CN105842371B - 忍冬藤中5‑O‑[4′‑O‑(β‑D‑吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸含量测定方法 - Google Patents

忍冬藤中5‑O‑[4′‑O‑(β‑D‑吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸含量测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了中药材忍冬藤中一种咖啡酰奎宁酸糖苷的含量测定方法，该方法制备的供试品溶液中目标成分稳定性好，加样回收率在95.0%~105.0%范围内，测定数值能够准确地反映原药材中目标成分的含量。该测定方法包括以下步骤：忍冬藤药材粉碎、前处理及提取；HPLC外标法或标准曲线法含量测定。本发明方法操作简便，步骤简单；供试品溶液和对照品溶液的制备过程中未用到有机试剂，降低了分析成本。

Description

忍冬藤中5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸 含量测定方法
技术领域
本发明涉及中医中药技术领域，特别涉及一种忍冬藤中5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的含量测定方法。
背景技术
中药材忍冬藤为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥茎枝，秋、冬二季采收。味甘，性寒，具有清热解毒，疏风通络的功效，用于温病发热，热毒血痢，痈肿疮疡，风湿热痹，关节红肿热痛。其化学成分主要包括有机酸类、三萜类、环烯醚萜类、黄酮类、挥发油类等。
经过长期研究，发现忍冬藤中含有一种咖啡酰奎宁酸糖苷：5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸，经HR-ESI-MS、2D NMR技术确定该化合物结构式如下：
该成分为绿原酸的单葡萄糖苷，是忍冬藤的主要成分之一，其含量甚至超过了《中国药典》2015年版一部忍冬藤药材项下控制的绿原酸含量，有必要进行定量测定。但目前对5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的研究仅限于定性分析，含量测定方法鲜有报道。研究发现，忍冬藤直接以水超声提取后，该成分稳定性差，24h后含量测定值下降一半，无法满足对样品稳定性的要求(24h内基本稳定)；加热回流提取后，样品溶液稳定性较好，但含量测定值过低，远远不能反映药材中该成分的真实含量，应当是剧烈的提取条件对目标成分造成了破坏。因此，测定忍冬藤药材中5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的真实含量，是一项具有挑战性又十分有意义的工作。
发明内容
忍冬藤中5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸含量测定时，因目标成分稳定性差导致测定不准确。为了解决以上问题，本申请提供了一种加样回收率在95.0％～105.0％范围内，测定数值能够准确地反映忍冬藤原药材中5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸含量的测定方法。
本发明是通过以下步骤得到的：
一种忍冬藤中5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的含量测定方法，包括以下步骤：
(1)取供试品忍冬藤药材粉末，在150±10℃加热8分钟～15分钟，放冷，加水50mL，密塞，称定重量，超声功率500W，频率40kHz处理15分钟～45分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，收集续滤液；
(2)精密吸取续滤液，注入液相色谱仪，色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以体积分数比0.1％～1％的酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：0min→20min：乙腈8％→15％，酸溶液92％→85％，检测波长为216±2nm、292±2nm、316±2nm或327±2nm，以外标法或标准曲线法测定供试品溶液中5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的含量。
优选步骤(2)中的酸溶液为冰醋酸溶液、甲酸溶液或磷酸溶液。
所述的含量测定方法，优选忍冬藤药材粉末过五号筛。
所述的含量测定方法，优选忍冬藤药材粉末取0.125g～0.25g。
所述的含量测定方法，优选忍冬藤药材粉末在150℃加热10分钟。
所述的含量测定方法，优选步骤(1)中超声处理时间为30分钟。
所述的含量测定方法，优选外标法或标准曲线法中使用的对照品通过以下步骤得到：
(1)取忍冬藤药材500g，粉碎成粗粉，加8倍量体积分数为50％的甲醇溶液，超声功率500W，频率40kHz提取2次，每次0.5小时，合并提取液并滤过，以旋转蒸发仪回收提取溶剂至干，得干浸膏a；
(2)干浸膏a加等量水使溶解，以D101大孔吸附树脂柱进行纯化，柱填料用量为干浸膏重量的2倍，以水为洗脱溶剂，洗脱3个柱体积，收集洗脱液并合并，以旋转蒸发仪回收溶剂至干得干浸膏b；
(3)干浸膏b加等量水使溶解，以Sephadex LH-20凝胶柱进行纯化，柱体积为样品水溶液体积的15倍，以水为洗脱溶剂，洗脱3个柱体积，以40分之一柱体积作为一份收集洗脱液，以HPLC进行检测，合并含有目标成分的洗脱液，以旋转蒸发仪回收溶剂至干，以Sephadex LH-20凝胶柱反复纯化2次，得到干浸膏c；
(4)干浸膏c加水使溶解，0.45μm微孔滤膜滤过，经半制备HPLC纯化，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈-0.4％冰醋酸溶液，体积比4:96，327nm检测，收集含有目标成分的洗脱液，收集液经浓缩干燥后可得5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸，按照峰面积归一化法计算，纯度大于98％。
对照品溶液的制备：取5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸对照品适量，精密称定，加水制成质量浓度为30μg/mL的溶液，即得。
