KR101064518B1

KR101064518B1 - 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 식물줄기세포주 및 이의 분리방법

Info

Publication number: KR101064518B1
Application number: KR1020080092310A
Authority: KR
Inventors: 장미옥; 이은경; 진영우
Original assignee: 주식회사 운화
Priority date: 2007-09-21
Filing date: 2008-09-19
Publication date: 2011-09-19
Also published as: RU2010115796A; HK1147517A1; US20130137178A1; AP2010005189A0; CN101939414A; EP2220211B1; JP2010539900A; KR20090031307A; ZA201001572B; MY162649A; US8247230B2; AU2008301352B2; WO2009038417A3; WO2009038417A2; CA2700340A1; CN101939414B; MX2010003028A; EP2220211A2; JP5572789B2; RU2467067C2

Abstract

본 발명은 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 세포주 및 이의 분리방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 함유 저장근 조직에서 별도의 탈분화 과정 없이 수득되는 것을 특징으로 하는 분열능을 갖는 동질적인 형성층 유래 세포주 및 이의 분리방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 세포주는 활발한 분열능을 가지며 동질적인 세포주로서, 탈분화과정을 거치지 않아 배양 시 안정적이다. 이에 이의 증식을 최적화함으로써 세포주를 짧은 시간 내에 대량 증식시킬 수 있게 된다. 따라서, 본 발명에 따른 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 세포주는 경작 기간, 경작지 선정, 경작 비용 등의 여러 가지 문제로 인해 노지에서는 배양이 어려운 유용 식물체를 대량으로 생산할 수 있게 한다.

저장근, 형성층, 세포배양, 삼투 스트레스, IAA, IBA, 2,4-D, 피클로람

Description

저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 식물줄기세포주 및 이의 분리방법{Plant Stem Cell line Derived from Cambium of Herbaceous Plant With Storage Root and Method for Isolating the Same}

본 발명은 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 세포주 및 이의 분리방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 함유 저장근 조직에서 별도의 탈분화 과정 없이 수득되는 것을 특징으로 하는, 분열능을 갖는 동질적인 형성층 유래 세포주 및 이의 분리방법에 관한 것이다.

고려인삼(Panax ginseng C.A.Meyer)에는 진세노사이드(ginsenoside), 폴리아세틸렌계 화합물, 폴리페놀 화합물, 생체방어기능을 갖는 단백질 함유 다당체 및 항보체활성(抗補體活性, anticomplementary activity) 다당체, 산성 다당체 같은 유용물질들이 다량으로 존재한다. 그러나 재배가 까다롭고, 농약오염, 환경파괴 등의 문제점이 발생될 수 있으며, 인삼뿌리를 약용으로 이용하기 위해서는 4년 이상을 재배해야 하므로 많은 인력 및 경비가 소요되어 값이 매우 비싸다.

따라서, 이에 대한 대안으로 생물공학적인 방법을 이용하여 기내에서 인삼세 포를 대량생산하는 방법 또는 인삼의 부정근, 모상근 등을 대량으로 생산하는 방법 등이 연구되었는데, 이러한 세포 배양법을 이용하여 인삼 세포를 기내 배양 시 얻어지는 캘러스라고 하는 세포덩어리의 증식 속도는 밭에서 얻어지는 인삼 식물체에 비해 높으며(대한민국 등록특허 제0333559호), 배양 세포의 사포닌 함량은 인삼뿌리에 비해 크게 떨어지지 않는다(Asaka et al., Plant Med . 59:345, 1993)고 보고된바 있다.

이에 부정근(인삼 또는 산삼- 산림청, CBN Biotech, 네오바이오, KT&G 연구원, 마이크로 프랜츠 등), 세포(일본 니토덴코 등) 등과 같은 배양체가 배양되어 식품 및 화장품의 원료로 사용되고 있다(대한민국 등록특허 제 0601903호, 대한민국 등록특허 제0637342호, 대한민국 공개특허 제10-2004-0014584호 등). 특히, 산삼의 경우는 희귀하고 매우 고가이므로 부정근 및 유식물체를 배양하고 대량생산하여 제품화하는 연구가 여러 곳에서 활발하게 진행되고 있다고 보고된바 있다(대한민국 공개특허 제10-2005-0078372호).

그런데 상기 인삼, 산삼 등의 초본식물에 있어서, 배양재료로 사용하고자 하는 조직은 뿌리부분, 즉 저장근이다. 그런데 저장근 조직의 경우 땅 속에 오랫동안 묻혀 있어서 땅 속 미생물들과 여러 관계를 맺고 살아가면서 땅 속에 존재하는 물과 무기 양분을 흡수하는 부분으로 이를 식물 조직배양이나 세포 배양에 이용 시 조직의 무균화가 반드시 필요하다. 그런데 이러한 조직을 표면살균하기 위해 소독액의 농도를 높일 경우 조직이 파괴되고 소독액의 농도를 낮출 경우 각종 곰팡이 및 세균의 오염이 심하며, 특히 토양 속에서 장기간 생육한 장뇌삼과 산삼의 경우 이러한 현상이 더욱 심하게 나타나므로 표면살균에 의한 제균이 매우 어려운 것으로 보고되어 있다(대한민국 등록특허 제 0478213호, Teng WL et al., Plant Cell Tissue Organ Cult ., 68:233, 2002).

또한, 식물의 저장 조직 중 저장근인 인삼류의 세포를 대량생산하기 위해서는, 현재 알려진 어떤 방법을 사용하더라도 분화된 조직인 저장근의 미분화조직으로의 탈분화 과정을 거쳐야만 하는데 이때 체세포의 변이가 발생할 수밖에 없다. 즉, 식물 조직 배양기술을 이용하여 인삼류의 세포를 대량생산하기 위해서 체세포 변이의 폭을 줄이기 위해 유전적으로 안정된 시료를 재료로 사용해야 하는데, 종래 인삼류의 어느 조직을 사용하더라도 기본적으로 체세포 변이가 발생하게 된다고 대한민국 공개특허 10-2005-0078372호에서 밝힌 바 있다.

한편, 형성층(cambium)이란 식물의 줄기와 뿌리를 굵어지게 해서 식물이 부피생장을 할 수 있도록 하는 조직이다. 형성층은 세포분열이 가장 활발하게 일어나는 분열조직으로써 식물조직배양의 절편체로 사용 시 세포의 고속 및 대량생산이 가능하다고 보고되어 있다(대한민국 등록특허 제 0533120호). 이러한 형성층의 구조와 미세 구조에 대한 연구는 재료가 가진 고유의 기술적 어려움 때문에 천천히 진행되었는데, 형성층은 몇 개의 좁고 신장되고 얇은 벽의 세포층으로 구성되어 있어서 추출 동안 쉽게 손상됨이 보고된 바 있으며 또한, 고도로 액포화된 활성적인 분열조직 세포들(highly vacuolated active meristematic cells)은 전자현미경을 사용하는 전통적인 방법이나 단백질, RNAs, 다른 분자들의 in situ localization을 연구하기 위해 최근에 완성된 기술로도 적절히 고정하기 어렵다고 보고되었다(Lachaud Suzanne et al ., Life science , 633, 1999).

이외에도 연속적인 형성층의 기계적인 sectioning은 널리 사용되지 못했는데 이것은 형성층 세포의 길이가 길고 벽이 얇다는 기술적인 어려움 때문으로 판단된다. 많은 연구들에서 형성층 세포의 모양과 크기와 배열은 2기 유관속 조직의 구조가 형성층을 반영한다는 가정 아래 형성층 유도체들의 구조를 바탕으로 간접적으로 특징지어졌다고 보고되었다(Kitin P et al., Ann . Bot ., 86:1109, 2000). 즉, 다양한 분야의 연구를 위해 직접적으로 형성층을 재료로 사용하는데 많은 어려움이 있음이 여러 연구들에서 제시되고 있다.

최근, 본 발명자 중 일부가 개발한 대한민국 등록특허 제0533120호에서는 식물의 줄기에서 채취한 형성층만을 이용하여 캘러스를 유도한 방법을 기술하고 있다. 이 등록특허에서는 식물세포를 대량으로 급속하게 얻기 위한 식물세포배양방법으로 일반적인 종자 배양법을 사용하기보다는 식물의 줄기에서 채취한 형성층을 통해 캘러스를 유도하는 식물세포배양방법에 대해서 언급하고 있다. 그러나, 이 방법은 목본 식물의 줄기 형성층을 이용하여 옥신류인 고농도의 피클로람과 gibberellic acid를 첨가하여 사용함으로써 형성층 세포를 유도하는 방법을 제시하고 있으나, 이 등록특허는 단순히 목본 식물의 줄기 형성층을 이용하여 캘러스를 유도하였을 뿐이었다. 캘러스(CAllus)란 탈분화가 일어나 형성된 조직인 바, 이에 상기 등록특허는 여전히 탈분화에 의한 변이 문제를 보류하고 있는 문제점이 있었다.

