KR101745718B1 - 밀몽화 추출물을 포함하는 백혈병 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 밀몽화 추출물을 포함하는 백혈병 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 밀몽화 추출물은 백혈병 세포에 대한 충분한 사멸효과를 갖고 있어 백혈병에 대한 치료용 조성물로서의 가치가 있으며, 특히 천연물로부터의 추출물이기 때문에 부작용의 위험이 적고, 전골수성 백혈병의 치료에 더욱 유용할 것으로 생각된다.

Description

밀몽화 추출물을 포함하는 백혈병 치료용 조성물{Composition for treatment of Leukemia comprising extract of Buddleiae Flos}

본 발명은 밀몽화 추출물을 포함하는 백혈병 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

백혈병은 세포의 분화 정도, 즉 악화 속도에 따라 급성(Acute)과 만성(Chronic)으로 나뉘고, 세포의 기원에 따라 골수성(myeloid)과 림프구성(lymphocytic)으로 나뉜다. 또한, 급성 골수성 백혈병 중 전골수성(promyelocytic)은 일부 형태학적 차이를 가진다. 한편, HL-60세포는 전골수구성 백혈병환자의 말초백혈구에서 분리, 수립한 부유세포이다. 그리고, 백혈병의 성격에 따라 치료방법과 효과의 차이가 있을 수 있다.

밀몽화(Buddleiae Flos; 密蒙花)는 마전과(Loganiaceae)에 속한 낙엽 관목으로 꽃봉오리와 화서(花序)를 건조한 것으로 봄에 꽃이 아직 피지 않았을 때 채취하여 건조한 것을 사용한다. 중국의 호북(湖北), 사천(四川), 하남(河南)이 주산지이며, 운남(雲南), 호남(湖南) 등에서도 산출된다. 국내에서는 중남부 지방에서 약재로 재배하고 있다. 성질은 약간 차고, 독이 없으며, 맛은 달다. 또한 거풍(祛風), 량혈(凉血), 윤간(潤肝), 명목(明目)등의 효능이 있다. 목적종통다노수명(目赤腫痛多노羞明), 청맹예장, 풍현란안(風眩爛眼)을 치료하는데 사용되고 있다(정보섭 및 신민교, 향약대사전, 영림사, p970~1, 1998). 현재까지 알려진 밀몽화의 성분으로는 플라보노이드(flavonoid)로 리나린(linarin) 또는 아카신(acaciin), 아카세틴(acacetin), 아피게닌 루테오린(apigenin luteolin), 뉴부도프사이드(neobudoffocide), 루테오린-7-O-루티노시드(luteolin-7-O-rutinoside), 루테오린-7-O-글루코시드(luteolin-7-O-glucoside), 코스모신 엔-페닐에타노이드 글루코시드-살리드로시드(cosmosiin nphenylethanoid glucosides - salidroside), 베바스코시드(verbascoside), 이소베바스코시드(isoverbascoside), 에치나코시드(echinacoside, Li J. et al. U. Phenylthanoid glucosides from flos Buddlejae Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 1997 Oct;22(10):pp613-5,1997 ) 등과 이외에도 페닐-메타옥신나모일 아쿠빈(p-methoxycinnamoyl acubin), 페닐-페타옥신나모일-카타폴(p-methoxycinnamoyl-catalpol), 카타폴(catalpol), 아쿠빈(aucubin), 카탈포시드(catalposide)등이 보고되었고, 약리작용으로는 간독성억제작용 (Acevedo L. et al. New phenylethanoids from Buddleja cordata.Planta Med., 66(3), pp257-261, 2000) 및 밀몽화의 성분 중 루테올린(luteolin)의 항백내장작용과, 항산화작용, 항진균작용 (Matsuda h., Cai H., Kubo M., Tosa H., Iinuma M., Effect of buddlejae flos on in vitro aldose reductase activity. Biol Pharm Bull ; 18(3): p463, 1995), 항염증작용(Mensah AY., Houghton PJ., Bloomfield S., Vlietinck Am Vanden Berghe D., Known and novel terpenes from Buddleja globosa displaying selective antijungal activity against dermatophytes. J. Nat. Prod. ;63: pp1210-1213, 2000)등이 있는 것으로 보고되었다.

그러나 아직 밀몽화의 백혈병 억제 효과에 대하여 알려진 바는 없다. 이에 본 발명자들은 밀몽화에 대한 천연물 연구를 하던 중, 밀몽화 추출물이 백혈병 세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 밀몽화 추출물을 유효성분으로 함유하는 백혈병 치료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 밀몽화(Buddleiae Flos; 密蒙花)를 유기 용매로 추출한 유효성분을 포함하는 백혈병 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 유기 용매는 저급 알코올(C1 내지 C4)이 바람직하며, 보다 바람직하게는 에탄올 95% 용매인 것이 바람직하다.

상기 추출은 밀몽화를 50℃에서 24시간 동안 추출하여, 감압 조건하에 건조하는 것이 바람직하다.

