CN110192140A - 用于循环荧光成像的系统和方法 - Google Patents

用于循环荧光成像的系统和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110192140A
CN110192140A CN201780083120.4A CN201780083120A CN110192140A CN 110192140 A CN110192140 A CN 110192140A CN 201780083120 A CN201780083120 A CN 201780083120A CN 110192140 A CN110192140 A CN 110192140A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
minutes
label
less
substrate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780083120.4A
Other languages
English (en)
Inventor
D·T·邱
郭俊廷
吴丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Washington
Original Assignee
University of Washington
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Washington filed Critical University of Washington
Publication of CN110192140A publication Critical patent/CN110192140A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/554—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being a biological cell or cell fragment, e.g. bacteria, yeast cells
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502715—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by interfacing components, e.g. fluidic, electrical, optical or mechanical interfaces
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1484—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry microstructural devices
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/04—Closures and closing means
    • B01L2300/046—Function or devices integrated in the closure
    • B01L2300/047—Additional chamber, reservoir
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0819—Microarrays; Biochips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0883—Serpentine channels
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/18—Means for temperature control
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6432—Quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

用于在科学实验、工业应用和临床研究的情境下的改进的对分子或细胞进行标记和/或去标记的方法和系统，包括以有效方式重复标记和去标记的过程的手段。

Description

用于循环荧光成像的系统和方法
交叉引用
本申请要求于2016年11月16日提交的美国临时申请第62/422,956号的权益，所述美国临时申请通过引用其全文结合在本文中。
背景技术
标记和检测分子在科学研究、临床治疗和工业应用中是有用的。在生物情境中标记分子可以允许识别特定的感兴趣分子，其在限定的实验条件下确定该分子的存在或不存在的过程中可以是有用的。在实验系统中检测被标记的分子可用于确定与被标记的分子相结合的细胞的特性，诸如细胞表型。细胞中的超过一种分子类型可同时被标记以便提供关于实验系统状态的更多信息。通过改进在标记和检测感兴趣分子的过程中使用的方法和系统，这些方法和系统在科学研究、临床治疗和工业应用的情境下的效用将增加。
发明内容
本文描述了对细胞或分子进行极快标记和去标记的方法，所述方法包括：提供与基材相结合的细胞或分子；用可检测试剂来检测所述细胞或分子；用所述可检测试剂来标记所述细胞或分子的多个位点；在所述细胞或分子上施加电压；以及将所述细胞或分子去标记，其中去标记包括移除或猝灭所述细胞或分子上的所述可检测试剂。本文还描述了极快标记的方法，所述方法包括：提供与基材相结合的细胞或分子；将所述细胞或分子加热到受控制的温度；使用流动池(flow cell)将可检测试剂递送至所述细胞或分子；以及使所述细胞或分子与所述可检测试剂接触。本文还描述了对被标记的细胞或分子进行去标记的方法，所述方法包括：提供与基材相结合的细胞或分子，其中所述细胞或分子被用多个可检测试剂来标记；以及将电压施加到被标记的细胞或分子；以及在少于15分钟内对所述被标记的细胞或分子上的所述多个可检测试剂中的至少75％进行去标记。本文还描述了用于对细胞或分子进行标记和去标记的系统，所述系统包括：基材，所述基材被配置为保持细胞或分子；第一可检测试剂；流动池，所述流动池被配置为跨所述细胞或分子传递流体；电压源；温度控制设备，所述温度控制设备被配置为将所述细胞或分子加热至温度设定点，其中将所述细胞或分子的所述温度控制在温度设定点的3摄氏度内；检测器，所述检测器被配置为检测第一可检测试剂；计算设备，所述计算设备被配置为操作所述电压源和所述检测器，所述计算设备包括处理器和非瞬态有形计算机可读存储介质，所述存储介质存储指令集，所述指令集在由处理器执行时使所述检测器检测第一可检测试剂信号；以及电压源，所述电压源向与所述细胞或分子相接触的溶液施加电压。
