WO2019172626A1 - 한약재 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보습 및 주름 개선용 조성물 - Google Patents
한약재 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보습 및 주름 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 감초, 대추, 반하, 생강, 시호, 인삼 및 황금의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보습 및 피부 주름 개선용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 혼합 추출물은 세포독성이 없고, 자외선 조사에 의해 손상된 세포를 보호하며, 엘라스타아제의 발현을 현저하게 억제하는 것이다. 따라서 본 발명의 조성물은 피부 보습 및 피부 주름 개선용 건강기능식품에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 한약재 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보습 및 주름 개선용 조성물에 관한 것이다.
피부는 외부환경의 자극으로부터 체내의 기관들을 보호해주며, 체온조절 등의 생체 항상성 유지에 중요한 역할을 한다. 이러한 피부는 여러 가지 내외적 요인에 의해서 노화가 발생하며, 크게 유전적 원인에 의한 내인성 노화와 환경적 원인에 의한 외인성 노화로 구분된다. 이 중, 광노화는 자외선(ultraviolet; UV)에 의한 노화를 의미한다. 최근 환경오염으로 인한 오존층 파괴는 자외선의 양을 증가시켰고 이에 따라 광노화에 대한 연구가 주목되고 있다. 광노화 된 피부에서는 거칠어짐, 탄력 손실, 주름 발생 및 불규칙한 색소 침착 등과 같은 외관상의 특징이 관찰되며, 이 중 광노화의 주된 연구 분야는 피부 주름의 변화에 대한 것이다. 상기 광노화에 의한 피부 주름 형성에 관해 피부의 주요 구성성분인 콜라겐(collagen)의 합성, 분해 및 수분 함유량 등의 기초적인 생리 대사 변화에 대한 연구 결과가 다수 보고되고 있다. 특히 자외선에 의해 활성 산소종(reactive oxygen species) 생성이 증가되고 피부의 효소적, 비효소적 항산화 방어체계가 붕괴되어 콜라겐의 분해 증가 및 생합성을 감소시켜 진피층 내의 콜라겐이 현저하게 감소된다. 상기 콜라겐 감소에 큰 영향을 미치는 것은 콜라겐 분해 효소(MMPs; matrix metalloproteinases)로, 이는 세포외기질(extracellular matrix)과 기저막(basement membrane)의 분해에 관여한다. 상기 효소는 자외선에 의해 활성이 증가되며 이를 억제함으로써 자외선에 의해 유도되는 피부 두께 증가 및 주름 형성이 감소된다는 연구 결과들이 보고되어 있다. 따라서 광노화의 예방 및 치료를 위해서는 MMPs를 조절하는 것이 효과적인 방법으로 알려져 있다.
한편, 감초(
Glycyrrhiza
uralensis Fischer)는 모든 약의 독성을 조화시켜서 약효가 잘 나타나게 하며 장부의 한열과 사기를 다스리고 모든 혈맥의 소통을 잘 시키며 근육과 뼈를 튼튼하게 하는 것으로 알려져 있으며, 해독작용, 간염, 두드러기, 피부염, 습진 등에 효과가 있다. 진해·거담, 근육이완, 이뇨작용, 항염작용이 있으며 소화성궤양을 억제하는 것으로 알려져 있다.
또한, 대추는 조(棗) 또는 목밀(木蜜)이라고도 한다. 표면은 적갈색이며 타원형이고 길이 1.5∼2.5cm에 달하며 빨갛게 익으면 단맛이 있다. 과실은 생식할 뿐 아니라 채취한 후 푹 말려 건과(乾果)로서 과자 ·요리 및 약용으로 쓰인다.
또한, 반하(
Pinellia
ternata Breitenbach)는 다년생 초본으로 끼무릇이라고도 한다. 둥근 뿌리줄기는 지름이 1㎝이며, 한두개의 잎이 나오고, 작은 잎은 3개이다. 꽃은 6월과 7월경에 피고, 수꽃은 대가 없이 꽃밥만으로 이루어지며, 장과는 녹색이고 크기가 작다. 중국, 일본, 한국 등 동남아 전역에 분포하며 우리나라에서는 전국적으로 재배하고 있으나, 서울, 수원, 제주도, 울릉도 산이 유명한 것으로 알려져 있다. 반하는 거담작용이 있어서 호흡중추를 진정하며 기관지의 경련을 제거하여 해수를 경미케 한다.