상기 밀몽화 추출 유효성분은, 이를 HL-60 세포에 48시간 처리한 후 알라머 블루(Alamar Blue) 분석법에 의해 정해진 EC₅₀ 값이 55.2 ㎍/㎖ 이하인 효과를 보이는 추출물인 경우, 그 효능을 어느 정도 보장할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하여 사용될 수 있다.

그리고, 상기 조성물은 전골수성 백혈병의 예방 또는 치료에 적합한 것일 수 있다.

상기 유기 용매의 경우, 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 극성용매의 사용이 바람직하며, 그 중 에탄올이 더욱 바람직하다. 에탄올의 농도를 다르게 할 수도 있으나, 바람직하게는 95% 에탄올이 더욱 바람직하다.

추출온도는 40℃ 내지 60℃가 유효성분의 변성이나 파괴를 유발하지 않기 때문에 바람직하며, 이러한 범위 내에서 감압조건하에서 농축 및 건조하는 것이 바람직하다.

본 발명의 구체적인 실시에서 밀몽화의 에탄올 추출물은 HL-60 인간 백혈병세포를 100 ㎍/㎖에서 57.7% 사멸시키는데, 그 경향은 농도 추이로 보아 150 ㎍/㎖ 정도에서는 거의 사멸시키는 것으로 예측할 수 있다. HL-60 백혈병 세포에 대한 사멸활성은 전골수성 백혈병에 대한 치료효과를 보일 것으로 예상할 수 있게 한다. 알라머 블루(Alamar Blue) 분석법에 의한 실험에서, 유효한 효과를 보이는 밀몽화 에탄올 추출물의 경우, 그 EC₅₀ 값이 55.2 ㎍/㎖ 정도를 나타내었는데, 이 정도 이하의 값을 갖는다면, 충분히 유효한 효과를 보이는 밀몽화 에탄올 추출물이 포함되어 있다고 볼 수 있을 것이다. 즉, 적절한 추출과정이 이루어졌다고 볼 수 있는 것이다.

상기 “약제학적으로 허용가능한 담체”는 신체의 한 기관 또는 부분으로부터 신체의 다른 기관 또는 부분으로 활성 성분을 수송하는 역할을 하는 액체 또는 고체 충진제, 희석제, 부형제 또는 용매와 같은 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 운반체(vehicle)를 의미한다. 본 발명의 백혈병 치료용 조성물은 유효성분과 함께 추가로 약제학적으로 허용되는 1종 이상의 담체를 첨가하여 약제로 제조할 수 있다. 상기 담체로는 식염수, 완충 식염수, 물, 글리세롤 및 에탄올 등이 있으나 이에 한정되지 않으며, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제(Remingtons's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)를 모두 사용 가능하다.

본 발명의 제제의 형태는 당해 기술분야에 알려진 적합한 제제(Remingtons's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)를 모두 사용 가능하다. 임상 투여시에 경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드, 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 또한 치료제의 효능 증진을 위해 칼슘이나 비타민 D₃를 첨가할 수 있다. 이러한 조성물은 단위-용량(1회분) 또는 다중-용량(수 회분) 용기, 예를 들면, 밀봉된 앰풀 및 바이알에 제시될 수 있고, 사용 직전에 멸균성 액상 담체, 예를 들면, 주사용 수의 부가 만을 요구하는 동결-건조 조건 하에 저장할 수 있다. 즉석의 주사 용제 및 현탁제는 멸균성 산제, 과립제 및 정제로부터 제조할 수 있다.

일반적으로 세포 실험에서 사용한 농도의 약 100배 내지 200배를 동물실험에서 사용하므로, 본 발명의 일 실시예에 따른 백혈병 치료용 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도 및 병용되는 약물을 고려하여 결정할 수 있다.

본 발명에 의한 밀몽화 추출물은 백혈병 세포에 대한 충분한 사멸효과를 갖고 있어 백혈병에 대한 치료용 조성물로서의 가치가 있으며, 특히 천연물로부터의 추출물이기 때문에 부작용의 위험이 적고, 전골수성 백혈병의 치료에 더욱 유용할 것으로 생각된다.

도 1은 HL-60 인간 백혈병 세포에서 밀몽화의 도입이 백혈병 세포의 성장에 미치는 영향을 알아보기 위한 Alamar Blue 분석 결과이다. 도면의 가로축은 추출물의 농도를, 세로축은 세포의 생존률을 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명의 실시형태에 의해 본 발명이 한정되는 것이 아니라 당업자의 입장에서 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위내에서 다양한 변화의 부가 및 변경이 가능함은 물론 균등한 타 실시예가 가능할 것이며, 이는 본 발명의 기술적 사상내의 것이다. 한편, 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지기술 혹은 구성에 대한 구체적인 설명은 본 발명의 요지를 모호하지 않게 하기 위하여 생략한다.

<실시예 1> 밀몽화 추출물의 제조

밀몽화를 실온의 음지에서 5일간 건조하고, 추출효율을 위해 잘게 분쇄한다. 분쇄된 밀몽화를 95% 에탄올(ethanol)에 침잠시키고 50℃ 에서 24시간 추출하였다. 이것을 여과한 후, 45℃ 감압 조건에서 건조하여 고형분을 수득하였다. 이를 -20℃의 저온에서 보관하였다.

