KR101717698B1

KR101717698B1 - 붉가시나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101717698B1
Application number: KR1020160093727A
Authority: KR
Inventors: 오득실; 박화식; 정성태; 서민재; 조승식; 윤인수; 박대훈; 배민석
Original assignee: 전라남도
Priority date: 2016-07-22
Filing date: 2016-07-22
Publication date: 2017-03-28

Abstract

본 발명은 붉가시나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 동물실험으로 혈중요산의 저하 효과를 나타내는 붉가시나무 추출물을 이용한 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 붉가시나무 추출물은 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애 예방 및 치료용 기능성 식품, 약제학적 조성물 등에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

붉가시나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애 예방 및 치료용 조성물{Composition comprising extract of Quercus acuta for prevention and treatment of hyperuricemia and metabolic disorders associated with hyperuricemia}

본 발명은 붉가시나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

고요산혈증(Hyperuricemia)이란 혈액 내에 요산의 농도가 비정상적으로 증가되어 있는 것을 말한다. 이는 혈청에서 모노소디움 요산염의 농도가 제한된 용해도의 한계를 넘을 때 발생한다. 37℃에서 혈장의 요산 포화도는 약 7mg/dL이며, 이 농도를 넘으면 물리화학적으로 과포화 상태가 된다. 혈청 요산 농도는 정상인의 평균 혈청 요산 농도보다 +2 표준편차를 초과한 경우에 상대적으로 높은 것으로 알려져 있으며, 대부분의 역학 조사에서 남성의 상위 한계는 6.8 내지 7.0mg/dL, 여성은 6.0mg/dL이다. 이러한 이유 때문에 고요산혈증의 실질적인 상위 한계 수준은 7.0mg/dL 이상인 경우로 정의되고 있다.

고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애들은 미국에서 3백만 명 내지 5백만 명에게서 발생하고 있으며, 아프리카계 미국인은 백인보다 고요산혈증 관련 대사 장애를 가질 가능성이 2배이다. 또한, 고요산혈증은 중국, 일본, 폴리네시아 및 도시 사하라 이남 아프리카에서 만연하고 있다.

고요산혈증을 위한 치료제는, 1) 크산틴 옥시다제 억제제(알로퓨리놀, 페북소스타트), 2) 요산 배설 촉진제(설핀피라존, 벤즈브로마론, 프로베네시드), 3) 요산염 옥시다제(페글로티카제, 푸리카제, 라스부리카제, 페길화 우리카제), 4) 요산염 저하제(페노피브레이트) 등이 있으며, 고요산혈증 관련 대사 장애를 위한 치료제는, 1) 비스테로이드성 항염증 약물(NSAID; 인도메타신, 이부프로펜), 2) 코르티코스테로이드, 3) 항염증제(콜히친) 등이 있다. 이러한 치료제들은 혈중 요산 농도를 저하시키는 기능을 하며, 치료제를 이용하여 혈중 요산 수준을 정상 범위로 회복시키면, 고요산혈증과 관련한 기타 대사 장애들을 예방할 수 있다.

그러나, 고요산혈증 또는 고요산혈증 관련 대사 장애에 이용하고 있는 치료제들 중의 다수는 여러 가지 부작용들이 알려져 있다. 예를 들면, 알로퓨리놀과 같은 크산틴 옥시다제 억제제는 과민성 맥관염, 스티븐스-존슨 증후군, 탈락성 피부염, 재생불량성 빈혈 및 간 기능부전과 관련이 있다. 프로베네시드 및 벤즈브로마론과 같은 요산 배설 촉진제는 위장 장애, 요로 결석증 및 특이체질 환자에서의 전격성 간부전과 같은 부작용이 있다. 또한, 비스테로이드성 항염증 약물(NSAID)의 장기적 사용은 궤양성 천공 및 상부 위장관 출혈을 포함하는 부작용을 초래할 수 있다.

따라서, 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애 예방 및 치료를 위한 신규한 제제들의 개발이 여전히 요구되어지고 있으며, 그 중 천연물을 이용한 연구들이 진행되고 있다. 대한민국 공개특허 제10-2015-0135037호에는 고요산혈증 또는 통풍에 유효한 섬쑥부쟁이 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리된 활성화합물이 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 제10-2010-0117979호에는 흑양파 추출물을 유효성분으로 포함하는 통풍 또는 고요산혈증 예방 및 치료용 조성물이 개시되어 있다.

