CN103403140A - 细胞黏附性光控制基材 - Google Patents
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Abstract
在活细胞的状态下进行解析、分级分离、培养时,可以更简便地实时操作,并且可以在从培养细胞中除去不需要的细胞使其纯化的同时进行培养。此外,从培养细胞中解析并分级分离所需的细胞,提高该细胞的纯度、回收率、存活率。本发明使用一种细胞黏附性光控制基材,其利用光照射使包含O-硝基苄基骨架的光解离性基团发生键裂,从而使被光照射后的部分的表面从细胞黏附性材料不可逆地变化为细胞非黏附性材料。对细胞图像进行检测、解析,得到所需细胞的位置信息。基于该信息,通过第2光照射来切断细胞/细胞间以及细胞黏附性光控制材料。另一方面,通过第1光照射使该基材的表面从细胞黏附性变化为细胞非黏附性,从而发生细胞/该基材之间的剥离。由此,可以在活细胞的状态下进行解析、分级分离。
Description
技术领域
本发明涉及再生医疗、干细胞研究领域,特别是涉及细胞的解析、分级分离、培养技术。
背景技术
在再生医疗领域中,实施以下操作:对体细胞中含有的极少的成体干细胞、前体细胞进行鉴定、离析,由此进行培养而制作体细胞。此外,作出了利用来自作为成体干细胞之源的iPS细胞、ES细胞的分化诱导而培养为成体干细胞、体细胞的尝试。但是,这些iPS细胞、ES细胞不均匀,而且由其分化诱导得到的细胞也不均匀。产生出各种细胞。对于供于再生医疗的细胞或组织要求作为体细胞的均一性、包含成体干细胞、且不含癌细胞、癌干细胞、iPS细胞、ES细胞等多能性干细胞。
这样一来,在再生医疗领域中,对细胞进行解析、分级分离、培养的技术越来越重要。为了对包含多个种类的细胞群进行分级分离,而需要对其进行识别的解析技术。如果不进一步地从识别出的包含多个种类的细胞群分级分离成单一种类的细胞,则不能解析单一种类的细胞的分子生物学性质、细胞生物学性质。只有实现上述的分级分类,才可以严密地控制分化诱导。进而,需要即使达不到100%分化诱导效率也可以除去不需要的细胞的技术。
作为在活细胞的状态下进行解析的装置,有周知的光学显微镜、用于观察进行了荧光标记的细胞的荧光显微镜、荧光成像装置等,但这些装置不能分级分离细胞。另一方面,作为在活细胞的状态下进行分级分离的装置,有通过细胞表面的抗原与连接于磁珠的抗体的抗原抗体反应来分级分离并收集目标细胞的装置,但该装置不能解析细胞,而且在纯度、回收率等方面存在问题。作为分级分离细胞的装置,还有激光显微切割装置,但其主要用于从被石蜡包埋后的死细胞切片的离析。
作为在活细胞的状态下进行解析、分级分离的装置,有周知的流式细胞仪和分选装置。该装置是使乘载于鞘流的样品流中的细胞逐个接触激光,通过观察散射光、荧光来对细胞进行解析、识别,以该信息为基础,使包含逐个细胞的液滴带电荷,施加电场并进行分级分离的装置。可以通过照射多色的激光来解析多个荧光标记物,但是荧光校正、光轴调整较为烦杂。此外,如果为了预先将细胞块分离成单个细胞而进行胰蛋白酶处理等,则会对细胞造成不小的损伤。进而,被分选出的细胞虽然纯度、回收率高,但存在由于分选时的冲击而导致存活率(viability)降低等问题。此外,为了用该装置进行处理,必须暂时从培养基材中取出细胞。
作为在活细胞的状态下进行解析、分级分离、培养的技术,有专利文献1中记载的方法。该技术涉及以下装置:使用成膜有通过光照射会使其物性发生变化的光响应材料的细胞培养基材,通过监测器识别培养后的细胞,确定所需的细胞的位置,向所需的细胞位置进行图案光照射,将所需的细胞从培养基材剥离。这里记载的“通过光照射会使其物性发生变化的光响应性材料”,可以列举具有如下功能的材料,即,通过光照射会使其发生结构异构化,其极化率、亲水-疏水性发生变化,从而将细胞从培养基材剥离。其中,特别优选使这些物性变化为可逆的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利第3975266号公报
专利文献2:日本专利第3472723号公报
专利文献3:日本特开2004-170930号公报
专利文献4:日本特开2008-167695号公报
非专利文献
非专利文献1:石原一彦,生体材料,18(1),33(2000)。
非专利文献2:Y.Arima et al.,J.Meter.Chem.,17,4079(2007).
非专利文献3:Y.Arima et al.,Biomaterials 28,3074(2007).
非专利文献4:M.N.Yousafet al.,PNAS98(11),5992(2001).
非专利文献5:古田寿昭,光学,34(4),213(2005).
非专利文献6:J.Edahiro et al.,Biomacromolecules,6(2),970(2005).
