량부씩 첨가한 다음 110℃에서 2 시간 동안 가열한 후 한방 생약재를 제거하고 열수 추출물 시료를 수득하였다.

그리고 페트리 접시에 평판 배양된 종균을 지름 1 cm 크기의 균체 조각을 만들고, 발효액 100 중량부에 대하여 별도로 YMB 배지에 사용되는 영양성분인 효모 추출물 0.4 중량부, 맥아 추출물 0.3 중량부, 펩톤 0.5 중량부, 글루코 1.0 중량부를 각각 첨가하여 각각의 한방 생약재 추출물에 넣어 121℃에서 15분간 살균시킨 다음 상온이 되었을 때 상기에서 만든 균체 조각을 3개씩 넣고 25℃에서 150 rpm으 로 최장 15일간(3일, 6일, 9일, 12일, 15일) 발효시킨 후 발효액을 여과지로 여과시킨 다음 0.2㎛ 필터로 최종 여과하여 수득하였다.

한방 생약재 30 종을 사용하여 추출한 추출물을 발효시킨 발효액 30 종류를 사용하여 균체를 배양한 형태는 도 1에 첨부된 사진의 내용과 같다. 각각의 한방 생약 약제의 종류에 따라 동일한 당화균을 사용하였음에도 불구하고 균체의 형태와 배양액의 색상이 다른 것으로 나타나 발효액의 약제 유효성분에 의한 영향을 받는 것으로 보여 진다. 상기 발효액 중에서 균체의 배양 상태가 좋은 8 종류의 백출, 닥나무, 상백피, 작약, 복령, 천궁, 당귀, 감초 약제 발효액을 선택하였다.

나. 개별 약제 추출물 및 발효액의 티로시나제 활성 억제 시험

한방 생약재 30 종의 종류별 추출물 및 발효액을 사용하여 in vitro 버섯 티로시나제 활성 저해 능력을 측정하기 위하여 96-웰 플레이트에 L-티로신(L-Tyrosine)(10 mM) 25 ㎕에 한방 생약재 약제별 추출물 및 발효액을 각각 30 중량%씩 첨가하고, 머쉬룸타이로시네이즈(mushroom tyrosinase)(2,500 unit, Sigma Chemical C., USA) 3 ㎕를 넣은 후 50 mM 인산완충용액으로 최종 200 ㎕가 되도록 조절하여 30℃에서 1시간 반응시켜 ELISA Reader를 통해 멜라닌 생성량을 490 nm로 흡광도를 측정하여 계산한 결과 티로시나제 저해율은 아래 [표 1]의 내용과 같다. 이때 티로시나제 저해율(%)은 아래의 공식에 의해 산출하였다.

티로시나제 저해율 (%) = [(A-B)/A] X 100

상기에서 A : 추출물 또는 발효액이 들어있지 않은 반응액의 반응 후 흡광도

B : 추출물 또는 발효액이 들어있는 반응액의 반응 후 흡광도

(단위 : %)

구분	A	B
천궁	0	27.3
감초	76.9	90.4
닥나무	20.5	17.6
당귀	11.6	16.1
백출	8.6	7.2
복령	6.1	12.8
상기생	19.8	2.6
상백피	54.7	7.1
선학초	10.1	7.5
유근피	12.3	10.5
작약	19.7	14.7
정공등	27.2	24.0
정향	43.9	31.5
지구목	17.9	13.9
진피	15.5	10.5
창출	5.7	3.0
녹차씨과피	48.5	30.6
함초	16.9	13.9
현호색	24.8	16.5
황기	19.4	0
후박	15.7	12.8
리파과피	72.1	50.7
가시오가피	12.3	10.1
갈근	22.2	19.1
거심맥문동	13.6	10.6
마가목	15.7	15.3
백굴채	22.7	20.2
삼백초	37.2	30.7
소엽	12.5	11.0
녹차씨	47.9	43.2

주 : A는 한방 생약재의 개별 약제의 추출물임

B는 한방 생약재의 개별 약제의 발효액임

상기 [표 1]에 나타난 바와 같은 30 종류의 생약재 중에서 각각의 다른 생약재의 약제에 비해 발효액 중에서 각각의 추출물보다 티로시나제 활성 저해효과가 높은 복령, 천궁, 당귀, 감초의 4종류를 선택하였다.

