CN113281449B - 小柴胡制剂的薄层鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种小柴胡制剂的薄层鉴别方法，属于中药制剂检测技术领域。该鉴别方法包括以下步骤：供试品制备：取小柴胡制剂供试品，加水溶解后上样至C18固相萃取小柱，经萃取得供试品溶液，备用；对照品制备：分别取甘草、黄芩、人参和柴胡对照药材，加入水作为溶剂提取，并将提取液上样至C18固相萃取小柱，经萃取得对照药材溶液，备用；薄层展开：分别吸取上述供试品溶液和对照药材溶液，点于硅胶薄层板上，以展开剂展开；显色检视：将上述薄层板晾干，进行显色并检视，将供试品斑点与对照药材斑点进行对比鉴别。该方法用一板多测的方法对小柴胡颗粒中的黄芩、甘草、人参和柴胡进行薄层鉴别，且重现性好，可以作为该品种的鉴别方法。

Description

小柴胡制剂的薄层鉴别方法

技术领域

本发明涉及中药制剂检测技术领域，特别是涉及一种小柴胡制剂的薄层鉴别方法。

背景技术

小柴胡汤是东汉张仲景所著《伤寒杂病论》中的千古名方，是和解少阳方中的代表，该方由柴胡、黄芩、人参、炙甘草、姜半夏、生姜和大枣组成，具有解表散热、舒肝和胃的功能。

《中国药典》2020版一部收载了由小柴胡汤运用现在制药技术研制的小柴胡片、小柴胡泡腾片、小柴胡胶囊和小柴胡颗粒，其中使用最多的是小柴胡颗粒。小柴胡颗粒鉴别项下分别采用了三种TLC的方法分别对黄芩、甘草和柴胡进行定性鉴别，然而，三个鉴别项的前处理方法均较复杂，同时也需要用到大量的有机溶剂，存在一定的不足。

在中药分析中，由于含量低且共存成分负责，供试液分离纯化有很大的难度，严重制约了分析的专属性和重现性。

固相萃取法(Solid Phase Extraction，SPE)，是指通过样品中的待测成分及杂质在液相与固定相之间相互作用的不同而达到分离的方法。其作用机理是色谱分离的过程，但却是一种特殊的“开关式”色谱，即可以选择性地“关闭”某些成分，同时对另外的一些组分则完全开通，并因此而去除干扰物，纯化、浓缩所需要的组分。

然而，目前还没有研究者将固相萃取方法成功应用于小柴胡品种的鉴定中。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种小柴胡制剂的薄层鉴别方法，采用C18SPE小柱对样品进行纯化，用一板多测的方法对小柴胡制剂(颗粒)中的黄芩、甘草、人参和柴胡进行薄层鉴别，优化了小柴胡制剂的薄层鉴别方法。

一种小柴胡制剂的薄层鉴别方法，包括以下步骤：

供试品制备：取小柴胡制剂供试品，加水溶解后上样至C18固相萃取小柱，以水洗脱，弃去洗脱液，再以梯度浓度的乙醇水溶液洗脱，分别收集洗脱液，回收溶剂后得残渣，所得残渣以有机溶剂溶解，得供试品溶液，备用；

对照品制备：分别取甘草、黄芩、人参和柴胡对照药材，加入水作为溶剂提取，并将提取液上样至C18固相萃取小柱，以水洗脱，弃去洗脱液，再以预定浓度的乙醇水溶液洗脱，分别收集洗脱液，回收溶剂后得残渣，所得残渣分别以有机溶剂溶解，得甘草对照药材溶液，黄芩对照药材溶液、人参对照药材溶液和柴胡对照药材溶液，备用；

薄层展开：分别吸取上述供试品溶液和对照药材溶液，点于硅胶薄层板上，以展开剂展开，所述展开剂为三氯甲烷-甲醇-水的混合溶剂，所述三氯甲烷-甲醇-水的体积比为13±1：6±0.5：1±0.2；

