CN114184696A - 一种宣肺败毒中药组合物的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种宣肺败毒组合物的检测方法，所述宣肺败毒组合物主要包括生麻黄，苦杏仁，生石膏，生薏苡仁，茅苍术，广藿香，青蒿草，虎杖，马鞭草，干芦根，葶苈子，化橘红，生甘草；宣肺败毒组合物的检测方法包括：柚皮苷、大黄素、大黄素甲醚、虎杖苷、盐酸麻黄碱的薄层鉴别方法；盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、柚皮苷和甘草酸含量测定方法。该检测方法具有较强的专属性，较好的重复性和线性关系，可对宣肺败毒组合物生产过程中的各个环节进行良好控制，保证产品的质量稳定性和疗效。

Description

一种宣肺败毒中药组合物的检测方法

技术领域

本发明涉及属于中成药含量成分检测质量分析领域，尤其具体涉及一种宣肺败毒中药组合物的检测方法。

背景技术

冠状病毒是病毒大家族中的一小部分，对于人类已知的七类冠状病毒中的三类包括：非典型肺炎病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)、中东呼吸综合征病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)和新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV2)，上述病毒对人类有较大的杀伤力。由SARS-CoV2病毒导致的新型冠状病毒肺炎(Corona VirusDesease 2019,COVID-19)正在全球范围内流行。

其中，COVID-19的临床症状常以发热、干咳、乏力为主要表现，少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹泻等症状。重症患者多在发病一周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。中医药在治疗新型冠状病毒肺炎疾病发挥重要作用。根据临床观察发现，该方在改善新冠肺炎患者的发热、咳嗽、憋喘、乏力方面有明显的效果，尤其是可以预防减少轻症患者转重症表现出独特优势。因本发明宣肺败毒中药组合物中的药材众多，且经过水煎煮提取，使得本发明中药所含化学成分十分复杂，中药的疗效大多是多组分、多种作用途径发挥作用的综合表现。中药复方质量控制随着中药现代化进程的加快也在不断向更深层次迈进，各种新技术、新方法层出不穷，有助于对中药及其复方制剂的质量监控和药物作用机理等进一步阐明。目前中药口服制剂质量评价研究大致可以分为4种模式：①基于多指标的中药制剂质量控制，针对多个有效成分或主要指标成分进行质量控制；②基于指纹图谱的中药制剂质量控制，对中药制剂产品的指纹图谱进行测定和控制；③体外评价，对溶出度或生物效价进行检测，以评价各剂型的差异；④体内组分-药效评价，对中药制剂在血液中移行成分、代谢成分进行研究。本发明基于对宣肺败毒颗粒的药味组成以及拟开展的质量控制方法研究，针对方中主要药味的指标成分及相应的质量控制方法。因此，本发明拟建立一种专属性强、科学简便的定性定量检测方法，并能确保该中药复方制剂的质量和疗效。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种宣肺败毒中药组合物的检测方法，该检测方法不仅包括柚皮苷、大黄素、大黄素甲醚、虎杖苷、盐酸麻黄碱的薄层定性鉴别方法，还建立了盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、柚皮苷和甘草酸多指标含量成分的测定方法。该检测方法的专属性和稳定性良好，耐用性强，能够有效保证工业化生产过程中对药品质量稳定性和可控性。本发明检测方法能提高本发明宣肺败毒中药组合物的质量控制标准，进一步有效地保障了该药品的安全性和有效性。

本发明所提及宣肺败毒中药组合物是由13味中药组成，包括生麻黄6g，苦杏仁15g，生石膏30g，生薏苡仁30g，茅苍术10g，广藿香15g，青蒿草12g，虎杖20g，马鞭草30g，干芦根30g，葶苈子15g，化橘红15g，生甘草10g。所述的宣肺败毒组合物可加入药用辅料制成药剂学上允许的常用药物口服制剂，如：胶囊剂、片剂、口服液、丸剂、颗粒剂等。

本发明的具体技术方案如下：

一种宣肺败毒中药组合物的检测方法，所述检测方法包括柚皮苷、大黄素、大黄素甲醚、虎杖苷、盐酸麻黄碱的薄层鉴别方法，以及盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、柚皮苷和甘草酸含量测定方法；其中，所述柚皮苷，甘草酸含量测定方法为高效液相色谱法，色谱条件及系统适用性试验为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A：0.05～0.15％甲酸水溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱程序如下：洗脱时间为0～35min，流动相A的比例为95％～30％，流动相B的比例为5％～70％，检测波长：254nm。

最为本发明的优选，所述柚皮苷和甘草酸含量测定的流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱程序如下：洗脱时间为0min，流动相A的比例为95％，流动相B的比例为5％、洗脱时间为5min，流动相A的比例为90％，流动相B的比例为10％、洗脱时间为10～12min，流动相A的比例为87％，流动相B的比例为13％、洗脱时间为18min，流动相A的比例为81％，流动相B的比例为19％、洗脱时间为21min，流动相A的比例为79％，流动相B的比例为21％、洗脱时间为29min，流动相A的比例为60％，流动相B的比例为40％、洗脱时间为35min，流动相A的比例为30％，流动相B的比例为70％。

作为本发明的进一步优选，所述柚皮苷，甘草酸含量测定方法包括如下步骤：

⑴、对照品溶液制备：取柚皮苷、甘草酸铵对照品适量，精密称定，用甲醇配制成每1mL含柚皮苷0.6～1.0mg、甘草酸铵0.1～0.3mg的混合溶液，即得；

⑵、供试品溶液制备：取中药组合物，研细，精密称定，精密加入60～80％甲醇，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用60～80％甲醇补足减失的重量，摇匀，离心8～12min，转速为11000～15000r/min，取续滤液，即得；

⑶、分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。

优选的，所述检测方法中薄层鉴别方法为如下项目(1)～(4)中任意一种或多种的组合：

(1)、柚皮苷的鉴别方法：取本发明中药粉末，加甲醇，超声处理20～40分钟，过滤，滤液蒸干，用甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取柚皮苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.5～1.5mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述两种溶液，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水8～12：4～8：1～3：0.8～1.2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3～7％三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热0.5～1.5分钟，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

(2)、大黄素或大黄素甲醚的鉴别方法：取本发明中药粉末，加甲醇，超声处理20～40分钟，过滤，滤液蒸干，用甲醇使其溶解，再取大黄素对照品或大黄素甲醚对照品，加甲醇制成每1mL各含0.2～0.8mg对照品的溶液，作为对照品溶液；吸取供试品溶液和对照品溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚30～60℃-甲酸乙酯-甲酸13～17:4～6:0.8～1.2的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