非专利文献7:J.Nakanishi et al.,Analytical Sciences,24,67(2008)
发明内容
发明要解决的问题
作为上述日本专利第3975266号公报中记载的通过光照射会使其物性发生变化的光响应性材料,通过光发生可逆性结构变化的材料难以100%保持为两个异构体中的一个,这会导致细胞黏附性的选择性降低。此外,如实施例中那样的在长波长的光下发生反应的材料,例如会与荧光观察用的激发光反应,使黏附性发生变化。而且在该技术即便可以将细胞从培养基材剥离,也未考虑到剥离细胞间的黏附。因此,还会遗留以下问题:将培养基材中存在的孤立的细胞或细胞块整个剥离,而不能将包含黏附的多种细胞的细胞块分级分离为单一细胞。
基于以上的现有技术,本发明提供用于在活细胞的状态下进行解析、分级分离、培养的细胞黏附性光控制基材。
本发明所要解决的课题是:在活细胞的状态下进行解析、分级分离、培养时,可以更简便地实时操作,并且可以在从培养细胞中除去不需要的细胞使其纯化的同时进行培养,此外,从培养细胞中解析并分级分离所需的细胞,将该细胞的纯度、回收率、存活率提高到现有水平以上。
用于解决问题的方案
本发明为了解决上述现有技术的问题而采取以下的技术手段。
即,本发明的细胞黏附性光控制基材是将细胞黏附性光控制材料在基材上成膜而成的,上述细胞黏附性光控制材料是介由光解离性基团将细胞黏附性材料键合于细胞非黏附性材料而成的。
此外,本发明的细胞黏附性光控制基材,其利用光照射使光解离性基团发生键裂,从而使细胞黏附性材料脱离,残留细胞非黏附性材料。
此外,本发明的细胞黏附性光控制基材,通过光照射而使光解离性基团发生键裂,被照射后的部分的表面从细胞黏附性材料向细胞非黏附性材料发生不可逆地变化。
此外,使用了本发明的细胞黏附性光控制基材的细胞的解析和分级分离方法包括以下工序。
对细胞黏附性光控制基材接种细胞并进行培养的工序,其中,所述细胞黏附性光控制基材为:将介由光解离性基团使细胞黏附性材料键合于细胞非黏附性材料而得的细胞黏附性光控制材料在基材上成膜而成的细胞黏附性光控制基材;或者,以利用光照射使光解离性基团发生键裂,从而细胞黏附性材料脱离,残留细胞非黏附性材料为特征的细胞黏附性光控制基材;或者,以利用光照射使光解离性基团发生键裂,从而被照射后的部分的表面从细胞黏附性材料不可逆地变化为细胞非黏附性材料为特征的细胞黏附性光控制基材。
利用对所需细胞区域的第1光照射将所需的细胞从基材剥离回收的工序。
此外,使用了本发明的细胞黏附性光控制基材的细胞的解析和分级分离方法包括以下工序。
对细胞黏附性基材进行第1光照射而设置细胞黏附区域和细胞非黏附区域的工序,其中,所述细胞黏附性光控制基材为:将介由光解离性基团使细胞黏附性材料键合于细胞非黏附性材料而得的细胞黏附性光控制材料在基材上成膜而成的细胞黏附性光控制基材;或者,以利用光照射使光解离性基团发生键裂,从而细胞黏附性材料脱离,残留细胞非黏附性材料为特征的细胞黏附性光控制基材;或者,以利用光照射使光解离性基团发生键裂,从而被照射后的部分的表面从细胞黏附性材料不可逆地变化为细胞非黏附性材料为特征的细胞黏附性光控制基材。
此外,使用了本发明的细胞黏附性光控制基材的细胞的解析和分级分离装置具备细胞黏附性光控制基材、和用于使基材上的细胞黏附性光控制材料进行光反应的第1光照射单元,其中,所述细胞黏附性光控制基材为:将介由光解离性基团使细胞黏附性材料键合于细胞非黏附性材料而得的细胞黏附性光控制材料在基材上成膜而成的细胞黏附性光控制基材;或者,以利用光照射使光解离性基团发生键裂,从而细胞黏附性材料脱离,残留细胞非黏附性材料为特征的细胞黏附性光控制基材;或者,以利用光照射使光解离性基团发生键裂,从而被照射后的部分的表面从细胞黏附性材料不可逆地变化为细胞非黏附性材料为特征的细胞黏附性光控制基材。
本说明书中包括作为本申请的优先权的基础的日本国专利申请2011-076462号的说明书和/或附图中记载的内容。
发明效果
在活细胞的状态下进行解析、分级分离、培养时,可以更简便地实时操作,并且可以在从培养细胞中除去不需要的细胞使其纯化的同时进行培养。此外,可以从培养细胞中解析并分级分离所需的细胞,提高细胞的纯度、回收率、存活率。
附图说明
图1是表示对培养中的细胞进行解析、并分级分离所需的细胞的方法(1)的图。
图2是表示对已逐个分离的细胞进行解析、并分级分离所需的细胞的方法(2)的图。
图3是表示对已逐个分离的细胞进行解析、并分级分离所需的细胞的方法(3)的图。
图4是表示式(14)所示的甲基丙烯酸酯单体的1H-NMR图谱的图。
图5是表示式(14)所示的甲基丙烯酸酯单体的IR图谱的图。
图6是表示式(15)所示的甲基丙烯酸酯三元共聚物的1H-NMR图谱的图。
图7是表示式(15)所示的甲基丙烯酸酯三元共聚物的IR图谱的图。
图8是利用细胞数来表示HELA细胞的黏附和因光照射所致的脱附的图。
图9是表示HELA细胞的通常的细胞与因光照射而脱附后的细胞的增值能力比较的图。
具体实施方式
以下示出具体实施方式,但本发明不受其限定。
