KR101212612B1

KR101212612B1 - 항산화활성 및 과산화물생성억제활성 중 하나 이상의 활성을 갖는 신규 화합물 및 퉁퉁마디로부터의 상기 신규 화합물 분리방법

Info

Publication number: KR101212612B1
Application number: KR1020100099317A
Authority: KR
Inventors: 문제학; 김진영; 이형재; 마영규; 조정용; 박근영; 문영학; 박근형
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2010-10-12
Filing date: 2010-10-12
Publication date: 2012-12-14
Also published as: KR20120088021A

Abstract

본 발명은 항산화활성 및 과산화물생성억제활성 중 하나 이상의 활성을 갖는 신규 화합물, 상기 신규 화합물을 퉁퉁마디(Salicornia herbacea L.)로부터 분리할 수 있는 화합물분리방법 및 신규화합물의 용도에 관한 것이다.

Description

항산화활성 및 과산화물생성억제활성 중 하나 이상의 활성을 갖는 신규 화합물 및 퉁퉁마디로부터의 상기 신규 화합물 분리방법{Novel compounds with antioxidant activity and/or lipid peroxidation inhibitory activity and isolation method of the compounds from Salicornia herbacea L.}

퉁퉁마디(Salicornia herbacea L.)는 명아주과에 속하는 식물로 서해안과 울릉도의 염수가 닿는 바닷가에서 자라는 일년초로서 우리말로 통통하고 마디가 튀어나온 풀이라고 하여 퉁퉁마디 또는 함초라고 불리운다. 퉁퉁마디의 줄기는 마디가 많고 두드러지며 가지는 2~3번 갈라져서 마주 난다. 가지는 다육질로 비대하고 진한 녹색이며 잎은 없다. 키는 10~40 cm정도 자라고 꽃은 6월부터 8월에 걸쳐 가지 끝에 녹색으로 보일 듯 말 듯 피며, 열매는 10월에 납작하고 까맣게 익는다. 퉁퉁마디는 봄부터 여름까지 녹색을 띠다 가을이 되면 진한 빨간색으로 물든다.

우리나라에서 퉁퉁마디를 약초나 식품으로 이용했다는 기록은 없지만, 바닷가에 사는 사람들은 나물로 무쳐 먹기도 한다. 또 민간에서 봄철에 몸이 나른하고 밥맛이 없을 때 퉁퉁마디 나물을 먹으면 눈이 맑아지고 밥맛이 좋아진다는 얘기가 전해지며, 황해도 지방에서는 퉁퉁마디를 소화불량, 위장병, 간염, 신장병 등의 약으로 썼다고 한다. 유럽에서는 퉁퉁마디의 어린 줄기를 샐러드로 만들어 먹기도 하고, 일본에서는 퉁퉁마디가 천연기념물로 지정되어 있다.

최근 우리나라에서는 퉁퉁마디의 독특한 맛과 다양한 생리적 효능이 구전되어 전라남도 해남 등지에서 생나물 등의 재래적인 방법으로 식용화하고 있으며, 생체나 분말형태로 판매되고 있다. 특히 혈중 콜레스테롤 저하 효과, 혈중 총 지질함량과 중성지질함량의 감소효과 및 동맥경화, 고지혈증, 지방간 등의 예방효과, 체중증가억제 등의 효과가 있다고 보고(박시형 외, J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem., 47, 120~123, 2004)되고 있지만, 그 원인 물질에 대한 연구는 매우 미흡한 실정이다.

한편, 퉁퉁마디로부터 지금까지 단리ㅇ구명된 화합물들로 이소람네틴 3-오-베타-디-글루코피라노사이드 (isorhamnetin 3-O-β-D-glucopyranoside), 쿼시틴 3-오-베타-디-글루코피라노사이드 (quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside), 3-카페오일-4-디하이드로카페오일퀴닉에시드 (퉁퉁마딕 에시드) (3-caffeoyl-4- dihydrocaffeoyl quinic acid; tungtungmadic acid), 베타-시토스테롤 (β-sitosterol), 스티그마스테롤 (stigmasterol), 우라실(uracil)이 보고되어 있다. 이 중 이소람네틴 3-오-베타-디-글루코피라노사이드는 항산화 효과와 항당뇨 효과가 있다고 보고되었고, 쿼시틴 3-오-베타-디-글루코피라노사이드도 항산화 효과가 있다고 보고된 바 있으며, 3-카페오일-4-디하이드로카페오일퀴닉에시드(퉁퉁마딕 에시드)는 간경화 유발쥐를 통한 실험에서 간경화 개선효과가 있다고 보고(Y. C. Chung et al., J. Toxicol. Pub. Health, 22, 267-273, 2006)되었다.