显色检视：将上述薄层板晾干，进行显色并检视，将供试品斑点与对照药材斑点进行对比鉴别。

本发明的小柴胡制剂的薄层鉴别方法，使用固相萃取法对小柴胡制剂(颗粒)进行分离纯化，然后用一个薄层色谱条件同时对其中的柴胡、人参、甘草、黄芩进行鉴别研究，简化了实验方法，减少有机溶剂的使用量。

在其中一个实施例中，所述供试品制备步骤中：

所述C18固相萃取小柱预先用0.5-1柱体积的甲醇活化，再用1-2柱体积的水平衡；

所得残渣以乙醇溶解。

预先对C18固相萃取小柱进行活化平衡，可保证分离纯化的效果。

在其中一个实施例中，所述供试品制备步骤中，所述梯度浓度的乙醇水溶液分别为20±5％乙醇、30±5％乙醇和95±5％乙醇，分别得到供试品溶液一、供试品溶液二和供试品溶液三。

以上述特定体积百分比，浓度的乙醇水溶液洗脱，可分别获得针对不同药材的特征性成分，以便在后续薄层色谱中展开，针对不同药材进行鉴别。

在其中一个实施例中，所述供试品制备步骤中，先以4.2±1个柱体积的水洗脱，再分别以20±5％乙醇洗脱4.2±1个柱体积、以30±5％乙醇洗脱4.2±1个柱体积、以95±5％乙醇洗脱4.2±1个柱体积。

在其中一个实施例中，所述对照品制备步骤中，按照下述方法分别制备对照药材溶液：

甘草对照药材溶液的制备：取甘草对照药材，加水回流提取，离心，取上清液加入C18固相萃取小柱中，用水洗脱，弃去洗脱液，然后用20±5％乙醇水溶液洗脱，洗脱液蒸干后，残渣用醇溶解，即得甘草对照药材溶液；

黄芩对照药材溶液的制备：取黄芩对照药材，加水回流提取，离心，取上清液加入C18固相萃取小柱中，用水洗脱，弃去洗脱液，然后用20±5％乙醇水溶液洗脱，洗脱液蒸干后，残渣用醇溶解，即得黄芩对照药材溶液；

人参对照药材溶液的制备：取人参对照药材，加水回流提取，离心，取上清液加入C18固相萃取小柱中，分别用水和20±5％乙醇水溶液洗脱，弃去洗脱液，然后用30±5％乙醇水溶液洗脱，洗脱液蒸干后，残渣用醇溶解，即得人参对照药材溶液；

柴胡对照药材溶液的制备：取柴胡对照药材，加水回流提取，离心，取上清液加入C18固相萃取小柱中，分别用水、20±5％乙醇水溶液和30±5％乙醇水溶液洗脱，弃去洗脱液，然后用95±5％乙醇水溶液洗脱，洗脱液蒸干后，残渣用醇溶解，即得柴胡对照药材溶液。

以上述方法对对照药材进行提取分离纯化，可将各药材中与小柴胡制剂相对应的特征成分提取，能够全面准确表征、评价和鉴别小柴胡制剂中相应药味。

在其中一个实施例中，所述对照品制备步骤中，按照下述方法分别制备对照药材溶液：

甘草对照药材溶液的制备：取甘草对照药材1g，加水20ml回流提取1小时，离心，取上清液10ml加入柱体积为6ml的C18固相萃取小柱中，用25ml水洗脱，弃去洗脱液，然后用25ml 20％乙醇水溶液洗脱，洗脱液蒸干后，残渣用1ml乙醇溶解，即得甘草对照药材溶液；

黄芩对照药材溶液的制备：取黄芩对照药材1g，加水20ml回流提取1小时，离心，取上清液10ml加入柱体积为6ml的C18固相萃取小柱中，用25ml水洗脱，弃去洗脱液，然后用25ml 20％乙醇水溶液洗脱，洗脱液蒸干后，残渣用1ml乙醇溶解，即得黄芩对照药材溶液；

