KR101100867B1 - 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 식물줄기세포주를 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항노화용 조성물 - Google Patents

주목의 형성층 또는 전형성층 유래 식물줄기세포주를 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항노화용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 항산화, 항염증 또는 항노화용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 기존 항산화제와 항염증제의 부작용을 최소화하며, 세포 내의 대사작용에 관여하여 세포 내 활성산소를 감소시키고, 노화와 관련된 신호들을 감소 및 유도시키는 효과가 있으므로, 노화의 방지 및 지연에 유용하다. 아울러, 본 발명에 따른 조성물은 멜라닌 생성을 억제하는 효과가 있어 미백용 화장료 조성물로서도 유용하다.
주목, 형성층, 전형성층, 항산화, 항염증, 노화방지, 미백

Description

주목의 형성층 또는 전형성층 유래 식물줄기세포주를 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항노화용 조성물{Anti-oxidative, Anti-inflammatory or Anit-aging Composition Comprising Plant Stem Cell Line Derived from Cambium or Procambium of Taxus}
본 발명은 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 항산화, 항염증 또는 항노화용 조성물에 관한 것이다.
노화란 인간이 태어나서 사망할 때까지 지속적으로 일어나는 기능적, 구조적, 생화학적 과정으로 인체를 구성하고 있는 세포와 신체조직 전체에 일어나며, 대사속도의 저하, 질병증가, 적응력 저하 등을 나타내어 궁극적으로는 세포와 신체 전체의 사망에 이르게 되는 현상이다. 노화 과정 및 원인을 설명하는 학설은 크게 유전자설(Chung.H.Y. et al., Kor. J. Gerontol., 2:1, 1992)과 소모설(Chung.H.Y. et al., Kor. J. Gerontol., 2:1, 1992)로 나뉜다. 이중 소모설은 생물체의 구성세 포가 시간의 경과에 따라 기능이 저하된다고 설명하거나(wear & tear theory), 유해물질의 축적에 의한 것으로 설명하는데, 특히 그 중 인체 대사과정, 방사능 노출, 바이러스, 중금속 및 대기오염 등을 통해 생성되는 자유 라디칼들이 독성이 강한 물질을 형성함으로써 노화를 촉진할 뿐 아니라 노화와 관련된 각종 질병을 일으킨다는 자유 라디칼 이론(free radical theory)이 가장 유력한 학설로 받아들여지고 있다.
자유 라디칼은 최외곽 전자궤도에 짝짓지 않은 전자를 하나 가지는 물질을 총칭하는데, 그 구조가 매우 불안정하여 전자를 얻어 안정화하려는 성질로 인해 반응성이 매우 높다. 특히 산소에서 유래되는 자유 라디칼을 활성산소라 칭하며, 이들은 단백질, 지질, 탄수화물 등과 반응하여 지질과산화, DNA손상, 단백질의 산화등을 유발하여 세포내 구조물에 손상을 야기하며 결과적으로 세포의 사멸을 초래하게 되며 특히 혈관노화의 원인으로 염증과정에 관여함으로써 동맥경화, 알츠하이머, 혈중에 호모시스테인을 증가시킨다.
산소와 관련된 인체 내 독성물질을 활성산소종(ROS: reactive oxygen species)이라고 하는데 이러한 ROS의 종류로는 수퍼옥사이드(superoxide), 히드록실(hydroxyl), 페록실(peroxyl), 알콕실(alkoxyl), 히드로페록실(hydroperoxyl)과 같은 프리라디칼(유리기, free radical)과 히드로젠페록사이드(hydrogenperoxide), 히포클로로스 산(hypochlorous acid), 오존(ozone), 일중항 산소(singlet oxygen), 페록시니트라이트(peroxinitrite) 등과 같은 비(非)프리 라디칼(비유리기, non free radial)이 있다. 이 중에서 산소 독성 중 가장 많이 연구되어 왔고 중요한 역 할을 하는 것은 수퍼옥사이드로 프리 라디칼(superoxide free radical, 활성 산소 또는 유해산소)이라고 알려져 있다(Fridovich L., Science, 201:175,1978).
노화가 진행되는 동안 세포의 미토콘드리아에 발생된 ROS는 산화 데미지를 나타내는 타겟이 된다(Lesnefsky, E.J. & Hoppel, C.L. Arch. Biochem.Biophys.420, 287, 2003) 세포 내 산소 라디칼인 이 자유 라디컬 이론은 노화와 연관되어진 산화적 스트레스와 이로 인한 노화-관련 질병에 많은 상관 관계가 있다는 보고들이 나타나고 있으며(Finkel, T. & Holbrook, N.J., Science 408;239, 2000) 이들 Oxidative stress는 senescence를 유도하는데 중요한 역할에 관여한다고 보고되어 있다 (Chen Q. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. May 9;92(10):4337, 1995; Packer L. & Fuehr K., Nature, 267(5610):423, 1977) 이러한 산화적 스트레스는 증가하는 활성산소종의 레벨과 감소된 antioxidant reserve에 의한 macromolecules의 산화에 의해 세포에 영향을 준 손상을 설명하기 위해 사용된 용어이다 (Thomas C. & Squier, Experimental Gerontology, 36;1539, 2001).
복제적인 노화(Replicative senescence)가 진행되는 노화된 세포는 젊은 세포보다 더 높은 레벨의 ROS를 생산할수 있고, 수퍼옥사이드, 하이드로겐 퍼옥사이드, 하이도록실 라디칼 등과 같은 정상 대사과정 중에 독성 부산물들을 생산하게 된다. 나이 든 개인이나, 늙은 실험 동물에 대한 실험 결과에 의하면 조직들은 그들의 DNA, 단백질 및 지방(lipid)에 산화적 데미지를 축적한다 (Chen, Ann. N. Y. Acad. Sci., 908:111, 2000). ROS와 특히 하이도록실 라디칼은 DNA를 공격하고 8- oxo-2'-deixyguanosine 과 다른 강력한 mutagenic abducts의 형성을 야기하며 각 종마다 ROS의 비율은 life-span과 관련되어 있고 이것은 노화의 비율과 다양한 노화와 관련된 질병에 대한 정의를 내리는데 결정적 요인이 되는 것을 의미한다 (Finkel & Holbrook, Nature, 408(6809):239, 2000).
"젊은 배양 세포에서 복제능은 점차 분열 횟수가 진행될수록 감소하게 되고 결국 증식하기 위한 능력을 잃고 성장상태가 끝나게 되는 doubling limited가 주어지게 된다."고 1961년 Hayflick과 Moorhead에 의해 처음으로 제시되면서, ROS는 인간 피브로블라스트에서 in vitro 노화와 세포대 노화를 위한 실험모델로서 인간세포의 노화와 관련된 분자적 변화를 정의하는데 사용되어지고 있다(HAYFLICK L. & MOORHEAD P.S., Exp. Cell Res., 25:585, 1961).
인간을 포함한 모든 호기성 생물체는 산소를 이용한 에너지 대사 과정에서 항상 발생하는 활성산소의 상해에 대하여 근본적으로는 자기방어 기구를 구비하고 지만, 조직의 방어능을 초월한 활성산소의 생성은 최근 성인병이라 불려지는 관절염, 순환기 장애 뿐만 아니라 치매 등과 같은 여러 질환의 원인이 되고 있다(Halliwell et al., Drugs, 42:569, 1991; Fukuzawa et al., J. Act. oxyg. Free Rad., 1:55, 1990).
흔히 유해산소라 불려지는 활성산소는 가장 안정한 형태의 산소인 중항산소(3O2)가 산화, 환원과정에서 환원되어 생성되는 일중항산소인 슈퍼옥사이드 이온(Superoxide anion; O2-)과 과산화수소(H2O2), 하이드록시라디칼(·OH)과 같은짝짓 지 않은 상태의 자유 라디칼로서, 이들은 단백질, DNA, 효소 및 T세포와 같은 면역계통의 인자를 손상시켜 질환을 일으킨다(Regnstrom et al., Lancet., 16:1183, 1992; Gey et al., Am. Ac. J. Cin. Nutr., 53:326, 1991).
이러한 이유로 항산화제의 개발 연구가 활발히 진행되어 효소계열인 예방적 항산화제인 슈퍼옥사이드 디스무테이즈(Superoxide dismutase), 카탈레이즈 (Catalase), 글루타티온페록시데이즈(Glutathioneperoxidase) 등과 같은 항산화효소와 천연항산화제인 비타민 E, 비타민 C, 카로테노이드(Carotenoid), 글루타티온(Glutathione) 및 합성항산화제인 부틸히드록시아니졸 (t-Butyl-4-hydroxyanisole; BHA) 디부틸히드록시톨루엔 (3,5-(t-Butyl)-4-hydroxytoluene; BHT) 등 많은 항산화제가 알려져 있으나, 항산화효소는 나이가 들어서 늙어감에 따라 활성산소에 대한 방어능력이 감소되며, 합성 항산화제 경우 그의 변이원성 및 독성이 지적되면서 보다 안전하고 효력이 강한 천연 항산화제의 개발이 절실히 요청되고 있는 실정이다(Hatano et al., Natural Medicines, 49:359, 1995; Masaki et al., Biol. Pharm. Bull, 18:162, 1995).
한편, 염증(inflammation)은 병원체의 침입 또는 손상된 조직 제거를 개시하기 위해 상처부위에 대해 나타나는 지역적인 반응이다. 염증의 긍정적인 역할에도 불구하고 인간질병을 위한 가장 일반적인 발병 메커니즘의 하나가 되었다. 활성화된 백혈구(monocytes) 및 대식세포에 의한 산화질소(NO)의 생성이 강력한 염증 반응을 개시하고, 세균 병원체에 대한 초기 면역반응에서 가장 중요한 부분이 된다 (Bogdan C., Nat. Immunol., 2:907, 2001).
