KR101402289B1 - 새싹땅콩 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부손상 예방 또는 치료용 약학조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 새싹땅콩 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부손상 예방 또는 치료용 약학조성물 및 자외선에 의한 피부손상 예방 또는 개선용 식품을 제공한다.

Description

새싹땅콩 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부손상 예방 또는 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating skin damage by ultraviolet comprising extract of peanut sprout as effective component}

본 발명은 새싹땅콩 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부손상 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 새싹땅콩 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부손상 예방 또는 치료용 약학조성물 및 자외선에 의한 피부손상 예방 또는 개선용 식품에 관한 것이다.

땅콩은 원산지가 남미의 안데스 지방으로, 지방과 단백질이 많이 함유되어 있으며 비타민 및 미네랄이 풍부하다. 이러한 땅콩이 새싹으로 발아하는 과정에서 지방 및 칼로리는 낮아지고 땅콩에 없는 비타민 C가 생성되는 한편, 땅콩에 미량으로 존재하는 레스베라트롤(resveratrol)이라는 항암 장수물질이 대량으로 증가한다. 새싹 채소는 씨앗에서 싹이 튼 후 1주일 정도 자란 어린 채소로서, 작고 여리지만 영양덩어리로 알려져 있다. 싹이 돋아나는 시기의 식물은 앞으로의 성장을 위해 필요한 물질들을 왕성하게 만들어 내기 때문에, 자연히 새싹 채소에는 생명 유지에 필요한 많은 영양소가 응축되어 있어 어른 채소보다 비타민 및 미네랄 함량이 서너 배 이상 많다. 식물체의 발아 과정은 높은 에너지가 소비되는 매우 활동적인 세포 기작을 필요로 하고, 따라서 세포 내의 산화적 스트레스가 극도로 높아지게 된다. 그 결과로, 땅콩을 포함한 많은 식물체들은 새싹 발아기간 동안 산화적 손상으로부터 그들을 보호하기 위해 원래 식물체보다 높은 수준의 항산화제를 발현하는 것으로 보고되었다(Yao et al., 2010 Arch Med Res. 41, 288-294). 새싹땅콩(peanut sprout, PS)은 다양한 아미노산, 당, 단백질, 지방산 및 비타민을 함유하고, 항염증작용, 항산화작용, 노화 방지 및 항암작용 같은 다양한 기능을 한다.

새싹땅콩에 함유된 폴리페놀 화합물 중 하나인 레스베라트롤(resveratrol)은 많은 질병 및 암에 대한 치료, 항산화작용, 항염증반응, 면역조절 및 화학적 보호기작 등에 응용될 수 있는 강력한 항산화 작용 및 세포보호 작용을 하는 것으로 알려져 있다(Athar et al., 2007 Toxicol Appl Parmacol. 224, 274-283). 레스베라트롤은 포도, 적포도주, 땅콩 및 베리 등에 존재한다. 적포도주의 심장병 예방 물질로 알려진 레스베라트롤은 적포도주(0.001-0.15ug/g)에 비해 새싹땅콩을 포함한 땅콩뿌리에 수십 배에서 수백 배 이상(0.62-0.91ug/g) 더 함유되어 있다는 것이 대만 국립자이대학 분자생물화학과의 연구진에 의해 밝혀지면서 새싹땅콩이 새롭게 주목을 받은 바 있다.

새싹땅콩의 에탄올 추출물(Ethanol extract of peanut sprout, EPS)은 레스베라트롤 같은 세포보호 물질을 땅콩에 비해 비교적 높은 함량으로 함유하고 있기 때문에 강력한 세포 보호 기능을 할 것으로 예상되었다. 게다가 새싹땅콩 에탄올 추출물은 기후, 계절 및 지리적 조건에 의해 재배의 영향을 받는 포도와 달리, 재배 및 제조의 제한이 없으며 비교적 높은 함량의 레스베라트롤을 함유하고 있기 때문에 레스베라트롤 함유 식물체의 대체원으로 이용될 수 있다.