다. 개별 약제 추출물 및 발효액의 멜라노마 세포 내 멜라닌 생성 억제 시험

본 실시예에 사용된 B16 멜라노마 세포는 마우스 유래의 세포 균주로 ATCC에서 구입하여 10% 소 태아혈청과 1% 페니실린, 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에 현탁시키고, 5% 이산화탄소/95% 공기의 조건으로 37℃ 배양기에서 배양하면서 시험에 사용하였다.

세포 내의 멜라닌 함량 측정을 위하여 30 종류의 한방 생약재 개별 추출물 및 발효액을 농도별로 세포에 처리하여 3일간 배양한 후 인산완충 용액으로 간단하게 씻어주고, 트립신/EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)를 처리하여 플레이트로부터 세포를 분리시켰다. 일부는 세포 수 측정에 사용하고, 나머지 세포를 모아 1 N 수산화나트륨(NaOH) 200 ㎕로 세포 파쇄를 시켜 세포 내 멜라닌 농도 측정에 사용하였다. 표준물질(Standard)로는 합성된 멜라닌을 사용하여 엘라이자 리더(ELISA Reader)에서 405 nm로 흡광도를 측정하여 멜라닌 함량(%)을 계산하였다. 이때 한방 생약재의 개별 약제의 추출물과 발효액을 각각 배지에 1 중량%, 3 중량%, 5 중량%, 8 중량%, 10 중량% 농도로 처리하였으며, 배지에 3 중량%로 처리한 한방 생약재의 개별 약제의 추출물과 발효액의 멜라닌 함량은 아래 [표 2]의 내용과 같다.

(단위 : %)

구분	A	B
천궁	71.0	99.9
감초	80.7	113.6
닥나무	88.7	50.9
당귀	53.0	87.0
백출	78.6	44.2
복령	57.1	102.7
상기생	11.4	23.2
상백피	75.4	45.3
선학초	50.3	54.4
유근피	51.9	67.7
작약	97.1	11.5
정공등	17.7	27.1
정향	2.4	6.4
지구목	27.1	29.7
진피	55.6	62.8
창출	77.8	82.1
녹차씨과피	22.8	72.2
함초	35.0	39.1
현호색	80.9	81.1
황기	77.7	80.6
후박	51.7	59.2
리파과피	27.0	44.7
가시오가피	43.9	56.7
갈근	50.5	51.6
거심맥문동	84.1	92.1
마가목	44.6	66.6
백굴채	77.8	84.2
삼백초	32.7	39.0
소엽	31.0	42.7
녹차씨	41.3	60.9

주 : A는 한방 생약재의 개별 약제의 추출물임

B는 한방 생약재의 개별 약제의 발효액임

상기 [표 2]의 내용에 나타난 바와 같이 31 종의 생약재의 약제 중에서 발효액이 추출물보다 멜라닌 생성량이 크게 줄어드는 것으로 나타난 백출, 작약, 닥나무, 상백피의 4종류를 선택하였다

2. 한방 생약재 혼합 추출물 및 혼합 발효액 조제

(실시예 1)

티로시나제 활성 실험과 멜라닌 생성 실험에서 각각 높은 저해 활성을 보였던 복령, 천궁, 당귀, 감초, 백출, 닥나무, 상백피, 작약의 8종의 한방 약제를 선택하여 증류수 100 중량부에 대하여 상기 8종의 생약 약제를 각각 2 중량부씩 첨가하여 추출된 생약재 혼합 추출물을 당화균으로 발효시킨 발효액을 상기 1의 방법과 동일한 방법으로 조제하였다.

(비교예 1)

상기 실시예 1의 방법과 동일한 방법으로 동일 종류의 약제를 이용하여 한방 생약재 혼합 추출물을 조제하였다.