염증 반응은 조직(세포)의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증매개물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열, 통증 등 외적 증상을 나타낸다. 정상인 경우 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 점막손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 암 발생 등의 질환을 이끈다. 따라서, 부작용 없이 과도하고 지속적인 염증 반응을 예방할 수 있는 천연 항염증제의 개발 또한 요구되었다.
이에 본 발명자들은 기존 항산화제 및 항염증제의 부작용을 최소화하고, 항산화 활성 및 항염증 활성이 우수한 천연물 유래 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주(cell line) 및 그 추출물이 노화 및 염증에 대해 뛰어난 억제 효과를 가진다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 기존 항산화제 및 항염증제의 부작용을 최소화한 항산화 및 항염증 활성과 노화방지 및 지연효과를 나타내는 천연물 유래 조성물을 제공하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 주목의 형성층 또는 전형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 항산화, 항염증 또는 항노화용 조성물을 제공한다:
(a) 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임;
(b) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨; 및
(c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄.
본 발명은 또한, 상기 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 노화방지용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 항산화 기능성 식품을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 노화방지용 기능성 식품을 제공한다.
본 발명은 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항노화용 조성물을 제공하는 효과가 있다.
본 발명에 따른 조성물은 기존 항산화제와 항염증제의 부작용을 최소화하며, 세포 내의 대사작용에 관여하여 세포 내 활성산소를 감소시키고, 노화와 관련된 신호들을 감소 및 유도시키는 효과가 있으므로, 노화의 방지 및 지연에 유용하다. 아울러, 본 발명에 따른 조성물은 멜라닌 생성을 억제하는 효과가 있어 미백용 화장료 조성물로서도 유용하다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본원에서, 유관속 "형성층"은 식물체의 측부에 위치하는 측재분열조직으로 형성층의 활동에 의해 식물의 비대생장이 일어나며, 그 결과 11,000년 이상의 연륜을 가진 거대 식물체가 존재할 수 있게 된다. 발생학적으로 유관속 형성층은 전형성층으로부터 기원되므로 분열조직적 연속성을 유지하면서 점진적으로 분화된 동일 분열조직이다. 이러한 형성층과 전형성층은 1기 분열조직으로서, 본 발명에 있어서 형성층 및 전형성층 조직을 사용하여 동일한 효과를 얻을 것으로 기대되었다.
본원에서 "파쇄물"이란 세포를 detergent 등을 이용한 화학적 방법 또는 물리적 방법 등으로 파쇄하여 얻은 세포 용해물을 의미하며, 세포주의 "추출물"이란 세포를 용매에 녹여 분리한 물질로, 증류 또는 증발을 이용하여 농축될 수 있다. 또한, 세포주의 "배양액"이란 세포를 배양시킨 다음, 세포를 제외하고 남은 세포 배양용액을 의미한다.
본원에서 "선천적인 미분화 상태(innately undifferentiated)"란 탈분화 과정을 거쳐 미분화 상태로 존재하는 것이 아닌, 본래부터 분화 전 상태를 유지하는 것을 말한다.
본 발명은 일 관점에서, 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 항산화, 항염증 또는 항노화용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주는 (a) 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임; (b) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨; 및 (c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타내는 것을 특징으로 한다. 아울러, 상기 세포주는 추가적으로 (a) 현탁배양 시 단세포 상태로 존재함; 및 (b) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스(shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포주는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 얻어진 것임을 특징으로 할 수 있다:
(a) 주목의 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 수득하는 단계;
(b) 상기 수득된 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 배양하여 형성층 또는 전형성층으로부터 증식되는 형성층 또는 전형성층의 층(cambium or procambium layer)과 상기 형성층 또는 전형성층 이외의 부분으로부터 무정형으로 증식되는 캘러스 층을 유도하는 단계; 및
(c) 상기 캘러스 층으로부터 형성층 또는 전형성층의 층(cambium layer)을 분리하여 형성층 또는 전형성층 유래 세포주를 수득하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 세포주는 3~5중량%의 원당 또는 설탕; 및 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 진균류 추출물, 세균류 추출물, 효모(yeast) 추출물, 키토산, 글루코마난(glucomanan), 글루칸(glucan), 페닐알라닌(phenylalanine), 벤조산(benzoic acid), 살리실산(salicylic acid), 아라키돈산(arachonic acid), STS, mevalonalonate N-benzolyglycine, ABA, SNP, IPP, BHT, CCC, 에테폰(ethephon), 히푸익산(hippuic acid), 암모니움 세릭 니트레이트(amminoium ceric nitrate), AgNO3, 바나딜 설페이트(vanadyl sulfate), p-아미노벤조익산(p- aminobenzoic acid), 브라시노스테로이드(brassinosteroids), 소디움 알지네이트(sodium alginate), 소디움 아세테이트(sodium acteate)로 구성되는 군에서 선택된 물질;을 포함하는 배지에서 추가로 배양된 것임을 특징으로 할 수 있다. 이때, 상기 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate)는 10~100μM의 함량으로 첨가될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 추출물은 증류수, 알코올, 아세톤, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 용매를 이용하여 추출된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서는 상기 세포주 추출물을 H2O2와 함께 피부섬유아세포에 처리하여, 활성산소종의 생성 및 p-ERK1/2의 발현을 억제하고, MnSOD의 발현을 유도하는 것을 확인하여, 본 발명에 따른 세포주 추출물의 항산화 활성을 확인하였다. 또한, 본 발명에서는 상기 세포주 추출물을 LPS와 함께 피부섬유아세포에 처리하여, ICAM-1, MMP9, MMP2 및 IL-1β를 억제함을 확인하여, 본 발명에 따른 세포주 추출물의 항염증 활성을 확인하였다. 즉, 상기 세포주 추출물은 노화와 염증이 유도되기 전 처리되어 세포 내 이들 신호를 블로킹함을 확인하였다.
아울러, 본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 세포주 배양액이 자외선 조사에 의하여 발생하는 활성산소종을 제거하는 효과가 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명에서는 상기 세포주를 함유하는 조성물이 항산화 활성, 항염 증 활성 및 항노화 활성을 나타냄을 제시하는 구체적인 실시예가 없다 하더라도, 상기에서 살펴본 바와 같이 그 세포주 추출물이 항산화, 항염증 및 항노화 활성을 가지는 것을 확인한바, 본 발명에 따른 세포주 자체나 그 파쇄물을 함유한 조성물의 경우에도 항산화 활성 및 항염증 활성을 나타내어 노화를 예방하고 피부염증을 예방 및 개선할 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다고 할 것이다.
본 발명에 따른 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항노화용 조성물은 이들을 각각 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학 조성물로 제공될 수 있으며, 상기 세포주 또는 세포주의 추출물은 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료 기간 등에 따라 적절한 약학적으로 유효한 양으로 약학 조성물에 포함될 수 있다.
상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리톤, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사 용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
한편, 본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 배양액이 주목나무 추출물 및 노화방지 효과가 우수하다고 알려진 RA(Retionic acid)와 대비하여서도 더 우수한 정도로 타입Ⅰ콜라게나아제(matrix metalloproteinase-1, MMP-1) 생성 억제 효과를 보임을 확인한바, 본 발명에 따른 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 또는 그 배양액을 포함하는 조성물이 콜라겐의 분해를 억제하는 효과가 있으므로 피부노화방지 및 주름개선효과가 있는 것으로 나타난바, 노화방지용 화장료 조성물로서 매우 유용함을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 노화방지용 화장료 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 세포주 배양액이 Murine melanoma 세포주에서 멜라닌 생성을 억제하는 효과를 가짐을 확인하여, 미백용 화장료 조성물로서도 매우 유용함을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 주목의 형성층 또는 전형성층에서 유래 세포주, 그 추출 물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본원에서 '기능성 화장품'이란, 일반 화장품에 본 발명에 따른 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 첨가함으로써 일반 화장품의 기능성을 향상시킨 화장품을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 세포주 또는 그 추출물 등을 함유하는 노화방지용 화장료 조성물을 이용하여 기능성 화장품을 제공할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 용매, 안정화제, 용해화제, 유화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으나, 바람직하게는, 화장수, 영양로션, 영양크림, 맛사지크림, 영양에센스, 팩, 메이컵베이스, 파운데이션, 바디오일, 헤어오일, 샴프, 린스로 구성된 군에서 선택된 제형으로 제조되는 것을 특징으로 한다.
이러한 화장료 조성물의 제형 예에 상관없이 본 발명의 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하여 항산화 효과를 가지며, 이에 피부에 발생한 자유라디칼을 소거하고 세포내 항산화계 보호효과가 있어 자유라디칼 등의 작용에 의한 산화에 의하여 발생하는 피부 노화의 예방 및 지연 효과를 발휘할 수 있으며, MMP-1 생성 억제를 통하여 피부노화를 방지하고 주름을 개선할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 항산화 기능성 식품에 관한 것이다.
아울러, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 노화방지용 기능성 식품에 관한 것이다.
본원에서 '기능성 식품'이란, 일반 식품에 본 발명에 따른 세포주 또는 세포주의 추출물을 첨가함으로써 식품의 기능성을 향상시킨 것을 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 추출물 및 그 배양액의 항산화, 항염증 및 항노화 효과 및 미백 효과를 확인하였으나, 그 세포주 자체를 사용해서도 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
실시예 1: 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 제조
(1) 식물재료의 준비
주목의 잔가지 및 줄기를 각각 채취한 후, 즉시 항산화제 100㎎/L 아스코르브산(L-ascorbic acid, DUCHEFA, The Netherlands) 용액에 침적하여 운송·보관하였다.