또한, 본 발명자 중 일부는 탈분화에 의한 변이의 문제를 해결하고 안정적으로 증식이 가능한 유전적 안정성이 높은 세포주의 제공방법으로서 국제특허출원 PCT/KR 2006/001544호의 발명을 개발한 바 있다. 그러나, 이 방법 역시 목본 식물의 줄기 형성층을 이용한 것으로서, 인삼류와 같은 초본식물의 경우 목본식물과 형태 및 생리가 달라 초본식물의 저장근 조직의 형성층으로부터 세포주를 유도해 내기 위하여 초본식물의 특성을 고려한 개량발명의 개발이 요청되었다.

이에 본 발명자들은 분열능을 가지는 동질적인 세포주이며, 탈분화 과정을 거치지 않아 배양 시 체세포 변이가 없는 식물 세포주를 수득하고자 예의 노력한 결과, 형성층 함유 저장근 조직에 삼투 스트레스를 가하고 특정 식물호르몬 함유 배지에서 배양하여 형성층 유래 세포주를 분리하고, 상기 분리된 세포주가 왕성한 분열능을 가지며 탈분화 과정 없이 분리되어 체세포 변이가 없어 유전적으로 안정성이 높고 생리적으로 균일한 동질적인 세포주임을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 분열능을 가지고 동질적이며, 배양 시 안정적인 증식이 가능한 초본식물 저장근의 형성층 유래 세포주를 제공하는 데 있다.

본 발명의 목적은 또한, 탈분화 과정 없이 상기 세포주를 분리하는 방법을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 세포주의 분리방법을 제공한다:

(a) 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 함유 저장근 조직을 수득하는 단계;

(b) 상기 수득된 형성층 함유 저장근 조직을 IAA(Indole-3-acetic acid) 또는 IBA(Indole-3-butyric acid)를 포함하는 배지에서 배양하여 형성층 유래 세포주를 유도하는 단계,

이때, 상기 배양의 수행 중 또는 배양 전단계 또는 후단계에서 상기 형성층 함유 저장근 조직에 삼투 스트레스를 가하는 것을 특징으로 함; 및

(c) 상기 유도된 형성층 유래 세포주를 회수하는 단계.

본 발명은 또한, 저장근을 가지는 초본식물의 형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 세포주를 제공한다:

(a) 선천적 미분화 상태 (innately undifferentiated)임;

(b) 동질적인 세포주(homogeneous cell line)임; 및

(c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄.

본 발명은 또한, 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 세포주를 동결하는 것을 특징으로 하는 초본식물 세포주의 보존방법을 제공한다.

본 발명은 분열능을 가지고 동질적이며, 대량배양 시 체세포 변이가 일어나지 않는 안정적인 특징을 갖는, 초본식물 저장근의 형성층 유래 세포주 및 이의 분리방법을 제공하는 효과가 있다.

본 발명의 방법에 의해 제공된 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 세포주는 활발한 분열능을 가지며 동질적인 세포주이고, 탈분화과정을 거치지 않아 배양 시 안정적이다. 이에 이의 증식을 최적화함으로써, 세포주가 짧은 시간 내에 대량 증식시킬 수 있게 된다. 따라서, 본 발명에 따른 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 세포주는 경작 기간, 경작지 선정, 경작 비용 등의 여러 가지 문제로 인해 노지에서는 배양이 어려운 유용 식물체를 대량으로 생산할 수 있게 한다.

본 발명의 방법에 의해 제공된 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 세포주는 또한, 피부 노화의 주요원인인 자외선 노출에 의한 활성산소를 억제하는 항산화 작용을 나타내며, 노화와 관련된 인자들을 효과적으로 감소 또는 억제할 수 있으므로, 피부 노화 예방 및 억제에 유용하다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 일 관점에서, 본 발명은 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 세포주의 분리방법에 관한 것이다.

이미 분화된 조직인 잎이나 줄기, 뿌리 부분을 사용할 경우, 캘러스를 형성하기 위해서는 분화된 조직에서 미분화조직으로 되돌아가는(rejuvenilation) 탈분화(dedifferentiation) 과정을 거쳐야 하는데 이 탈분화 과정 중에 체세포에 돌연변이가 나타나 세포 불안정성의 원인이 된다. 이에 본 발명자들은 체세포 변이가 거의 없는 식물 세포 시스템을 연구하던 중, 분열조직인 형성층에서만 특이적으로 세포주를 유도할 경우 탈분화를 거치지 않고 분열조직 자체가 가지고 있는 왕성한 분열능을 사용할 수 있으므로 체세포 변이가 없어 유전적으로 안정성이 높고, 생리적으로 균일한 동질적인 세포주를 유도할 수 있다는 점에 착안하고 형성층 유래 세포주를 분리하였다.

본 발명에 따른 분리방법은 (a) 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 함유 저장근 조직을 수득하는 단계; (b) 상기 수득된 형성층 함유 저장근 조직을 IAA(Indole-3-acetic acid) 또는 IBA(Indole-3-butyric acid)를 포함하는 배지에서 배양하여 형성층 유래 세포주를 유도하는 단계, 이때, 상기 배양의 수행 중 또는 배양 전단계 또는 후단계에서 상기 형성층 함유 저장근 조직에 삼투 스트레스를 가하는 것을 특징으로 함; 및 (c) 상기 유도된 형성층 유래 세포주를 회수하는 단계를 포함한다.

이때, 상기 (b) 단계에 있어서, 상기 삼투 스트레스 공정은 형성층 특이적으로 세포주를 유도하기 위한 것으로서, 바람직하게는 상기 IAA 또는 IBA를 포함하는 배지에서 배양하기 전에 수행하여 형성층 이외의 일반 조직, 즉, 피층(cortex), 사부(phloem), 목부(xylem), 수(pith)에서는 분열능을 잃어 추후 IAA 또는 IBA와 같이 형성층분열 특이적인 호르몬을 처리하여 배양하는 경우 괴사되도록 한다.

또한, 바람직하게는 상기 (c) 단계는 유도된 형성층 유래 세포주를 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 피클로람(picloram) 및 IBA 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 증식시킨 다음, 형성층 유래 세포주를 회수하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 방법을 상세히 살펴보면 다음과 같다.

(1) 살균공정 및 삼투 스트레스 처리 공정

먼저, 초본식물의 형성층 함유 저장근 조직을 준비한 후, 살균과정을 거친다. 이때, 바람직하게는 살균 공정은 2단계로 진행한다. 그 후, 살균공정을 거친 형성층 함유 저장근 조직에 삼투 스트레스를 주어 극한 환경 하에서 형성층 이외의 일반 조직, 즉, 피층(cortex), 사부(phloem), 목부(xylem), 수(pith)에서는 분열능을 잃어 추후 IAA 또는 IBA와 같이 형성층분열 특이적인 호르몬을 처리하여 배양하 는 경우 괴사되도록 하고, 분열능이 왕성한 형성층에서만 특이적으로 분열능을 갖는 동질성 세포주를 유도한다. 이때, 수크로오즈 등 당류, 만니톨, 소르비톨 등 당알코올 및 염화나트륨 등 염류 등을 삼투제로서 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이때 삼투제는 0.5~2M의 함량으로 처리하고, 냉장 또는 상온에서 16시간 내지 24시간 동안 삼투 스트레스를 가한 후, 처리한 삼투 스트레스를 제거하는 것이 바람직하나, 삼투제의 농도, 처리 시간 및 온도는 식물체별, 조직별 상태에 따라 달라질 수 있으므로 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명에서는 상기 삼투 스트레스의 처리 후 이를 해제해주는 단계 및 유도배지 적응단계의 두 단계를 거치는 것을 특징으로 한다. 삼투 스트레스를 해제해 주기 위해서는 0.03~0.05M과 같이 삼투제의 농도를 급하강시켜 절편체에 처리하는데, 처리시간은 1분 내지 15분으로 하는 것이 바람직하다. 또한, 상기와 같이 낮은 농도에 절편체를 계속하여 노출시키는 경우, 이후 형성층 특이적 세포주를 유도하는 배지에서 배양 시 유도배지와 농도의 차이가 있어 이 역시 삼투 스트레스로 작용할 수 있으므로 적응단계를 더 거치는 것이 바람직하다. 또한 유도배지 적응단계는 상기 삼투 스트레스 해제단계를 거친 절편체에 유도배지와 유사한 농도로 삼투제를 처리함으로써 이루어진다. 이때 바람직하게는 0.08~0.1M의 농도로 삼투제를 처리하며, 처리시간은 1~15분으로 한다.