3. 한방 생약재 혼합 추출물 및 혼합 발효액의 비교 평가

(실험 1) 세포독성 실험

배양 세포의 생존율(cell viability)을 확인하기 위한 세포 독성 실험은 MTT(3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 방법을 이용하여 실험하였다.

세포 내 활성 미토콘드리아의 디하이드로겐아제(dehydrogenase)에 의해 MTT 반응으로 보라색의 포말존(formazan)을 형성하는 것에 기초하여 흡광도로 측정하였으며, 실시예 1 및 비교예 1의 시료를 각각 멜라노마 세포의 배양 배지에 세포량에 대하여 1 중량%씩의 농도로 첨가한 다음 세포 생존율을 아래의 공식에 따라 독성 실험 결과를 도 2의 세포 생존율을 도시한 그래프에 나타내었다.

세포 생존율(cell viability)(%) = (시료를 첨가한 것의 흡광도/ 배지의 흡광도) × 100

도 2의 세포 독성 결과를 나타내는 플레이트 사진에서 MTT 반응에서 살아있는 세포가 많을수록 짙은 보라색을 띄게 되고, 처리 시료액의 독성이 강할수록 살아있는 세포가 줄어들어 보라색이 옅어지는 결과를 얻어 세포독성을 판단하게 된다.

또한, 한방 생약제 혼합 추출물인 비교예 1에 대한 세포 독성 실험을 실시 한 결과 1 중량% 농도 처리부터 80% 이하의 세포 생존율을 보여 세포독성이 있는 것으로 나타났으며, 5중량% 농도 처리부터는 세포가 거의 사멸할 정도의 독성을 보였지만 12일까지 발효시킨 생약재 혼합 발효액인 실시예 1의 경우에는 각각 10 중량% 농도 처리까지도 높은 세포 생존율을 보였고, 각 처리 농도에서 발효 일수가 길어질수록 세포 생존율이 증가되어 독성이 더욱 낮아지는 특성을 가지고 있었다

따라서 한방 생약제 혼합 추출물을 이용하여 당화균으로 최장 12일까지 발효시킴으로써 혼합 추출물에서 나타내는 세포 독성이 경감하여 피부에 안전성 부여로 피부 미백용 화장료로 사용될 가능성이 매우 높다.

(실험 2) 버섯 티로시나제 활성 실험

티로시나제 활성 저해 정도에 따라 색상이 달라지는데, 활성 저해도가 강할수록 색소 생성량이 낮아 옅은색을 보이게 된다. 한방 생약재 혼합 추출물인 비교예 1과 이를 당화균으로 15일까지 발효시킨 발효액인 실시예 1을 처리하여 티로시나제 활성을 측정한 결과 도 3에 도시된 그래프에서 나타난 바와 같이 실시예 1의 경우에 발효 9일째까지 80% 정도의 활성 저해효과가 있는 반면에 비교예 1의 경우에는 75% 정도의 활성 저해효과가 있었다. 그러나 발효일수가 12일을 초과할 경우에는 오히려 티로시나제 활성 저해효과가 떨어지는 결과를 보이고 있다. 참고로 도 3은 비교예 1과 실시예 1의 티로시나제 활성 측정 플레이트 상의 티로시나제 활성 상태의 나타낸 사진 및 티로시나제 활성 저해율을 도시한 그래프를 나타낸 것이다.