(3)、虎杖苷的鉴别方法：取本发明中药粉末，研细，加甲醇，超声处理，滤过，滤液作为供试品溶液；另取虎杖苷对照品，加甲醇制成对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-三氯甲烷-水(23～28:7～11:6～10:3～5)为展开剂，置展开缸中预饱和，展开，取出，晾干，喷以8～12％氢氧化钾甲醇溶液，在紫外光254nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

(4)、盐酸麻黄碱的鉴别方法：取本发明中药粉末，加甲醇，超声处理20～40分钟，过滤，滤液蒸干，用甲醇使溶解，另取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.8～1.2mg的溶液，作为对照品溶液，吸取上述两种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液18～22:4～6:0.4～0.6为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在102～107℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的红色斑点。

优选的，所述盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱含量测定方法为高效液相色谱法，色谱条件及系统适用性试验为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为：乙腈-0.1～0.3％磷酸，比例为：2～4:95～99，检测波长：207nm。

优选的，所述检测方法中流动相为：乙腈-0.12％磷酸，比例为：3:97。

优选的，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的型号为：COSMOSIL 5C18-MS-II、SHIMADZU VP-ODS、YMC-Pack ODS-A。

优选的，所述检测方法中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱含量测定方法包括如下步骤：

⑴、对照品溶液制备：取盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加60～80％甲醇分别制成每1mL各含30～50μg的混合溶液，即得；

⑵、供试品溶液制备：取中药，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入水溶液，超声处理，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，离心2～8min，转速为3000～8000r/min，量取上清液，加浓氨试液，用乙醚振摇提取1～4次，加盐酸乙醇溶液，摇匀，放置，蒸干，残渣加50～80％甲醇使溶解，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

⑶、分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。

优选的，所述检测方法中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱含量测定方法包括如下步骤：

⑴、对照品溶液制备：取盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加70％甲醇分别制成每1mL各含40μg的混合溶液，即得；

⑵、供试品溶液制备：取中药，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水溶液，超声处理，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，离心4～7min，转速为5000～7000r/min，量取上清液，加浓氨试液，用乙醚振摇提取3次，加盐酸乙醇5％溶液，摇匀，放置，蒸干，残渣加70％甲醇使溶解，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

⑶、分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。

为了突出本发明中药组合物含量检测方法技术方案创新性，我们将本实验色谱条件摸索过程中筛选的部分实验提供如下。

①、含量测定指标成分及方法选择

由于本发明宣肺败毒中药组合物的成分众多，我们在指标成分检测控制中尽量选择与本发明中药治疗功效相关的主要活性成分进行检测。其中，选择盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、柚皮苷和甘草酸作为含量测定的指标成分，基于如下方面的考虑：(1)、化橘红具有散寒，燥湿，理气，消痰的功效，其中，柚皮苷是化橘红中黄酮类成分的代表化合物，可以起到消炎、止咳、平喘作用，这也是宣肺败毒方的主要药理作用，并且柚皮苷在宣肺败毒组合物中成分稳定，含量较高，易于识别；(2)、麻黄具有发汗解表，宣肺平喘，辛温通络，利水消肿的功效，是宣肺败毒组合物中主要君药，2015版中国药典一部规定麻黄药材含量测定的指标成分是盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的总量；(3)、甘草酸具有抗肿瘤、抗病毒、抗血清、免疫调节、治疗心血管疾病、抗氧化等多种药理作用，它是甘草中最重要反映药材质量的药用活性成分之一。

②、宣肺败毒中药组合物的部分指标含量摸索试验

2.1盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱含量测定

盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱是处方中主要君药麻黄的药效成分，查阅文献，含量测定通常采用HPLC方法，或者经过柱前衍生的HPLC法测定，根据文献中色谱条件，结合实际情况，确定具体方案。

2.2色谱条件的选择

2.2.1波长筛选

采用DAD检测器对盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱对照品溶液进行190～800nm的全波长扫描，分别得到盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱的光谱图，根据图谱结果确定含量测定波长为：207nm。

2.2.2流动相筛选

2.2.2.1样品的制备

供试品溶液制备：取批号为XX200306T1的提取液适量，于13000转/min离心处理10min，取上清液，即得。

对照品溶液制备：取盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1mL各含40μg的混合溶液，即得。

测定法：吸取供试品溶液10mL，注入高效液相色谱中，依据下述方法，记录色谱图信息如下。

2.2.2.2色谱条件

色谱条件一：色谱柱为Hypersil Gold C18(250×4.6mm，5μm)，流动相采用乙腈(A)与0.1％磷酸溶液(B)，洗脱梯度如下表，流速1mL/min，柱温30℃，进样量10μL，检测波长为207nm。

表S1洗脱梯度

色谱条件二：色谱柱为Hypersil Gold C₁₈(250×4.6mm，5μm)，流动相采用乙腈(A)与0.1％磷酸溶液(含有0.1％三乙胺)(B)，洗脱梯度如下表，流速1mL/min，柱温30℃，进样量10μL，检测波长为207nm。

表S2洗脱梯度

色谱条件三：色谱柱为Hypersil Gold C₁₈(250×4.6mm，5μm)，流动相采用乙腈(A)与0.1％磷酸溶液-0.1％三乙胺(B)，洗脱梯度如下表，流速1mL/min，柱温30℃，进样量10μL，检测波长为207nm。

表S3洗脱梯度

③试验结果色谱条件能将盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱与附近色谱峰有效分离，因此确定色谱条件三作为宣肺败毒中药组合物中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱含量测定方法，基于此方案，改变流动相梯度、类型与色谱柱进行优化。

2.2.2.3色谱条件

含量测定：麻黄照高效液相色谱法(中国药典2020年版通则0512)测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈-0.12％磷酸溶液(含0.1％三乙胺)(3：97)为流动相；检测波长为207nm。理论板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于2000。

对照品溶液的制备取盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml各含40μg的混合溶液，即得。

2.2.2.4供试品制备方法

根据盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱在碱性条件下易溶于极性较小的有机溶剂的性质，对供试品进行萃取处理，具体操作如下。

取宣肺败毒中药组合物(批号：210206)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25ml，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，置离心管中，离心(每分钟6000转)5分钟，精密量取上清液10ml，加浓氨试液0.3ml，用乙醚振摇提取4次，每次15ml，合并乙醚液，加5％盐酸乙醇溶液0.3ml，摇匀，放置30min，蒸干，残渣加70％甲醇适量使溶解，转移至10ml量瓶中，加70％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

另精密量取上清液10ml，置离心管中，加浓氨试液0.3ml，用二氯甲烷振摇提取4次，每次15ml，混合液置离心机中，离心(每分钟6000转)5分钟，合并二氯甲烷液，加5％盐酸乙醇溶液0.3ml，摇匀，放置30min，蒸干，残渣加70％甲醇适量使溶解，转移至10ml量瓶中，加70％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