在各种方面中，本文所描述的方法包括用于对细胞进行标记和去标记的方法，所述方法包括：提供与基材相结合的细胞；使所述细胞与可检测试剂接触；用所述可检测试剂来标记所述细胞的多个位点；在所述细胞两端施加电压；以及对所述细胞进行去标记，其中去标记包括移除或猝灭所述细胞上的所述可检测试剂。
在各种方面中，本文所描述的方法包括用于对细胞进行标记和去标记的方法，所述方法包括：提供与基材相结合的细胞；使所述细胞与可检测试剂接触；用所述可检测试剂来标记所述细胞的多个位点；对与所述细胞接触的溶液施加电压；以及对所述细胞进行去标记。
在各种方面中，对与所述细胞接触的溶液施加电压产生一个或多个反应化学物质。在各种方面中，对细胞进行去标记包括使所述可检测试剂与所述一个或多个反应化学物质接触。
在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可进一步包括在标记了所述多个位点之后检测所述可检测试剂。在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括其中所述检测包括光学检测所述可检测试剂的方法。
在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的所述方法可包括在少于20分钟、少于15分钟、少于10分钟、少于9分钟、少于8分钟、少于7分钟、少于6分钟、少于5分钟、少于4分钟或少于3分钟内对细胞进行标记和去标记。
在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括重复标记和去标记的方法多次。在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可在30分钟内被执行2次、在45分钟内被执行3次、在60分钟内被执行4次、在75分钟内被执行5次或在90分钟内被执行6次。
在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括循环地重复标记和去标记的方法至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少10次或至少50次。
在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可进一步包括用多个可检测试剂来标记所述细胞或者对用多个可检测试剂来标记的所述细胞进行成像。在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括其中所述多个可检测试剂可单独接触所述细胞或可组合地接触所述细胞的方法。
在用于对细胞进行标记和去标记的方法的一些方面中，可进一步包括将所述细胞的所述温度控制在26℃至60℃、30℃至45℃、35℃至45℃、35℃至40℃、36.5℃至37.5℃。在各种方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括其中所述温度可被控制在所述温度设定点的0.5摄氏度、1摄氏度、2摄氏度或3摄氏度内的方法。
在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括其中所述可检测试剂与抗体共价连接的方法，其中在所述标记期间浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至10μg/ml、或0.1μg/ml至5μg/ml。在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括其中所述可检测试剂与CD4抗体共价连接的方法，其中在所述标记期间所述CD4抗体的浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至10μg/ml、或0.1μg/ml至5μg/ml之间。在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括其中所述可检测试剂与CD3抗体共价连接的方法，其中在所述标记期间所述CD3抗体的浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至10μg/ml、或0.1μg/ml至5μg/ml之间。在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括其中所述可检测试剂与CD28抗体共价连接的方法，其中在所述标记期间所述CD28抗体的浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至10μg/ml、或0.1μg/ml至5μg/ml之间。
在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括其中所述可检测试剂与核酸共价连接的方法，其中在所述标记期间所述核酸的浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至50μg/ml、或0.1μg/ml至5μg/ml之间。在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括其中所述可检测试剂与核糖核酸共价连接的方法，其中在所述标记期间所述核糖核酸的浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至50μg/ml、或0.1μg/ml至5μg/ml之间。在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括其中所述可检测试剂与脱氧核糖核酸共价连接的方法，其中在所述标记期间所述脱氧核糖核酸的浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至50μg/ml、或0.1μg/ml至5μg/ml之间。