(실험 3) 세포 내 멜라닌 농도 측정

한방 생약재 혼합 발효액인 실시예 1과 한방 생약재 혼합 추출물인 비교예 1의 시료를 세포 배양배지에 각각 1 중량%, 3 중량%, 5 중량%, 8 중량%, 10 중량% 농도로 처리한 결과, 도 4의 그래프에 나타난 바와 같이 낮은 농도인 1 중량% 농도에서는 멜라닌 생성 저해효과가 거의 없었고, 3~5 중량% 농도 처리에서는 80% 정도의 세포내 멜라닌 생성 저해효과가 있었다. 그러나 그 이상의 처리 농도에서는 세포독성으로 인하여 세포내 멜라닌 생합성 저해 효과를 검토하기에는 무리가 있었다. 실시예 1의 경우에는 각 처리농도에서 각각 9일째 발효액이 세포내 멜라닌 생합성 억제 효과가 가장 높은 것으로 나타났다. 한편 비교예 1의 경우에도 실시예 1과 비슷한 효과를 나타내고 있지만 이는 세포 독성으로 인해 세포 생육에 문제가 있어 멜라닌 농도가 낮아졌기 때문에 비교예 1의 추출물을 사용보다는 반드시 실시예 1의 발효액을 사용하는 것이 적절한 것으로 판단되었다. 따라서 세포내 멜라닌 생합성 억제 효과는 한방 생약재 추출물인 비교예 1보다는 한방 생약재 발효액인 실시예 1에서 효과가 더 좋았으며, 특히 발효액에서 세포 독성경감과 함께 멜라닌 생합성 억제 효과가 있어 당화균의 발효가 반드시 필요한 공정으로 여겨진다. 참고로 도 4는 실시예 1과 비교예 1의 멜라민 생 합성량의 상태를 나타낸 플레이트 상태의 사진 및 멜라닌 생합성량을 도시한 그래프를 나타낸 것이다.

(실험 4) 멜라닌 세포 형태, 배양액 및 세포 펠렛 형태 측정

이상의 실험 결과에서 실시예 1의 생약재 발효액의 효과를 나타내는 최소 농도가 3 중량% 이었기 때문에 그 사용 농도의 범위를 좁혀 2 중량%, 3 중량%, 4 중량%, 5 중량% 농도로 처리하여 세포내 멜라닌 생합성 억제 효과를 검토한 결과 도 5에 도시된 바와 같이 실시예 1은 3 중량% 처리농도에서 멜라노마 세포 형태 및 이를 함유한 배양액과 세포 펠렛 자체만의 색소 정도가 가장 옅은 것으로 나타났다. 참고로 도 5는 실시예 1을 처리한 세포 형태, 세포 배양액 및 세포 페렛을 나타낸 사진에 관한 것이다.

따라서 3 중량% 이상의 농도 처리에서는 약간의 세포독성으로 인해 멜라닌 생성량이 낮아지는 결과를 나타내었기 때문에 실시예 1에 의한 멜라닌 생성 억제 효과는 발효액 3 중량% 처리가 가장 효과적인 것으로 확립되었다.

(실험 5) 멜라노마 세포 내 티로시나제 활성 측정(in vivo 실험)

버섯 티로시나제 in vitro 활성 측정에서는 실시예 1 및 비교예 1은 도 3의 그래프에서 나타난 바와 같이 30 중량% 농도 처리에서 약 80% 정도의 활성 저해 효과가 있었다. 그러나 실시예 1은 이보다 낮은 농도로 처리한 실험에서는 도 6의 그래프에서와 같이 5 중량% 이하 처리에서 버섯 티로시나제 활성 저해 효과가 관찰되지 않았다. 이때 티로시나제의 직접적인 저해제인 시판 코직산(Kojic acid)을 4000 uM 이하 농도로 처리한 결과에서는 도 7의 그래프에 도시된 바와 같이 처리 농도에 의존해서 저해활성을 보여 티로시나제 활성 측정실험이 정상적으로 이루진 것을 의미한다.

참고로 도 6은 실시예 1의 티로시나제 활성율을 나타낸 그래프이고, 도 7은 티로시나제 저해제인 시판 코직산(Kojic acid) 처리에 의한 티로시나제 활성율을 나타낸 그래프에 관한 것이다.

세포의 단백질 농도는 BSA를 표준물질로 하여 Lowry 방법에 의해 상층액의 단백질 농도를 정량하였다. 티로시나제가 포함되어 있는 상층액을 0.1% L-티로신이 함유된 0.1M 나트륨인산완충용액(sodium phosphate buffer)(pH 6.8) 1 ml에서 37℃, 1시간 동안 배양하였다. 배양하기 전과 15분간 배양한 후 각각 475 nm에서 흡광도를 조사하여 억제되는 정도를 측정하여 티로시나제의 활성 저해율(%)을 아래 공식에 의해 계산하였다.