본 발명의 일 실시예에서 삼투 스트레스를 처리한 경우와 미처리한 경우를 비교하였으며, 이때 삼투 스트레스를 처리하지 않은 대조군에서는 형성층 특이적인 세포주 유도가 나타나지 않는 것으로 나타난바, 삼투 스트레스 처리 단계가 저장근을 갖는 초본식물의 형성층 유래 세포주를 유도하는 데 반드시 필요함을 확인할 수 있었다.

(2) 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 세포주의 유도

상기 삼투 스트레스의 처리 후, 초본식물의 형성층 유래 세포주의 유도를 위하여 상기 삼투 스트레스를 받은 조직을 IAA 또는 IBA가 포함된 세포 배양용 배지에 치상하여 형성층에서만 특이적으로 세포분열을 유도하여 동질적인 형성층 유래 세포주를 수득하였다. 이때, 바람직하게는 IAA 또는 IBA가 0.5~3.0mg/L의 함량으로 첨가된 세포 배양용 배지에 형성층 포함 절편체를 치상한다.

IAA를 세포주 유도배지에 첨가하는 경우, 식물체 내부의 본래의 IAA와 합해져 형성층 활성에 시너지 효과를 일으킨다. 이러한 시너지 효과의 결과, 분화조직과 분열조직, 즉 형성층의 세포분열활성 차이로 인하여 형성층에서만 특이적으로 동질적인 세포주가 유도되게 된다. 한편, IAA를 1차 천연옥신이라 하는 반면, IBA는 2차 천연옥신으로 보고되고 있다(Andrew et al ., Ann . Bot ., 95:707, 2005).

본 발명의 일 실시예에서는 삼투 스트레스 처리 후, picloram, 2,4-D, CPA, NAA 등 다른 식물 호르몬인 옥신류를 처리하여 보았으나, IAA 및 IBA만 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 세포주의 유도에 유효한 것으로 나타났다.

(3) 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 세포주의 증식

상기와 같이 유도된 형성층 유래 동질성 세포주는 식물 생장조절물질인 옥신이 포함된 증식 최적 배지로 옮겨 증식시켜 동질성 세포주를 대량으로 얻을 수 있다. 이때, 생장조절물질로서 바람직하게는 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 피클로람(picloram) 및 IBA 중 어느 하나 이상을 사용할 수 있으며, 상기 2,4-D, 피클로람 및 IBA 중 어느 하나는 바람직하게는 1~5mg/L, 더욱 바람직하게는 2mg/L의 함량으로 사용한다.

본 발명에서 사용한 배지는 통상의 식물 조직 배양을 위한 배지로써, 일례로 N6배지, SH배지, MS 배지, AA 배지, LS 배지, B5배지, WPM 배지, LP배지, White배지, GD배지, DKW배지, DCR 배지 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 저장근을 가지는 초본식물의 형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 세포주에 관한 것이다:

(a) 선천적 미분화 상태 (innately undifferentiated)임;

(b) 동질적인 세포주(homogeneous cell line)임; 및

(c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄.

본 발명에 따른 형성층 유래 세포주는 추가적으로 (a) 현탁배양 시 단세포 상태로 존재함; (b) 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스 (shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가 짐; 및 (c) 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명에 따른 형성층 유래 세포주가 3L의 바이오리액터 뿐만 아니라, 20L 바이오리액터에서도 대량배양이 가능함을 확인하였다. 또한, 본 발명에 따른 형성층 유래 세포주가 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 전단스트레스에 대하여 5~9배의 낮은 민감성을 가지며, 역시 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도에서도 3~5배 정도의 높은 증식율을 보임을 확인하였다. 한편, 11개월 이상 장기 배양한 경우에는 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 최대 400배의 증식율 차를 보였다.

본 발명의 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 배양액이 피부콜라겐을 분해하여 피부주름을 형성시키는 MMP-1의 발현을 억제하는 효과를 확인하여, 주름 방지 및 개선 효과가 있음을 확인하였고, 또 다른 실시예에서는 UV에 의해 유도되는 활성산소 억제 효능이 있음을 확인하여 항산화 효과가 있음을 확인하였다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 세포주를 동결하는 것을 특징으로 하는 초본식물 세포주의 보존방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시예에서는 인삼 자엽 유래 이질적인 세포주와, 인삼 형성층 유래의 동질적인 세포주에 대하여 동결보존 실험을 수행한 결과, 인삼 자엽 유래 이질적인 세포주의 경우 해동 시 재생장을 하지 않는 반면, 형성층 유래 동질적인 세포주는 재생장을 시작하여 증식하는 양상을 보임을 확인하였다.

세포주를 동결보존할 수 있는 경우 원료의 안정적인 공급 및 실질적인 마스터 세포은행(master cell bank)을 구축하는 것이 가능한바, 본 발명의 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 세포주를 이용하여 장기적이고도 안정적인 초본식물의 세포주 공급이 가능하다.

세계는 지금 연구소재 (생물자원) 전쟁 중으로, 인체조직, 식물종자 및 미생물, 세포, 유전자 등 각종 신약개발과 식량개량 등을 위한 생물자원의 보존과 해독이 중요한 국가자산으로 부상되고 있다. 이에 연구소재 확보가 곧 국가경쟁력인 시대에 생명과학과 관련된 분야의 연구에 필수 자료로 활용되고 있는 세포주 (Cell Line)를 개발하고 수집, 보존, 분양하는 세포주 은행의 구축이 필요한 실정이다. 따라서, 이러한 식물 세포 은행을 구축함에 연구소재의 공급을 원활하게 할 수 있으며 식물 세포주를 이용한 연구기간을 단축하게 할 것으로 기대된다.

본 발명은 저장근의 형성층을 이용하는 점에 특징이 있는 것으로 통상의 저장근을 가지고 있는 모든 종류의 초본식물에 적용할 수 있다. 즉, 본 발명의 일 실시예에서는 인삼, 산삼 및 당근 저장근의 형성층으로부터 세포주를 분리하였으나, 이에 한정되지 않고 저장근을 가지는 초본식물이라면 본 발명의 방법을 적용할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 자명하다. 예컨대, 저장근을 가지고 있는 초본식물인 더덕, 강활, 도라지, 칡, 독활, 방풍, 당귀, 당근, 고구마, 마카, 카사바, 인삼, 산삼, 장뇌삼 등을 포함하나 역시 이에 한 정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에 따른 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 함유 저장근 조직은 노지식물의 저장근 조직뿐만 아니라, 조직배양체(부정근 및 부정근 유래 세포주)를 포함하는 개념이다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 세포주의 분리 (1)-인삼

1-1. 식물재료의 준비

도 1은 본 발명에서 사용한 노지 인삼의 전형적인 모습을 보여준다. 도 1에 나타난 바와 같이, 매끈하고 상처가 없는 인삼만을 선별·수집하고, 흐르는 물로 수집된 인삼의 겉표면의 흙이나 그 외 오염물질을 제거하였다. 그 후 주근부를 사용하기 위하여 세근을 모두 정리한 다음 액체 세제를 이용해 주근의 표면을 씻은 후 흐르는 물에 방치하였다. 씻은 조직은 클린벤치 내 준비된 멸균 플라스크에 넣고 70% 에탄올로 30초 내지 1분 정도 살균하였다. 그 후 멸균수로 헹군 후, 1% 내지 1.5% 차아염소산나트륨 (sodium hypochlorite, Junsei, Japan)을 이용하여 5분 내지 8분 정도로 소독하였다. 그 후 소독액을 따라 내고 멸균수로 1회 정도 헹군 후, 상기 소독액으로 5분 내지 8분 정도 2차 처리하였다. 이때, 소독액이 효과적으로 조직 내에 침투되도록 TWEEN 20(Polyoxyethylenesorbitan monolaurate, Junsei, Japan)을 몇 방울 정도 첨가하여 처리한 후, 멸균수로 3회 내지 5회 정도로 헹궈 주었다. 그 후, 살균 처리한 조직의 갈변화 방지를 위해 항산화제가 포함된 BIM(browning inhibition medium)에 살균된 주근을 넣고 30분 내지 1시간 정도 진탕배양한 후 멸균된 여과지로 물기를 제거하였다.