本发明的一个实施方式是将介由光解离性基团使细胞黏附性材料键合于细胞非黏附性材料而得的细胞黏附性光控制材料在基材上成膜而成的细胞黏附性光控制基材。该细胞黏附性光控制材料可以利用光照射而使光解离性基团发生键裂,从而使细胞黏附性材料从基材脱离。光键裂可以在细胞非黏附性材料与光解离性基团之间或者光解离性基团与细胞黏附性材料之间发生。利用光照射使细胞非黏附性材料残留在基材中。利用该非可逆性光解离反应,可以从细胞黏附性高效地变化为细胞非黏附性,可以改善黏附选择性。
通过使用上述细胞黏附性光控制基材,可以实施特定的细胞解析和分级分离。这里,解析和分级分离是指对细胞进行解析、并与其他细胞进行分级分离。
作为细胞非黏附性材料,可以列举具有与细胞膜类似的结构、且具有生物适合性的磷酰胆碱基的材料。细胞非黏附性材料为例如下述通式(1)所示的具有磷酰胆碱基的(甲基)丙烯酸酯聚合物。
[化学式1]
式中,R1表示氢或甲基,n表示1~20的数值。
此外,下述通式(2)所示的(甲基)丙烯酸酯聚合物也可以作为细胞非黏附性材料使用。
[化学式2]
式中,R1与通式(1)中相同,R2表示C1~C20的亚烷基或1~20个聚氧乙烯基。
作为细胞非黏附性材料,也可以是上述通式(1)和(2)所示的(甲基)丙烯酸酯聚合物的共聚物。进而,作为细胞非黏附性材料,也可以使用下述通式(3)所示的烷氧基硅烷。
[化学式3]
(R3O)3Si—R2—H …(3)
式中,R2与通式(2)中相同,R3表示氢或烷基。
作为细胞黏附性材料,可以列举末端具有细胞黏附性基团的材料。作为细胞黏附性基团,可以列举下述通式(4)所示的基团。
[化学式4]
—X …(4)
式中,X表示羧酸、单羧酸烷基或多羧酸烷基、氨基、单氨基烷基或多氨基烷基、酰胺基、单酰胺烷基或多酰胺烷基、酰肼基、单酰肼烷基或多酰肼烷基、氨基酸基、多肽基或核酸基。
通过改变通式(4)的细胞黏附性基团X,可以获得对各种细胞的黏附性的变化。进而,该细胞黏附性材料也包括使促进与细胞的黏附的细胞外基质、能与细胞的表面抗原结合的抗体、以及用于使该抗体结合的蛋白质等键合或黏附于上述通式(4)所示的基团而得的材料。作为细胞外基质,为胶原类、非胶原性糖蛋白类(纤连蛋白(fibronectin)、玻连蛋白(vitronectin)、层粘连蛋白(laminin)、巢蛋白(nidogen)、腱生蛋白(tenascin)、血小板反应蛋白(thrombospondin)、血管性血友病因子(vonWillebrand factor)、骨桥蛋白(osteopontin)、血纤蛋白原(fibrinogen)等)、弹性蛋白类、蛋白聚糖类等。作为使抗体结合的蛋白质,有抗生物素蛋白(avidin)/生物素、蛋白质A、蛋白质G等。此外,也可以使用抗生物素蛋白/生物素系使抗体结合。
光解离性基团可以在特定波长的光下发生反应、解离。光解离性基团的光反应波长需要为不显示细胞毒性的350nm以上,并且比光学显微镜用入射光、荧光观察用激发光的波长短。由此,在细胞观察时可以避免因细胞观察用的光导致的细胞黏附性变化。作为这样的光解离性基团,可以列举O-硝基苄基、羟基苯甲酰甲基、香豆素基甲基等,特别适合使用下述2价的通式(5)所示的含有O-硝基苄基骨架的基团。
[化学式5]
式中,作为R4,可以使用氢、卤素基、羟基、烷基、羧酸基、羧酸酯基、酰胺基、氨基等;作为R5及R6,可以各自独立地使用氢、烷氧基、乙烯氧基等。此外,m位、p位的相互位置关系也可以改变。进而,还可以将苯环变为萘环。
光解离性基团和细胞黏附性材料的结合形成将通式(4)所示的细胞黏附性基团和通式(5)所示的光解离性基团直接或间接地键合于苯骨架的位置或苄基位而成的结构。光解离在苄基位上发生。例如在使其键合于苯骨架的位置的情况下,如下述通式(6)所示那样,可以介由二价的连接基团R7进行键合。
[化学式6]
在此,R4、R5及R6与通式(5)相同。
作为2价的连接基团R7,可以利用O(CH2)m、O(CH2CH2O)m、OCO(CH2)m、OCOCH2O(CH2CH2O)m(m为0~20的整数)等,但是R7仅具有使光解离性基团和细胞黏附性基团键合的作用。此外,如果使光解离性基团的方向相反,则可以使光解离性基团与细胞黏附性基团之间发生光解离。例如,可以列举以2价的连接基团R8键合于苄基位置而成的结构即下述通式(7)所示的结构。
[化学式7]
在此,R4、R5及R6与通式(5)相同。
作为2价的连接基团,可以利用O、OCO、NH、OCONH、NHCO、S等,R8仅具有使光解离性基团和细胞黏附性基团键合的作用。
上述那样的键合细胞黏附性材料和光解离性基团而成的结构直接或间接地键合于细胞非黏附性材料。
例如,可以形成下述通式(8)或(9)所示的(甲基)丙烯酸酯聚合物的形式,引入到细胞非黏附性材料中。
[化学式8]
[化学式9]
在此,R1、R4、R5、R6、R7及R8如上述所示。R9及R10表示2价的连接基团,可以利用O、CO2、CONH、CO2(CH2CH2O)p、CO2(CH2CH2)pO、CONH(CH2CH2O)p、CONH(CH2CH2)pO(p为1~20的整数)等,但R9及R10仅具有使键合细胞黏附性材料和光解离性基团而成的结构连接到细胞非黏附性材料上的作用。