在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可进一步包括使所述细胞与所述可检测试剂接触长达以下时间：10秒至15分钟、30秒至10分钟、1分钟至8分钟或2分钟至6分钟、不超过5分钟、不超过7.5分钟、或不超过10分钟。
在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括其中所述细胞的所述多个位点中的一部分被标记的方法，所述一部分为至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括其中用所述可检测试剂在以下时间内标记所述细胞的所述位点中的所述一部分：不超过15分钟、不超过10分钟、不超过7.5分钟、不超过5分钟、不超过4分钟、不超过3分钟、不超过2分钟、或不超过1分钟。
在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括如下方法：其中，所述多个可检测试剂的饱和度大于相比于在相同条件下(除了在20℃下执行第二细胞的标记达1小时之外)标记的第二细胞的饱和度的25％、50％、75％或90％。
在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括如下方法：其中施加到与所述细胞接触的所述溶液的所述电压可为1V至100V、1V至50V、1V至25V、或5V至15V、或至少8V。在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括如下方法：其中，所述电压可施加到细胞长达1秒至20分钟、1秒至15分钟、10秒至10分钟、20秒至5分钟、30秒至3分钟、或50秒至150秒。在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括其中所述电压可为直流电(DC)、交流电(AC)或DC和AC的组合的方法。
在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括如下方法：其中所述多个位点中的至少90％在少于15分钟、少于10分钟、少于6分钟、少于5分钟、少于4分钟、少于3分钟、少于2分钟、少于1分钟、或少于30秒的时间内被去标记。在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括如下方法：其中所述细胞上的所述多个可检测试剂中的至少95％在少于10分钟、少于5分钟、少于4分钟、少于3分钟、少于2分钟、或少于1分钟的时间内被去标记。在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括其中所述细胞上的所述多个可检测试剂中的至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、或至少99.9％被去标记。
在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括其中从所述细胞检测到的残留荧光少于5％、少于2％、少于1％、少于0.5％或少于0.1％的方法。
在用于对细胞进行标记和去标记的方法的一些方面中，所述方法可进一步包括使得被标记的细胞与猝灭剂相接触。在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括其中所述猝灭剂是“黑洞猝灭剂(Black Hole Quencher)”的方法。
在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括其中所述多个可检测试剂可包括荧光可检测试剂的方法。在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括其中所述多个可检测试剂可共价连接到亲和标签的方法。在一些方面中，对细胞进行标记和去标记的方法可包括其中所述亲和标签可以是适体或抗体或核酸的方法。在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括其中所述核酸包括核糖核酸的方法，并且在一些方面中，对细胞进行标记和去标记的方法可包括其中所述核酸包括脱氧核糖核酸的方法。
在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括其中所述基材可包括芯片的方法。在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括其中所述基材可包括单细胞阵列的方法，并且在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括其中所述单细胞阵列是规则阵列(所述规则阵列包括以周期格式来布置的多个细胞)的方法。在一些方面，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括其中所述单细胞阵列是无序阵列(所述无序阵列包括覆盖超过所述基材的30％、超过所述基材的40％、超过所述基材的50％、超过所述基材的60％、超过所述基材的70％、超过所述基材的80％、超过所述基材的90％的多个细胞的单层)的方法。在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括其中所述基材可以是平面基材的方法。
在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的所述方法可包括其中所述多个细胞可包括组织的方法。
在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的所述方法可进一步包括使用流动池来将流体递送到所述基材。在一些方面中，用于对细胞进行标记和去标记的方法可包括其中所述流动池是微流体设备的方法。
在各种方面中，本文所描述的方法包括对细胞进行标记的方法，所述方法包括：提供与基材相结合的细胞；将所述细胞加热到受控制的温度；使用流动池将可检测试剂递送至所述细胞；以及使所述细胞与所述可检测试剂接触。
在一些方面中，对细胞进行标记的方法进一步包括在标记了所述多个位点之后检测所述可检测试剂。在一些方面中，对细胞进行标记的方法可包括其中所述检测包括光学检测所述可检测试剂的方法。