이에 본 발명자는 혈중 요산 농도를 저하시키는 효능을 가지는 천연 치료제를 개발하고자 연구하던 중 붉가시나무(Quercus acuta)가 혈중 요산 농도를 저하시키는 탁월한 효능을 가지고 있음을 알게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 붉가시나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애 예방 및 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 붉가시나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애 예방 및 개선용 기능성 식품 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 붉가시나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

하나의 양태로서, 본 발명은 붉가시나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용하는 식물로서 붉가시나무(Quercus acuta)는 참나무과에 속하고, 가새나무, 가랑닢(전라도), 가시낭, 북가시낭, 홍가시낭, 버레낭(제주도)으로 불린다. 양지바른 산기슭과 계곡에서 자라며 높이 20m, 지름 60cm에 달한다. 줄기는 곧게 자라며 많은 가지와 무성한 잎이 있어 장대한 수형을 이룬다. 온대성의 상록활엽수로서 한국과 일본의 온대 공통종이다. 붉가시나무는 제주도를 비롯한 남부 제도와 남부 해안 산지의 온대림을 형성하던 주요수목이다. 붉가시나무라는 이름은 목재의 색깔이 붉은데서 비롯되었으며, 목재가 무겁고 잘 쪼개지지 않을 뿐 아니라 보존성이 좋고 잎의 질감이 어느 것보다 좋아서 건축재, 가구재, 기구재(특히 대패의 재료)로 쓰이고 있다. 가을에는 도토리(acorn) 열매가 열리고 이 열매는 사람이 먹을 수 있으며, 탄닌 성분이 수렴작용을 하고 설사를 멈추게 하는 작용을 하며, 이질, 대장염, 설사, 젖앓이, 잇몸염, 입안염에 약효가 있다.

본 발명에 있어서, 상기 붉가시나무 추출물은 붉가시나무의 잎, 줄기, 꽃, 뿌리 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 통상의 방법에 의하여 추출한 추출물을 말한다. 바람직하게는 붉가시나무 잎의 추출물을 말한다. 또한, 상기 추출물은 통상의 방법에 의하여 붉가시나무로부터 추출한 추출액뿐만 아니라 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 말한다.

상기 붉가시나무 추출물은 물 또는 유기 용매를 사용하여 추출할 수 있는데, 추출한 액은 액체 형태로 사용하거나 또는 농출 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 상기 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매이며, 추출물의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 특히 에틸아세테이트를 용매로 사용한 추출물의 경우 다른 용매를 사용하여 추출한 추출물보다 유효 성분의 함량이 높아 잔틴 산화효소 억제 효과, DPPH free radical 소거 활성 효과, 환원력이 우수하다는 장점이 있다. 추출하는 유기 용매에 따라 추출물의 유효 성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기 용매를 선택하여 사용하도록 한다. 추출 방법은 제한되지 않고, 예를 들어, 냉침추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다.

본 발명의 붉가시나무 추출물은 추출, 분획, 또는 정제(분리, 분획)의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획, 정제물, 그들의 희석액, 농축액, 또는 건조물일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

하나의 구체적 실시에서, 상기 방법으로 추출한 붉가시나무 추출물은 ICR 마우스에서 혈중 요산 저하 및 잔틴 산화효소 활성 감소 효과를 나타내었다.

따라서, 본 발명의 붉가시나무 추출물은 혈중 요산 저하 효과가 뛰어나며, 잔틴 산화효소 활성을 감소시키므로, 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애 예방 및 치료용 조성물로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

한편, 본 발명의 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애 예방 및 치료용 조성물은 그 유효성분인 붉가시나무 추출물을 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애 개선 활성을 나타낼 수 있는 한 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량% 내지 70 중량% 범위 내에서 결정될 수 있다. 여기서 "유효량"이란 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애의 예방, 개선, 치료, 또는 그 증상의 발현 지연을 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다. 바람직하게는 0.01 중량% 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 30 중량%의 함량으로 포함될 수 있다. 상기 붉가시나무 추출물의 함량이 0.001 중량% 미만일 경우 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애 개선 효과가 미약하고, 70 중량%를 초과하는 경우 함량 증가에 따른 효과 증가가 비례적이지 않아 비효율적일 수 있으며, 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제가 있다.

