KR20090118154A - 붉가시나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및항암용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 붉가시나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항암용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 붉가시나무 추출물은, 붉가시나무(Quercus acuta Thunb)의 잎이 달린 줄기를 준비하고, 음건한 다음, 마쇄기로 분쇄하여 분말로 만들고, 이 분말을 초음파를 이용하여 1 시간씩 3 회 에탄올로 추출한 다음, 추출물의 상층액을 회수하여 감압 농축하고, 농축물을 증류수에 현탁시킨 후, 현탁액을 용매인 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 순차적으로 추출하여 제조된다.
본 발명에 의해 붉가시나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 및 항암용 조성물이 제공된다.
붉가시나무, 항산화, 항암, 추출, 조성물,
Description
본 발명은 붉가시나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항암용 조성물에 관한 것이다.
활성산소는 스트레스, 자외선, 방사선, 화학물질, 인스턴트식품, 흡연 및 기타 환경공해 등의 여러 가지 원인으로 인하여 체내에 들어온 산소 중 일부가 안정한 물로 환원되지 못하고 쌍을 이루지 않은 전자를 지닌 상태로 남게 되어 생기는 것으로, 상태가 불안정해 쌍을 이루지 않은 전자를 떼거나 주위로부터 전자 하나를 더 얻어 보다 안정된 상태로 나가려는 성질을 가지고 있어 주변조직들을 변화시키는 독성이 있고, 암의 유발, 뇌졸중, 동맥경화, 당뇨병, 관절 등의 질병뿐만 아니라 성인병, 남성불임에도 원인이 되고 있다.
이러한 활성산소의 작용을 중화시키는 성질을 가지고 있는 항산화제는 저분자 화합물로서 체내에서 고분자 항산화물(효소)의 작용을 돕거나 자체적으로 활성산소를 제거하기도 하는데, 베타카로틴, 비타민A, 비타민C(아스코르빈산), 비타민 E(토코페롤)와 플라보노이드 등이 대표적인 항산화 성분들로서, 강력한 항산화력을 지니고 있으며, 현재 식물영양소(phytonutrients)들이 항산화 성분으로 주목받아 활발하게 연구되고 있다.
또한, 암은 인류가 해결해야 할 난치병 중의 하나로, 전 세계적으로 이를 치유하기 위한 개발에 막대한 자본이 투자되고 있는 실정이며, 한국의 경우, 질병 사망원인 중 제 1위의 질병으로서 연간 약 10만 명 이상이 진단되고, 약 6만 명 이상이 사망하고 있다.
이러한 암의 유발 인자인 발암물질로는 흡연, 자외선, 화학물질, 음식물, 기타 환경인자들이 있으나, 그 유발 원인이 다양하여 치료제의 개발이 어려울 뿐만 아니라 발생하는 부위에 따라 치료제의 효과 또한 각기 다르다.
현재 치료제로 사용되는 물질들은 상당한 독성을 지니고 있으며, 암 세포만을 선택적으로 제거하지 못하므로, 암의 발생 후 이의 치료뿐 아니라, 암의 발생을 예방하기 위한 독성이 적고 효과적인 항암제의 개발이 절실히 필요하다.
한편, 붉가시나무(Quercus acuta Thunb)는 참나무과에 속하며 온대성의 상록활엽수로서 한국과 일본의 온대 공통종이다.
이 나무는 제주도를 비롯한 남부 제도와 남부 해안 산지의 온대림을 형성하던 주요수목으로, 재질이 단단하고 잘 쪼개지지 않으며 보존성이 좋아서 가구나 선박 등을 만드는데 이용되어 왔다.
그러나, 붉가시나무에 대해 아직까지 항산화 및 항암활성 등 그 생리활성에 대하여 알려진 바가 없어 더욱 많은 연구가 필요한 실정이다.
본 발명은 붉가시나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항암용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명의 붉가시나무 추출물이 식품첨가제, 음료조성물, 화장료조성물 등에 함유된 항산화용 조성물 또는 항암용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 붉가시나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항암용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 붉가시나무 추출물은 고순도 저급 알코올 또는 물로 추출하여 얻은 항산화 및 항암활성을 갖는 조성물을 제공한다.
또한, 상기 과정에 더하여 용매인 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 순차적으로 추출하여 얻어진 분획물로서 항산화 활성과 항암활성을 갖분획물을 제공한다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 붉가시나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항암용 조성물을 제공한다.
본 발명의 붉가시나무 추출물은 잎이 달린 줄기를 음건한 후 분쇄하여 미세분말을 만들고 미세분말을 저급 알코올로 또는 물로 추출한 것을 이용한다.
이때, 저급 알코올로는 메탄올 또는 에탄올을 사용하는 것이 바람직하며 식품, 약제용으로 이용할 경우에는 고순도 에탄올이나 증류수를 사용하는 것이 바람직하다.
추출물은 다시 유기용매 또는 물로 순차추출하여 얻어진 분획을 사용할 수 있다.
이때, 유기용매로는 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 및 이들의 혼합 용매 등을 사용한다.
상기와 같이 하여 얻어진 붉가시나무 추출물과 각 용매 분획물은 모두 뛰어난 항산화 활성과 항암활성을 갖는다.
먼저, 본 발명의 붉가시나무 추출물은 총 폴리페놀화합물과 플라보노이드의 함량이 매우 높았다.