在一些方面中，对细胞进行标记的方法进一步包括用多个可检测试剂标记所述细胞。在一些方面中，对细胞进行标记的方法可包括其中所述多个可检测试剂可单独接触所述细胞或可组合地接触所述细胞的方法。
在一些方面中，对细胞进行标记的方法可包括如下方法：其中，所述受控制的温度是26℃至60℃、30℃至45℃、35℃至45℃、35℃至40℃、36.5℃至37.5℃。在一些方面中，对细胞进行标记的方法可包括其中所述受控制的温度在温度设定点的0.5摄氏度、1摄氏度、2摄氏度、或3摄氏度内的方法。
在一些方面中，对细胞进行标记的方法可包括其中所述可检测试剂与抗体共价连接的方法，其中在所述标记期间所述抗体的浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至10μg/ml、或0.1μg/ml至5μg/ml之间。在一些方面中，对细胞进行标记的方法可包括其中所述可检测试剂与CD4抗体共价连接的方法，其中在所述标记期间所述CD4抗体的浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至10μg/ml、或0.1μg/ml至5μg/ml之间。在一些方面中，对细胞进行标记的方法可包括其中所述可检测试剂与CD3抗体共价连接的方法，其中在所述标记期间所述CD3抗体的浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至10μg/ml、或0.1μg/ml至5μg/ml之间。在一些方面中，对细胞进行标记的方法可包括其中所述可检测试剂与CD28抗体共价连接的方法，其中在所述标记期间所述CD28抗体的浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至10μg/ml、或0.1μg/ml至5μg/ml之间。
在一些方面中，对细胞进行标记的方法可包括其中所述可检测试剂与核酸共价连接的方法，其中在所述标记期间所述核酸的浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至50μg/ml、或0.1μg/ml至5μg/ml之间。在一些方面中，对细胞进行标记的方法可包括其中所述可检测试剂与核糖核酸共价连接的方法，其中在所述标记期间所述核糖核酸的浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至50μg/ml、或0.1μg/ml至5μg/ml之间。在一些方面中，对细胞进行标记的方法可包括其中所述可检测试剂与脱氧核糖核酸共价连接的方法，其中在所述标记期间所述脱氧核糖核酸的浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至50μg/ml、或0.1μg/ml至5μg/ml之间。
在一些方面中，用于对细胞进行标记的所述方法进一步包括如下方法：其中使所述细胞与所述可检测试剂接触长达以下时间：10秒至15分钟、30秒至10分钟、1分钟至8分钟或2分钟至6分钟、不超过5分钟、不超过7.5分钟、或不超过10分钟。
在一些方面中，用于对细胞进行标记的方法可包括如下方法：其中所述细胞的所述多个位点中的至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或至少95％被标记。在一些方面中，用于对细胞进行标记的方法可包括如下方法：其中所述多个可检测试剂的饱和度大于在相同条件下(除了在20℃下执行第二细胞的标记达1小时之外)标记的第二细胞的饱和度的25％、50％、75％、或90％。
在一些方面中，用于对细胞进行标记的方法可包括其中所述多个可检测试剂包括荧光可检测试剂的方法。在一些方面中，用于对细胞进行标记的方法可包括其中所述多个可检测试剂共价连接到亲和标签的方法。在一些方面中，用于对细胞进行标记的方法可包括其中所述亲和标签是适体或抗体或核酸的方法。在一些方面中，用于对细胞进行标记的方法可包括其中所述亲和标签包括核糖核酸的方法，并且在一些方面中，用于对细胞进行标记的方法可包括其中所述亲和标签包括脱氧核糖核酸的方法。
在一些方面中，用于对细胞进行标记的方法可包括其中所述基材包括芯片的方法，并且在一些方面中，用于对细胞进行标记的方法可包括其中所述基材包括单细胞阵列的方法。在一些方面中，用于对细胞进行标记的方法可包括其中所述单细胞阵列是规则阵列(所述规则阵列包括以周期格式来布置的多个细胞)的方法。在一些方面，用于对细胞进行标记的方法可包括其中所述单细胞阵列是随机阵列(所述随机阵列包括覆盖超过基材的30％、超过基材的40％、超过基材的50％、超过基材的60％、超过基材的70％、超过基材的80％、超过基材的90％的多个细胞的单层)的方法。在一些方面中，用于对细胞进行标记的方法可包括其中所述基材可以是平面基材的方法。
在一些方面中，用于对细胞进行标记的方法可包括其中所述多个细胞包括组织的方法。
在一些方面中，用于对细胞进行标记的方法可包括其中所述流动池是微流体设备的方法。
在各种方面中，本文所描述的方法可包括用于对被标记的细胞进行去标记的方法，所述方法包括：提供与基材相结合的细胞，其中所述细胞被用多个可检测的试剂来标记；以及将电压施加到被标记的细胞；以及在少于15分钟内对所述被标记的细胞上的所述多个可检测的试剂中的至少75％进行去标记。
在各种方面中，本文所描述的方法可包括用于对被标记的细胞进行去标记的方法，所述方法包括：提供与基材相结合的细胞，其中所述细胞被用多个可检测试剂来标记；将电压施加到与所述细胞相接触的溶液以生成一个或多个反应化学物质；以及在少于15分钟内对被标记的细胞上的所述多个可检测试剂中的至少75％进行去标记，其中去标记包括使得所述可检测试剂与所述一个或多个反应化学物质相接触。
在一些方面中，用于对细胞进行去标记的方法可进一步包括在标记了所述多个位点之后检测所述可检测试剂。
在一些方面中，用于对细胞进行去标记的方法可包括其中所述检测包括光学检测所述可检测试剂的方法。
在一些方面中，用于对细胞进行去标记的方法可包括如下方法：其中所施加的电压是1V至100V、1V至50V、1V至25V、5V至15V、至少7V或至少8V。在一些方面中，用于对细胞进行去标记的方法可包括如下方法：其中，所述电压被施加到细胞长达1秒至20分钟、1秒至15分钟、10秒至10分钟、20秒至5分钟、30秒至3分钟或50秒至150秒。在一些方面中，用于对细胞进行去标记的方法可包括其中所述电压可为直流电(DC)、交流电(AC)或DC和AC的组合的方法。