分别取上述供试品，照“2.2.2.3色谱条件”进行测定。根据实验结果，选择合适的萃取溶剂。

2.2.2.5加样回收预实验

由于操作步骤较多，为给后期方法准确度测定提供参考，进行加样回收预实验研究，具体操作如下。

取宣肺败毒中药组合物(批号：210206)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸麻黄碱盐酸伪麻黄碱混合溶液25ml(溶剂为水，浓度分别为盐酸麻黄碱：21.68μg/ml；盐酸伪麻黄碱：20.30μg/ml)，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，置离心管中，离心(每分钟6000转)5分钟，精密量取上清液10ml，加浓氨试液0.3ml，用乙醚振摇提取4次，每次15ml，合并乙醚液，加5％盐酸乙醇溶液0.3ml，摇匀，放置30min，蒸干，残渣加70％甲醇适量使溶解，转移至10ml量瓶中，加70％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

另精密量取上清液10ml，置离心管中，加浓氨试液0.3ml，用二氯甲烷振摇提取4次，每次15ml，混合液置离心机中，离心(每分钟6000转)5分钟，合并二氯甲烷液，加5％盐酸乙醇溶液0.3ml，摇匀，放置30min，蒸干，残渣加70％甲醇适量使溶解，转移至10ml量瓶中，加70％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

取上述供试品，照“2.2.1.1色谱条件”进行测定。

2.2.3样品的前处理方法

2.2.3.1萃取溶剂对比结果

无水乙醚、二氯甲烷萃取结果表明，经过无水乙醚萃取与二氯甲烷萃取均能有效富集盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱，乙醚萃取含量稍高于二氯甲烷萃取，且在操作过程中发现，二氯甲烷萃取乳化现象严重不易分层，需要增加离心操作，而无水乙醚萃取则分层明显易于操作，因此认为乙醚作为萃取溶剂优于二氯甲烷。

2.2.3.2加样回收预实验结果

结果表明，经过无水乙醚萃取后，制备供试品中盐酸麻黄碱回收率为92％，盐酸伪麻黄碱回收率为92％，经过二氯甲烷萃取后，制备供试品中盐酸麻黄碱回收率为96％，盐酸伪麻黄碱回收率为94％，均符合《中国药典》2020年版要求。

表S4无水乙醚萃取加样回收预实验结果

表S5二氯甲烷萃取加样回收预实验结果

2.2.3.3小结

前期研究中发现，更换不同厂家色谱柱后，盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱色谱峰附近会出现干扰峰，导致色谱柱耐用性较差，现对供试品前处理方法进行改进，对比无水乙醚及二氯甲烷萃取结果，虽然加样回收预实验结果均符合《中国药典》2020年版规定，但是二氯甲烷不易分层，需要增加离心操作，较无水乙醚操作复杂。

2.2.4供试品制备方法考察

2.2.4.1复溶溶剂考察

考察残渣复溶溶剂类型，供试品制备方法参照“2.2.2.4供试品制备方法”项下无水乙醚萃取方法，残渣分别选择纯水、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇溶剂制样，供试品按照“2.2.2.3色谱条件”进行采集，比较不同浓度甲醇复溶效果和结果，选择最佳溶剂。

2.2.4.2超声功率考察

取宣肺败毒中药组合物(批号：210206)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25ml，密塞，称定重量，分别用50％额定功率、75％额定功率、100％额定功率超声处理30min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，过滤，取续滤液，制备供试品溶液，考察不同功率超声对检测结果的影响，供试品按照“2.2.1.1色谱条件”中色谱条件进行采集，选择最佳超声功率。

2.2.4.3超声时间考察

取宣肺败毒中药组合物(批号：210206)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25ml，密塞，称定重量，分别超声处理20min、30min、40min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，过滤，取续滤液，制备供试品溶液，考察不同超声时间对检测结果的影响，供试品按照“2.2.1.1色谱条件”中色谱条件进行采集，选择最佳超声时间。

2.2.4.4无水乙醚提取次数考察

考察无水乙醚萃取次数，供试品制备方法参照“2.2.2.4供试品制备方法”项下无水乙醚萃取方法，用15ml无水乙醚进行5次萃取，取每次萃取的无水乙醚层，分别制备供试品溶液，供试品按照“2.2.2.3色谱条件”中色谱条件进行采集，筛选无水乙醚(15ml)萃取次数。

分别用45ml无水乙醚萃取2次，30ml无水乙醚萃取2次，每次萃取取无水乙醚层制备供试品溶液，按照“2.2.1.1色谱条件”中色谱条件进行采集，根据实验结果比较萃取效果。

2.2.4.5浓氨试液加入体积考察

取宣肺败毒中药组合物(批号：210206)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25ml，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，置离心管中，离心(每分钟6000转)5分钟，精密量取上清液10ml，测定pH，分别加入浓氨试液至0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml、1.0ml、1.5ml，测定pH值如下。

2.2.5实验结果

2.2.5.1复溶溶剂考察结果

不同溶剂复溶结果如表S6，结果显示，除甲醇复溶峰型较差以及峰面积较低外，其余溶剂复溶对结果无显著性差异，考虑实际操作中残渣脂溶性成分较多，选择最易溶剂残渣的70％甲醇作为溶剂。

表S6不同浓度甲醇复溶效果比较

2.2.5.2超声功率考察结果

不同超声功率考察结果如表S7，根据实验结果，确定最佳超声功率为100％额定功率，即520W，40kHz。同时结果显示，不同超声功率对提取结果影响并不大，因此超声功率并不做特别规定。

表S7不同超声功率效果比较

2.2.5.3超声时间考察结果

不同超声时间考察结果如表S8，结果显示，不同超声功率对提取结果影响较大，根据实验结果，确定最佳超声时间为20min。

表S8不同超声时间考察结果比较

2.2.5.4无水乙醚提取次数考察结果

不同体积无水乙醚萃取次数考察结果如表S9，S10和S11，结果显示，15ml无水乙醚萃取三次能将盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱萃取完全，45ml和30ml无水乙醚萃取第二次显示还存在少量盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱，因此选择15ml乙醚萃取三次。