즉, 총 폴리페놀 함량은 에탄올 추출물에서 428.00 mg/g, 헥산 분획물에서 112.10 mg/g, 디클로로메탄 분획물에서 168.60 mg/g, 에틸아세테이트 분획물에서 883.5 mg/g, 부탄올 분획물에서 557.20 mg/g, 그리고 물 분획물에서 130.80 mg/g 이었다.
즉, 총 폴리페놀 함량은 에틸아세테이트 분획물>부탄올 분획물>에탄올 추출물>디클로로메탄 분획물>수용성 분획물>헥산 분획물 순으로 나타났다.
특히, 총 폴리페놀 함량이 가장 높게 나타난 에틸아세테이트 분획물은 에탄올 추출물에 비해 약 2 배 가량 증가되는 경향을 보였다.
또, 총 플라보노이드 함량은 에탄올 추출물에서 389.60 mg/g, 헥산분획물에 서 87.00 mg/g, 디클로로메탄 분획물에서 134.00 mg/g, 에틸아세테이트 분획물에서 820.10 mg/g, 부탄올 분획물에서 503.30 mg/g, 그리고 수용성 분획물에서 115.50 mg/g로 나타났다.
즉, 총 플라보노이드 함량 또한 에틸아세테이트 분획물이 에탄올 추출물에 비해 약 2.1 배 가량 증가되는 경향을 보였다(표 1).
또한, 본 발명의 붉가시나무 추출물은 항산화활성이 뛰어난 것을 알 수 있었다.
상기의 항산화활성은 DPPH 라디칼 소거활성, Hydroxyl 라디칼 소거활성, Alkyl 라디칼 소거활성을 측정하는 실험을 통하여 확인하였다.
그 결과, DPPH, Hydroxyl, Alkyl 라디칼의 경우, 총 폴리페놀 및 플라보노이드 가장 높게 나타난 에틸아세테이트 분획물에서 활성이 가장 좋았으며 농도 의존적으로 농도가 증가할수록 소거활성 또한 증가하였다.
에틸아세테이트 분획물의 DPPH, Hydroxyl 및 Alkyl 라디칼 소거활성의 IC50 농도는 각각 11.46, 708.38 및 431.75 ㎍/㎖였으며, DPPH 라디칼 소거활성의 경우 표준물질로 사용한 Ascorbic acid보다 활성이 좋은 것으로 나타났다(표 2).
또한, 본 발명의 붉가시나무 추출물의 DNA 손상억제활성에 대해 실험한 결과, 과산화수소를 처리하였을 때 꼬리모양이 길게 형성되고 머리 부분이 작아지는 것을 확인할 수 있었다(도 1).
L-5178R 세포에 과산화수소를 처리하였을 때 과산화수소를 처리하지 않은 대 조군에 비해 44.7 %의 손상을 일으킨 것을 알 수 있었으며 에틸아세테이트 분획물을 농도별로 처리하였을 때 DNA 손상이 억제되는 것을 알 수 있었다.
특히, 에틸아세테이트 분획물을 50 ㎍/㎖를 처리하였을 때 과산화수소만을 처리한 군 보다 60.6 % 만큼에 손상 억제를 보였다(표 3).
총 폴리페놀과 플라보노이드의 함량 차이에 따른 항산화 및 DNA 손상 억제활성과의 유연관계를 살려보면, 전반적으로 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 높게 나타난 에틸아세테이트 분획물에서 각각의 처리 농도 범위 내에서 3가지 항산화 효과 및 DNA 손상 억제활성 측정 결과에서 보듯이 모든 활성이 높게 나타난 걸로 보아 유의성을 찾을 수 있었으며, 아울러 추출물 및 극성에 따른 순차적 분획물에 함유된 총 페놀성화합물의 함량에 따라서 항산화 활성 및 DNA 손상 억제활성의 차이가 다르게 나타남을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명의 붉가시나무 추출물은 항암활성이 뛰어난 것을 알 수 있었다.
즉, 본 발명의 붉가시나무 추출물을 대상으로 한 암세포의 세포증식 억제효과는 테트라졸리움염(tetrazolium salt)의 하나인 MTT를 사용하여 MTT의 환원에 의해 생성되는 formazan의 흡광도로 측정하였다.
그 결과 전반적으로 디클로로메탄 〉헥산 〉에탄올 〉물 〉부탄올 〉에틸아세테이트 순으로 나타났다(표 4).
암세포에 대한 세포 성장 억제효과는 대부분 유기용매 추출물인 디클롤로메탄 분획물에서 그 세포성장 억제 효과가 높게 나타났으며, 특히 혈액암 세포주인 HL-60 세포에서 80.97% (100 μg/mL)의 높은 세포성장 억제 효과를 보였다.
이에 혈액암 세포주인 HL-60 세포를 대상으로 용매추출방법에 의한 추출물을 대상으로 농도별에 따른 그 암세포 증식 억제능을 비교 조사하여 보았다.
그 결과, 디클로로메탄 분획물이 농도 의존적으로 제일 좋은 세포증식 억제능을 보여주었다. 이때의 IC50 농도는 13.06 μg/ml로 나타났다(Table 5).
이상과 같이, 본 발명의 붉가시나무 추출물은 항암, 항산화 효능이 탁월하여 앞으로 약학적 조성물, 건강보조식품, 화장품 첨가물, 식품 및 음료로서 매우 유용하게 이용될 수 있다.
약학적 조성물로 이용되기 위하여는 약제학적 분야에서의 공지의 방법에 의해 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있고, 이들은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 붉가시나무 추출물의 유효 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 물활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 발명에 의해 붉가시나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 및 항암용 조성물이 제공된다.