그 후, 1% 베노밀(benomyl, Dongbu Hannong Chemical, Korea), 1% 다코닐(daconil, Dongbu Hannong Chemical, Korea), 1% 스트렙토마이신(sterptomycin sulphate, DUCHEFA, The Netherlands), 0.1% 세포탁심(cefotaxime sodium DUCHEFA, The Netherlands)의 혼합용액에 24시간 전처리 후 페놀 화합물(phenolic compound)과 잔존 화학물질을 제거하기 위하여 수돗물(tap water)로 30분간 세척하였다. 그리고, 70% 에탄올(ethanol, DC Chemical, Korea)에 1분, 30% 과산화수소(hydrogen peroxide, LG Chemical, Korea) 15분, 1% CLOROX 용액에 15분, 3% CLOROX용액에 5분 표면 살균 후 3~4회 세척하였다.
(2) 잔가지 및 줄기로부터 전형성 및 형성층 조직 분리
상기 살균과정을 거친 잔가지 및 줄기의 바깥조직들을 세로방향으로 잡아당기면 쉽게 벗겨졌다. 벗겨진 조직들은 목부, 전형성층 또는 형성층, 사부, 피층, 표피로 구성되는데, 벗겨진 조직들의 가장 안쪽조직 즉, 목부가 배지면에 닿도록 배양하였다.
(3) 주목의 전형성층 및 형성층 유래 세포주 유도단계
초기 배양 4~7일째 전형성층 및 형성층으로부터 세포 분열이 육안상으로 관찰되고, 배양 15일 이후에 사부·피층 및 표피로 이루어진 층으로부터 탈분화에 의한 무정형의 캘러스가 유도되기 시작하였다. 그러나 배양기간 내내 목부는 세포분열이 일어나지 않아 전형성층 및 형성층의 층(layer)과의 분리가 자연스럽게 이루어졌다. 배양 30일 경과 후 전형성층 및 형성층의 층(layer)과 사부를 포함한 윗층, 즉 무정형의 캘러스층으로 분리되기 시작했고(도 1의 (a)A 및 (b)A), 두 층이 자연스럽게 분리될 때까지 기다렸다가 완벽한 분리가 이루어지면 각기 다른 페트리디쉬(petridish)에 분리 배양하였다(도 1의 (a)B~C, (b)B~D). 도 1의 (a)에서 Asms 전형성층 분리를 나타내며, 목부를 제거 후 배양하여 top은 사부·피층·표피 포함조직, bottom은 전형성층을 나타낸다. 도 1의 (b)에서 A는 형성층 분리를 나타내며, top은 사부·피층·표피 포함조직을, middle은 형성층을 나타내고, Bottom은 목부를 나타낸다. Arrow head는 전형성층 및 형성층의 층과 사부·피층·표피 포함조직 간의 분리를 표시한다. 또한, 도 1의 (a)와 (b)에서 B는 세포들간의 분열 차이로 부정형으로 증식되는 사부·피층·표피 포함조직 유래 세포주를, C는 세포들간의 분열이 균일하여 일정한 판의 형태로 증식되는 전형성층 및 형성층 유래 세포주를, (b)에서 D는 세포분열이 일어나지 않는 목부를 나타낸다. 분리 후, 생장률이 좋은 희고 무른 부분을 유도배지와 동일한 새로운 배지로 매 21일째 계대하였다.
한편, 전형성층 및 형성층 유래 세포주만을 유도하기 위해 사용한 배지는 <표 1>과 같다.
<표 1> 세포주 유도배지 in Taxus spp.(배지 1)
Composition Contents(㎎/L)
Inorganic salts

 KNO3 2500
(NH4)2SO4 134
MgSO4·7H2O 121.56
MnSO4·4H2O 10
ZnSO4·7H2O 2
CuSO4·5H2O 0.025
CaCl2·2H2O 113.23
KI 0.75
CoCl2·6H2O 0.025
NaH2PO4·H2O 130.44
H3BO3 3
Na2MoO4·2H2O 0.25
FeNaEDTA 36.7
Vitamin
 Myo-inositol 200
Thiamine-HCl 20
Nicotinic acid 2
Pyridoxine-HCl 2
L-ascorbic acid 50
Citric acid 75
Amino acid


 L-aspartic acid 133
L-arginine 175
Glycine 75
Proline 115
Hormone α-Naphtalene acetic acid 2
Sucrose 10,000
Activated charcoal 100
Gelrite 2,000
배지에 생장 조절제로서 NAA, IAA와 같은 옥신(Auxin)류를 1~3mg/L의 농도로 첨가하였는데, 바람직하게는 2mg/L의 농도로 첨가한다. 배양은 25±1℃로 조절된 암실에서 실시되었다.
한편, 비교를 위하여 주목의 배(embryo)와 잎(needle) 절편체를 소독한 후 상기 <표 1>의 배지에서 배양하였으며, 그 결과, 배(embryo)와 잎(needle) 절편체는 탈분화에 의해 캘러스가 형성함을 관찰할 수 있었다. 배 및 잎 절편체에서 유도 된 캘러스는 사부포함조직과 같이 여러 세포들 간의 분열 속도에 차이로 부정형을 이루었고, 생장률이 불안전하며 쉽게 갈변되는 경향을 보였다. 갈변 및 응집되어진 벼 및 잎 절편체에서 유도된 캘러스는 종국에는 자신이 분비하는 페놀 화합물에 의해 생장이 둔해지다가 종국에는 괴사하였다. 즉, 6개월 후부터 배(embryo)와 잎(needle)으로부터 유도된 캘러스들은 유지 및 배양이 어려웠다. 반면, 전형성층 및 형성층 유래 세포는 20개월 이상 장기 배양시 세포의 생장률, 생장 패턴, 응집 정도에 변이 없이 안정적으로 유지되어 대량 배양이 가능했다.
(4) 분리된 세포주의 증식단계 및 특성관찰
상기 전형성층 및 형성층 유래 세포주를 하기 <표 2>의 액상배지가 함유된 플라스크에 넣어 암조건에서 25±1℃에서 100rpm의 회전 교반기(shaker)에서 배양하였다. 계대배양 주기는 2주일로 고정함으로써 배양세포가 항상 대수생장기 상태에서 높은 활력을 유지할 수 있도록 하였다.
<표 2> Suspension medium in Taxus spp. (배지 2)
Composition Contents(㎎/L)
Inorganic salts

 Ca(NO3)2 471.26
NH4NO3 400
MgSO4·7H2O 180.54
MnSO4·4H2O 22.3
ZnSO4·7H2O 8.6
CuSO4·5H2O 0.25
CaCl2·2H2O 72.5
K2SO4 990
Na2MoO4·2H2O 0.25
H3BO3 6.2
KH2PO4 170
FeNaEDTA 36.7
Vitamin
 Myo-inositol 200
Thiamine-HCl 20
Nicotinic acid 2
Pyridoxine-HCl 2
L-ascorbic acid 50
Citric acid 75
Amino acid


 L-aspartic acid 133
L-arginine 175
Glycine 75
Proline 115
Hormone α-Naphtalene acetic acid 2
Sucrose 30,000
한편, 배 및 잎 유래 캘러스(callus)도 상기 <표 2>의 배지 2에서 배양하여 본 발명에 따른 전형성층 및 형성층 유래 세포주와 비교하였다.
세포 응집정도(biological microscope CX31, Olympus, Japan)를 살펴 볼 때, <표 3>과 같이 본 발명에 따른 세포주는 현탁배양 시 90%이상의 단세포 상태로 존재함을 확인할 수 있었으며, 도 1의 (c)에 나타난 바와 같이, 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 관찰할 수 있었으며, 미분화상태임을 확인할 수 있었다. 도 1의 (c)의 주목의 전형성층 유래 세포에서 화살표로 표시된 부분이 액포를 나타낸다.
<표 3> The type of cell aggregates of Taxus long-term cultures
Large cell
aggregates		 Moderate cell
aggregates		 Small cell
aggregates		 Single cell
population		 Explant
source

60%
30%
7%
3%		 embryo
needle

0
0
9%
91%
cambium

0
0
7.4%
92.6%
procambium
Large cell aggregates, size higher than 1.5×103㎛;
Moderate cell aggregates 1×103㎛;
Small cell aggregates 4×102㎛＜size＜ 1×103㎛
한편, 대량 배양 가능성을 살펴보기 위하여, 3L의 내용적을 갖는 공기 부양식 생물반응기(airlift bioreactor, 성원사이텍, Korea)에서 배(embryo)·잎(needle) 유래 캘러스와 전형성층 및 형성층 유래 세포를 배양하였다. 배지는 표 2의 액상배지를 사용하였고, 암조건에서 25±1°C로 일정하게 유지하였다. 이 경우, 배(embryo·잎(needles) 유래 배양물의 배가시간(doubling time)은 플라스크에서는 12일인데 반해 반응기(reactor)에서는 21일로 길어졌다. 이것은 반응기 내에서의 생장고리 생성과 배양중의 식물 배양체 응집성과 세포벽이 단단하여 전단에 대한 민감성으로 세포 생존율(cell viability)이 급격히 감소한 것이 원인인 것으로 판단되었다. 한편, 전형성층 및 형성층 유래 세포 배양물의 배가시간은 4-5일로 플라스크와 반응기 사이에 차이가 없거나 오히려 단축되었다(표 4). 전형성층 및 형성층 유래 세포 배양물은 생물반응기 내의 생장고리 면적을 아주 작게 형성하고, 배양기에 간단한 자극을 주어 배지를 움직여주면 내벽의 링(ring)이 간단하게 해소되었다. 또한 응집이 작고, 많은 액포(vacuole)를 가지고 있어 전단에 대한 민감성 이 약하여 세포 생존율(cell viability)의 감소를 가져오지 않았다.