또한, 생강(
Zingiber
officinale)은 특유의 향기와 매운맛 때문에 가정에서 식품원료인 향신료로 사용되어 왔으며, 다양한 활성 때문에 모든 한방 처방에 많이 사용되고 있다. 한약재의 원료로는 사용방법이 다양하며, 수확한 근경을 생강이라고 하며 생강의 근강을 찌거나 삶아서 건조한 것을 건강(乾薑)이라 하고, 불에 구워 말린 것을 흑강이라 칭한다. 생강은 소화액을 분비하여 식욕을 증진시키고 위장의 운동을 촉진하고 소화흡수를 도와주며, 또한 담을 없애고 기를 내리며 구토를 그치게 하고 풍한과 종기를 제거함과 동시에 천식에 사용된다. 또한 발한 해열약, 혈행장애, 감기풍한 등에 이용되고 있으며 방향신미 성분은 혈액순환과 체온을 증가시키며, 민간요법으로 감기와 기침을 치료하기 위해 생강즙에 꿀을 혼합하여 복용한다. 반면에 건강은 신진대사 기능이 저하되었을 때 이용되며 기침, 현기증, 손발이 찬 경우, 요통, 설사, 구토 등의 치료제로 활용된다. 또한, 구풍, 소화제로서 심기를 통하고 양을 돋우며 오장육부의 냉을 제거하는데 사용된다.
또한, 시호는 북시호·묏미나리라고도 한다. 풀밭에서 자라며 높이 40∼70cm이다. 포기 전체에 털이 없으며 가늘고 긴 줄기 위에서 가지가 갈라진다. 뿌리줄기는 굵고 짧다. 잎은 어긋나고 줄 모양이거나 바소꼴이며 가장자리가 밋밋하고 맥은 평행하다. 뿌리에 달린 잎은 밑부분이 좁아져서 잎자루처럼 되고 길이 10∼30cm이다. 줄기에 달린 잎은 4∼10cm, 나비 5∼15mm이고 끝이 뾰족하다. 해열·진통·강장제나 호흡기·소화기·순환기 질환에 약재로 쓴다.
또한, 인삼(ginseng C. A. Meyer)은 깊은 산악지대에서 자라는 식물로 흔히 재배하고 있다. 높이는 60㎝에 달하고, 근경(根莖: 뿌리와 줄기)은 짧으며 곧거나 비스듬히 서고, 밑에서 도라지 같은 뿌리가 발달한다. 근경 끝에서 1개의 원줄기가 나오고 끝에서 3, 4개의 잎이 윤생(輪生：돌려나기)하며 긴 엽병 끝에 5개의 장상복엽(손바닥 모양의 겹잎)이 달린다. 강장·강심·건위보정(健胃補精)·진정약으로 널리 상용되고, 위장기능 쇠약에 의한 신진대사기능의 저하에 진흥약(振興藥)으로 사용되며, 병약자의 위부정체감(胃部停滯感)·소화불량·구토·흉통(胸痛)·이완성하리(弛緩性下痢)·식욕부진 등에도 응용된다.
또한, 황금은 산지의 풀밭에서 자란다. 높이 20∼60cm이다. 여러 대가 나와 포기로 자라고 털이 있으며 가지가 갈라진다. 잎은 마주나고 바소꼴이며 가장자리가 밋밋하다. 꽃은 7∼8월에 피고 자주빛이 돌며 총상꽃차례로 한쪽으로 치우쳐서 달린다. 화관(花冠)은 밑부분에서 꼬부라져 곧게 서고 통형이며 길이 1.5∼2.5cm이고 입술 모양이다. 꽃받침은 종 모양이다. 뿌리를 해열·이뇨·지사·이담 및 소염제로 이용한다.