또한, 본 발명의 붉가시나무 추출물이 식품첨가제, 음료조성물, 화장료조성 물 등에 함유된 항산화용 조성물 또는 항암용 조성물이 제공된다.
이하, 본 발명에 대하여 실시예 및 실험예를 통하여 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
<실시예 1> 붉가시나무 추출물의 제조
제주도에 자생하고 있는 붉가시나무(Quercus acuta Thunb)의 잎이 달린 줄기를 채집하여 음건한 다음 마쇄기로 분쇄하여 각각의 미세분말을 준비하였다.
준비한 붉가시나무 분말을 70 % 에탄올로 추출하고 상층액을 회수하여 본 발명의 붉가시나무 추출물을 제조하였다.
<실시예 2> 붉가시나무 추출물의 용매분획물 제조
본 발명의 실시예 1의 방법과 같이 제조된 붉가시나무 추출물을 감압 농축한 다음, 농축물을 증류수에 현탁하고, 용매인 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 물을 이용하여 순차적으로 분획하여 용매분획물을 제조하였다.
<실시예 3> 붉가시나무 추출물이 함유된 식품첨가제의 제조
본 발명의 실시예 1의 방법에 의해 제조된 붉가시나무 추출물을 감압 농축 후 동결건조하여 분말로 제조하였다.
통상적인 식품 제조시 상기의 분말을 2 중량% 첨가하여 사용하였다.
<실시예 4> 붉가시나무 추출물이 함유된 음료조성물의 제조
본 발명의 실시예 2의 방법에 의해 제조된 분획물 중 에틸아세테이트 분획물을 준비하였다.
통상적인 음료조성물 제조시 상기의 물질을 5 중량% 첨가하여 사용하였다.
<실시예 5> 붉가시나무 추출물이 함유된 화장료조성물의 제조
본 발명의 실시예 2의 방법에 의해 제조된 분획물 중 에틸아세테이트 분획물을 준비하였다.
통상적인 화장료조성물에 상기의 물질을 10 중량% 첨가하여 사용하였다.
<실험예 1> 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 측정실험
식물에 널리 분포되어 있는 페놀성 물질은 페놀성 하이드록시기(phenolic hydroxyl) 그룹 때문에 단백질 또는 효소단백질, 기타 거대분자들과 결합하는 성질, 항산화 효과, 2가 금속이온과의 결합력을 가진다.
또한, 단백질과 결합하는 성질은 미생물 세포와 작용하여 성장저해를 유발시킴으로써 항균효과 등의 생리활성 기능을 가진다.
따라서, 본 발명의 붉가시나무 추출물을 대상으로 총 폴리페놀화합물과 플라보노이드의 함량을 측정하여 비교하였다.
폴리페놀 화합물 함량은 페놀성 물질인 포스포몰리브덴산(phosphomolybdic acid)과 반응하여 청색을 나타내는 원리를 이용한 폴린-데니스법(Folin-Denis)을 이용하여 측정하였다.
실시예1과 실시예2에서 제조한 추출물과 각 분획물을 준비하였다.
각각의 시료를 1 mg/mL로 녹인 다음 0.2 mL를 시험관에 취하고 증류수를 가하여 2 mL로 만든 후, 여기에 0.2 mL Folin-ciocalteu's phenol reagent(Sigma, USA)를 첨가하여 잘 혼합한 후 3분간 실온에 방치하였다.
그리고 2 M sodium carbonate 용액 0.4 mL를 가하여 혼합하고 증류수를 첨가하여 4 mL로 만든 후, 실온에서 1시간 동안 방치하여 상등액을 725 nm에서 흡광도를 측정하였고, 표준물질은 tannic acid(Sigma, USA)를 이용하였다. 표준곡선을 작성한 후 시료의 총 폴리페놀 함량은 g/mg 탄닌산(tannic acid)으로 나타내었다.
그 결과, 각 시료의 총 폴리페놀 함량은 에탄올 추출물에서 428.00 mg/g, 헥산에서 112.10 mg/g, 디클로로메탄에서 168.60 mg/g, 에틸아세테이트에서 883.5 mg/g, 부탄올에서 557.20 mg/g, 그리고 물 분획물에서 130.80 mg/g로 나타났다. 즉, 에틸아세테이트 분획물>부탄올 분획물>에탄올 추출물>디클로로메탄 분획물>물 분획물>헥산 분획물 순으로 나타났다.
특히, 총 폴리페놀 함량이 가장 높게 나타난 에틸아세테이트 분획물은 에탄올 추출물에 비해 약 2 배 가량 증가되는 경향을 보였다.
또한, 총 플라보노이드 화합물의 함량은 다음과 같은 발색 방법을 통하여 측정하였다.
실시예1과 실시예2에서 제조한 추출물과 각 분획물을 준비하였다.
각각의 시료를 1 mg/mL로 녹인 다음 0.1 mL를 마이크로튜브에 취하고 증류수를 0.4 mL를 첨가하였다.
여기에 5% NaNO2를 0.03 mL를 첨가하여 잘 혼합한 후 5분간 실온에 방치하였다.
그리고 10 % AlCl3를 0.03 mL를 첨가하여 혼합하고 실온에 5 분간 방치한 후 1 M NaOH 용액을 0.2 mL 첨가하였다.
1 분간 상온에서 반응시킨 후 증류수를 0.24 mL 첨가한 후 잘 혼합하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다.