또한 퉁퉁마디의 면역조절 기능, 항산화 효과, 혈청지질 개선효과, 기능성 화장품 소재로써의 응용가능성에 관한 내용 등 다양한 연구결과가 보고(이진태 외, Kor. J. Herbology, 17, 61-69, 2002; 김경란 외, J. Korean Soc. Food Sci. Nutr., 37, 170-176, 2008)되어진 바 있다. 그러나 아직 퉁퉁마디에 포함된 성분 연구는 충분치 못한 실정이다.

본 발명자들은 다양한 질병예방에 관여하는 것으로 알려진 항산화 화합물에 초점을 맞추어 퉁퉁마디에 함유된 물질들을 탐색하여 단리함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 항산화 활성 및 과산화물생성억제활성을 갖는 신규 화합물인 이소쿼시트린 6''-오-메칠옥살레이트 (isoquercitrin 6''-O-methyloxalate) 및 메칠 4-카페오일-3-디하이드로카페오일퀴네이트(살리코네이트) [methyl 4-caffeoyl-3- dihydrocaffeoyl quinate (salicornate)]를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 퉁퉁 마디에 다양한 항산화 물질들이 있음을 확인하고, 퉁퉁 마디로부터 항산화 활성 및 과산화물생성억제활성을 갖는 신규 화합물을 분리하고 구조를 확인할 수 있는 신규 항산화 화합물 분리방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 퉁퉁마디로부터 분리, 구조 결정된 신규 항산화 화합물을 유효성분으로 포함하여 항산화 활성 및 과산화물생성억제활성 중 하나 이상을 갖는 기능성 식품 및 약학조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하기 화학식 1을 갖는 이소쿼시트린 6''-오-메칠옥살레이트 (isoquercitrin 6''-O-methyloxalate)로 명명된 신규화합물을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 하기 화학식 2를 갖는 메칠 4-카페오일-3-디하이드로카페오일퀴네이트(살리코네이트) {methyl 4-caffeoyl-3-dihydrocaffeoyl quinate (salicornate)}로 명명된 신규화합물을 제공한다.

[화학식 2]

또한, 본 발명은 퉁퉁마디추출액을 얻는 단계; 상기 퉁퉁마디추출액을 감압농축하는 단계; 상기 농축물의 용매분획을 거쳐 부탄올분획물을 얻는 단계; 및 상기 부탄올분획물을 Amberlite XAD-2 컬럼 크로마토그라피 및 역상컬럼을 이용한 HPLC에 의해 정제하는 단계를 포함하는 퉁퉁마디 유래 제 1 항 또는 제 2 항의 신규화합물 분리방법을 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 퉁퉁마디추출액을 얻는 단계는 퉁퉁마디의 지상부를 세절한 후 메탄올을 가하고 균질화하여 추출된다.

또한, 본 발명은 이소쿼시트린 6''-오-메칠옥살레이트 또는 메칠 4-카페오일-3-디하이드로카페오일퀴네이트 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하여 항산화활성 및 과산화물생성억제활성 중 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 하는 기능성식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 이소쿼시트린 6''-오-메칠옥살레이트 또는 메칠 4-카페오일-3-디하이드로카페오일퀴네이트 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 항산화제용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 이소쿼시트린 6''-오-메칠옥살레이트 또는 메칠 4-카페오일-3-디하이드로카페오일퀴네이트 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 과산화물생성억제제용 약학조성물을 제공한다.

본 발명은 다음과 같은 우수한 효과를 갖는다.

먼저, 본 발명에 의하면 항산화 활성 및 과산화물생성억제활성을 갖는 신규 화합물인 이소쿼시트린 6''-오-메칠옥살레이트 (isoquercitrin 6''-O-methyloxalate) 및 메칠 4-카페오일-3-디하이드로카페오일퀴네이트(살리코네이트) [methyl 4-caffeoyl-3- dihydrocaffeoyl quinate (salicornate)]를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면 퉁퉁 마디에 다양한 항산화 물질들이 있음을 확인하고, 퉁퉁 마디로부터 항산화 활성 및 과산화물생성억제활성을 갖는 신규 화합물을 분리하고 구조를 확인할 수 있는 신규 항산화 화합물 분리방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면 퉁퉁마디로부터 분리, 구조 결정된 신규 항산화 화합물을 유효성분으로 포함하여 항산화 활성 및 과산화물생성억제활성 중 하나 이상을 갖는 기능성 식품 및 약학조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1 및 2에서 얻어지는 신규화합물 1 및 신규화합물 2의 분리, 정제 과정도,
도 2는 도 1의 분리, 정제과정 중에 얻어진 퉁퉁마디 추출물의 용매분획 후 각 획분들의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical-scavenging 활성평가그래프,
도 3은 신규화합물 1인 이소쿼시트린 6''-오-메칠옥살레이트(isoquercitrin 6''-O- methyloxalate)의 gHMBC 상관관계 (화살표) 및 구조도,
도 4는 신규화합물 2인 메칠 4-카페오일-3-디하이드로카페오일퀴네이트(살리코네이트; 화합물 2) [methyl 4-caffeoyl-3-dihydrocaffeoyl quinate (salicornate)]의 gHMBC 상관관계 (화살표) 및 구조도,
도 5는 퉁퉁마디로부터 분리한 신규화합물 1 및 2의 DPPH radical-scavenging 활성정도를 나타낸 그래프,
도 6은 퉁퉁마디로부터 분리한 신규화합물 1 및 2의 쥐 혈장의 과산화물 (cholesteryl ester hydroperoxide; CE-OOH) 생성억제효과를 나타낸 그래프.