人参对照药材溶液的制备：取人参对照药材1g，加水20ml回流提取1小时，离心，取上清液10ml加入柱体积为6ml的C18固相萃取小柱中，分别用水和20％乙醇水溶液各25ml洗脱，弃去洗脱液，然后用25ml 30％乙醇水溶液洗脱，洗脱液蒸干后，残渣用1ml乙醇溶解，即得人参对照药材溶液；

柴胡对照药材溶液的制备：取柴胡对照药材2g，加水20ml回流提取1小时，离心，取上清液10ml加入柱体积为6ml的C18固相萃取小柱中，分别用水、20％乙醇水溶液和30％乙醇水溶液各25ml洗脱，弃去洗脱液，然后用25ml 95％乙醇洗脱，洗脱液蒸干后，残渣用1ml乙醇溶解，即得柴胡对照药材溶液。

在其中一个实施例中，所述薄层展开步骤中，以展开剂展开8±1cm。经过试验筛选，将薄层色谱展开至8±1的展距，具有斑点清晰，分离度佳，鉴别效果好的优势。

在其中一个实施例中，所述显色检视步骤中，按照以下方法进行：

1)取薄层板，置紫外光灯下检视，将供试品溶液一斑点与黄芩对照药材溶液斑点进行对比；

2)对薄层板喷以对苯二甲氨基苯甲醛的硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰，置紫外光灯下检视，将供试品溶液一斑点与甘草对照药材溶液斑点进行对比；将供试品溶液二斑点与人参对照药材溶液斑点进行对比；将供试品溶液三斑点与柴胡对照药材溶液斑点进行对比。

按照上述方法检视，可以在一块薄层板上对小柴胡颗粒中的黄芩、甘草、人参和柴胡进行薄层鉴别，具有高效、便捷的优势。

在其中一个实施例中，所述显色检视步骤中，按照以下方法进行：

1)取薄层板，置紫外光灯254nm下检视，将供试品溶液一斑点与黄芩对照药材溶液斑点进行对比；

2)对薄层板喷以1％对苯二甲氨基苯甲醛的10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯366nm下检视，将供试品溶液一斑点与甘草对照药材溶液斑点进行对比；将供试品溶液二斑点与人参对照药材溶液斑点进行对比；将供试品溶液三斑点与柴胡对照药材溶液斑点进行对比。

在其中一个实施例中，所述鉴别方法还包括阴性对照溶液制备步骤，所述阴性对照溶液制备步骤中，分别按照处方比例，称取缺甘草、缺黄芩、缺柴胡和缺人参的处方，按小柴胡制剂的标准制法煎煮，按所述供试品制备步骤中的方法，分别制备甘草、黄芩、柴胡和人参阴性对照溶液；

所述薄层展开步骤中，同样将所述阴性对照溶液点于硅胶薄层板上。

在其中一个实施例中，所述小柴胡制剂为颗粒剂。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种小柴胡制剂的薄层鉴别方法，使用固相萃取法对小柴胡颗粒进行分离纯化，然后用一个薄层色谱条件同时对其中的柴胡、人参、甘草、黄芩进行鉴别研究，简化了实验方法，减少有机溶剂的使用量。