표준물질은 루틴(rutin, Sigma, USA)을 이용하여 표준곡선을 작성한 후 각 시료의 총 플라보노이드 함량을 g/mg rutin으로 나타내었다.
그 결과, 총 플라보노이드 함량은 에탄올 추출물에서 389.60 mg/g, 헥산에서 87.00 mg/g, 디클로로메탄에서 134.00 mg/g, 에틸아세테이트에서 820.10 mg/g, 부탄올에서 503.30 mg/g, 그리고 물 분획물에서 115.50 mg/g로 나타났다.
즉, 총 플라보노이드 함량 또한 에틸아세테이트 분획물이 에탄올 추출물에 비해 약 2.1 배 가량 증가되는 경향을 보였다.
| 용매 | 면적 (%,w/w) | 폴리페놀함량 (mg TAE/g plant extract) | 플라보노이드함량 (mg RE/g plant extract) |
| 에탄올 추출물 | 24.2 | 428.0 ± 10.8 | 389.6 ± 7.2 |
| 헥산분획물 | 5.0 | 112.1 ± 8.2 | 87.0 ± 4.1 |
| 디클로로메탄 분획물 | 4.1 | 168.6 ± 4.6 | 134.0 ± 5.9 |
| 에틸아세테이트 분획물 | 12.8 | 883.5 ± 14.9 | 820.1 ± 7.7 |
| 부탄올 분획물 | 19.6 | 557.2 ± 7.1 | 503.3 ± 8.3 |
| 물 분획물 | 47.8 | 130.8 ± 6.6 | 115.5 ± 2.9 |
<실험예 2> 붉가시나무 추출물에 대한 항산화 활성 실험
1. ESR분석을 이용한 라디칼 소거활성 측정
각 시료의 DPPH free radical 소거활성은 Nanjo 등(Nanjo, F., Goto, K., Sto, R., Suzuki, M., Sakai., M., & Hara, Y. (1996). Scavenging effects of tea catechns and their derivatives on 1,1,-diphenyl-2-picrylydrazyl radical. FreeradicalBiologyandMedicine,21,895-902.)의 방법에 의하여 측정하였다.
즉, 60 μl 시료용액에 60 μl DPPH (60 μM) 용액을 첨가하여 10 초 동안 교반한 다음 혼합용액을 석영 모세관 튜브(quartz capillary tube)에 옮긴 후 2분 후에 ESR로 측정하였다.
스펙트럼은 scan time : 30s, filed : 336 ± 5 mT, time constant : 0.3s, power :5 mW, amplitude :1×500 의 조건으로 기록하였다.
항산화시료에 대한 DPPH radical의 소거활성은 아래의 식을 이용하여 계산하였다.
DPPH 자유라디칼 소거활성(%) = (ESR signal intensity for medium containing the additives of concern/ESR signal intensity for the control medium) × 100.
2. 히드록실 라디칼 소거활성 실험
각 시료의 Hydroxyl radical 소거활성은 Rosen(Rosen, G. M., & Rauckman, E. J. (1984). Spin trapping of superoxide and hydroxyl radical. In L. Packer (Ed), Mehods in enzymology (Vol. 105, pp. 198-209). Orlando,Fl:AcadmicPress.) 등의 방법에 의하여 측정하였다.
즉, 20 μl 시료용액에 0.3 M DMPO 20 μl, 10 mM FeSO4 20 μl, 10mM H2O2 20 μl을 혼합한 다음 quartz capillary tube에 옮긴 후 2.5분 후에 ESR로 측정하였다. 스펙트럼은 scan time : 30s, filed : 336 ± 5 mT, time constant : 0.3s, power : 1 mW, amplitude :1×100 의 조건으로 기록하였다. 항산화시료에 대한 Hydroxyl radical의 소거활성은 아래의 식을 이용하여 계산하였다.
히드록실 라디칼 소거활성(%) = (ESR signal intensity for medium containing the additives of concern/ESR signal intensity for the control medium) × 100.
3. 알킬 라디칼 소거활성
각 시료의 Alkyl radical 소거활성은 Hiramoto(Hiramoto, K., Johkoh, H., Sako, K. I., & Kikugawa, K. (1993). DNA breaking activity of the carbon-centered radical generated from 2,2´-azobis(2-amidinopropane) hydrochloride (AAPH). FreeRadicalResearchCommunications19,323-332.) 등의 방법에 의하여 측정하였다.
즉, 20 μl의 시료용액에 D.W 20 μl, 40 mM AAPH 20 μl, 40 mM POBN 20 μl를 혼합한 다음 37 ℃에서 30분 방치 한 후 석영 모세관 튜브(quartz capillary tube)에 옮긴 후 ESR로 측정하였다.
스펙트럼은 scan time : 30s, filed : 336 ± 5 mT, time constant : 0.3s, power : 7 mW, amplitude :1×500 의 조건으로 기록하였다. 항산화시료에 대한 알킬 라디칼 소거활성은 아래의 식을 이용하여 계산하였다.
알킬 라디칼 소거활성(%) = (ESR signal intensity for medium containing the additives of concern/ESR signal intensity for the control medium) × 100.
4. 결과
DPPH, Hydroxyl, Alkyl 라디칼의 경우, 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 가장 높게 나타난 에틸아세테이트 분획물에서 활성이 가장 좋았으며 농도 의존적으로 농도가 증가할수록 소거활성 또한 증가하였다.