作为本发明的使键合细胞黏附性基团和光解离性基团而成的结构键合于细胞非黏附性材料而得的材料,可以列举例如:上述通式(1)及(8)所示的(甲基)丙烯酸酯的共聚物;上述通式(1)及(9)所示的(甲基)丙烯酸酯的共聚物;上述通式(1)、(2)及(8)所示的(甲基)丙烯酸酯的共聚物;上述通式(1)、(2)及(9)所示的(甲基)丙烯酸酯的共聚物。通过形成共聚物,可以任意地改变细胞黏附性材料和细胞非黏附性材料的比率,利用比率的变化而提供对各种细胞的黏附性的变化。此外,如果将在这些聚合物的侧链中包含烷氧基硅烷的(甲基)丙烯酸酯进行共聚,则可以进一步提高与基材的黏附性。
这些体系采用共聚物的形式,但是也可以采用均聚物的形式。例如,也可以单独使用具有上述通式(8)或(9)所示的结构的均聚物。通过将这些使键合有细胞黏附性基团和光解离性基团的结合键合于细胞非黏附性材料而得的材料在基材上成膜,从而可以制造细胞黏附性光控制基材。
此外,也可以在利用硅烷偶联以下述通式(10)或(11)所示的烷氧基硅烷的形式在基材上成膜后,制作键合了下述通式(12)或(13)所示的具有导入了细胞黏附性基团X的结构的化合物的细胞黏附性光控制基材。通过这样的工序进行制造,可以防止因预先导入细胞黏附性基团X所致的烷氧基硅烷的水解。通式(10)或通式(11)所示的化合物在R7及R8上键合马来酰亚胺基,也可以将马来酰亚胺基部分变换为上述通式(4)所示的-X。
[化学式10]
[化学式11]
[化学式12]
[化学式13]
在这种情况下,细胞黏附性材料也包括:键合或黏附有促进与细胞的黏附的细胞外基质、与细胞的表面抗原结合的抗体、以及用于使该抗体结合的蛋白质等的材料。
作为成膜这些细胞黏附性光控制材料的基材,也可以使用透明的塑料制培养容器等,但从光学性能、耐久性出发,可适合使用透明的玻璃制培养容器。
接下来,参照附图对使用本细胞黏附性光控制基材解析和分级分离细胞的方法进行详细说明。
图1为表示使用了本发明的细胞黏附性光控制基材的细胞的解析和分级分离方法的一个方式的图。该方法包括工序(1)、(2)、(3)、(4a)及(5a);或者包括工序(1)、(2)、(3)、(4b)及(5b)。在图1中,各工序以左右一组图来表示,左侧图为右侧图的点划线所示部分的截面图。工序说明如下。(1)在成膜于玻璃制培养容器(透明基材)1而成的细胞黏附性的细胞黏附性光控制材料2上接种细胞3,并进行培养。(2)通过显微镜观察(包括透射像、相位差像、微分干涉像等)、荧光观察、散射光观察、拉曼光观察等来检测细胞图像,提取细胞的特征量,然后,(3)在鉴定所需的细胞的同时获得该细胞的位置信息。所需的细胞包括应进行解析和分级分离的需要的细胞和不需要的细胞。此时,通过荧光标记物等对细胞进行标记,荧光标记物标记等既可以在培养前进行,也可以在培养后进行。(4a)在本方式的示例中,(3)所示的细胞4为不需要的细胞,除此以外的细胞3为需要的细胞。通过进行第2光照射5来切断细胞3与细胞4的边界的细胞4侧周边及细胞黏附性光控制材料6。结果使(4a)中矩形所示部分的细胞4被破坏。作为此时的第2光照射5,可适合使用激光。(5a)在存在细胞4的基材上的面积大的情况下,对存在细胞4的区域8进行第1光照射7,使细胞黏附性光控制材料2变成细胞非黏附性,将剩下的细胞4从玻璃制培养容器1剥离,与培养液一起回收。在存在细胞4的基材上的面积小的情况下,可以通过对全部的细胞4及细胞黏附性光控制材料8进行第2光照射5来将其切断和破坏。然后,继续进行培养,逐次除去不需要的细胞4,从而可以在纯化的同时对基材上剩下的细胞3继续进行培养。
另一方面,图1的工序(4b)是为了进行解析而想要分级分离、离析细胞4时(需要细胞4时)的工序。通过进行第2光照射5来切断细胞3与细胞4的边界的细胞3侧周边及细胞黏附性光控制材料6。
作为第2光照射5,可适合使用激光。然后,(5b)对存在细胞4的基材上的区域8进行第1光照射7,使细胞黏附性光控制材料2变成细胞非黏附性,将细胞4从玻璃制培养容器1剥离,与培养液一起回收。回收到的分级分离细胞可以在活细胞的状态下进行解析。
图2为表示使用了本发明的细胞黏附性光控制基材的细胞的解析和分级分离方法的另一方式的图。该方法包括工序(1)、(2)、(3)、(4)、(5)及(6)。在图2中,各工序以左右一组图来表示,左侧图为右侧图的点划线所示部分的截面图。(1)对在玻璃制培养容器1上成膜而成的细胞黏附性的细胞黏附性光控制材料,进行如图所示的第1光照射7,设置细胞黏附区域69和细胞非黏附区域8。细胞黏附区域69和细胞非黏附区域8可以通过改变光的照射图案设定成任意的图案。在图2所示的示例中,将细胞黏附区域69作为1个细胞的面积呈格子状排列。即,按照细胞黏附区域69呈格子状排列的方式进行第1光照射7。此时,期望按照能够鉴定细胞黏附区域的方式分配地址(address)。