在一些方面中，用于对细胞进行去标记的方法可包括其中流体流动以连续的、间歇的、定时的或受控制的方式或它们的组合来应用的方法。
在一些方面中，用于对细胞进行去标记的方法可包括如下方法：其中所述细胞的所述多个位点中的至少95％在少于15分钟、少于10分钟、少于6分钟、少于5分钟、少于4分钟、少于3分钟、少于2分钟、少于1分钟、或少于30秒的时间内被去标记。在一些方面中，用于对细胞进行去标记的方法可包括如下方法：其中所述细胞上的所述多个可检测试剂中的至少95％在少于10分钟、少于5分钟、少于4分钟、少于3分钟、少于2分钟、或少于1分钟的时间内被去标记。在一些方面中，用于对细胞进行去标记的方法可包括其中所述细胞上的所述多个可检测试剂中的至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、或至少99.9％在少于10分钟内被去标记。
在一些方面中，用于对细胞进行去标记的方法可包括其中从所述细胞检测到的残留荧光少于5％、少于2％、少于1％、少于0.5％或少于0.1％的方法。
在一些方面中，用于对细胞进行去标记的方法可进一步包括使被标记的细胞与猝灭剂接触。在一些方面中，用于对细胞进行去标记的方法可包括其中所述猝灭剂为“黑洞猝灭剂”的方法。
在一些方面中，用于对细胞进行去标记的方法可包括其中所述多个可检测试剂包括荧光可检测试剂的方法。
在一些方面中，用于对细胞进行去标记的方法可包括其中所述多个可检测试剂共价连接到亲和标签的方法。在一些方面中，用于对细胞进行去标记的方法可包括其中所述亲和标签是适体或抗体或核酸的方法。在一些方面中，用于对细胞进行去标记的方法可包括其中所述亲和标签包括核糖核酸的方法，并且在一些方面中，用于对细胞进行去标记的方法可包括其中所述亲和标签包括脱氧核糖核酸的方法。
在一些方面中，用于对细胞进行去标记的方法可包括其中所述基材包括芯片的方法。在一些方面中，用于对细胞进行去标记的方法可包括其中所述基材包括单细胞阵列的方法。在一些方面中，用于对细胞进行去标记的方法可包括其中所述单细胞阵列是规则阵列(包括以周期格式来布置的多个细胞)的方法。在一些方面，用于对细胞进行去标记的方法可包括其中所述单细胞阵列是随机阵列(所述随机阵列包括覆盖超过基材的30％、超过基材的40％、超过基材的50％、超过基材的60％、超过基材的70％、超过基材的80％、超过基材的90％的多个细胞的单层)的方法。在一些方面中，用于对细胞进行去标记的方法可包括其中所述基材是平面基材的方法。
在一些方面中，用于对细胞进行去标记的方法可包括其中所述多个细胞包括组织的方法。
在一些方面中，用于对细胞进行去标记的方法进一步包括使用流动池来将流体递送到所述基材。在一些方面中，用于对细胞进行去标记的方法可包括其中所述流动池是微流体设备的方法。
在各种方面中，本文所描述的系统可包括用于对细胞进行标记和去标记的系统，所述系统包括：基材，所述基材被配置为保持细胞；第一可检测试剂；流动池，所述流动池被配置为跨所述细胞地传递流体；电压源；温度控制设备，所述温度控制设备被配置为将所述细胞加热至温度设定点，其中将所述细胞的所述温度控制在温度设定点的3摄氏度内；检测器，所述检测器被配置为检测第一可检测试剂；计算设备，所述计算设备被配置为操作所述电压源和所述检测器，所述计算设备包括处理器和非瞬态有形计算机可读存储介质，所述存储介质存储指令集，所述指令集在由处理器执行时使所述检测器检测第一可检测试剂信号；以及电压源，所述电压源向与所述细胞相接触的溶液施加电压。
在一些方面中，用于标记和去标记的系统可包括其中所述检测器具有低于5微米、4微米、3微米、2微米、1微米、0.5微米、或0.1微米的空间分辨率的系统。
在一些方面中，用于标记和去标记的系统可包括如下系统：其中所述检测器具有能够检测少于10000种可检测试剂、少于5000种可检测试剂、少于1000种可检测试剂、少于500种可检测试剂、少于100种可检测试剂、少于50种可检测试剂、或少于10种可检测试剂的成像灵敏度。
在一些方面中，用于标记和去标记的系统可包括如下系统：其中每检测信道每秒可成像至少10个细胞、每检测信号每秒可成像至少100个细胞、每检测信号每秒可成像至少1000个细胞、每检测信道每秒可成像至少5000个细胞。
在一些方面中，用于标记和去标记的系统可包括如下系统：其中，所述温度控制设备用于将所述细胞的所述温度控制到不超过温度设定点的2℃、不超过温度设定点的1℃、不超过温度设定点的0.5℃的范围内。在一些方面中，用于标记和去标记的系统可包括如下系统：其中，所述温度控制设备被配置为将所述细胞加热到至少26℃、至少30℃、至少45℃、至少60℃的温度。
在一些方面，用于标记和去标记的系统可进一步包括电压源，所述电压源被配置为将至少1伏特、至少3伏特、至少5伏特、至少7伏特，至少8伏特、至少9伏特、至少10伏特的电压施加至与所述细胞接触的所述溶液。
在一些方面中，用于标记和去标记的系统可进一步包括成像设备。
在一些方面中，用于标记和去标记的系统可包括其中所述第一可检测试剂为荧光可检测试剂的系统。在一些方面中，用于标记和去标记的系统可包括光源，所述光源被配置为激发所述荧光可检测试剂。
在一些方面中，用于标记和去标记的系统可进一步包括第二可检测试剂。在一些方面中，用于标记和去标记的系统可进一步包括检测器，所述检测器被配置为检测所述第二可检测试剂。
在一些方面中，用于标记和去标记的系统可包括其中所述基材包括芯片的系统。
在一些方面中，用于标记和去标记的系统可进一步如下系统：其中所述计算设备进一步被配置为操作所述流动池。
在一些方面中，用于标记和去标记的系统可进一步包括连接到所述流动池的流体容器。在一些方面中，用于标记和去标记的系统可包括其中所述流动池包括微流体设备的系统。
在一些方面中，用于标记和去标记的系统可包括其中所述基材被封闭于所述装置内的系统。
通过引用结合
本说明书中所提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用结合在此，其程度就如同明确且单独地指明了每一个单独的出版物、专利或专利申请通过引用结合
附图说明
在所附权利要求书中特别阐述了本发明的新颖特征。通过参照以下详细描述将获得对本发明的特征和优点的更好理解，所述详细描述阐述了使用本发明的原理的说明性实施例、及其附图，在所述附图中：