且该方法用一板多测的方法对小柴胡颗粒中的黄芩、甘草、人参和柴胡进行薄层鉴别，进一步优化了小柴胡颗粒的薄层鉴别方法。

该方法能快速纯化和分离小柴胡颗粒中的不同成分，重现性好，可以作为该品种的鉴别方法。

附图说明

图1为实施例1中小柴胡颗粒薄层色谱图(T：25℃，RH：66％)；

其中A为显色前254nm检视，B为显色后366nm检视。

图2为实施例2中不同洗脱溶剂比较薄层色谱图(T：25℃，RH：66％)；

其中A为显色前254nm检视，B为显色后366nm检视。

图3为实施例2中不同品牌C18固相萃取小柱分离效果比较(T：25℃，RH：33％)；

其中A为20％乙醇洗脱，B为40％乙醇洗脱，C为95％乙醇洗脱。

图4为实施例2中低温试验薄层色谱图(T：5℃，RH：66％)；

其中A为显色前254nm检视，B为显色后366nm检视。

图5为实施例2中高湿试验薄层色谱图(T：30℃，RH：88％)；

其中A为显色前254nm检视，B为显色后366nm检视。

图6为实施例2中低湿试验薄层色谱图(T：25℃，RH：32％)；

其中A为显色前254nm检视，B为显色后366nm检视。

图7为实施例2中国产预制板薄层色谱图(T：25℃，RH：66％)；

其中A为显色前254nm检视，B为显色后366nm检视。

图8为对比例1中薄层色谱图；

其中A为展开剂三氯甲烷-甲醇-水，B为展开剂氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水。

图9为对比例2中薄层色谱图；

其中A为2％对二甲氨基苯甲醛的10％硫酸乙醇溶液显色，B为10％硫酸乙醇溶液显色。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

以下实施例中所用仪器和材料如下，其它材料如无特别说明，均为市售可得。

仪器：电子天平(METTLER ME2002E，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)、超声波清洗器(KQ-300DE，昆山市超声仪器有限公司)、恒温水浴锅(HWS-26型)、平面色谱点样仪(SPDY-1A，南京迈科理特科学仪器有限公司)

材料：硅胶G薄层预制板(青岛海洋化工厂)、硅胶G薄层预制板(德国Merck)、C18固相萃取小柱(岛津5010-81004，500mg，6ml)、C18固相萃取小柱(Waters，WAT020515，500mg，6ml)、C18固相萃取小柱(安谱，CNW，2.CA0954.0000，500mg，6ml)；试剂均为分析纯。柴胡对照药材(批号：120992-201509)、黄芩对照药材(批号：120955-201309)、人参对照药材(批号：120917-201110)，甘草对照药材(批号：120904-201519，)均采购于中国药品生物制品鉴定研究院。小柴胡颗粒(批号：20191218、20200115、20200226)由广东志道医药科技有限公司生产。

实施例1

一种小柴胡制剂的薄层鉴别方法，包括以下步骤：

1、供试品制备

取1g小柴胡颗粒供试品，加水10ml振摇使溶解，然后加入至C18固相萃取小柱(C18固相萃取小柱预先用5ml甲醇活化，再用10ml水平衡好)中，用25ml水洗脱，弃去洗脱液，然后分别用体积百分浓度20％乙醇水溶液(以下简称20％乙醇)、30％乙醇水溶液(以下简称30％乙醇)和95％乙醇水溶液(以下简称95％乙醇)各25ml洗脱，分别收集三种洗脱液，水浴蒸干后，残渣分别用1ml乙醇溶解，即得供试品溶液、供试品溶液二和供试品溶液，备用。

2、对照品制备

2.1甘草对照药材溶液制备。

取甘草对照药材1g，加水20ml回流1小时后，放冷离心，取上清液10ml加入C18固相萃取小柱(C18固相萃取小柱预先用5ml甲醇活化，再用10ml水平衡好)中，用25ml水洗脱，弃去洗脱液，然后用25ml 20％乙醇洗脱，洗脱液水浴蒸干后，残渣用1ml乙醇溶解，即得甘草对照药材溶液。

2.2黄芩对照药材溶液制备。

取黄芩对照药材1g，加水20ml回流1小时后，放冷离心，取上清液10ml加入C18固相萃取小柱(C18固相萃取小柱预先用5ml甲醇活化，再用10ml水平衡好)中，用25ml水洗脱，弃去洗脱液，然后用25ml 20％乙醇洗脱，洗脱液水浴蒸干后，残渣用1ml乙醇溶解，即得黄芩对照药材溶液。