본 발명에서 사용되는 용어는 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어를 선택하였으나, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있는데 이 경우에는 단순한 용어의 명칭이 아닌 발명의 상세한 설명 부분에 기재되거나 사용된 의미를 고려하여 그 의미가 파악되어야 할 것이다.

이하, 첨부한 도면 및 바람직한 실시예를 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.

그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.

본 발명의 기술적 특징은 퉁퉁마디에 다양한 항산화 물질들이 있음을 TLC-DPPH법(Takao T. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 1780-1783, 1994)에 의해 확인한 다음, 퉁퉁마디로부터 항산화활성 및 과산화물생성억제활성 중 하나 이상을 나타내는 2종의 신규 화합물을 분리하고 구조를 결정한 것이다.

본 발명에서 분리된 2종의 신규화합물은 각각 이소쿼시트린 6''-오-메칠옥살레이트 (isoquercitrin 6''-O-methyloxalate) 및 메칠 4-카페오일-3-디하이드로카페오일퀴네이트(살리코네이트) [methyl 4-caffeoyl-3- dihydrocaffeoyl quinate (salicornate)]로 명명되었다.

먼저, 본 발명의 신규화합물 중 이소쿼시트린 6''-오-메칠옥살레이트 (isoquercitrin 6''-O-methyloxalate)은 하기의 화학식 1을 갖는다.

[화학식 1]

또한, 본 발명의 신규화합물 중 메칠 4-카페오일-3-디하이드로카페오일퀴네이트(살리코네이트) [methyl 4-caffeoyl-3-dihydrocaffeoyl quinate (salicornate)]는 하기의 화학식 2를 갖는다.

[화학식 2]

구체적으로 후술하는 바와 같이 본 발명의 신규화합물들은 이들 화합물이 지니고 있는 카테콜(catechol) 골격으로부터 유래되는 것으로 예측되는 우수한 항산화활성 및/또는 과산화물생성억제활성을 갖는다.

실시예 1

1. 퉁퉁마디 추출 및 용매분획

퉁퉁마디(Salicornia herbacea L.)는 전남 영광군 염산면 야월리에서 2008년 6월 30일에 15~20 cm의 생초를 채취하여 준비하였고, 준비된 퉁퉁마디 지상부 8 kg을 세절하여 메탄올 16 L를 가하고 호모게나이져(BM-2 Nissei boi-mixer, Nehonseiki kaiseiki LTD., Japan)로 균질화하여 상온ㆍ암조건 하에서 18시간동안 추출하였다. 흡입 여과(No. 2, Whatman)를 행한 후 얻어진 잔사에 메탄올 10 L를 가하여 동일 방법으로 다시 추출ㆍ여과하였다. 얻어진 추출 여액은 아스피레이터(CCA-1110, Eyela, Tokyo, Japan)가 장착된 진공농축기(A-3S, Eyela, Tokyo, Japan)를 사용하여 39℃에서 감압 농축하였다. 얻어진 농축물(417.33 g)의 물 현탁액(3 L)을 헥산, 에칠아세테이트 및 수포화 부탄올로 각각 3 L씩 3회 반복하여 순차적으로 용매분획하였다.