图1示出了用可检测试剂对感兴趣的细胞或分子进行极快标记的流程图。如所示，样品(例如，感兴趣的细胞或分子)可首先被加热到设定温度并随后与可检测试剂接触，或者样品可首先与可检测试剂接触并随后被加热到设定温度(将图序列101-102-103-106与图序列101-104-105-106比较)。
图2示出了用可检测试剂对感兴趣的细胞或分子进行极快标记的流程图，其中用于冷却样品(例如，感兴趣细胞或分子)的步骤在标记之后并在检测之前被执行。
图3示出了对感兴趣的细胞或分子进行去标记的流程图。如所示，验证对可检测试剂的去标记的任选步骤(该任选步骤可包括检测可检测试剂信号)可在将样品(例如，感兴趣的细胞或分子)去标记之后被执行。
图4示出了涉及对感兴趣的细胞或分子进行极快标记和极快去标记的极快循环荧光成像的流程图。
图5示出了涉及对感兴趣的细胞或分子进行极快标记和极快去标记的极快循环荧光成像的流程图，其中加热样品(例如，感兴趣细胞或分子)的步骤可在每一个循环中重复。
图6示出了涉及对感兴趣的细胞或分子进行极快标记和极快去标记的极快循环荧光成像的流程图，其中加热样品(例如，感兴趣细胞或分子)的步骤可在每一个循环中重复。
图7示出了涉及对感兴趣的细胞或分子进行极快标记和极快去标记的极快循环荧光成像的流程图，其中加热样品(例如，感兴趣细胞或分子)的步骤以及用于冷却样品的步骤可在每一个循环中重复。
图8示出了涉及对感兴趣的细胞或分子进行极快标记和极快去标记的极快循环荧光成像的流程图，其中加热样品(例如，感兴趣细胞或分子)的步骤以及用于冷却样品的步骤可在每一个循环中重复。
图9D至图9F示出了与使用标准协议标记(图9A至图9C)相比而言对细胞的极快标记(或超快循环染色，SCS，其可包括与正常标记方法相比可检测试剂浓度的10倍增加)。图9A和图9D的插图已经经受后处理，其中为了说明细胞存在的目的已经在图像捕捉之后增加了信号增益。信号增益水平对于除了图9A和图9D的插图面板以外的所有图像面板而言是相同的。图9G示出了对使用极快标记来标记的细胞的流式细胞计数测量(例如，10x 37℃，5分钟)，并且图9G指示了极快标记方法得到高度有效的标记(如由流式细胞计数中的细胞所展现的高正荧光强度所指示的那样)，而同时保持与用正常标记方法所获得的非特异性结合相比而言低的非特异性结合。
图10A至图10H示出了用两个独立的可检测试剂来对细胞进行极快去标记。
图11A至图11D示出了使用极快去标记方法在去标记上所施加的电压(图11A至图11B)以及在给定的电压(图11C至图11D)下去标记发生的速度。在图11A和图11C中，强度被表示为荧光的任意单位(au)。
图12A至图12C示出在0伏特(图12A)、1伏特(图12B)和5伏特(图12C)下3分钟后将用PFBT聚合物点来标记的MCF-7细胞的去标记。
图13A至图13T示出在8伏特下180秒和150秒(图13A至图13E)、6伏特下330秒和340秒(图13F至图13J)、5伏特下480秒和510秒(图13K至图13O)以及3伏特下1020秒和1080秒(图13P至图13T)后将标记PE-抗EpCAM的细胞去标记。图13E、图13J、图13O和图13T是示出细胞自身未被极快去标记过程所改变或从基材剥离的亮场图像。
图14A至图14F示出在连续缓冲流的情况下(图14A至图14C)以及在受控制且定时地应用缓冲流的情况下(图14D至图14F)对MCF-7细胞进行去标记。
图15A至图15C示出了控制细胞(图15A)与在9次去标记循环(每一次施加4伏特持续3分钟)之后的细胞之间亮度无明显差异，这证明了可执行至少9次标记和去标记循环而不对细胞造成任何明显表位损伤。沿着图15A和图15B中的线的亮度分布也证明了在图15C中所示的两个代表性图像的亮度水平之间无明显差异，由此指示了没有明显的表位损伤。
图16示出了用于极快荧光成像的系统。
图17A至图17D示出了在使用正常标记方法(图17A和图17B)或极快标记方法(图17C和图17D)用PE-抗CD28(PE-anti-CD28)抗体单独标记B细胞(一种缺少CD28细胞表面蛋白的细胞类型(图17A和图17C))或B细胞和表达了CD28的T细胞的1∶1混合物(图17B和图17D)达5分钟时相似的抗体特异性以及相似的非特异性结合水平。面板插图已经经受后处理，其中为了说明细胞存在的目的已经在图像捕捉之后增加了信号增益。信号增益水平对于除了图17A和图17C的插图以外的所有图像面板而言是相同的。
图18A至图18B示出了在使用极快标记方法标记B细胞和T细胞之后的标记流式细胞计数结果，其示出了正常标记方法与极快标记方法之间可比较的非特异性结合和特定标记。图18A示出了使用正常标记方法和极快标记方法标记的混合的B细胞和T细胞。图18B示出了使用正常标记方法和极快标记方法两者单独标记的B细胞和T细胞。
图19A至图19D示出了涉及用“黑洞猝灭剂”去标记的循环极快标记。图19A示出了使用亮场成像的标记的细胞，且图19B示出了使用荧光成像标记的细胞。图19C示出了在用“黑洞猝灭剂”去标记之后的相同的细胞。图19D示出了用另一种荧光抗体(例如可检测试剂)重新标记。
图20A至图20I示出了使用五种不同的可检测试剂(PE-抗细胞角蛋白(PE-anti-cytokeratine)、PE-抗MUC1(PE-anti-MUC1)、PE-抗HER2(PE-anti-HER2)、PE-抗EpCAM(PE-anti-EpCAM)以及PE-抗EGFR(PE-anti-EGFR))并在标记步骤之间在8V下去标记长达5分钟的极快循环荧光成像的五个循环的图像。
图21A至图21G示出了用于循环荧光单细胞标记的单细胞阵列。单细胞阵列可以根据阵列的设计和微制造而以不同的强度和大小(图21A至图21F)产生。图21G示出了单细胞阵列中处于悬浮的单细胞。
图22A至图22C示出了根据本公开内容的方面的单细胞阵列的示例。
具体实施方式
本公开内容提供了用于改进关于一种可检测试剂或多种可检测试剂来标记(例如染色)和去标记(例如脱色、移除可检测试剂或减少可检测试剂所产生的可检测信号)细胞或分子的效率的方法及系统。除了改进将分子标记或去标记为其自身端部的各个任务的效率之外，本文所公开的方法和系统在要检测的分子的数量超过可以同时检测的可检测试剂信号的数量的实验系统中特别地有价值。在这样的情景中，执行实验的速度受执行以下步骤所需的时间的限制：用一组可检测试剂标记样品；检测第一组可检测试剂；对用第一组可检测试剂标记的样品去标记；以及用第二组可检测试剂来标记样品(例如，第二组感兴趣的分子)(可包括标记和/或去标记样品的多个周期使得所有的感兴趣的细胞或分子都被标记和检测的过程)。相应地，对标记和去标记的步骤中的每一个步骤的效率的改进与对用给定的一组可检测试剂检测、去标记和标记给定的一组细胞或分子的过程的每一次重复相复合。