<표 4>

Explant source		 Doubling time (day)
flask bioreactor
embryo 11.5 21
needle 12 21
cambium 5 4
procambium 5 4
(5) 당 및 메틸 자스모네이트의 처리
상기 실시예 1의 (4)와 같이 14일간 현탁배양한 세포주를 멸균수에 원당 3~5중량%(g/L) 및 메틸 자스모네이트 100μM를 첨가한 배지에서 10일간 암배양한 후, 세포를 수거하여 다음의 실험을 수행하였다.
실시예 2 : 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 추출물 제조
(1) DMSO(dimethyl sulfoxide) 추출물의 제조
(ⅰ) 배양액을 제거시킨 상기 세포주 500g에 500ml의 DMSO를 가하여 50℃에서 6시간 교반시키면서 용해시켰다.
(ⅱ) 상기 용해 후, 3,000g에서 10분간 원심분리시켜 상층액을 취함으로써 DMSO 가용성물질을 얻었다.
(ⅲ) 상기에서 얻은 DMSO 가용성물질을 회전진공농축기를 이용하여 농축하였다.
(ⅳ) 농축시료를 동결건조기를 이용하여 건조시키고 DMSO 추출물을 얻었다.
(2) 증류수 추출물, 메탄올 추출물 및 아세톤 추출물의 제조
실시예 1에서 제조된 세포주로부터 다음과 같이 단계별로 유효물질을 추출하였다 (도 2).
(ⅰ) 배양액을 제거시킨 상기 세포주 500g에 500ml의 증류수를 가하여 50℃에서 6시간 교반시키면서 용해시켰다.
(ⅱ) 상기 용해 후, 3,000g에서 10분간 원심분리시켜 상층액을 취함으로써 증류수 가용성물질을 얻었다.
(ⅲ) 상기 증류수 가용성 물질을 얻은 후, 남은 증류수 불용성물질에 500ml의 메탄올(methanol)을 첨가시켜 실온에서 6시간 교반하여 용해시켰다.
(ⅳ) 상기 용해 후, 3,000g에서 10분간 원심분리 시켜 상층액을 취함으로써 메탄올 가용성물질을 얻었다.
(ⅴ) 상기 메탄올 가용성물질을 얻은 후, 남은 메탄올 불용성물질에 500ml의 아세톤(acetone)을 첨가시켜 실온에서 6시간 교반하여 용해시켰다.
(ⅵ) 상기 용해 후, 3,000g에서 10분간 원심분리 시켜 상층액을 취함으로써 아세톤 가용성물질을 얻었다.
(ⅶ) 상기에서 얻은 증류수, methanol, acetone 가용성물질을 회전진공농축기를 이용하여 농축하였다.
(ⅷ)- 농축시료를 동결건조기를 이용하여 건조시키고 세포배양액, 메탄올, 아세톤에 녹여 증류수 추출물, 메탄올 추출물, 아세톤 추출물을 얻었다.
실시예 3: 피부섬유아 ( HDF , Human diploid fibroblast ) 세포 배양
HDF 세포는 태아의 음경포피로부터 분리 배양하였다. 세포 배양액은 DMEM (Invitroge Gibco life tech. Vienna, Austriea) 배지에 56℃에서 30분간 가열하여 비활성화시킨 우태아 혈청(FBS, Hyclone, Logan, Utah, USA)을 10%, 페니실린(penicillin) (100unit/㎖)과 스트레토마이신(streptomycin) (100㎍/㎖) 및 300 ㎍/㎖-glutamine을 첨가하여 조제하였다. 세포는 위의 배양액을 사용하여 37℃, 95% 습도, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였고, 통상적으로 세포가 서로 융합되기 직전인 3~4일 간격으로 계대배양을 하였으며, 계대배양에 따라 20계대 이하의 어린 (Young) 세포, 21-49계대의 middle 세포와 50계대 이상의 노화세포로 구분하였다. 이와 같이 배양한 HDF 세포는 하기 실시예 4 내지 6의 실험에 사용하였다.
실시예 4 : 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주 추출물의 항산화 활성 측정 (1) - H 2 O 2 에 의해 유도되는 활성산소종 측정
본 발명에 따른 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 항산화 활성을 측정하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 즉, 상기 피부섬유아 세포(HDF cell)에 실시예 2에서 수득한 추출물 중 증류수 추출물을 이용하여, 노화를 일으키고 활성산소종을 유도하는 H2O2를 처리하였을 때, 노화와 활성산소종을 저해하는지 확인하기 위하여, 활성산소종 (ROS: reactive oxygen species)을 측정하는 실험을 수행하였다.
세포내 활성 산소의 측정은 활성산소에 민감한 DCFDA(2',7'-dichlorofluorescin diacetate, Fluka Cat 35847 Molecular Probes, USA) 형광 dye를 사용하여 Facscan analysis를 이용하여 분석하였다. 각각의 PD에 따른 HDF 세포를 100mm plate 에 키운 후 5uM 농도의 DCFDA 를 dark 상태로 처리하여 30분간 37℃에서 반응시킨 후 PBS로2회 세척후 trypsin-EDTA 처리로 세포를 회수하였다. 이후 900rpm에서 4분간 원심분리하여 세포를 모은 후 각각 세포 10,000개당 활성산소를 측정하였다 (도 3의 (a), (b)).
5x105 의 세포를 6 well plate에 분주 후 각 실험에 따라 H2O2를 단독으로 처리하거나 실시예 2에서 수득한 추출물을 함께 처리하였다. 실시예2에서 수득한 추출물 중 증류수 추출물을 10~100㎍/㎖ 처리하였는데, 바람직하게는 증류수 추출물 50㎍/㎖ 처리한 후 HBSS (Hank's balanced salt solution)로 2~3회 세척하고,재차 HBSS에 30분 정도 안정화시켰다. 10uM의 DCFDA (Molecular Probes USA)를 처리 후 Dark상태로 37℃에서 1시간 염색하고, HBSS로 3번 세척 후 형광 현미경으로 관찰하였다 (도 3의 (c)).
HDF 세포에 H2O2 200uM과 실시예 2에서 수득한 세포주의 증류수 추출물을 10~100㎍/㎖로 처리하였는데, 바람직하게는 50㎍/㎖을 처리하여 세포의 형태의 변화 정도를 관찰하였다.
H2O2를 세포에 처리하고 24시간이 경과하면, HDF 세포는 산화적 스트레스에 의해 활성산소(ROS)를 발생하게 된다. 비형광성인, DCFDA는 활성산소에 의해 산화되어 강한 형광을 나타내는 DCF가 되므로, 이를 측정할 수 있다. 본 실시예에서는 측정을 위하여 FACS CAlibur (Becton Dickinson Analytic Flow Cytometer, USA)를사용하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 주목의 형성층 유래 세포주 추출물 및 주목의 전형성층 유래 세포주 추출물 모두 활성산소종(ROS)의 생성이 억제되는 것으로 나타났다 (P-WE:전형성층 증류수 추출물, C-WE: 형성층 증류수 추출물). 즉, 두 세포주 추출물 모두 활성산소종의 생성을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주 추출물의 항산화 활성 측정 (2) - H 2 O 2 에 의해 유도되는 p- ERK1 /2 억제능 측정 및 MnSOD 유도능 측정
5-1. 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주 추출물의 p-ERK1/2의 발현억제효과
생체 내에서 활성산소에 의해 p-ERK1/2의 증가되는 것으로 알려져 있는바, HDK 세포에 실시예 2에서 수득한 세포주 추출물과 H2O2를 처리하여, 본 발명에 따른 세포주 추출물이 p-ERK1/2 발현을 억제하는지 측정하는 실험을 수행하였다.
HDF 세포에 H2O2 200uM과 실시예 2에서 수득한 세포주 증류수 추출물을 투여한 11일 후, 세포를 회수하여 단백질을 추출하였다. 단백질 양의 확인은 Bradford법으로 실시하였다. 즉, HDF 세포를 회수한 후, 세포 내 단백질을 추출하여 정량하 였다.
p-ERK1/2의 양은 웨스턴 블러팅으로 실시하였다. 즉, 정량된 단백질은 브롬페놀 블루(bromophenol blue) 염색액과 섞은 후 10 % SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 전기영동하였다. 전기영동 후 폴리비닐리딘 플로라이드 막(밀리포아사)에 단백질을 전이시키고, 0.5% 탈지유가 포함된 TBS(Tris buffered saline)-tween 용액 (10 mM Tris. HCl, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.5)에 담궈 비특이적인 반응을 차단하였다.
이후 ERK에 대한 토끼의 항체(Upstate)를 1/600으로 희석한 용액과 상온에서 3시간 동안 반응시킨 다음, 2차 항체로서 항 토끼 IgG 항체를 이용하여 반응시켰다. 반응이 끝난 막을 TBS( Tris buffered saline)-tween 용액으로 4회 세척하고 ECL(enhanced chemiluminescence) 검출시약과 1분간 반응시킨 후 상온에서 X-선 필름에 감광시켰다.
그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이, H2O2만 처리한 대조군보다 본 발명에 따른 세포주 추출물을 함께 처리한 실험군에서 p-ERK1/2 발현이 감소되었음을 확인할 수 있었다.