2. 이소쿼시트린 6''-오-메칠옥살레이트로 명명된 화합물 1의 단리

도 1에 도시된 바와 같이 퉁퉁마디 메탄올 추출물을 용매분획하여 얻어진 부탄올층 33.94 g을 대상으로 Amberlite XAD-2 column chromatography를 행하였다. 시료는 농축 후, trifluoroacetic acid (TFA)로 pH 2.65로 조정한 H₂O로 용해하여 시료의 약 30배에 해당하는 XAD-2 (1 L, 521 μm, SUPELCO, USA)가 충진된 column (4.5 ㅧ 80 cm)에 charge하였다. TFA로 pH 2.65로 조정한 H₂O, 그리고 H₂O 중에 MeOH 함량이 20, 40, 60, 80, 100%의 용액(v/v)을 각각 1.8 L씩 용출시키고, 이어서 acetone을 2 L 용출시켰다. 얻어진 50개의 획분들은 TLC-DPPH 분석을 통하여 항산화 활성 화합물들의 분포 경향을 판단하여 그룹화한 후, 항산화 활성이 상대적으로 높고, 비교적 양이 많은 획분 BH (60% MeOH, 2.21 g)로부터 항산화물질을 단리하기 위하여 prep-ODS 컬럼[shim-pack-prep-ODS (H) Kit 20 ㅧ 250 mm]을 이용하여 TFA로 pH 2.65로 조정한 35% 메탄올 용액과 50% 메탄올 간에 그래디언트 (gradient, 55분) 용출법(10.0 ml/min)을 적용하여 HPLC를 행하였다. 그 결과, BH1~8까지 총 8개의 그룹을 얻을 수 있었으며, 그 중 항산화활성이 높은 BH5 (t _R 31.5 min, 16.8 mg)를 상기와 동일 조건으로 HPLC를 행하여, t _R 37.9 min의 피크를 갖는 단일화합물(화합물 1, 3.8 mg, 황색분말)을 단리하였고, 이소쿼시트린 6''-오-메칠옥살레이트로 명명하였다.

실시예 2

BH 획분을 HPLC로 분획한 다음, 획분 BH5 (신규화합물 1을 단리했던 획분) 이외의 항산화활성이 높은 또 다른 획분 BH6 (t _R 32.3 min, 22.4 mg)을 대상으로 한 것을 제외하면 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여, t _R 43.6 min의 피크를 갖는 단일화합물(화합물 2, 4.5 mg, 흰색분말)을 단리하였고, 메칠 4-카페오일-3-디하이드로카페오일퀴네이트(살리코네이트)로 명명하였다.

실험예 1

퉁퉁마디 추출물의 용매분획 후 각 획분의 TLC 분석 및 항산화 활성을 다음과 같은 실험을 수행하여 확인하였다.

먼저, 실시예 1의 용매분획에 의해 얻어진 각 획분을 대상으로 TLC-DPPH법을 이용하여 항산화 활성을 검정하였다. 즉 퉁퉁마디 메탄올 추출물, 헥산층, 에칠아세테이트층, 부탄올층 및 물층을 각각 동일 상당량(퉁퉁마디 신선중량 20 mg 상당량)의 농도로 조제하여 TLC 상에 스팟팅 (spotting) 후, 부탄올/초산/물 = 4:1:1 (v/v) 용매계를 이용하여 전개한 다음, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 에탄올 용액을 분무하여 흰색으로 탈색되어진 부분을 항산화 활성 양성으로 판정하는 방법(TLC-DPPH법; Takao T. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 1780-1783, 1994)을 이용하여 각 층에 함유된 항산화물질들의 존재 경향을 비교하였다.

그 결과 에칠아세테이트층, 헥산층, 부탄올층 및 물층 모두에서 다양한 항산화 화합물들의 스팟(spot)이 검출되었으며, 이에 각 획분별 다양한 농도의 시료와 일정농도(250 μM, 최종농도)의 DPPH radical을 반응시켜 상대적인 radical-scavenging 활성 정도(SC₅₀)를 비교ㆍ검토하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 도시된 바와 같이 에칠아세테이트층 및 부탄올층의 활성이 가장 높게 나타났다. 물층은 매우 낮은 활성을 보였으며, 헥산층은 517 nm의 광을 흡수하는 화합물이 (다량) 함유되어 있어 시료의 첨가량이 증가할수록 활성이 감소되는 결과를 보여 상대적인 항산화 활성 평가를 위해서는 다른 평가법이 적용되어야 할 것으로 판단되었다.

한편, 에칠아세테이트층은 가장 높은 항산화 활성을 보였으나 너무 다양한 활성 화합물들의 존재 경향으로 인해 정제ㆍ단리 과정의 어려움과 시간적 소요가 많을 것으로 판단되었다. 그러나 부탄올층은 에칠아세테이트층에는 다소 못 미치나 그에 필적할만한 항산화 활성을 보이면서 비교적 항산화화합물들의 존재경향이 단순한 것으로 판단되었다. 그 결과 부탄올층이 항산화 화합물의 정제ㆍ단리를 행하기에 적합한 것을 알 수 있다.