<표 1> BIM 조성 및 사용 농도

구성성분	사용농도
McCown WPM salt	1/4 strength
Sucrose	1%(w/v)
PVP(polyvinyl pyrrolidone)	0.5%(w/v)
Ascorbic acid	100㎎/ℓ
Citric acid	150㎎/ℓ
pH 5.8로 보정

여기서, 염농도는 전체의 1/4에 해당하는 양만 첨가한다.

그 후, 상기 재료를 갈변화 방지를 위해, <표 2>의 항산화제가 포함된 CS solution (cutting sloution)이 담긴 멸균 접시 위에 놓고 겉껍질을 얇게 벗겨 내고 반으로 갈라 분열능이 왕성한 형성층 부분이 포함되도록 가로×세로×높이=0.5~0.7cm×0.5~0.7cm×0.2~0.5mm의 크기로 절단을 하였다. 도 2는 식물의 저장 조직 중 인삼류 저장근로부터 상기 크기로 절단을 하여 형성층 포함 절편체를 제조한 모습이다.

<표 2> CS(cutting solution)

구성성분	사용농도
PVP(Polyvinyl pyrrolidone)	0.5%(w/v)
Ascorbic acid	100㎎/ℓ
Citric acid	150㎎/ℓ

1-2: 인삼 주근부 형성층 포함 절편체에의 삼투제의 처리

실시예 1-1에서 준비한 절편체에서, 분화된 조직 즉, 사부, 목부, 수 등은 괴사시키고 분열조직인 형성층만을 유도시키기 위해 삼투 스트레스를 처리하였다. 상기 형성층 포함 절편체를 여과지가 깔린 전치상 배지(배지 1)에 블로팅 (blotting)하여 1M 수크로오즈 (Duchefa, Netherland) 용액이 담긴 플라스크에 넣고 냉장상태에서 16~24시간 동안 삼투스트레스를 처리하였다. 그 후, 0.05M 수크로오즈 용액(sucrose solution)에서 5분간, 0.1M sucrose 용액에서 5분간 처리하여 고농도의 sucrose에 의한 스트레스를 해제하였다. 상기 삼투 스트레스가 해제된 형성층 포함 절편체는 여과지가 깔린 전치상 배지(배지 1)에 올려 물기를 제거하였다.

<표 3> 전치상 배지(배지 1) 조성

조성		mM	㎎/ℓ
Macroelements	Ca(NO₃)₂	2.35	471.26
	NH₄NO₃	5	400
	MgSO₄·7H₂O	1.5	180.54
	K₂SO₄	5.68	990
	CaCl₂·2H₂O	0.65	72.5
	KH₂PO₄	1.25	170
조성		μM	㎎/ℓ
Microelements	MnSO₄·4H₂O	131.94	22.3
	ZnSO₄·7H₂O	29.91	8.6
	Na₂MoO₄·2H₂O	1.03	0.25
	H₃BO₃	100.27	6.2
	CuSO₄·5H₂O	1.0	0.25
	FeNa-EDTA	100	36.7
Vitamin	Glycine	26.64	2.0
	myo-Inositol	554.94	100
	Nicotinic acid	4.06	0.5
	Pyridoxine-HCl	2.43	0.5
	Thiamine-HCl	2.96	1.0

1-3: 인삼 주근부의 형성층 포함 절편체에서 동질적인 형성층 유래 세포주 유도

분열능을 갖는 동질적인 형성층 유래 세포주를 유도하기 위하여, 상기 실시예 1의 2의 삼투 스트레스 처리한 절편체를 세포주 유도 배지(배지 2)에 치상하였다. 치상에 사용된 배지는 하기 <표 4>에 수록된 바와 같다. 치상된 절편체는 22±1℃ 암조건에서 배양하였다.

<표 4> 형성층 유래 세포주 유도를 위한 배지 조성(배지 2)

조성 및 조건	사용농도 및 조건
Salt	Full strength WPM
Sucrose	3%(w/v)
IAA(Indole-3-acetic acid)	2㎎/ℓ
pH	5.8
Gelrite	0.3%(w/v)
Ascorbic acid	100㎎/ℓ
Citric acid	150㎎/ℓ

상기와 같이 삼투 처리를 하고 해제를 한 후 형성층 유래 세포주 유도배지 (배지 2)에 치상한 절편체는 <표 5>에 기재한 바와 같이 다른 조직에서는 세포가 유도되지 않고 형성층에서만 특이적으로 동질적인 세포가 유도됨이 관찰되었다. 즉, 삼투 처리를 한 후 해제를 하여 치상한 절편체에서는 배양 3~7일 사이에 절편체의 형성층 부위가 연노랑색으로 변하기 시작하였고, 이로부터 약 7~14일 후 연노랑색으로 변한 부위에서 동글동글한 세포주가 유도되는 것이 관찰되었다. 도 3 (a)는 인삼의 뿌리 형성층 포함 절편체 중 형성층에서만 특이적으로 동질적인 세포주가 유도되는 모습을 나타낸다.

반면, <표 5>에 기재한 바와 같이, 실시예 1의 2의 삼투 스트레스 처리단계 를 거치지 않고 바로 형성층 유래 세포주 유도배지 (배지 2)에 치상한 절편체에서는 치상 초기(2~3일 내)에 빠르게 형성층 중심으로 노랗게 반응을 보이다가 시간이 지나면서 절편체 전체가 노랗게 변하는 양상을 보였으며, 형성층 중심의 노란 반응을 보인 절편체를 형성층 유래 세포주 분리 및 증식 최적 배지(배지 3)에 계대를 하여 계속적인 형성층 유래 세포주 유도 및 증식을 시도해 보았으나 갈변 양상이 심화되었고 시간이 경과해도 갈변 반응외에 어떤 반응도 보이지 않았다. 이는 삼투 스트레스 처리단계가 형성층 유래 세포주의 유도를 위해서는 반드시 필요함을 나타낸다.

<표 5> 삼투 처리 한 절편체와 처리하지 않은 절편체의 반응 비교

처리별	무처리	16시간 처리	20시간 처리	24시간 처리
양상	치상 초기에 형성층 중심으로 노란 반응이 진행되면서 이런 반응이 절편체 전체로 퍼지는 경향을 보였음. 그 후 형성층을 포함한 절편체 전체적으로 갈변 반응이 심하게 진행되어 더 이상 형성층 특이적으로 유도되는 동질적인 세포주 유도는 나타나지 않았음	형성층에서만 특이적으로 세포가 유도됨이 관찰됨. 삼투 스트레스 처리 시간을 달리하여 처리한 결과, 서로 유사한 결과를 보였음. 즉, 상기 처리 시간별 반응물간 큰 차이는 보이지 않음.

한편 유도배지 사용 호르몬별 영향을 살펴보기 위하여, 형성층 유래 세포주 유도배지가 아닌 통상적인 인삼류 배양에서 사용하는 2,4-D를 포함하는 배지를 사용하여 절편체를 배양하였다. 이 경우, 배양 7~10일 사이에 절편체의 전체 부분이 노랑색으로 변하기 시작해서 이로부터 약 7~14일 후 전체 절단면에서 세포가 유도됨이 관찰되었다 (도 3 (b)). 즉, 2,4-D를 사용한 경우에는 형성층 특이적으로 세포주가 유도되지 않음을 볼 수 있었다.

도 3 (b)에 나타난 바와 같이, 2,4-D를 사용한 일반적인 배양 시스템을 사용 하여 배양하였을 경우 전체 절단면에 존재하는 여러 조직 즉, 피층 (cortex), 사부 (phloem), 목부 (xylem), 형성층 (cambium), 수 (pith) 등에서 세포가 유도되어 여러 세포가 섞이게 되므로 유도되어 증식되는 세포는 이질성 (heterogeneity)을 가지게 된다. 그러나, 도 3 (a)에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 절편체에 삼투 스트레스를 처리한 후 해제하고 형성층 유래 세포주 유도 배지에 절편체를 치상하였을 때에는, 형성층에서만 특이적으로 세포가 유도되어 형성층 세포로만 이루어져 있으므로 유도된 세포는 동질성(homogeneity)을 가지게 되는 것이다.

1-4: 인삼 주근부의 형성층 포함 절편체에서 동질적인 형성층 유래 세포주 증식

도 3 (a)에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1의 배지 2에서 배양하여 형성층 이외의 다른 조직이 괴사된 후, 배지 3으로 계대하여 배양하였다. 배지 3은 형성층 유래 세포주의 증식 최적 배지로서 아래 <표 6>에 제시된 기본 염(salt) 조성을 바탕으로 한 것으로 <표 7>에 제시된 것이다.