본 발명에 있어서, 상기 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애는 요산이 정상 수치보다 많아져서 신장이 요산을 배설시키는 능력이 저하될 경우 혈액 중에 여분의 요산이 남아있게 되고 혈중요산치가 높아져 발생되는 질환이나 질병을 말한다.

상기 고요산혈증 관련 대사 장애에는 통풍, 요산 결정, 관절내 요산염 결정의 침착, 요산염 결정의 침착으로 인한 급성 관절성 관절염, 단일 관절성 관절염, 염증성 관절염의 통증 발작, 요로 결석증, 신결석증 및 통풍성 신병증이 포함된다. 장기적인 신결석증 및 통풍성 신병증은 신장 손상 및 신부전의 위험을 증가시키는 것으로 알려져 있다.

상기 통풍은 통상적으로 급성 염증성 관절염의 재발성 발작을 특징으로 하는 의학적 상태이며, 엄지 발가락 기저부의 중족-지골 관절에서 흔하게 발생한다. 또한, 통풍은 관절, 힘줄 및 주변 조직들 내에서 결정화되고 침착되는 혈중 요산에 의해 유발되며, 통풍 결절, 신장 결석 또는 요산염 신병증으로서 존재할 수도 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 개체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 개체에서 (a) 질환 또는 질병의 발전의 억제 (b) 질환 또는 질병의 경감 및 (c) 질환 또는 질병의 제거를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "개체"는 본 발명의 상기 조성물을 투여하여 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 개, 고양이, 랫트, 마우스, 침팬지 등의 포유동물을 의미한다.

본 발명은 붉가시나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애 예방 및 개선용 기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 붉가시나무 추출물이 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애 예방 및 개선용 기능성 식품 조성물의 유효성분으로 사용되는 경우, 유효성분으로서 붉가시나무 추출물 이외에 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 식품보조 첨가제, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)] 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 본 발명의 붉가시나무 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 가공육류, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강 기능성 식품을 모두 포함한다.

본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분인 붉가시나무 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 상술한 성분 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일쥬스, 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명은 붉가시나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 붉가시나무 추출물이 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애 예방 및 개선용 약제학적 조성물의 유효성분으로 사용되는 경우, 유효성분으로서 붉가시나무 추출물 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물(예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름(예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적으로 허용되는 담체는 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

상기 약제학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애를 예방 및 치료할 수 있는데, 치료방법은 상기 약제학적 조성물을 약제학적 유효량으로 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물 내에 다양한 경로로 투여하는 것을 포함한다. 상기 투여방법은 모든 방식으로 이루어질 수 있는데, 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥 내 주입, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 또는 피하 투여 등으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태 등의 요인에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 다만, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명의 상술한 붉가시나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애 예방 및 치료용 조성물을 개체에 투여하여 고요산혈증 및/또는 고요산혈증 관련 대사 장애를 치료, 예방, 또는 개선하는 방법을 제공한다.

상기 개체는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 개, 고양이, 랫트, 마우스, 침팬지 등의 포유동물을 의미하며, 상기 방법에 의하여 상기 개체의 혈액 내에 비정상적으로 증가된 요산 수치를 정상 범위로 회복 시키는 효과가 있어, 고요산혈증 및/또는 고요산혈증 관련 대사 장애를 치료, 예방, 또는 개선할 수 있다.

본 발명에 따른 붉가시나무 추출물은 혈중 요산의 농도를 저하시키는데 탁월한 효과를 나타낸다.