에틸아세테이트 분획물의 DPPH, Hydroxyl 및 Alkyl 라디칼 소거활성의 IC50 농도는 각각 11.46, 708.38 및 431.75 ㎍/㎖이었으며, DPPH 라디칼 소거활성의 경우 표준물질로 사용한 Ascorbic acid보다 활성이 좋은 것으로 나타났다(표 2).
| 구 분 | IC50 (㎍/㎖) | ||
| DPPH radical scavenging activity | Hydroxyl radical scavenging activity | Alkyl radical scavenging activity | |
| 에탄올 추출물 | 19.58 | 860.96 | 764.99 |
| 헥산분획물 | 228.9 | >1000 | >1000 |
| 디클로로메탄 분획물 | 79.28 | >1000 | >1000 |
| 에틸아세테이트 분획물 | 11.46 | 708.38 | 431.75 |
| 부탄올 분획물 | 13.99 | 761.76 | 504.21 |
| 물 분획물 | 55.76 | >1000 | 834.99 |
| 아스코르브산 | 19.94 | 19.26 | 69.75 |
<실험예 3> Comet assay를 이용한 DNA 손상 억제활성을 측정실험
활성이 좋았던 에틸아세테이트 분획물의 경우 과산화수소 처리에 따른 L-5178R 세포의 손상을 얼마만큼 억제시켰는지 알아보기 위해 comet 방법을 이용하여 측정하였다.
Comet assay는 근본적으로 분자량에 따라 그 이동속도가 반비례 되는 전기영동의 원리에 기초하고 있다.
즉, Alkaline comet assay는 Singh (Singh PN, McCoy MT, Tice RR Schneider EL. 1988. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cell. Exp Cell Res 175: 184-191.)의 방법을 수정, 보완하여 수행되어졌다.
L5178Y-R (L5178 mouse T-cell lymphoma cell line) 세포를 1 ml 당 4×104의 세포수로 e-tube에 첨가한 후, 샘플 100 ug/ml를 처리하여 37℃에서 30분간 배양하였다.
배양된 세포들은 PBS로 세척하였고, 세포 DNA의 산화적 스트레스를 유도하기 위하여 50 uM H2O2를 포함하는 1 ml의 PBS를 처리하여 5분간 얼음 위에서 반응시켰다.
PBS로 세척한 그 세포들은 100 ul의 0.7% low melting point agarose (LMPA)와 섞어진 후, 1.0% normal melting point agarose (NMPA)로 fully frosted slide 위에 LMPA와 세포 현탁액을 분주하여 cover glass로 덮어 4℃에서 10분간 보관하였다.
Gel이 굳은 후, cover glass를 제거하고 다시 0.7% LMPA 100 ul를 slide 위에 떨어뜨린 후, 40분 동안 4℃에서 보관하였다. Gel이 굳은 것을 확인하고 alkali lysis buffer (2.5 M NaCl, 100 uM EDTA, 10 mM Tris, 1% sodium laurylsarcosine)와 1% triton X-100을 섞어 바로 cover glass를 벗긴 slide를 담가 4℃에서 1시간 동안 침지시켜 주었다. 이에 따라, DNA의 double strand가 풀어지게 되고, unwinding buffer(300 mM NaOH, 10 mM Na2EDTA, pH 13)에 slide를 침지시켜 20분 동안 4℃에서 unwinding 되어졌다.
이 과정을 통해 DNA는 alkali labile sites가 드러나게 되고, 이것은 25V/300m의 전압이 걸리는 electrophoresis buffer에서 20분 동안 전기영동 되었다.
이때 빛에 의해 DNA가 부가적으로 손상되는 것을 방지하기 위해 위의 과정에서 전기영동 탱크를 빛으로부터 차단한 채 실시하였다.
전기영동이 끝난 후, 슬라이드는 0.4 M Tris 완충용액(pH 7.5)에 10분씩 담가 세척하는 과정을 3회 반복하였고, 70% 에탄올에서 5분간 탈수과정을 거쳐 건조되어 졌다.
이렇게 건조된 slide는 핵을 형광 염색시키는 20 ㎕/㎖ ethidium bromide를 45 ㎕씩 떨어뜨려 커버글래스로 덮었다.
염색된 슬라이드는 형광 현미경(LEICA DMLB, Germany)으로 관찰되었고, CCD 카메라(Nikon, Japan)를 통해 보내진 각각의 세포핵 이미지는 Komet 5.0 코멧 이미ㅈco지 분석시스템(Kinetic Imaging, U.K)이 설치된 컴퓨터상에서 분석하였다.
세포의 DNA 손상 정도는 핵으로부터 이동한 DNA 파편의 거리(tail length, TL) 또는 tail length에 tail내에 함유된 DNA%를 곱해준 tail moment (TM) 값을 측정하여 나타내었으며 각 처리구 당 2개의 slide를 만들어 각각 50개의 세포를 관찰하였다.
DNA 분자량의 크기가 작을수록 핵으로부터 멀리 이동되므로 손상되어 잘려진 DNA 가닥이 많을수록 혜성 꼬리처럼 긴 모양이 생긴다.
이러한 꼬리 운동(tail movement)을 측정하여 얻은 DNA 손상 억제활성 효과를 도 1에 나타내었다.
과산화수소를 처리하였을 때 꼬리모양이 길게 형성되고 머리 부분이 작아지는 것을 확인할 수 있었다(도 1).