태양의 자외선은 살균이나 소독작용을 하여 인체에 비타민 D 생성을 도와주지만, 자외선이 피부에 조사되면 자외선의 에너지에 의해 활성산소가 생성된다. 지나친 자외선에 의해 과량으로 생성된 활성산소는 피부 진피층에서 생성된 콜라겐 및 엘라스틴과 같은 섬유질 및 히아루론산을 파괴하여 피부를 건조하게 하거나, 심하면 피부염에 이르게 할 수도 있다. 이러한 활성산소의 작용을 차단 또는 감소시키는 인체 내 방어 기전을 항산화 기전이라고 하는데, 상기 항산화 방어 기전을 수행하기 위해 항산화 효소가 관여한다. 체내에서 만들어지는 항산화 물질을 항산화 효소라 하며 항산화 효소가 만들어지는 과정에서 화학작용을 하여 활성산소를 제거한다. 체내에서 합성되는 항산화 관련 효소에는 SOD(superoxide dismutase), CAT(catalase) 및 GPx(glutathione peroxidase) 등의 기본 항산화 효소가 있으며, HO-1(heme oxygenase-1), NQO-1(NAD(P)H quinine oxidoreductase-1), GST(glutathione-S-transferase) 및 다른 phase II 효소를 포함하는 해독화 효소가 있다. 또한, 상기 효소들은 주로 Nrf-2(NF-E2-related factor) 및 항산화 연관 요소(ARE) 경로에 의해 활동적으로 조절되기 때문에 Nrf2-연관 항산화 효소 및 해독화 효소로 분류되었다.

상기 배경지식으로, 본 발명자는 정상 섬유모세포(Normal dermal fibroblasts, HDFs)에서 산화적 스트레스에 의한 EPS의 세포 보호 기작을 측정했다. 자외선 파장에 의해 HDF 세포에 산화적 스트레스를 주었고, 그 후에 EPS의 세포보호 기작을 측정한 결과, 자외선에 조사된 HDF 세포에서 EPS가 활성산소를 억제하며, 항산화 관련 효소의 발현을 유도함으로써 자외선 유도 산화적 스트레스에 대응하는 강력한 항산화 작용을 하는 것을 확인하였다. 이는 EPS에 함유되어 있는 비교적 높은 함량의 레스베라트롤에 기인한 것으로 여겨진다.

한편, 한국공개특허 제2009-0078203호에는 '새싹땅콩 추출물 및 이를 함유한 식품 조성물, 화장품 조성물, 의약품 조성물'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2007-0016660호에는 '새싹땅콩 음료 및 그 제조방법'이 개시되어 있다. 그러나 본 발명에서와 같이, 새싹땅콩 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부손상 예방 또는 치료용 약학조성물에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 새싹땅콩 에탄올 추출물(EPS)을 처리한 정상 피부세포인 섬유모세포(HDF)에 자외선을 조사한 결과, 새싹땅콩 에탄올 추출물을 처리하지 않은 대조구 세포에서보다 항산화 관련 효소 발현이 증가하였고, 활성산소 발생이 억제되는 것을 확인하였는데, 이를 통해 본 발명의 새싹 땅콩 에탄올 추출물이 자외선에 의한 피부손상 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 새싹땅콩의 용매 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부손상 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 새싹땅콩의 용매 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부손상 예방 또는 개선용 식품을 제공한다.

