CN114965757B - 川牛膝和/或酒川牛膝的uplc特征图谱构建方法及鉴别与质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及川牛膝和/或酒川牛膝的UPLC特征图谱构建方法及鉴别与质量控制方法。本发明采用超高效液相色谱法，以乙腈‑0.2％含酸水溶液为洗脱剂，在特定的梯度洗脱条件下构建得到川牛膝和/或酒川牛膝的UPLC特征图谱，具有分析效率高，基线平稳，特征峰分布均匀，杂峰少，分离度好，精密度高，稳定性好，准确可靠的优点，可对川牛膝和酒川牛膝进行真伪和品质鉴定，有效解决了现有技术对川牛膝或者酒川牛膝鉴别和质量控制不准确的缺陷。本发明还通过对酒川牛膝标准汤剂的性状、出膏率、薄层鉴别、浸出物、杯苋甾酮含量测定进行了研究，结合特征图谱建立了一种酒川牛膝标准汤剂的质量控制方法。

Description

川牛膝和/或酒川牛膝的UPLC特征图谱构建方法及鉴别与质 量控制方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，特别涉及一种川牛膝和/或酒川牛膝的UPLC特征图谱构建方法及鉴别与质量控制方法。

背景技术

川牛膝为苋科植物川牛膝Cyathula officinalis Kuan的干燥根，为2020版《中国药典》收载的常用中药材，具有逐瘀通经，通利关节，利尿通淋之作用，主要用于经闭癍瘕，胞衣不下，跌扑损伤，风湿痹痛，足痿筋挛，尿血血淋；其性味甘、微苦，平，归肝、肾经。酒川牛膝是川牛膝的炮制加工品，也是中医常用中药，川牛膝经酒炙后，可增强逐瘀通经，通利关节的作用，可用于关节痹痛，足痿筋挛，跌仆损伤，及肾虚腰痛等症。

对于中药材而言，由于复杂的自然环境、社会状况、人文因素等多种原因，造成了中药材在应用方面的复杂性，比如同一名称的中药材可能来自不同基源的植物，同一基源的中药材因产地、采收季节、生长年限等的不同，使得其化学组成有可能不同，这必然会影响中药的质量和临床疗效。因此，建立准确有效的鉴别中药材的方法—中药特征图谱，是当前解决上述问题的主要技术手段之一。

现有技术公开了一种川牛膝和/或酒川牛膝的HPLC特征图谱构建方法，该方法是采用Kromasil 100-5C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)、柱温为30℃、流速为0.5mL/min、理论板数按杯苋甾酮峰计算应不低于2000、检测波长为266nm、以乙腈-0.2％磷酸溶液为流动相，采用梯度洗脱方式构建特征图谱，所得酒川牛膝的HPLC对照特征图谱如图1所示，川牛膝的HPLC对照特征图谱如图2所示。由图1和图2可知，根据上述方法构建的特征图谱分析时间都很长，约80分钟，基线不平稳，波动大，杂峰较多，并且图1中峰3、峰4、峰5的分离度相对较差，图2中峰2、峰3、峰4的分离度相对较差，导致通过这两个特征图谱鉴别酒川牛膝、川牛膝时存在不准确的缺陷。同时，该现有技术还公开了利用特征图谱来区分酒川牛膝和川牛膝，但没有提供如何鉴别牛膝与川牛膝和/或酒川牛膝的方法，而在日常生活中人们容易将名称相近的牛膝与川牛膝和/或酒川牛膝混淆，因此有必要提供一种牛膝与川牛膝和/或酒川牛膝的鉴别方法。另外，现有技术未见针对酒川牛膝药物制剂的质量控制方法的报道。

发明内容

鉴于此，本发明首要解决的技术问题在于现有的川牛膝和/或酒川牛膝特征图谱在鉴别川牛膝和/或酒川牛膝时存在不准确的缺陷，从而提供一种川牛膝和/或酒川牛膝的UPLC特征图谱构建方法。

本发明要解决的另一个技术问题在于现有技术没有提供牛膝与川牛膝和/或酒川牛膝的鉴别方法，从而提供一种川牛膝和/或酒川牛膝的薄层鉴别方法，该方法可区分牛膝与川牛膝和/或酒川牛膝。

本发明要解决的另一个技术问题在于提供一种酒川牛膝药物制剂的质量控制方法，以全面控制酒川牛膝药物制剂的质量。

为此，本发明提供如下技术方案：

一方面，本发明提供了一种川牛膝和/或酒川牛膝的UPLC特征图谱构建方法，包括如下步骤：

供试品溶液的制备：取川牛膝供试品制备得到川牛膝供试品溶液；和/或，取酒川牛膝供试品制备得到酒川牛膝供试品溶液；

超高效液相色谱法：将川牛膝供试品溶液和/或酒川牛膝供试品溶液注入液相色谱仪，检测，即得；

其中，超高效液相色谱法的色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.2％含酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱条件如下：0min→4min，5％→10％流动相A，95％→90％流动相B；4min→9min，10％→15％流动相A，90％→85％流动相B；9min→12min，15％→20％流动相A，85％→80％流动相B；12min→20min，20％→30％流动相A，80％→70％流动相B；20min→25min，30％→70％流动相A，70％→30％流动相B。

可选地，所述含酸水溶液选自磷酸水溶液、醋酸水溶液和甲酸水溶液中的至少一种，特别优选为磷酸水溶液。

可选地，所述色谱条件还包括：采用Waters ACQUITY BEH C18 150mm×2.1mm 1.7μm色谱柱，柱温为28-32℃，流速为0.3mL/min，检测波长为266nm，理论板数按杯苋甾酮峰计算应不低于8000。

可选地，在所述酒川牛膝供试品溶液的制备过程中，包括采用溶剂对酒川牛膝供试品进行提取的步骤。进一步优选地，采用的溶剂为体积分数为30％的甲醇水溶液，提取的方式为超声提取，酒川牛膝供试品的质量与溶剂的体积比为1:25g/mL。更优选地，所述超声提取的功率为300W，频率为40kHz，时间为30min。

可选地，在所述川牛膝供试品溶液或者酒川牛膝供试品溶液的制备过程中，包括对供试品先水提再醇提的步骤。优选地，水提时供试品的质量与水的体积比为1:25g/mL，水提方式为加热回流45min，之后过滤，滤液蒸干，再对残渣醇提，醇提时采用体积分数为30％的甲醇水溶液，醇提方式为超声提取。更优选地，所述超声提取的功率为300W，频率为40kHz，时间为30min。

可选地，所述构建方法还包括对照品溶液的制备步骤、以及按照本发明提供的川牛膝和/或酒川牛膝的UPLC特征图谱构建方法中的超高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品特征图谱的步骤。

优选地，在所述对照品溶液的制备过程中包括采用溶剂对杯苋甾酮进行溶解的步骤；更优选地，采用的溶剂为体积分数≥50％的甲醇水溶液或纯甲醇，对照品溶液中杯苋甾酮的浓度为10-30μg/mL。

优选地，在所述对照品溶液的制备过程中包括采用溶剂对5-羟甲基糠醛进行溶解的步骤；更优选地，采用的溶剂为体积分数为10～70％的甲醇水溶液，对照品溶液中5-羟甲基糠醛的浓度为10-30μg/mL。

可选地，所述构建方法还包括参照物溶液的制备步骤、以及按照本发明提供的川牛膝和/或酒川牛膝的UPLC特征图谱构建方法中的超高效液相色谱法检测参照物溶液得到参照物特征图谱的步骤。

优选地，在所述参照物溶液的制备过程中包括，采用体积分数为30％的甲醇水溶液对川牛膝对照药材进行超声提取；更优选地，所述超声提取的功率为300W，频率为40kHz，时间为30min。

根据本发明提供的川牛膝和/或酒川牛膝的UPLC特征图谱构建方法得到的川牛膝和/或酒川牛膝的UPLC特征图谱。

一种川牛膝的UPLC对照特征图谱，选自如下任意一项：

(1)其含有7个特征峰，各特征峰与峰5的相对保留时间在规定值的土10％范围之内，规定值为0.47(峰1)、0.49(峰2)、0.72(峰3)、0.97(峰4)、1.11(峰6)、1.37(峰7)；

(2)使用单批次或多批次川牛膝道地药材并按照本发明提供的川牛膝和/或酒川牛膝的UPLC特征图谱构建方法得到的川牛膝UPLC特征图谱；

(3)使用多批川牛膝按照本发明提供的川牛膝和/或酒川牛膝的UPLC特征图谱构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照谱图。

一种酒川牛膝的UPLC对照特征图谱，选自如下任意一项：

(1)包含8个特征峰，各特征峰与峰6的相对保留时间在规定值的土10％范围之内，规定值为0.47(峰2)、0.49(峰3)、0.72(峰4)、0.97(峰5)、1.11(峰7)、1.37(峰8)，且峰1与峰6的相对峰面积应不低于0.34或0.13；

(2)包含8个特征峰，其中峰6为杯苋甾酮参照峰S，峰1为5-羟甲基糠醛；各特征峰与峰S的相对保留时间在规定值的土10％范围之内，规定值为0.47(峰2)、0.49(峰3)、0.72(峰4)、0.97(峰5)、1.11(峰7)、1.37(峰8)，且峰1与峰S的相对峰面积应不低于0.34或0.13；

(3)使用单批次或多批次川牛膝道地药材按照药典方法炮制的酒川牛膝药材并按照本发明提供的川牛膝和/或酒川牛膝的UPLC特征图谱构建方法得到的酒川牛膝UPLC特征图谱；

(4)使用多批酒川牛膝按照本发明提供的川牛膝和/或酒川牛膝的UPLC特征图谱构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照谱图。

另一方面，本发明提供了一种川牛膝和/或酒川牛膝的鉴别方法，包括将待测产品的特征图谱与川牛膝对照特征图谱和/或酒川牛膝对照特征图谱进行比较的步骤；所述待测产品的特征图谱为使用待测产品按照本发明提供的川牛膝和/或酒川牛膝的UPLC特征图谱构建方法得到，所述川牛膝对照特征图谱为本发明提供的川牛膝UPLC对照特征图谱，所述酒川牛膝对照特征图谱为本发明提供的酒川牛膝UPLC对照特征图谱。

可选地，所述鉴别方法还包括采用薄层色谱方法鉴别牛膝与川牛膝和/或酒川牛膝的步骤，具体为：分别吸取待测产品溶液、川牛膝溶液、酒川牛膝溶液、杯苋甾酮溶液，点于同一硅胶薄层板上，以体积比为10:1:2:1的乙酸乙酯-甲酸-甲醇-水体系为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇试液，热风吹干，置紫外光灯下检视；其中，

所述酒川牛膝溶液的制备方法为：甲醇超声提取，酒川牛膝药物制剂的质量与甲醇的体积比为1:40g/mL，之后滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解；所述酒川牛膝药物制剂为酒川牛膝配方颗粒或酒川牛膝标准汤剂冻干粉；

所述川牛膝溶液的制备方法为：先水提再醇提，水提时川牛膝药材的质量与水的体积比为1:50g/mL，水提方式为加热回流30min，之后过滤，滤液蒸干，再对残渣醇提，醇提时采用甲醇超声提取，之后滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解；

所述杯苋甾酮溶液的制备方法为：取杯苋甾酮对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg杯苋甾酮的溶液；

所述待测产品溶液的制备方法为：若待测产品为药材或饮片，其制备方法同所述川牛膝溶液的制备方法；若待测产品为药物制剂，其制备方法同所述酒川牛膝溶液的制备方法。

第三方面，本发明提供了一种川牛膝的质量控制方法，包括将待测川牛膝产品的特征图谱与川牛膝UPLC对照特征图谱进行比较的步骤；其中，所述待测川牛膝产品的特征图谱为使用待测产品按照本发明提供的川牛膝和/或酒川牛膝的UPLC特征图谱构建方法得到，所述川牛膝对照特征图谱为本发明提供的川牛膝UPLC对照特征图谱。

本发明还提供了一种酒川牛膝药物制剂的质量控制方法，包括将待测酒川牛膝产品的特征图谱与酒川牛膝对照特征图谱进行比较的步骤；其中，所述酒川牛膝药物制剂为酒川牛膝配方颗粒或酒川牛膝标准汤剂冻干粉；所述待测酒川牛膝产品的特征图谱为使用待测产品按照本发明提供的川牛膝和/或酒川牛膝的UPLC特征图谱构建方法得到，所述酒川牛膝对照特征图谱为本发明提供的酒川牛膝UPLC对照特征图谱。

可选地，所述的质量控制方法还包括选自如下任意一项：

（1）性状为浅黄色至棕黄色的粉末或颗粒；气微，味甘；

（2）酒川牛膝配方颗粒的浸出物的质量百分含量不少于9.0%；或者酒川牛膝标准汤剂冻干粉的浸出物的质量百分含量不少于14.0%；

（3）酒川牛膝配方颗粒的干浸膏出膏率为40.0%～60.0%；或者酒川牛膝标准汤剂的干浸膏出膏率为40.0%～62.0%；

（4）如本发明提供的鉴别方法；

（5）HPLC含量测定方法，具体为：

待测产品溶液的制备：采用甲醇水溶液超声提取；优选地，甲醇水溶液的体积分数为70%，待测产品的质量与甲醇水溶液的体积之比为1:40g/mL，所述超声提取的功率为300W，频率为40kHz，时间为30min，之后，用70%甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液；

对照品溶液的制备：取杯苋甾酮对照品，加甲醇制成每 1mL 含 25μg 杯苋甾酮的溶液；

色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以水为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱条件如下：0min→5min，10%流动相A，90%流动相B；5min→15min，10%→35%流动相A，90%→65%流动相B；15min→35min，35%流动相A，65%流动相B；35min→36min，35%→100%流动相A，65%→0%流动相B；流速为每分钟1.0 mL；柱温25℃；检测波长为243nm；理论板数按杯苋甾酮峰计算应不低于3000；

测定法：分别精密吸取对照品溶液、待测产品溶液各10ul，注入液相色谱仪，按照上述色谱条件测定，每1g酒川牛膝配方颗粒含杯苋甾酮应为0.4~1.6mg或者每1g酒川牛膝标准汤剂冻干粉含杯苋甾酮应为0.7~1.8mg。

对照品溶液的制备：取杯苋甾酮对照品，加甲醇制成每1mL含25μg杯苋甾酮的溶液；

色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以水为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱条件如下：0min→5min，10％流动相A，90％流动相B；5min→15min，10％→35％流动相A，90％→65％流动相B；15min→35min，35％流动相A，65％流动相B；35min→36min，35％→100％流动相A，65％→0％流动相B；流速为每分钟1.0mL；柱温25℃；检测波长为243nm；理论板数按杯苋甾酮峰计算应不低于3000；

测定法：分别精密吸取对照品溶液、待测产品溶液各10ul，注入液相色谱仪，按照上述色谱条件测定，每1g酒川牛膝配方颗粒含杯苋甾酮应为0.4～1.6mg或者每1g酒川牛膝标准汤剂冻干粉含杯苋甾酮应为0.7～1.8mg。

本发明中，峰1表示1号峰，峰2表示2号峰，以此类推。

本发明中，所述待测产品可以是川牛膝或者酒川牛膝产品，也可以是除了川牛膝或者酒川牛膝之外的其他产品。所述待测川牛膝产品可以采用药材、饮片或者制剂，例如选自川牛膝药材、川牛膝饮片、川牛膝标准汤剂冻干粉、川牛膝配方颗粒中的至少一种。所述待测酒川牛膝产品可以采用饮片或者制剂，例如选自酒川牛膝饮片、酒川牛膝标准汤剂冻干粉、酒川牛膝配方颗粒中的至少一种。