티로시나제 저해율(%) =(B-A)/(D-C) × 100

상기에서 A 및 B : 시료를 넣은 용액의 반응 전 흡광도와 반응 후의 흡광도

C 및 D : 시료를 넣지 않은 용액의 반응 전과 반응 후의 흡광도

(실험 6) 티로시나제 단백질 발현 웨스턴 블랏 검사(Western blot analysis)

B16 멜라노마 세포는 10% 소태아혈청과 1% 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지에 현탁시키고 5% 이산화탄소/95% 공기조건으로 37℃ 배양기에서 배양된 B16 멜라노마 세포를 0.025% 트립신과 0.52mM EDTA가 첨가된 인산 완충용액으로 처리한 후 세포를 플라스크로부터 분리하여 모은 다음 6-well plate에 5X10⁴ 세포의 농도로 접종하였다. 배양 24시간 후에 2% 소태아혈청과 1% penicillin 및 streptomycin이 포함된 신선한 DMEM 배양액으로 교체한 다음 실시예 1의 발효액을 0%, 2%, 3%의 농도별로 처리하여 세포를 배양시킨 후 실제 tyrosinase 단백질의 발현에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 웨스턴 블랏 검사를 실시하였다. 이때 멜라닌 색소 형성을 촉진하는 IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)를 처리하여 멜라닌을 많이 유도시킨 상태에서 생약재 혼합 발효액을 농도별로 처리하였다. 생약재 혼합 발효액을 처리한 처리구와 비처리구 각각의 세포 추출물로부터 얻은 총 단백질 10 ㎍을 10% SDS-PAGE상에서 전기영동 한 후 PVDF막으로 이동시켜 웨스턴 블랏을 실시하였다. 1st 항체(antibody)는 goat tyrosinase polyclonal 항체로 1:200 비율로 희석하여 사용하였고, 2nd 항체는 donkey anti-goat lgG-HRP (horseradish peroxidase)를 사용하였으며, signal은 chemiluminescences detection reagent로 확인하였다.

NC(Negative control: 음성대조구)구의 IBMX 및 발효액을 모두 처리하지 않은 세포에서 티로시나제 단백질 발현량을 1로 기준으로 하였을 때, IBMX만을 처리한 PC (Positive Control: 양성대조구)구에서는 8.3배의 티로시나제 단백질 발현량이 증가하였고, IBMX 처리에 실시예 1의 발효액 2 중량% 및 3 중량%를 각각 처리한 실험구에서는 도 8에 도시된 바와 같이 각각 3.8배 및 2.6배로 농도 의존적으로 현저히 감소하는 결과를 얻었다. 따라서 실시예 1의 발효액은 멜라노마 세포에서 티로시나제 단백질 발현량을 억제함으로서 세포 내 멜라닌 생합성을 조절하는 기작을 밝혀내었다. 참고로, 도 8은 실시예 1의 티로시나제 단백질 발현을 나타내는 웨스턴 블랏 전기영동 사진을 나타낸 것이다.

(실험 7) 티로시나제 활성 염색(Tyrosinase activity zymogram)

B16 멜라노마 세포에 IBMX와 실시예 1의 발효액을 3일간 처리하였다. 3일간 배양한 후 세포를 얻어 티로시나제 활성 염색을 위하여 세포를 파쇄한 후 파쇄액의 단백질 농도를 측정하여 동일한 양의 단백질을 SDS-acrylamide gel에 전기영동 하였다. 이때, b-mercaptoethanol이 없는 Laemmli sample buffer를 사용하고 끓이는 과정은 생략하였다. 전기영동이 끝난 후, 겔(gel) 상에서 티로시나아제 밴드가 나타날 때까지 5 mM L-DOPA에 담근 후 Lumi-Imager F1 (Roche, Switzerland)로 Lumianalyst 3.1.0 프로그램에 의해 활성 염색 밴드를 정량하였다.