따라서 본 발명에 따른 붉가시나무 추출물은 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애 예방 및 치료를 위한 약제학적 조성물, 기능성 식품 조성물 등의 제조를 위한 활성성분으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 붉가시나무 추출물의 농도별 잔틴 산화효소 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 정상 대조군(Normal control), 고요산혈증 대조군(Model control, HU), 알로퓨리놀 투여군(Positive control, HU+ALP), 붉가시나무 잎 추출물 투여군(HU+QA50, HU+QA250)의 혈중 요산 농도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 정상 대조군(Normal control), 고요산혈증 대조군(Model control, HU), 알로퓨리놀 투여군(Positive control, HU+ALP), 붉가시나무 잎 추출물 투여군(HU+QA50, HU+QA250)의 간에서의 잔틴 산화효소 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 정상 대조군(Normal control), 고요산혈증 대조군(Model control, HU), 알로퓨리놀 투여군(Positive control, HU+ALP), 붉가시나무 잎 추출물 투여군(HU+QA50, HU+QA250)의 혈중 잔틴 산화효소 활성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 붉가시나무 추출물의 활성 성분을 분석한 GC-MS 크로마토그램을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 붉가시나무 추출물의 활성 성분을 분석한 HPLC 크로마토그램을 나타낸 그래프이다.

이하, 제조예 및 실험예 등을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 제조예 및 실험예 등은 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 제조예 및 실험예 등에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

모든 데이터는 평균±표준 편차로 표현하였고, 반올림하여 나타내었다. 두 평균 사이의 차이는 t-테스트를 수행하였고, 세 개 이상의 평균 사이의 차이는 사후 검증 (Tukey's multiple range test) 변화량 분석을 수행하였으며, p-value<0.05 수준에서 유의차를 검정하였다.

제조예 1: 붉가시나무 잎 추출물( QALE )의 제조

대한민국 전라남도 완도 수목원의 붉가시나무(Quercus acuta, QA) 잎을 채집하여 건조한 다음 마쇄기로 분쇄하여 미세분말을 준비하였다. 붉가시나무 잎의 채집 표본 (MNUCSS-QA-01)은 대한민국 무안의 목포 국립 대학교에 보관하였다.

분쇄한 붉가시나무의 잎 분말 10g을 상온에서 3일 동안 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 100mL로 두 번 추출하였다. 그 다음, 추출물을 농축하고 건조하여 -50℃에 저장하여 사용하였다.

실험예 1: 붉가시나무 잎 추출물(QALE)의 항산화 활성 측정

1-1. DPPH 라디칼(radical) 소거 활성 분석

붉가시나무 잎 추출물(QALE)의 항산화 효능은 517nm에서 항산화 화합물에 의해 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) radical의 양이 줄어들어 최대 흡광도(A)가 사라지는 DPPH radical 소거 활성 분석을 통해 측정하였다. 흡광도(A)는 microplate reader(Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)를 이용해 측정하였으며, DPPH radical 소거 활성(%)은 하기 수학식 1을 이용하여 계산하였다.

[수학식 1]

DPPH radical 소거 활성(%)=[1-(A_sample/A_blank)] x 100

구체적으로, 붉가시나무 잎 추출물(QALE) 1mL에 0.4mM의 DPPH 1mL를 넣고 혼합하여 어두운 상온에서 10분 동안 반응시킨 후, 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었으며, 붉가시나무 잎 추출물의 DPPH free radical 소거 활성의 IC₅₀ 농도는 10.6±0.5μg/mL의 비교적 낮은 값으로 나타났다.

1-2. 라디칼(radical) 환원력 분석

붉가시나무 잎 추출물(QALE)의 radical 환원력은 문헌 [Kim, Y. H. (2015), "The antioxidant activity and their major antioxidant compounds from Acanthopanax senticosus and A. koreanum." Molecules, 20: 13281-13295]에 개시된 방법을 수정한 환원력 분석 방법을 통해 계산하였다.

구체적으로, 붉가시나무 잎 추출액 0.1mL, 0.2M 인산나트륨완충용액(sodium phosphate) 0.5mL 및 1% 포타슘 페리시아나이드(potassium ferricyanide) 0.5mL를 혼합하고, 50℃에서 20분 동안 반응하였다. 그 다음, 10% 삼염화아세트산(trichloroacetic acid) 수용액 0.5mL를 반응 혼합물에 첨가하고, 12,000rpm에서 10분 동안 원심 분리하였다. 그 다음, 원심 분리하여 얻은 상등액과 증류수 0.5mL 및 0.1% 염화 제3철(iron(III) chloride) 수용액 0.1mL를 혼합하고, 700nm에서 흡광도를 측정하였다. radical 환원력 분석 실험의 양성 대조군으로 비타민 C(Ascorbic acid)를 사용하였으며, Fe³⁺에서 Fe²⁺로의 환원력은 비타민 C(Ascorbic acid) eq. μg/50 μg ext.로 나타내었다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었으며, 50μg 붉가시나무 추출물(QALE)의 환원력은 36.3±3.5μg의 높은 값으로 나타났다.