실험예 2

화합물 1의 구조해석

화합물 1의 HR-ESI-MS (postive) spectrum으로부터 분자량 피크인 m/z 573.0855 [M + Na]⁺가 관찰되었고, 이 화합물의 분자식이 C₂₄H₂₂O₁₅ (m/z 550) 임이 제시되었다. 그리고 ¹H-NMR (600 MHz, CD₃OD) 스펙트럼으로부터 플라보노이드인 쿼서틴에 귀속되어지는 5종의 sp ² carbon proton siganls [δ 6.21 (1H, br. s, H-6), 6.41 (1H, br. s, H-8), 7.62 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-2′), 6.75 (1H, d, J = 8.7 Hz, H-5′) 및 7.58 (1H, dd, J = 8.7, 2.4 Hz, H-6′)]와 1종의 글루코스에 귀속되어지는 7종의 sp ³ carbon proton signals [δ 5.17 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-1″), 3.38~3.47 (4H, m, H-2″~5″), 4.26 (1H, dd, J = 12.0, 1.8 Hz, H-6a″) 및 4.11 (1H, dd, J = 12.0, 5.4 Hz, H-6b″)]가 관찰되었으며, 1종의 methoxyl proton signal이 δ 3.68 (3H, s)에서 관찰되었다.

¹³C-NMR로부터 총 24종의 carbon signals가 관찰되었으며, 그 중에는 15종의 어글리콘(aglycone) carbon signals [carbonyl carbon signal {δ 179.6 (C-4)}, 14 sp ² carbon signals (δ 166.2-94.9)], 6종의 당 (monosaccharide) 유래 carbon signals [anomer carbon signal (δ 104.4), 5 non-anomer carbon signals (δ 78.0-65.2)] 및 2종의 carbonyl carbon signals [δ 168.1 (C-1'''), δ 168.9 (C-2''')]와 1종의 methoxyl carbon signal [δ 52.9 (-OCH₃)]이 각각 관찰되었다.

이에 보다 정확한 구조해석을 위해 gHSQC, gHMBC 등의 2D-NMR 분석을 행하였다. 그 결과, gHMBC에서 δ 4.26 (H-6″a) proton으로부터 methyloxalate의 δ 168.1 (C-1''')과의 에스테르 (ester) 결합을 형성하고 있음을 나타내는 상관관계 및 δ 3.68 (-OCH₃) proton signal로부터 methyloxalate의 탄소 signal (δ 168.9, C-2''') 간에 상관관계가 각각 관찰되어 그들의 결합양식이 확인되었다.

본 기기분석 결과들이 도시된 하기 표 1로부터 화합물 1은 이소쿼시트린 6''-오-메칠옥살레이트(isoquercitrin 6''-O-methyloxalate)로 결정되었으며, 신규화합물로 판명되었다.

표 1은 이소쿼시트린 6''-오-메칠옥살레이트(isoquercitrin 6''-O- methyloxalate; 화합물 1)의 ¹H- (600 MHz) 및 ¹³C-NMR (150 MHz) 자료 (CD₃OD, TMS)이다.

또한, 이소쿼시트린 6''-오-메칠옥살레이트(isoquercitrin 6''-O- methyloxalate)의 gHMBC 상관관계 (화살표) 및 구조는 도 3에 도시된 바와 같다.

Carbon	δ_H(int, mult., J in Hz)	δ_C
2	-	159.6
3	-	135.5
4	-	179.6
5	-	163.2
6	6.21 (1H, s)	100.1
7	-	166.2
8	6.41 (1H, s)	94.9
9	-	158.7
10	-	105.8
1′	-	123.3
2ㅄ	7.62 (1H, d, 2.4)	117.6
3ㅄ	-	146.1
4ㅄ	-	149.9
5ㅄ	6.75 (1H, d, 8.7)	116.1
6ㅄ	7.58 (1H, dd, 2.4, 8.7)	123.5
1˝	5.17 (1H, d, 7.8)	104.4
2˝	3.47 (1H, d, 6.5, 8.0)	75.8
3˝	3.42 (1H, d, 7.0, 8.0)	78.0
4˝	3.30 (1H, d, 7.5, 8.0)	71.3
5˝	3.38 (1H, m)	75.6
6a˝	4.26 (1H, dd, 1.8, 12.0)	65.2
6b˝	4.11 (1H, dd, 5.4, 12.0)	65.2
1??	-	168.1
2??	-	168.9
-OCH₃	3.68 (3H, s)	52.9