2.3人参对照药材溶液制备。

取人参对照药材1g，加水20ml回流1小时后，放冷离心，取上清液10ml加入C18固相萃取小柱(C18固相萃取小柱预先用5ml甲醇活化，再用10ml水平衡好)中，分别用水和20％乙醇各25ml洗脱，弃去洗脱液，然后用25ml 30％乙醇洗脱，洗脱液水浴蒸干后，残渣用1ml乙醇溶解，即得人参对照药材溶液。

2.4柴胡对照药材溶液制备。

取柴胡对照药材2g，加水20ml回流1小时后，放冷离心，取上清液10ml加入C18固相萃取小柱(C18固相萃取小柱预先用5ml甲醇活化，再用10ml水平衡好)中，分别用水、20％乙醇和30％乙醇各25ml洗脱，弃去洗脱液，然后用25ml 95％乙醇洗脱，洗脱液水浴蒸干后，残渣用1ml乙醇溶解，即得柴胡对照药材溶液。

3，阴性对照溶液制备

按照小柴胡颗粒处方比例，称取缺甘草及缺黄芩、缺柴胡及缺人参的处方，按标准的制法煎煮，取相当于1g颗粒的煎煮液，按上述供试品制备方法，分别制备甘草、黄芩、柴胡及人参阴性对照溶液。

4、薄层展开

薄层色谱条件：照薄层色谱法(《中国药典》四部通则0502)试验，吸取上述三种供试品溶液、四种对照药材溶液和四种阴性对照溶液各2μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13：6：1)为展开剂，展开8cm，取出。

5、显色检视

将上述薄层板晾干，置紫外光灯(254nm)下检视，供试品溶液一色谱中，在与黄芩对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

再喷以1％对苯二甲氨基苯甲醛的10％硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰，置紫外光灯(366nm)下检视，供试品小柴胡颗粒色谱中，在与甘草对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。供试品溶液二色谱中，在与人参对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。供试品溶液三色谱中，在与柴胡对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

6、结果

取由广东志道医药科技有限公司生产，批号分别为20191218、20200115、20200226的三个批次小柴胡颗粒，按照上述方法进行试验。

所得薄层色谱图见图1，其中A为显色前254nm检视，B为显色后366nm检视照片；各条带编号为：

1、供试品一(批号：20191218)； 10、供试品溶液二(批号：20200226)；

2供试品溶液一(批号：20200115)； 11、人参对照药材；

3、供试品溶液一(批号：20200226)； 12、人参阴性；

4、黄芩对照药材； 13、供试品溶液三(批号：20191218)；

5、黄芩阴性； 14、供试品溶液三(批号：20200115)；

6、甘草对照药材； 15、供试品溶液三(批号：20200226)；

7、甘草阴性； 16、柴胡对照药材；

8、供试品溶液二(批号：20191218)； 17、柴胡阴性；

9、供试品溶液二(批号：20200115)。

上述结果说明，不同批次供试品之间重复性良好，阴性对照无干扰，说明该鉴别方法可用于这四种药材的薄层鉴别。

实施例2

本实施例对实施例1的鉴别方法中各条件进行筛选考察。

1、洗脱条件考察

取小柴胡颗粒样品(批号：20200115)，加水溶解，分别加入2支已活化的C18固相萃取小柱(安谱)，用不同浓度的乙醇和甲醇分别洗脱，收集所有的洗脱液，点于同一GF254薄层板上，然后展开，用实施例1中的方法检视，色谱图见图2。