<표 6> 형성층 유래 세포주 증식 최적 배지의 기본 염 조성

조성		mM	mg/L
Macroelements	CaCl₂ㆍ2H₂O	2.99	332.02
	KH₂PO₄	1.25	170
	KNO₃	18.79	1900
	MgSO₄	1.5	180.54
	NH₄NO₃	20.61	1650
조성		uM	mg/L
Microelements	CoCl₂·6H₂O	0.11	0.025
	CuSO₄·5H₂O	0.1	0.025
	FeNa-EDTA	100	36.7
	H₃BO₃	100.27	6.2
	KI	5.0	0.83
	MnSO₄·4H₂O	100	16.9
	Na₂MoO₄·2H₂O	1.03	0.25
	ZnSO₄·7H₂O	29.91	8.6
Vitamins	Glycine	26.64	2.0
	myo-Inositol	554.94	100
	Nicotinic acid	4.06	0.5
	Pyridoxine-HCl	2.43	0.5
	Thiamine-HCl	0.3	0.1

<표 7> 형성층 유래 세포주의 증식 최적 배지 조성(배지 3)

조성 및 조건	사용농도 및 조건
Salt	Full strength MS
Sucrose	3%(w/v)
2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid)	2mg/L
pH	5.8
Gelrite	0.3%(w/v)
Ascorbic acid	100mg/L
Citric acid	150mg/L

도 4 (a)는 배지 2에 치상된 형성층 포함 절편체에서 형성층 특이적으로 동질적인 세포가 유도되었을 때 <표 7>에 제시된 배지 3에 계대하여 이 동질적인 세포주를 조금 더 증식시켜 나타낸 모습이다.

배지 3에서 배양 시, 분열능을 가지며 동질적인 형성층 유래 세포주는 계속적인 분열·증식을 하였다. 배양 약 10~20일 후에 형성층 유래 세포주를 분리하였고, 이렇게 분리된 세포주는 다시 동일 배지 (배지 3)에서 증식시켰다.

도 4 (b)는 분리된 형성층 유래 세포주를 <표 7>에 제시된 배지 3에서 증식시킨 모습이다. 한편, 증식배지에 2,4-D가 아닌 IAA를 포함하여 배양시킨 경우에는 증식은 되지 않고 분화되는 경향을 보여, 증식을 위한 배지에 IAA를 사용할 수 없는 것으로 나타났다. 도 4 (c)는 형성층 유래 동질성 세포주를, (d)는 인삼 자엽 유래 캘러스(KCTC 10224)를 광학현미경 하에서 단세포 수준으로 관찰한 모습이다.

실시예 2. 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 세포주의 유도 및 증식 (2) - 산삼

2-1: 산삼의 형성층 유래 세포주의 유도

노지산삼을 준비하여 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 표면살균하여 준비하였다. 또한, 생물반응기(bioreactor)에서 유지 중인 100년된 산삼부정근을 준비하고 역시 <표 2>의 CS solution이 담긴 멸균접시에 놓고 역시 상기와 동일한 방법으로 형성층을 포함하는 절편체를 수득하였다. 그 후, 준비된 두 시료에 대하여 역시 실시예 1-2 및 실시예 1-3과 동일한 방법으로 삼투 스트레스 처리를 한 후 형성층 기원의 동질적 세포주를 유도하였다.

그 결과, 상기 실시예 1의 인삼을 이용한 경우와 동일하게 삼투 처리를 하고 해제를 한 후 동질성 세포주 유도배지에 치상한 절편체는, 노지산삼의 형성층 포함 절편체 및 산삼부정근의 형성층 포함 절편체 모두 다른 조직에서는 세포가 유도되지 않고 형성층에서만 특이적으로 동질성 세포가 유도됨이 관찰되었다. 도 5 (a)는 산삼의 형성층 포함 절편체 중 형성층 특이적 분열능을 갖는 동질성 세포주가 유도 된 모습을 나타낸다.

2-2: 산삼의 형성층 유래 세포주의 증식

도 5 (a)에 나타난 바와 같이 삼투 스트레스 처리와 배지 2를 사용하여 형성층에서만 특이적으로 동질성 세포가 유도된 후, 노지산삼의 형성층 포함 절편체에 대하여 실시예 2와 동일한 방법으로 <표 7>에 제시된 배지 3으로 계대한 결과, 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질성 세포가 계속적으로 분열·증식하여 배양 약 10~20일 후에 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질성 세포주를 분리할 수 있었다. 이렇게 분리된 산삼 형성층 유래 동질성 세포주를 동일 배지에서 배양하여 분열능을 갖는 동질성 세포주를 다시 증식시켰다. 도 5 (b)는 분리된 형성층 특이적 동질성 세포주를 <표 7>에 제시된 배지 3에서 증식시킨 모습이다. 또한, 도 5 (c)는 산삼의 형성층 유래 동질성 세포주를 광학현미경 하에서 단세포 수준으로 관찰한 모습이다.

한편, 실시예 2-1의 산삼부정근의 형성층 포함 절편체에 대하여도 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 증식시켰다. 다만, 표 7에서 2,4-D 대신, IBA를 사용하였다. 그 결과, IAA를 포함하여 배양시킨 경우 증식은 되지 않고 분화되는 경향을 보였던 것과 달리, IBA를 사용한 경우에는 분화되지 않고 2,4-D와 동일한 양상으로 증식되었다.

실시예 3. 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 세포주의 유도 및 증식 (3) - 당근

당근(Daucus carota L.)을 준비하여 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 표면살균하여 준비하였다. 그 후, 준비된 시료에 대하여 역시 실시예 1-2 및 실시예 1-3과 동일한 방법으로 삼투 스트레스 처리를 한 후 형성층 유래 세포주를 유도하였다.

그 결과, 상기 실시예 1 및 2와 동일하게 형성층 이외의 다른 조직은 괴사되고 분열능을 갖는 동질적인 세포주인 형성층 유래 세포주가 유도됨을 확인하였다. 도 6은 당근에서 분열능을 갖는 동질적인 세포주인 형성층 유래 세포주가 유도되는 모습이다.

또한, 추가적으로 다른 식물호르몬 중 옥신(auxin)류를 종류별로 IAA, IBA, picloram, 2,4-D, CPA 및 NAA를 동일 농도로 사용하여 유도 배지 사용 호르몬별 영향을 살펴보았다. <표 8>은 유도배지에 옥신류를 종류별로 사용 시 결과를 나타낸 표이다.

<표 8> 당근에서 동일 농도의 옥신(auxin) 종류별 처리시 세포주 유도 양상

호르몬 종류	IAA	IBA	Picloram	CPA	2,4-D	NAA
형성층 중심의 반응	++++	++++	-	-	-	-
기타 사항	형성층 중심의 동질성 세포주 유도		절편체 전체적으로 세포주 유도			절편체 전체적으로 세포주 유도, 시간 경과 시 형성층 부위에서 뿌리 유도

+: 양성; -: 음성

<표 8>에 나타난 바와 같이, 유도배지에 IAA 또는 IBA를 사용한 경우는 형성층 중심의 동질성 세포주가 유도되는 반면, 유도 배지에 피클로람(picloram), CPA, 2,4-D 또는 NAA를 사용한 경우는 형성층 중심의 반응보다는 절편체 전체적으로 세포주가 유도되는 모습이 관찰되었다. 특히 유도배지에 NAA를 사용한 경우 시간이 지날수록(약 4주 경과 시) 형성층 부위에서 뿌리가 유도되어 분화되는 모습이 관찰되었다. 따라서, 형성층 유래 세포주의 유도는 IAA 또는 IBA에 한정되는 것으로 확인되었다.

실시예 4. 분리된 세포주의 특성 관찰

4-1: 형성층 유래 세포주에 대한 장기 배양 확립

상기 실시예 1에서 확보된 인삼의 형성층 유래의 분열능을 갖는 동질적인 세포주 중 생장률이 좋은 희고 무른 세포(white and friable cell)를 매 14일째 새로운 증식 최적 배지(표 7의 배지 3)로 계대하였으며, 대조군으로서 이질적인 세포주인 인삼 자엽 유래의 세포주를 매 28일째 증식 최적 배지로 계대하였다.

그 결과, 형성층 기원의 동질성 세포주는 희고 무른 세포가 배양 11개월째 까지 계속 증식되었다. 또한, 11개월 이상 장기 배양함에도 세포의 생장률, 생장 패턴, 집적(aggregation) 정도에 변화없이 안정적으로 유지되었고, 이질적인 세포주인 인삼 자엽 유래 세포주보다 약 400배 정도 높은 증식율을 보였다.