若待测产品与川牛膝对照特征图谱相一致，则为川牛膝；若与酒川牛膝对照特征图谱相一致，则为酒川牛膝；若与川牛膝对照特征图谱和酒川牛膝对照特征图谱均不相一致，则不是川牛膝和酒川牛膝。

若待测川牛膝产品的特征图谱与川牛膝对照特征图谱不能匹配，则可以认为是伪品。若待测酒川牛膝产品的特征图谱与酒川牛膝对照特征图谱不能匹配，则可以认为是伪品。

当待测产品为酒川牛膝饮片时，UPLC特征图谱中峰1与S峰的相对峰面积不低于0.34，说明炮制工艺合格，产品质量合格。当待测产品为酒川牛膝标准汤剂冻干粉或酒川牛膝配方颗粒时，UPLC特征图谱中峰1与S峰的相对峰面积不低于0.13，说明炮制工艺合格，产品质量合格。

将本发明构建得到的酒川牛膝UPLC特征图谱与川牛膝UPLC特征图谱进行共有峰的指认，发现特征峰数量发生了变化，主要体现为酒川牛膝特征图谱中的峰1存在于炮制后的酒川牛膝饮片中，川牛膝特征图谱中相应位置缺失。也就是说通过酒川牛膝UPLC特征图谱中的峰1可用于鉴别川牛膝(生品)与酒川牛膝(炮制品)。而且峰1与S峰的相对峰面积受不同炮制程度有所影响，除峰1外，其余7个特征峰与川牛膝UPLC特征图谱中特征峰保留时间一致，其他7个特征峰未发生明显变化，特征性成分量值传递关系良好。说明可以通过控制酒川牛膝UPLC特征图谱中峰1的相对峰面积可作为酒川牛膝的炮制程度的评价指标。综合质谱和对照品定位结果，本发明确认峰1为5-羟甲基糠醛，通过制定其与S峰的相对峰面积的规定值，可在终端产品种起到区分和控制酒川牛膝产品的质量。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下优点：

1.本发明提供的川牛膝和/或酒川牛膝的UPLC特征图谱构建方法，采用超高效液相色谱法对川牛膝和/或酒川牛膝的有效成分进行检测，经过多次反复试验，采用C18色谱柱，以乙腈为流动相A，以体积分数为0.2％含酸水溶液为流动相B，并在特定的梯度洗脱条件下构建得到川牛膝和/或酒川牛膝的UPLC特征图谱，与现有的川牛膝和/或酒川牛膝的HPLC特征图谱相比，本发明的川牛膝和/或酒川牛膝的UPLC特征图谱分析效率更高，约25分钟，基线更平稳，特征峰分布更均匀，杂峰少，分离度更好，虽与现有技术的共有峰数量相同，但特征峰不完全一致。并且，本发明具有精密度高，稳定性好，准确可靠的优点，可以对川牛膝和酒川牛膝进行真伪和品质鉴定，有效解决了现有方法对川牛膝或者酒川牛膝鉴别和质量控制不准确的缺陷。

本发明提供的川牛膝和/或酒川牛膝的UPLC特征图谱构建方法，注重各个特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因测定一、二个化学成分而判定饮片质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性；而且特征图谱中共有色谱峰出峰时间适中，纯度高，容易定位，可用于准确判定川牛膝和酒川牛膝的质量。

2.本发明提供的川牛膝和/或酒川牛膝的UPLC特征图谱，其中川牛膝的UPLC特征图谱包含7个共有色谱峰，酒川牛膝的UPLC特征图谱包含8个共有色谱峰，并确定了7个特征峰为川牛膝和酒川牛膝共有，1个特征峰为川牛膝炮制后得到产生的，是炮制后的酒川牛膝特有的，综合质谱和对照品定位结果，本发明确认该特有峰为5-羟甲基糠醛，通过制定其与S峰的相对峰面积的规定值，可在终端产品种起到区分和控制酒川牛膝产品的质量。本发明的川牛膝和/或酒川牛膝的UPLC特征图谱在用于定性分析川牛膝与酒川牛膝的质量的同时，还能有效地辨别产品的真伪。

3.本发明提供的川牛膝和/或酒川牛膝的鉴别方法，除采用特征图谱之外，还首次提出通过薄层色谱来鉴别牛膝与川牛膝和/或酒川牛膝，薄层色谱的操作更简单，从而使得本发明的鉴别方法更加快速高效。

4.本发明提供的川牛膝和/或酒川牛膝的质量控制方法，通过将待测产品特征图谱的特征峰信息，例如相对保留时间与相对峰面积，与川牛膝和/或酒川牛膝的UPLC特征图谱进行比较，较传统的单指标成分含量测定作为质量控制依据更具科学性和可持续性，能够全面的对川牛膝和/或酒川牛膝进行质量控制。且共有的7个特征峰能够从川牛膝到酒川牛膝中稳定传递，同时出峰时间稳定适中，纯度高，容易定位和计算相对峰面积；且酒川牛膝在炮制过程中，不同批次间炮制的酒量、闷润程度以及炒制程度等均不影响特征图谱的构建及得到的特征图谱中特征峰的相对保留时间等。

5.本发明提供的酒川牛膝药物制剂的质量控制方法，除采用特征图谱之外，还可以通过性状、浸出物含量、出膏率、HPLC含量测定等多种手段实现对酒川牛膝药物制剂的全面质量控制，从而更好地确保酒川牛膝药物制剂的质量稳定性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是现有技术中酒川牛膝的HPLC对照特征图谱；图2是现有技术中川牛膝的HPLC对照特征图谱；图3是本发明实施例1中采用色谱柱1的UPLC色谱图；图4是本发明实施例1中采用色谱柱2的UPLC色谱图；图5是本发明实施例1中采用色谱柱3的UPLC色谱图；图6是本发明实施例1中采用色谱柱4的UPLC色谱图；图7是本发明实施例1中采用梯度1的UPLC色谱图；图8是本发明实施例1中采用梯度2的UPLC色谱图；图9是本发明实施例1中采用梯度3的UPLC色谱图；图10是本发明实施例1中采用乙腈-0.2％磷酸的UPLC色谱图；图11是本发明实施例1中采用甲醇-0.2％磷酸的UPLC色谱图；图12是本发明实施例1中采用乙腈-0.2％磷酸的UPLC色谱图；图13是本发明实施例1中采用乙腈-0.2％醋酸的UPLC色谱图；图14是本发明实施例1中采用乙腈-0.2％甲酸的UPLC色谱图；图15是本发明实施例1中在柱温28℃条件下的UPLC色谱图；图16是本发明实施例1中在柱温30℃条件下的UPLC色谱图；图17是本发明实施例1中在柱温32℃条件下的UPLC色谱图；图18是本发明实施例1中采用Agilent 1290Ⅱ仪器的UPLC色谱图；图19是本发明实施例1中采用waters H-class仪器的UPLC色谱图；图20是本发明实施例1最终得到的酒川牛膝配方颗粒的UPLC色谱图；图21是本发明实施例1最终得到的酒川牛膝配方颗粒的UPLC色谱图中色谱峰1(5-羟甲基糠醛)的LC/MS/MS图谱；图22是本发明实施例1中5-羟甲基糠醛对照品的LC/MS/MS图谱；图23是本发明实施例1最终得到的酒川牛膝配方颗粒的UPLC色谱图中色谱峰1(5-羟甲基糠醛)的紫外吸收图谱；图24是本发明实施例1中5-羟甲基糠醛对照品的紫外吸收图谱；图25是本发明实施例1最终得到的酒川牛膝配方颗粒的UPLC色谱图中色谱峰6(杯苋甾酮)的LC/MS/MS图谱；图26是本发明实施例1中杯苋甾酮对照品的LC/MS/MS图谱；图27是本发明实施例1中杯苋甾酮对照品的紫外吸收图谱；图28是本发明实施例1最终得到的酒川牛膝配方颗粒的UPLC色谱图中色谱峰6(杯苋甾酮)的紫外吸收图谱；图29是本发明实施例1中杯苋甾酮对照品的UPLC色谱图；图30是本发明实施例1中5-羟甲基糠醛对照品的UPLC色谱图；图31是本发明实施例1中酒川牛膝配方颗粒的的UPLC色谱图；图32是本发明实施例1仪器精密度考察中获得的色谱图；图33是本发明实施例1重复性考察中获得的色谱图；图34是本发明实施例1专属性考察中获得的供试品色谱图；图35是本发明实施例1专属性考察中获得的阴性对照色谱图；图36是本发明实施例1中人员甲测得的色谱图；图37是本发明实施例1中人员乙测得的色谱图；图38是本发明实施例1中人员丙测得的色谱图；图39是本发明实施例1中稳定性色谱图；图40是本发明实施例1中流速0.28mL/min下的色谱图；图41是本发明实施例1中流速0.30mL/min下的色谱图；图42是本发明实施例1中流速0.32mL/min下的色谱图；图43是本发明实施例1中柱温28℃条件下的色谱图；图44是本发明实施例1中柱温30℃条件下的色谱图；图45是本发明实施例1中柱温32℃条件下的色谱图；图46是本发明实施例1中采用ACQUITY UPLC BEH C18型号色谱柱03933111928367批号获得的色谱图；图47是本发明实施例1中采用ACQUITY UPLC BEH C18型号色谱柱03503926315165批号获得的色谱图；图48是本发明实施例1中采用ACQUITYUPLC BEH C18型号色谱柱04083123718391批号获得的色谱图；图49是本发明实施例1中采用安捷伦仪器获得的色谱图；图50是本发明实施例1中采用Waters仪器获得的色谱图；图51是本发明实施例2中3批次酒川牛膝配方颗粒UPLC特征图谱共有峰模式；图52是本发明实施例2中酒川牛膝配方颗粒对照特征图谱；图53是本发明实施例3中杯苋甾酮对照品的色谱图；图54是本发明实施例3中5-羟甲基糠醛对照品的色谱图；图55是本发明实施例3中酒川牛膝饮片供试品的色谱图；图56是本发明实施例3仪器精密度考察中获得的色谱共有模式图；图57是本发明实施例3重复性考察中获得的色谱共有模式图；图58是本发明实施例3不同人员中间精密度考察中获得的色谱共有模式图；图59是本发明实施例3中采用安捷伦仪器获得的色谱图；图60是本发明实施例3中采用Waters仪器获得的色谱图；图61是本发明实施例3中采用ACQUITYUPLC BEH C18色谱柱03933111928367批号获得的色谱图；图62是本发明实施例3中采用ACQUITYUPLC BEH C18色谱柱03503926315165批号获得的色谱图；图63是本发明实施例3中采用ACQUITYUPLC BEH C18色谱柱04083123718391批号获得的色谱图；图64是本发明实施例3专属性考察中获得的阴性空白供试品色谱图；图65是本发明实施例3专属性考察中获得的供试品色谱图；图66是本发明实施例3中稳定性色谱共有模式图；图67是本发明实施例3中流速0.28mL/min下的色谱图；图68是本发明实施例3中流速0.30mL/min下的色谱图；图69是本发明实施例3中流速0.32mL/min下的色谱图；图70是本发明实施例3中柱温28℃条件下的色谱图；图71是本发明实施例3中柱温30℃条件下的色谱图；图72是本发明实施例3中柱温32℃条件下的色谱图；图73是本发明实施例3中15批次酒川牛膝饮片UPLC特征图谱共有峰模式；图74是本发明实施例3中酒川牛膝饮片对照特征图谱；图75是本发明实施例5中杯苋甾酮对照品的色谱图；图76是本发明实施例5中5-羟甲基糠醛对照品的色谱图；图77是本发明实施例5中酒川牛膝冻干粉供试品的色谱图；图78是本发明实施例5仪器精密度考察中获得的色谱共有模式图；图79是本发明实施例5重复性考察中获得的色谱共有模式图；图80是本发明实施例5专属性考察中获得的供试品色谱图；图81是本发明实施例5专属性考察中获得的阴性空白供试品色谱图；图82是本发明实施例5中人员甲测得的色谱图；图83是本发明实施例5中人员乙测得的色谱图；图84是本发明实施例5中人员丙测得的色谱图；图85是本发明实施例5中稳定性色谱共有模式图；图86是本发明实施例5中流速0.28mL/min下的色谱图；图87是本发明实施例5中流速0.30mL/min下的色谱图；图88是本发明实施例5中流速0.32mL/min下的色谱图；图89是本发明实施例5中柱温28℃条件下的色谱图；图90是本发明实施例5中柱温30℃条件下的色谱图；图91是本发明实施例5中柱温32℃条件下的色谱图；图92是本发明实施例5中采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱03933111928367批号获得的色谱图；图93是本发明实施例5中采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱03503926315165批号获得的色谱图；图94是本发明实施例5中采用ACQUITY UPLCBEH C18色谱柱04083123718391批号获得的色谱图；图95是本发明实施例5中采用安捷伦仪器获得的色谱图；图96是本发明实施例5中采用Waters仪器获得的色谱图；图97是本发明实施例6中15批次酒川牛膝冻干粉UPLC特征图谱共有峰模式；图98是本发明实施例6中酒川牛膝冻干粉对照特征图谱；图99是本发明实施例7中杯苋甾酮对照品的色谱图；图100是本发明实施例7中川牛膝药材供试品的色谱图；图101是本发明实施例7仪器精密度考察中获得的色谱共有模式图；图102是本发明实施例7重复性考察中获得的色谱共有模式图；图103是本发明实施例7不同人员中间精密度考察中获得的色谱共有模式图；图104是本发明实施例7中采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱03933111928367批号获得的色谱图；图105是本发明实施例7中采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱03503926315165批号获得的色谱图；图106是本发明实施例7中采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱04083123718391批号获得的色谱图；图107是本发明实施例7专属性考察中获得的阴性空白供试品色谱图；图108是本发明实施例7专属性考察中获得的供试品色谱图；图109是本发明实施例7中稳定性色谱共有模式图；图110是本发明实施例7中流速0.28mL/min下的色谱图；图111是本发明实施例7中流速0.30mL/min下的色谱图；图112是本发明实施例7中流速0.32mL/min下的色谱图；图113是本发明实施例7中柱温28℃条件下的色谱图；图114是本发明实施例7中柱温30℃条件下的色谱图；图115是本发明实施例7中柱温32℃条件下的色谱图；图116是本发明实施例8中15批次川牛膝药材UPLC特征图谱共有峰模式；图117是本发明实施例8中川牛膝药材对照特征图谱；图118是本发明实施例9中杯苋甾酮对照品的色谱图；图119是本发明实施例9中川牛膝饮片供试品的色谱图；图120是本发明实施例9中川牛膝饮片对照特征图谱；图121是本发明实施例11中药材、饮片、酒饮片和标准汤剂对照图谱共有模式(其中S1为川牛膝药材对照图谱，S2为川牛膝饮片对照图谱，S3为酒川牛膝饮片对照图谱，S4为酒川牛膝标准汤剂冻干粉对照图谱)；图122为本发明实施例12中不同点样量条件下酒川牛膝配方颗粒薄层鉴别色谱图(其中T：23.5℃，RH：56％，1.酒川牛膝配方颗粒(1μL)，2.酒川牛膝配方颗粒(3μL)，3.酒川牛膝配方颗粒(5μL)，4.酒川牛膝配方颗粒(8μL)，5.酒川牛膝配方颗粒(10μL)，6.川牛膝对照药材(1μL)，7.川牛膝对照药材(3μL)，8.川牛膝对照药材(5μL)，9.川牛膝对照药材(8μL)，10.川牛膝对照药材(10μL)，11.杯苋甾酮对照品(3μL)，12.阴性对照(5μL))；图123为本发明实施例12在T＝4.0℃(低温)且RH＝56％条件下酒川牛膝配方颗粒薄层鉴别色谱图(其中，1.酒川牛膝配方颗粒(1909001Y)，2.酒川牛膝配方颗粒(1909002Y)，3.酒川牛膝配方颗粒(1909003Y)，4.川牛膝对照药材，5.杯苋甾酮对照品(3μL))；图124为本发明实施例12在T＝23.5℃(常温)且RH＝56％条件下酒川牛膝配方颗粒薄层鉴别色谱图(其中，1.酒川牛膝配方颗粒(1909001Y)，2.酒川牛膝配方颗粒(1909002Y)，3.酒川牛膝配方颗粒(1909003Y)，4.川牛膝对照药材，5.杯苋甾酮对照品(3μL))；图125为本发明实施例12在T＝23.5℃(常温)且RH＝88％(高湿)条件下酒川牛膝配方颗粒薄层鉴别色谱图(其中，1.酒川牛膝配方颗粒(1909001Y)，2.酒川牛膝配方颗粒(1909002Y)，3.酒川牛膝配方颗粒(1909003Y)，4.川牛膝对照药材，5.杯苋甾酮对照品(3μL))；图126为本发明实施例12在T＝23.5℃(常温)且RH＝32％(低湿)条件下酒川牛膝配方颗粒薄层鉴别色谱图(其中，1.酒川牛膝配方颗粒(1909001Y)，2.酒川牛膝配方颗粒(1909002Y)，3.酒川牛膝配方颗粒(1909003Y)，4.川牛膝对照药材，5.杯苋甾酮对照品(3μL))；图127为本发明实施例12采用青岛硅胶H板获得的酒川牛膝配方颗粒薄层鉴别色谱图(其中，T：23.5℃，RH：53％，1.酒川牛膝配方颗粒(1909001Y)，2.酒川牛膝配方颗粒(1909002Y)，3.酒川牛膝配方颗粒(1909003Y)，4.川牛膝对照药材，5.杯苋甾酮对照品(3μL))；图128为本发明实施例12采用烟台板获得的酒川牛膝配方颗粒薄层鉴别色谱图(其中，T：23.5℃，RH：53％，1.酒川牛膝配方颗粒(1909001Y)，2.酒川牛膝配方颗粒(1909002Y)，3.酒川牛膝配方颗粒(1909003Y)，4.川牛膝对照药材，5.杯苋甾酮对照品(3μL))；图129为本发明实施例12采用Merck板获得的酒川牛膝配方颗粒薄层鉴别色谱图(其中，T：23.5℃，RH：53％，1.酒川牛膝配方颗粒(1909001Y)，2.酒川牛膝配方颗粒(1909002Y)，3.酒川牛膝配方颗粒(1909003Y)，4.川牛膝对照药材，5.杯苋甾酮对照品(3μL))；图130为本发明实施例12中实验人员甲的酒川牛膝配方颗粒薄层鉴别色谱图(其中，T：23.5℃，RH：56％，1.酒川牛膝配方颗粒(1909001Y)，2.酒川牛膝配方颗粒(1909002Y)，3.酒川牛膝配方颗粒(1909003Y)，4.川牛膝对照药材，5.杯苋甾酮对照品(3μL)；图131为本发明实施例12中牛膝与川牛膝、不同批号酒川牛膝配方颗粒的薄层鉴别色谱图(其中，T：23.5℃，RH：56％，1.酒川牛膝配方颗粒(1909001Y)，2.酒川牛膝配方颗粒(1909002Y)，3.酒川牛膝配方颗粒(1909003Y)，4.川牛膝对照药材，5.杯苋甾酮对照品(3μL)，6.牛膝对照药材，7.阴性对照(10μL))；图132为本发明实施例13获得的薄层色谱图(其中1.酒川牛膝冻干粉1907001Y，2.酒川牛膝冻干粉1907002Y，3.酒川牛膝冻干粉1907003Y，4.酒川牛膝冻干粉1907004Y，5.酒川牛膝冻干粉1907005Y，6.酒川牛膝冻干粉1907006Y，7.酒川牛膝冻干粉1907007Y，8.酒川牛膝冻干粉1907008Y，9.酒川牛膝冻干粉1907009Y，10.酒川牛膝冻干粉1907010Y，11.酒川牛膝冻干粉1907011Y，12.酒川牛膝冻干粉1907012Y，13.酒川牛膝冻干粉1907013Y，14.酒川牛膝冻干粉1907014Y，15.酒川牛膝冻干粉1907015Y，16.川牛膝对照药材，17.杯苋甾酮对照品)；图133为本发明实施例13中梯度1供试品色谱图；图134为本发明实施例13中梯度2供试品色谱图；图135为本发明实施例13中梯度2采用Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱的供试品色谱图；图136为本发明实施例13中梯度2采用Agilent Extend C18色谱柱的供试品色谱图；图137为本发明实施例13中梯度2采用Kromasil 100-5C18色谱柱的供试品色谱图；图138为本发明实施例13中梯度2采用ThermoU3000仪器的供试品色谱图；图139为本发明实施例13中梯度2采用Agilent 1200仪器的供试品色谱图；图140为本发明实施例13中梯度2采用Waters e2695仪器的供试品色谱图；图141为本发明实施例13中采用流速0.8mL/min的供试品色谱图；图142为本发明实施例13中采用流速1.0mL/min的供试品色谱图；图143为本发明实施例13中采用流速1.2mL/min的供试品色谱图；图144为本发明实施例13中采用柱温20℃的供试品色谱图；图145为本发明实施例13中采用柱温25℃的供试品色谱图；图146为本发明实施例13中采用柱温30℃的供试品色谱图；图147为本发明实施例13中色谱条件确定后杯苋甾酮对照品色谱图；图148为本发明实施例13中色谱条件确定后供试品色谱图；图149为本发明实施例13中采用超声提取方式获得的色谱图；图150为本发明实施例13中采用回流提取方式获得的色谱图；图151为本发明实施例13中采用水提方式获得的色谱图；图152为本发明实施例13中采用乙醇提取方式获得的色谱图；图153为本发明实施例13中采用甲醇提取方式获得的色谱图；图154为本发明实施例13中采用70％甲醇提取方式获得的色谱图；图155为本发明实施例13中采用50％甲醇提取方式获得的色谱图；图156为本发明实施例13中采用30％甲醇提取方式获得的色谱图；图157为本发明实施例13中超声20分钟获得的色谱图；图158为本发明实施例13中超声30分钟获得的色谱图；图159为本发明实施例13中超声45分钟获得的色谱图；图160为本发明实施例13中超声60分钟获得的色谱图；图161为本发明实施例13中200W功率获得的色谱图；图162为本发明实施例13中250W功率获得的色谱图；图163为本发明实施例13中300W功率获得的色谱图；图164为本发明实施例13中350W功率获得的色谱图；图165为本发明实施例13中20mL溶剂获得的色谱图；图166为本发明实施例13中50mL溶剂获得的色谱图；图167为本发明实施例13中100mL溶剂获得的色谱图；图168为本发明实施例13中0.3g称样量获得的色谱图；图169为本发明实施例13中0.4g称样量获得的色谱图；图170为本发明实施例13中0.5g称样量获得的色谱图；图171为本发明实施例13中0.6g称样量获得的色谱图；图172为本发明实施例13中杯苋甾酮色谱图；图173为本发明实施例13中酒川牛膝标准汤剂冻干粉供试品色谱图；图174为本发明实施例13中酒川牛膝标准汤剂冻干粉空白对照色谱图；图175为本发明实施例13中酒川牛膝标准汤剂冻干粉供试品色谱图；图176为本发明实施例13中杯苋甾酮检测限色谱图；图177为本发明实施例13中杯苋甾酮定量限色谱图；图178为本发明实施例13中不同进样量杯苋甾酮对照品线性关系图；图179为本发明实施例13精密度考察中安捷伦仪器色谱仪色谱图；图180为本发明实施例13精密度考察中戴安仪器色谱仪色谱图；图181为本发明实施例13精密度考察中沃特世仪器色谱仪色谱图；图182为本发明实施例13中采用0.9mL/min流速获得的色谱图；图183为本发明实施例13中采用1.0mL/min流速获得的色谱图；图184为本发明实施例13中采用1.1mL/min流速获得的色谱图；图185为本发明实施例13中采用20℃柱温获得的色谱图；图186为本发明实施例13中采用25℃柱温获得的色谱图；图187为本发明实施例13中采用30℃柱温获得的色谱图；图188为本发明实施例13中15694批次供试品色谱图；图189为本发明实施例13中15748批次供试品色谱图；图190为本发明实施例13中15725批次供试品色谱图；图191为本发明实施例12中实验人员乙的酒川牛膝配方颗粒薄层鉴别色谱图(其中，T：23.5℃，RH：56％，1.酒川牛膝配方颗粒(1909001Y)，2.酒川牛膝配方颗粒(1909002Y)，3.酒川牛膝配方颗粒(1909003Y)，4.川牛膝对照药材，5.杯苋甾酮对照品(3μL))。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

