KR100364478B1 - 초음파를 이용한 식물세포의 고농도 배양방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 초음파를 조사한 후, 식물세포들이 세포분리기 밖으로 유출되기 시작하였을 때, 초음파의 조사를 중단하고, 펌프를 이용하여 역압(back pressure)을 가하여 세포를 생물반응기 내부로 돌려보낸 후, 다시 초음파를 조사하는 방법으로 운전하는 초음파 세포분리기를 사용하여 세포와 배지를 분리하는 것에 의해 식물세포를 고농도로 배양하는 방법에 관한 것이다.

Description

초음파를 이용한 식물세포의 고농도 배양방법{A method for high density cultures of plant cells using ultrasonic waves}

본 발명은 초음파를 이용하여 식물세포를 고농도로 배양하는 방법에 관한 것이다.

세포를 배양하는 방법에는 초기에 한번 배양액과 세포를 넣고 더 이상의 영양물질의 공급이나 제거가 없는 회분식 배양법(batch cultivation)과, 배양기 안에 배양액을 넣고 세포를 배양하는데 있어 외부에서 새로운 배양액을 일정한 속도로 유입시킴과 동시에 같은 속도로 배양 생성물들이 포함된 오래된 배양액을 외부로 유출시켜 세포들이 영양의 고갈없이 계속 배양되도록 유지시키는 연속식 배양방법(continuous cultivation)이 있다.

그러나, 회분식 배양방법은 배양 생성물의 낮은 생산성으로 인하여 상업화를 전제로 할 때 대량생산이 어려운 문제점이 있으므로, 최근에는 연속식 배양방법중, 세포를 배양기 안에 머무르게 하고 생성물을 포함하고 있는 배지를 연속적으로 회수함과 동시에 새로운 배지를 공급하는 관류식(perfusion) 배양 방법이 주목을 받고 있다. 그러나, 이러한 관류식 배양방법을 이용하여 세포를 배양하는데 있어서도 세포를 고농도로 배양하기 위해서는 세포와 배지를 분리하여야 하는데, 이를 위해서 스핀 필터(spin-filter)와 같은 막을 이용하거나 또는 디켄터(decanter)와 같은 중력을 이용한 장치들을 사용하여야 한다.

그러나, 막을 사용하는 경우 막힘 현상이 발생하고, 중력을 사용하는 경우에는 낮은 효율성 때문에 상업화가 어려운 문제점이 있다.

따라서, 종래 이러한 문제점을 개선하기 위하여, 초음파를 이용하여 세포와 배지를 분리하고자 하는 방법이 시도되었으며, 예를 들면, F. Trampler(Bio/TECHNOLOGY, 12, 281~284, 1994)등은 초음파를 이용하여 6×10⁶cells/㎖까지 하이브리도마 2Ell 세포를 배양하였으며, J. Zhang, A.(Biotechnol. Bioeng., 59, 352-359, 1998) 등은 초음파를 이용하여 3×10⁷cells/㎖까지스포도프테라 프르기퍼다(Spodoptera frghiperda)곤충 세포를 배양하였다.

그러나, 종래의 방법은 동물세포 또는 곤충세포를 배양하는데 초음파를 이용한 것으로, 본 발명에서와 같이 식물세포를 배양하는데 초음파를 이용한 예는 없다.

즉, 식물세포는 동물세포와 비교하여, 지름이 약 30배 가량 크고(30~300㎛), 세포끼리 응집되려는 성질이 강하며, 현탁액의 경우에는 끈적끈적한 성질이 있는 등 동물세포와 다른 특징을 가지고 있다. 또한, 식물세포의 낮은 생산성을 극복하기 위하여 동물 또는 곤충세포와 달리 훨씬 높은 농도의 배양조건을 필요로 하는데, 이때 초음파를 이용하여 세포와 배지를 분리하면 초음파를 이용한 세포분리기의 밖으로 세포가 유출되기 때문에, 단순히 초음파를 조사하는 것만으로는 세포와 배지의 분리가 잘 안되는 문제점이 있으므로, 식물세포의 배양에 적합한 세포분리기의 개발이 필요하며 아직 식물세포의 배양에 초음파를 이용한 예는 없다.