Parameter	QALE	Ascorbic acid
DPPH IC₅₀ (μg/mL)	10.6 ± 0.5	6.95 ± 0.30
Reducing power (Ascorbic acid eq. μg/50μg ext.)	36.6 ± 3.5

실험예 2: 붉가시나무 잎 추출물(QALE)의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 측정

일부 폴리페놀과 플라보노이드 화합물은 항산화 활성 및 혈청 요산 수치를 감소시킬 수 있는 잔틴 산화효소 억제 활성을 가진다. 따라서, 본 발명의 붉가시나무 추출물을 대상으로 총 폴리페놀과 플라보노이드 화합물의 함량을 측정하여 비교하였다.

2-1. 총 폴리페놀 함량 분석

폴리페놀 함량은 폴리페놀 분석법으로 가장 널리 사용되고 있는 몰리브데늄 염의 색변화를 이용하는 Folin-Ciocalteu 분석법을 이용하여 측정하였다.

구체적으로, 붉가시나무 잎 추출물(QALE) 5mg을 물 1mL에 녹인 다음 2% 탄산나트륨(sodium carbonate) 수용액 1mL와 10% Folin-Ciocalteu's 폴리페놀 시약 1mL와 혼합하였다. 그 다음, 혼합액을 상온에서 10분 동안 배양하고, microplate reader(Perkin Elmer)를 사용하여 750nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질은 갈산(gallic acid)을 이용하였다. 총 폴리페놀 함량은 갈산(gallic acid)을 표준용액으로 하여 작성한 standard curve(equation: y= 0.023x + 0.124, r²= 0.999)와 대비하여 구하였으며, mg/g eq. gallic acid로 나타내었다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었으며, 총 폴리페놀 함량은 126±2 mg/g eq. gallic acid로 나타났다.

2-2. 총 플라보노이드 함량 분석

플라보노이드 함량은 비색법(colorimetric method)을 이용하여 측정하였다.

구체적으로, 붉가시나무 잎 추출액 0.5mL를 증류수 2mL 및 5% 아질산 나트륨 (NaNO₂) 수용액 0.15mL와 혼합하여 5분 동안 배양하였다. 그 다음, 혼합물에 10% 염화알루미늄(AlCl₃) 수용액 0.15mL를 첨가하고, 상온에서 5분 동안 배양한 후, 4% 수산화나트륨(NaOH) 수용액 2mL를 첨가하였다. 그 다음, 물 5mL를 첨가하고, 잘 혼합하여 상온에서 15분 동안 배양하고, 415nm에서 최종 혼합물의 흡광도를 측정하였다. 표준물질은 퀘르세틴(quercetin)을 이용하였으며, 총 플라보노이드 함량은 퀘르세틴(quercetin)을 표준물질로 하여 작성한 standard curve(equation: y= 6.694x + 0.035, r²= 0.999)와 대비하여 구하였고, mg/g eq. quercetin으로 나타내었다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었으며, 총 플라보노이드 함량은 27.6±1.4 mg/g eq. quercetin으로 나타났다.

Parameter	QALE
Total phenol (mg/g ext.)	126 ± 2
Total flavonoid (mg/g ext.)	27.6 ± 1.4

실험예 3: 잔틴 산화효소 억제(Xanthine Oxidase Inhibition) 실험

잔틴 산화효소(XO)의 반응으로 잔틴이 산화되면서 요산이 생성되는데, 본 실험에서는 붉가시나무 잎 추출물(QALE)의 요산 생성 억제 효능을 확인하기 위하여 문헌 [Arimboor, R. (2011), "Tetrahydroamentoflavone(THA) from Semecarpus anacardium as a pootent inhibitor of xanthine oxidase." J Ethnopharmacol, 133: 1117-1120]에 개시된 방법에 따라 잔틴 산화효소(XO) 시스템에서 요산 생성을 측정하였다.