本发明实施例及实验例采用的实验仪器、试剂与对照品见表1。

表1实验仪器、试剂与对照品

实施例1酒川牛膝配方颗粒UPLC特征图谱的构建方法和方法学验证

1、溶液制备

1.1参照物溶液的制备

对照药材溶液的制备：取川牛膝对照药材约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水50mL，加热回流45分钟，取出，放冷，滤过，滤液蒸干，加入30％甲醇25mL，密塞，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得对照药材参照物溶液。

对照品溶液的制备：

取杯苋甾酮对照品适量，置量瓶中，加甲醇制成每1mL含杯苋甾酮25μg的溶液，即得对照品溶液A。

取5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1mL含20μg的溶液，即得对照品溶液B。

1.2供试品溶液的制备：

取酒川牛膝配方颗粒适量，研细，取约1g，精密称定，加入30％甲醇25mL，密塞，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2、测定方法

分别精密吸取对照药材溶液、对照品溶液A、对照品溶液B、以及供试品溶液各2μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图；初步拟定的色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按表2中的规定进行梯度洗脱；波长为266nm；柱温为30℃；流速为每分钟0.3mL；理论板数按杯苋甾酮峰计算应不低于8000。

表2洗脱梯度

3、色谱分析条件的确定

3.1不同色谱柱考察

首先考察了不同填料、规格的色谱柱(见表3)对酒川牛膝配方颗粒分离效果的影响，结果如图3-6所示。

表3色谱柱型号、规格

由图3-6可知，BEH C18色谱柱对于前10分钟的分离优于HSS T3色谱柱，且150mm的色谱柱分离效果好于100mm，故选用Waters ACQUITY BEH C18 150mm×2.1mm；1.7μm色谱柱进一步考察。

3.2梯度优化

主要针对8分钟左右和18分钟左右的特征峰进行梯度调整(见表4-6)，保证色谱峰有效分离的同时尽可能使其均匀分布。结果如图7-9所示。

表4梯度1

表5梯度2

表6梯度3

由图7-9可知，在梯度3条件下色谱峰分离较好，各特征峰分布比较均匀，故暂定梯度3进行下一步考察。

3.3不同洗脱体系考察

考察了乙腈-0.2％磷酸体系和甲醇-0.2％磷酸体系对峰分离影响，结果分别如图10、图11所示。

结果表明，采用甲醇-0.2％磷酸体系，色谱峰分离不佳，且特征峰分布过于集中，故仍选用乙腈-0.2％磷酸体系进一步考察。

3.4不同酸体系考察

考察了乙腈-0.2％磷酸体系、乙腈-0.2％醋酸和乙腈-0.2％甲酸体系对峰分离效果的影响，结果如图12-14所示。

结果表明，采用不同酸条件下各特征峰数量基本保持一致，分离也都能达到要求，但乙腈-0.2％磷酸色谱峰分布相对均匀，故仍选用乙腈-0.2％磷酸体系进一步考察。

3.5不同柱温考察

按照上述优化结果，考察不同柱温(28℃、30℃、32℃)对于对特征峰分离效果的影响，结果如图15-17所示。

结果表明，不同柱温条件下各特征峰分离度都符合要求，因此，暂定30℃进行下一步考察。

3.6不同色谱仪器考察

按照上述方法，分别在不同品牌的色谱仪下(waters H-class和Agilent 1290Ⅱ)进样，考察不同仪器耐用性，结果如图18-19所示。

3.7色谱条件的确定

综上，最终确定色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按表7中的规定进行梯度洗脱；波长为266nm；柱温为30℃；流速为每分钟0.3mL；理论板数按杯苋甾酮峰计算应不低于8000。由此得到如图20所示的酒川牛膝配方颗粒的UPLC色谱图，并对该图谱中的主要色谱峰进行指认，结果见表8。

表7洗脱梯度

表8

3.8特征峰的确认

通过LC/MS/MS进行分子结构分析，解析峰1为5-羟甲基糠醛，峰6为杯苋甾酮，峰2为香草酰酒石酸，峰7为二香草酰酒石酸，并采用对照品定位和光谱研究，确认峰1为5-羟甲基糠醛，峰6为杯苋甾酮，因峰2香草酰酒石酸和峰7二香草酰酒石酸并未采购到对照品，故暂不在本发明中进行规定。并同时对峰3、峰5、峰8确认了分子量，便于为后续特征成分峰的定性提供参考依据，结果见表9。LC/MS/MS分析结构的具体定位图谱见图21-28。

表9酒川牛膝配方颗粒LC/MS/MS分析检测结果

4.色谱条件及系统适应性试验

4.1色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm)；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按表10中的规定进行梯度洗脱；波长为266nm；柱温为30℃；流速为每分钟0.3mL；理论板数按杯苋甾酮峰计算应不低于8000。

表10洗脱梯度

4.2溶液制备

4.2.1参照物溶液的制备

对照药材溶液的制备：取川牛膝对照药材约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水50mL，加热回流45分钟，取出，放冷，滤过，滤液蒸干，加入30％甲醇25mL，密塞，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得对照药材参照物溶液。

对照品溶液的制备：

取杯苋甾酮对照品(批号：111804-201705，纯度95.3％，购于中国食品药品检定研究院)适量，置量瓶中，加甲醇制成每1mL含杯苋甾酮25μg的溶液，即得对照品溶液A。

取5-羟甲基糠醛对照品(批号：111626-202114，纯度98.7％，购于中国食品药品检定研究院)适量，精密称定，加50％甲醇制成每1mL含20μg的溶液，即得对照品溶液B。

4.2.2供试品溶液的制备：

取酒川牛膝配方颗粒适量，研细，取约1g，精密称定，加入30％甲醇25mL，密塞，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

4.3测定方法

分别精密吸取对照药材溶液、对照品溶液A、对照品溶液B、以及供试品溶液各2μL，注入液相色谱仪，按照4.1项下的色谱条件进行测定，记录如图29-31所示的色谱图，并获得如表11所示的系统适应性参数。