所述的含量测定方法，优选标准曲线法中标准曲线为y＝1.5205x-2.1952，相关系数r＝1.0000，x为进样量，取值范围30～3100ng，y为峰面积。
所述的含量测定方法，优选加样回收率为95.0％～105.0％。
所述的忍冬藤药材为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥茎枝。
所述的梯度洗脱方式为梯度性地改变洗脱液的组分(成分、离子强度等)或pH，以期将层析柱上不同的组分在合理的时间内洗脱出来的方法。
有益效果：
1)本发明方法制备的忍冬藤供试品溶液稳定性好，24h测定值基本稳定；
2)加样回收率在95.0％～105.0％范围内，测定数值能够准确地反映原药材中5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的含量；
3)方法操作简便，步骤简单；供试品溶液和对照品溶液的制备过程中未用到有机试剂，降低了分析成本。
附图说明
图1为5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸紫外吸收光谱图；
图2为实施例1的2.3项下5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸对照品的HPLC色谱图；
图3为实施例1的2.3项下忍冬藤药材供试品溶液的HPLC色谱图；
图4为5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸标准曲线(横坐标为进样量，纵坐标为峰面积)。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步的说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于具体实施例。
实施例1
1仪器与试药
仪器：Sartorius CP225D电子天平；DGG-9070B电热鼓风干燥箱；Agilent 1200高效液相色谱仪。
对照品及来源：如发明内容部分中方法自制5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸，以峰面积归一化法测定，含量大于98％。
试剂：乙腈、甲醇为色谱纯，水为Millipore制备的纯化水，其他试剂均为分析纯。
2色谱条件
2.1对照品溶液的制备精密称取5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸对照品15.36mg，置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液(0.1536mg/mL)。精密量取上述对照品贮备液10mL，置50mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得到浓度为30.72μg/mL的对照品溶液。
2.2供试品溶液的制备取待测忍冬藤粉末(过五号筛)约0.25g，精密称定，平铺于具塞锥形瓶中，在150℃加热10分钟，放冷，精密加水50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3色谱条件
5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸紫外吸收光谱图见图1。在216、292、316nm波长处有最大吸收。考虑到咖啡酰奎宁酸类成分常以327nm作为测定波长，而5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸在327nm也有较大吸收，最终选择327nm作为测定波长。
色谱柱：Dikma Technologies PLATISILTM ODS C18(250mm×4.6mm,5μm)；以乙腈为流动相A，以0.4％冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为327nm。流速1.0mL/min，柱温35℃。理论板数按5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸峰计算应不低于8000。
精密吸取2.1项下对照品溶液10μL、2.2项下供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，进行测定。结果5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸峰型较好，理论板数、分离度、对称因子均符合相关要求，证明该色谱条件可行。色谱图见图2、3。
3供试品溶液制备方法的考察
3.1提取溶剂的考察
供试品溶液的制备分别取待检忍冬藤粉末(过五号筛)约0.25g，精密称定，分别精密加水、50％甲醇、50％乙醇、甲醇各50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
分别精密吸取2.1项下对照品溶液10μL、上述供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，计算含量(以干燥品计算；经烘干法测定，方法学研究用忍冬藤水分为7.39％)。结果见表1。
表1 提取溶剂考察结果
提取溶剂 含量(mg/g)
水 6.391
50％甲醇 4.933
50％乙醇 3.084
甲醇 4.079
由测定结果可知，以水为提取溶剂时目标成分色谱峰面积最大，含量测定结果最高，所以应采用水作为提取溶剂。
但在考察过程中发现，随时间的推移，水提液中目标成分含量下降明显，24h后峰面积降低一半(见表2)，忍冬藤水提液中可能存在某些酶，可以将目标成分降解。研究发现，通过对忍冬藤样品进行前处理，将上述酶类灭活，可以增加水提液中目标成分的稳定性。
3.2样品前处理方法及稳定性考察
3.2.1前处理方法的考察
方法一(直接水煮)：取待检忍冬藤粉末(过五号筛)约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加水50mL，密塞，称定重量，回流提取30分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
方法二(改变pH值)：取待检忍冬藤粉末(过五号筛)约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加pH为2.0的盐酸溶液50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
方法三(直接加热)：取待检忍冬藤粉末(过五号筛)约0.25g，精密称定，平铺于具塞锥形瓶中，在150℃加热20分钟，放冷，精密加水50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