구체적으로 100mM 인산완충용액(pH 7.4) 0.6mL에 0.1mL 붉가시나무 잎 추출물(QALE), 잔틴 산화효소(농도 0.2 U/mL) 0.1mL 및 잔틴 0.2mL (1mM; dissolved in 0.1N NaOH)로 구성된 시스템에 촉매와 억제제 또는 촉매만을 첨가하여 반응을 개시하고, 15분 동안 혼합물의 흡광도 변화를 290nm에서 대조군의 흡광도와 비교하였다. 그 다음, 1N 염화수소(HCl) 0.2mL를 넣어 효소 작용을 중지시켰다.

양성 대조군으로는 잔틴 산화효소 저해제로서 잘 알려져 있으며, 농도 30μg/mL일 때, 64.55±2.55%의 잔틴 산화효소 억제율을 나타내는 알로퓨리놀(allopurinol)을 사용하였다.

붉가시나무 잎 추출물(QALE)의 잔틴 산화효소 억제율은 요산(uric acid) 생성물 억제 비율로 나타내었으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 그 결과, 붉가시나무 잎 추출물(QALE) 투여량을 증가시킬수록 잔틴 산화효소 억제율이 증가되는 것을 알 수 있었으며, 붉가시나무 잎 추출물(QALE) 농도가 1,000μg/mL일 때, 44.0±0.3%의 높은 잔틴 산화효소 억제율을 나타냈다.

실험예 4: 고요산혈증 유발 동물 모델에서의 혈중 요산 감소 실험

본 발명의 붉가시나무 잎 추출물(QALE)의 혈중 요산 감소 효능을 확인하기 위하여 요산 분해 효소 저해제인 칼륨 옥소네이트(potassium oxonate)를 투여하여 고요산혈증을 유도한 후, 붉가시나무 잎 추출물(QALE)의 혈중 요산 감소효과에 대한 실험을 수행하였다. 양성 대조군에는 요산 합성 저해제인 알로퓨리놀(allopurinol)을 투여하여 비교 실험을 수행하였다.

실험동물은 생후 4주 정도의 ICR 마우스(Orient Bio, Co., 대한민국)를 구입하여 사용하였다. 사육환경은 온도 20~23℃, 상대습도 50ㅁ5%이며, 조명 시간 12시간(오전 7시 점등~오후 7시 소등)으로 설정한 무균 처리된 환기되는 케이지(Tecniplast USA, Inc.)에서 사육하였으며, 사료(Agribrands Purina Korea, InC.)와 물은 더 이상 먹지 않고 남을 때까지 충분히 공급하였다. 모든 동물 실험은 대한민국 나주의 AIC-JBF(Animal Investigation Committee of Jeonnam Bioindustry Foundation)의 승인번호 JINR 1517 지침에 준하여 수행하였다.

본 실험에서는 요산 분해 효소 저해제인 칼륨 옥소네이트(potassium oxonate) 250mg/kg을 시료 투여 1시간 전에 복강 내에 투여하여 고요산혈증을 유도하였다. 칼륨 옥소네이트를 투여하고 1시간 후, 고요산혈증의 유도 여부를 확인하기 위해 혈중 요산 농도를 측정하였으며, 그 결과 정상 대조군에 비하여 높은 혈중 요산 농도를 나타내어 고요산혈증이 유도된 것을 확인하였다.

실험동물은 정상 대조군(Normal control), 고요산혈증 대조군(Model control, HU), 알로퓨리놀 투여군(Positive control, HU+ALP), 붉가시나무 잎 추출물 투여군(HU+QA50, HU+QA250)으로 각 그룹당 5마리씩 다섯 그룹으로 나누어 실험하였다.

붉가시나무 잎 추출물 투여군은 붉가시나무 잎 추출물 50mg/kg, 250mg/kg을, 알로퓨리놀 투여군은 알로퓨리놀 10mg/kg을 각각 0.3% 카르복시메틸셀루로오스나트륨 (CMC-Na) 수용액에 녹여 7일 동안 1회/1일 경구 투여를 실시하였으며, 약 투여하기 1.5시간 전에는 물을 제외한 음식물을 주지 않았다.