图中各条带的编号如下：

1、水洗脱； 2、10％甲醇洗脱； 3、20％甲醇洗脱； 4、30％甲醇洗脱；

5、40％甲醇洗脱； 6、100％甲醇洗脱； 7、甘草对照药材； 8、人参对照药材；

9、柴胡对照药材； 10、10％乙醇洗脱； 11、20％乙醇洗脱； 12、30％乙醇洗脱；

13、40％乙醇洗脱； 14、95％乙醇洗脱。

结果显示，乙醇洗脱的分离效果较好。确定黄芩和甘草的洗脱溶液为20％乙醇、人参的洗脱溶液为30％乙醇、柴胡的洗脱溶剂为95％乙醇。

2、不同品牌C18固相萃取小柱考察

取小柴胡颗粒样品(批号：20200115)，按照实施例1的方法，用不同品牌的C18固相萃取小柱(安谱、岛津和沃特世)，分别制备20％乙醇洗脱、40％乙醇洗脱及95％乙醇洗脱的供试品溶液，展开，检视，色谱图见图3。

图中各条带的编号如下：

1、岛津柱； 2、安谱柱； 3、沃特世柱； 4、甘草对照药材；

5、岛津柱； 6、安谱柱； 7、沃特世柱； 8、人参对照药材；

9、岛津柱； 10、安谱柱； 11沃特世柱； 12、柴胡对照药材。

结果显示，不同品牌的固相萃取小柱分离纯化的效果均较好，该前处理方法可行。

3、温度考察

将点样后的薄层板按照实施例1的条件，置于冰箱中展开，然后检视，色谱图见图4。

图中各条带的编号如下：

1、供试品溶液一(批号：20191218)； 10、供试品溶液二(批号：20200226)；

2供试品溶液一(批号：20200115)； 11、人参对照药材；

3、供试品溶液一(批号：20200226)； 12、人参阴性；

4、黄芩对照药材； 13、供试品溶液三(批号：20191218)；

5、黄芩阴性； 14、供试品溶液三(批号：20200115)；

6、甘草对照药材； 15、供试品溶液三(批号：20200226)；

7、甘草阴性； 16、柴胡对照药材；

8、供试品溶液二(批号：20191218)； 17、柴胡阴性；

9、供试品溶液二(批号：20200115)。

结果显示，低温条件下，各药材斑点均能较好分离，说明温度对该方法的影响较小。

4、湿度考察

将点样后的薄层板按照实施例1的条件，置于高湿(T：30℃，RH：88％)和低湿(T：25℃，RH：32％)环境中展开，然后检视，色谱图分别见图5和图6。

图中各条带的编号如下：

1、供试品溶液一(批号：20191218)； 10、供试品溶液二(批号：20200226)；

2、供试品溶液一(批号：20200115)； 11、人参对照药材；

3、供试品溶液一(批号：20200226)； 12、人参阴性；

4、黄芩对照药材； 13、供试品溶液三(批号：20191218)；

5、黄芩阴性； 14、供试品溶液三(批号：20200115)；

6、甘草对照药材； 15、供试品溶液三(批号：20200226)；

7、甘草阴性； 16、柴胡对照药材；

8、供试品溶液二(批号：20191218)； 17、柴胡阴性；

9、供试品溶液二(批号：20200115)。

结果显示，高湿和低湿条件下，各药材斑点均能较好分离，说明湿度对该方法的影响较小。

5、不同薄层板考察

用国产青岛预制GF254薄层板点样，然后按照实施例1的条件展开，然后检视，色谱图见图7。

图中各条带的编号如下：

1、供试品溶液一(批号：20191218)； 10、供试品溶液二(批号：20200226)；

2、供试品溶液一(批号：20200115)； 11、人参对照药材；

3、供试品溶液一(批号：20200226)； 12、人参阴性；

4、黄芩对照药材； 13、供试品溶液三(批号：20191218)；

5、黄芩阴性； 14、供试品溶液三(批号：20200115)；

6、甘草对照药材； 15、供试品溶液三(批号：20200226)；

7、甘草阴性； 16、柴胡对照药材；

8、供试品溶液二(批号：20191218)； 17、柴胡阴性；

9、供试品溶液二(批号：20200115)。

结果显示，国产预制薄层板虽然分离度不如进口Merck薄层板，但仍能满足药材的鉴别，说明该方法对薄层板的选择性不高。

综上，本实施例通过不同条件下的验证结果可以说明该方法的色谱斑点清晰，专属性强，重复性好，且操作简便，避免使用大量的有机溶剂，可以作为小柴胡颗粒的薄层鉴别方法。

对比例1

一种小柴胡制剂的薄层鉴别方法，参照实施例1的方法，区别在于，本对比例中所选用展开剂为《中国药典》一部人参药材薄层鉴别的展开剂：氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15：40：22：10)10℃以下放置的下层溶液。