상기 감초, 대추, 반하, 생강, 시호, 인삼 및 황금의 피부 주름의 예방 또는 개선에 관한 선행기술로는 일본공개특허 제2013-203679호에 황금 추출물을 포함한 MMP-1 저해제가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2006-0027764호에 시호 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물이 개시되어 있으나, 본 발명의 한약재 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보습 및 주름 개선용 조성물에 관한 선행기술은 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 한약재 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보습 및 주름 개선용 조성물을 제공하고, 본 발명의 유효성분인 혼합 추출물이 세포 독성이 없으며, 자외선 조사에 의한 세포 손상으로부터 세포를 보호하고, 엘라스타아제 저해 활성이 현저하며, UV 조사에 의해 감소된 표피두께를 회복시키며, UV 조사에 의해 감소된 히알루론산 함량이 거의 정상 수준으로 회복되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 감초, 대추, 반하, 생강, 시호, 인삼 및 황금의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보습 및 피부 주름 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 감초, 대추, 반하, 생강, 시호, 인삼 및 황금의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보습 및 피부 주름 개선용 한약재 조성물을 제공한다.
본 발명은 한약재 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보습 및 피부 주름 개선용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 혼합 추출물이 자외선 조사에 의해 손상된 세포를 보호하며, 엘라스타아제의 발현을 현저하게 억제하는 것이다. 따라서 본 발명의 조성물은 피부 보습 및 피부 주름 개선용 건강기능식품에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 감초, 대추, 반하, 생강, 시호, 인삼 및 황금의 혼합 추출물과 상기 한약재 단독 추출물(비교군)의 세포생존률(%)을 확인하기 위하여, HaCaT 세포에 24시간 동안 각각의 시료를 농도별(10, 50, 100 및 200㎍/㎖)로 처리한 후, 수행한 MTS 어세이 결과이다.
도 2는 본 발명의 감초, 대추, 반하, 생강, 시호, 인삼 및 황금의 혼합 추출물과 상기 한약재 단독 추출물(비교군)의 처리가 UVB 조사에 따른 세포 보호효과가 있는지를 확인하기 위하여, HaCaT 세포(사람 각질형성 세포주)에 24시간 동안 각각의 시료를 농도별(50㎍/㎖ 및 100㎍/㎖)로 처리하고, 자외선(UV Crosslinker, UVP)을 30분 동안 조사한 후, 수행한 MTS 어세이 결과이다. Control은 아무것도 처리하지 않은 군으로, 자외선 조사 및 한약재 추출물 처리도 하지 않은 군이다.
도 3은 본 발명의 감초, 대추, 반하, 생강, 시호, 인삼 및 황금의 혼합 추출물과 상기 한약재 단독 추출물(비교군)의 처리에 따른 엘라스타아제 저해 활성을 확인한 결과이다. ****은 본 발명의 혼합 추출물을 처리한 군에서의 엘라스타아제 저해 활성(%)이 상기 한약재 단독 추출물에 비해 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로 p<0.0001임을 의미한다.
도 4는 본 발명의 감초, 대추, 반하, 생강, 시호, 인삼 및 황금의 혼합 추출물과 비교군인 상기 한약재들의 단독 추출물의 처리에 따른 히알루론산 함량 변화를 확인한 결과이다. ####은 아무것도 처리하지 않은 대조군(Control)에 비해 자외선 조사군(UVB)의 히알루론산 함량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로 p<0.0001임을 의미한다. $$$$는 자외선 조사군에 비해 본 발명의 혼합 추출물을 처리하고 자외선을 조사한 실험군의 히알루론산 함량이 유의미하게 증가하였다는 것으로 p<0.0001임을 의미한다. **, ****은 본 발명의 혼합 추출물의 함량이 한약재 단독 추출물에 비해 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, **는 p<0.01이고, ****은 p<0.0001임을 의미한다.
도 5는 UV 조사에 의해 증가한 표피 두께가 본 발명의 감초, 대추, 반하, 생강, 시호, 인삼 및 황금의 혼합 추출물을 투여하여 표피 두께의 감소와 콜라겐의 증가를 확인한 결과이다. A는 H&E 염색결과이고, B는 Masson's trichome 염색 결과이며, C는 표피 두께를 나타낸다. #은 정상군에 비해 자외선 조사군의 표피 두께가 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것이고, p<0.05이다. *는 자외선 조사군에 비해 본 발명의 혼합 추출물을 처리한 군의 표피 두께가 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로 p<0.05이다.