그러나, 본 발명자들은 식물세포를 고농도로 배양하는데 있어서, 상기한 문제점을 해결할 수 있는 방법에 대하여 연구를 거듭한 결과, 식물세포의 관류식 배양방법에 있어서, 초음파를 조사한 후, 식물세포들이 세포분리기 밖으로 유출되기 시작하였을 때, 초음파의 조사를 중단하고, 펌프를 이용하여 역압(back pressure)을 가하여 세포를 반응기 내부로 돌려보낸 후, 다시 초음파를 조사하는 방법(이하, '역압방식'이라 한다.)으로 운전하는 초음파 세포분리기를 사용하여 세포와 배지를 분리한다면, 상기한 목적을 달성할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 초음파를 이용하여 식물세포를 고농도로 배양하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 하기 발명의 구성으로부터 더욱 명백해질 것이다.

도 1은 본 발명에서 사용된 초음파 세포분리기의 구조를 나타내는 도면이다.

도 2는 식물세포의 배양시, 시간의 경과에 따른 초음파 세포분리기의 유속과 분리효율의 관계를 나타낸 도면이다.

도 3은 식물세포의 농도를 고농도로 하였을 때, 세포분리기의 유속과 분리효율의 관계를 나타내는 도면으로, 도면에서 화살표는 세포가 초음파 파장부 밖으로 유출되는 시간을 의미한다.

도 4는 식물세포의 배양시, 초음파 세포분리기의 유속과 세포가 초음파 세포분리기에 머물러 있는 시간(잡힘시간(holding time))과의 관계를 나타내는 도면이다.

도 5는 식물세포의 배양시, 초음파 세포분리기의 진동자에 인가된 전압과 잡힘시간과의 관계를 나타낸 도면이다.

도 6은 식물세포의 배양시, 초음파 세포분리기의 진동자와 반사판 사이의 거리와, 초음파장의 부피당 잡힘시간과의 관계를 나타내는 도면이다.

도 7은 초음파 세포 분리기를 이용한 5ℓ 생물반응기에서 관류식 배양을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 방법은, 식물세포를 관류식 배양방법으로 배양하는데 있어서, 초음파를 조사한 후, 식물세포들이 세포분리기 밖으로 유출되기 시작하였을 때, 초음파의 조사를 중단하고, 펌프를 이용하여 역압을 가하여 세포를 생물반응기 내부로 돌려보낸 후, 다시 초음파를 조사하는 방법으로 운전하는 초음파 세포분리기를 사용하여 세포와 배지를 분리함을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

세포의 배양시 배양 생성물의 생산성을 향상시키기 위해 관류식(Perfusion) 배양방법으로 세포를 배양하는데, 이 경우 세포와 배지의 분리가 이루어져야 한다. 따라서, 이를 위해 동물세포나 곤충세포의 배양에서는 초음파를 이용하여 분리를 하였으나, 식물세포는 세포특성상 동물세포나 곤충세포와 달리 주로 고농도로 배양이 이루어지는데, 식물세포에서 처럼 세포의 농도가 고농도일 경우에는 단순히 초음파를 조사하는 방법으로는 세포와 배지의 분리가 잘 이루어지지 않기 때문에, 단순히 초음파를 조사하는 것에 의해서는 식물세포의 고농도 배양이 불가능하다.

따라서, 본 발명에서는 역압방식으로 운전하는 초음파 세포분리기를 사용하여 세포와 배지를 분리함으로써, 식물세포를 고농도로 배양할 수 있다.

본 발명의 배양방법에 사용된 초음파 세포분리기는 도 1과 같은 구조를 가질수 있으며, 그 작동원리는 다음과 같다.

초음파 생성장치(2)에 연결된 진동자(3)로부터 초음파를 발생시키면, 진동자(3)로부터 초음파가 반사판(4)에 조사되고, 반사판(4)에서 반사된 반사파는 정재파(standing wave)를 형성하게 되며, 펌프(6)에 의해 이러한 초음파 파장내에 세포가 유입되면 세포는 정재파의 속도 안티노드(velocity anti-node)로 이동하여 서로 응집되게 되고, 따라서, 응집된 세포들은 중력에 의해 침강되고, 배지는 펌프(6)에 의해 초음파 파장부 밖으로 유출됨으로써 세포와 배지의 분리가 일어나게 되는 것이다.