例如，其中要检测的不同类型的感兴趣分子的数量大于可用的检测系统可同时检测感兴趣分子的数量或大于在同时使用时彼此相溶(例如，作为荧光可检测试剂的光谱重叠的结果)的感兴趣分子的数量的实验必须被重复或经受去标记及标记过程，以便每个感兴趣的分子都被标记和检测。除增加检测所有感兴趣的分子所需的时间以外，重复实验可引入实验变异，同时使用常规的方法和系统去标记和标记分子可能需要相当长的时间。通过采用本文所述的方法和系统(所述方法和系统可以改进标记、去标记和/或检测分子所需的时间)，即使使用能力有限的检测系统也可以快速地完成在单次实验中对大量不同类型的分子的检测。
因此，本文所述的方法和系统(如在图1的过程中所描述)可以涉及提供与基材相结合的或者在基材上的细胞或分子(101、102)。细胞可以是初生的或永生的，且可以是活动的或固定的。基材可以是平面的，或者基材可以包括多滴定板。细胞或分子(例如，样品)的温度可以被调节使得其维持在特定范围(例如，36.5℃和37.5℃)内或维持在容许温度变化(例如0.5℃)内(102、202)，同时使得细胞或分子接触第一可检测试剂(或第一多种可检测试剂，参见103、203)以改进用可检测试剂对细胞或分子进行标记的速度。替代地，可在细胞被加热(105、206)之前使细胞与第一可检测试剂接触(104、205)。可检测试剂可包括荧光团，并且该荧光团可以是例如聚合物点、有机染料或蛋白染料。在一些实施例中，可将样品冷却(例如，允许通过热辐射或热传导或通过制冷将样品冷却，204、207)。随后可使用荧光显微镜来检测可检测试剂(106、208)，并接着通过向与感兴趣的细胞或分子相结合的可检测试剂施加电压或者电场在少于5分钟内将可检测试剂去标记(302、405、505、605、705、805)。可由电源产生电压或电场，该电压或电场可用于在样品上产生电势(例如，在电极之间隔1cm且被取向为使得样品坐落在电极之间的8伏特的电势，该电势可包括通过样品的800伏特/米的电场)。由电源产生的电压可用于产生反应化学物质，诸如反应氧物质，该反应化学物质可与可检测试剂反应以从可检测试剂中猝灭或移除荧光信号。如在图4至图8中进一步描述的，标记、检测和去标记的过程随后可用额外的一种可检测试剂(例如，第二可检测试剂、第三可检测试剂等)或额外的多种可检测试剂(例如，第二多种可检测试剂、第三多种可检测试剂等)来重复一次、两次、三次、四次、五次或更多次，以便增加一次实验中所分析的分子的总数或样品的各方面，而同时改进执行这样的过程的脱色速度和水平。对细胞或分子进行极快循环标记和去标记的过程可通过本文所述的系统来实现，由此提供用于可重复的、快速的、能够复用的细胞和分子标记和去标记的平台。
标记的方法
可以用可检测试剂或多种可检测试剂来标记感兴趣的细胞或分子，以识别、量化、或监测感兴趣的细胞或分子的各方面。对细胞或分子进行标记可包括使特定的细胞或分子与一种可检测试剂或多种可检测试剂相结合，且该过程可能受数个因素影响。可影响细胞或分子标记的各方面的非限制性列表包括：可检测试剂被放置为与细胞或分子接触的时间量；用于对细胞或分子进行标记的可检测试剂的浓度；在被可检测试剂接触的过程期间细胞或分子的温度；可检测试剂的选择；使得细胞或分子与可检测试剂接触的方法；细胞或分子是固定的或是未固定的；细胞或分子是否被贴附、吸附或固定化于基材上；细胞周围的流体是否相对于细胞移动；和是否在标记过程的步骤之间洗涤细胞或分子。本文公开的方法可包括：对标记过程的某些方面的规定；引起非常强的标记(例如，与标准标记协议相比而言的高强度的可检测试剂信号，同时保持针对靶向细胞或分子的特异性，如图17A至图17D中所示的，而只需要在其期间细胞或分子需被可检测试剂接触的惊人地短的时间段)。
图9A至图9G示出了增加可检测试剂浓度以及增加温度对细胞标记的叠加效应。当温度从室温(约24摄氏度，图9A；插图表示图像增益的后处理增加以说明细胞的存在)升高至37摄氏度(图9D；插图表示图像增益的后处理增加以说明细胞的存在)时，在标记5分钟后的标记的程度增加。如果在室温下可检测试剂的浓度增加十倍，则5分钟后的标记的程度进一步增加(10xC，图9E)。若温度增加到37摄氏度(℃)同时浓度增加到正常标记浓度的十倍(“10xC”，图9F)，5分钟后的标记的程度在所有条件上都被显著地改进。在37℃和10倍可检测试剂浓度的条件下5分钟后的可检测信号的量大于在室温并在正常标记浓度下用可检测试剂标记靶向细胞或分子甚至60分钟(图9B)和120分钟(图9C)后时的标记程度，暗示了升高的温度和可检测试剂浓度的组合在比基线标记条件(例如，正常的可检测试剂的标记浓度下、室温)需要达到稳态标记水平更少的时间内大大提高了标记的效率。图9G示出在极快标记条件(例如，37℃和10倍可检测试剂信号)下，可在5分钟内实现最大细胞标记(例如，在室温下60分钟后达到的可检测试剂信号或标记强度的饱和)。
细胞或分子可以例如通过优先定位或化学键结来与另一分子(例如，可检测试剂)或基材暂时地或永久地相结合。分子的结合可以作为生物过程或作为本文公开的方法的一部分发生，诸如使得分子与特定于该分子的荧光标记的亲和标签接触。替代地，如果细胞贴附到基材或如果故意使得细胞长时间与基材接触(例如，如果施加力(诸如流体压力)从而保持细胞与基材接触)，则可称细胞与基材相结合。
亲和标签是用于形成与另一分子形成特定结合的分子。亲和标签可以是适体、或核酸，并且亲和标签可以与可检测试剂(诸如荧光团)相结合。在一些实施例中，亲和标签可以经由共价键与可检测试剂相结合。适体可以是寡核苷酸或肽分子，适体可以是自然产生或人工设计的，且适体可以用于特定瞄准感兴趣的分子。在一些情况中，适体可以限制在其中使用该适体的系统中的免疫响应。抗体可以是多肽包括轻链和重链，并且重链和轻链可包括可变区。抗体的每一个可变区可包括三个互补决定区(CDR)，该三个互补决定区可确定与抗体特定相关的分子。核酸可包括核糖核酸或脱氧核糖核酸，并且可如以荧光原位杂交(FISH)的方式与感兴趣的分子杂交。由此，核酸亲和标签可用于调查用于本文所述的方法和系统中的细胞中的mRNA或DNA。亲和标签可用于在检测到细胞或者分子之前分离细胞或者分子。例如，荧光亲和标签可被用作用于在检测到细胞或分子之前对细胞或分子分类的基础。