表11系统适应性参数

5.分析方法验证

5.1仪器精密度试验

取同一批次酒川牛膝配方颗粒供试品溶液，按“供试品溶液制备”的方法制备供试品，连续进样6次，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果见表12-13和图32。

表12仪器精密度相对保留时间结果

表13仪器精密度相对峰面积结果

结果表明：8个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％、相对峰面积RSD％小于3％。综合判断，仪器精密度良好，符合特征图谱的要求。

5.2重复性试验

取同一批次酒川牛膝配方颗粒供试品溶液，平行称取6份，精密称定，按“供试品溶液制备”的方法制备供试品，进样分析，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果见下表14-15和图33。

表14方法重复性相对保留时间结果

表15方法重复性相对峰面积结果

结果表明：8个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％，相对峰面积RSD％小于4％。综合判断，该方法的重复性较好，符合特征图谱的要求。

5.3专属性

供试品采用提取溶剂为30％甲醇，精密吸取供试品溶液、阴性对照溶液(30％甲醇)各2μL，分别注入超高效液相色谱仪，按4.1项下的色谱条件进行测试，如图34-35所示，结果显示阴性无干扰。

5.4中间精密度(不同人员)

同一批酒川牛膝配方颗粒供试品溶液，由甲、乙、丙实验人员分开独立操作，按供试品制备方法制备供试品，进样分析，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如表16-17和图36-38。

表16不同人员相对保留时间结果

/>

表17不同人员相对峰面积结果

结果表明：8个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％，相对峰面积RSD％小于4％。综合判断，方法的中间精密度(不同人员)好，符合特征图谱的要求。

5.5稳定性试验

取同一份酒川牛膝配方颗粒供试品溶液，配制后在第0、4、8、12、16、24小时进样。记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，以考察供试品溶液的稳定性。结果如表18-19和图39所示。

表18稳定性试验相对保留时间结果

表19稳定性试验相对峰面积结果

结果表明：8个特征峰的相对保留时间小于2％，相对峰面积RSD％小于2％。说明供试品溶液在24小时内稳定。

5.6耐用性

5.6.1不同流速的考察

取同一酒川牛膝配方颗粒供试品溶液，分别在不同流速0.28mL/min、0.30mL/min和0.32mL/min下进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如表20-21和图40-42所示。

表20不同流速相对保留时间结果

表21不同流速相对峰面积结果

结果表明，8个特征峰的相对保留时间RSD％为0％～2.8％，8个特征峰的相对峰面积RSD％在0％～6.9％之间，由图可知，不同流速对特征峰的分离度有一定影响，为保证特征图谱的分离重现，选定0.30mL/min作为酒川牛膝配方颗粒特征图谱测定方法的流速。

5.6.2不同柱温的考察

取同一酒川牛膝配方颗粒供试品溶液分别在28℃﹑30℃和32℃下进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如表22-23和图43-45所示。

表22不同柱温相对保留时间结果

表23不同柱温相对峰面积结果

结果表明，8个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％，8个特征峰的相对峰面积RSD％在0％～3.3％之间，由图可知，不同柱温条件下对特征峰的分离度有一定影响，为保证特征图谱的分离重现，故建议固定柱温为30℃。

5.6.3不同色谱柱的考察

取同一酒川牛膝配方颗粒供试品溶液，分别用ACQUITY UPLC BEH C18型号色谱柱不同生产批次(批号03933111928367；批号03503926315165；批号04083123718391)进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如表24-25和图46-48所示。

表24不同色谱柱相对保留时间结果

表25不同色谱柱相对峰面积结果

结果表明：8个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％，相对峰面积RSD％偏差小于3％。综合判断，方法的中间精密度(不同色谱柱批号)好，符合特征图谱的要求。

5.6.4不同仪器的考察

取同一酒川牛膝配方颗粒供试品溶液，分别在不同品牌的超高效液相色谱仪(Agilent 1290Ⅱ、Waters H-class)上进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如表26-27和图49-50所示。

表26中间精密度相对保留时间试验结果(不同实验仪器)

表27中间精密度相对峰面积试验结果(不同实验仪器)

结果表明：峰1出峰早，距离S峰远，因此相对保留时间差异较大，其余7个特征峰的相对保留时间RSD％小于3％，故建议峰1(5-羟甲基糠醛)采用对照品定位，不规定其相对保留时间，峰4相对峰面积RSD％偏差较大，原因是因为峰4峰面积较小，以及各特征峰在不同仪器上存在响应差异造成的。其他特征峰相对峰面积偏差较小。综合判断，方法的中间精密度(不同仪器)较好，符合特征图谱的要求。

由上述方法学考察结果建立的酒川牛膝配方颗粒特征图谱的8个共有峰中，以杯苋甾酮参照物峰相应的峰为S峰，计算相对保留时间，各色谱峰受不同色谱柱、不同高效液相、柱温与流速因素均有一定程度上的影响，为适应其耐用性，建议将规定值范围控制在±10％以内。

根据上述分析方法验证，结果表明该方法操作简便、结果准确、方法重现性好。

7.多批酒川牛膝配方颗粒特征图谱测定

根据前述确定的特征图谱测定方法，取3批酒川牛膝配方颗粒按该法测定，见表28-29。

表28三批酒川牛膝配方颗粒特征图谱相对保留时间

表29三批酒川牛膝配方颗粒特征图谱相对峰面积

结果显示，3批酒川牛膝配方颗粒特征图谱各个特征峰规定的相对保留时间均在规定值的±10％之内，计算峰1与杯苋甾酮峰面积比值均高于0.13。这表明3批酒川牛膝配方颗粒相对保留时间及相对峰面积均在要求范围内。

实施例2酒川牛膝配方颗粒UPLC对照特征图谱的构建方法

取3批酒川牛膝配方颗粒(1909001Y、1909002Y、1909003Y；来源：华润三九医药股份有限公司)，按照实施例1提供的酒川牛膝配方颗粒特征图谱测定方法进行检测。

结果分析：参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术指南(试行)》，利用中国药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件，对所得图谱进行拟合，并对3批酒川牛膝配方颗粒共有峰信息进行分析，见图51，选择分离度好，色谱峰较纯的共有峰作为酒川牛膝配方颗粒特征图谱共有峰，建立酒川牛膝配方颗粒UPLC对照特征图谱，见图52。

根据图52可知，酒川牛膝配方颗粒供试品色谱中应呈现8个特征峰，除峰1(5-羟甲基糠醛)外，其余7个特征峰应与川牛膝对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，其中峰1、峰6(杯苋甾酮)的保留时间应与相应的对照品参照物色谱图中峰的保留时间相同；以杯苋甾酮参照物峰相应的峰6为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为0.47(峰2)、0.49(峰3)、0.72(峰4)、0.97(峰5)、1.11(峰7)、1.37(峰8)。计算峰1与S峰的相对峰面积，相对峰面积应不低于0.13。

实施例3酒川牛膝饮片UPLC特征图谱的构建方法与方法学验证

1、溶液制备

1.1参照物溶液的制备

对照药材溶液的制备：取川牛膝对照药材约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水50mL，加热回流45分钟，取出，放冷，滤过，滤液蒸干，加入30％甲醇25mL，密塞，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得对照药材参照物溶液。

对照品溶液的制备：

取杯苋甾酮对照品适量，置量瓶中，加甲醇制成每1mL含杯苋甾酮25μg的溶液，即得对照品溶液A。

取5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1mL含20μg的溶液，即得对照品溶液B。

1.2供试品溶液的制备：

取酒川牛膝饮片(过三号筛)，约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水50mL，加热回流45分钟，取出，放冷，滤过，滤液蒸干，加入30％甲醇25mL，密塞，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2、测定方法

分别精密吸取对照药材溶液、对照品溶液A、对照品溶液B、以及供试品溶液各2μL，注入液相色谱仪，采用如下色谱条件进行测定：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ACQUITY BEH C18；150mm×2.1mm，1.7μm)；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按表31中的规定进行梯度洗脱；波长为266nm；柱温为30℃；流速为每分钟0.3mL；理论板数按杯苋甾酮峰计算应不低于8000。记录色谱图，见图53-55。并获得如表32所示的系统适应性参数。

表31洗脱梯度

表32系统适应性参数

3、方法学验证

3.1精密度

取同一批酒川牛膝饮片2.0g，精密称定，按“供试品溶液制备”的方法制备供试品，连续进样6次，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果见表33-34和图56。

表33仪器精密度相对保留时间试验结果

表34仪器精密度相对峰面积试验结果

结果表明：8个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％、相对峰面积RSD％小于0％～3.1％。综合判断，仪器的精密度良好，符合特征图谱的要求。

3.2方法重复性试验

取同一批酒川牛膝饮片2.0g，平行称取6份，精密称定，按“供试品溶液制备”的方法制备供试品，进样分析，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果见表35-36和图57。

表35方法重复性相对保留时间试验结果(n＝6)

表36方法重复性相对峰面积试验结果(n＝6)

结果表明：8个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％，相对峰面积RSD％小于5％。综合判断，该方法的重复性较好，符合特征图谱的要求。

3.3中间精密度(不同操作人员)

取同一批酒川牛膝饮片，由甲、乙、丙实验人员分开独立操作，按供试品制备方法制备供试品，进样分析，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如表37-38和图58。

表37中间精密度相对保留时间试验结果(不同操作人员)

表38中间精密度相对峰面积试验结果(不同操作人员)

结果表明：8个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％，峰5相对峰面积RSD％偏差较大，原因是峰5的峰面积较小所致。综合判断，方法的中间精密度(不同人员)好，符合特征图谱的要求。

3.4中间精密度(不同实验仪器)

取同一批酒川牛膝饮片供试品溶液，分别在不同品牌的超高效液相色谱仪(Agilent 1290Ⅱ、Waters H-class)上进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如表39-40和图59-60。

表39中间精密度相对保留时间试验结果(不同实验仪器)

表40中间精密度相对峰面积试验结果(不同实验仪器)

结果表明：峰1出峰早，距离S峰远，因此相对保留时间差异较大，其余7个特征峰的相对保留时间RSD％小于3％，故建议峰1(5-羟甲基糠醛)采用对照品定位，不规定其相对保留时间，峰4、峰5相对峰面积RSD％偏差较大，原因是因为峰4、峰5峰面积较小，以及各特征峰在不同仪器上存在响应差异造成的。其他特征峰相对峰面积偏差较小。综合判断，方法的中间精密度(不同仪器)较好，符合特征图谱的要求。

3.5中间精密度(不同色谱柱)

取同一批酒川牛膝饮片供试品溶液，分别用ACQUITY UPLC BEH C18型号色谱柱不同生产批次(批号03933111928367；批号03503926315165；批号04083123718391)进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如表41-42和图61-63所示。

表41中间精密度相对保留时间试验结果(不同批次色谱柱)

表42中间精密度相对峰面积试验结果(不同批次色谱柱)

结果表明：8个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％，相对峰面积RSD％,小于5％。综合判断，方法的中间精密度(不同批次色谱柱)较好，符合特征图谱的要求。

3.6专属性

按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，并考察酒川牛膝饮片阴性样品是否会造成干扰。按前述的色谱条件进行UPLC分析，记录色谱图，见图64-65。结果表明，阴性无干扰，方法专属性好。

3.7耐用性

3.7.1稳定性考察

取同一份供试品溶液，配制后在第0、4、8、12、16、24小时进样。记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，以考察供试品溶液的稳定性。结果如表43-44和图66。

表43稳定性相对保留时间试验结果

/>

表44稳定性相对峰面积试验结果

结果表明：8个特征峰的相对保留时间小于2％，相对峰面积RSD％小于0％～6.3％，峰5相对峰面积RSD％偏差较大是因为峰5的峰面积较小所致，其他特征峰相对峰面积偏差较小。说明供试品溶液在24小时内稳定。

3.6.2不同流速的考察

取同一供试品溶液，分别在不同流速0.28mL/min、0.30mL/min和0.32mL/min下进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如表45-46和图67-69。

表45不同流速相对保留时间结果

表46不同流速相对峰面积结果

结果表明，8个特征峰的相对保留时间RSD％为0％～2.6％，8个特征峰的相对峰面积RSD％在0％～21.9％之间，由图可知，不同流速对特征峰的分离度有一定影响，为保证特征图谱的分离重现，选定0.30mL/min作为酒川牛膝饮片特征图谱测定方法的流速。

3.7.3不同柱温的考察

取同一供试品溶液分别在28℃﹑30℃和32℃下进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如表47-48和图70-72。

表47不同柱温测定相对保留时间结果

表48不同柱温相对峰面积结果

结果表明，8个特征峰的相对保留时间RSD％小于3％，8个特征峰的相对峰面积RSD％在0％～22％之间，由图可知，不同柱温条件下对特征峰的分离度有一定影响，为保证特征图谱的分离重现，故建议固定柱温为30℃。

由上述方法学考察结果可知，建立的酒川牛膝饮片特征图谱的8个共有峰中，各色谱峰受不同色谱柱、不同柱温和不同流速均有一定程度上的影响，其余色谱条件影响变化不大。相对保留时间值处在±10％范围内，为适应其耐用性，建议将规定值范围控制在±10％以内。

实施例4酒川牛膝饮片对照特征图谱的构建方法

取15批酒川牛膝饮片(1907001Y、1907002Y、1907003Y、1907004Y、1907005Y、1907006Y、1907007Y、1907008Y、1907009Y、1907010Y、1907011Y、1907012Y、1907013Y、1907014Y、1905015Y；川牛膝药材为产地自行采收，酒川牛膝饮片为自行炮制)，按照实施例3提供的酒川牛膝饮片特征图谱测定方法检测，结果如表49-50和图73所示。根据表49-50分析，15批酒川牛膝饮片中峰1的相对峰面积在0.34～2.99之间，均值1.06，考虑到不同批次间在炮制时随炮制酒量、闷润程度以及炒制程度等都可能有所差异，以及本次研究15批酒川牛膝样品代表局限性，建议规定峰1与S峰的相对峰面积的比值限度以最低值计算，即0.34。

参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术指南(试行)》，利用中国药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件，对所得图谱进行拟合，并对如图73所示的15批酒川牛膝饮片共有峰信息进行分析，选择分离度好，色谱峰较纯的共有峰作为酒川牛膝饮片特征图谱共有峰，建立酒川牛膝饮片UPLC对照特征图谱，见图74。

根据图74可知，酒川牛膝饮片供试品色谱中应呈现8个特征峰，除峰1(5-羟甲基糠醛)外，其余7个特征峰应与川牛膝对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，其中峰1、峰6(杯苋甾酮)的保留时间应与相应的对照品参照物峰的保留时间相同；以杯苋甾酮参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为0.47(峰2)、0.49(峰3)、0.72(峰4)、0.97(峰5)、1.11(峰7)、1.37(峰8)。计算峰1与S峰的相对峰面积，相对峰面积应不低于0.34。

表49 15批酒川牛膝饮片特征图谱测定相对保留时间结果

/>

表50 15批酒川牛膝饮片特征图谱测定相对峰面积结果

/>

实施例5酒川牛膝标准汤剂冻干粉UPLC特征图谱的构建方法与方法学验证

1、溶液制备

1.1参照物溶液的制备

对照药材溶液的制备：取川牛膝对照药材约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水50mL，加热回流45分钟，取出，放冷，滤过，滤液蒸干，加入30％甲醇25mL，密塞，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得对照药材参照物溶液。