상기한 원리에 의해 작동되는 초음파 세포분리기를 사용하여 식물세포를 고농도로 배양하기 위해서는 역압방식, 즉, 초음파를 조사한 후, 식물세포들이 세포분리기 밖으로 유출되기 시작하였을 때, 초음파의 조사를 중단하고, 펌프(5)를 이용하여 역압(back pressure)을 가하여 세포를 생물반응기 내부로 돌려보낸 후, 다시 초음파를 조사하는 방법으로 운전하면서 세포를 배양하여야만 한다.

한편, 세포배양에 사용된 초음파는 식물세포의 활성도에 영향을 미치지 않는 범위의 초음파이어야 한다. 따라서, 본 발명에서는 초음파 세포 분리기 중 초음파 생성장치(2)에 연결된 진동자에 45V 이하의 전압, 바람직하게는 약 30V의 전압을 인가하여, 이로부터 발생된 초음파에 의해 세포와 배지를 분리한다.

본 발명의 방법에서, 세포와 배지의 분리능을 좋게 하기 위해서는 초음파 세포분리기의 운전 방식, 예를 들면, 유속, 반사판과 진동자와의 거리 등을 식물세포의 종류에 따라 가장 적합한 조건으로 선정하는 것이 바람직하다. 즉, 유속은 작을수록, 반사판과 진동자 사이의 거리는 짧을수록 세포와 배지의 분리효율이 우수하므로, 식물세포의 종류에 따라 적의하게 선정하여 세포와 배지를 분리한다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

식물세포로서, 무라시케-스툭(M&S) 배지(pH 5.6)에 글루코스 3%, NAA(α-나프탈렌아세틱애시드) 30μM 및 BA(6-벤질아미노퓨린; 6-benzylaminopurine) 10 μM을 첨가한 배지에 알로에 사포나리아 하우(Aloe saponaria Haw)를 접종한 후, 25℃의 암실에서 10일 동안 계대 배양한 세포를 사용하였다.

세포의 농도가 4g/ℓ(이는 식물세포배양에서는 저농도로 볼 수 있음)인 배양물을 각각 0.93㎝/min, 3.7㎝/min의 유속으로 초음파 세포분리기에 유입시켰을 때와, 중력을 이용하여 세포와 배지를 분리하는 세포분리기에 유입시켰을 때의 세포의 분리효율을 하기 수학식 1에 따라 계산하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

식 중,

Co는 반응기내 식물세포의 농도이고

Ci는 초음파 세포 분리기 밖으로 배출되는 용액에서 채취한 식물세포의 농도이다.

도 2로부터, 초음파 세포 분리기의 유속을 0.93cm/min으로 한 경우에는, 초음파를 이용하는 경우와 중력을 이용하는 경우에 있어서 뚜렷한 차이가 없지만, 유속이 3.7cm/min인 경우에는 초음파를 이용하는 경우 분리효율이 67%로, 중력을 이용하여 분리하는 경우의 효율 57%보다 증가한다는 것을 알 수 있고, 아울러, 유속이 작을수록 분리효율이 증가한다는 것을 알 수 있다.

[실시예 2]

식물세포로서, 주목세포(Taxus cuspidata)와 페파민트 세포(Mentha piperita)를 각각 사용한다는 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 세포와 배지를 분리하여 분리효율을 계산하고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

한편, 주목세포는 B5 배지(pH 5.8)에 NAA 10μM, 키네틴 0.5μM, 슈크로스30g/ℓ를 첨가한 후, 10일 간격으로 계대 배양한 세포주를 사용하였고, 페파민트는 Lin-staba 배지(pH 5.7)에 2,4-D 9μM, 슈크로스 30g/ℓ를 첨가하여 10일 간격으로 계대 배양한 세포주를 사용하였다.