도 6은 UV 조사에 의해 감소한 히알루론산의 함량이 본 발명의 혼합 추출물을 투여하여 증가한 것을 확인한 결과이다. #는 정상군 대비 UV 조사군에서의 히알루론산 함량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.05임을 의미하며, *는 UV 조사군에 대비하여 본 발명의 혼합 추출물을 투여한 군에서의 히알루론산 함량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것이며, p<0.05이다.
본 발명은 감초, 대추, 반하, 생강, 시호, 인삼 및 황금의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보습 및 피부 주름 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
상기 감초, 대추, 반하, 생강, 시호, 인삼 및 황금의 혼합 추출물은 한의학상의 처방으로 '소시호탕'이라고 지칭하는 것이다.
상기 감초, 대추, 반하, 생강, 시호, 인삼 및 황금의 혼합 추출물은 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다:
(1) 감초, 대추, 반하, 생강, 시호, 인삼 및 황금의 혼합물에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
(2) 단계 (1)의 추출물을 여과하는 단계; 및
(3) 단계 (2)의 여과한 추출물을 감압 농축하고 건조하여 추출물을 제조하는 단계.
상기 단계 (1)에서 추출용매는 물, C
1~C
4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물 중에서 선택하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 에탄올이고, 더욱더 바람직하게는 70%(v/v) 에탄올이지만 이에 한정하지 않는다.
상기 제조방법에 있어서, 추출방법은 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 당 업계에 공지된 모든 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 상기 추출용매는 건조된 감초, 대추, 반하, 생강, 시호, 인삼 및 황금의 혼합물의 중량에 대하여 1~20배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 5~15배 첨가하는 것이다. 추출온도는 4~50℃인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 0.5~10시간인 것이 바람직하며, 0.5~5시간이 더욱 바람직하고, 1 시간이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 방법에 있어서, 단계 (3)의 감압농축은 진공 감압 농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무 건조 또는 동결 건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 감초, 대추, 반하, 생강, 시호, 인삼 및 황금의 혼합 추출물은 18~26중량% 시호, 8~12중량%의 인삼, 5~7중량%의 감초, 9~14중량%의 대추, 31~46중량%의 황금, 8~13중량%의 반하 및 0.8~1.2중량%의 생강의 혼합 추출물인 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 감초, 대추, 반하, 생강, 시호, 인삼 및 황금의 혼합 추출물은 엘라스타아제 저해 활성이 우수한 것이 특징이며, 특히, 상기 혼합 추출물에 함유된 단독의 한약재 추출물을 단독으로 사용하는 것에 비해 엘라스타아제 저해 활성이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것이 특징이다.
상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등), 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 감초, 대추, 반하, 생강, 시호, 인삼 및 황금의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보습 및 피부 주름 개선용 한약재 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 한약재 조성물은 한의학적 처방에 의해 제조되는 것을 의미하지만 이에 한정하는 것은 아니다. 또한, 한의사의 처방에 의해 상기 혼합 추출물을 구성하는 한약재 추출물의 일부를 제외하거나, 임의로 추가할 수 있다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 감초, 대추, 반하 , 생강, 시호, 인삼 및 황금의 혼합 추출물의 제조
감초, 대추, 반하, 생강, 시호, 인삼 및 황금 각각의 총중량에 대하여 10배량에 해당되는 물을 첨가하여 3시간씩 2회 환류냉각 추출하고, 여과지를 이용하여 얻어진 여액을 감압농축기로 용매를 제거함으로써 각각의 추출물을 제조하였고, 0.64g의 시호, 0.3g의 인삼, 0.17g의 감초, 0.34g의 대추, 1.13g의 황금, 0.31g의 반하, 0.03g의 생강을 혼합하여 상기 추출방법과 동일한 방법으로 본 발명의 혼합추출물을 제조하였다.