멜라노마 세포에 IBMX를 처리하여 세포 내 멜라닌 함량을 증가시키는 PC(대조)구에서는 티로시나제 활성 염색이 NC구의 2.63배 증가하였으나, IBMX와 동시에 실시예 1의 발효액을 처리하였을 경우에는 처리 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 티로시나제 단백질 발현량과 동일한 양상을 나타내었다. 따라서 실시예 1의 한방 생약재 발효액에 의한 멜라노마 세포 내에서 멜라닌 생성량 저해효과는 직접적인 티로시나제 활성 저해라기 보다는 티로시나제 단백질 발현 억제와 활성 염색 억제에 의해 감소하는 기작을 밝혀냄으로서 우수한 피부미백 화장료 조성물로 사용될 수 있다. 참고로, 도 9는 실시예 1의 티로시나제 활성 염색 사진에 관한 것이다.

(실험 8) 총 폴리페놀 화합물 농도 측정

총 폴리페놀 화합물의 함량은 페놀성 물질이 안산몰리브덴산과 반응하여 청색을 나타내는 것을 이용한 폴린-데니스(Folin-Denis)법을 약간 변형시켜 측정하였다. 즉, 실시예 1 및 비교예 1의 시료액 0.5 ㎖에 폴린시약(Folin-ciocalteu's phenol reagent) 2.5 ㎖를 첨가하여 잘 혼합하고 5분간 실온에서 방치하였다. 정확히 5분 반응시킨 후 7.5% Na₂CO₃ 2 ㎖를 가하여 혼합하고 50℃에서 5분간 발색시킨 후 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 폴리페놀 화합물은 탄닌산을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였으며, 탄닌산의 표준곡선은 탄닌산 1 g을 50% 메탄올 용액 1 ㎖에 녹이고 최종농도가 0, 50, 100, 150, 200, 300 및 500 ppm 용액이 되도록 취하여 상기와 같은 방법으로 760 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 발효액의 총 폴리페놀 화합물의 농도는 도 10에서와 같이 발효 9일까지는 변화가 없다가 12일 이후부터 감소하는 경향을 보여 티로시나제 활성과 비슷한 경향을 보이고 있어 상당히 높은 상관관계를 나타내는 것으로 보여진다. 참고로, 도 10은 실시예 1과 비교예 1의 총 폴리페놀 화합물의 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

(실험 9) 항산화 실험

1,1-디페닐-2-피크릴하이드라질(DPPH; 1,1'-diphenyl-2-picrylhydrazyl)은 비교적 안정한 유리기로써 아스코로빅에시드(ascorbic acid), 토코페롤, 폴리하이드록시(polyhydroxy) 방향족 화합물, 방향족 아민류에 의해 환원되어 짙은 자색이 탈색되는 원리를 이용하여 비교예 1의 추출물과 실시예 1의 9일간 발효시킨 발효액의 항산화 활성을 측정하는데, 이러한 항산화 측정법은 식물 추출물의 항산화 활성을 간단히 측정할 수 있는 동시에 실제 항산화 활성과도 연관성이 매우 높기 때문에 많이 이용되는 방법이다.

DPPH 용액의 조제는 에탄올 100 ml에 DPPH 16 mg을 녹인 후 증류수 100 ml를 혼합하여 여과(Whatman filter paper NO. 2)시켜 제조하였다. DPPH 용액 5 ml에 실시예 1과 비교예 1의 시료를 각각 5 중량%, 25 중량%, 50 중량%, 75 중량%, 100 중량%로 희석시켜 총 1 ml을 만들고 이를 혼합한 후 실온에서 30분간 반응시킨 다음 528 nm에서 흡광도의 감소를 측정하였다. DPPH를 이용한 전자공여능(EDA: electron donating activity)(%)은 아래의 공식에 의해 계산하였으며, 그 결과는 첨부된 도면인 도 11의 그래프에 나타내었다.