L-5178R 세포에 과산화수소를 처리하였을 때 과산화수소를 처리하지 않은 Control에 비해 44.7 %의 손상을 일으킨 것을 알 수 있었으며 에틸아세테이트 분획물을 농도별로 처리하였을 때 DNA 손상이 억제되는 것을 알 수 있었다.
특히, 에틸아세테이트 분획물을 50 ㎍/㎖를 처리하였을 때 과산화수소만을 처리한 군 보다 60.6 % 만큼에 손상 억제를 보였다(표 3).
총 폴리페놀과 플라보노이드의 함량 차이에 따른 항산화 및 DNA 손상 억제활성과의 유연관계를 살려보면, 전반적으로 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 높게 나타난 에틸아세테이트 분획물에서 각각의 처리 농도 범위 내에서 3가지 항산화 효과 및 DNA 손상 억제활성 측정 결과에서 보듯이 모든 활성이 높게 나타난 걸로 보아 유의성을 찾을 수 있었으며, 아울러 추출물 및 극성에 따른 순차적 분획물에 함유된 총 페놀성화합물의 함량에 따라서 항산화 활성 및 DNA 손상 억제활성의 차이가 다르게 나타남을 확인할 수 있었다.
| Head DNA (%)1 | Tail DNA (%)1 | S.E.1 | DNA damage (%)2 | Inhibition effect (%)3 | ||
| 대조군 | 88.6a4 | 11.4a | 0.7 | |||
| H2O2 (50 μM) | 49.0e | 51.0e | 1.5 | 44.7 | ||
| EtOAc fraction (㎍/㎖) | 6.25 | 58.4d | 41.6d | 1.7 | 34.1 | 18.4 |
| 12.5 | 61.0cd | 39.0cd | 1.4 | 31.2 | 23.5 | |
| 25 | 63.0c | 37.0c | 1.6 | 28.9 | 27.5 | |
| 50 | 79.9b | 20.1b | 0.8 | 9.9 | 60.6 | |
1추정값은 반복실험에 의한 표준오차를 가진 평균치이다.
2DNA 손상(%) = (대조군Head DNA-H2O2 and EtOAcHead DNA)/대조군Head DNA×100
3억제효과(%) = (H2O2Tail DNA-EtOAcTail DNA)/H2O2Tail DNA ×100
4Means with different letters within a column are significantly different (P< 0.05).
<실험예 4> 붉가시나무 추출물에 대한 항암활성 측정실험
1. 세포배양
혈액암세포주인 HL-60 세포 및 B-16(피부암), A-549(폐암), 그리고 CT-26(대장암) 세포주를 한국세포주은행(KCLB)으로부터 분양받아 100 units/mL의 penicillin-streptomycin(GIBCO, Grand Island, NY, USA)과 10%의 fetal bovine serum(FBS; GIBCO, Grand Island, NY, USA)이 함유된 RPMI 1640 배지 및 DMEM 배지(GIBCO, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 계대 배양은 3~4일에 한 번씩 시행하였다.
2. 암세포 증식 억제효과(Cytotoxicity) 측정
추출방법에 따른 각 추출시료의 암세포에 대한 증식억제 효과는 MTT assay법(Carmichael J, DeGraff WG, Gazdar AF. 1987. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemisensitivity testing. Cancer Res 47: 936-942.)을 이용하여 알아보았다. 각 세포(2.0～5.0×104/mL)를 96 well plate의 각 well에 넣고, 시료를 농도별로 첨가하였다. 이를 3 일간 배양한 다음, 3-(4,5-dimethylthiazol)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide(MTT; Sigma, St. Louis, MO, USA) 100 μg을 첨가하고 4시간 동안 더 배양하였다. Plate를 1,000 rpm에서 10 분간 원심분리하고 조심스럽게 배지를 제거한 다음, dimethylsulfoxide(DMSO; Sigma, St. Louis, MO, USA) 150 μL를 가하여 MTT의 환원에 의해 생성된 formazan 침전물을 용해시킨 후 microplate reader(Bio-TEK instrumenis. Inc., Winooski Vermont, WI, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포 증식억제 정도를 조사하였다.
그 결과, 그 결과 전반적으로 디클로로메탄 〉헥산 〉에탄올 〉물 〉부탄올 〉에틸아세테이트 순으로 나타났다(표 4).
| Treatment (100 μg/ml) | Cell growth inhibition activity (%) | |||
| HL-60 | B-16 | CT-26 | A-549 | |
| 80%EtOH | 46.88±6.84 | 45.16±1.75 | 22.83±4.72 | 6.01±3.68 |
| n-hexane | 73.73±2.05 | 47.96±2.50 | 44.91±6.28 | 21.88±4.06 |
| CH2Cl2 | 80.97±4.74 | 78.14±0.65 | 79.10±1.27 | 59.61±4.30 |
| EtOAc | 2.21±4.39 | 5.44±2.69 | 2.80±3.35 | -1.18±2.95 |
| BuOH | 22.39±4.81 | -1.68±4.60 | -5.38±2.50 | 5.19±4.61 |
| Water | 34.04±3.23 | 24.01±4.61 | 7.01±4.63 | 5.44±2.67 |
* 상기 데이터는 3회 반복실험에 의한 평균±표준편차 값을 나타냄.