실험예 3

화합물 2의 구조해석

화합물 2는 흰색의 분말형태로 HR-ESI-MS (negative) 분석에서 분자량 피크인 m/z 531.1508 [M - H]⁺이 관찰되었고, 또한 이 화합물의 분자식이 C₂₆H₂₈O₁₂ (m/z 532)로 나타났다. ¹H-NMR (600 MHz, CD₃OD) 스펙트럼으로부터 1종의 methoxyl group signal (δ 3.74, 3H, s), 9종의 sp ³ carbon proton signals [δ 2.15 (1H, m, H-2a), 2.08 (1H, m, H-2b), 5.49 (1H, m, H-3), 5.01 (1H, dd, J = 8.7, 3.3 Hz, H-4), 4.27 (1H, m, H-5), 2.24 (1H, m, H-6a), 2.07 (1H, m, H-6b), 2.71 (2H, J = 7.2, 7.5, 7.8 Hz, t, H-7ㅄ) 및 2.49 (2H, m, H-8ㅄ)], 8종의 sp ² carbon proton signals [δ 6.59 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2ㅄ), 6.62 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5ㅄ), 6.65 (1H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz, H-6ㅄ), 7.05 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-2˝), 6.78 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5˝), 6.96 (1H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz, H-6˝), 7.60 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-7˝) 및 6.29 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-8˝)]가 관찰되었다. 이 데이터로부터 2종의 3치환체 벤젠환, 트랜스형태의 올레피닉 (olefinic) double bond, -CH₂-CH₂- 부분구조 및 퀴닉산(quinic acid)의 존재가 각각 시사되었다.

그리고 ¹³C-NMR로부터 총 26종의 carbon signals가 관찰되었으며, 그 중에는 3종의 carboxylic carbon signals [δ 175.3 (C-7), 173.8 (C-9ㅄ) 및 168.5 (C-9˝)], 1종의 methoxyl carbon signal [δ 53.2 (-OCH₃)], 4종의 methylene carbon signals [δ 39.1 (C-2), 38.4 (C-6), 31.5 (C-7ㅄ), 37.5 (C-8ㅄ)], 3종의 methine carbon signals [δ 69.1 (C-3), 75.4 (C-4), 69.0 (C-5)], 8종의 double bond carbon signals [δ 116.5 (C-2ㅄ), 116.5 (C-5ㅄ), 120.6 (C-6ㅄ), 115.3 (C-2˝), 116.6 (C-5˝), 123.3 (C-6˝), 147.8 (C-7˝), 114.8 (C-8˝)], 그리고 7종의 4차 carbon signals [δ 76.2 (C-1), 133.4 (C-1′), 146.3 (C-3ㅄ), 144.8 (C-4ㅄ), 127.8 (C-1˝), 146.9 (C-3˝), 149.9 (C-4˝)]가 존재하였다.

이상의 데이터들을 종합해보면 퀴닉산(quinic acid)에 카페익산 (caffeic acid), 디하이드로카페익산 (dihydrocaffeic acid), 그리고 메칠기가 에스테르 (ester) 결합되어 있을 것으로 생각되었다. 이에 보다 정확한 구조해석을 위해 gHSQC, gCOSY, gHMBC 등의 2D-NMR 분석을 행하였다. 그 결과, gHMBC 스펙트럼에 있어 δ 3.74 (-OCH₃) proton으로부터 퀴닉산(quinic acid)의 C-7 (δ 175.3)과, δ 5.49 (H-3) proton으로부터 디하이드로퀴닉산(dihydrocaffeic acid)의 C-9′ (δ 173.8)와, 그리고 δ 5.01 (H-4) proton으로부터 카페익산(caffeic acid)의 C-9″ (δ 173.8)와의 상관관계가 각각 관찰되었다. 이 결과로부터 이 화합물 퀴닉산(quinic acid)의 7위에 메칠기, 3위에 디하이드로퀴닉산 (dihydrocaffeic acid) 및 4위에 카페익산(caffeic acid)이 각각 에스테르 (ester) 결합되어 있음을 확인하였다.

표 2에 나타낸 본 기기분석 결과들로부터 화합물 2는 메칠 4-카페오일-3-디하이드로카페오일퀴네이트(살리코네이트) [methyl 4-caffeoyl-3-dihydrocaffeoyl quinate (salicornate)]로 결정되었고 신규화합물로 판명되었다.

표 2는 메칠 4-카페오일-3-디하이드로카페오일퀴네이트(살리코네이트; 화합물 2) [methyl 4-caffeoyl-3-dihydrocaffeoyl quinate (salicornate)]의 ¹H- (600 MHz) 및 ¹³C-NMR (150 MHz) 자료 (CD₃OD, TMS)이다.

또한, 메칠 4-카페오일-3-디하이드로카페오일퀴네이트(살리코네이트; 화합물 2) [methyl 4-caffeoyl-3-dihydrocaffeoyl quinate (salicornate)]의 gHMBC 상관관계 (화살표) 및 구조는 도 4에 도시된 바와 같다.