(2)接下来,通过胰蛋白酶等处理将已经培养后的细胞块分离成单个细胞,接种在基材上。(3)通过显微镜观察(包括透射像、相位差像、微分干涉像等)、荧光观察、散射光观察、拉曼光观察等来检测细胞图像,提取细胞的特征量,然后,(4)在鉴定所需的细胞的同时获得该细胞的位置信息。所需的细胞包括应进行解析和分级分离的需要的细胞和不需要的细胞。此时,通过荧光标记物等对细胞进行标记,荧光标记物标记等既可以在培养前进行,也可以在培养后进行。在图2所示的示例中,除了细胞3以外,还存在其他细胞(例如细胞4及细胞9)。(5)在全部地址(细胞黏附区域69)均未黏附细胞的情况下,对未黏附细胞的地址的区域进行第1光照射7而成为细胞非黏附性(图中示出的参照符号10的区域)。(6)接下来,对存在所需的细胞、在此为细胞4的区域11进行第1光照射7,将细胞4从玻璃制培养容器剥离,与培养液一起回收。通过逐次重复此(6)的工序,可以对细胞3及9进行进一步的分级分离和离析。
图3为表示使用了本发明的细胞黏附性光控制基材的细胞的解析和分级分离方法的另一方式的图。该方法包括工序(1)、(2)、(3)、(4)、(5)及(6)。在图3中,各工序以左右一组图来表示,左侧图为右侧图的点划线所示部分的截面图。(1)对在玻璃制培养容器1上成膜而成的细胞黏附性的细胞黏附性光控制材料2,隔开规定的间隔沿着行方向和列方向进行第2光照射(例如利用激光的光照射)5,切断相邻的细胞黏附性光控制材料(在图3中切断线如符号6所示)。此外,对规定的位置进行第1光照射7,设置细胞黏附区域69和细胞非黏附区域8。此时,期望按照能够鉴定细胞黏附区域的方式分配地址。
细胞黏附区域69和细胞非黏附区域8,可以通过改变光照射图案设定成任意的图案,在此将细胞黏附区域69作为一个细胞的面积呈格子状排列。(2)接下来,利用胰蛋白酶等处理将已经培养后的细胞块分离成单个细胞,接种在基材上。(3)通过显微镜观察(包括透射像、相位差像、微分干涉像等)、荧光观察、散射光观察、拉曼光观察等来检测细胞图像,提取细胞的特征量,然后,(4)在鉴定所需的细胞的同时获得该细胞的位置信息。所需的细胞包括应进行解析和分级分离的需要的细胞和不需要的细胞。此时,通过荧光标记物等对细胞进行标记,荧光标记物标记等既可以在培养前进行,也可以在培养后进行。在图3所示的示例中,除了细胞3以外,还存在细胞4及细胞9。
(5)在全部细胞黏附区域(地址)69均未黏附细胞的情况下,对未黏附细胞的地址10的区域进行第1光照射7而成为细胞非黏附性。(6)接下来,对存在所需的细胞、在此为细胞4的区域11进行第1光照射7,将细胞4从玻璃制培养容器剥离,与培养液一起回收。通过逐次重复此(6)的工序,可以对细胞3及9进行进一步的分级分离和离析。与图2的不同之处在于:图2所示的方法在细胞黏附性材料的上层具有细胞外基质、如饲养细胞那样的纤维状或膜状物质的情况下,仅通过第1光照射7无法切断每个区域的细胞黏附性材料,图3所示的方法通过进行第2光照射5来切断区域之间。
实施使用了本发明的细胞黏附性光控制基材(例如将细胞黏附性光控制材料在透明基材上成膜而成)的细胞的解析和分级分离方法的装置至少具备以下的(1)、(2)、(3)、(4)、(6)及(7)。
(1)该细胞黏附性光控制基材
(2)该基材的载置台
(3)取得细胞图像的光学检测单元
(4)从细胞图像获得位置信息的单元
(5)用于切断或破坏细胞间及细胞黏附性光控制材料的第2光照射单元
(6)用于使该基材上的细胞黏附性光控制材料发生光反应而变为细胞非黏附性的第1光照射单元
(7)控制各单元动作的单元
作为上述(3)的取得细胞图像的光学检测单元可以使用公知的光学系统。在取得细胞图像时,照射不对细胞黏附性光控制材料的光解离性基团产生影响的波长的光来实施。例如,作为光源,使用获得宽范围的发射光谱的灯或LED,通过用于至少除去光反应波长以下的波长的光的短波长截止滤波器进行光照射,以CCD等二维传感器检测透射光、反射光等。在来自细胞的荧光图像的情况下,由带通干涉滤波器等分光出处于比光反应波长长的波长带且处于目标荧光色素的吸收波长带的光作为激发光来进行照射。也可以使用上述波长带的激光。通过激发光截止滤波器、荧光波长透射滤波器(带通干涉滤波器等)等波长滤波器,以CCD等二维传感器来检测荧光。如果使激发光较细地集中并且采用二维扫描的方式,则也可以由光电倍增管来测量荧光图像。如果切换多个波长滤波器进行测定,则可以得到多个荧光波长的荧光图像,并可以与多个荧光体相对应。如果通过棱镜、衍射光栅等色散元件并由线传感器等进行检测,则也可以获得更微细的波长光谱图像。
上述(5)的第2光照射单元可以使用红外激光器或紫外激光器作为光源,基于由上述(4)的单元得到的位置信息,利用激光扫描来实施。在进行激光扫描时使用XY偏向器,对目标位置进行光照射。此外,也可以通过反映了由上述(4)的单元得到的位置信息的光掩模一并进行光图案照射。在该情况下,为了不制成每次实验时固定的光掩模,通过作为图案发生器的空间光调制器件而在基材上会聚激光的光学系统是合适的。作为空间光调制器件,可以使用反射型或透射型空间光调制器件。作为反射型空间光调制器件,可以使用数字微镜器件,此外,作为透射型空间光调制器件,可以使用液晶空间光调制器件。在此,数字微镜器件、液晶空间光调制器件可使用的激光波长主要是从可见光到近红外光区域。因此,作为激光光源,可以使用水的吸收强的近红外激光。此外,在想要将波长设定在紫外区域的情况下,使用将可见光至近红外激光通过空间光调制器件后,通过非线性结晶、铁电体结晶等波长变换器件而使波长变成1/2、1/3的第二谐波、第三谐波。