암세포에 대한 세포 성장 억제효과는 대부분 유기용매 추출물인 디클롤로메탄 분획물에서 그 세포성장 억제 효과가 높게 나타났으며, 특히 혈액암 세포주인 HL-60 세포에서 80.97% (100 μg/mL)의 높은 세포성장 억제 효과를 보였다. 이에 혈액암 세포주인 HL-60 세포를 대상으로 용매추출방법에 의한 추출물을 대상으로 농도별에 따른 그 암세포 증식 억제능을 비교 조사하여 보았다. 그 결과, 디클로로메탄 분획물이 농도 의존적으로 제일 좋은 세포증식 억제능을 보여주었다. 이때의 IC50 농도는 13.06 μg/ml로 나타났다(표 5).
| Treatment (㎍/㎖) | Cell growth inhibition activity (%) | IC50 (μg/ml) | |||
| 12.5 | 25 | 50 | 100 | ||
| 80%EtOH | 20.19±4.73 | 28.68±4.11 | 50.53±2.3 | 59.40±3. | 50.65 |
| n-hexane | 30.60±3.10 | 61.01±1.37 | 78.48±0.72 | 82.86±0.94 | 20.17 |
| CH2Cl2 | 29.23±3.57 | 83.68±0.83 | 82.61±0.90 | 78.91±0.58 | 13.06 |
| EtOAc | -0.65±1.01 | 7.87±2.65 | 59.01±5.53 | 65.89±2.76 | 43.90 |
| BuOH | 1.38±4.32 | 0.34±3.69 | 43.61±2.88 | 52.61±2.61 | 55.38 |
| Water | 1.73±1.16 | 6.36±4.36 | 9.18±1.35 | 11.45±3.61 | >100 |
* 상기 데이터는 3회 반복실험에 의한 평균±표준편차 값을 나타냄.
3. DNA 단편분석
붉가시나무 용매분획물의 세포독성효과에 의한 HL-60 세포에서의 세포증식 억제작용이 apoptosis 유도에 의한 것인지 그 기전을 알아보기 위하여, apoptosis 유도에 의하여 나타나는 DNA 단편화 현상을 전기영동을 통해 확인하였다.
HL-60 세포 (3.5× 105/㎖)에 시료를 처리하여 배양이 끝난 후 세포를 수집하여 Promega Wizard® Genomic DNA Purification Kit를 이용하여 DNA를 분리하였다. 분리한 DNA를 1.5% agarose gel에서 30분(100 V)동안 전기영동을 한 다음 ethidium bromide로 염색하고 UV transilluminator하에서 DNA단편화 현상을 관찰하였다.
그 결과, 디클로로메탄 용매분획물을 농도별로 처리하여 관찰한 결과, 농도가 증가할수록 DNA 단편화 현상이 두드러지게 나타나는 경향을 보여주었다(도 2).
4. 핵의 형태학적 변화(Morphological changes) 측정
Apoptosis가 일어난 세포에서 볼 수 있는 가장 특징적인 변화인 형태학적 변화를 조사하였다.
세포자사멸의 형태학적 특징 중의 하나인 핵의 변화를 관찰하기 위해 HL-60 세포(3.5×105/mL)에 시료를 처리하여 배양이 끝나기 30분 전에 DNA에 특이적으로 결합하는 생체 형광 염색액인 Hoechst 33342(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 사용하여 DNA를 염색하고 형광현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 정상세포들(Control)의 핵들의 형태는 정상적인 둥근 형태이나 헥산과 디클로로메탄 분획물이 처리된 세포에서는 세포의 크기가 축소되며, 핵의 모양이 불규칙하고 부분적인 핵의 응집현상을 관찰할 수 있었다(도 3).
Apoptosis 기전에 대하여는 확실하게 증명된 바는 없지만 세포질내 칼슘치가 증가되어 칼슘의존성 endonuclease가 활성화되어 핵내 DNA 분절이 일어나며, transglutaminase가 활성화되어 세포질내 단백질의 cross-linking이 일어나면서 세포질 농축이 일어나고 수액이 세포 밖으로 빠져나가면서 apoptotic bodies를 형성하는 것으로 알려져 있다.
5. 세포주기 분석(Cell cycle analysis)
붉가시나무 용매분획물의 apoptosis 유도에 의하여 sub-G1 hypodiploid 세포가 증가하는지 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 물질인 propidium iodide로 염색한 후 유동세포분석기(Flow Cytometry)를 이용하여 세포내 DNA 함량을 sub-G1 peak 구간을 환산하여 apoptotic cell의 percentage로 측정하였다.
HL-60 세포 (3.5× 105/㎖)에 시료를 처리하여 시간별로 배양한 후, HL-60 세포를 수확하여 PBS로 세척하였다. HL-60 세포를 -20 ℃에서 70 % 에탄올로 30분 동안 고정시킨 후, PBS로 세척하고, RNase A를 처리한 다음 propidium iodide (PI, Sigma)로 염색하고, BD FACSCallibur flow cytometer(BD, USA)로 세포주기를 분석하였다.
그 결과, 디클로로메탄 분획물에서 HL-60 세포에 12.5, 20, 25 μg/mL의 농도로 처리하여 control과 비교 관찰시, 처리 농도가 높아질 수록 sub-G1 hypodiploid 세포가 control에 비해 증가됨을 확인할 수 있었다. 특히 디클로로메탄 분획물이 25 μg/mL의 농도에서는 G0/G1 세포가 약 7배 정도 감소되었고 sub-G1 hypodiploid 세포가 약 9배 이상 증가하였다(도 4).