본 발명의 새싹땅콩 에탄올 추출물은 강력한 항산화 작용을 통해서 자외선에 의한 산화적 스트레스에 대응하는 잠재적 세포 보호 작용을 하는 것을 확인하였다. 본 발명의 새싹땅콩 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학조성물은 천연재료로부터 얻어진 물질로 세포독성이 없으며, 자외선을 포함하는 다양한 산화적 스트레스로부터 피부를 보호할 수 있는 항산화 효과가 뛰어나, 자외선에 의한 피부손상의 예방 및 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 HPLC를 이용한 EPS의 레스베라트롤 정량 분석을 나타낸다. EPS 내의 레스베라트롤 함량을 측정하기 위하여, 1ml EPS 스톡을 9ml 에탄올에 용해시킨 후, 여과시켰고, 그 후에 HPLC로 분석하였다. 표준 트랜스-레스베라트롤은 Sigma-Aldrich 사에서 구입하였고, 표준 물질로 이용되었다.
도 2는 자외선에 의한 HDF 세포의 세포사로부터 EPS의 보호 작용을 나타낸다. HDF 세포에 산화적 스트레스를 주기 위하여 50mJ/cm² 자외선에 조사시켰고, 24시간 후에 Annexin V로 염색 후 유동 세포측정기(flow cytometry)를 이용하여 세포사 정도를 정량하였다. (A)는 자외선을 조사하지 않은 정상 세포, (B)는 자외선을 조사한 세포, (C)는 EPS를 처리하고 자외선을 조사한 세포를 나타낸다.
도 3은 HDF 세포에서 EPS의 상향조절(up-regulation)에 의한 항산화 관련 효소의 발현 수준을 나타낸다. EPS가 처리된 세포 및 EPS가 처리되지 않은 세포(대조군) 사이의 항산화 관련 효소의 발현 수준을 비교하기 위하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. (A)는 EPS가 처리된 세포 및 EPS가 처리되지 않은 HDF 세포에서 항산화 관련 효소의 발현 수준을 나타낸다. (B)는 항산화 관련 효소의 발현을 덴시토미트리(densitometry)로 측정한 결과 그래프를 나타낸다(*p < 0.05, *p < 0.01).
도 4는 HDF 세포 내의 활성산소를 측정하기 위한 FACS 분석을 나타낸다. FACS 분석은 DCF-DA 양성세포를 측정하여 수행되었다. (A)는 자외선을 조사하지 않은 정상 HDF 세포, (B)는 자외선을 조사한 HDF 세포, (C)는 EPS를 처리하고 자외선을 조사한 HDF 세포를 나타낸다. 자외선 조사에 의한 DCF-DA 양성 세포(B)는 EPS 처리에 의해 급격하게 감소되었다(C).
도 5는 HDF 세포에서 자외선 조사에 의한 활성산소 생성이 EPS에 의해 억제됨을 나타낸다. HDF 세포를 50mJ/cm² 자외선에 조사시킨 후, 공초점 미세현미경에 의한 세포 내 활성산소 측정을 위해 DCF-DA 염료로 세포를 염색하였다. (A)는 자외선을 조사하지 않은 대조군 HDF 세포, (B)는 EPS를 처리하지 않고 자외선을 조사한 HDF 세포, (C)는 EPS를 처리하고 자외선을 조사한 HDF 세포를 나타낸다. 공초점 미세현미경 관찰을 통해, DCF-DA 양성 형광은 (A) 및 (C)에서는 약하게 검출되었으나, (B)에서는 강하게 검출되었다.
도 6은 건강한 사람에서 EPS의 안정성 평가를 나타낸다. 5% EPS 연고(위) 및 2.5% 팩(아래)을 제조하여 팔 안쪽에 하루에 2회씩 적용한 후 2주 동안 홍반 및 가려움증에 대한 부작용을 검사한 결과를 나타내었다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 새싹땅콩의 용매 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부손상 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 새싹땅콩은 혈중 콜레스테롤을 저하시켜주는 올레인산, 신경 전달물질 아세틸콜린의 원료가 되어 기억력을 증진시켜 주는 레시틴, 체내에 지방산의 산화를 억제함으로써 노화와 동맥경화를 막아주는 비타민-E 및 알코올 대사를 도와주는 나이아신이 풍부하고, 그 밖에 비타민-B1, B2도 함유되어 있으며, 땅콩에 비해 지방이 10분의 1에 불과하고 식이섬유가 많이 포함되어 있어 특히 영양 불균형이 심각한 현대인에게 적합한 식품으로 각광받고 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 약학조성물에서, 상기 용매는 물, C_{1 -4} 알콜 또는 이의 혼합 용매일 수 있으며, 바람직하게는 에탄올일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "추출물(extract)"은 천연물로부터 분리된 활성성분을 의미하며, 물, 유기 용매, 또는 이들의 혼합 용매를 이용하는 추출과정으로 획득할 수 있으며, 추출액, 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다. 추출한 액은 바로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 유기 용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올,에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르,클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매인 유기용매를 사용하며 새싹땅콩 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 약재의 유효성분의 추출 정도와 손실 정도가 차이날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 추출방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 열수 추출, 냉침 추출, 초음파 추출, 및 환류 추출 등이 있다.

상기 용매 추출물은 부유하는 고체 입자를 제거하기 위하여 추출물을 여과시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러내거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