이에 반하여, 이질성 세포주인 인삼 자엽 유래의 세포는 노란색의 크고 무른 세포(large and friable cell)로, 배양 초기 단계에는 노란색만을 띠면서 4주에 2배씩 증식하는 경향을 보이다가 배양 5개월 이후부터는 증식율이 둔화되는 경향을 보였다. 그 후 1.5배 미만의 증식율을 보임과 동시에 노란색의 세포 이외에, 희거 나 옅은 회색의 워터리 세포(watery cells), 갈색 세포 등이 나타났고, 이러한 세포들은 더 이상 증식을 하지 않고 그대로 존재하거나, 갈변물질이 많이 유도되며 사멸하는 양상을 나타내었다. 이에 배양이 11개월 진행됨에 따라 증식율이 떨어지는 경향을 보였다.

도 7은 인삼의 형성층 유래 세포주(A)와 인삼 자엽 유래 이질적인 세포주(B)의 장기 배양에 있어서 생장 곡선을 보여 준다.

4-2: 세포 현탁배양체 확립

상기 실시예 1 및 2의 인삼 및 산삼의 형성층 유래 세포주를 하기 <표 9>의 액상 배지가 함유된 플라스크에 넣어 암조건에서 25±1℃에서 100rpm의 회전 교반기(shaker)에서 배양하였다. 이때, 인삼 형성층 및 노지산삼의 형성층 유래 세포주는 2,4-D를 사용하여 배양하였고, 산삼부정근의 형성층 유래 세포주는 IBA를 사용하여 배양하였다. 계대배양 주기는 2주일로 고정함으로써 배양세포가 항상 대수생장기 상태에서 높은 활력을 유지할 수 있도록 하였다. 한편, 이질적인 세포주인 인삼 자엽 유래 캘러스(callus, KCTC 10224)도 <표 9>의 배지 4에서 배양하여 본 발명에 따른 분열능을 갖는 동질적인 세포주인 형성층 유래 세포주와 비교하였다.

<표 9> 형성층 유래 세포주의 현탁배양 배지 (배지 4)

조성 및 조건	사용농도 및 조건
Salt	Full strength MS
Sucrose	3%(w/v)
2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 또는 IBA	2mg/L
pH	5.8

세포 응집정도(cell aggregation quantification)를 광학 현미경 하에서(biological microscope CX31, Olympus, Japan)를 관찰한 결과, <표 10>과 같이 본 발명에 따른 형성층 유래 세포주들은 현탁배양 시 단세포 상태로 존재함을 확인할 수 있었다. 이에 반하여, 이질성 세포주인 인삼 자엽 유래 세포주는 90%이상이 큰 응집체(large cell aggregates)로 존재했으며 1% 미만이 단세포(single cell)로 존재함을 확인할 수 있었다. 도 8 (a)는 인삼의 형성층 유래 세포주의 단세포 형태(single cell poplulation)로 존재함을 보이는 현미경 사진이고, (b)는 인삼 자엽 유래 이질적인 세포주의 큰 응집체(large cell aggregation population)로 존재함을 보이는 현미경 사진이다.

<표 10> 형성층 유래 세포주의 장기 배양에서 세포 응집 형태 (cell aggregates type)

Large cell aggregates	Moderate cell aggregates	Small cell aggregates	Single cell population	Explant source
90%	7%	2%	1%	cotyledon
0	0	5%	95%	cambium (인삼)
0	0	5%	95%	cambium (산삼, 2,4-D 처리 시)
5%	10%	25%	60%	cambium (산삼, IBA 처리 시)

Large cell aggregates, size higher than 1.5×10³㎛;

Moderate cell aggregates 1×10³㎛;

Small cell aggregates 4×10²㎛＜size＜ 1×10³㎛

한편, 현미경 관찰 시 본 발명에 따른 형성층 유래 세포주는 도 4 (c)나 도 5 (c)에 나타난 바와 같이, 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 가지는 것으로 확인되었으며, 미분화상태인 것을 확인할 수 있었다. 이에 반하여, 인삼 자엽 유래 캘러스(callus, KCTC 10224)를 관찰한 결과, 도 4 (d)에 나타난 바와 같이, 액포가 거의 관찰되지 않는 것으로 나타났다.

4-3: 대량 배양 ( Scale - up )

대량 배양 가능성을 살펴보기 위하여, 3L의 내용적을 갖는 공기 부양식 생물반응기(airlift bioreactor, 성원사이텍, Korea)에서 이질적인 세포주인 인삼 자엽(cotyledon) 유래 캘러스와 실시예 2 및 3의 형성층 유래 세포주를 배양하였다. 배지는 <표 9>의 액상배지를 사용하였고, 암조건에서 25±1°C로 일정하게 유지하였다.

그 결과, <표 11>에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 분열능을 갖는 동질적인 세포주인 형성층 유래 세포주의 배가시간은 3~6일로 플라스크와 반응기 사이에 차이가 없거나 오히려 단축된 것으로 나타난 데 반하여, 이질적인 세포주인 인삼 자엽(cotyledon) 유래 배양물의 배가시간(doubling time)은 플라스크에서는 21일인데 반해 반응기(reactor)에서는 28일로 길어진 것으로 관찰되었다. 즉, 플라스크에서 배양 시 본 발명에 따른 형성층 유래 세포주가 형성층 이외 조직 유래 세포 주에 비하여 생장속도에서도 3~5배 정도의 높은 증식율을 보임을 확인하였으며, 대량 반응기에서는 본 발명에 따른 형성층 유래 세포주가 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 5~9배의 높은 증식율을 보임을 확인하였다. 이는 이질적인 세포주는 반응기 내에서의 생장고리 생성과 배양중의 식물 배양체 응집성과 세포벽이 단단하여 전단(shear)에 대한 민감성으로 세포 생존율(cell viability)이 급격히 감소한 것이 원인인 것으로 판단되었다.

분열능을 가지며 동질적인 특성을 갖는, 본 발명에 따른 형성층 유래 세포주는 생물반응기 내의 생장고리 면적을 아주 작게 형성하고, 배양기에 간단한 자극을 주어 배지를 움직여주면 내벽의 링(ring)이 간단하게 해소되었다. 또한 응집이 작고, 많은 액포(vacuole)를 가지고 있어 전단에 대한 민감성이 약하여 세포 생존율(cell viability)의 감소를 가져오지 않는 것으로 나타났다. 즉, 본 발명에 따른 형성층 유래 세포주는 대량배양을 위한 생물 반응기에서 교반작용에 따른 전단 스트레스에 대하여 낮은 민감성을 가지므로, 생물반응기 내에서 급속 대량 생장이 가능함을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 형성층 유래 세포주가 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 전단스트레스에 대하여 5~9배의 낮은 민감성을 가짐을 알 수 있었다.

<표 11> 액체 현탁배양 및 생물 반응기에서의 형성층 유래 세포주와 이질적인 세포주인 인삼 자엽 유래 세포주의 배가 시간

Explant source	Doubling time (day)
Explant source	flask	bioreactor
Cytoledon	21	28
cambium(인삼)	5	3~4
cambium(산삼, 2,4-D 처리시)	5	3~4
cambium(산삼, IBA 처리 시)	7	5~6

추가적으로 본 발명에 따른 형성층 유래 세포주는 20L의 내용적을 갖는 공기 부양식 생물반응기(airlift bioreactor, 성원사이텍, Korea)에서도 배양이 가능함을 확인한바(도 9), 대량배양이 가능함을 확인하였다.

4-4: 동결보존( Cryopreservation )

동결보존은 산업화를 위해 선택된 유용 세포주를 장시간 안전하게 보존하는 매우 이상적인 방법이다. 유용한 세포주를 안전하게 보존하는 방법은 다음과 같다.

이질적인 세포주인 인삼 자엽(cotyledon) 유래 캘러스와 형성층 유래 세포주에 대하여 동결보존을 실시하였다. 현탁배양물은 배양 6일에서 8일 된 것을 사용하며, 동결보존제는 0.5M glycerol(DUCHEFA, The Netherlands)과 0.5M DMSO(DUCHEFA, The Netherlands)와 1M sucrose(DUCHEFA, The Netherlands) 포함된 배지이고, 5ml cryovial(Duran, USA)에 옮겼다. 동결보존제에 처리되는 세포 접종량은 200mg/ml 이다. 동결보존제 처리된 현탁세포는 30분간 냉동고에 유지한 다음 deep freezer에 3시간 보관 후 액체질소에 침지시켜 냉동시켰다.