表S9 15ml无水乙醚萃取次数考察结果比较

表S10 30ml无水乙醚萃取次数考察结果比较

表S11 45ml无水乙醚萃取次数考察结果比较

2.2.5.5浓氨试液加入体积考察结果

不同体积浓氨试液体积考察结果如表S12，结果显示，加入1ml浓氨试液效果最佳，因此确定加入氨试液体积为1ml。

表S12不同体积氨试液考察结果比较

2.2.5.6 5％盐酸乙醇加入体积考察结果

不同体积5％盐酸乙醇考察结果如表S13，结果显示，加入1ml 5％盐酸乙醇试液效果最佳，因此确定加入5％盐酸乙醇体积为1ml。

表S13 5％盐酸乙醇加入体积考察结果比较

2.2.4.7反应时间考察结果

5％盐酸乙醇加入后反应时间考察结果如表S14，结果显示，加入5％盐酸乙醇后静置30min效果最佳，因此确定静置时间为30min。

表S14 5％盐酸乙醇加入后反应时间考察结果

本发明检测方法采用的技术方案有益效果如下：

1.本发明检测方法增加多指标成分含量检测，能够对产品内在质量进行控制，以确保有效成分含量符合药品标准。本发明检测方法科学合理、切实可行，并处方中麻黄、化橘红、甘草等主要成分进行有效的成分检测，从而保证该宣肺败毒中药组合物的临床疗效。

2.本发明选取宣肺败毒组合物中的柚皮苷(化橘红药材)、大黄素、大黄素甲醚(虎杖药材)、虎杖苷(虎杖药材)、盐酸麻黄碱(麻黄药材)、5种成分作为薄层定性鉴别的指标成分，基于以下方面考虑：(1)本发明药物组合物中的化橘红具有散寒，燥湿，理气，消痰的功效，柚皮苷是化橘红中黄酮类成分的代表化合物，可以起到消炎、止咳、平喘作用，这也是宣肺败毒方的主要药理作用，并且柚皮苷在宣肺败毒组合物中成分稳定，含量较高，易于识别；(2)虎杖具有活血祛瘀、利湿退黄、清热解毒的功效，对冠状病毒具有较强的抑制作用，而虎杖苷和大黄素是虎杖中苯乙烯苷和蒽醌两大类成分的代表性化合物；(3)麻黄具有发汗解表，宣肺平喘，辛温通络，利水消肿的功效，是宣肺败毒组合物的主要君药，2015版中国药典一部规定麻黄药材含量测定的指标成分是盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的总量；本发明不用对宣肺败毒组合物中13味中药全部进行鉴定，缩短了定性鉴别时间，节约了生产成本。

3.本发明检测方法选取宣肺败毒组合物中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、柚皮苷、甘草酸4种成分作为含量测定指标成分，上述成分为关联药效的指标成分，不但能在产品工业化生产中有效控制产品质量，而且简化了产品质量控制程序，节约了生产成本。

4.本发明建立检测方法，对上述盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、柚皮苷和甘草酸指标成分在精密度、重复性、线性关系、专属性、稳定性上进行了大量摸索研究，其具体实验结果如下：盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱精密度试验结果表明，对方法进行方法学研究，该方法盐酸麻黄碱含量测定标准曲线为：Y＝0.4064X+0.7156(n＝6)，R2＝1，盐酸伪麻黄碱含量测定标准曲线为：Y＝0.3608X+0.7000(n＝6)，R2＝1，盐酸麻黄碱在30.4ng～3040.0ng范围内线性关系良好，盐酸伪麻黄碱在31.3ng～3133.7ng范围内线性关系良好；重复性试验盐酸麻黄碱RSD(n＝6)为1.5％，盐酸伪麻黄碱RSD(n＝6)为0.9％；精密度试验盐酸麻黄碱RSD(n＝6)为0.9％，盐酸伪麻黄碱RSD(n＝6)为1.0％，表明仪器精密度良好。准确度试验中，进行加样回收试验考察，结果盐酸麻黄碱平均回收率为90.1％，RSD(n＝9)为3.2％，盐酸伪麻黄碱平均回收率为90.7％，RSD(n＝9)为2.8％。考察24h稳定性，结果表明供试品溶液在24小时内稳定。考察专属性，缺麻黄阴性样品盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱峰处无干扰，专属性良好。考察不同厂家的色谱柱，结果表明：色谱柱耐用性良好。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。本发明所述供试品为宣肺败毒中药组合物。

图1-柚皮苷专属性薄层鉴别图，其中，①、柚皮苷对照品；②、化橘红对照药材；③、XF-HJH200325(缺化橘红的阴性提取液)；④、XX200325T1(供试品样品溶液)；

图2-大黄素、大黄素甲醚耐用性薄层鉴别图，①、大黄素对照品；②、大黄素甲醚对照品；③、虎杖对照药材；④、XF-HZ200325(缺虎杖药材的阴性提取液)；⑤、XX200325T1；

图3-虎杖苷专属性薄层鉴别图，①、虎杖苷对照品；②、批号210206颗粒；③、批号2021颗粒(缺虎杖药材的阴性)；

图4-盐酸麻黄碱专属性薄层鉴别图，①、盐酸麻黄碱对照品；②、麻黄对照药材；③、XF-MH200325；④、XX200325T1(供试品样品溶液)；

图5-中试产品的柚皮苷薄层鉴别图，①、柚皮苷对照品；②、XZ200323Z1(供试品样品溶液)；③、XZ200324Z1(供试品样品溶液)；④、XZ200324Z2(供试品样品溶液)；

图6-中试产品的大黄素、大黄素甲醚薄层鉴别图；①、大黄素对照品；②、大黄素甲醚对照品；③、XZ200323Z1(供试品样品溶液)；④、XZ200324Z1(供试品样品溶液)；⑤、XZ200324Z2(供试品样品溶液)；

图7-三批生产宣肺败毒中药组合物的虎杖苷薄层鉴别图；①、虎杖苷对照品；②、批号210204颗粒(供试品样品溶液)；③、批号210205颗粒(供试品样品溶液)；④、批号210206颗粒(供试品样品溶液)；

图8-中试产品的盐酸麻黄碱薄层鉴别图；①、盐酸麻黄碱对照品；②、XZ200323Z1(供试品样品溶液)；③、XZ200324Z1(供试品样品溶液)；④、XZ200324Z2(供试品样品溶液)；

图9-盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱含量测定专属性色谱图；(色谱峰1为盐酸麻黄碱；色谱峰1峰为2为盐酸伪麻黄碱)其中，A-宣肺败毒中药组合物(批号：210206)；B-缺麻黄阴性(批号：2103)；C-盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱混标。

图10-重复性试验色谱图(在254nm下，柚皮苷和甘草酸铵的含量色谱图)。

具体实施方式

为了更加充分理解本发明的实施，下面通过典型的实施例对本发明做进一步的说明。除非另作定义，本发明专利申请说明书以及权利要求书中使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