5-2. 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주 추출물의 MnSOD의 발현유도효과
생체 내에서 활성산소에 의해 MnSOD가 증가되는 것으로 알려져 있는바, HDK 세포에 실시예 2에서 수득한 세포주 추출물과 H2O2를 처리하여, 본 발명에 따른 세포주 추출물이 MnSOD 발현을 유도하는지 측정하는 실험을 수행하였다.
HDF 세포에 H2O2 200uM과 실시예 2에서 수득한 세포주 증류수 추출물을 투여하고 3, 7, 11일 후 세포를 회수하여 단백질을 추출하였다. 단백질 양의 확인은 Bradford법으로 실시하였다. 즉, HDF 세포를 회수한 후, 세포 내 단백질을 추출하여 정량하였다.
MnSOD의 양은 웨스턴 블러팅으로 실시하였다. 즉, 정량된 단백질은 브롬페놀 블루(bromophenol blue) 염색액과 섞은 후 10 % SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 전기영동하였다. 전기영동 후 폴리비닐리딘 플로라이드 막(밀리포아사)에 단백질을 전이시키고, 0.5% 탈지유가 포함된 TBS(Tris buffered saline)-tween 용액 (10 mM Tris. HCl, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.5)에 담궈 비특이적인 반응을 차단하였다.
이후 MnSOD에 대한 마우스의 항체(Upstate)를 1/600으로 희석한 용액과 상온에서 3시간 동안 반응시킨 다음, 2차 항체로서 항 마우스 IgG 항체를 이용하여 반응시켰다. 반응이 끝난 막을 TBS( Tris buffered saline)-tween 용액으로 4회 세척하고 ECL(enhanced chemiluminescence) 검출시약과 1분간 반응시킨 후 상온에서 X-선 필름에 감광시켰다.
그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이, H2O2만 처리한 대조군보다 본 발명에 따른 세포주 추출물을 함께 처리한 실험군에서 MnSOD의 신호가 증가되었음을 확인 할 수 있었다.
실시예 6: 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주 추출물의 항염증 활성 측정 - LPS에 의해 유도되는 ICAM -1, MMP -9 , MMP -2 및 IL -1β 억제능
LPS (Lipopolysacharide: : Escherichia coli strain B5:025, Sigma, St. Louis, MO)란, E. Coli 독소에서 추출된 것으로, macrophage, fibroblast, dendritic cell, lymphocyte 등의 세포의 핵에서 nuclear factor-κB (NF-κB)의 활성화를 유도하여 각종 염증성 사이토카인(cytokine)의 분비를 촉진하게 된다. 이를 세포에 처리하는 경우, IL-1β, ICAM-1, MMP-9 및 MMP-2를 유도하게 되어 염증을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 이에 수득한 형성층 및 전형성층 유래 세포주 추출물을 이용하여 이들 단백질의 신호를 억제하는지 여부를 확인하였다.
6-1. 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 추출물의 IL-1β의 발현억제효과
LPS를 세포에 처리하는 경우, 염증자극의 신호전달에 의한 생성물인 IL-1β가 증가되는 것으로 알려져 있다. 이에 HDK 세포에 실시예 2에서 수득한 세포주 추출물과 LPS를 처리하여, 본 발명에 따른 세포주 추출물이 IL-1β의 발현을 억제하는지 측정하는 실험을 수행하였다.
HDF 세포에 LPS 10㎍/㎖과 실시예 2에서 수득한 세포주의 추출물 중 메탄올 추출물을 10~100㎍/㎖ 처리하였다. 이때, 바람직한 처리 양인 50㎍/㎖이다. 메탄올 추출물을 처리한 후, 3, 6, 24시간 후 세포를 회수하여 단백질을 추출하였다. 단백질 양의 확인은 Bradford법으로 실시하였다. 즉, HDF 세포를 회수한 후, 세포 내 단백질을 추출하여 정량하였다.
IL-1β의 양은 웨스턴 블러팅으로 실시하였다. 정량된 단백질은 브롬페놀 블루(bromophenol blue) 염색액과 섞은 후 10 % SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 전기영동하였다. 전기영동 후 폴리비닐리딘 플로라이드 막(밀리포아사)에 단백질을 전이시키고, 0.5% 탈지유가 포함된 TBS(Tris buffered saline)-tween 용액 (10 mM Tris. HCl, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.5)에 담궈 비특이적인 반응을 차단하였다.
이후 IL-1β에 대한 마우스의 항체(Upstate)를 1/600으로 희석한 용액과 상온에서 3시간 동안 반응시킨 다음, 2차 항체로서 항 마우수 IgG 항체를 이용하여 반응시켰다. 반응이 끝난 막을 TBS( Tris buffered saline)-tween 용액으로 4회 세척하고 ECL(enhanced chemiluminescence) 검출시약과 1분간 반응시킨 후 상온에서 X-선 필름에 감광시켰다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, LPS만 처리한 대조군보다 본 발명에 따른 세포주 추출물을 함께 처리한 실험군에서 IL-1β의 신호가 감소되었음을 확인할 수 있었다.
6-2. 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 추출물의 MMP-9의 발현억제효과
LPS를 세포에 처리하는 경우, 염증 자극의 신호전달에 의한 생성물인 MMP-9가 증가되는 것으로 알려져 있다.
이에 HDK 세포에 실시예 2에서 수득한 세포주 추출물과 LPS를 처리하여, 본 발명에 따른 세포주 추출물이 MMP-9의 발현을 억제하는지 측정하는 실험을 수행하였다.
HDF 세포에 LPS 10㎍/㎖과 실시예 2에서 수득한 추출물 중 메탄올 추출물을 10~100㎍/㎖ 처리하였다. 이때, 바람직한 처리 양인 50㎍/㎖이다. 메탄올 추출물을 처리한 후, 6시간 후 세포를 회수하여 단백질을 추출하였다. 단백질 양의 확인은 Bradford법으로 실시하였다. 즉, HDF 세포를 회수한 후, 세포 내 단백질을 추출하여 정량하였다.
MMP-9의 양은 웨스턴 블러팅으로 실시하였다. 즉, 정량된 단백질은 브롬페놀 블루(bromophenol blue) 염색액과 섞은 후 10 % SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 전기영동하였다. 전기영동 후 폴리비닐리딘 플로라이드 막(밀리포아사)에 단백질을 전이시키고, 0.5% 탈지유가 포함된 TBS(Tris buffered saline)-tween 용액 (10 mM Tris. HCl, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.5)에 담궈 비특이적인 반응을 차단하였다.
이후 MMP-9에 대한 마우스의 항체(Upstate)를 1/600으로 희석한 용액과 상온에서 3시간 동안 반응시킨 다음, 2차 항체로서 항 마우스 IgG 항체를 이용하여 반응시켰다. 반응이 끝난 막을 TBS( Tris buffered saline)-tween 용액으로 4회 세척하고 ECL(enhanced chemiluminescence) 검출시약과 1분간 반응시킨 후 상온에서 X- 선 필름에 감광시켰다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, LPS만 처리한 대조군보다 본 발명에 따른 세포주 추출물을 함께 처리한 실험군에서 MMP-9의 신호가 감소되었음을 확인할 수 있었다.
6-3. 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 추출물의 MMP-2의 발현억제효과
LPS를 세포에 처리하는 경우, 염증 자극의 신호전달에 의한 생성물인 MMP-2가 증가되는 것으로 알려져 있다. 이에 HDK 세포에 실시예 2에서 수득한 세포주 추출물과 LPS를 처리하여, 본 발명에 따른 세포주 추출물이 MMP-2의 발현을 억제하는지 측정하는 실험을 수행하였다.
HDF 세포에 LPS 10㎍/㎖과 실시예 2에서 수득한 세포주 추출물 중 메탄올 추출물을 10~100㎍/㎖ 처리하였다. 이때, 바람직한 처리 양인 50㎍/㎖이다. 메탄올 추출물을 처리한 후, 3, 6, 24시간 후 세포를 회수하여 단백질을 추출하였다. 단백질 양의 확인은 Bradford법으로 실시하였다. 즉, HDF 세포를 회수한 후, 세포 내 단백질을 추출하여 정량하였다.
MMP-2의 양은 웨스턴 블러팅으로 실시하였다. 즉, 정량된 단백질은 브롬페놀 블루(bromophenol blue) 염색액과 섞은 후 10 % SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 전기영동하였다. 전기영동 후 폴리비닐리딘 플로라이드 막(밀리포아사)에 단백질을 전이시키고, 0.5% 탈지유가 포함된 TBS(Tris buffered saline)- tween 용액 (10 mM Tris. HCl, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.5)에 담궈 비특이적인 반응을 차단하였다.
이후 MMP-2에 대한 마우스의 항체(Upstate)를 1/600으로 희석한 용액과 상온에서 3시간 동안 반응시킨 다음, 2차 항체로서 항 마우스 IgG 항체를 이용하여 반응시켰다. 반응이 끝난 막을 TBS( Tris buffered saline)-tween 용액으로 4회 세척하고 ECL(enhanced chemiluminescence) 검출시약과 1분간 반응시킨 후 상온에서 X-선 필름에 감광시켰다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, LPS만 처리한 대조군보다 본 발명에 따른 세포주 추출물을 함께 처리한 실험군에서 MMP-2의 신호가 감소되었음을 확인할 수 있었다.
6-4. 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 추출물의 ICAM-1의 발현억제효과
HDF 세포에 실시예 2에서 수득한 세포주 메탄올 추출물과 LPS를 처리하여, 본 발명에 따른 세포주 추출물이 ICAM-1의 발현을 억제하는지 측정하는 실험을 수행하였다.