그 후 해빙을 위하여 액체질소에 20분 이상 유지된 배양세포를 꺼내어 40℃ 항온수조에 넣고 1~2분간 해동시켰다. 세포 재생장을 위해, 세포 현탁액을 무균상 태의 깔때기 및 여과지를 사용하였다. 여과된 세포는 filter paper가 포함된 고형생장배지상에 적용시키고 30분간 실온에서 안정화 시킨 다음, 다시 신선한 고형생장배지로 다시 옮겨졌다.

그 결과, 인삼 자엽 유래 이질적인 세포주는 재생장을 하지 않는 반면, 형성층 유래 동질적인 세포주는 4주 후 재생장을 시작하여 증식하는 양상을 보였고 증식률 상에 있어서 동결보존 전 후 차이를 보이지 않았다.

4-5: 엘리시터의 처리

상기 실시예 4-2와 같이 노지산삼 형성층 유래 세포주를 2,4-D를 처리한 배지에서 14일간 현탁배양한 세포주를 이용하여 3가지의 처리구로 나누어 실험을 수행하였다.

즉, (1) 상기 14일간 현탁배양한 세포주 (Growth stage), (2) 상기 14일간 현탁배양한 세포주를 멸균수에 원당 3~5중량%(g/L) 및 메틸 자스모네이트 100μM를 첨가한 배지에서 14일간 암배양한 세포주 (Elicitation 1) 및 (3) 상기 14일간 현탁배양한 세포주에 메틸 자스모네이트 100uM를 첨가한 배지에서 14일간 암배양한 세포주 (Elicitaion 2)를 각각 수거하여 다음의 실험을 수행하였다.

실시예 5: 분리된 세포주의 항노화 및 항산화 효과 확인

5-1: 산삼 형성층 유래 세포주의 추출물 제조

실시예 4-5의 세포주로부터 다음과 같이 추출물을 제조하였다.

즉, 배양액을 제거시킨 세포주(Wet) 및 동결건조세포주(Dry) 500g에 500ml의 DMSO를 가하여 50℃에서 6시간 교반시키면서 용해시켰다. 상기 용해 후, 3,000g에서 10분간 원심분리시켜 상층액을 취함으로써 증류수 가용성물질을 얻었다. 상기에서 얻은 DMSO 가용성물질을 회전진공농축기를 이용하여 농축하고, 농축시료를 동결건조기를 이용하여 건조시키고 DMSO 추출물을 얻었다.

5-2: 산삼 형성층 유래 세포주의 배양액 및 세포주 추출물의 항노화 효과 확인 - UV 에 의한 MMP -1 발현 억제 효능 확인

자외선 노출에 의하여 MMP가 증가되는 경우, 증가된 MMPs는 피부의 콜라겐을 분해하여 피부주름을 형성시키는바, 자외선에 의해 증가된 MMP-1 발현이 산삼 형성층 유래 동질성 세포주 추출물 또는 그 배양액에 의해 억제되는 효과를 확인하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.

시험에 사용된 NHF(normal human fibroblast) 세포는 태아의 음경포피로부터 분리 배양하였다. 세포 배양액은 DMEM (Invitroge Gibco life tech. Vienna, Austriea) 배지에 56℃에서 30분간 가열하여 비활성화시킨 우태아 혈청(FBS, Hyclone, Logan, Utah, USA)을 10%, 페니실린(penicillin) (100unit/㎖)과 스트렙토마이신(streptomycin) (100㎍/㎖) 및 300 ㎍/㎖-glutamine을 첨가하여 조제하였다. 세포는 위의 배양액을 사용하여 37℃, 95% 습도, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였고, 통상적으로 세포가 서로 융합되기 직전인 3~4일 간격으로 계대배양을 하였 다.

NHF(p6)를 12 웰 플레이트에 75,000 세포/well가 되도록 분주하고 24시간 starvation한 후 40 mJ의 UVB를 조사하고, 각 시료를 농도별로 48시간 처리하여 키트(Amersham, RPN 2610)를 이용하여 실험을 수행하였다. 양성 대조군으로는 10uM의 레티노인산(retinoic acid)을 사용하였다.

엘리시테이션 1(Elicitation 1)은 실시예 5-3의 원당 3~5중량%(g/L) 및 메틸 자스모네이트 100μM을 처리한 세포주의 DMSO 추출물을, 엘리시테이션 2(Elicitation 2)는 실시예 5-4의 메틸 자스모네이트 100μM을 처리한 세포주의 DMSO 추출물을, Growth는 실시예 5-4의 14일간 현탁배양한 세포주 (Growth stage)의 DMSO 추출물을 나타내며, Wet은 배양액을 제거시킨 세포주의 DMSO 추출물을, Dry는 동결건조세포주의 DMSO 추출물을 나타내며, Media는 상기 세포주 추출물 제조 시 제거한 배양액을 나타낸다.

<표 12> 산삼 형성층 유래 동질성 세포주 추출물 또는 그 배양액을 이용하여 UV에 의한 MMP-1 발현 억제 효능

시료	단계	농도(ppm or %)	% of control
No UV			100
Control UV			230
Retinoic acid		10uM	85
Wet(ppm)	Elicitation 1	100	125
	Elicitation 1	10	130
	Elicitation2	100	125
	Elicitation2	10	135
	Growth	100	140
	Growth	10	160
Dry(ppm)	Elicitation 1	50	120
	Elicitation 1	10	140
	Elicitation2	50	135
	Elicitation2	10	180
	Growth	50	100
	Growth	10	165
Media(%)	Elicitation 1	1/10	60
	Elicitation 1	1/20	130
	Elicitation2	1/10	60
	Elicitation2	1/20	200
	Growth	1/10	230
	Growth	1/20	250

그 결과, <표 12> 및 도 10에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 세포주 배양액은 음성대조군 (Control UV)과 비교하여 유효하게 MMP-1의 발현을 억제하는 것으로 나타나 주름방지 및 개선효과가 있는 것으로 나타났다. 특히, 원당 및 메틸 자스모네이트를 처리한 Elicitation 1과 메틸 자스모네이트만을 처리한 Elicitation 2의 세포주 배양액 모두 0.1%를 시료로서 처리한 경우 종래 알려진 물질 중 주름개선 효과가 가장 강한 것으로 알려진 레티노인산에 비하여도 매우 우수한 효과를 가지는 것으로 나타났다.

5-3: 산삼 형성층 유래 세포주의 배양액 및 세포주 추출물의 항산화 효과 확인- UV 에 의한 활성산소 억제효능 확인

자외선에 의한 증가된 활성 산소가 산삼 형성층 유래 동질성 세포주 추출물 또는 그 배양액에 의해 억제되는 효과를 확인하기 위하여, 96well black plate에 HaCaT cell을 30,000 세포/웰이 되게 분주하고 각 시료를 농도별로 3시간 동안 처리 하였다. 3시간 후 HBSS로 1번 세척하고 DCF 50uM을 각 웰에 처리하고 37도에서 20분간 반응을 시켰다. HBSS로 2번 세척한 후 Luminator를 이용하여 초기 흡광도를 측정하였다. 여기에 UVB 30mJ을 조사한 후 37도에서 2시간 배양 후 흡광도를 측정하였다. Control은 시료 및 UVB를 첨가하지 않은 것이고, UVB는 시료의 첨가 없이 UVB만 처리한 것을 나타낸다.

<표 13> 산삼 형성층 유래 동질성 세포주 추출물 또는 그 배양액을 이용한 UV에 의한 활성산소 억제 효능

시료	단계	농도(ppm or %)	% of control
Control			100
UVB			140
Wet(ppm)	Elicitation 1	100	80
	Elicitation 1	10	170
	Elicitation2	100	140
	Elicitation2	10	135
	Growth	100	150
	Growth	10	170
Dry(ppm)	Elicitation 1	50	50
	Elicitation 1	10	135
	Elicitation2	50	140
	Elicitation2	10	135
	Growth	50	105
	Growth	10	145
Media(%)	Elicitation 1	10	100
	Elicitation 1	1	130
	Elicitation2	10	130
	Elicitation2	1	105
	Growth	10	110
	Growth	1	120

그 결과, 상기 <표 13> 및 도 11에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 세포주 추출물의 경우 배양액을 제거한 세포주를 이용한 경우(Wet)과 동결건조 세포주를 이용한 경우(Dry) 모두 Elicitation 1의 세포주 추출물에서 우수한 항산화 효과를 보임을 확인하였다. 그 다음으로는 Elicitation 2 단계와 Growth 단계가 비슷하게 나타남을 확인하였다. 또한 Elicitation 1 단계의 동결건조 세포주 추출물 (Dry) 50ppm 처리군에서 항산화 효능이 가장 우수하게 나타남이 확인되었다.