세포주및 농도	유속에 따른 분리효율(%)
	0.9 ㎝/min	1.5 ㎝/min	2.0 ㎝/min	3.0 ㎝/min
	대조구	초음파	대조구	초음파	대조구	초음파	대조구	초음파
주목(5.2 g/ℓ)	98	98	65	92	61	76	55	65
페파민트(6.3 g/ℓ)	97	98	67	95	63	78	57	63

표 1로부터, 유속이 0.9cm/min일때는 초음파의 영향을 받지 않지만, 유속이 1.5cm/min 이상인 경우에는 초음파에 의해 분리효율이 향상된다는 것을 알 수 있다. 또한, 상기 실시예 1 및 2로부터, 본 발명의 초음파 세포분리기가 식물세포주의 종류에 상관없이 적용될 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 3]

세포의 농도를 8g/ℓ로 한다는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 세포와 배지를 분리하여 분리효율을 계산하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3으로부터, 초음파 파장내에서 응집된 세포들은 초음파 파장부로 올라오는 고농도의 세포들로 인하여 아래로 침강하지 못하고, 초음파 파장부에 응집 및 축적되게 된다. 그 결과, 일정 시간이 지난 후 초음파 파장부는 용량을 초과하게 되고, 따라서, 초음파 파장부 밖으로 세포들이 배출되는 현상이 발생하기 때문에, 식물세포를 고농도로 배양하는 경우에는 단순히 초음파를 조사하는 것만으로는 세포와 배지의 분리가 잘 되지 않는 다는 것을 알 수 있다.

[실시예 4]

상기 실시예 3으로부터 식물세포를 고농도로 배양하는 경우에는 초음파 파장내에 응집된 세포들이 일정시간이 지난 후 초음파 세포분리기 밖으로 배출되는 현상이 발생한다는 것을 알 수 있다. 따라서, 분리효율 대신에 세포가 초음파 세포분리기에 머물러 있는 시간인 잡힘시간(holding time)으로 초음파 세포분리기의 성능을 평가한다. 즉, 잡힘시간이 길수록 속도 안티노드에서 응집되는 세포들이 많게되고, 따라서, 세포와 배지의 분리가 잘 이루어지므로, 잡힘시간을 측정, 세포분리기 성능을 평가한다.

초음파 세포분리기에서 잡힘시간과 유속과의 관계를 살펴보기 위하여, 세포의 농도를 8g/ℓ로, 초음파 세포분리기의 유속을 0.97, 0.6, 0.2, 0.1cm/min로 한다는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 세포와 배지를 분리하고, 세포의 세포분리기에서의 잡힘시간을 측정, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4로부터, 초음파 세포분리기를 사용하여 세포와 배지를 분리하면 초음파세포분리기의 유속에 반비례하여 잡힘시간이 증가한다는 것을 알 수 있다. 따라서, 식물세포주의 종류에 따라 초음파 세포분리기의 적정 유속이 달라지지만, 일반적으로 본 실험에서 사용한 유속보다 작은영역에서 운전될 것으로 예상되며 그때는 초음파 분리기의 성능이 더욱 향상될 것으로 사료된다.

[실시예 5]

유속을 0.24cm/min로, 세포농도를 17g DCW/L로 일정하게 한 후, 0V, 20V,30V 및 45V의 전압을 진동자에 인가한다는 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 세포와 배지를 분리하고, 잡힘시간을 측정하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5로부터, 초음파 세포분리기에서 초음파를 조사하였을 때는 초음파를 조사하지 않았을 때와 비교하여 최고 10배 정도 잡힘시간이 증가한다는 것을 알 수 있으며, 30V가 최적의 전압임을 알 수 있다.

[실시예 6]

초음파가 세포에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 9일 동안 계대 배양한 알로에 사포나리아 하우 세포에 전압을 20V, 30V 및 40V로 하여 1시간 동안 초음파를 조사한 후, 세포의 활성도를 측정하였다.

활성도는 초음파를 일정시간 조사한 세포를 채취한 후, 2%의 플로로세인 디아세테이트(fluorescein diacetate)에 염색하고, 형광 현미경을 이용하여 형광을 발하는 세포의 수를 측정하여, 하기 수학식 2에 따라 계산하였다. 그 결과는 표 2에 나타내었다.