实施例1本发明检测指标成分的薄层鉴别方法

1仪器与试药

试验仪器：分析天平(赛多利斯，SQP QUINTIX224-1CN，德国)，烘箱(BINDER，FD115，德国)，Thermo Ultimate3000型高效液相色谱仪(配有DAD检测器、控温型柱温箱、控温型自动进样器，美国)，Thermo Ultimate3000型高效液相色谱仪(配有VWD检测器、控温型柱温箱、控温型自动进样器，美国)，高速台式离心机(SIGMA，1-14，德国)，超纯水仪(CASCADA，PALL，美国)，ACQUITY UPLC H-ClASS Plus(Waters，美国)，超声波清洗仪(天津奥特赛恩斯，AS20500BT，中国)，水浴锅(Julabo，TW20，德国)，紫外光灯(上海精科实业有限公司，203L-18-127，中国)。

供试品：宣肺败毒中药组合物(批号：XZ200323Z1、XZ200324Z1、XZ200324Z2、TRT200302、TRT200303、TRT200304)，依据宣肺败毒中药组合物的制法经中试及中试放大生产制取。

对照品：盐酸麻黄碱(批号：171241-201809，纯度:100％)，盐酸伪麻黄碱(批号:171237-201510，纯度:99.8％)，柚皮苷(批号:110722-201815，纯度91.7％)，甘草酸铵(批号:110731-201720，纯度97.7％)，大黄素(批号:110756-201913，纯度96.0％)，大黄素甲醚(批号:110758-201817，纯度:99.2％)和苦杏仁苷(批号:110820-201808，纯度：88.2％)购自中国食品药品检定研究院；马鞭草苷(批号:7504)和戟叶马鞭草苷(批号:7505)购自上海诗丹德标准技术服务有限公司。

试验试剂：乙腈(天津渤化化学试剂有限公司，20200102)，三乙胺(天津大茂化学试剂厂，20200102)，磷酸(天津风船化学试剂科技有限公司，20190715)，乙腈(FisherChemical，190888)甲酸(上海市试剂一厂，2019-1-2)，甲醇(天津市渤化化学试剂有限公司，191130)乙酸乙酯(天津市康科德科技有限公司，180918)，丙酮(天津市渤化化学试剂有限公司，181126)，冰醋酸(天津市康科德科技有限公司，181011)，石油醚(天津市渤化化学试剂有限公司，20200228)，甲酸乙酯(天津市渤化化学试剂有限公司，20200102)，甲酸(天津市华东试剂厂)，三氯甲烷(天津市化学试剂供销公司第二分公司，181102)，氨水(天津市风船化学试剂科技有限公司，20180806)。

2方法与结果

2.1试验样品制备

2.1.1供试品样品制备

⑴、取麻黄300g、虎杖1000g、苦杏仁750g、马鞭草1500g、生石膏1500g、芦根1500g、薏苡仁1500g、葶苈子750g、麸炒苍术500g、化橘红750g、广藿香750g、甘草500g、青蒿600g，加水4倍量的水，浸泡30分钟，加热至沸腾，煎煮时间为40分钟，水煎煮滤液，滤液浓缩至相对密度1.02～1.10中药浸膏(60℃)；

⑵、取步骤⑴中药浸膏，进行喷雾干燥，制成干膏粉，加入乳糖和甘露醇适量(乳糖：甘露醇＝2：1)，混合均匀，干法制粒，制成1000g颗粒剂。

2.1.2阴性样品制备：

依据2.1.1中全方的供试品样品制备方法，扣除相应的药材，分别制作缺化橘红的阴性提取液(批号：XF-HJH200325)，缺虎杖的阴性提取液(XF-HZ200325)和缺麻黄的阴性提取液(XF-MH200325)。

2.1.3对照药材提取液制备

取化橘红对照药材粉末1g，加甲醇10mL，超声处理30min，过滤，滤液蒸干，用3mL甲醇使溶解，作为化橘红对照药材溶液；取虎杖对照药材粉末1g，加甲醇10mL，超声处理30min，过滤，滤液蒸干，用3mL甲醇使溶解，作为虎杖对照药材溶液；取麻黄对照药材粉末1g，加甲醇10mL，超声处理30min，过滤，滤液蒸干，用3mL甲醇使溶解，作为麻黄对照药材溶液。

2.1.4对照品溶液制备

称取柚皮苷对照品，大黄素对照品、大黄素甲醚对照品，虎杖苷对照品，盐酸麻黄碱对照品各适量，分别加甲醇制成每1mL含1mg的柚皮苷对照品溶液；每1mL含1mg的大黄素对照品溶液；每1mL含1mg的大黄素甲醚对照品溶液；每1mL含1mg的盐酸麻黄碱对照品溶液；每1mL含0.2mg的虎杖苷对照品溶液。

2.2薄层鉴别的专属性试验

2.2.1柚皮苷专属性

试验方法：照薄层色谱法2015版中国药典四部通则0502试验，吸取柚皮苷对照品溶液、化橘红对照药材溶液、全方供试品样品溶液(XX200325T1)和缺化橘红的阴性样品溶液(XF-HJH200325)各2μL，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-冰醋酸-水(8:4:0.3:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热1分钟，置紫外光灯(365nm)下检视。

试验结果：如图1所示，经显色后置于365nm下观察，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；对照药材色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；阴性样品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，未见相同颜色的荧光斑点；因此，该方法可以作为宣肺败毒组合物中化橘红指标成分柚皮苷的鉴别方法。

2.2.2大黄素和大黄素甲醚专属性

试验方法：照薄层色谱法2015版中国药典四部通则0502试验，吸取供试品样品溶液(XX200325T1)4μL、虎杖对照药材溶液4μL、缺虎杖的阴性样品溶液(XF-HZ200325)4μL、大黄素和大黄素甲醚的对照品溶液各1μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。

试验结果：如图2所示，在紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与大黄素和大黄素甲醚对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；虎杖对照药材色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；缺虎杖的阴性样品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，未见相同颜色的荧光斑点，因此，该方法可以作为宣肺败毒组合物中虎杖中指标成分大黄素、大黄素甲醚的鉴别方法。

2.2.3虎杖苷专属性

试验方法：试验方法：取本品1g，研细，加甲醇10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取虎杖苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取上述两种各溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-三氯甲烷-水(26:9.5:8:4)为展开剂，置展开缸中预饱和15分钟，展开，取出，晾干，喷以10％氢氧化钾甲醇溶液，在紫外光(254nm)下检视。

试验结果：如图3所示，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性样品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，未见相同颜色的荧光斑点；因此该方法可以作为宣肺败毒中药组合物中虎杖指标成分虎杖苷的鉴别方法。

2.2.4盐酸麻黄碱专属性

试验方法：照中国药典2015年版四部通则0502试验照薄层色谱法，吸取供试品样品溶液、麻黄对照药材溶液、缺麻黄的阴性样品溶液(XF-MH200325)和盐酸麻黄碱对照品溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液(20:5:0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。