5-4: 진세노사이드 성분의 확인

산삼추출물의 진세노사이드 성분이 피부노화방지 및 항산화에 효과가 있는 것으로 알려져 있는바, 이에 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 그 배양액의 피부노화방지 및 항산화 효과가 이러한 진세노사이드 성분의 효과에 의한 것인지 살펴보기 위하여 진세노사이드 함량을 측정하였다. 즉, 실시예 2에서 제조한 단계별 산삼의 형성층 유래 동질성 세포주와 산삼은 동결건조 시킨 후 동결건조된 세포주 20mg를 메탄올 600ul에 1시간 추출하여 원심분리 후 상층액을 분리한다. 분리된 추출물에 진세노사이드 함량은 UPLC를 이용하여 측정하였으며 함량은 standard Re, Rb1, Rb2, Rd와 비교하여 나타내었다. 또한 배양액은 Elicitation 1 단계의 배양액을 0.2um Syringe 필터를 이용하여 filter한 후 UPLC를 이용하여 측정하였으며 함량은 standard Re, Rb1, Rb2, Rd와 비교하여 나타내었다.

<표 14> 산삼 형성층 유래 동질성 세포주 및 그 배양액과 산삼의 진세노사이드 함량 비교

	산삼의 형성층 유래 세포주			산삼의 형성층 유래 세포주 배양액	산삼
	Growth	Elicitation1	Elicitation2	산삼의 형성층 유래 세포주 배양액
진세노사이드 (Rb1, Rb2, Rd, Re)	0%	0.003%	0.018%	0%	3%

그 결과, 상기 <표 14>에서 볼 수 있는 바와 같이, Elicitation 2의 단계에서 가장 높게 진세노사이드가 나타나기는 하나, 이는 대조군인 산삼 추출물과 대비하여 약 167 배의 차이를 나타내고 성장단계의 산삼 형성층 유래 세포주에서나 세포주 배양액에서는 전혀 진세노사이드가 검출되지 않는바, 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 그 배양액의 피부노화방지 및 항산화 효과는 진세노사이드에 의한 효과가 아니며, 본 발명의 방법으로 분리된 세포주는 통상의 산삼세포와 활성성분이 상이함을 알 수 있었다. 더욱이 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 그 배양액의 피부노화방지 및 항산화 효과는 종래 알려진 물질 중 주름개선효과가 가장 강한 것으로 알려진 레티노인산에 비하여도 매우 우수한 것으로 나타난바, 통상의 산삼 추출물보다 현저히 높은 효과를 가짐을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 본 발명에서 사용한 노지 인삼의 전형적인 모습이다.

도 2는 식물의 저장 조직 중 인삼류 저장근의 형성층 포함 절편체를 제조한 모습이다.

도 3의 (a)는 인삼의 뿌리 형성층 포함 절편체 중 형성층에서만 특이적으로 분열능을 갖는 동질적인 세포주가 유도되는 모습이고, (b)는 일반적인 배양 시스템을 사용하였을 때 절편체의 절단면 전체에서 세포가 유도된 모습을 나타내는 사진이다.

도 4의 (a)는 인삼의 뿌리 형성층 유래 세포주를 유도시킨 후 분리 및 증식 배지로 계대하여 증식시킨 것으로 분리 전 모습이고, (b)는 형성층 유래 세포주를 분리하여 대량증식시킨 모습이고, (c)는 형성층 유래 세포주를, (d)는 인삼 자엽 유래 캘러스(KCTC 10224)를 광학현미경 하에서 단세포 수준으로 관찰한 모습이다.

도 5의 (a)는 산삼 뿌리 형성층 포함 절편체 중 형성층에서만 특이적으로 분열능을 갖는 동질적인 세포주가 유도되는 모습이고, (b)는 형성층 유래 세포주를 분리하여 대량증식시킨 모습이며, (c)는 형성층 유래 세포주를 광학현미경 하에서 단세포 수준으로 관찰한 모습이다.

도 6은 당근 뿌리의 형성층 포함 절편체에서 동질적인 형성층 유래 세포주가 유도되는 모습이다.

도 7은 인삼의 형성층 유래 세포주(A)와 인삼 자엽 유래 세포주(B)의 장기 배양에 따른 생장 곡선이다.

도 8의 (a)는 인삼의 형성층 유래 세포주가 단세포 형태(single cell poplulation)로 존재함을 보이는 현미경 사진이고, (b)는 인삼 자엽 유래 이질적인 세포주가 큰 응집체(large cell aggregation population)로 존재함을 보이는 현미경 사진이다.

도 9는 산삼의 형성층 유래 세포주의 플라스크 배양(ⓐ), 3L 생물반응기 배양 (bioreactor culture) 및 20L 생물반응기 배양 사진이다.

도 10은 정상 인간 피부 섬유아세포(NHF)에 산삼 형성층 유래 동질성 세포주 추출물 또는 그 배양액을 농도별로 처리하고 자외선인 UVB를 처리하여 산삼 형성층 유래 동질성 세포주 추출물 또는 그 배양액에 의해 자외선 조사로 증가된 MMP-1 발현이 억제되는지를 확인한 그래프이다 (ginseng wet cell, ginseng dry cell, ginseng cell-cultured medium, E1: elicitation 1 stage, E2: elicitation 2 stage, G: growth stage, RA: retinoic acid).

도 11은 정상 인간 피부 섬유아세포(NHF)에 산삼 형성층 유래 동질성 세포주 추출물 또는 그 배양액을 농도별로 처리하고 자외선인 UVB를 처리하여 산삼 형성층 유래 동질성 세포주 추출물 또는 그 배양액에 의해 자외선 조사로 증가된 활성산소가 억제되는지를 확인한 그래프이다 (ginseng wet cell, ginseng dry cell, ginseng cell-cultured medium, E1: elicitation 1 stage, E2: elicitation 2 stage, G: growth stage).

Claims

다음 단계를 포함하는, 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 세포주의 분리방법:

(a) 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 함유 저장근 조직을 수득하는 단계;

(b) 분화되고, 형성층이 아닌 세포들이 분열능을 잃도록 상기 조직에 삼투 스트레스를 가하는 단계;

(c) 상기 형성층 함유 저장근 조직을 형성층 분열 특이적 호르몬이 함유된 유도 배지에서 배양함으로써 형성층 세포 분열을 유도하는 단계; 및

(d) 상기 유도된 형성층 유래 세포주를 회수하는 단계.
삭제
제1항에 있어서, 상기 형성층 분열 특이적 호르몬은 옥신(auxin)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 형성층 분열 특이적 호르몬은 IAA(Indole-3-acetic acid), IBA(Indole-3-butyric acid) 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 IAA(Indole-3-acetic acid) 또는 IBA(Indole-3-butyric acid)를 0.1~5mg/l의 농도로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 형성층 유래 세포주를 옥신을 함유하는 증식 최적 배지로 계대하여 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 형성층 유래 세포주를 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 피클로람(picloram) 및 IBA 중 어느 하나 이상의 생장 조절 물질을 함유하는 증식 최적 배지로 계대하여 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 증식 최적 배지는 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D), 피클로람 또는 IBA를 1~5 mg/L의 농도로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 초본 식물은 인삼류, 더덕, 강활, 도라지, 칡, 독활, 방풍, 당귀, 당근, 고구마, 마카 및 카사바로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 인삼류는 산삼 또는 인삼으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 동결에 의해 형성층 유래 세포주를 보존하는 단계를 포함하고, 상기 형성층 유래 세포주는 해동되고, 재생장될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항의 방법에 의해 생산되고, 탈분화되지 않은 선천적 미분화된 세포주.
제12항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 특성 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포주:

(a) 분화된 식물 조직 또는 탈분화된 캘러스로부터 유래되지 않음;

(b) 동질적임; 및

(c) 체세포 변이를 거치지 않음.
제12항에 있어서, 다음의 특징 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포주:

(i) 다수개의 액포를 가지는 형태학적 특징을 나타냄;

(ii) 현탁배양시 단세포 수준으로 존재할 수 있음;

(iii) 분화된 식물 조직 또는 탈분화된 캘러스로부터 유래된 세포주에 비하여, 생물반응기에서 전단 스트레스에 대해 낮은 민감성을 가짐; 및

(iv) 분화된 식물 조직 또는 탈분화된 캘러스로부터 유래된 세포주에 비하여, 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨.
제12항에 있어서, 상기 초본식물은 인삼류, 더덕, 강활, 도라지, 칡, 독활, 방풍, 당귀, 당근, 고구마, 마카 및 카사바로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 세포주.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항의 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 세포주를 동결하는 것을 특징으로 하는 초본식물 세포주의 보존방법.