对照品溶液的制备：

取杯苋甾酮对照品适量，置量瓶中，加甲醇制成每1mL含杯苋甾酮25μg的溶液，即得对照品溶液A。

取5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1mL含20μg的溶液，即得对照品溶液B。

1.2供试品溶液的制备：

取酒川牛膝标准汤剂冻干粉适量，研细，取约1g，精密称定，加入30％甲醇25mL，密塞，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2、测定方法

分别精密吸取对照药材溶液、对照品溶液A、对照品溶液B、以及供试品溶液各2μL，注入液相色谱仪，采用如下色谱条件进行测定：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ACQUITY BEH C18；150mm×2.1mm，1.7μm)；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按表51中的规定进行梯度洗脱；波长为266nm；柱温为30℃；流速为每分钟0.3mL；理论板数按杯苋甾酮峰计算应不低于8000。记录色谱图，见图75-77。并获得如表52所示的系统适应性参数。

表51洗脱梯度

表52系统适应性参数

3、方法学验证

3.1仪器精密度实验

取同一酒川牛膝冻干粉供试品，按“供试品溶液制备”的方法制备供试品，连续进样6次，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果见表53-54及图78。

表53仪器精密度相对保留时间结果

表54仪器精密度相对峰面积结果

结果表明：8个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％、相对峰面积RSD％小于2％。综合判断，仪器精密度良好，符合特征图谱的要求。

3.2重复性试验

取同一批次酒川牛膝冻干粉供试品，平行称取6份，精密称定，按“供试品溶液制备”的方法制备供试品，进样分析，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果见表55-56及图79。

表55方法重复性相对保留时间结果

表56方法重复性相对峰面积结果

结果表明：8个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％，相对峰面积RSD％较小于4％。综合判断，该方法的重复性较好，符合特征图谱的要求。

3.3专属性

供试品采用提取溶剂为30％甲醇，精密吸取供试品溶液、阴性对照溶液(30％甲醇)各2ul，分别注入超高效液相色谱仪，按前述特征图谱测定方法试验，结果如图80-81所示，表明阴性无干扰。

3.4不同人员(中间精密度)

同一批酒川牛膝冻干粉供试品溶液，由甲、乙、丙实验人员分开独立操作，按供试品制备方法制备供试品，进样分析，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如表57-58和图82-84。

表57不同人员相对保留时间结果

表58不同人员相对峰面积结果

结果表明：8个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％，相对峰面积RSD％小于4％。综合判断，方法的中间精密度(不同人员)好，符合特征图谱的要求。

3.5稳定性试验

取同一份供试品溶液，配制后在第0、4、8、12、16、24小时进样。记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，以考察供试品溶液的稳定性。结果如表59-60和图85。

表59稳定性试验相对保留时间结果

表60稳定性试验相对峰面积结果

结果表明：8个特征峰的相对保留时间小于2％，相对峰面积RSD％小于2％。说明供试品溶液在24小时内稳定。

3.6耐用性

3.6.1不同流速的考察

取同一供试品溶液，分别在不同流速0.28mL/min、0.30mL/min和0.32mL/min下进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如表61-62和图86-88。

表61不同流速相对保留时间结果

表62不同流速相对峰面积结果

结果表明，8个特征峰的相对保留时间RSD％为0％～2.8％，8个特征峰的相对峰面积RSD％在0％～6.9％之间，由图可知，不同流速对特征峰的分离度有一定影响，为保证特征图谱的分离重现，选定0.30mL/min作为川牛膝药材特征图谱测定方法的流速。

3.6.2不同柱温的考察

取同一供试品溶液分别在28℃﹑30℃和32℃下进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如表63-64和图89-91。

表63不同柱温相对保留时间结果

表64不同柱温相对峰面积结果

结果表明，8个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％，8个特征峰的相对峰面积RSD％在0％～3.3％之间，由图可知，不同柱温条件下对特征峰的分离度有一定影响，为保证特征图谱的分离重现，故建议固定柱温为30℃。

3.6.3不同色谱柱的考察

取同一供试品溶液，分别用ACQUITY UPLC BEH C18型号色谱柱不同生产批次(批号03933111928367；批号03503926315165；批号04083123718391)进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如表65-66及图92-94。

表65不同色谱柱相对保留时间结果

表66不同色谱柱相对峰面积结果

结果表明：8个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％，相对峰面积RSD％偏差小于3％。综合判断，方法的中间精密度(不同色谱柱批号)好，符合特征图谱的要求。

3.6.4不同仪器的考察

取同一供试品溶液，分别在不同品牌的超高效液相色谱仪(Agilent 1290Ⅱ、Waters H-class)上进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如表67-68和图95-96。

表67中间精密度相对保留时间试验结果(不同实验仪器)

表68中间精密度相对峰面积试验结果(不同实验仪器)

结果表明：峰1出峰早，距离S峰远，因此相对保留时间差异较大，其余7个特征峰的相对保留时间RSD％小于3％，故建议峰1(5-羟甲基糠醛)采用对照品定位，不规定其相对保留时间，峰4相对峰面积RSD％偏差较大，原因是因为峰4峰面积较小，以及各特征峰在不同仪器上存在响应差异造成的。其他特征峰相对峰面积偏差较小。综合判断，方法的中间精密度(不同仪器)较好，符合特征图谱的要求。

由上述方法学考察结果，建立的酒川牛膝标准汤剂冻干粉特征图谱的8个共有峰中，以杯苋甾酮参照物峰相应的峰为S峰，计算相对保留时间，各色谱峰受不同色谱柱、不同高效液相、柱温与流速因素均有一定程度上的影响，为适应其耐用性，建议将规定值范围控制在±10％以内。

实施例6酒川牛膝标准汤剂对照特征图谱的构建方法

取15批酒川牛膝标准汤剂(批号:1907001Y、1907002Y、1907003Y、1907004Y、1907005Y、1907006Y、1907007Y、1907008Y、1907009Y、1907010Y、1907011Y、1907012Y、1907013Y、1907014Y、1907015Y；酒川牛膝标准汤剂按照《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》和《医疗机构中药煎药室管理规范》自行制备)，按实施例5提供的酒川牛膝标准汤剂特征图谱测定方法操作，结果见表69-70和图97。测定结果表明15批酒川牛膝标准汤剂各特征峰相对保留时间均在规定值的±10％之内。

参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术指南(试行)》，利用中国药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件，对所得图谱进行拟合，并对如图97所示的15批酒川牛膝标准汤剂冻干粉共有峰信息进行分析，选择分离度好，色谱峰较纯的共有峰作为酒川牛膝标准汤剂冻干粉特征图谱共有峰，建立酒川牛膝标准汤剂冻干粉UPLC对照特征图谱，见图98。

根据图98可知，酒川牛膝标准汤剂冻干粉供试品色谱中应呈现8个特征峰，除峰1(5-羟甲基糠醛)外，其余7个特征峰应与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，其中峰1、峰6(杯苋甾酮)的保留时间应与相应的对照品参照物峰的保留时间相同；以杯苋甾酮参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为0.47(峰2)、0.49(峰3)、0.72(峰4)、0.97(峰5)、1.11(峰7)、1.37(峰8)。计算峰1与S峰的相对峰面积，相对峰面积应不低于0.13。

表69 15批酒川牛膝标准汤剂冻干粉特征图谱测定相对保留时间结果

表70 15批酒川牛膝标准汤剂冻干粉特征图谱测定相对峰面积结果

为明确整个研究过程中量值传递情况，参照前述UPLC特征图谱测定方法，还需要对原料(川牛膝药材、川牛膝饮片)进行分析方法验证及多批次检验，验证结果表明，该方法操作简便、结果准确，方法重现性较好。具体实验方法及结果如下所述。

实施例7川牛膝药材UPLC特征图谱的构建方法与方法学验证

1、溶液制备

1.1参照物溶液的制备

对照药材溶液的制备：取川牛膝对照药材约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水50mL，加热回流45分钟，取出，放冷，滤过，滤液蒸干，加入30％甲醇25mL，密塞，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得对照药材参照物溶液。

对照品溶液的制备：

取杯苋甾酮对照品适量，置量瓶中，加甲醇制成每1mL含杯苋甾酮25μg的溶液，即得对照品溶液。

1.2供试品溶液的制备：

取川牛膝药材(过三号筛)，约2g，精密称定，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水50mL，加热回流45分钟，取出，放冷，滤过，滤液蒸干，加入30％甲醇25mL，密塞，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2、测定方法

分别精密吸取对照药材溶液、对照品溶液、以及供试品溶液各2μL，注入液相色谱仪，采用如下色谱条件进行测定：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ACQUITY BEH C18；150mm×2.1mm，1.7μm)；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按表71中的规定进行梯度洗脱；波长为266nm；柱温为30℃；流速为每分钟0.3mL；理论板数按杯苋甾酮峰计算应不低于8000。记录色谱图，见图99-100。并获得如表72所示的系统适应性参数。

表71洗脱梯度

表72系统适应性参数

3.方法学验证

3.1精密度

取川牛膝药材2.0g，精密称定，按“供试品溶液制备”的方法制备供试品，连续进样6次，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果见表73-74和图101。

表73仪器精密度相对保留时间试验结果

表74仪器精密度相对峰面积试验结果

结果表明：7个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％、相对峰面积RSD％小于2％。综合判断，仪器精密度良好，符合特征图谱的要求。

3.2方法重复性试验

取同一批川牛膝药材2.0g，平行称取6份，精密称定，按“供试品溶液制备”的方法制备供试品，进样分析，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果见表75-76和图102。

表75方法重复性相对保留时间试验结果(n＝6)

表76方法重复性相对峰面积试验结果(n＝6)

结果表明：7个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％，相对峰面积RSD％均小于4％，综合判断，该方法的重复性较好，符合要求。

3.3中间精密度(不同操作人员)

取同一批川牛膝药材，由甲、乙、丙实验人员分开独立操作，按供试品制备方法制备供试品，进样分析，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如表77-78和图103。

表77中间精密度相对保留时间试验结果(不同操作人员)

表78中间精密度相对峰面积试验结果(不同操作人员)

结果表明：7个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％，相对峰面积RSD％小于4％。综合判断，方法的中间精密度(不同人员)好，符合特征图谱的要求。

3.4中间精密度(不同色谱柱批号)

通过色谱条件优化及色谱柱选择结果可知，该色谱条件重现需固定ACQUITY UPLCBEH C18，150*2.1mm；1.7um色谱柱，因此，取同一供试品溶液，分别用不同生产批次(批号03933111928367；批号03503926315165；批号04083123718391)色谱柱进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如表79-80和图104-106。

表79中间精密度相对保留时间试验结果(不同批次色谱柱)

表80中间精密度相对峰面积试验结果(不同批次色谱柱)

/>

结果表明：7个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％，相对峰面积RSD％,小于5％。综合判断，方法的中间精密度(不同批次色谱柱)较好，符合特征图谱的要求。

3.5专属性

按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，并考察川牛膝药材阴性样品是否会造成干扰。按前述特征图谱所述的色谱条件进行UPLC分析，记录色谱图，结果见图107-108，结果表明，阴性无干扰，方法专属性好。

3.6耐用性

3.6.1稳定性考察

取同一份供试品溶液，配制后在第0、4、8、12、16、24小时进样。记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，以考察供试品溶液的稳定性。结果如表81-82和图109。

表81稳定性相对保留时间试验结果

表82稳定性相对峰面积试验结果

/>

结果表明：7个特征峰的相对保留时间小于2％，相对峰面积RSD％小于3％。说明供试品溶液在24小时内稳定。

3.6.2不同流速的考察

取同一供试品溶液，分别在不同流速0.28mL/min、0.30mL/min和0.32mL/min下进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如表83-84和图110-112。

表83不同流速相对保留时间结果

表84不同流速相对峰面积结果

结果表明，7个特征峰的相对保留时间RSD％为0％～2.6％，7个特征峰的相对峰面积RSD％在0％～14.3％之间，由图可知，不同流速对特征峰的分离度有一定影响，为保证特征图谱的分离重现，选定0.30mL/min作为川牛膝药材特征图谱测定方法的流速。

3.6.3不同柱温的考察

取同一供试品溶液分别在28℃﹑30℃和32℃下进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如表85-86和图113-115。

表85不同柱温测定相对保留时间结果

表86不同柱温相对峰面积结果

结果表明，7个特征峰的相对保留时间RSD％小于3％，7个特征峰的相对峰面积RSD％在0％～27.7％之间，由图可知，不同柱温条件下对特征峰的分离度有一定影响，为保证特征图谱的分离重现，故建议固定柱温为30℃。

由上述方法学考察结果可知，建立的川牛膝药材特征图谱的7个共有峰中，各色谱峰受不同色谱柱、不同柱温和不同流速均有一定程度上的影响，其余色谱条件影响变化不大。相对保留时间值处在±10％范围内，为适应其耐用性，建议将规定值范围控制在±10％以内。

实施例8川牛膝药材UPLC对照特征图谱的构建方法

取15批川牛膝药材(批号:1905001、1905002、1905004、1905008、1905009、1905011、1905012、1905013、1905014、1905015、1905016、1905018、1905020、1905021、1905022；川牛膝药材原产地自行收集)，按实施例7提供的川牛膝药材特征图谱测定方法操作，结果见表87-88和图116。测定结果表明15批川牛膝药材特征图谱各个特征峰规定的相对保留时间均在川牛膝药材对照图谱规定值的±10％范围之内。

参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术指南(试行)》，利用中国药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件，对所得图谱进行拟合，并对如图116所示的15批川牛膝药材共有峰信息进行分析，选择分离度好，色谱峰较纯的共有峰作为川牛膝药材特征图谱共有峰，建立川牛膝药材UPLC对照特征图谱，见图117。

根据图117可知，供试品色谱中应呈现7个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，其中5号峰(杯苋甾酮)的保留时间应与相应的对照品参照物峰的保留时间相同；以杯苋甾酮参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为0.47(峰1)、0.49(峰2)、0.72(峰3)、0.97(峰4)、1.11(峰6)、1.37(峰7)。

表87 15批川牛膝药材相对保留时间

表88 15批川牛膝药材相对峰面积

/>

实施例9川牛膝饮片UPLC特征图谱的构建方法

1、溶液制备

1.1参照物溶液的制备

对照药材溶液的制备：取川牛膝对照药材约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水50mL，加热回流45分钟，取出，放冷，滤过，滤液蒸干，加入30％甲醇25mL，密塞，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得对照药材参照物溶液。

对照品溶液的制备：

取杯苋甾酮对照品适量，置量瓶中，加甲醇制成每1mL含杯苋甾酮25μg的溶液，即得对照品溶液。

1.2供试品溶液的制备：

取川牛膝饮片(过三号筛)，约2g，精密称定，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水50mL，加热回流45分钟，取出，放冷，滤过，滤液蒸干，加入30％甲醇25mL，密塞，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2、测定方法

分别精密吸取对照药材溶液、对照品溶液、以及供试品溶液各2μL，注入液相色谱仪，采用如下色谱条件进行测定：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ACQUITY BEH C18；150mm×2.1mm，1.7μm)；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按表89中的规定进行梯度洗脱；波长为266nm；柱温为30℃；流速为每分钟0.3mL；理论板数按杯苋甾酮峰计算应不低于8000。记录色谱图，见图118-119。并获得如表90所示的系统适应性参数。