추출액을 농축할 경우에는, 감압농축, 역삼투압 농축 등의 방법이 사용될 수 있다. 농축 후 건조 단계는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 약학조성물에서, 상기 새싹땅콩 에탄올 추출물은 건조 후 분쇄한 새싹땅콩 분말 15-20%를 25-35%(w/v) 에탄올 용액에 용해시킨 후, 저온에서 농축하여 제조될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 건조 후 분쇄한 새싹땅콩 분말 10%를 30%(w/v) 에탄올 용액에 용해시킨 후 60℃ 이하의 저온 감압농축 추출 방법으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 약학조성물에서, 상기 새싹땅콩 추출물은 HO-1(heme oxygenase-1), NQO-1(NAD(P)H quinine oxidoreductase-1), GSTpi(glutathione-S-transferase-pi), MnSOD(manganese superoxide dismutase) 및 Trx(thioredoxin)의 항산화 관련 효소의 발현을 유도할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "항산화 관련 효소"란 지질과산화반응을 억제하는 물질로서, 수퍼옥시드음이온 및 과산화수소 등의 활성산소의 작용을 소거 또는 감쇠시키는 물질이다. 항산화 관련 효소는 O₂-, H₂O₂, OH 등의 독성을 탈독성화 시키거나 억제시키는 기능을 지니고 있다. 항산화 관련 효소에 의한 항산화작용은 활성산소의 유해성을 억제하여 세포 내 DNA의 손상을 막아주기 때문에, 노화 방지 및 암과 같은 유전자적 변이에 의한 각종 질병을 예방하고 개선시켜 주는 탁월한 면역 메카니즘이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 약학조성물에서, 상기 자외선에 의한 피부손상은 피부염, 피부암, 피부건조, 알레르기, 습진, 홍반반응, 색소침착, 일광화상, 광노화, 만성광선피부염, 일광두드러기, 광독성 접촉피부염, 광알레르기성 접촉피부염, 포르피린증, 홍반성낭창 또는 단순포진으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 자외선에 의한 피부손상 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 약학조성물 총 중량에 대하여 상기 새싹땅콩 에탄올 추출물을 0.02 내지 80 중량%, 바람직하게는 0.02 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.

본 발명의 새싹땅콩 에탄올 추출물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 새싹땅콩 에탄올 추출물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 새싹땅콩 에탄올 추출물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 팩제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물을 포함하는 약학조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 새싹땅콩 에탄올 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 새싹땅콩 추출물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

본 발명의 새싹땅콩 에탄올 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 새싹땅콩 에탄올 추출물을 연고기제(Ointment base)에 희석하여 국소도포제용 연고를 제조하여 하루에 2회씩 실험 대상자의 몸에 도포시킬 수 있으며, 겔제제에 희석한 국소도포제용 팩제를 제조하여 하루에 2회씩 병변 부위에 적용할 수 있다.

또한, 본 발명은 새싹땅콩의 용매 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부손상 예방 또는 개선용 식품을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식품에서, 상기 용매는 물, C_{1 -4} 알콜 또는 이의 혼합 용매일 수 있으며, 바람직하게는 에탄올일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식품에서, 상기 새싹땅콩 에탄올 추출물은 건조 후 분쇄한 새싹땅콩 분말 15-20%를 25-35%(w/v) 에탄올 용액에 용해시킨 후, 저온에서 농축하여 제조될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 건조 후 분쇄한 새싹땅콩 분말 10%를 30%(w/v) 에탄올 용액에 용해시킨 후 60℃ 이하의 저온 감압농축 추출 방법으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식품에서, 상기 새싹땅콩 추출물은 HO-1(heme oxygenase-1), NQO-1(NAD(P)H quinine oxidoreductase-1), GSTpi(glutathione-S-transferase-pi), MnSOD(manganese superoxide dismutase) 및 Trx(thioredoxin)의 항산화 관련 효소의 발현을 유도할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식품에서, 상기 자외선에 의한 피부손상은 피부염, 피부암, 피부건조, 알레르기, 습진, 홍반반응, 색소침착, 일광화상, 광노화, 만성광선피부염, 일광두드러기, 광독성 접촉피부염, 광알레르기성 접촉피부염, 포르피린증, 홍반성낭창 또는 단순포진으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 새싹땅콩 에탄올 추출물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 새싹땅콩 에탄올 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 새싹땅콩 에탄올 추출물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 구체적인 예로, 상기 새싹땅콩 에탄올 추출물을 이용하여 농산물, 축산물 또는 수산물의 특성을 살려 변형시키는 동시에 저장성을 좋게 한 가공식품을 제조할 수 있다. 이런 가공식품에는 예를 들어, 과자, 음료, 주류, 발효식품, 통조림, 우유가공식품, 육류가공식품, 국수 등을 포함한다. 과자는 비스킷, 파이, 빵, 캔디, 젤리, 껌, 시리얼(곡물푸레이크 등의 식사대용품류 포함) 등을 포함한다. 음료는 탄산음료, 기능성이온음료, 쥬스(예를 들어, 사과, 배,포도, 알로에, 감귤, 복숭아, 당근, 토마토쥬스 등), 식혜 등을 포함한다. 주류는 청주, 위스키, 소주, 맥주,양주, 과실주 등을 포함한다. 발효식품은 간장, 된장, 고추장 등을 포함한다. 통조림은 수산물 통조림(예를 들어, 참치, 고등어, 꽁치, 소라 통조림 등), 축산물 통조림(쇠고기, 돼지고기, 닭고기, 칠면조 통조림 등), 농산물 통조림(옥수수, 복숭아, 파인애플 통조림 등)을 포함한다. 우유가공식품은 치즈, 버터, 요구르트 등을 포함한다. 육류가공식품은 돈까스, 비프까스, 치킨까스, 소세지, 탕수육, 너겟류, 너비아니 등을 포함한다. 밀봉포장생면 등의 국수를 포함한다. 이 외에도 상기 조성물은 레토르트식품, 스프류 등에 사용될 수 있다.