HDF 세포에 LPS 10㎍/㎖과 실시예 2에서 수득한 세포주의 추출물 중 메탄올 추출물을 10~100㎍/㎖ 처리하였다. 이때, 바람직한 처리 양인 50㎍/㎖이다. 메탄올 추출물을 처리하고, 1, 3, 6, 12 및 24시간 배양한 후 세포를 회수하여 단백질을 추출하였다. 단백질 양의 확인은 Bradford법으로 실시하였다. 즉, HDF 세포를 회수 한 후, 세포 내 단백질을 추출하여 정량하였다.
ICAM-1의 양은 웨스턴 블러팅으로 실시하였다. 즉, 정량된 단백질은 브롬페놀 블루(bromophenol blue) 염색액과 섞은 후 10 % SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 전기영동하였다. 전기영동 후 폴리비닐리딘 플로라이드 막(밀리포아사)에 단백질을 전이시키고, 0.5% 탈지유가 포함된 TBS(Tris buffered saline)-tween 용액 (10 mM Tris. HCl, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.5)에 담궈 비특이적인 반응을 차단하였다.
이후 ICAM-1에 대한 마우스의 항체(Upstate)를 1/600으로 희석한 용액과 상온에서 3시간 동안 반응시킨 다음, 2차 항체로서 항 마우스 IgG 항체를 이용하여 반응시켰다. 반응이 끝난 막을 TBS( Tris buffered saline)-tween 용액으로 4회 세척하고 ECL(enhanced chemiluminescence) 검출시약과 1분간 반응시킨 후 상온에서 X-선 필름에 감광시켰다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, LPS만 처리한 대조군보다 본 발명에 따른 세포주 추출물을 함께 처리한 실험군에서 ICAM-1의 신호가 감소되었음을 확인할 수 있었다.
ICAM-1은 내피세포(endothelial cells) 표면에서 발현되는 세포부착물질군의 대표적인 단백질으로, 정상적인 경우 매우 낮은 수준으로 발현되나, TNF-α, 인테페론-γ, 인터루킨-1β 등 싸이토카인류 염증매개물질에 의하여 자극을 받으면, 발현량이 급속히 증가되어 혈류 중 이동하는 단핵구나 임파구 등 염증세포를 부착하고 염증세포가 염증발생 조직으로 이동하는데 역할을 한다고 알려진 것으로 [Wegner C. D. et al, Science, 247(1941):456, 1990; Dustin, M. L. et al, J. Immunol., 137(1):245, 1986], ICAM-1의 발현은 염증세포가 염증발생 부위로 이동 및 집속하는 초기에 작용을 하며 염증반응의 증폭작용에 중요한 작용을 한다. 따라서, 본 발명에 따른 세포주의 처리에 의하여 이러한 ICAM-1의 발현이 억제되는 것으로 나타난 바, 본 발명에 따른 조성물은 염증을 억제 및 예방하는 효과가 있음을 알 수 있었다.
실시예 7: 세포 독성 실험
본 발명에 따른 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 독성여부를 확인하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.
인간 섬유아세포는 (Normal human dermal fibroblast, NHDF)는 MCTT사 (한국)에서 구입하였으며 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지(Welgene, 한국)에서 배양하였다. 섬유아세포를 1×104/(96 well)를 접종하고 12시간 배양한 후, 실시예 2에서 수득한 주목의 형성층 유래 세포주의 DMSO 추출물을 1ppm, 10ppm 및 100ppm의 농도로 및 실시예 2에서 세포주를 제거하고 수득한 배양액을 1, 5 및 10 부피%의 농도로 FBS 무첨가 DMEM배지에 24시간 처리하였다. 이때, 대조군(N)은 시료를 처리하지 않았다. 섬유아세포의 생존율은 WST-1 용액 10%를 포함한 FBS 무첨가 DMEM에서 2시간 배양한 후 450 nm의 흡광도로 측정하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 주목의 형성층 유래 세포주의 DMSO 추 출물은 실험범위에서 세포의 생존율을 감소시키지 않는 것으로 측정되었으며, 배양액의 경우 10%에서 생존율이 약간 감소하는 것으로 나타났다. 세포활성도가 80% 이하인 경우에 세포독성이 있다고 판단하는바, 실험범위에서 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 배양액은 세포독성이 없는 것으로 나타났다.
실시예 8: 자외선 조사에 의하여 발생하는 활성산소종 제거 효과 확인
본 발명에 따른 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 항산화 활성 및 항노화 활성을 측정하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.
먼저 인간 각질형성세포주(HaCaT: German Cancer Research Institute, Heidelberg, Germany)는 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 3×104/(96 well)를 접종하고 12시간 배양하여 부착하고, 시료로 실시예 2의 주목의 형성층 및 전형성층 유래 세포주의 DMSO 추출물을 1, 10, 25 및 50 ppm의 농도로, 그리고 실시예 2의 배양액을 0.1 및 1부피%의 농도로 FBS 무첨가 DMEM배지에 첨가하여 3시간 처리하였다. 이때, 양성대조군으로서 NAC (N-acetyl-cysteine)을 10mM 처리하였으며, 추가 대조군으로서 주목나무의 DMSO 추출물을 1, 10, 25 및 50 ppm의 농도로 처리하였다.
그 다음, HBSS 버퍼로 세척하고 DCF-DA 50 uM (HBSS)을 37℃에서 20분간 배양하였다. 다시 HBSS 버퍼로 2회 세척하고 HBSS 30 ul를 첨가하여 365 nm 200 mJ/cm2를 조사하였다. 37℃에서 2시간 배양 후 형광도 (excitation, 485 nm;emission, 535nm, Infinite M-200, Tecan)를 측정하고, WST-1 용액을 이용하여 생존율을 측정하여 보정하였다. 시료의 활성산소종 제거 효과는 자외선 조사를 하지 않는 군의 형광도를 100으로 하여 자외선 조사군과 비교하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 세포주의 DMSO 추출물 및 배양액을 처리한 경우 자외선에 의하여 유도된 활성산소종을 제거하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다(세포주 추출물의 경우 전형성층 유래 세포주 추출물 및 형성층 유래 세포주 추출물의 측정값의 평균값으로 기재함). 특히 대조군인 주목나무 추출물의 경우 자외선 처리 시 시료 미처리군(0ppm 첨가군)의 측정값 대비 시료 첨가시 측정값의 감소율을 산정하였을 때 44% (1ppm), 55%(10ppm), 48%(25ppm) 및 56%(50ppm)과 같이 감소한 것에 비하여, 본 발명에 따른 세포주 추출물의 경우 자외선 처리 시 시료 미처리군(0ppm 첨가군)의 측정값 대비 시료 첨가시 측정값의 감소율을 살펴보았을 때, 62% (1ppm), 70%(10ppm), 73%(25ppm), 70%(50ppm)과 같이 더 현저한 감소값을 보여 본 발명에 따른 세포주의 경우 주목나무에 비하여 훨씬 강력한 항산화 효과를 가짐을 확인할 수 있었다.
실시예 9: 자외선 조사에 의하여 유도되는 콜라겐분해효소 ( MMP -1) 생성 억제효과 확인
본 발명에 따른 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 노화방지 활성을 측정하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.
먼저 섬유아세포(MCTT사, 한국)를 2×104/(24 well)로 접종하고 12시간 배양하여 부착 후 FBS 무첨가 DMEM 배지에서 12시간 starvation하였다. DPBS 버퍼로 세척하고 365 nm 100 mJ/cm2를 조사하였다. 그리고, 시료로 실시예 2의 주목의 형성층 및 전형성층 유래 세포주의 DMSO 추출물을 50 및 25ppm의 농도로, 그리고 실시예 2의 배양액을 1 및 0.1%의 농도로 FBS 무첨가 DMEM배지에서 농도별로 24시간 처리하였다. 이때, 양성대조군으로서 RA(Retinoic acid)을 1μM 처리하였으며, 추가 대조군으로서 주목나무 추출물을 50 및 25ppm의 농도로 처리하였다. 그 후, 배지를 회수하여 원심분리하고 상징액 중의 MMP-1의 양을 ELISA (Amersham) 방법으로 정량하였다. WST-1 용액을 이용하여 생존율을 측정하여 보정하였다.
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 세포주 배양액의 경우 MMP-1 생성 억제효과가 우수한 것으로 확인되었다(세포주 추출물의 경우 전형성층 유래 세포주 추출물 및 형성층 유래 세포주 추출물의 측정값의 평균값으로 기재함). 특히 대조군인 주목나무 추출물 및 노화방지 효과가 우수한 것으로 알려진 RA와 대비하여서도 MMP-1 억제효과가 매우 우수한 것으로 나타나 노화방지용 화장료 조성물로서 특히 유용한 것으로 나타났다.
실시예 10: 세포 내 멜라닌 생성 ( melanogenesis ) 억제 효과
본 발명에 따른 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 미백 활성을 측정하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.