分别精密吸取2.1项下对照品溶液10μL、3.2.1项下各提取供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，每隔4h进样一次，测定供试品溶液24h稳定性，计算含量。结果见表2。
表2 不同前处理方法样品稳定性试验结果
根据表2测定结果，水直接超声样品稳定性较差，目标成分24h测定含量下降一半！使用不同的样品前处理方法后，提取液中目标成分稳定性增强：水煮提取后稳定性最好，24h测定含量几乎不变，但其测定值较低，可能是水煮过程中对目标成分造成了破坏；pH2.0的盐酸溶液提取后含量测定值较高，但稳定性不足(RSD＞2.0％)；样品直接加热后再提取得到的供试品溶液稳定性好，24h测定值RSD≤2.0％，而且含量测定值较高。
综上，采用直接加热的方式对忍冬疼药材进行前处理，可以增加供试品溶液中5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的稳定性。
3.2.2前处理温度的考察
取待检忍冬藤粉末(过五号筛)约0.25g，精密称定，平铺于具塞锥形瓶中，分别在100、150、200℃加热20分钟，放冷，精密加水50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
分别精密吸取2.1项下对照品溶液10μL、3.2.2项下供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，每隔4h进样一次，测定供试品溶液24h稳定性，计算含量。结果见表3。
表3 不同前处理温度样品稳定性试验结果
根据表3测定结果，100℃处理后样品溶液稳定性不足，而200℃处理后测定含量过低，150℃处理后稳定性较好，含量较高。故前处理温度选择150℃。
3.2.3前处理时间的考察
取待检忍冬藤粉末(过五号筛)约0.25g，精密称定，平铺于具塞锥形瓶中，分别在150℃加热5、10、20分钟，放冷，精密加水50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
分别精密吸取2.1项下对照品溶液10μL、3.2.3项下供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，每隔4h进样一次，测定供试品溶液24h稳定性，计算含量。结果见表4。
表4 不同前处理时间样品稳定性试验结果
根据表4测定结果，前处理5min后样品溶液稳定性不足，前处理10min和20min后24h含量测定稳定性均较好，RSD≤2.0％，两者相比，前处理10min含量测定值更高。故前处理时间选择10min。
3.2.4样品前处理方法
综上，采用如下前处理方法可以增加忍冬藤样品中5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的稳定性(24h内测定数值RSD≤2.0％)：取本品粉末(过五号筛)约0.25g，精密称定，平铺于具塞锥形瓶中，在150℃加热10分钟，放冷。
3.3提取时间的考察
取待检忍冬藤粉末(过五号筛)约0.25g，精密称定，平铺于具塞锥形瓶中，在150℃加热10分钟，放冷，精密加水50mL，密塞，称定重量，分别超声处理(功率500W，频率40kHz)15、30、45分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
分别精密吸取2.1项下对照品溶液10μL、3.3项下供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，计算含量。结果见表5。
表5 提取时间考察结果
超声时间 含量(mg/g)
15min 7.116
30min 7.112
45min 7.101
由上述结果可见，三种超声时间测定结果没有显著性差异。为了确保目标成分的完全提取，同时兼顾节约能源，选择提取时间为30分钟。
3.4取样量的考察
分别取待检忍冬藤粉末(过五号筛)约0.125、0.25、0.375g，精密称定，平铺于具塞锥形瓶中，在150℃加热10分钟，放冷，精密加水50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
分别精密吸取2.1项下对照品溶液10μL、3.4项下供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，计算含量。结果见表6。
表6 取样量考察结果
由上述结果可见，取样量为0.375g时测定结果偏低，另外两种取样量测定结果没有显著性差异。为了确保取样的均匀性，确定取样量为0.25g。
3.5供试品溶液的制备
综上所述，供试品溶液的制备方法如下：取待检忍冬藤粉末(过五号筛)约0.25g，精密称定，平铺于具塞锥形瓶中，在150℃加热10分钟，放冷，精密加水50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4线性关系的考察
取2.1项下对照品溶液，分别精密吸取各1、2、5、10、15、20μL，2.1项下对照品贮备液各5、10、15、20μL，注入液相色谱仪，分别测定峰面积积分值。以5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸对照品的进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，得回归方程。测定结果见表7。
表7 线性关系考察结果
进样体积(μL) 浓度(μg/mL) 进样量(ng) 峰面积
1 30.72 30.72 47.03
2 30.72 61.44 94.20
5 30.72 153.60 233.77
10 30.72 307.20 462.75
15 30.72 460.80 698.83
20 30.72 614.40 929.42
5 153.60 768.00 1165.86
10 153.60 1536.00 2322.27
15 153.60 2304.00 3506.72
20 153.60 3072.00 4670.72
回归方程y＝1.5205x-2.1952，相关系数r＝1.0000。x为进样量，取值范围30-3100ng，y为峰面积。
试验结果表明，5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸进样量在30.72～3072.00ng之间进样量与峰面积积分值呈良好的线性关系。见图4。