실시예 2. 세포 생존율 분석
세포 생존율 분석은 HaCaT 세포를 이용하였으며, HaCaT 세포는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM, Gibco)에 10% 소태아 혈청(Fetal bovine serum;FBS, Gibco)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin;PS, Gibco)이 함유된 배지에서 37℃, 5% CO
2 조건에서 배양하였다.
상기 추출한 시호, 인삼, 감초, 대추, 황금, 반하 추출물 및 혼합 추출물을 농도별(10, 50, 100, 200㎍/㎖)로 희석하여, 배양한 HaCaT 세포에 24시간 동안 처리하고, MTS 어세이(CellTiter Aqueous One Solution Cell proliferation assay kit, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophynyl)-2H-tetrazolium, inner salt; MTS, Promega Co. Madison, WI, USA) 기법으로 세포 생존율을 490nm에서 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였다.
그 결과, 도 1에 개시한 바와 같이 본 발명의 시료를 처리하였을 때의 상대적 세포 생존율(%)이 다소 증가하였거나 유지하였다. 따라서, 본 발명의 혼합추출물은 세포 독성이 거의 없다는 것을 알 수 있었다.
실시예 3. 자외선 조사에 따른 세포 보호 효과 확인
HaCaT 세포에 24시간 동안 각각의 시료를 농도별로 희석하여 처리하고 자외선(UV Crosslinker, UVP)을 30분간 조사한 후, MTS 어세이(CellTiter Aqueous One Solution Cell proliferation assay kit, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophynyl)-2H-tetrazolium, inner salt; MTS, Promega Co. Madison, WI, USA) 기법으로 세포 생존능을 490nm에서 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 로 측정하여 시험하였다.
그 결과 도 2에 개시한 바와 같이 UVB 조사에 의해 세포생존률(%)이 약 50% 정도 감소한 것을 확인할 수 있었고, UV 조사 후, 본 발명의 혼합 추출물을 처리한 경우 세포 생존률(%)이 증가하는 것을 확인하여 본 발명의 혼합 추출물이 세포보호 효과가 있다고 판단하였다.
실시예 4. 엘라스타아제 저해 활성 확인
본 발명의 시료 및 상기 시료를 구성하는 각각의 한약재 단독 추출물의 엘라스타아제 저해 활성을 확인하기 위하여, 트리스 완충 용액(0.2M Tris buffer, pH 8.0) 140㎕와 1mg/㎖의 각각의 시료 20㎕ 및 5mM N-Succinyl-Ala-Ala-p-nitroanilide (Sigma S4760) 20㎕씩 기질 용액을 첨가한 후, 10㎍/㎖의 엘라스타아제(Sigma, E7885) 20㎕를 잘 혼합하여 상온에서 15분 동안 반응시킨 후, 410nm에서 생성된 p-nitroanline의 양을 마이크로플레이트 리더기로 측정하였다. 양성대조군으로 아스코르브산을 사용하였다.
그 결과, 도 3에 개시한 바와 같이 본 발명의 혼합 추출물뿐만 아니라, 단독의 한약재 추출물 모두 엘라스타아제 저해 활성이 있는 것으로 나타났다. 특히, 단독의 한약재 추출물에 비해 혼합 추출물의 엘라스타아제 저해 활성이 통계적으로 유의미하게 증가된 것을 확인하였다.
실시예 5. 히알루론산의 발현량 분석
HaCaT 세포에 24시간 동안 각각의 시료를 농도별로 희석하여 처리하고 자외선(UV Crosslinker, UVP)을 30분간 조사한 후, 각 실험군의 상층액을 모아 히알루론산 ELISA kit (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 세포에서 발현된 히알루론산의 발현량을 측정하였다. 반응물은 흡광 어세이를 수행하여 히알루론산의 발현량을 450nm에서 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 로 측정한 후 정량하였다.
그 결과, 도 4에 개시한 바와 같이, 자외선 조사에 의해 히알루론산 함량이 감소하였고, 본 발명의 혼합 추출물뿐만 아니라, 단독의 한약재 추출물을 처리한 군은 모두 히알루론산 함량이 증가한 것으로 나타났으나, 단독의 한약재 추출물에 비해 혼합 추출물의 히알루론산 함량의 증가가 통계적으로 유의미하게 증가한 것으로 나타났다.