세포는 성장 분열을 하기 위해서 G1 세포주기를 거쳐 S 세포주기로 이행되어야 한다. 대부분의 종말 분화 세포들은 거의 G0/G1 세포주기에 머물러 있다가 결국 세포의 자연사(apoptotic cell death)를 맞게 된다. 세포가 손상을 입게 되면 세포분열을 하기 전에 G1 세포주기에 머물면서 세포자연사(apoptosis)로 갈 것인지, 혹은 손상을 수복한 후 재분열을 할 것인지를 결정하게 된다.
그래서 G1 세포주기는 세포의 항상성 유지에 필수적인 과정이라 할 수 있다.
따라서, 붉가시나무 디클로로메탄 분획물에 의해 G1 세포주기가 arrest 되면서 sub-G1 hypodiploid 세포가 증가된다는 결과는 앞 실험결과인 암세포 증식 억제 현상이 apoptosis 유도에 의해 일어남을 간접적으로 뒷받침해줄 수 있는 결과라 할 수 있다.
도 1은 본 발명의 붉가시나무 추출물의 농도별 처리에 따른 DNA 손상 억제활성을 나타내는 사진
a. 대조군, b. 과산화수소 50 μM H2O2 처리,
c. 에틸아세테이트 분획물 6.25 μg/ml + 과산화수소 50 μM H2O2 처리,
d. 에틸아세테이트 분획물 12.5 μg/ml + 과산화수소 50 μM H2O2 처리,
e. 에틸아세테이트 분획물 25 μg/ml + 과산화수소 50 μM H2O2 처리,
f. 에틸아세테이트 분획물 50 μg/ml + 과산화수소 50 μM H2O2 처리
도 2는 본 발명의 붉가시나무 추출물에 대한 DNA 단편화 현상 결과를 나타내는 전기영동 사진
도 3은 본 발명의 붉가시나무 추출물이 처리된 세포에서의 핵의 형태학적 변화 관찰결과 사진
도 4는 본 발명의 붉가시나무 추출물 처리시 HL-60 세포의 세포주기분석 결과 사진
Claims (10)
- 붉가시나무(Quercus acuta Thunb)의 잎이 달린 줄기를 준비하고, 음건한 다음, 마쇄기로 분쇄하여 분말로 만들고, 이 분말을 초음파를 이용하여 1 시간씩 3회에탄올로 추출한 다음, 추출물의 상층액을 회수하여 감압 농축하고, 농축물을 증류수에 현탁시킨 후, 현탁액을 용매인 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 순차 추출하여 제조된 분획물 중, 항산화활성과 항암활성을 나타내는 붉가시나무 추출물의 에틸아세테이트 분획물.
- 붉가시나무(Quercus acuta Thunb)의 잎이 달린 줄기를 준비하고, 음건한 다음, 마쇄기로 분쇄하여 분말로 만들고, 이 분말을 초음파를 이용하여 1 시간씩 3회에탄올로 추출한 다음, 추출물의 상층액을 회수하여 감압 농축하고, 농축물을 증류수에 현탁시킨 후, 현탁액을 용매인 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 순차 추출하여 제조된 분획물 중, 암세포증식억제 효과를 나타내는 붉가시나무 추출물의 디클로로메탄 분획물.
- 붉가시나무(Quercus acuta Thunb)의 잎이 달린 줄기를 준비하고, 음건한 다음, 마쇄기로 분쇄하여 분말로 만들고, 이 분말을 초음파를 이용하여 1 시간씩 3회 에탄올로 추출한 다음, 추출물의 상층액을 회수하여 제조된 붉가시나무의 에탄올 추출물로서, 항산화활성과 암세포증식억제 효과를 나타내는 붉가시나무의 에탄올 추출물.
- 제1항의 붉가시나무 추출물의 에틸아세테이트 분획물이,식품첨가제, 음료조성물, 기능성 건강식품 중 선택된 1 종에 유효성분으로 포함된 것이 특징인 항산화용 조성물.
- 제1항의 붉가시나무 추출물의 에틸아세테이트 분획물이,화장료조성물에 유효성분으로 포함된 것이 특징인 항산화용 조성물.
- 제2항의 붉가시나무 추출물의 디클로로메탄 분획물이,식품첨가제, 음료조성물, 기능성 건강식품 중 선택된 1 종에 유효성분으로 포함된 것이 특징인 항암용 조성물.
- 제3항의 붉가시나무의 에탄올 추출물이식품첨가제, 음료조성물, 기능성 건강식품 중 선택된 1 종에 유효성분으로 포함된 것이 특징인 항산화용 조성물.
- 제3항의 붉가시나무의 에탄올 추출물이화장료조성물에 유효성분으로 포함되는 것이 특징인 항산화용 조성물.
- 붉가시나무(Quercus acuta Thunb)의 잎이 달린 줄기를 준비하고, 음건한 다음, 마쇄기로 분쇄하여 분말로 만들고, 이 분말을 초음파를 이용하여 1 시간씩 3회에탄올로 추출한 다음, 추출물의 상층액을 회수하여 감압 농축하고, 농축물을 증류수에 현탁시킨 후, 현탁액을 용매인 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올,물로 순차적으로 추출하여 제조된 추출 분획물 중, 항산화활성을 나타내는 붉가시나무 추출물의 부탄올 분획물.
- 제9항의 붉가시나무 추출물의 부탄올 분획물이,식품첨가제, 음료조성물, 기능성 건강식품 중 선택된 1 종에 유효성분으로 포함된 것이 특징인 항산화용 조성물.
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