먼저 Murine melanoma (B-16 F1)(한국세포주은행, 한국)는 10% FBS가 함유된 DMEM 배지로 6-well plate에 well당 1×105 개로 접종한 후, 5% CO2, 37℃하에서 세포가 well 바닥에 약 80% 부착될 때까지 배양하였다. 배지를 제거하고, 시료로서 실시예 2의 주목의 형성층 및 전형성층 유래 세포주 DMSO 추출물이 1 및 10 ppm으로 첨가되고 실시예 2의 배양액이 0.05, 0.1 및 1%의 농도로 희석된 배지로 교체한 후 5% CO2, 37℃하에서 일정시간 배양하였다. 이때, 양성대조군으로서 Kojic acid를 1mM 처리하였으며, 음성대조군(도 13의 대조군)은 시료미첨가군으로 하였다.배지를 제거한 세포를 PBS로 세척하고, 이것을 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. 세포 펠렛(pellet)은 10% DMSO가 함유된 1M NaOH 100 ul를 넣어 세포 내 멜라닌을 얻었다. 이 액을 마이크로플레이트 리더(microplate reader: Tecan Infinite M200, Austria)로 490nm에서 흡광도를 측정하여 일정단백질 당 멜라닌 양을 구하였다. 단백질 정량은 Bradford 방법을 사용하였다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 배양액의 경우 멜라닌의 생성이 억제된 것을 확인할 수 있었다(세포주 추출물의 경우 전형성층 유래 세포주 추출물 및 형성층 유래 세포주 추출물의 측정값의 평균값으로 기재함). 특히 세포주 추출물 1ppm 처리 시와 배양액을 처리한 경우에는 미백 효과로 알려진 Kojic acid와 거의 유사한 멜라닌 생성 억제 효과를 얻을 수 있었는바, 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 배양액이 미백용 화장 조성물로서 매우 유용한 것으로 나타났다.
실시예 11: 약학제제 제조예
제제예 1. 정제의 제조
실시예 2에서 제조된 세포주 추출물 100㎎을 옥수수 전분 100㎎, 유당 100㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2㎎을 혼합하여 통상의 정제제조방법에 따라 제조하였다.
제제예 2. 캡슐제의 제조
실시예 2에서 제조된 세포주 추출물 500㎎을 연질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 3. 시럽제의 제조
실시예 1에서 제조된 세포주 1g, 이성화당 10g, 만니톨 5g, 적량의 정제수의 함량으로 통상적인 액제제의 제조방법에 따라 100㎖의 시럽제를 제조하였다.
제제예 4. 주사제의 제조
실시예 2에서 제조된 세포주 추출물 200㎎을 폴리옥시에틸렌 수소화 카스트로 오일을 함유하는 생리 식염수 200㎎에 가열 용해시켜 혼합 추출물을 0.1%의 농도로 함유하는 주사제를 제조하였다.
실시예 12: 기능성 식품의 제조 : 기능성 음료의 제조
제조예 1.
실시예 1에서 제조한 세포주 200㎎을 96㎖의 물에 용해시킨 후 보조제로서 비타민 C 500㎎, 교미제로서 구연산, 올리고당을 각각 1g 가하고, 보존재로서 나트 륨벤조에이트 0.05g을 가한 후 정제수를 가하여 전량을 100㎖로 만들어 기능성 음료를 제조하였다.
제조예 2.
실시예 2에서 제조한 세포주 추출물 200㎎을 96㎖의 물에 용해시킨 후 보조제로서 비타민 C 500㎎, 교미제로서 구연산, 올리고당을 각각 1g 가하고, 보존재로서 나트륨벤조에이트 0.05g을 가한 후 정제수를 가하여 전량을 100㎖로 만들어 기능성 음료를 제조하였다.
실시예 13: 기능성 화장품의 제조
제조예 1. 유액의 제조
실시예 2에서 제조한 세포주 추출물 6.2mg, 1,3-부틸렌 글리콜 6.5mg, 글리세린 1.2mg, D-판테놀 0.2mg, 에탄올 3.0mg, 카보머 0.1mg, 스테아릭애씨드 1.5mg, 폴리소르베이트 60 0.7mg, 친유성 글리세릴스테아레이트 0.6mg, 소르비탄세스퀴올리에이트 0.3mg, 세테아릴 알코올 0.6mg, 스쿠알란 3.5mg, 카르릭릭/카프릭트리글리세라이드 3mg, 디메치콘 0.4mg, 방부제 소량, 조합향료 적량, 정제수 (총 100mg이 되도록 첨가)의 조성에 따라 통상의 방법으로 유액을 제조하였다.
제조예 2. 크림의 제조
실시예 2에서 제조한 세포주 추출물 5.0mg, 1,3-부틸렌 글리콜 7.0mg, 글리 세린 1.0mg, D-판테놀 0.1mg, 마그네슘알루미늄실리케이트 0.4mg, 스테아릭애씨드 2.0mg, 폴리소르베이트 60 1.5mg, 친유성 글리세릴스테아레이트 2.0mg, 소르비탄세스퀴올리에이트 1.5mg, 미네랄 오일 4.0mg, 세테아릴 알코올 3.0mg, 스쿠알란 3.8mg, 카르릭릭/카프릭트리글리세라이드 2.8mg, 디메치콘 0.4mg, 산탄 검 적량, 트리에탄올아민 적량, 토코페릴아세테이트 적량, 방부제 소량, 조합향료 적량, 정제수 (총 100mg이 되도록 첨가)의 조성에 따라 통상의 방법으로 크림을 제조하였다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 세포주의 유도과정, 전형성층 및 형성층의 층의 분리 후 모습 및 탈분화된 세포와 주목의 전형성층 및 형성층 유래 세포 간 비교를 나타내는 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 세포주로부터 단계별로 유효물질을 추출하는 공정도이다.
도 3은 피부 섬유아세포(HDF)에 H2O2로 처리하여 노화를 유도할 때, 본 발명에 따른 세포주 추출물의 항산화 활성을 나타내는 ROS 량을 비교 그래프와 DCFH 형광 촬영 사진이다 (p-WE: 전형성층 증류수 추출물, C-WE: 형성층 증류수 추출물).
도 4는 피부 섬유아세포(HDF)에 H2O2로 처리하여 노화를 유도할 때, 본 발명에 따른 세포주 추출물의 ERK 발현 억제능을 나타내는 사진이다 (p-WE: 전형성층 증류수 추출물, C-WE: 형성층 증류수 추출물).
도 5는 피부 섬유아세포(HDF)에 H2O2로 처리하여 노화를 유도할 때, 본 발명에 따른 세포주 추출물의 MnSOD 발현 유도능을 나타내는 사진이다 (P-WE: 전형성층 증류수 추출물).
도 6은 피부 섬유아세포(HDF)에 LPS를 처리하여 염증을 유도할 때, 본 발명에 따른 세포주 추출물의 IL-1β 발현 억제능을 나타내는 사진이다 (P-ME: 전형성층 메탄올 추출물, C-WE: 형성층 메탄올 추출물).
도 7은 피부 섬유아세포(HDF)에 LPS를 처리하여 염증을 유도할 때, 본 발명 에 따른 세포주 추출물의 MMP-9 발현 억제능을 나타내는 사진이다 (P-ME: 전형성층 메탄올 추출물).
도 8은 피부 섬유아세포(HDF)에 LPS를 처리하여 염증을 유도할 때, 본 발명에 따른 세포주 추출물의 MMP-2 발현 억제능을 나타내는 사진이다 (P-ME: 전형성층 메탄올 추출물).
도 9는 피부 섬유아세포(HDF)에 LPS를 처리하여 염증을 유도할 때, 본 발명에 따른 세포주 추출물의 ICAM-1 발현 억제능을 나타내는 사진이다 (P-ME: 전형성층 메탄올 추출물).
도 10은 본 발명에 따른 세포주 추출물 (주목의 형성층 유래 세포주의 DMSO 추출물)의 처리 시 섬유아세포 생존율을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 배양액의 자외선 조사에 의해 발생되는 활성산소종 제거 효과를 나타내는 그래프이다.
도 12는 자외선 조사하여 MMP-1를 유도할 때, 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 배양액의 MMP-1 생성억제효과를 나타내는 그래프이다.
도 13은 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 배양액의 B-16 melanoma 세포주에서 멜라닌 생성 억제효과를 나타내는 그래프이다.

Claims (27)

  1. 주목의 형성층 또는 전형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 항염증용 약학조성물:
    (a) 탈분화 과정을 거친 캘러스가 아닌, 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임; 및
    (b) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포주는 추가로 다음의 특징으로 가지는 것을 특징으로 하는 약학 조성물:
    (a) 현탁배양 시 단세포 상태로 존재함;
    (b) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스(shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐; 및
    (c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 얻어진 것임을 특징으로 하는 약학 조성물:
    (a) 주목의 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 수득하는 단계;
    (b) 상기 수득된 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 배양하여 형성층 또는 전형성층으로부터 증식되는 형성층 또는 전형성층의 층(cambium or procambium layer)과 상기 형성층 또는 전형성층 이외의 부분으로부터 무정형으로 증식되는 캘러스 층을 유도하는 단계; 및
    (c) 상기 캘러스 층으로부터 형성층 또는 전형성층의 층(cambium layer)을 분리하여 형성층 또는 전형성층 유래 세포주를 수득하는 단계.
  4. 제3항에 있어서, 상기 세포주는 3~5중량%의 원당 또는 설탕; 및 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 진균류 추출물, 세균류 추출물, 효모(yeast) 추출물, 키토산, 글루코마난(glucomanan), 글루칸(glucan), 페닐알라닌(phenylalanine), 벤조산(benzoic acid), 살리실산(salicylic acid), 아라키돈산(arachonic acid), 스타우로스포린 (staurosporine, STS), 메발로나로네이트 N-벤조일글리신 (mevalonalonate N-benzolyglycine), 아브시스산 (abscisic acid, ABA), 나이트로프루사이드나트륨 (sodium nitroprusside, SNP), 이소펜테닐 피로인산 (isopentenyl pyrophosphate, IPP), 부틸레이티드 하이드록시 톨루엔 (butylated hydroxy toluene, BHT), 2-클로로에틸 트리메틸암모니움 클로라이드 (2-chloroethyl trimethylammonium chloride, CCC), 에테폰(ethephon), 히푸익산(hippuic acid), 암모니움 세릭 니트레이트(amminoium ceric nitrate), AgNO3, 바나딜 설페이트(vanadyl sulfate), p-아미노벤조익산(p-aminobenzoic acid), 브라시노스테로이드(brassinosteroids), 소디움 알지네이트(sodium alginate), 소디움 아세테이트(sodium acteate)로 구성되는 군에서 선택된 물질;을 포함하는 배지에서 추가로 배양된 것임을 특징으로 하는 약학 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 추출물은 증류수, 알코올, 아세톤, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 용매를 이용하여 추출한 것임을 특징으로 하는 약학 조성물.