结果如图8所示，图8中A为采用实施例1相同展开剂(三氯甲烷-甲醇-水(13：6：1))展开薄层色谱图，B为本对比例展开剂(氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15：40：22：10))展开薄层色谱图。其中：1为柴胡阴性对照；2为柴胡对照药材；3为柴胡皂苷a、d对照品；4为供试品；5为人参皂苷Rg1、Rb1、Re对照品；6为人参对照药材；7为人参阴性对照。

结果显示Rf值约0.45附近，人参和柴胡的斑点分离度不佳。

对比例2

一种小柴胡制剂的薄层鉴别方法，参照实施例1的方法，区别在于，本对比例中所选用显色剂为10％硫酸乙醇。

结果如图9所示，图9中A为采用实施例1相同显色剂(2％对二甲氨基苯甲醛的10％硫酸乙醇溶液)显色薄层色谱图，B为本对比例显色剂(10％硫酸乙醇溶液)显色薄层色谱图。其中：1为柴胡阴性对照；2为柴胡对照药材；3为柴胡皂苷a、d对照品；4为供试品；5为人参皂苷Rg1、Rb1、Re对照品；6为人参对照药材；7为人参阴性对照。

结果显示柴胡对照药材和人参对照药材的斑点颜色一致，不能很好区分，稍有干扰。

对比例3

一种小柴胡制剂的薄层鉴别方法，参照实施例1的方法，区别在于，本对比例中所选用显色方法为105℃加热显示，结果柴胡的斑点颜色变淡，不利于观察。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种小柴胡制剂的薄层鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：

供试品制备：取小柴胡制剂供试品，加水溶解后上样至C18固相萃取小柱，以4.2±1个柱体积的水洗脱，弃去洗脱液，再分别以20±5％乙醇洗脱4.2±1个柱体积、以30±5％乙醇洗脱4.2±1个柱体积、以95±5％乙醇洗脱4.2±1个柱体积洗脱，分别收集洗脱液，得到供试品溶液一、供试品溶液二和供试品溶液三，回收溶剂后得残渣，所得残渣以有机溶剂溶解，得供试品溶液，备用；

对照品制备：分别取甘草、黄芩、人参和柴胡对照药材，按照下述方法分别制备对照药材溶液：

甘草对照药材溶液的制备：取甘草对照药材，加水回流提取，离心，取上清液加入C18固相萃取小柱中，用水洗脱，弃去洗脱液，然后用20±5％乙醇水溶液洗脱，洗脱液蒸干后，残渣用醇溶解，即得甘草对照药材溶液；

黄芩对照药材溶液的制备：取黄芩对照药材，加水回流提取，离心，取上清液加入C18固相萃取小柱中，用水洗脱，弃去洗脱液，然后用20±5％乙醇水溶液洗脱，洗脱液蒸干后，残渣用醇溶解，即得黄芩对照药材溶液；

人参对照药材溶液的制备：取人参对照药材，加水回流提取，离心，取上清液加入C18固相萃取小柱中，分别用水和20±5％乙醇水溶液洗脱，弃去洗脱液，然后用30±5％乙醇水溶液洗脱，洗脱液蒸干后，残渣用醇溶解，即得人参对照药材溶液；

柴胡对照药材溶液的制备：取柴胡对照药材，加水回流提取，离心，取上清液加入C18固相萃取小柱中，分别用水、20±5％乙醇水溶液和30±5％乙醇水溶液洗脱，弃去洗脱液，然后用95±5％乙醇水溶液洗脱，洗脱液蒸干后，残渣用醇溶解，即得柴胡对照药材溶液；