5仪器精密度试验
精密吸取2.1项下对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，测其峰面积积分值。结果见表8。
表8 精密度试验结果
试验结果显示仪器精密度良好。
6方法重复性考察
供试品溶液的制备：取待检忍冬藤粉末(过五号筛)约0.25g，精密称定，照3.5项下方法制成供试品溶液，平行制备6份。
分别精密吸取2.1项下的对照品溶液10μL、上述供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，计算含量。结果见表9。
表9 重复性考察结果
6份样品测定结果RSD≤2.0％，表明含量测定方法的重复性良好。
7加样回收率试验
供试品溶液的制备：取已测知含量的忍冬藤粉末适量(5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸含量为7.114mg/g)，取约0.125g，精密称定，平铺于具塞锥形瓶中，在150℃加热10分钟，放冷，精密加2.1项下对照品贮备液5mL、水45mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。平行制备6份。
分别精密吸取2.1项下的对照品溶液10μL、上述供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，计算含量。结果见表10。
表10 加样回收率考察结果
6份样品加样回收率平均值在95.0％～105.0％范围内，RSD≤2.0％，表明测定方法的回收率良好。
8样品测定
按照3.5项下方法制备供试品溶液，对所收集到的8批样品进行测定，结果见表11。
表11 样品含量测定结果(按照干燥品计算)
编号 生产企业 批号 产地 含量(mg/g)
1 山东菏泽泰山中药饮片有限公司 120320 山东 7.390
2 安徽亳州市永刚饮片厂有限公司 150411 山东 7.114
3 河北祁一堂药业有限公司 1502013 河南 4.638
4 安徽易元堂中药饮片科技有限公司 151109 湖北 1.737
5 河北楚风中药饮片有限公司 B510121 湖北 5.796
6 山东建联盛嘉中药饮片有限公司中药饮片厂 20150801 山东 6.816
7 对照药材(购自中国药品生物制品检定所) 1069-9901 / 4.370
8 自己收集 / 山东 4.063
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种忍冬藤中5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的含量测定方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取供试品忍冬藤药材粉末，在150±10℃加热8分钟～15分钟，放冷，加水50mL，密塞，称定重量，超声功率500W，频率40kHz处理15分钟～45分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，收集续滤液；
(2)精密吸取续滤液，注入液相色谱仪，色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以体积分数比0.1％～1％的酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：0min→20min：乙腈8％→15％，酸溶液92％→85％，检测波长为216±2nm、292±2nm、316±2nm或327±2nm，以外标法或标准曲线法测定供试品溶液中5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的含量；
外标法或标准曲线法中使用的对照品是通过以下步骤得到的：
(1)取忍冬藤药材500g，粉碎成粗粉，加8倍量体积分数为50％的甲醇溶液，超声功率500W，频率40kHz提取2次，每次0.5小时，合并提取液并滤过，以旋转蒸发仪回收提取溶剂至干，得干浸膏a；
(2)干浸膏a加等量水使溶解，以D101大孔吸附树脂柱进行纯化，柱填料用量为干浸膏重量的2倍，以水为洗脱溶剂，洗脱3个柱体积，收集洗脱液并合并，以旋转蒸发仪回收溶剂至干得干浸膏b；
(3)干浸膏b加等量水使溶解，以Sephadex LH-20凝胶柱进行纯化，柱体积为样品水溶液体积的15倍，以水为洗脱溶剂，洗脱3个柱体积，以40分之一柱体积作为一份收集洗脱液，以HPLC进行检测，合并含有目标成分的洗脱液，以旋转蒸发仪回收溶剂至干，以SephadexLH-20凝胶柱反复纯化2次，得到干浸膏c；
(4)干浸膏c加水使溶解，0.45μm微孔滤膜滤过，经半制备HPLC纯化，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈-0.4％冰醋酸溶液，体积比4:96，327nm检测，收集含有目标成分的洗脱液，收集液经浓缩干燥后可得5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸，按照峰面积归一化法计算，纯度大于98％。
2.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于忍冬藤药材粉末过五号筛。
3.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于忍冬藤药材粉末取0.125g～0.25g。
4.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于忍冬藤药材粉末在150℃加热10分钟。
5.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于步骤(1)中超声处理时间为30分钟。
6.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于标准曲线法中标准曲线为y＝1.5205x-2.1952，相关系数r＝1.0000，x为进样量，取值范围30-3100ng，y为峰面积。
7.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于加样回收率为95.0％～105.0％。
8.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于步骤(2)中的酸溶液为冰醋酸溶液、甲酸溶液或磷酸溶液。
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