또한, 상기 새싹땅콩 에탄올 추출물을 이용하여 기능성식품, 건강식품 또는 건강보조식품을 제조할 수 있다. 기능성식품, 건강식품 또는 건강보조식품은 영양 기능 외에도 생리활성 성분을 포함하여 생체조절 기능을 제공하는 식품을 의미하고, 본 발명의 새싹땅콩 에탄올 추출물은 자외선에 의한 피부 손상 예방 및 개선 효과를 가지는 천연 추출물을 유효 성분으로 포함하므로 기능성식품, 건강식품 또는 건강보조식품 등의 제조에 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 제한되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1) 새싹땅콩 에탄올 추출물( EPS ) 스톡 ( stock ) 및 EPS 용액 제조

재배 후 7일 된 새싹땅콩(Peanut Sprout)을 수확하여 건조시킨 후 열처리 및 재건조시켰고, 분쇄하여 새싹땅콩 분말로 제조했다. 새싹땅콩 분말의 10%를 70% 정제수 및 30%(w/v) 에탄올 용액에 용해시켰다. 그 후에 원심분리하여 땅콩 오일을 제거시켰고, 에탄올을 제거시킨 후, 새싹땅콩 에탄올 추출물(Ethanol extract of Peanut Sprout, EPS) 스톡 제조를 위해 60℃ 이하의 저온 감압농축 추출 방법으로 저온에서 농축시켰다. EPS 스톡은 0.1%부터 1%까지 각각 다른 농도의 희석된 EPS 용액 제조를 위해 PBS(phosphate buffered saline) 용액에 용해시켰다.

2) EPS 의 레스베라트롤 ( resveratrol ) 성분 결정

1ml EPS 스톡을 9ml 에탄올에 용해시키고, 0.45um 테플론 시린지 필터로 여과시킨 후에, HPLC(pump: jsaco PU-98, detector: jsaco UV-975, column: phenomenex (250 X 4.6 X 4 micron) C18, injected volume: 20mL, detected at 306 nm, flow rate: 0.6mL/min)에 주입하였다. 표준 트랜스-레스베라트롤(Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO)을 정량하였고, 표준 물질로 사용하였다.

3) 세포배양

정상 피부세포인 섬유모세포(Normal dermal fibroblasts, HDFs)의 초기배양은 신생아의 표피에서 절취한 피부를 무균상태에서 2×15mm 크기의 절편으로 만들어 2.4U/ml 디스페이즈(dispase, Boehriger Mannheim, Ingelhein, Germany)로 37℃ 에서 약 40분간 처리하여 표피 및 진피를 분리한 후 진피를 세절(chopping)하여 DMEM 배지(Gibco, Grand Island, NY)에 10% FBS(fetal bovine serum) 및 항생제(100U/ml penicillin 및 100mg/ml streptomycin)가 포함된 배지를 사용하여 배양하였다. 정상 섬유모세포는 2^nd-10^th 세대를 실험에 사용하였다.

4) FACS 를 이용한 세포 생존력( viability ) 분석

HDF 세포를 배양 용기(60mm)에 배양한 후 세포 상태가 70-80% 성장했을 때 EPS를 1시간 동안 전처리 한 후, PBS로 2번 세척 후 자외선(ultraviolet) 50mJ/cm²를 조사하였다. 자외선 조사 24시간 뒤 스크래퍼를 이용하여 세포를 포집한 후 Apoptosis detection Kit(BD Biosciences, Mountain View, CA)를 이용하여 세포 사(apoptosis)를 확인하였다. 세포를 0.5ml PBS로 현탁시킨 후 Annexin V-FITC(AV)로 5분 동안 염색한 후, 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide, PI)로 염색하였다. 분석은 유동 세포측정기(FACScalibur, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, excitation wavelength: 488nm, emission wavelength : 530nm)를 이용하여 분석하였다.