表89洗脱梯度

表90系统适应性参数

实施例10川牛膝饮片UPLC对照特征图谱的构建方法

取15批川牛膝饮片(批号:1907001Y、1907002Y、1907003Y、1907004Y、1907005Y、1907006Y、1907007Y、1907008Y、1907009Y、1907010Y、1907011Y、1907012Y、1907013Y、1907014Y、1907015Y；川牛膝药材为原产地自行收集，川牛膝饮片为自行炮制)，按实施例8提供的川牛膝饮片特征图谱测定方法操作，结果如表91-92所示。测定结果表明，15批川牛膝饮片特征图谱各个特征峰规定的相对保留时间均在川牛膝饮片对照图谱规定值的±10％范围之内。

参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术指南(试行)》，利用中国药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件，对所得图谱进行拟合，并对如图120所示的15批川牛膝饮片共有峰信息进行分析，选择分离度好，色谱峰较纯的共有峰作为川牛膝药材特征图谱共有峰，建立川牛膝药材UPLC对照特征图谱，见图121。

根据图121可知，供试品色谱中应呈现7个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，其中5号峰的保留时间应与相应的对照品参照物峰的保留时间相同；以杯苋甾酮参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为0.47(峰1)、0.49(峰2)、0.72(峰3)、0.97(峰4)、1.11(峰6)、1.37(峰7)。

表91 15批川牛膝饮片特征图谱测定相对保留时间结果

表92 15批川牛膝饮片特征图谱测定相对峰面积结果

实施例11川牛膝药材、川牛膝饮片、酒川牛膝饮片及酒川牛膝标准汤剂的特征图谱传递关系研究

根据研究选用的15批川牛膝药材和对应的的15批川牛膝饮片、15批酒川牛膝饮片、15批酒川牛膝标准汤剂冻干粉，按各自的特征图谱方法进行测定，结果如表93和图121所示。得到的特征峰数量发生了一定变化，主要体现在川牛膝饮片经炮制为酒川牛膝饮片后，峰1含量得到显著提升，在经水煎煮后的酒川牛膝标准汤剂中再呈下降趋势，而指标成分杯苋甾酮含量变化较小，说明川牛膝从药材经炮制加工为酒川牛膝饮片过程及水煎煮过程中，主要化学成分峰1发生了一定变化，而其他成分较小，说明除峰1外，其他特征性成分量值传递关系良好，同时计算峰1相对峰面积也能控制酒川牛膝的炮制程度及作为生品与炮制品的区分评价指标。

通过对15批酒川牛膝饮片及标准汤剂冻干粉中峰1的变化研究，峰1与S峰的相对峰面积受炮制不同程度有所影响，在经水煎煮为标准汤剂后，峰1呈较好规律进行传递。综合质谱和对照品定位结果，峰1为5-羟甲基糠醛，5-羟甲基糠醛是由葡萄糖、果糖等单糖在高温或弱酸性条件下脱水生成的具有呋喃环结构的醛类化合物，是麦拉德反应的典型产物之一。5-羟甲基糠醛广泛存在于食品(如干果、热牛奶)、药品(如含葡萄糖的注射液)、中药材(如地黄、何首乌、党参等)中。因此通过制定其与S峰的规定值，可在终端产品种起到区分和控制川牛膝炮制为酒川牛膝的质量，进而控制酒川牛膝药物制剂的质量。故分析15批酒川牛膝饮片中峰1的相对峰面积在0.34～2.99之间，均值1.06，考虑到不同批次间在炮制时随炮制酒量、闷润程度以及炒制程度等都可能有所差异，以及本次研究15批酒川牛膝样品代表局限性，建议规定峰1与S峰的相对峰面积的比值限度以最低值计算，即0.34。故分析15批酒川牛膝标准汤剂中峰1的相对峰面积在0.13-3.55之间，均值0.98，考虑到不同批次间在炮制时随炮制酒量、闷润程度以及炒制程度等都可能有所差异，以及本次研究15批酒川牛膝样品代表局限性，建议规定峰1与S峰的相对峰面积的比值限度以最低值计算，即0.13。

表93药材、饮片、标准汤剂对照图谱比较

实施例12牛膝与川牛膝和/或酒川牛膝的薄层鉴别方法

1、仪器与试药

仪器：薄层自动成像仪(TLC visualizer2)、万分之一天平(瑞士梅特勒)METTLERTOLEDO XS 204、展开缸、硅胶G薄层板。

试药：

酒川牛膝配方颗粒(批号：1909001Y、1909002Y、1909003Y；来源：华润三九医药股份有限公司)；川牛膝对照药材(批号：121065-201707；购于中国食品药品检定研究院)；牛膝对照药材(批号：110812-201912；购于中国食品药品检定研究院)；杯苋甾酮对照品(批号：110804-201705；购于中国食品药品检定研究院)。

试剂：

乙酸乙酯(批号20200925；来源：广东光华科技股份有限公司)；甲醇(批号：20201003-10；来源：广州化学试剂厂)；硫酸(批号：20200104-09；来源：广州化学试剂厂)；甲酸(批号：20200312；来源：广东光华科技股份有限公司)；95％乙醇(批号：20210903；来源：广州化学试剂厂)；水为自制纯化水。

2、溶液的制备

2.1供试品溶液的制备：

取酒川牛膝配方颗粒0.5g，研细，加甲醇20mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。

2.2对照药材溶液的制备：

取川牛膝对照药材1g，加水50mL，煮沸30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇20mL，同法制成川牛膝对照药材溶液。

另取牛膝对照药材，按照川牛膝对照药材处理方法制备牛膝对照药材溶液。

2.3对照品溶液的制备：

取杯苋甾酮对照品，加甲醇制成每1mL含杯苋甾酮0.5mg，作为对照品溶液。

2.4阴性对照溶液的制备：

取阴性颗粒0.5g，研细，加甲醇20mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为阴性对照溶液。

3、鉴别方法

照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各5μL，对照品溶液3μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-甲醇-水(10:1:2:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇试液，热风吹干，置紫外光灯(365nm)下检视。

4、供试品、对照药材溶液不同点样量和专属性考察

分别吸取酒川牛膝配方颗粒(1909001Y)供试品溶液及川牛膝对照药材1μL、3μL、5μL、8μL、10μL，杯苋甾酮对照品溶液3μL，阴性对照溶液5μL点于同一硅胶G薄层板上，按上述薄层色谱条件展开、取出、晾干，喷以10％硫酸乙醇试液，热风吹干，置紫外光灯(365nm)下检视，实验结果见图122(T：23.5℃，RH：56％)。

结果分析：由图122可见，酒川牛膝配方颗粒供试品色谱中，在与酒川牛膝对照药材及杯苋甾酮对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性无干扰。根据斑点的分离度及清晰度，确定酒川牛膝供试品溶液与对照药材的点样量为5uL、杯苋甾酮对照品溶液的点样量为3uL。

5、不同温度考察

分别吸取酒川牛膝配方颗粒(1909001Y、1909002Y、1909003Y)供试品溶液5μL、对照药材溶液5μL，杯苋甾酮对照品溶液3μL点于同一硅胶G薄层板上，按上述薄层色谱条件，分别在常温和低温条件下展开、取出、晾干，喷以10％硫酸乙醇试液，热风吹干，置紫外光灯(365nm)下检视，实验结果见图123-124。

结果分析：由图123-124可见，在常温和低温条件下，酒川牛膝配方颗粒色谱在与酒川牛膝对照药材及杯苋甾酮对照品色谱相应的位置显相同颜色的荧光斑点，且色谱斑点分离效果都较好，实验结果表明，温度对酒川牛膝配方颗粒薄层鉴别无显著影响，该薄层鉴别方法对温度有较好的耐用性。

6、不同湿度考察

分别吸取酒川牛膝配方颗粒(1909001Y、1909002Y、1909003Y)供试品溶液5μL、对照药材溶液5μL，杯苋甾酮对照品溶液3μL点于同一硅胶G薄层板上，按上述薄层色谱条件，分别在高湿和低湿条件下展开、取出、晾干，喷以10％硫酸乙醇试液，热风吹干，置紫外光灯(365nm)下检视，实验结果见图125-126。

结果分析：由图125-126可见，在高湿和低湿条件下，酒川牛膝配方颗粒色谱在与酒川牛膝对照药材及杯苋甾酮对照品色谱相应的位置显相同颜色的荧光斑点，且色谱斑点分离效果都较好，实验结果表明，湿度对酒川牛膝配方颗粒薄层鉴别无显著影响，该薄层鉴别方法对湿度有较好的耐用性。

7、不同厂家薄层板的考察

分别吸取酒川牛膝配方颗粒(1909001Y、1909002Y、1909003Y)供试品溶液5μL、对照药材溶液5μL，杯苋甾酮对照品溶液3μL点于不同厂家的硅胶G薄层板(青岛硅胶G板、烟台G板及Merck硅胶预制薄层板)上，按上述薄层色谱条件展开、取出、晾干，喷以10％硫酸乙醇试液，热风吹干，置紫外光灯(365nm)下检视，实验结果见图127-129。

结果分析：由图127-129可见，不同厂家生产薄层板，酒川牛膝配方颗粒色谱在与川牛膝对照药材及杯苋甾酮对照品色谱相应的位置显相同颜色的荧光斑点，且色谱斑点分离效果都较好，实验结果表明，不同厂家薄层板对酒川牛膝配方颗粒薄层鉴别无显著影响，该薄层鉴别方法的耐用性良好。

8、重现性考察

由不同实验操作人员甲和乙，制备供试品、对照药材和对照品溶液，分别吸取酒川牛膝配方颗粒(1909001Y、1909002Y、1909003Y)供试品溶液5μL、对照药材溶液5μL，杯苋甾酮对照品溶液3μL点于同一硅胶G薄层板上，按上述薄层色谱条件，展开、取出、晾干，喷以10％硫酸乙醇试液，热风吹干，置紫外光灯(365nm)下检视，实验结果见图130和图191。

结果分析：由图130和图191可见，不同实验操作人员，按供试品制备方法处理，照上述薄层鉴别方法进行鉴别，酒川牛膝配方颗粒色谱在与杯苋甾酮对照品色谱相应的位置显相同颜色的荧光斑点，且色谱斑点分离效果都较好，表明本法在不同操作人员中间重现性良好。

9、近似品区分考察

分别吸取酒川牛膝配方颗粒(1909001Y、1909002Y、1909003Y)供试品溶液5μL、川牛膝对照药材溶液5μL，杯苋甾酮对照品溶液3μL，牛膝对照药材溶液5μL、阴性颗粒5μL，点于硅胶G薄层板上，按上述薄层色谱条件展开、取出、晾干，喷以10％硫酸乙醇试液，热风吹干，置紫外光灯(365nm)下检视，实验结果见图131。

结果分析：照上述薄层鉴别方法进行鉴别，由图131可见牛膝对照药材色谱与酒川牛膝配方颗粒色谱相应的位置荧光斑点存在明显差异，牛膝在杯苋甾酮对照品位置不得出现相同斑点，表明本法可用于区分酒川牛膝和牛膝，且阴性无干扰。

综上，本实施例提供了一种牛膝与川牛膝和/或酒川牛膝的薄层鉴别方法，包括如下步骤：

取酒川牛膝配方颗粒或者酒川牛膝标准汤剂0.5g，研细，加甲醇20mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取川牛膝对照药材1g，加水50mL，煮沸30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇20mL，同法制成川牛膝对照药材溶液。取牛膝对照药材按照川牛膝对照药材处理方法制备牛膝对照药材溶液。再取杯苋甾酮对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各5μL，对照品溶液3μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-甲醇-水(10:1:2:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇试液，热风吹干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与川牛膝对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，而牛膝对照药材色谱与川牛膝、酒川牛膝配方颗粒色谱相应的位置荧光斑点存在明显差异，牛膝在杯苋甾酮对照品位置未出现相同斑点，表明本法可用于区分牛膝与川牛膝、酒川牛膝，且阴性无干扰。

实施例13酒川牛膝标准汤剂的质量控制方法

1性状

15批酒川牛膝标准汤剂性状如下表。根据多批性状，将性状确定为：本品为浅黄色至棕黄色的粉末；气微，味甘。

表94

2浸出物

取本品粉末约2g，精密称定，精密加入乙醇100mL，依法(中国药典2020年版四部通则2201醇溶性浸出物测定法－热浸法)测定，不得少于14.0％。

按照上述浸出物测定方法对15批酒川牛膝标准汤剂浸出物进行测定。结果如表95所示，根据实测范围为14.6％-19.1％。由于研究批次有限，且标准汤剂的浸出物与原料无直接相关性，故仅规定浸出物的下限，将浸出物限度制定为：不得少于14.0％。

表95酒川牛膝标准汤剂浸出物测定结果

3出膏率

依据卫生部、国家中医药管理局《医疗机构中药煎药管理规范》要求“煎煮开始时的用水量一般以浸过药面2-5厘米为宜”进行考察，确定了酒川牛膝标准汤剂加水量为一煎9倍水，二煎7倍水。要求一般药物煎煮两次，煮沸后煎煮20-30分钟。故将酒川牛膝标准汤剂的煎煮次数定为2次，煎煮时间按照常规品种，定为30分钟/25分钟。

根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》中浓缩温度不得高于65℃的要求，确认浓缩温度65℃，此外要求，在标准汤剂的制备过程中，应尽量减少含量及出率的损失，使得终产物(冻干粉)与药液保持一致。故选择冷冻干燥的方式进行干燥。

按前述方法将15批酒川牛膝饮片制备成标准汤剂，每批饮片平行制备两份，测定15批次“标准汤剂”出膏率，并按照《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》的要求，规定“标准汤剂”出膏率范围。各批次饮片的得率，及规定的“标准汤剂”出膏率范围如表96所示。

表96 15批次酒川牛膝标准汤剂出膏率及出膏率范围

由上表可知，标准汤剂实测平均得率在40.6％-62.2％之间，平均得率为47.9％，SD为6.4％，得率平均值±30％的波动范围为33.5％～62.2％。规定酒川牛膝标准汤剂冻干粉得率范围为40.0％～62.0％。

4薄层色谱鉴别

取本品0.5g，研细，加甲醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取川牛膝对照药材1g，加水50ml，煮沸30分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇20ml，同法制成对照药材溶液。再取杯苋甾酮对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各5μL，对照品溶液3μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-甲醇-水(体积比10:1:2:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇试液，热风吹干，置紫外光灯(365nm)下检视。如图132所示，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

5含量测定

参照2020版《中国药典》川牛膝药材含量测定项下色谱条件，以杯苋甾酮的含量和指标成分的系统适应性为评判指标，对酒川牛膝标准汤剂含量测定的色谱条件进行重新优化和系统适应性进行了验证，并且对样品的前处理方法进行考察，确定供试品制备方法，通过对该测定方法进行方法学考察，建立了酒川牛膝标准汤剂冻干粉中杯苋甾酮含量的方法，并测定了多批酒川牛膝标准汤剂中杯苋甾酮的含量，结果表明了该方法简单易操作，具有分离效果好、灵敏度高、重复性好等优点，因此可用于酒川牛膝标准汤剂的含量测定。

5.1仪器与试药

5.1.1仪器设备：

色谱仪1:Waters e2695色谱系统，包括四元梯度输液泵(Alliance2695型)、120位高性能自动进样器、原装进口色谱柱温箱、Waters 2998二极管阵列紫外检测器、Empower色谱管理系统；