Carbon	δ_H(int, mult., J in Hz)	δ_C
1	-	76.2
2a	2.15 (1H, m)	39.1
2b	2.08 (1H, m)	39.1
3	5.49 (1H, m)	69.1
4	5.01 (1H, dd, 3.3, 8.7)	75.4
5	4.27 (1H, m)	69.0
6a	2.24 (1H, m)	38.4
6b	2.07 (1H, m)	38.4
7	-	175.3
1′	-	133.4
2ㅄ	6.59 (1H, d, 1.8)	116.5
3ㅄ	-	146.3
4ㅄ	-	144.8
5ㅄ	6.62 (1H, d, 7.8)	116.5
6ㅄ	6.65 (1H, dd, 2.1, 8.1)	120.6
7ㅄ	2.71 (2H, t, 7.2, 7.5, 7.8)	31.5
8ㅄ	2.49 (2H, m)	37.5
9ㅄ	-	173.8
1˝	-	127.8
2˝	7.05 (1H, d, 1.8)	115.3
3˝	-	146.9
4˝	-	149.9
5˝	6.78 (1H, d, 8.4)	116.6
6˝	6.96 (1H, dd, 1.8, 8.4)	123.3
7˝	7.60 (1H, d, 15.6)	147.8
8˝	6.29 (1H, d, 15.6)	114.8
9˝	-	168.5
-OCH₃	3.74 (3H, s)	53.2

실험예 4

DPPH radical-scavenging 활성실험

실시예 1 및 실시예 2에서 얻어진 퉁퉁마디에서 단리한 화합물 1과 2의 최종농도는 10 μM이 되도록하고, 1,1-디페닐-2-피크릴하이드라질 (DPPH, Wako, Japan) 에탄올 용액(50 μL)의 최종농도는 250 μM이 되도록 설정하여 최종 부피가 200 μL가 되도록 용액을 조제하였다. 혼합용액은 실온의 암소에서 20분간 반응시킨 후, 517 nm (Versa max microplate reader, Molecular Devices, USA)에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 5에 도시하였다. 대조구로 클로로제닉에시드(chlorogenic acid)를 이용하였다. 제시된 값은 3회 반복 실험하여 얻어진 결과의 표준편차이다. 도 5에서 1은 화합물 1을 2는 화합물 2를 CA는 클로로제닉에시드 (chlorogenic acid)를 나타내며, a, b는 서로 다른 문자로 표시된 군 간에 유의차(p < 0.05)가 인정됨을 의미한다.

활성 평가 결과, 화합물 2는 화합물 1보다 낮은 경향의 활성을 보였으나 유의차는 관찰되지 않았다. 그리고 화합물 1과 2는 대조구로 이용한 클로로제닉에시드보다 유의하게 높은 활성을 보였음을 알 수 있었다.

실험예 5

쥐 혈장의 콜레스테릴 에스테르 하이드로퍼옥사이드 [Cholesteryl Ester Hydroperoxide (CE-OOH)] 생성 억제능 실험

1) 실험동물 및 혈장의 분리

실험에 사용된 쥐는 6주령의 스프라그-돌리(Sprague-Dawley)계, 180~200 g body wt.로 수컷만을 구입(샘타코, 경기도 오산시)하여 플라스틱 케이지에서 3일 동안 사육하였다. 생육조건은 20ㅁ2℃, 습도는 50~60%, 12시간 간격으로 light-dark cycle을 유지하였으며, 식이와 물은 자유롭게 섭취할 수 있도록 하여 실험실 환경에 순화시켰다. 실험 15시간 전에 절식, 3시간 전에 절수시킨 후, 에테르 마취 하에서 개복한 다음, 대동맥으로부터 헤파린이 첨가된 주사기로 채혈하여 원심분리(3000 rpm, 4℃, 20분, VS-15 CFN, VISION, KOREA)를 행하였고, 얻어진 상층(혈장, plasma)을 취하여 사용 직전까지 -40℃에서 냉동 저장하였다.