5) 항산화 관련 효소 발현에 대한 웨스턴 블랏 분석

HDF 세포에 적당량의 RIPA 용해 버퍼(50mM Tris-HCl[pH 7.4], 150mM NaCl, 0.25% deoxycholic acid, 1% NP-40, 1mM EDTA[pH8.0], protease inhibitor cocktail)를 넣고 소니케이터로 균질화한 후, 14,000rpm으로 4℃에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 취하였다. 단백질은 BCA Protein Assay Kit(Pierce, Rickford, IL)를 사용하여 정량하였다. 단백질 균질액 20㎍을 2X SDS 샘플 버퍼(20mM Tris-HCl[pH 6.8], 20% glycerol, 0.04% bromophenol blue, 2% β-mercaptoethanol, 4% SDS)에 넣은 다음 95℃ 이상에서 5분간 변성시킨 후 4℃에 5분간 두었다. 10% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동 후, 0.4㎛ 크기의 PVDF 막(Millipore, MA, U.S.A)으로 옮겨 블로킹(blocking) 용액(5% skim milk, 0.1% tween-20)으로 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 1차 항체인 항-HO-1(SPA-896, 1:2,000; Stressgen Bioreagents, Ann Arbor, MI), 항-NQO-1(ab28947, 1:1,000; Abcam, Cambridgeshire, UK), 항-GSTpi(ab-65977, 1;100; Abcam), 항-Trx(ab16835, 1:1,000, Abcam), 항-MnSOD(06-984, 1:1,000, Millipore, Temecula, CA), Nrf-2(SC-722, 1:200, Santa Cruz Biotechnology) 및 항-베타 액틴(ab-6276, 1:1,000; Abcam)을 4℃에서 밤새 반응시켰다. TBST(1X TBS, 0.1% Tween 20)로 15분씩 4회 세척한 후 각각 2차 항체인 항-토끼 다클론 항체(1:5,000, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA), 항-염소 다클론 항체(1:5,000, Jackson Immunoresearch) 및 항-마우스 단일클론 항체(1:5,000, Jackson Immunoresearch)를 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, TBST로 15분씩 4회 세척하였다. ECL kit(Amersham,UK)를 이용하여 발색시킨 후, luminescent image analyzer(LAS 3000, Fujifilm, Japan)로 확인하였다.

6) 유동 세포측정기( Flow cytometer )를 이용한 활성산소 측정

HDF 세포가 70-80% 성장했을 때 EPS를 40분간 전처리한 후 10uM DCF-DA(2'-7'-Dichloro Dihydrofluorescein Diacetate)로 염색하였고, 그 후 자외선 50mJ/cm²를 조사하였다. PBS로 2번 세척한 후 스크래퍼를 이용하여 세포를 포집한 후 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후 세포를 PBS로 현탁시켰다. EPS를 처리하고 자외선을 조사한 세포 및 자외선만을 조사한 세포를 유동 세포측정기로 측정하여 비교하였다.

7) 공초점 현미경관찰( Confocal microscopy)을 이용한 활성산소 측정

HDF 세포를 4웰(well) 슬라이드 챔버에 3×10³으로 분주한 후 세포가 70-80% 성장했을 때 EPS를 40분간 전처리하였다. 슬라이드 챔버를 PBS로 세척한 후 10uM DCF-DA로 30분간 염색하였다. PBS로 2번 세척한 후 자외선 50mJ/cm²를 조사하였다. 대조염색으로 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)를 이용하여 염색하였다. 공초점 현미경(Confocal microscopy, excitation : 492-495 nm, emission : 517-527 nm, LSM 510; Carl Zeiss, Jena, Germany) 20X 배로 세포에 염색된 형광을 확인하였으며, LSM 5 브라우저 이미징 소프트웨어(browser imaging software)로 분석하였다.