약물 투여 마지막 날(7일째), 마지막 약 투여 1시간 전에 칼륨 옥소네이트(potassium oxonate) 250mg/kg을 복강 내에 투여하여 고요산혈증을 유도하고, 1시간 후 마지막 약물을 경구 투여하였다. 약물 투여 1시간 후, 실험동물의 꼬리 혈관에서 혈액 샘플을 채취하여 상온에서 1시간 동안 응고시켰다. 응고된 혈액으로부터 혈청을 얻기 위해서 혈액 샘플을 10,000rpm에서 15분 동안 원심분리 하였으며, 얻어진 혈청 샘플은 -80℃에 보관하였다. 혈청 요산 농도는 요산 분석 키트(Abcam, Cambridge, UK)를 사용하여 3회씩 반복하여 분석하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었으며, 붉가시나무 잎 추출물의 투여로 인하여 붉가시나무 잎 추출물 투여군(HU+QA50과 HU+QA250)의 혈청에서의 요산 농도는 각각 6.81±2.38, 4.78±2.70μM로 고요산혈증 대조군에 비하여 낮은 수치를 나타냈다. 붉가시나무 잎 추출물 투여군은 알로퓨리놀 투여군(Positive control, HU+ALP)에 비교하여 요산 감소능력이 다소 떨어지는 경향을 보이지만, 붉가시나무 잎 추출물이 식물에서 추출한 안전한 천연물임을 감안하면 다양한 부작용을 나타내는 알로퓨리놀의 대체 약물로 유용하다는 것을 확인할 수 있다.

실험예 5: 간(Hepatic)과 혈청에서의 잔틴 산화효소 활성 실험

고요산혈증이 유도된 실험동물의 간과 혈청에서의 잔틴 산화효소 잔여 활성을 측정하기 위해서 잔틴으로부터 요산이 형성되는 것을 모니터링하여 분광 광도법으로 측정하였다.

고요산혈증이 유도된 실험동물의 간 0.5g을 50mM 인산나트륨완충용액(pH 7.4) 1mL에 균질화하고, 균질화된 간을 4℃, 3,000rpm에서 10분 동안 원심분리 하였다. 그 다음, 액상을 제거하고, 상등액을 4℃, 10,000rpm에서 60분 동안 원심분리 하여 잔틴 산화효소의 잔여 활성과 총 단백질 농도를 측정하였다.

구체적으로, 50mM 인산나트륨완충용액(pH 7.4)에 10μL의 균질화된 간과 1mM 포타슘 옥소네이트(potassium oxonate) 용액 0.54mL를 넣고 35℃에서 15분 동안 배양한 시험관에 250mM 잔틴 용액 0.12mL을 넣어 반응시키고, 반응 0 내지 30분 후, 0.6M 염화수소(HCl)를 0.1mL 넣어 반응을 중단시켰다. 그 다음, 시험관을 3,000rpm에서 5분 동안 원심분리 하고, UV/VIS 스펙트로미터를 이용하여 295nm에서 상등액의 흡광도를 측정하였다. 총 단백질 농도는 Bradford 방법에 따라 분광광도법에 의해 측정하였으며, 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 고요산혈증이 유도된 실험동물 간에서의 잔틴 산화효소 활성은 일주일 동안 붉가시나무 잎 추출물 50mg/kg과 250mg/kg을 투여하였을 때 각각 46.3, 32.0% 감소하였으며, 알로퓨리놀을 투여하였을 때 46.0% 감소하는 것을 알 수 있었다.

이와 유사하게, 고요산혈증이 유도된 실험동물의 혈청에서의 잔틴 산화효소 활성은 도 4에 나타낸 바와 같이, 일주일 동안 붉가시나무 잎 추출물 50mg/kg과 250mg/kg을 투여하였을 때 각각 35.8%, 33.5% 감소하였으며, 알로퓨리놀을 투여하였을 때 25.1% 감소하는 것을 알 수 있었다.

실험예 6: 붉가시나무 잎 추출물(QALE)의 활성 성분 분석

항산화 및 잔틴 산화효소 억제 활성을 가지는 붉가시나무 잎 추출물(QALE)의 활성 성분을 확인하기 위해 GC-MS 및 HPLC 분석을 수행하였다.