对于上述(6)的第1光照射单元,其光源使用细胞黏附性光控制基材的光反应波长。可以使用获得宽范围的发射光谱的灯或LED等,利用波长滤波器阻断360nm以下和根据情况阻断荧光激发波长以上的波长的光;或者也可以使用光反应波长的激光。可以基于由上述(4)的单元得到的位置信息,使用XY偏向器进行光扫描,对目标位置进行光照射;或者也可以通过反映了由上述(4)的单元得到的位置信息的光掩模一并进行图案光照射。在该情况下,为了不制成每次实验时固定的光掩模,通过作为图案发生器的空间光调制器件而在基材上进行聚光的光学系统是合适的。作为空间光调制器件,可以使用反射型或透射型空间光调制器件。作为反射型空间光调制器件,可以使用数字微镜器件,此外,作为透射型空间光调制器件,可以使用液晶空间光调制器件。
期望上述(3)、(5)及(6)的光学系统尽量使用通用的部件。
以下,示出用于验证作为本发明的一个方式的原理的实施例,但本发明不受其限定。
实施例
[实施例1]
式(14)所示的甲基丙烯酸酯单体的合成
[化学式14]
将0.3g的羟乙基光解连接体(Hydroxy Ethyl Photolabile Linker)溶解到2.56g的二氯甲烷、0.3g的三乙胺中。以氩气对混合液进行10分钟的脱气处理。接下来,在0℃条件下添加0.52g的甲基丙烯酰氯,在室温下搅拌一昼夜。以5%碳酸钠水溶液、稀盐酸、及蒸馏水的顺序洗涤反应溶液。通过减压操作使挥发性成分蒸发。将得到的液体再溶解到50%丙酮溶液中。混合溶液在室温下搅拌一昼夜,使用二氯甲烷提取光解离性单体。以稀盐酸及蒸馏水的顺序洗涤所提取出的二氯甲烷层。对得到的化合物进行真空干燥,然后进行冷冻干燥。上述操作全部在遮光状态下实施。1H-NMR光谱及IR光谱分别如图4及图5所示。
式(15)所示的甲基丙烯酸酯三元共聚物的合成
[化学式15]
甲基丙烯酸酯三元共聚物使用2,2′-偶氮二异丁腈(聚合引发剂)通过自由基聚合反应来合成。将各单体(25:50:25摩尔%)及AIBN的混合物投入到聚合管中,按照使单体浓度为0.38M的方式溶解到二烷/乙醇=1/1(v/v)的混合溶剂中。使用氩气进行10分钟脱气处理后,封管。将聚合管投入到设定为60℃的油浴中,使之反应48小时。反应后冷却到室温,投入到乙醚/氯仿=6/4(v/v)的不良溶剂中,得到沉淀物。Mw:1.1×104、Mw/Mn:1.65。1H-NMR光谱及IR光谱分别如图6及图7所示。
在式(15)所示的三元共聚物表面的由光照射引起的细胞脱附
将式(15)所示的三元共聚物的0.5wt%乙醇溶液浸涂在玻璃基材上,制作细胞黏附性光控制基材。在其上接种HeLa细胞2×104个,在37℃、5%CO2条件下静置3小时。接下来,照射365nm(80mW/cm2)的光,立即回收上清液,对细胞数进行计数。然后,洗涤光照射后的基材,使用胰蛋白酶回收残留的黏附细胞,对细胞数进行计数。结果:如图8所示那样,剥离的细胞的比例随着光照射时间而增加。在其他实验中,发现91%的细胞黏附后,通过60秒的光照射而使67%的细胞发生剥离。另外,如果将光照射时间延长到180秒、300秒、600秒,则回收得到的细胞中的活细胞数减少,而在60秒时没有光毒性的影响,如图9所示那样,回收得到的细胞与普通细胞同样地增殖。
[比较例]
在聚苯乙烯培养基材上接种HeLa细胞2×104个,在37℃、5%CO2条件下静置3小时。接下来,照射365nm(80mW/cm2)的光,立即回收上清液,对细胞数进行计数。然后,洗涤光照射后的基材,使用胰蛋白酶回收残留的黏附细胞,对细胞数进行计数。结果:86%的细胞黏附,通过60秒的光照射而使5%的细胞剥离。
本例虽然只是一个示例,但是,通过对细胞黏附性光控制材料的细胞黏附性基团进行适当地选择、对细胞黏附性材料和细胞非黏附性材料的比例进行适当地控制,从而可以使各种细胞黏附。此外,由于通过光解离反应使其从细胞黏附性高效且不可逆地变化为非黏附性,因此细胞与该基材的黏附选择性优异,并且,由于细胞间的黏附及细胞黏附性光控制材料可以通过激光来切断,因此对存在于任意区域的所需细胞进行回收时,可以提高该细胞的纯度、回收率。进而,在进行细胞培养时,无需如流式细胞仪或分选装置那样将细胞从培养基材中暂时取出并且纯化,可以边在相同的培养基材上实时地去除不需要的细胞边进行培养,从而使培养、纯化的操作变得简单。即使正常细胞与异常细胞密合、掺混,也能在空间上分离正常细胞与异常细胞,可以使异常细胞区域被区分开。由此,可以将光解离反应限定在异常细胞区域,可以将异常细胞进行选择性剥离。暂时被剥离的细胞因原来的场所不可逆性地变成细胞非黏附性而不会再黏附,可以有效地去除异常细胞。进而,不存在如流式细胞仪或分选装置那样的电刺激、冲击,并且通过控制光反应波长、显微镜观察用光波长、荧光观察用激发光波长也可以减少对细胞的光毒性,因此,可以提高细胞的存活率。进而,由于将细胞排列在二维平面上、大致同时地对各细胞进行光照射并进行显微镜或荧光观察,因此不需要如流式细胞仪那样用于一维地排列细胞而使各个细胞接触激的光轴调整。