8) 임상시험

건강한 사람(10명)을 대상으로 5% EPS 연고 및 2.5% EPS 팩제를 제조하여 팔 안쪽에 하루에 2회씩 바르게 한 후 2주 동안 홍반 및 가려움증에 대한 부작용 및 안정성을 검사하였다. 왼쪽 팔에는 5% EPS 연고를 도포하고, 오른쪽 팔에는 2.5% EPS 팩을 적용시켰다. 국소도포제용 EPS 연고는 EPS를 연고기제(Ointment base)에 5% 농도로 희석하여 제조하였다. 국소도포제를 실험 대상자의 몸을 중심으로 오른쪽에 도포시켰다. 대조군으로 사용할 연고는 EPS가 포함되지 않고 연고기제만으로 제조한 연고를 사용하였다. 대조군 연고 도포는 국소도포제를 실험 대상자의 몸을 중심으로 왼쪽에 도포시켰다. 국소도포제용 EPS 팩은 EPS를 연고기제 대신 겔제제에 희석하였으며 팩의 특성상 밀폐되기 때문에 EPS를 5% 농도에서 2.5% 농도로 희석하여 제조하였다. 팩을 국소도포제와 마찬가지로 실험 대상자의 몸을 중심으로 오른쪽 부위에 하루에 2회씩 15분간 적용시켰고, 2주 후에 증상변화를 평가하였다. 대조군은 EPS가 포함되지 않은 기본 팩만 포함된 샘플을 실험 대상자의 왼쪽 부위에 똑같은 방법으로 적용시켰다.

9) 통계처리

모든 실험은 3회 반복으로 수행되었고, 결과는 평균 ± 표준편차로 표기했다. 샘플간의 비교는 P < 0.05가 되도록 통계적 유의성을 고려한 스튜던츠 티 테스트(Student's t-test)를 이용하여 수행되었다.

실시예 1. EPS 의 레스베라트롤 함량 분석

레스베라트롤의 함량을 측정하기 위하여, 1ml EPS 스톡을 9ml 에탄올에 용해시키고, 0.45um 테플론 시린지 필터로 여과시킨 후에, HPLC에 주입하였다. HPLC 정량 분석을 이용한 EPS의 성분 분석 결과, EPS의 레스베라트롤 함량은 54.2ug/g으로 확인되었다(도 1). 상기 EPS의 레스베라트롤 함량은 이전에 보고된 데이터의 2.3-4.5ug/g에 비해 높은 수치를 보여준다(Wang et al., 2005 Agric Food Cehm. 53, 242-246).

실시예 2. 자외선 유도 세포사를 억제하는 EPS 의 효능 분석

EPS가 자외선에 의한 HDF 세포의 세포사(apoptosis)를 억제하는 세포보호 기능을 하는지 확인하기 위하여, Annexin V로 세포 염색 후 세포사 정도를 유동 세포측정기로 측정하였다. HDF 세포를 배양 용기에 분주한 후 세포가 70-80% 성장했을 때 0.1% EPS를 1 시간 동안 전처리한 후 자외선을 조사하여 세포사를 유도하였고, FACS로 분석하였다. 도 2에서 나타낸 바와 같이, 자외선을 조사하지 않은 HDF 세포에서 4 ± 1.5%(n=3)의 세포사 비율을 보이며(도 2A), 자외선 조사에 의하여 세포사 비율이 20 ± 4.5%(n=3)로 증가하였다(도 2B). 그러나 EPS를 처리한 후 자외선을 조사한 경우 세포사 비율이 7 ± 2.5%(n=3)로 감소되어 EPS가 자외선에 의해 발생하는 초기 세포사를 효과적으로 억제함을 알 수 있었다(도 2C). 상기 결과로 EPS가 활성산소로 인해 발생되는 세포 손상 및 세포사에 대한 세포보호 효능이 있음을 확인하였다.

실시예 3. 여러 항산화 관련 효소 발현을 유도하는 EPS 의 효능 분석

EPS가 자외선으로부터 HDF 세포를 보호하는 세포보호 기능 기전을 알아보고자, EPS를 처리한 HDF 세포에서 여러 종류의 항산화 관련 효소의 발현 정도를 웨스턴 블랏을 통해 분석하였다. HDF 세포에 EPS를 0-0.1% 농도별로 처리한 후 단백질을 분리하여 BCA 방법으로 정량한 후, 항산화 관련 효소에 대한 웨스턴 블랏을 수행하였다. 항산화 관련 효소 HO-1, NQO-1, GSTpi, MnSOD 및 Trx에 대한 단백질 발현을 분석한 결과, 도 3A에 나타낸 바와 같이, EPS 농도에 비례하여 항산화 관련 효소들의 발현이 현저히 증가되었다. 항산화 관련 효소 중 해독화 효소인 HO-1, NQO-1 등의 Phase II 효소 발현이 증가된 것으로 보아 EPS가 해독화 효소를 발현시키는 항산화 효능 뿐만 아니라 항염증 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 또한 상기 항산화 관련 효소의 발현에 중요한 전사인자인 Nrf-2의 발현도 EPS의 처리에 의하여 발현 유도됨을 확인하였다(데이터 미제시). 이는 EPS에 함유되어 있는 비교적 높은 함량의 레스베라트롤에 의한 것으로 여겨진다. 도 3B는 항산화 관련 효소의 발현을 덴시토미트리(densitometry)로 측정한 결과를 그래프로 나타내었다.