실시예 6. 피부의 조직학적 분석
피부의 조직학적 변화를 분석하기 위하여, 무모생쥐군에게 1일 1회 100mg/kg의 양으로 본 발명의 혼합 추출물을 투여하기를 주5회 실시하였으며, 동시에 주3회 2일 간격으로 주3회 자외선을 조사하였는데, 이를 총 12주 동안 실시하였다.
이후, 주름억제 효능을 확인하기 위하여, 아무것도 실시하지 않는 정상군, 자외선 조사군(주3회 12주 동안 자외선을 조사한 군)과 자외선 조사 및 본 발명의 혼합 추출물을 경구 투여한 동물모델군의 피부조직을 적출하여 조직염색을 실시하였다.
상기 각 실험군의 피부조직을 적출하여 10% 중성 포르말린 용액에 고정한 후 수세, 탈수, 투명, 침투 과정을 거친 다음 파라핀으로 포매하고 4μm 두께로 절편을 만든 후 H&E(Hematoxylin & Eosin) 염색 및 Masson's trichome 염색을 실시하였다. H&E 염색을 실시한 조직의 케라틴층에서 표피세포 기저막(epidermal basement membrane)까지의 두께를 현미경에 장착된 자를 이용하여 측정하였다.
H&E 염색 결과에서 보는 바와 같이 자외선 조사군은 자외선을 처리하지 않은 대조군에 비해서 각질층이 일어났고 표피두께 또한 증가된 것을 확인할 수 있었고 혼합 추출물을 투여한 결과 각질층이 완화되었으며 표피두께가 감소함을 확인할 수 있었다(도 5A). H&E 염색을 실시한 조직의 케라틴층에서 표피 기저 막까지의 두께를 현미경에 장착된 자를 이용하여 측정한 결과 자외선 조사군에서 표피 두께가 증가되었고, 혼합 추출물을 투여한 결과 표피의 두께가 감소하였음을 확인하였다(도 5C). 또한, Masson's trichome 염색결과에서 보는 바와 같이, 자외선을 조사한 군에서는 각질층이 굵게 형성되었으며, 콜라겐 섬유가 관찰되지 않았다. 그러나 혼합 추출물을 투여한 군에서는 콜라겐 섬유가 자외선 조사군에 비해서 증가함을 확인하였다(도 5B).
실시예 7. 히알루론산의 함량 분석
피부 보습 기능과 피부 장벽 손상을 방지하는 역할을 하며, 자외선 손상에 의하여 함량이 감소하는 히알루론산(hyaluronic acid)의 함량 변화를 확인하기 위하여, 각 실험군의 피부조직에서 히알루론산을 추출하여 히알루론산 ELISA kit(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 히알루론산의 함량을 측정하였다. 반응물은 흡광 어세이를 수행하여 히알루론산의 함량을 정량 분석하였다.
그 결과, 자외선을 조사한 군(vehicle)에서 히알루론산의 함량이 감소하는 것을 확인하였고, 본 발명의 혼합 추출물을 처리한 군에서는 히알루론산의 함량이 증가되어 자외선 조사에 의해 손상된 보습 기능이 증가된 것을 확인하였다(도 6).
Claims (6)
- 감초, 대추, 반하, 생강, 시호, 인삼 및 황금의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보습 및 피부 주름 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 감초, 대추, 반하, 생강, 시호, 인삼 및 황금의 혼합 추출물의 추출용매는 물, C 1~C 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 피부 보습 및 피부 주름 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 18~26중량%의 시호, 8~12중량%의 인삼, 5~7중량%의 감초, 9~14중량%의 대추, 31~46중량%의 황금, 8~13중량%의 반하 및 0.8~1.2중량%의 생강의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 보습 및 피부 주름 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 엘라스타아제 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는 피부 보습 및 피부 주름 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 피부 보습 및 피부 주름 개선용 건강기능식품 조성물.
- 감초, 대추, 반하, 생강, 시호, 인삼 및 황금의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보습 및 피부 주름 개선용 한약재 조성물.
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