试验结果：如图4所示，经显色后观察，供试品色谱中，在与盐酸麻黄碱对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；麻黄对照药材溶液的色谱中，在与盐酸麻黄碱对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；无麻黄的阴性样品色谱中，在与盐酸麻黄碱对照品色谱相应的位置上，未见相同颜色的荧光斑点；因此该方法可以作为宣肺败毒组合物中麻黄指标成分盐酸麻黄碱的鉴别方法。

2.3指标成分的薄层鉴别

2.3.1柚皮苷的薄层鉴别

分别称取三批次的XZ200323Z2、XZ200324Z1和XZ200324Z2颗粒剂各1g，加甲醇10mL，超声处理30min，过滤，滤液蒸干，用3mL甲醇使溶解，作为供试品溶液。

另取柚皮苷对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的柚皮苷溶液，作为对照品溶液。

照中国药典2015年版四部通则0502试验照薄层色谱法，吸取上四种溶液各2μL，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-冰醋酸-水(8:4:0.3:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热1min，置紫外光灯(365mn)下检视。

结果如图6所示，薄层显色后经紫外灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与柚皮苷对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

2.3.2大黄素、大黄素甲醚的薄层鉴别

分别称取三批次的XZ200323Z2、XZ200324Z1和XZ200324Z2颗粒剂各1g，加甲醇10mL，超声处理30min，过滤，滤液蒸干，用3mL甲醇使溶解，作为供试品溶液。

取大黄素对照品和大黄素甲醚对照品，分别加甲醇制成每1mL各含1mg的大黄素对照品溶液和大黄素甲醚对照品溶液，作为对照品溶液。

照中国药典2015年版四部通则0502试验照薄层色谱法，吸取供试品溶液各4μL、对照品溶液各1μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。

如图7所示，供试品色谱中，在与大黄素、大黄素甲醚对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

2.3.3虎杖苷的薄层鉴别

取本发明宣肺败毒中药组合物1g，研细，加甲醇10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取虎杖苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取上述两种各溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-三氯甲烷-水(26:9.5:8:4)为展开剂，置展开缸中预饱和15分钟，展开，取出，晾干，喷以10％氢氧化钾甲醇溶液，在紫外光(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。如图7所示，供试品色谱中，在与虎杖苷对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

2.3.4盐酸麻黄碱的薄层鉴别

分别称取三批次的XZ200323Z2、XZ200324Z1和XZ200324Z2颗粒剂各1g，加甲醇10mL，超声处理30min，过滤，滤液蒸干，用3mL甲醇使溶解，作为供试品溶液。

取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。

照中国药典2015年版四部通则0502试验照薄层色谱法，吸取盐酸麻黄碱对照品溶液、供试品溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液(20:5:0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。如图8所示，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

实施例2本发明盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱指标成分的含量测定

2.1仪器和试药

试验仪器：高效液相色谱(赛默飞世尔科技有限公司，型号ULtimate 3000)，十万分之一分析天平(赛多利斯，型号SQP QUINTIX224-1CN)；超纯水仪(PALL，型号CASCADA)；小型台式离心机(SIGMA，规格1-14)。

试剂：对照品盐酸麻黄碱(批号：171241-201809，纯度：100％)，盐酸伪麻黄碱(批号：171237-201510，纯度：99.8％)，购自中国食品药品检定研究院；试验试剂为：乙腈(批号：20200102，天津渤化化学试剂有限公司)，磷酸(天津风船化学试剂科技有限公司，20190715)，三乙胺(批号：20200302，天津市大茂化学试剂厂)，超纯水由纯水仪制得。

2.2试验步骤

具体的，在本发明中，盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱含量的测定方法如下：

2.2.1色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈-0.12％磷酸溶液(含0.1％三乙胺)(3：97)为流动相；检测波长为207nm。理论板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于2000。

2.2.2对照品溶液的制备

取盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml各含40μg的混合溶液，即得。

2.2.3供试品溶液制备

取本发明中药约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率520W，频率40kHz)20min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，置离心管中，离心(每分钟6000转)5分钟，精密量取上清液10ml，加浓氨试液1ml，用乙醚振摇提取3次，每次15ml，合并乙醚液，加5％盐酸乙醇溶液1ml，摇匀，放置30min，蒸干，残渣加70％甲醇适量使溶解，转移至10ml量瓶中，加70％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.3方法学研究

依据2015版中国药典药品质量标准分析方法验证指导原则(通则9101)开展方法学研究。

2.3.1精密度

精密度系指在规定的条件下，同一份均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度，主要包括重复性，期间精密度和重现性。经过精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。

2.3.1.1期间精密度

取盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱混合对照品，采用“2.2.1色谱条件”中色谱条件，重复进样6针，计算盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱峰面积相对标准偏差，结果见表1，结果表明，盐酸麻黄碱6针进样峰面积RSD值为0.9％，盐酸伪麻黄碱6针进样峰面积RSD值为1.0％，表明仪器精密度良好，符合药品质量标准分析方法验证指导原则(《中国药典》2020年版四部通则9101)要求。

表1盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱含量测定精密度试验结果

2.3.1.2重复性

取宣肺败毒中药组合物(批号：210206)适量，按照“2.2.3供试品制备方法考察”项下供试品制备方法制备供试品6份，分别采用“2.1.1色谱条件”中色谱条件，进行液相分析，分析供试品中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱含量RSD值，结果见表2，结果表明，6份供试品盐酸麻黄碱含量RSD值为1.5％，盐酸伪麻黄碱含量RSD值为0.9％，重复性良好，符合药品质量标准分析方法验证指导原则(《中国药典》2020年版四部通则9101)要求。

表2盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱含量测定重复性试验结果

2.3.2准确度

准确度系指采用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率(％)表示。取宣肺败毒中药组合物(批号：210206)样品，按对照品量与所取供试品中待测定成分量之比为在0.5:1，1:1，1:1.5分别加入对照品进行加样(n＝9)，制备供试品，并按照2.2.1中色谱条件，进行液相分析，试验结果取平均值，结果见表3和表4，结果表明，加样回收试验，盐酸麻黄碱平均回收率为90.1％，RSD为3.2％，盐酸伪麻黄碱平均回收率为90.7％，RSD为2.8％，符合药品质量标准分析方法验证指导原则(《中国药典》2020年版四部通则9101)要求。

表3盐酸麻黄碱加样回收试验数据

表4盐酸伪麻黄碱加样回收试验数据

2.3.3线性与范围

取盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含盐酸麻黄碱304.00μg/ml，盐酸伪麻黄碱313.37μg/ml的混合标准溶液。