本说明书中引用的全部出版物、专利及专利申请直接作为参考引入本说明书中。
符号说明
1 透明基材
2 细胞黏附性光控制材料
3、4、9 细胞
5 第2光照射
6 细胞间及细胞黏附性光控制材料的切断区域
7 第1光照射
8 通过光反应使其从细胞黏附性变为非黏附性的区域(细胞非黏附区域)
10、11 通过光反应使其从细胞黏附性变为非黏附性的区域
69 细胞黏附区域
Claims (14)
1.一种细胞黏附性光控制基材,其特征在于,其利用光照射使包含O-硝基苄基骨架的光解离性基团发生键裂,从而使被光照射后的部分的基材表面从细胞黏附性材料不可逆地变化为细胞非黏附性材料。
2.一种细胞黏附性光控制基材,其是将细胞黏附性光控制材料在基材上成膜而成的,
所述细胞黏附性光控制材料是介由包含O-硝基苄基骨架的光解离性基团将细胞黏附性材料键合于细胞非黏附性材料而成的。
3.一种细胞黏附性光控制基材,其特征在于,其利用光照射使包含O-硝基苄基骨架的光解离性基团发生键裂,从而使细胞黏附性材料脱离,残留细胞非黏附性材料。
5.根据权利要求1~3中任一项所述的细胞黏附性光控制基材,其特征在于,所述细胞黏附性光控制材料包含将通式(4)所示的细胞黏附性基团和通式(5)所示的光解离性基团直接或间接地键合于苯骨架或苄基位而成的结构,
-X …(4)
式(4)中,X表示选自由羧酸、单羧酸烷基或多羧酸烷基、氨基、单氨基烷基或多氨基烷基、酰胺基、单酰胺烷基或多酰胺烷基、酰肼基、单酰肼烷基或多酰肼烷基、氨基酸基、多肽基及核酸基组成的组中的基团,
式(5)中,R4是选自由氢、卤素基、羟基、烷基、羧酸基、羧酸酯基、酰胺基及氨基组成的组中的基团,R5及R6各自独立地为选自由氢、烷氧基及乙烯氧基组成的组中的基团,m位、p位的相互位置关系能够变更。
6.根据权利要求1~3中任一项所述的细胞黏附性光控制基材,其特征在于,所述细胞黏附性光控制材料包含介由二价的连接基团R7将下述通式(6)所示的光解离性基团和细胞黏附性基团键合于苯骨架而成的结构,
式(6)中,X表示选自由羧酸、单羧酸烷基或多羧酸烷基、氨基、单氨基烷基或多氨基烷基、酰胺基、单酰胺烷基或多酰胺烷基、酰肼基、单酰肼烷基或多酰肼烷基、氨基酸基、多肽基及核酸基组成的组中的基团,R4表示选自由氢、卤素基、羟基、烷基、羧酸基、羧酸酯基、酰胺基及氨基组成的组中的基团,R5及R6各自独立地表示选自由氢、烷氧基及乙烯氧基组成的组中的基团,m位、p位的相互位置关系能够变更;R7表示选自O(CH2)m、O(CH2CH2O)m、OCO(CH2)m、OCOCH2O(CH2CH2O)m中的2价的连接基团,其中,m为0~20的整数。
7.根据权利要求1~3中任一项所述的细胞黏附性光控制基材,其特征在于,所述细胞黏附性光控制材料包含将下述通式(7)所示的光解离性基团和细胞黏附性基团键合于苄基位而成的结构,
式(7)中,X表示选自由羧酸、单羧酸烷基或多羧酸烷基、氨基、单氨基烷基或多氨基烷基、酰胺基、单酰胺烷基或多酰胺烷基、酰肼基、单酰肼烷基或多酰肼烷基、氨基酸基、多肽基及核酸基组成的组中的基团,R4表示选自由氢、卤素基、羟基、烷基、羧酸基、羧酸酯基、酰胺基及氨基组成的组中的基团,R5及R6各自独立地表示选自由氢、烷氧基及乙烯氧基组成的组中的基团,m位、p位的相互位置关系能够变更,R8表示选自由O、OCO、NH、OCONH及NHCO组成的组中的2价的连接基团。
8.根据权利要求1~3中任一项所述的细胞黏附性光控制基材,其特征在于,所述细胞黏附性光控制材料包含以下结构:将通式(4)所示的细胞黏附性基团和通式(5)所示的光解离性基团直接或间接地键合于O-硝基苄基骨架的苯环或苄基位,并将所得的所述结构直接或间接地键合于所述细胞非黏附性材料而成的结构,
-X …(4)
式(4)中,X表示选自由羧酸、单羧酸烷基或多羧酸烷基、氨基、单氨基烷基或多氨基烷基、酰胺基、单酰胺烷基或多酰胺烷基、酰肼基、单酰肼烷基或多酰肼烷基、氨基酸基、多肽基及核酸基组成的组中的基团,
式(5)中,R4是选自由氢、卤素基、羟基、烷基、羧酸基、羧酸酯基、酰胺基及氨基组成的组中的基团,R5及R6各自独立地表示选自由氢、烷氧基及乙烯氧基组成的组中的基团,m位、p位的相互位置关系能够变更。
9.根据权利要求1~3中任一项所述的细胞黏附性光控制基材,其特征在于,所述细胞黏附性光控制材料包含下述通式(8)所示的结构,
式(8)中,R1表示氢或甲基,R4是选自由氢、卤素基、羟基、烷基、羧酸基、羧酸酯基、酰胺基及氨基组成的组中的基团,R5及R6各自独立地为选自由氢、烷氧基及乙烯氧基组成的组中的基团,m位、p位的相互位置关系能够变更;R7表示选自由O(CH2)m、O(CH2CH2O)m、OCO(CH2)m及OCOCH2O(CH2CH2O)m组成的组中的2价的连接基团,其中,m为0~20的整数;R9表示选自由O、CO2、CONH、CO2(CH2CH2O)p、CO2(CH2CH2)pO、CONH(CH2CH2O)p及CONH(CH2CH2)pO组成的组中的2价的连接基团,其中,p为1~20的整数;X表示选自由羧酸、单羧酸烷基或多羧酸烷基、氨基、单氨基烷基或多氨基烷基、酰胺基、单酰胺烷基或多酰胺烷基、酰肼基、单酰肼烷基或多酰肼烷基、氨基酸基、多肽基及核酸基组成的组中的基团。