色谱仪2：Agilent1200色谱系统，包括G1311A型四元泵、G1329A型自动进样器、G1314B型VWD检测器、G1316A型柱温箱、色谱工作站；

色谱仪3：UltiMate 3000色谱系统，包括LPG-3400SDN四元泵、WPS-3000SL自动进样器、TCC-3000SD柱温箱、DAD-3000二极管阵列检测器、色谱工作站；

煎煮器具：一枚王(自动型500W)砂锅

电子分析天平：METTLER TOLEDO(瑞士梅特勒)MS204S、MS36S；奥豪斯CP523C

恒温电热鼓风干燥箱上海一恒科学仪器有限公司DHG-9240A

冷冻干燥机无锡沃信仪器有限公司FD-1A-80

超声清洗机：KQ-500DB型昆山市超声仪器有限公司

色谱柱1：Kromasil 100-5C18 5μm 4.6mm×250mm

色谱柱2：Thermo Hypersil GOLD C18 5μm 4.6mm×250mm

色谱柱3：Agilent ZORBAX SB C18 5μm 4.6mm×250mm

色谱柱4：Thermo accliam C18 5μm 4.6mm×250mm

试剂与试药：

试剂：乙腈、甲醇均为色谱纯，水为超纯水，醋酸、磷酸、甲酸为分析纯。

试药：杯苋甾酮(批号：111804-201504，纯度为96.9％，中国食品药品检定研究院)酒川牛膝标准汤剂“冻干粉”(采用批号：1907001Y酒川牛膝饮片制得)

5.2含量指标成分的选择依据

酒川牛膝配方颗粒原料的基原为苋科植物川牛膝Cyathula officinalis Kuan，药用部位是其干燥根。川牛膝甘、微苦，平。归肝、肾经。具有逐瘀通经，通利关节，利尿通淋之功效。用于经闭癥瘕，胞衣不下，跌扑损伤，风湿痹痛，足痿筋挛，尿血血淋。目前对于川牛膝的药理作用研究较多，酒川牛膝较川牛膝生品而言或增强或减弱某些药理作用，生用以逐瘀通经为主，酒炙后增强逐瘀、通利关节作用。现阶段酒川牛膝化学成分研究主要集中在甾酮类、皂苷类、多糖类、异黄酮类等。其中甾酮类被认为是主要的有效成分，包括了杯苋甾酮、异杯苋甾酮、蜕皮甾酮、头花杯苋甾酮等，同时杯苋甾酮在川牛膝中的含量较高。而药理研究表明，在改善微循环方面，甾酮类能降低血浆粘度，能增强红细胞变形能力，这与中药川牛膝的活血化瘀功效是相吻合的；在补益方面，近年有研究报道，川牛膝含的昆虫变态激素、脱皮甾酮、杯苋甾酮有促进蛋白质合成、抗血小板聚集等活性，与川牛膝补肝肾、强筋骨功效也相符合。此外，其所含甾酮类为天然植物雌性激素，所以在治疗泌尿生殖系统疾病时有着显著的疗效。同时，中国药典中将杯苋甾酮作为川牛膝药材的含量指标成分，甾酮类成分具有一定的水溶性，可作为标准汤剂的指标成分。因此选择杯苋甾酮作为酒川牛膝标准汤剂含量指标成分。

5.2.1杯苋甾酮方法起草预实验

参考2020版《中国药典》川牛膝含量测定中供试品及杯苋甾酮对照品溶液的制备方法，制备酒川牛膝冻干粉含量起草预实验的对照品及供试品溶液。

5.2.1.1对照品溶液的制备

取杯苋甾酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含25μg的溶液，即得。

5.2.1.2供试品溶液的制备

暂定供试品的制备方法：取酒川牛膝冻干粉0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20mL，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

5.2.2流动相梯度的选择

参照2020版《中国药典》川牛膝含量测定的流动相成分和比例，通过对照品比对，发现在主峰杯苋甾酮前后各有一杂质峰，分离度差，未能达到基线分离，见图133。

表97(药典)梯度1

表98梯度1供试品系统适应性参数

经过更换多个品牌色谱柱后，杯苋甾酮附近分离效果仍然不理想，因此打算在药典梯度基础上进行流动相比例的微调。考虑到出峰时间的延长，因此在药典的梯度基础上延长5min时间。梯度如下:

表99梯度2

表100供试品系统适应性参数

通过优化后的梯度，供试品中杯苋甾酮色谱峰的峰型、分离度、对称性等得到明显改善，分离度达到了含量测定的基本要求，如图134所示。因此，暂定梯度2进行后续的研究。

5.2.3不同色谱柱考察

优化后的分离度虽然达到了基本要求，但前后的杂质峰可能会受到不同色谱柱的影响，为了验证该方法的耐用性，对不同品牌的色谱柱进行了考察。具体结果如下表及图135-137所示：

表101供试品系统适应性参数(Thermo Hypersil GOLD C18)

表102供试品系统适应性参数(Agilent Extend C18)

表103供试品系统适应性参数(Kromasil 100-5C18)

由上述图表可知，药典方法优化后(梯度2)在Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱下系统适应性参数良好，达到了含量测定基本要求。Agilent和Kromasil品牌的色谱柱下峰形差，峰有包合，因此建议固定Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱进行杯苋甾酮的含量测定。

5.2.4不同仪器的考察

按上述确定的条件，考察不同仪器对杯苋甾酮色谱峰的影响，结果如下表及图138-140所示。

表104供试品系统适应性参数(ThermoU3000)

表105供试品系统适应性参数(Agilent 1200)

表106供试品系统适应性参数(Waters e2695)

由上述图表可知，药典优化后的方法(梯度2)在不同品牌的色谱仪中系统适应性参数均符合要求，重现性较好，达到了含量测定基本要求。

5.2.5不同流速考察

按上述流动相梯度进行洗脱，考察不同流速对杯苋甾酮色谱峰分离效果的影响，结果如下表及图141-143所示。

表107供试品系统适应性参数(流速0.8mL/min)

表108供试品系统适应性参数(流速1.0mL/min)

表109供试品系统适应性参数(流速1.2mL/min)

由色谱图可知，酒川牛膝标准汤剂冻干粉供试品溶液在0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min流速下，杯苋甾酮分离度均大于1.5，但随着流速的降低，杯苋甾酮出峰时间拉长，峰形变宽，导致峰面积增加。考虑到1.0mL/min最为常用流速，且峰宽适中，分离度较好，暂定流速1.0mL/min开展后续研究。

5.2.6不同柱温考察

取酒川牛膝标准汤剂冻干粉供试品溶液，按上述条件进行洗脱，考察不同柱温(20℃、25℃、30℃)对杯苋甾酮色谱峰的影响，结果如下表及图144-146所示。

表110供试品系统适应性参数(柱温20℃)

表111供试品系统适应性参数(柱温25℃)

表112供试品系统适应性参数(柱温30℃)

不同柱温条件的确定：根据相同梯度条件下，对该方法进行不同柱温条件考察，发现当柱温逐渐升高时，色谱峰出峰时间不断前移，峰宽逐渐减小，同时分离度逐渐降低，但都能够满足含量测定的基本要求，因此，综合考虑，暂固定柱温25℃进行检测。

5.2.7色谱条件的确定

综上，确定酒川牛膝饮片标准汤冻干粉供试品色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Thermo Hypersil GOLD C18；柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相A，水为流动相B，流速为每分钟1.0mL，按表113中的规定进行梯度洗脱；检测波长为243nm；理论板数按杯苋甾酮峰计算应不低于3000。并获得如图147-148所示的系统适应性参数。

表113

表114对照品系统适应性参数(Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱)

/>

表115供试品系统适应性参数(Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱)

5.3供试品处理方法考察

本品是酒川牛膝饮片通过水煎煮得到的水提取物，拟参考《中国药典》2020年版“川牛膝”项下【含量测定】的供试品溶液制备方法，对酒川牛膝标准汤剂“冻干粉”的处理方法进行优化和考察，确定冻干粉供试品溶液的制备方法。

5.3.1提取方式考察

考虑到本品为水溶液提取物，较药材更容易被提取溶解，因此比较加热回流和超声提取两种提取方式，根据杯苋甾酮含量确定合适的提取方式。

取酒川牛膝标准汤剂冻干粉约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20mL，称定重量，分别采取回流提取1小时与超声处理(功率300W，频率40kHz)1小时，取出，放冷，用甲醇补足减失的重量，混匀，滤过，取续滤液，即得。按上述色谱条件测定，计算杯苋甾酮含量。结果如下表及图149-150：

表116不同提取方式的考察结果

表117超声提取系统适应性参数

表118回流提取系统适应性参数

结果表明，加热回流和超声提取样品测得含量较为一致，说明两种方式均能将杯苋甾酮有效提取出来，提前效率接近。考虑到超声提取更为简单，且两种提取方式测得杯苋甾酮的系统适应性参数均符合规定，故选择超声作为供试品溶液制备的提取方式。

5.3.2提取溶剂的考察

在对酒川牛膝冻干粉进行含量测定时，为了保证杯苋甾酮的提取完全，考虑不同的溶剂对提取效果的影响，分别考察以水、乙醇、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇为提取溶剂，根据杯苋甾酮含量和该峰的系统适应性参数确定适宜的提取溶剂。取酒川牛膝标准汤剂冻干粉约0.5g，分别加入上述溶剂20mL，超声提取1小时，取出，放冷，用相应溶剂补足减失的重量，混匀，滤过，即得。按上述色谱条件测定，计算杯苋甾酮含量，结果见下表及图151-156。

表119不同提取溶剂的考察结果

表120水提取系统适应性参数

表121乙醇提取系统适应性参数

表122甲醇提取系统适应性参数

表123 70％甲醇提取系统适应性参数

表124 50％甲醇提取系统适应性参数

表125 30％甲醇提取系统适应性参数

结果表明，用乙醇提取，杯苋甾酮几乎不溶，用水和纯甲醇作溶剂提取时，样品测得含量稍微低于其它溶剂。而使用含水甲醇作提取溶剂时，测得样品含量差异不明显，结果样品溶解性和杯苋甾酮峰统适用性参数均合要求，单位含量接近，故暂定使用70％甲醇作为酒川牛膝标准汤剂的提取溶剂。

5.3.3提取时间的考察

取酒川牛膝标准汤剂冻干粉约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20mL，称定重量，超声处理(功率300W，频率40kHz)20、30、45、60分钟，取出，放冷，用70％甲醇补足减失的重量，混匀，滤过，取续滤液，即得。按上述色谱条件测定，计算杯苋甾酮含量。结果见下表及图157-160：

表126不同提取时间的考察结果

表127超声20分钟系统适应性参数

表128超声30分钟系统适应性参数

表129超声45分钟系统适应性参数

表130超声60分钟系统适应性参数

结果表明，不同提取时间测得杯苋甾酮含量基本一致，为保证酒川牛膝标准汤剂中杯苋甾酮提取完全，暂定提取时间为30分钟。

5.3.4超声功率的考察

取酒川牛膝标准汤剂冻干粉约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20mL，称定重量，分别在200W、250W、300W、350W功率下超声处理30分钟，取出，放冷，用70％甲醇补足减失的重量，混匀，滤过，取续滤液，即得。按上述色谱条件测定，计算杯苋甾酮含量。结果见下表及图161-164：

表131不同超声功率的考察结果

表132 200W功率系统适应性参数

表133 250W功率系统适应性参数

表134 300W功率系统适应性参数

表135 350W功率系统适应性参数

结果表明，不同超声功率测得样品中杯苋甾酮含量几乎无差异，且各条件下杯苋甾酮峰系统适应性参数均符合要求，综合考虑，暂定为实验室常用功率300W进行下一步考察。

5.3.5提取溶剂用量的考察

取酒川牛膝标准汤剂冻干粉约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％甲醇20mL、50mL、100mL，称定重量，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，用70％甲醇补足减失的重量，混匀，滤过，取续滤液，即得。按上述色谱条件测定，计算杯苋甾酮含量。结果见下表及图165-167：

表136不同提取溶剂用量的考察结果

表137 20mL溶剂系统适应性参数

表138 50mL溶剂系统适应性参数

表139 100mL溶剂系统适应性参数

上述结果可知，提取溶剂不同用量测得杯苋甾酮含量基本一致，表明酒川牛膝标准汤剂中杯苋甾酮在上述条件下提取完全，为保证色谱峰的相应值大小适中，暂定提取溶剂加入量为20mL。

5.3.6取样量的考察

分别取酒川牛膝标准汤剂冻干粉约0.3、0.4、0.5、0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20mL，称定重量，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，用70％甲醇补足减失的重量，混匀，滤过，取续滤液，即得。按上述色谱条件测定，计算杯苋甾酮含量。结果见下表及图168-171：

表140不同取样量考察结果

表141 0.3g称样量系统适应性参数

表142 0.4g称样量系统适应性参数

表143 0.5g称样量系统适应性参数

表144 0.6g称样量系统适应性参数

结果表明，不同取样量测得杯苋甾酮的含量相差不明显，RSD％为1.95％，说明在取样量0.3～0.6g的范围内，冻干粉中杯苋甾酮能被完全提取，结合杯苋甾酮峰系统适应性参数，确定供试品的取样量为0.5g。

5.4确定系统适应性条件和溶液的制备方法

5.4.1色谱条件与系统适用性条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，水为流动相B，按表145中的规定进行梯度洗脱；波长为243nm；流速为每分钟1.0mL；柱温25度。理论板数按杯苋甾酮峰计算应不低于3000。

表145

5.4.2溶液的制备方法

对照品溶液的制备取杯苋甾酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含25μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取酒川牛膝冻干粉0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人70％甲醇20mL，称定重量，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得图172-173。

表146杯苋甾酮对照品系统适用性

表147酒川牛膝标准汤剂供试品系统适应性参数

5.5方法学验证

5.5.1专属性考察

取供试品溶液和空白对照溶液，按已确定的色谱条件进行HPLC分析，记录色谱图，结果见图174-175。结果阴性对照试验无干扰。

5.5.2检测限与定量限

5.5.2.1检测限：按照中国药典2020年版四部通则质量标准分析方法验证指导原则中检测限进行测定，把已知浓度供试品测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，信噪比为3:1。试验测得杯苋甾酮最低量为0.000176μg。结果见下表及图176。

表148杯苋甾酮检测限系统适用性参数

5.5.2.2定量限：按照中国药典2020年版四部通则质量标准分析方法验证指导原则中定量限进行测定，把已知浓度供试品测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，信噪比为10:1。试验测得杯苋甾酮最低量为0.000529μg。结果见下表及图177。

表149杯苋甾酮定量限系统适用性

5.5.3线性关系考察

不同进样量线性关系考察：取杯苋甾酮适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.575μg、2.87μg、11.5μg、34.5μg、69.0μg、138.0μg的溶液，精密吸取以上6个不同浓度的杯苋甾酮对照品溶液10μL注入液相色谱仪，测定峰面积，以杯苋甾酮的量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，如图178所示。回归方程：y＝19.760x+0.081，R²＝0.999。实验结果表明杯苋甾酮进样量在0.00575μg～1.38μg范围内线性关系良好。