GC-MS 분석은 문헌 [Bae, M. S. (2014), "Long-range transport of biomass burning emissions based on organic molecular markers and carbonaceous thermal distribution", Sci Total Environ, 56-66: 466-467]에 보고된 방법을 수정하여 수행하였다.

유기화합물의 분석은 Agilent HP-5MS fused silica capillary column (30mm l. x 0.25mm i.d., 0.25-μm film thickness)을 갖춘 사극자 Agilent 5975C 전자 이온화(70 eV) mass spectrometric 검출기(Agilent Technologies, Palo alto, CA, USA)와 연결된 Gas chromatograph system(Agilent 7890)으로 수행하였다.

GC-MS의 작동 파라미터는 하기 표 3에 나타내었다. GC-MS는 전자 이온화(EI) mass fragments가 69.0, 219.0, 502.0m/z인 PFTBA (perfluorotributylamine)을 사용하여 조정하였으며, 오븐은 운반기체로 Helium(He)을 300/10min로 흘려주며, 10분 동안 65℃ 등온조건으로 가열하였다. 트랜스퍼 라인은 300℃로 가열하였으며, mass 스펙트로미터의 스캔모드는 50-550amu로 하였다. 모든 mass 스펙트라는 data system library(NIST 2008)와 대비하여 분석하였다.

HPLC 분석은 포토다이오드 어레이(photodiode array) 검출기를 갖춘 Alliance 2695 HPLC system(Waters; Millford, MA, USA)으로 수행하였다.

하기 표 3에 나타낸 바와 같이, Agilent Zorbax extended C18(5μm, 150mm l. x 4.6mm i.d.) column과 용매 A(acetonitrile) 및 B(water containing 0.2% phosphoric acid)로 구성된 이동상을 사용하였으며, 용매의 구배 용리(gradient elution, 10/90 ~ 100/0, v/v)는 flow rate 1.0mL/min으로 수행하였다. 컬럼 온도는 25℃를 유지하여 수행하였으며, 퀘르세틴(quercetin), 루테올린(luteolin) 및 아피제닌(apigenin)의 검출 파장은 270nm에서 수행하였다. 용매는 0.22μm 필터로 필터하고, 가스를 제거하여 사용하였으며, 샘플 주입량은 10μL로 수행하였다.

GC-MS 및 HPLC 분석을 통해 붉가시나무 잎 추출물(QALE)의 활성 성분을 확인한 결과는 도 5 및 도 6에 나타내었다. GC-MS 분석을 통해 비타민 E(vitamin E, 28.6%), 로리오리드(loliolide, 0.38%), 네오피타디엔(neophytadiene, 2.36%), 스티그마테롤 (stigmaterol, 11.2%), 팔미트산(palmitic acid, 1.55%), α-아미린(α-amyrin, 3.96%), 리놀렌산(linolenic acid, 0.94%), 프리델린(friedelin, 2.97%), all-trans-스쿠알렌(all-trans- squalene, 4.13%)의 9가지 활성 성분을 확인하였으며, HPLC 분석을 통해 퀘르세틴 (quercetin, 0.212%), 루테올린(luteolin, 0.0279%), 아피제닌(apigenin, 0.0426%)의 3가지 성분을 확인하였다.

Claims

붉가시나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 고요산혈증; 및 통풍, 관절내 요산염 결정의 침착, 요산염 결정의 침착으로 인한 급성 관절성 관절염, 요로 결석증, 신결석증 및 통풍성 신병증으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 고요산혈증 관련 대사 장애 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 붉가시나무 추출물은 붉가시나무의 잎, 줄기, 꽃, 뿌리 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 추출물인 것을 특징으로 하는 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
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붉가시나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 고요산혈증; 및 통풍, 관절내 요산염 결정의 침착, 요산염 결정의 침착으로 인한 급성 관절성 관절염, 요로 결석증, 신결석증 및 통풍성 신병증으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 고요산혈증 관련 대사 장애 예방 및 개선용 기능성 식품 조성물.
제4항에 있어서, 상기 붉가시나무 추출물은 붉가시나무의 잎, 줄기, 꽃, 뿌리 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 추출물인 것을 특징으로 하는 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애 예방 및 개선용 기능성 식품 조성물.
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