  6. 주목의 형성층 또는 전형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 항산화 또는 노화방지용 화장료 조성물:
    (a) 탈분화 과정을 거친 캘러스가 아닌, 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임; 및
    (b) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨.
  7. 제6항에 있어서, 상기 세포주는 추가로 다음의 특징으로 가지는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물:
    (a) 현탁배양 시 단세포 상태로 존재함;
    (b) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스(shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐; 및
    (c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 조성물은 메갈로프로테인에이즈-1 (matrix metalloproteinase-1 , MMP-1) 생성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  9. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 얻어진 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물:
    (a) 주목의 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 수득하는 단계;
    (b) 상기 수득된 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 배양하여 형성층 또는 전형성층으로부터 증식되는 형성층 또는 전형성층의 층(cambium or procambium layer)과 상기 형성층 또는 전형성층 이외의 부분으로부터 무정형으로 증식되는 캘러스 층을 유도하는 단계; 및
    (c) 상기 캘러스 층으로부터 형성층 또는 전형성층의 층(cambium layer)을 분리하여 형성층 또는 전형성층 유래 세포주를 수득하는 단계.
  10. 제9항에 있어서, 상기 세포주는 3~5중량%의 원당 또는 설탕; 및 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 진균류 추출물, 세균류 추출물, 효모(yeast) 추출물, 키토산, 글루코마난(glucomanan), 글루칸(glucan), 페닐알라닌(phenylalanine), 벤조산(benzoic acid), 살리실산(salicylic acid), 아라키돈산(arachonic acid), 스타우로스포린 (staurosporine, STS), 메발로나로네이트 N-벤조일글리신 (mevalonalonate N-benzolyglycine), 아브시스산 (abscisic acid, ABA), 나이트로프루사이드나트륨 (sodium nitroprusside, SNP), 이소펜테닐 피로인산 (isopentenyl pyrophosphate, IPP), 부틸레이티드 하이드록시 톨루엔 (butylated hydroxy toluene, BHT), 2-클로로에틸 트리메틸암모니움 클로라이드 (2-chloroethyl trimethylammonium chloride, CCC), 에테폰(ethephon), 히푸익산(hippuic acid), 암모니움 세릭 니트레이트(amminoium ceric nitrate), AgNO3, 바나딜 설페이트(vanadyl sulfate), p-아미노벤조익산(p-aminobenzoic acid), 브라시노스테로이드(brassinosteroids), 소디움 알지네이트(sodium alginate), 소디움 아세테이트(sodium acteate)로 구성되는 군에서 선택된 물질;을 포함하는 배지에서 추가로 배양된 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  11. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 추출물은 증류수, 알코올, 아세톤, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 용매를 이용하여 추출한 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  12. 주목의 형성층 또는 전형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 미백용 화장료 조성물:
    (a) 탈분화 과정을 거친 캘러스가 아닌, 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임; 및
    (b) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨.
  13. 제12항에 있어서, 상기 추출물은 증류수, 알코올, 아세톤, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 용매를 이용하여 추출한 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  14. 주목의 형성층 또는 전형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 항산화 기능성 식품:
    (a) 탈분화 과정을 거친 캘러스가 아닌, 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임; 및
    (b) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨.
  15. 제14항에 있어서, 상기 추출물은 증류수, 알코올, 아세톤, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 용매를 이용하여 추출한 것임을 특징으로 하는 기능성 식품.
  16. 주목의 형성층 또는 전형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 노화방지용 기능성 식품:
    (a) 탈분화 과정을 거친 캘러스가 아닌, 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임; 및
    (b) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨.
  17. 제16항에 있어서, 상기 추출물은 증류수, 알코올, 아세톤, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 용매를 이용하여 추출한 것임을 특징으로 하는 기능성 식품.
  18. 주목의 형성층 또는 전형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 항염증 화장료 조성물:
    (a) 탈분화 과정을 거친 캘러스가 아닌, 선천적인 미분화 상태(innately undifferentiated)임; 및
    (b) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨.
  19. 제18항에 있어서, 상기 세포주는 추가로 다음의 특징으로 가지는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물:
    (a) 현탁배양 시 단세포 상태로 존재함;
    (b) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스(shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐; 및
    (c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 얻어진 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물:
    (a) 주목의 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 수득하는 단계;
    (b) 상기 수득된 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 배양하여 형성층 또는 전형성층으로부터 증식되는 형성층 또는 전형성층의 층(cambium or procambium layer)과 상기 형성층 또는 전형성층 이외의 부분으로부터 무정형으로 증식되는 캘러스 층을 유도하는 단계; 및
    (c) 상기 캘러스 층으로부터 형성층 또는 전형성층의 층(cambium layer)을 분리하여 형성층 또는 전형성층 유래 세포주를 수득하는 단계.
  21. 제20항에 있어서, 상기 세포주는 3~5중량%의 원당 또는 설탕; 및 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 진균류 추출물, 세균류 추출물, 효모(yeast) 추출물, 키토산, 글루코마난(glucomanan), 글루칸(glucan), 페닐알라닌(phenylalanine), 벤조산(benzoic acid), 살리실산(salicylic acid), 아라키돈산(arachonic acid), 스타우로스포린 (staurosporine, STS), 메발로나로네이트 N-벤조일글리신 (mevalonalonate N-benzolyglycine), 아브시스산 (abscisic acid, ABA), 나이트로프루사이드나트륨 (sodium nitroprusside, SNP), 이소펜테닐 피로인산 (isopentenyl pyrophosphate, IPP), 부틸레이티드 하이드록시 톨루엔 (butylated hydroxy toluene, BHT), 2-클로로에틸 트리메틸암모니움 클로라이드 (2-chloroethyl trimethylammonium chloride, CCC), STS, mevalonalonate N-benzolyglycine, ABA, SNP, IPP, BHT, CCC, 에테폰(ethephon), 히푸익산(hippuic acid), 암모니움 세릭 니트레이트(amminoium ceric nitrate), AgNO3, 바나딜 설페이트(vanadyl sulfate), p-아미노벤조익산(p-aminobenzoic acid), 브라시노스테로이드(brassinosteroids), 소디움 알지네이트(sodium alginate), 소디움 아세테이트(sodium acteate)로 구성되는 군에서 선택된 물질;을 포함하는 배지에서 추가로 배양된 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  22. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 추출물은 증류수, 알코올, 아세톤, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 용매를 이용하여 추출한 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  23. 주목의 형성층 또는 전형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 항염증 기능성 식품:
    (a) 탈분화 과정을 거친 캘러스가 아닌, 선천적인 미분화 상태(innately undifferentiated)임; 및
    (b) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨.
  24. 제23항에 있어서, 상기 세포주는 추가로 다음의 특징으로 가지는 것을 특징으로 하는 기능성 식품:
    (a) 현탁배양 시 단세포 상태로 존재함;
    (b) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스(shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐; 및
    (c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 얻어진 것임을 특징으로 하는 기능성 식품:
    (a) 주목의 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 수득하는 단계;
    (b) 상기 수득된 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 배양하여 형성층 또는 전형성층으로부터 증식되는 형성층 또는 전형성층의 층(cambium or procambium layer)과 상기 형성층 또는 전형성층 이외의 부분으로부터 무정형으로 증식되는 캘러스 층을 유도하는 단계; 및
    (c) 상기 캘러스 층으로부터 형성층 또는 전형성층의 층(cambium layer)을 분리하여 형성층 또는 전형성층 유래 세포주를 수득하는 단계.
  26. 제25항에 있어서, 상기 세포주는 3~5중량%의 원당 또는 설탕; 및 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 진균류 추출물, 세균류 추출물, 효모(yeast) 추출물, 키토산, 글루코마난(glucomanan), 글루칸(glucan), 페닐알라닌(phenylalanine), 벤조산(benzoic acid), 살리실산(salicylic acid), 아라키돈산(arachonic acid), 스타우로스포린 (staurosporine, STS), 메발로나로네이트 N-벤조일글리신 (mevalonalonate N-benzolyglycine), 아브시스산 (abscisic acid, ABA), 나이트로프루사이드나트륨 (sodium nitroprusside, SNP), 이소펜테닐 피로인산 (isopentenyl pyrophosphate, IPP), 부틸레이티드 하이드록시 톨루엔 (butylated hydroxy toluene, BHT), 2-클로로에틸 트리메틸암모니움 클로라이드 (2-chloroethyl trimethylammonium chloride, CCC), 에테폰(ethephon), 히푸익산(hippuic acid), 암모니움 세릭 니트레이트(amminoium ceric nitrate), AgNO3, 바나딜 설페이트(vanadyl sulfate), p-아미노벤조익산(p-aminobenzoic acid), 브라시노스테로이드(brassinosteroids), 소디움 알지네이트(sodium alginate), 소디움 아세테이트(sodium acteate)로 구성되는 군에서 선택된 물질;을 포함하는 배지에서 추가로 배양된 것임을 특징으로 하는 기능성 식품.
  27. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 추출물은 증류수, 알코올, 아세톤, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 용매를 이용하여 추출한 것임을 특징으로 하는 기능성 식품.
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