表150不同进样量杯苋甾酮线性关系考察结果

5.5.4精密度试验

5.5.4.1仪器精密度试验

取同一份供试品溶液，按以上确定条件，连续进样6次，测定杯苋甾酮峰面积，结果峰面积RSD值为0.2％，说明仪器精密度良好，结果见下表。

表151精密度试验结果

5.5.4.2不同人员中间精密度考察

同一批酒川牛膝标准汤剂，由甲、乙实验人员分开独立操作，按供试品制备方法处理，用不同仪器测定杯苋甾酮的含量，结果表明本法在不同操作人员中间精密度良好。

表152不同人员中间精密度考察结果

5.5.4.3不同液相色谱仪中间精密度

取同一份供试品溶液，按以上确定条件，分别在沃特世e2695、安捷伦1200、戴安U3000超高效液相色谱仪上进行试验，测定杯苋甾酮的含量。结果见下表及图179-181。结果表明本法在不同的超高效液相色谱仪间中间精密度良好。

表153不同液相色谱仪中间精密度考察结果

5.5.5重复性考察

取同一批酒川牛膝标准汤剂(1907001Y)6份，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备，照上述色谱条件进行测定并计算含量结果RSD％。结果见下表，结果RSD为0.6％，表明该方法重复性良好。

表154方法重复性试验结果

5.5.6准确度考察

即加样回收试验，精密称取同一批号酒川牛膝标准汤剂冻干粉6份样品约0.25g，分别置于具塞锥形瓶中，分别精密加入杯苋甾酮对照品溶液(70％甲醇溶解；0.06097mg/mL)5mL和70％甲醇15mL，按供试品制备方法处理，按以上确定条件，进行含量测定。使用随行测定2份酒川牛膝标准汤剂冻干粉含量(计算得杯苋甾酮含量1.11mg/g)，计算回收率，结果见下表。实验结果表明方法准确性良好。

表155准确度试验结果

5.5.7耐用性考察

5.5.7.1溶液的稳定性

取同一份供试品溶液，配制后在第0、4、8、12、16、20、24小时进样，测定峰面积，以考察溶液的稳定性。结果见下表及图182-184。实验结果表明供试品溶液在24小时内基本稳定，可以满足测定需要。

表156溶液稳定性测定结果

5.5.7.2不同流速耐用性考察

取酒川牛膝标准汤剂0.5g，精密称定，按供试品制备方法处理，分别在不同流速0.9mL/min、1.0mL/min、1.1mL/min下进行试验，测定杯苋甾酮的含量，结果见下表及图185-187。结果表明不同流速对杯苋甾酮的含量影响较小。

表157不同流速测定结果

5.5.7.3不同柱温耐用性考察

取酒川牛膝标准汤剂0.5g，精密称定，按供试品制备方法处理，分别在不同柱温20℃、25℃、30℃下进行试验，测定杯苋甾酮的含量，结果表明不同柱温对杯苋甾酮的含量影响较小。

表158不同柱温测定结果

5.7.4不同批次色谱柱的考察

取酒川牛膝标准汤剂0.5g，精密称定，按供试品制备方法处理，在ThermoHypersil GOLD C18 5μm 4.6mm×250mm色谱柱不同批次下进行试验，测定杯苋甾酮的含量，结果见下表及图188-190。结果表明色谱柱不同批次对杯苋甾酮的含量影响较小，该方法对该品牌耐用性较好。

表159不同色谱柱的测定结果

以上方法学研究结果表明该方法符合含量测定的要求，可用于测定酒川牛膝标准汤剂中杯苋甾酮含量的测定。

5.6酒川牛膝标准汤剂杯苋甾酮含量测定方法确定

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ThermoHypersil GOLD C18；柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相A，水为流动相B，按表160中的规定进行梯度洗脱；波长为243nm；流速为每分钟1.0mL；理论板数按杯苋甾酮峰计算应不低于3000。

表160

对照品溶液的制备取杯苋甾酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含25μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理(功率300W，频率40HZ)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪中，测定，即得。

取15批酒川牛膝标准汤剂样品，按上述前处理方法和色谱条件测定各批次标准汤剂的杯苋甾酮含量。按照《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》的要求，规定标准汤剂中杯苋甾酮含量范围。各批次标准汤剂水煎液中杯苋甾酮含量以及规定的标准汤剂中杯苋甾酮含量范围见表161。

表161 15批次酒川牛膝标准汤剂中杯苋甾酮含量及范围

结论：由上表可知，各批次酒川牛膝标准汤剂杯苋甾酮含量均值0.13％，最小值0.07％，最大值0.18％，均值0.13％。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (22)

1.川牛膝和/或酒川牛膝的UPLC特征图谱构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

供试品溶液的制备：取川牛膝供试品制备得到川牛膝供试品溶液；和/或，取酒川牛膝供试品制备得到酒川牛膝供试品溶液；

对照品溶液的制备：取杯苋甾酮、5-羟甲基糠醛，分别制备杯苋甾酮对照品溶液、5-羟甲基糠醛对照品溶液；

超高效液相色谱法：将川牛膝供试品溶液和/或酒川牛膝供试品溶液注入液相色谱仪，检测，即得；

其中，超高效液相色谱法的色谱条件包括：采用Waters ACQUITY BEH C18 150mm×2.1mm 1.7µm色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.2%含酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱条件如下：0min→4min，5%→10%流动相A，95%→90%流动相B；4min→9min，10%→15%流动相A，90%→85%流动相B；9min→12min，15%→20%流动相A，85%→80%流动相B；12min→20min，20%→30%流动相A，80%→70%流动相B；20min→25min，30%→70%流动相A，70%→30%流动相B。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述含酸水溶液选自磷酸水溶液、醋酸水溶液和甲酸水溶液中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述含酸水溶液为磷酸水溶液。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述色谱条件还包括：柱温为28-32℃，流速为0.3mL/min，检测波长为266nm，理论板数按杯苋甾酮峰计算应不低于8000。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述酒川牛膝供试品溶液的制备过程中，包括采用溶剂对酒川牛膝供试品进行提取的步骤。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，采用的溶剂为体积分数为30%的甲醇水溶液，提取的方式为超声提取，酒川牛膝供试品的质量与溶剂的体积比为1:25g/mL。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述超声提取的功率为300W，频率为40kHz，时间为30min。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述川牛膝供试品溶液或者酒川牛膝供试品溶液的制备过程中，包括对供试品先水提再醇提的步骤。

9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，水提时供试品的质量与水的体积比为1:25g/mL，水提方式为加热回流45min，之后过滤，滤液蒸干，再对残渣醇提，醇提时采用体积分数为30%的甲醇水溶液，醇提方式为超声提取。

10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述超声提取的功率为300W，频率为40kHz，时间为30min。

11.根据权利要求1-4中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括按照权利要求1-4任一项所述的超高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品特征图谱的步骤。

12.根据权利要求11所述的构建方法，其特征在于，在所述对照品溶液的制备过程中包括采用溶剂对杯苋甾酮进行溶解的步骤；和/或

在所述对照品溶液的制备过程中包括采用溶剂对5-羟甲基糠醛进行溶解的步骤。

13.根据权利要求12所述的构建方法，其特征在于，采用的溶剂为体积分数≥50%的甲醇水溶液或纯甲醇，对照品溶液中杯苋甾酮的浓度为10-30μg/mL；和/或

采用的溶剂为体积分数为10-70%的甲醇水溶液，对照品溶液中5-羟甲基糠醛的浓度为10-30μg/mL。

14.根据权利要求1-4中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括参照物溶液的制备步骤、以及按照权利要求1-4任一项所述的超高效液相色谱法检测参照物溶液得到参照物特征图谱的步骤。

15.根据权利要求14所述的构建方法，其特征在于，在所述参照物溶液的制备过程中包括，采用体积分数为30%的甲醇水溶液对川牛膝对照药材进行超声提取。

16.根据权利要求15所述的构建方法，其特征在于，所述超声提取的功率为300W，频率为40kHz，时间为30min。

17.一种川牛膝和/或酒川牛膝的鉴别方法，其特征在于，包括将待测产品的特征图谱与川牛膝对照特征图谱和/或酒川牛膝对照特征图谱进行比较的步骤；所述待测产品的特征图谱为使用待测产品按照权利要求1-16中任一所述的构建方法得到，所述川牛膝对照特征图谱选自如下任意一项：

（1）其含有7个特征峰，以杯苋甾酮对应的峰5为参照峰，各特征峰与峰5的相对保留时间在规定值的土10%范围之内，规定值为：

峰1：0.47、峰2：0.49、峰3：0.72、峰4：0.97、峰6：1.11、峰7：1.37；

（2）使用单批次或多批次川牛膝道地药材并按照权利要求1-16中任一项所述的构建方法得到的川牛膝UPLC特征图谱；

（3）使用多批川牛膝按照权利要求1-16中任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照谱图；

所述酒川牛膝对照特征图谱选自如下任意一项：

（1）包含8个特征峰，以杯苋甾酮对应的峰6为参照峰，峰1为5-羟甲基糠醛，各特征峰与峰6的相对保留时间在规定值的土10%范围之内，规定值为：

峰2：0.47、峰3：0.49、峰4：0.72、峰5：0.97、峰7：1.11、峰8：1.37，并且，

当所述待测产品为酒川牛膝饮片时，峰1与峰6的相对峰面积应不低于0.34；当所述待测产品为酒川牛膝标准汤剂冻干粉或酒川牛膝配方颗粒时，峰1与峰6的相对峰面积应不低于0.13；

（2）包含8个特征峰，其中峰6为杯苋甾酮参照峰S，峰1为5-羟甲基糠醛；各特征峰与峰S的相对保留时间在规定值的土10%范围之内，规定值为：

峰2：0.47、峰3：0.49、峰4：0.72、峰5：0.97、峰7：1.11、峰8：1.37，并且，

当所述待测产品为酒川牛膝饮片时，峰1与峰6的相对峰面积应不低于0.34；当所述待测产品为酒川牛膝标准汤剂冻干粉或酒川牛膝配方颗粒时，峰1与峰6的相对峰面积应不低于0.13；

（3）使用单批次或多批次川牛膝道地药材按照药典方法炮制的酒川牛膝药材并按照权利要求1-16中任一项所述的构建方法得到的酒川牛膝UPLC特征图谱；

（4）使用多批酒川牛膝按照权利要求1-16中任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照图谱。

18.根据权利要求17所述的川牛膝和/或酒川牛膝的鉴别方法，其特征在于，还包括采用薄层色谱方法鉴别牛膝与川牛膝和/或酒川牛膝的步骤，具体为：分别吸取待测产品溶液、川牛膝溶液、酒川牛膝溶液、杯苋甾酮溶液，点于同一硅胶薄层板上，以体积比为10:1:2:1的乙酸乙酯-甲酸-甲醇-水体系为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇试液，热风吹干，置紫外光灯下检视；其中，

所述酒川牛膝溶液的制备方法为：甲醇超声提取，酒川牛膝药物制剂的质量与甲醇的体积比为1:40g/mL，之后滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL 使溶解；所述酒川牛膝药物制剂为酒川牛膝配方颗粒或酒川牛膝标准汤剂冻干粉；

所述川牛膝溶液的制备方法为：先水提再醇提，水提时川牛膝药材的质量与水的体积比为1:50g/mL，水提方式为加热回流30min，之后过滤，滤液蒸干，再对残渣醇提，醇提时采用甲醇超声提取，之后滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL 使溶解；

所述杯苋甾酮溶液的制备方法为：取杯苋甾酮对照品，加甲醇制成每 1mL 含 0.5mg杯苋甾酮的溶液；

所述待测产品溶液的制备方法为：若待测产品为药材或饮片，其制备方法同所述川牛膝溶液的制备方法；若待测产品为药物制剂，其制备方法同所述酒川牛膝溶液的制备方法。

19.一种川牛膝的质量控制方法，其特征在于，包括将待测川牛膝产品的特征图谱与川牛膝对照特征图谱进行比较的步骤；其中，所述待测川牛膝产品的特征图谱为使用待测产品按照权利要求1-5中任一所述的构建方法得到，所述川牛膝对照特征图谱为权利要求7所述的川牛膝UPLC对照特征图谱。

20.一种酒川牛膝药物制剂的质量控制方法，其特征在于，包括将待测酒川牛膝产品的特征图谱与酒川牛膝对照特征图谱进行比较的步骤；其中，所述酒川牛膝药物制剂为酒川牛膝配方颗粒或酒川牛膝标准汤剂冻干粉；所述待测酒川牛膝产品的特征图谱为使用待测产品按照权利要求1-16中任一所述的构建方法得到，所述酒川牛膝对照特征图谱选自如下任意一项：

（1）包含8个特征峰，以杯苋甾酮对应的峰6为参照峰，峰1为5-羟甲基糠醛，各特征峰与峰6的相对保留时间在规定值的土10%范围之内，规定值为：

峰2：0.47、峰3：0.49、峰4：0.72、峰5：0.97、峰7：1.11、峰8：1.37，且峰1与峰6的相对峰面积应不低于0.13；

（2）包含8个特征峰，其中峰6为杯苋甾酮参照峰S，峰1为5-羟甲基糠醛；各特征峰与峰S的相对保留时间在规定值的土10%范围之内，规定值为：

峰2：0.47、峰3：0.49、峰4：0.72、峰5：0.97、峰7：1.11、峰8：1.37，且峰1与峰S的相对峰面积应不低于0.13；

（3）使用单批次或多批次川牛膝道地药材按照药典方法炮制的酒川牛膝药材并按照权利要求1-16中任一项所述的构建方法得到的酒川牛膝UPLC特征图谱；

（4）使用多批酒川牛膝按照权利要求1-16中任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照图谱。

21.根据权利要求20所述的酒川牛膝药物制剂的质量控制方法，其特征在于，还包括选自如下任意一项：

（1）性状为浅黄色至棕黄色的粉末或颗粒；气微，味甘；

（2）酒川牛膝配方颗粒的浸出物的质量百分含量不少于9.0%；或者酒川牛膝标准汤剂冻干粉的浸出物的质量百分含量不少于14.0%；

（3）酒川牛膝配方颗粒的干浸膏出膏率为40.0%～60.0%；或者酒川牛膝标准汤剂冻干粉的干浸膏出膏率为40.0%～62.0%；

（4）如权利要求18所述的鉴别方法；

（5）HPLC含量测定方法，具体为：

待测产品溶液的制备：采用甲醇水溶液超声提取；之后，用70%甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液；

对照品溶液的制备：取杯苋甾酮对照品，加甲醇制成每 1mL 含 25μg 杯苋甾酮的溶液；

色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以水为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱条件如下：0min→5min，10%流动相A，90%流动相B；5min→15min，10%→35%流动相A，90%→65%流动相B；15min→35min，35%流动相A，65%流动相B；35min→36min，35%→100%流动相A，65%→0%流动相B；流速为每分钟1.0 mL；柱温25℃；检测波长为243nm；理论板数按杯苋甾酮峰计算应不低于3000；

测定法：分别精密吸取对照品溶液、待测产品溶液各10ul，注入液相色谱仪，按照上述色谱条件测定，每1g酒川牛膝配方颗粒含杯苋甾酮应为0.4mg~1.6mg或者每1g酒川牛膝标准汤剂冻干粉含杯苋甾酮应为0.7mg~1.8mg。

22.根据权利要求21所述的酒川牛膝药物制剂的质量控制方法，其特征在于，所述甲醇水溶液的体积分数为70%，待测产品的质量与甲醇水溶液的体积之比为1:40g/mL，所述超声提取的功率为300W，频率为40kHz，时间为30min。

Images