진동자에 인가된전압	초음파 주사시간(min)
	0	20	40	60
20 V	95	94	94	94
30 V	95	92	92	92
40 V	96	92	91	91
45 V	95	92	92	91

표 4로부터, 45V이하의 전압이 인가된 진동자로부터 발생된 초음파는 세포의 활성도에는 크게 영향을 미치지 않는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에서는, 초음파 생성장치(2)에 연결된 진동자에 약 45V이하의 전압을 인가하여 초음파를 생성시켜 세포와 배지를 분리한다.

[실시예 7]

진동자에 30V의 전압을 인가하고, 진동자와 반사판 사이의 거리를 1.5, 3.0 및 4.5cm로, 유속을 0.97 및 0.6㎝/min으로 변화시키면서 알로에 사포나리아 하우 세포의 초음파 파장의 부피당 잡힘시간을 측정하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6으로부터, 진동자와 반사판 사이의 거리가 작아질수록 초음파 세포분리기의 효율이 증가한다는 것을 알 수 있다.

[실시예 8]

초음파 세포 분리기를 이용하여 알로에 사포나리아 하우를 5ℓ 생물반응기 관류식 세포배양을 수행하였다. 글루코스의 농도가 2% 이하로 떨어지는 지점인 12일부터 관류식 배양을 시작하였다. 주입되는 새로운 배지는 3% 글루코스를 포함하는 실시예 1의 배지조성과 동일하다. 세포의 농도가 8g/ℓ이상의 고농도에서는 실시예 3과 같이 세포가 초음파 세포 분리기 밖으로 유출되는 현상이 발생되므로, 초음파 세포분리기는 다음과 같은 '역압방식'전략을 이용하여 운전하였다.

1) 특정 유속에서 잡힘시간 동안 펌프와 초음파를 동작시킨다.

2) 잡힘시간 이후 세포가 분리기 밖으로 배출될 때 펌프(6)와 초음파의 전원을 끈다.

3) 펌프(5)를 이용하여 초음파 세포분리기에 공기 압력을 가한다.

4) 가해진 압력에 의해 초음파 세포분리기에 잡혀있던 세포들이 반응기로 떨어지게 된다.

5) 펌프(6)를 이용하여 초음파장부까지 세포를 끌어올린 후, 초음파의 스위치를 켜고 '1)'의 방법대로 다시 수행한다.

이와 같은 역압방식을 이용하여 관류속도를 0.1/day, 0.2/day, 0.25/day로 변화를 주면서 운전을 하였다.

그 결과, 회분식 배양에서는 최고 10g/ℓ까지 배양할 수 있었으나, 초음파 세포분리기를 이용한 관류식 배양에서는 19.5g/ℓ까지 배양할 수 있었다(도 7).

상기에서 설명한 바와 같이, 식물세포의 관류식 배양에 있어서, 역압방식으로 운전하는 초음파 세포분리기를 이용하여 세포와 배지를 분리함으로써, 식물세포를 고농도로 배양할 수 있다.

Claims (3)

1. 식물세포를 관류식 배양방법으로 배양하는데 있어서,

   초음파를 조사한 후, 식물세포들이 세포분리기 밖으로 유출되기 시작하였을 때, 초음파의 조사를 중단하고, 펌프를 이용하여 역압(back pressure)을 가하여 세포를 생물반응기 내부로 돌려보낸 후, 다시 초음파를 조사하는 방법으로 운전하는 초음파 세포 분리기를 사용하여 세포와 배지를 분리함을 특징으로 하는 식물세포의 고농도 배양방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 초음파 세포분리기는

   - 생물반응기 (1)

   - 초음파 생성장치 (2),

   - 상기 초음파 생성장치(2)에 연결되어 초음파를 발생시키는 진동자(3)

   - 상기 진동자 (3)로부터 발생된 초음파가 반사되는 반사판 (4)

   - 역압을 가하는 펌프(5) 및

   - 세포와 배지를 초음파 파장부로 끌어올리는 펌프(6)를 포함하는 것을 특징으로 하는 배양방법.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 초음파는 45V이하의 전압에 의해 발생된 것임을 특징으로 하는 방법.