2) 쥐 혈장의 산화 및 과산화물 (CE-OOH) 분석

쥐 혈장 250 μL에 PBS 완충용액 (pH 7.4) 640 μL를 가하고, 실시예 1 및 실시예 2에서 얻어진 화합물 1, 화합물 2를 각각 10 nmol (final concentration 10 μM)을 PBS 버퍼에 용해하여 첨가한 다음, 동이온(CuSO₄)이 최종적으로 100 μM이 되도록 PBS 버퍼 용액으로 조제하여 100 μL를 첨가함으로써 산화를 개시하였다. 혼합 용액은 37℃에서 7시간 shaking incubation시킨 후, 100 μL를 취하여 2.5 mM BHT를 함유한 메탄올과 n-헥산을 각각 3 mL씩 가하여 vortex로 혼합하였다. 상층액을 농축용기에 취한 후, 하층 용액에 다시 n-헥산 3 mL를 가하고 재차 vortex로 혼합하였다. 그 상층액을 취하여 전단계의 n-헥산층과 혼합하여 농축한 다음, 얻어진 농축물을 메탄올/트리클로로메탄 (95:5, v/v) 용액 100 μL로 녹여 시료중의 CE-OOH 농도를 티에스케이겔 ODS 컬럼(TSKgel ODS-80Ts column, 4.6 ㅧ 250 mm, Tosoh, Japan)을 이용하여 97% 메탄올을 이동상으로 유속 1.0 mL/min (model 510 solvent delivery system, Waters, USA)로 UV detector (280 nm, SPD 10A, SHIMADZU, Japan)를 이용한 조건에서 HPLC를 행하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 본 실험 역시 대조구로 클로로제닉에시드(chlorogenic acid)를 이용하였다. 도 6에서 C는 항산화제 무첨가군을, 1은 화합물 1을, 2는 화합물 2를, CA는 클로로제닉에시드 (chlorogenic acid) 첨가군을 나타낸다.

도 6에 그 활성평가 결과를 제시하였듯이 화합물 1과 2 간에는 활성에 큰 차이를 보이지 않았으며, 쥐 혈장 용액에 항산화 화합물을 외부로부터 첨가하지 않은 항산화 무첨가구(C)와 클로로제닉에시드를 첨가한 구(CA)를 비교하였을 때, 5배 이상의 CE-OOH 생성 억제 효과가 관찰되었다. 즉, 화합물 2는 화합물 1보다 낮은 경향의 활성을 보였으나 유의차는 관찰되지 않았고, 화합물 1과 2는 대조구로 이용한 클로로제닉에시드보다 유의하게 높은 활성을 보였음을 알 수 있었다.

이러한 실험결과들로부터 화합물 1과 2는 용액 중에서의 radical scavenging은 물론, 동이온에 의해 유도되어지는 혈장의 과산화물 생성 억제 효과 또한 발휘함을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 화합물 1 (이소쿼시트린 6''-오-메칠옥살레이트) 및 화합물 2 (메칠 4-카페오일-3-디하이드로카페오일퀴네이트)가 항산화활성 및/또는 과산화물생성억제활성을 갖는 이상, 본 발명의 화합물 1 또는 화합물 2 중 어느 하나 이상을 포함하여 식품을 제조하게 되면 항산화활성 및/또는 과산화물생성억제활성을 갖는 기능성 식품을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물 1 (이소쿼시트린 6''-오-메칠옥살레이트) 및 화합물 2 (메칠 4-카페오일-3-디하이드로카페오일퀴네이트) 또는 그의 무독성염과 제약상 또는 수의학상 허용가능한 액체 또는 고체 담체를 포함하는 약학조성물을 제공할 수 있다. 여기서, 상기 약학조성물은 항산화제 또는 과산화물생성억제제의 용도로 사용될 수 있으며 제약상 또는 수의학상 허용가능한 액체 또는 고체 담체는 제한되지 않고 공지된 것을 모두 사용할 수 있으므로 상세한 설명은 생략하기로 한다.

본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며, 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

Claims

하기 화학식 1을 갖는 이소쿼시트린 6''-오-메칠옥살레이트 (isoquercitrin 6''-O-methyloxalate)로 명명된 신규화합물.
[화학식 1]
하기 화학식 2를 갖는 메칠 4-카페오일-3-디하이드로카페오일퀴네이트(살리코네이트) {methyl 4-caffeoyl-3-dihydrocaffeoyl quinate (salicornate)}로 명명된 신규화합물.
[화학식 2]
퉁퉁마디추출액을 얻는 단계;
상기 퉁퉁마디추출액을 감압농축하는 단계;
상기 농축물의 용매분획을 거쳐 부탄올분획물을 얻는 단계; 및
상기 부탄올분획물을 Amberlite XAD-2 컬럼 크로마토그라피 및 역상컬럼을 이용한 HPLC에 의해 정제하는 단계를 포함하는 퉁퉁마디 유래 제 1 항 또는 제 2 항의 신규화합물 분리방법.
제 3 항에 있어서,
상기 퉁퉁마디추출액을 얻는 단계는 퉁퉁마디의 지상부를 세절한 후 메탄올을 가하고 균질화하여 추출되는 것을 특징으로 하는 신규화합물 분리방법.
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