吸取标准溶液，分别稀释浓度为混合标准溶液浓度的1％、10％、25％、50％、75％、100％的标准溶液，按照“2.2.1色谱条件”中色谱条件，进行液相分析。以峰面积为横坐标X，浓度为纵坐标Y，拟合盐酸麻黄碱标准曲线为：Y＝0.4064X+0.7156(n＝6)，R²＝1，盐酸麻黄碱标准曲线为：Y＝0.3608X+0.7000(n＝6)，R²＝1。结果表明，盐酸麻黄碱在30.4ng～3040.0ng，盐酸伪麻黄碱在31.3ng～3133.7ng，范围内线性关系良好。

2.3.4专属性

取缺麻黄阴性颗粒(批号：2103)约1g，按照“2.2.3供试品制备方法考察”项下供试品制备方法制备供试品，分别采用“2.2.1色谱条件”中色谱条件，进行液相分析，结果见图9，结果表明，盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱在缺阴性位置处无干扰峰，含量测定专属性良好。

2.3.5稳定性

取宣肺败毒中药组合物(批号：210206)，按照“2.2.3供试品制备方法考察”项下供试品制备方法制备供试品，分别采用“2.2.1色谱条件”中色谱条件，进行液相分析，在0h、3h、6h、9h、12h、24h分别进样测定，将峰面积作为指标，考察样品在24h内稳定性，结果见表5，结果表明，供试品24h内盐酸麻黄碱峰面积RSD为0.8％，盐酸伪麻黄碱峰面积RSD为0.9％，稳定性良好。

表5供试品的稳定性考察结果

2.3.6耐用性

考察不同厂家色谱柱耐用性，取宣肺败毒中药组合物(批号：210206)，按照“2.2.3供试品制备方法考察”项下供试品制备方法制备供试品，用不同厂家的色谱柱，采用“2.2.1色谱条件”中色谱条件，进行液相分析，考察不同厂家色谱柱耐用性，进行系统适应性试验，色谱柱信息见表-6。

表6盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱含量测定色谱柱信息

表7色谱柱考察结果

色谱柱耐用性试验结果见表6-7，结果表明，不同色谱柱对盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱分离较好，均已达到基线分离，且缺阴性样品显示无干扰峰，表明宣肺败毒中药组合物盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱含量测定色谱柱耐用性良好。

实施例3本发明柚皮苷、甘草酸含量测定

3.1仪器和试药

试验仪器：超高效液相色谱(Waters，型号ACQUITYH-CLASSPLUS)，十万分之一分析天平(赛多利斯，型号SQP)；超纯水仪(PALL，型号CASCADA)；小型台式离心机(SIGMA，规格1-14)。

试剂：对照品柚皮苷(批号：110722-201815，纯度91.7％)，甘草酸铵(批号：110731-201720，纯度97.7％)，大黄素(批号：110756-201913，纯度96.0％)均购自中国食品药品检定研究院；试验试剂为：乙腈(批号：190888，Fisher Chemical)，甲酸(批号：2019-1-2，上海市试剂一厂)，超纯水由纯水仪制得。

3.2试验步骤

具体的，在本发明中，柚皮苷、甘草酸含量测定方法如下：

3.2.1色谱条件与系统适应性

色谱柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100mm×2.1mm，1.7μm)；以乙腈为流动相A，0.1％甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为254nm；流速0.4ml/min；柱温为30℃；进样量为2μl。

表8流动相A和B的梯度洗脱程序

3.2.2对照品溶液制备

取柚皮苷、甘草酸铵对照品适量，精密称定，用甲醇配制成每1mL含柚皮苷0.8mg、甘草酸铵0.2mg的混合溶液，即得(甘草酸重量＝甘草酸铵重量/1.0207)。

3.2.3供试品溶液制备

取装量差异项下的本品，混匀，取适量，研细，取约1g，精密称定，精密加入70％甲醇25mL，称定重量，超声(功率520W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，离心(转速为每分钟13000转)10min，取上清液，滤过，取续滤液，即得。

3.3方法学研究

依据2015版中国药典药品质量标准分析方法验证指导原则(通则9101)开展方法学研究。

3.3.1精密度

精密度系指在规定的条件下，同一份均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度，包括重复性，期间精密度和重现性，其中本公司只有一个试验室，因此未考察其不同实验室的重现性。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。

3.3.1.1重复性

取XZ200323Z1的颗粒剂重复制备6组供试品溶液，按照柚皮苷和甘草酸含量测定项下“色谱条件”并进行液相分析。结果如表9所示，检测方法重现性很好，RSD值分别为柚皮苷0.50％，甘草酸铵0.19％，未见显著性差异，均符2015版中国药典四部通则9101药品质量标准分析方法验证指导原则。

表9重复性试验结果

3.3.1.2精密度

取柚皮苷和甘草酸含量测定项下的对照品溶液，采用柚皮苷和甘草酸含量测定项下色谱条件，重复进样6针，计算柚皮苷、甘草酸铵峰面积相对标准偏差，结果如表10所示，柚皮苷6针进样峰面积RSD值为0.12％，甘草酸铵6针进样峰面积的RSD值为0.38％，表明仪器精密度良好，符合2015版中国药典四部通则9101药品质量标准分析方法验证指导原则要求。

表10精密度试验结果

3.3.2准确度

准确度系指采用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率(％)表示。取批号XZ200323Z1的颗粒剂样品，按对照品量与所取供试品中待测定成分量之比为1.5:1，1:1，0.5:1分别加入对照品，制备供试品，并按照柚皮苷和甘草酸含量测定项下色谱条件进行液相分析，进行加样回收率实验(n＝9)，试验结果取平均值。

表11柚皮苷加样回收试验数据

表12甘草酸铵加样回收试验数据

结果如表11和表12，加样回收试验中柚皮苷平均回收率为101.1％，RSD为3.3％；甘草酸铵平均回收率为102.8％，RSD为4.0％，符合2015版《中华国药典》相关规定，方法准确度良好。

3.3.3线性范围

将对照品母液分别稀释为原浓度的100％、80％、50％、40％、25％、20％、2％，进行液相测定。结果所示，得到柚皮苷回归方程Y＝5480.1X-2950.5，R²＝0.9994，线性良好，范围为40.7ng～2035.7ng，其中当柚皮苷量在40.7ng时(最小量值)，S/N为1320.74。甘草酸回归方程Y＝2527.4X-4738.4，R²＝0.9993，线性良好，范围为10.4～492.5ng，当甘草酸铵量在10.4ng时(最小量值)，S/N为219.30。

3.3.4专属性

取供试品溶液，混合标准品溶液，阴性对照溶液按照柚皮苷和甘草酸含量测定“色谱条件的选择”中色谱条件进行液相分析，考察其专属性。

结果所示，柚皮苷(284nm)和甘草酸铵(254nm)在阴性对照样品色谱图对应位置未检测到干扰峰，专属性良好。

3.3.5稳定性

对宣肺败毒组合物供试品溶液进行0h，3h，6h，9h，12h，15h，18h，21h，24h的稳定性考察，结果如表13和表14所示，结果表明，柚皮苷峰面积的RSD值为1.50％，甘草酸铵峰面积的RSD值为0.70％，供试品在24h内稳定，满足系统适应性要求。