10.根据权利要求1~3中任一项所述的细胞黏附性光控制基材,其特征在于,所述细胞黏附性光控制材料包含下述通式(9)所示的结构,
式(9)中,R1表示氢或甲基,R4是选自由氢、卤素基、羟基、烷基、羧酸基、羧酸酯基、酰胺基及氨基组成的组中的基团,R5及R6为选自由氢、烷氧基及乙烯氧基组成的组中的基团,m位、p位的相互位置关系能够变更;R8表示选自由O、OCO、NH、OCONH及NHCO组成的组中的2价的连接基团;R10表示选自由O、CO2、CONH、CO2(CH2CH2O)p、CO2(CH2CH2)pO、CONH(CH2CH2O)p及CONH(CH2CH2)pO组成的组中的2价的连接基团,其中,p为1~20的整数;X表示选自由羧酸、单羧酸烷基或多羧酸烷基、氨基、单氨基烷基或多氨基烷基、酰胺基、单酰胺烷基或多酰胺烷基、酰肼基、单酰肼烷基或多酰肼烷基、氨基酸基、多肽基及核酸基组成的组中的基团。
11.根据权利要求1~3中任一项所述的细胞黏附性光控制基材,其特征在于,所述细胞黏附性光控制材料包含下述通式(1)及(8)所示的(甲基)丙烯酸酯的共聚物、下述通式(1)及(9)所示的(甲基)丙烯酸酯的共聚物、下述通式(1)、(8)及(2)所示的(甲基)丙烯酸酯的共聚物、或下述通式(1)、(9)及(2)所示的(甲基)丙烯酸酯的共聚物中的任一种,
式中,R1表示氢或甲基,R2表示C1~C20的亚烷基或1~20个聚氧乙烯基,R4是选自由氢、卤素基、羟基、烷基、羧酸基、羧酸酯基、酰胺基及氨基组成的组中的基团,R5及R6各自独立地为选自由氢、烷氧基及乙烯氧基组成的组中的基团,m位、p位的相互位置关系能够变更;R7表示选自由O(CH2)m、O(CH2CH2O)m、OCO(CH2)m及OCOCH2O(CH2CH2O)m组成的组中的2价的连接基团,其中,m为0~20的整数;R8表示选自由O、OCO、NH、OCONH及NHCO组成的组中的2价的连接基团;R9及R10表示选自由O、CO2、CONH、CO2(CH2CH2O)p、CO2(CH2CH2)pO、CONH(CH2CH2O)p及CONH(CH2CH2)pO组成的组中的2价的连接基团,其中,p为1~20的整数;X表示选自由羧酸、单羧酸烷基或多羧酸烷基、氨基、单氨基烷基或多氨基烷基、酰胺基、单酰胺烷基或多酰胺烷基、酰肼基、单酰肼烷基或多酰肼烷基、氨基酸基、多肽基及核酸基组成的组中的基团。
12.根据权利要求1~3中任一项所述的细胞黏附性光控制基材,其特征在于,所述细胞黏附性光控制材料是将侧链中含有烷氧基硅烷的(甲基)丙烯酸酯共聚而成的。
13.根据权利要求1~3中任一项所述的细胞黏附性光控制基材,其特征在于,所述细胞黏附性光控制材料如下形成:将下述通式(10)所示的烷氧基硅烷在基材上成膜后,导入细胞黏附性基团X,从而形成该细胞黏附性光控制材料,
式(10)中,R2表示C1~C20的亚烷基或1~20个聚氧乙烯基,R3表示氢或烷基,R4是选自由氢、卤素基、羟基、烷基、羧酸基、羧酸酯基、酰胺基及氨基组成的组中的基团,R5及R6各自独立地为选自由氢、烷氧基及乙烯氧基组成的组中的基团,m位、p位的相互位置关系能够变更;R7表示选自由O(CH2)m、O(CH2CH2O)m、OCO(CH2)m及OCOCH2O(CH2CH2O)m组成的组中的2价的连接基团,m为0~20的整数;R9表示选自由O、CO2、CONH、CO2(CH2CH2O)p、CO2(CH2CH2)pO、CONH(CH2CH2O)p及CONH(CH2CH2)pO组成的组中的2价的连接基团,其中,p为1~20的整数;X表示选自由羧酸、单羧酸烷基或多羧酸烷基、氨基、单氨基烷基或多氨基烷基、酰胺基、单酰胺烷基或多酰胺烷基、酰肼基、单酰肼烷基或多酰肼烷基、氨基酸基、多肽基及核酸基组成的组中的基团。
14.根据权利要求1~3中任一项所述的细胞黏附性光控制基材,其特征在于,所述细胞黏附性光控制材料如下形成:将下述通式(11)所示的烷氧基硅烷在基材上成膜后,导入细胞黏附性基团X,从而形成该细胞黏附性光控制材料,
式(11)中,R2表示C1~C20的亚烷基或1~20个聚氧乙烯基,R3表示氢或烷基,R4是选自由氢、卤素基、羟基、烷基、羧酸基、羧酸酯基、酰胺基及氨基组成的组中的基团,R5及R6为选自由氢、烷氧基及乙烯氧基组成的组中的基团,m位、p位的相互位置关系能够变更;R8表示选自由O、OCO、NH、OCONH及NHCO组成的组中的2价的连接基团;R10表示选自由O、CO2、CONH、CO2(CH2CH2O)p、CO2(CH2CH2)pO、CONH(CH2CH2O)p及CONH(CH2CH2)pO组成的组中的2价的连接基团,其中,p为1~20的整数;X表示选自由羧酸、单羧酸烷基或多羧酸烷基、氨基、单氨基烷基或多氨基烷基、酰胺基、单酰胺烷基或多酰胺烷基、酰肼基、单酰肼烷基或多酰肼烷基、氨基酸基、多肽基及核酸基组成的组中的基团。
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