薄层展开：分别吸取上述供试品溶液和对照药材溶液，点于硅胶薄层板上，以展开剂展开，所述展开剂为三氯甲烷-甲醇-水的混合溶剂，所述三氯甲烷-甲醇-水的体积比为13±1：6±0.5：1±0.2；

显色检视：将上述薄层板晾干，按照以下方法进行对比鉴别：

1)取薄层板，置紫外光灯下检视，将供试品溶液一斑点与黄芩对照药材溶液斑点进行对比；

2)对薄层板喷以对苯二甲氨基苯甲醛的硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰，置紫外光灯下检视，将供试品溶液一斑点与甘草对照药材溶液斑点进行对比；将供试品溶液二斑点与人参对照药材溶液斑点进行对比；将供试品溶液三斑点与柴胡对照药材溶液斑点进行对比。

2.根据权利要求1所述的小柴胡制剂的薄层鉴别方法，其特征在于，所述供试品制备步骤中：

所述C18固相萃取小柱预先用0.5-1柱体积的甲醇活化，再用1-2柱体积的水平衡；

所得残渣以乙醇溶解。

3.根据权利要求1所述的小柴胡制剂的薄层鉴别方法，其特征在于，所述对照品制备步骤中，按照下述方法分别制备对照药材溶液：

甘草对照药材溶液的制备：取甘草对照药材1g，加水20ml回流提取1小时，离心，取上清液10ml加入柱体积为6ml的C18固相萃取小柱中，用25ml水洗脱，弃去洗脱液，然后用25ml20％乙醇水溶液洗脱，洗脱液蒸干后，残渣用1ml乙醇溶解，即得甘草对照药材溶液；

黄芩对照药材溶液的制备：取黄芩对照药材1g，加水20ml回流提取1小时，离心，取上清液10ml加入柱体积为6ml的C18固相萃取小柱中，用25ml水洗脱，弃去洗脱液，然后用25ml20％乙醇水溶液洗脱，洗脱液蒸干后，残渣用1ml乙醇溶解，即得黄芩对照药材溶液；

人参对照药材溶液的制备：取人参对照药材1g，加水20ml回流提取1小时，离心，取上清液10ml加入柱体积为6ml的C18固相萃取小柱中，分别用水和20％乙醇水溶液各25ml洗脱，弃去洗脱液，然后用25ml 30％乙醇水溶液洗脱，洗脱液蒸干后，残渣用1ml乙醇溶解，即得人参对照药材溶液；

柴胡对照药材溶液的制备：取柴胡对照药材2g，加水20ml回流提取1小时，离心，取上清液10ml加入柱体积为6ml的C18固相萃取小柱中，分别用水、20％乙醇水溶液和30％乙醇水溶液各25ml洗脱，弃去洗脱液，然后用25ml 95％乙醇洗脱，洗脱液蒸干后，残渣用1ml乙醇溶解，即得柴胡对照药材溶液。

4.根据权利要求1所述的小柴胡制剂的薄层鉴别方法，其特征在于，所述薄层展开步骤中，以展开剂展开8±1cm。

5.根据权利要求1所述的小柴胡制剂的薄层鉴别方法，其特征在于，还包括阴性对照溶液制备步骤，所述阴性对照溶液制备步骤中，分别按照处方比例，称取缺甘草、缺黄芩、缺柴胡和缺人参的处方，按小柴胡制剂的标准制法煎煮，按所述供试品制备步骤中的方法，分别制备甘草、黄芩、柴胡和人参阴性对照溶液；

所述薄层展开步骤中，同样将所述阴性对照溶液点于硅胶薄层板上。

6.根据权利要求1所述的小柴胡制剂的薄层鉴别方法，其特征在于，所述小柴胡制剂为颗粒剂。

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