表13柚皮苷24h稳定性试验系统适应性

表14甘草酸铵24h稳定性试验系统适应性

综上，经方法学验证，该方法柚皮苷线性回归方程：Y＝5480.1X-2950.5，R²＝0.9994，线性良好，范围为40.7ng～2035.7ng，其中当柚皮苷量在40.7ng时(最小量值)，S/N为1320.74；甘草酸回归方程Y＝2527.4X-4738.4，R²＝0.9993，线性良好，范围为10.6ng～502.7ng，当甘草酸铵量在10.6ng时(最小量值)，S/N为219.30。重复性试验柚皮苷RSD(n＝6)为0.19％，甘草酸铵RSD(n＝6)为0.50％。精密度试验柚皮苷RSD(n＝6)为0.12％，甘草酸铵RSD(n＝6)为0.38％，表明仪器精密度良好。准确度试验中，进行加样回收试验考察，结果柚皮苷平均回收率为101.1％，RSD(n＝9)为3.3％；甘草酸铵平均回收率为102.8％，RSD(n＝9)为4.0％。考察宣肺败毒组合物供试液24h稳定性，结果表明供试品溶液在24h内稳定。

最后应说明的是：本发明并不局限于上述的具体实施方案，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下，但凡在本发明的精神和实质范围内，所作的任何改变、等同替换和改进，均在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种宣肺败毒中药组合物的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括柚皮苷、大黄素、大黄素甲醚、虎杖苷、盐酸麻黄碱的薄层鉴别方法，以及盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、柚皮苷和甘草酸含量测定方法；其中，所述柚皮苷，甘草酸含量测定方法为高效液相色谱法，色谱条件及系统适用性试验为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A：0.05～0.15％甲酸水溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱程序如下：洗脱时间为0～35min，流动相A的比例为95％～30％，流动相B的比例为5％～70％，检测波长：254nm。

2.如权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述柚皮苷和甘草酸含量测定的流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱程序如下：洗脱时间为0min，流动相A的比例为95％，流动相B的比例为5％、洗脱时间为5min，流动相A的比例为90％，流动相B的比例为10％、洗脱时间为10～12min，流动相A的比例为87％，流动相B的比例为13％、洗脱时间为18min，流动相A的比例为81％，流动相B的比例为19％、洗脱时间为21min，流动相A的比例为79％，流动相B的比例为21％、洗脱时间为29min，流动相A的比例为60％，流动相B的比例为40％、洗脱时间为35min，流动相A的比例为30％，流动相B的比例为70％。

3.如权利要求1或2所述检测方法，其中，所述柚皮苷，甘草酸含量测定方法包括如下步骤：

⑴、对照品溶液制备：取柚皮苷、甘草酸铵对照品适量，精密称定，用甲醇配制成每1mL含柚皮苷0.6～1.0mg、甘草酸铵0.1～0.3mg的混合溶液，即得；

⑵、供试品溶液制备：取中药组合物，研细，精密称定，精密加入60～80％甲醇，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用60～80％甲醇补足减失的重量，摇匀，离心8～12min，转速为11000～15000r/min，取续滤液，即得；

⑶、分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。

4.如权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述检测方法中薄层鉴别方法为如下项目(1)～(4)中任意一种或多种的组合：

(1)、柚皮苷的鉴别方法：取本发明中药粉末，加甲醇，超声处理20～40分钟，过滤，滤液蒸干，用甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取柚皮苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.5～1.5mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述两种溶液，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水8～12：4～8：1～3：0.8～1.2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3～7％三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热0.5～1.5分钟，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

(2)、大黄素或大黄素甲醚的鉴别方法：取本发明中药粉末，加甲醇，超声处理20～40分钟，过滤，滤液蒸干，用甲醇使其溶解，再取大黄素对照品或大黄素甲醚对照品，加甲醇制成每1mL各含0.2～0.8mg对照品的溶液，作为对照品溶液；吸取供试品溶液和对照品溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚30～60℃-甲酸乙酯-甲酸13～17:4～6:0.8～1.2的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

(3)、虎杖苷的鉴别方法：取本发明中药粉末，研细，加甲醇，超声处理，滤过，滤液作为供试品溶液；另取虎杖苷对照品，加甲醇制成对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-三氯甲烷-水(23～28:7～11:6～10:3～5)为展开剂，置展开缸中预饱和，展开，取出，晾干，喷以8～12％氢氧化钾甲醇溶液，在紫外光254nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

(4)、盐酸麻黄碱的鉴别方法：取本发明中药粉末，加甲醇，超声处理20～40分钟，过滤，滤液蒸干，用甲醇使溶解，另取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.8～1.2mg的溶液，作为对照品溶液，吸取上述两种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液18～22:4～6:0.4～0.6为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在102～107℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的红色斑点。

5.如权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱含量测定方法为高效液相色谱法，色谱条件及系统适用性试验为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为：乙腈-0.1～0.3％磷酸，比例为：2～4:95～99，检测波长：207nm。

6.如权利要求5所述检测方法，其特征在于，所述检测方法中流动相为：乙腈-0.12％磷酸，比例为：3:97。

7.如权利要求5所述检测方法，其特征在于，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的型号为：COSMOSIL 5C18-MS-II、SHIMADZU VP-ODS、YMC-Pack ODS-A。

8.如权利要求5所述检测方法，其特征在于，所述检测方法中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱含量测定方法包括如下步骤：

⑴、对照品溶液制备：取盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加60～80％甲醇分别制成每1mL各含30～50μg的混合溶液，即得；

⑵、供试品溶液制备：取中药，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入水溶液，超声处理，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，离心2～8min，转速为3000～8000r/min，量取上清液，加浓氨试液，用乙醚振摇提取1～4次，加盐酸乙醇溶液，摇匀，放置，蒸干，残渣加50～80％甲醇使溶解，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

⑶、分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。

9.如权利要求8所述检测方法，其特征在于，所述检测方法中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱含量测定方法包括如下步骤：

⑴、对照品溶液制备：取盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加70％甲醇分别制成每1mL各含40μg的混合溶液，即得；

⑵、供试品溶液制备：取中药，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水溶液，超声处理，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，离心4～7min，转速为5000～7000r/min，量取上清液，加浓氨试液，用乙醚振摇提取3次，加盐酸乙醇5％溶液，摇匀，放置，蒸干，残渣加70％甲醇使溶解，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

⑶、分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。

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