실시예 4. 유동 세포측정기를 이용한 EPS 의 활성산소 제거 효능 분석

EPS가 항산화 관련 효소의 발현을 유도하여 자외선으로부터 피부세포를 보호하는 기능을 확인하고자 실제로 세포 내의 활성산소를 유동 세포측정기로 정량한 결과를 도 4에 나타내었다. HDF 세포가 70-80% 성장했을 때 0.1% EPS를 40분간 전처리한 후 10uM DCF-DA(2'-7'-Dichloro Dihydrofluorescein Diacetate)로 염색하였다. 자외선을 조사하지 않은 정상 HDF 세포(도 4A)에서 활성산소의 양이 100 ± 25%(n=3)일 때, 자외선을 조사한 HDF 세포(도 4B)에서는 활성산소의 양이 2150 ± 450%(n=3)로 현저히 증가하였으나, EPS를 처리한 후 자외선을 조사한 HDF 세포(도 4C)에서는 활성산소 양이 180 ± 42%(n=3)로 자외선을 조사하지 않은 정상세포(도 4A)와 거의 유사한 수준으로 감소됨을 확인하였다. 상기 결과는 EPS가 자외선에 의해 생성되는 활성산소를 제거하여 강력한 항산화 효능 및 세포 보호 효능이 있음을 확인한 결과이다.

실시예 5. 공초점 현미경을 이용한 EPS 의 활성산소 제거 효능 분석

EPS의 활성산소 제거 효능을 다른 방법인 공초점 현미경으로 분석한 결과를 도 5에 나타내었다. HDF 세포를 4웰(well) 슬라이드 챔버에 분주한 후 EPS를 전처리하였다. 그 후 DCF-DA로 염색한 후 자외선을 이용하여 활성산소를 생성시켜 세포에서 발생되는 활성산소를 공초점 현미경으로 확인하였다. 그 결과 자외선을 조사한 세포에서는 세포질에 활성산소가 생성되어 연두색의 형광이 발광하였다(도 5B). 자외선 및 EPS를 함께 처리한 세포에서는 EPS가 자외선에 의해 생성된 활성산소를 제거함으로써 세포질에 연두색의 형광이 거의 제거되어 있음을 확인할 수 있었다(도 5C).

실시예 6. 임상시험을 통한 EPS 의 안정성 평가

건강한 사람(10명)을 대상으로 5% EPS 연고 및 2.5% EPS 팩을 제조하여 팔 안쪽에 하루에 2회씩 도포하게 한 후 2주 동안 홍반 및 가려움증에 대한 부작용을 검사하였다. 실험 대상자에서 홍반 및 가려움증에 대한 부작용은 나타나지 않았고, 피부자극이나 염증, 감염 등의 특별한 증상도 나타나지 않음을 확인함으로써, EPS가 세포 독성 및 부작용이 없음을 확인하였다(도 6).

Claims (12)

1. 새싹땅콩의 용매 추출물은 건조 후 분쇄한 새싹땅콩 분말을 에탄올 용액에 용해시킨 후, 저온 감압농축 추출 방법으로 저온에서 농축하여 제조하며, 약학 조성물 100 중량부에 대하여 상기 새싹땅콩 용매 추출물을 0.02 내지 80 중량부로 포함하는 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부손상 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 새싹땅콩의 용매 추출물은 HO-1(heme oxygenase-1), NQO-1(NAD(P)H quinine oxidoreductase-1), GSTpi(glutathione-S-transferase-pi), MnSOD(manganese superoxide dismutase) 및 Trx(thioredoxin)의 항산화 관련 효소의 발현을 유도하고, 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여하는 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부손상 예방 또는 치료용 약학조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 새싹땅콩의 용매 추출물을 연고기제에 희석하여 국소도포제용 연고로 제조하는 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부손상 예방 또는 치료용 약학조성물.
7. 새싹땅콩 용매의 추출물은 건조 후 분쇄한 새싹땅콩 분말을 에탄올 용액에 용해시킨 후, 저온 감압농축 추출 방법으로 저온에서 농축하여 제조하며, 식품 원료 100 중량부에 대하여 상기 새싹땅콩의 용매 추출물을 15 중량부 이하의 양으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 새싹땅콩의 용매 추출물을 함유한 식품.
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제

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