<실시예 2> 밀몽화 추출물이 백혈병 세포의 성장에 미치는 영향

상기 실시예 1에서 수득한 밀몽화 추출물이 백혈병 세포의 성장에 미치는 영향을 알아보기 위하여 인간 백혈병 세포인 HL-60에 대하여 Alamar Blue 분석을 시행하였다. Alamar Blue 분석은 MTT 분석의 변형된 형태인데, 특정 효소에 의해서 분해되는 화합물을 살아있는 세포에 처리한 후 화합물이 분해되면서 나오는 생성물의 형광 세기를 측정함으로써 약물을 처리한 후 살아있는 세포의 상대적인 숫자를 알아내는 실험방법이다.

<2-1> 인간 백혈병 세포의 준비 및 처리

본 발명에 사용된 백혈병 세포주인 HL-60 세포는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)으로부터 분양받아 실험에 이용하였다. 상기 HL-60 백혈병 세포를 20% FBS(fetal bovine serum, 소태아혈청)(Welgene)와 25 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid )를 포함하는 RPMI(Roswell Park Memorial Institute medium) 1640 배지에서 배양하였다. 상기 세포를 37℃, 5% CO2의 수분이 있는 상태로 유지하고, 2-3일 정도 계대배양하였다.

<2-2> HL-60 세포의 세포 생존율 측정

상기 실시예 1에서 추출한 밀몽화 추출물이 백혈병 세포인 HL-60에 대한 세포 성장 억제효과를 확인하였다. 구체적으로, 96 웰 플레이트에 각 웰 당 5.0×10⁴ 개의 HL-60 세포를 주입(seeding)하고 DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 녹인 상기 밀몽화 에탄올 추출물을 각각 0 내지 100 ㎍/㎖ 농도(구체적으로, 각각 0, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 및 100 ㎍/㎖ 농도)로 48시간 동안 처리하였을 때, 세포 성장을 저해하는 정도를 확인하였다(표 1). 각 농도의 추출물을 처리한 후, 96-웰 플레이트에서 각 웰에 채워진 0.2 ㎖의 세포 배양액에 20 ㎕의 Alamar Blue 시약을 첨가한 후 플레이트를 인큐베이터에서 2시간 동안 배양하였다. 각 웰의 세포를 고르게 반응시키기 위하여 플레이트를 천천히 흔들고, 544 ㎚의 파장에서 조사광을 조사하면서 590 ㎚에서 형광의 세기를 형광광도계(Fluorescence Microplate Reader; Molecular Devices Corp.)로 흡광도를 측정하였고, 세포의 생존율을 도 1에 나타내었다.

추출물의 농도(㎍/㎖)	생존률	표준편차
0	1.000	0.000
3.125	1.071	0.039
6.25	1.086	0.097
12.5	1.006	0.042
25	0.977	0.062
50	0.752	0.018
100	0.423	0.006

그 결과, 표 1 및 도 1에서 나타난 바와 같이, 밀몽화의 처리 농도가 25 ㎍/㎖ 이상의 범위에서 처리 농도가 높을수록 백혈병 세포의 생존률이 떨어지는 경향을 보이고 있으며, 이로부터 밀몽화가 백혈병 예방 내지는 치료 효과가 있음을 알 수 있다. 표 1의 생존률은 밀몽화 추출물을 처리하지 않은 대조군의 세포의 수를 1로 보았을 때, 각각의 밀몽화 추출물의 처리 농도에 따른 48시간 후의 세포의 상대적 세포수를 나타낸 것이다. 아울러, EC₅₀(half maximal effective concentration)은 55.2 ㎍/㎖로 측정되었다.이와 같이 본 발명의 밀몽화 추출물은 우수한 HL-60 세포 사멸 활성을 가지며, 나아가 백혈병 치료 및 예방 활성을 가진다는 것을 입증한다.

<실시예 3> 밀몽화 추출물에 의한 급성독성 시험

본 발명에 이용된 밀몽화는 약재로 이용되고 있어서 안정성에 문제가 없을 것으로 판단하였으나, 경구 투여시 및 복강내 투여시의 독성 실험을 수행하여 이를 확인하고자 하였다.

6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 본 발명의 실시예 1의 대계근 추출물을 각각 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 5 g/㎏의 용량으로 단회 경구투여하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 대계근 추출물은 모두 랫트에서 5 g/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소치사량 (LD₅₀)은 5 g/㎏이상인 안전한 물질로 판단되었다.

Claims (6)

1. 밀몽화(Buddleiae Flos; 密蒙花)를 에탄올 95% 용매로 50℃에서 24시간 동안 추출하여, 감압 조건하에 건조한 것을 기준으로, 이를 HL-60 세포에 48시간 처리한 후 알라머 블루(Alamar Blue) 분석법에 의해 정해진 EC₅₀ 값이 55.2 ㎍/㎖ 이하인 효과를 보이는 추출물의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 백혈병 예방 또는 치료용 조성물.
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6. 제 1항에 있어서,
   상기 백혈병은 전골수성 백혈병인 것을 특징으로 하는 백혈병 예방 또는 치료용 조성물.

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