전자공여능(%) = [ 1 - (Abs/Abc)] × 100

상기에서 Abc : Absorbance of control treatment at 528 nm

Abs : Absorbance of sample treatment at 528 nm

첨부된 도면인 도 11은 비교예 1의 추출물과 실시예 1의 9일간 발효시킨 발효액의 항산화 활성 측정 사진과 DPPH 소거활성율을 나타낸 그래프에 관한 것이다.

도 11에 의하면, 실시예 1은 비교예 1에 비해 25% 이상의 처리량에서 80% 이상의 라디칼 소거능을 보여 높은 항산화 활성을 보였다. 따라서 발효에 의한 항산화 활성에는 변화가 없으면서도 세포 독성 감소 효과 및 미백효과는 그대로 유지하기 때문에 당화균의 발효는 세포독성 감소를 위해 반드시 필요한 공정으로 여겨진다.

따라서 실시예 1의 발효액은 총 폴리페놀 농도의 변화와 또한 높은 항산화 활성이 멜라노마 세포에서 멜라닌 생합성의 억제와 깊은 상관관계를 가짐으로써 피부 미백 효과를 나타낸 것으로 확인되었다.

상기에서 설명 드린 바와 같이 본 발명은 상기의 실시예를 통해 그 물성의 우수성이 입증되었지만 본 발명은 상기의 실시예에 의해서만 반드시 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능하다.

도 1은 한방 생약재의 각 약제별 발효액에 당화균을 이용하여 발효시킨 상태를 나타낸 사진,

도 2는 실시예 1의 한방 생약재 혼합 발효액을 이용하여 농도별, 발효일수 별 세포 배양배지의 상태와 비교예 1의 세포 배양배지의 상태를 나타낸 사진,

도 3은 실시예 1과 비교예 1의 티로시나제 활성 상태를 측정하는 플레이트 사진 및 티로시나제 활성 저해율을 나타낸 그래프,

도 4는 실시예 1과 비교예 1의 멜라민 생성량의 상태를 나타낸 플레이트 상태의 사진 및 생성량을 도시한 그래프,

도 5는 실시예 1을 처리한 세포 형태, 세포 배양액 및 세포 페렛을 나타낸 사진,

도 6은 실시예 1의 티로시나제 활성율을 나타낸 그래프,

도 7은 티로시나제 저해제인 시판 코직산(Kojic acid) 처리에 의한 티로시나제 활성율을 나타낸 그래프,

도 8은 실시예 1의 티로시나제 단백질 발현을 나타내는 웨스턴 블랏 전기영동 사진,

도 9는 실시예 1의 티로시나제 활성 염색 사진,

도 10은 실시예 1과 비교예 1의 총 폴리페놀 화합물의 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프,

도 11은 한방 생약재 혼합 발효액의 항산화 활성 측정 사진과 DPPH 소거활성 율을 나타낸 그래프를 도시한 것이다.

Claims (6)

1. 백출, 닥나무, 상백피, 작약, 복령, 천궁, 당귀, 감초를 균등한 양으로 혼합한 한방 생약재 혼합물을 열수 추출한 추출물을 발효시킨 발효액을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물에 있어서,

   상기 추출물은 물 100 중량부에 상기 한방 생약재 혼합물 1~3 중량부를 첨가하여 100~121℃에서 1~3시간 동안 열수 추출한 것이고,

   상기 발효액은 추출물 100 중량부에 대하여 효모 추출물(Yeast extract) 0.2~0.5 중량부, 맥아 추출물(Malt extract) 0.2~0.5 중량부, 펩톤(Peptone) 0.4~0.7 중량부, 글루코스(Glucose) 0.8~1.2 중량부를 각각 첨가한 다음 아스퍼질루스 속(Aspergillus sp.) 당화균을 이용하여 20~30℃에서 3~15 일간 발효시킨 것이며,

   그리고 상기 발효액이 미백용 화장료 조성물에 2~4 중량%가 함유되는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
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