本文所述的标记(例如，染色)的方法可包含对细胞或分子进行标记的标准方法，或可使用本文所述的标记的方法来代替标准标记程序。常规标记程序(例如，标准标记程序)常常在室温(室温可以是不小于20℃且不超过25℃的范围内的温度)或更冷的温度下使用制造商针对该可检测试剂和检测模态所推荐的稀释范围内的可检测试剂浓度被执行达至少三十分钟和长达24小时的时间段。贴壁培养的活细胞和与活细胞相结合的分子频繁地用可检测试剂在室温下被染色达60分钟到120分钟的时间段。固定的细胞和与它们相结合的分子常常与可检测试剂相接触地在制造商针对可检测试剂和预期的检测模态所推荐的稀释度下在2-8摄氏度(℃)下通宵地(例如，12小时至24小时)培养。
本领域技术人员将认识到，尽管预期到增加与感兴趣的细胞或分子接触的可检测试剂的浓度会增加可检测试剂的信号，但也预期到增加可检测试剂浓度会增加可检测试剂造成的不期望的非特异性标记(例如，可检测试剂与非靶向分子和和基于化学计量的细胞方面结合，而不是将可检测试剂特异性靶向特定细胞或分子)，这减少了可检测试剂信号的任何增加的效用。进一步地，本领域普通技术人员将理解到，如由增加的可检测信号来评估的那样，增加可检测试剂浓度的增量回报将随可检测试剂浓度的每次增量增加而减少。
因此，使用本文所述的方法和系统产生的结果是意想不到的，因为可以通过除了增加可检测试剂浓度以外增加温度来显著增加标记样品的速度(例如，达到通过使用常规标签协议所取得的最大标记的100％所需的时间，参见图9G)而无需显著地增加可检测试剂的非特异性标记(参见例如图17A至图17D)。
可以以数种方式量化用于接触样品(例如，感兴趣分子或细胞)的可检测试剂的增加的水平。相对于商业可获得的可检测试剂，用于极快标记的可检测试剂的浓度可以是供应商所建议的最低质量、浓度或稀释度的5倍(5x)、10倍(10x)、20倍(20x)、25倍(25x)、50倍(50x)、100倍(100x)或1000倍(1000x)。在一些实施例中，可检测试剂的绝对浓度可用于描述用于接触样品(例如，感兴趣的细胞或分子)的可检测试剂的适当的量。在这样的情况中，可检测试剂的浓度范围可以是例如浓度范围可以是例如0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml，优选为.05μg/ml至10μg/ml，或甚至更优选为0.1μg/ml至5μg/ml。
含有可检测试剂的用于将可检测试剂递送到样品的溶液的体积可根据标记期间使用的基材。通常，应当允许可检测试剂接触要标记的样品的所有位点。在一些实施例中，基材是微流体设备，并且可以使用少至5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、35μl、40μl、50μl、75μl、100μl、150μl、200μl、250μl或300ul来对细胞进行标记。在一些实施例中，基材是96孔板，并且可以使用少至10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、35μl、40μl、50μl、75μl、100μl、150μl、200μl、250μl或300μl来对细胞进行标记。在一些实施例中，基材是384孔板，并且可以使用少至0.5μl、1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、50μl、75μl、100μl或150μl来对细胞进行标记。
然而，本公开内容的方法和系统描述了用可检测试剂提高标记感兴趣的细胞或分子的效率的方法，使得可以在少于15分钟、少于10分钟、少于9分钟、少于8分钟、少于7分钟、少于6分钟、少于5分钟、少于4分钟、少于3分钟、少于2分钟或少于1分钟内实现细胞或分子的标记(例如，可检测试剂与针对通过该可检测试剂对细胞或分子进行特异性标记可用的位点的至少50％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或至少99.5％的结合)。
细胞可以包括多个位点，并且这些位点可以特异于单独的亲和标签(例如，适体、抗体或核酸)。例如，位点可以是可通过与可检测试剂相结合的亲和标签识别的分子。样品可以包括多个通过同一个亲和标签来识别的位点，或者可以包括多个通过多个亲和标签来识别的位点。分子可以包括单个类型的亲和标签可与其相结合的多个位点，或分子可以包括多个类型的亲和标签可与其相结合的多个位点。在一些情况中，并非所有的位点对亲和位点来说是可用的(例如，因为分子构象、分子相互作用或其他阻止亲和标记与它本来要结合的位点接触的情形)。因此，评估被亲和标签标记的位点的百分比可以顾及相关的实验考虑(诸如温度、时间、湿度、对流、pH、分子构象)，这是因为这些相关的实验考虑与位点-亲和标签相互作用的阻碍有关。
具体地，细胞的温度可以保持或控制在不低于26℃、不低于30℃、不低于31℃、不低于32℃、不低于33℃、不低于34℃、不低于35℃、不低于36℃、不低于37℃、不低于38℃、不低于39℃、不低于40℃、不低于45℃、不低于50℃、不低于55℃、不低于60℃或不低于70℃，误差不超过0.25℃、不超过0.5℃、不超过0.75℃、不超过1℃、不超过2℃、不超过3℃、不超过4℃或不超过5℃，同时利用可检测试剂的增加的浓度(例如，高1.5倍，高2倍，高5倍，高7倍，高10倍，高15倍，比制造商推荐的浓度或稀释度高20倍)来接触细胞或分子以实现在少于15分钟、少于10分钟、少于9分钟、少于8分钟、少于7分钟、少于6分钟、或少于5分钟、少于4分钟、少于3分钟、少于2分钟、少于1分钟内将可检测试剂与针对通过该可检测试剂对细胞或分子进行特异性标记(例如，标记的饱和水平)可用的位点的至少50％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或至少99.5％结合。
饱和度可以指的是被标记的细胞或分子的可检测试剂信号的相对强度(例如，相对于未标记的细胞或分子的信号、相对于在室温下标记为饱和的细胞或分子的信号、或相对于最大标记的细胞的信号的被标记的细胞或分子的可检测试剂信号的相对强度)，或者饱和度可以指的是位点的百分比，该位点的百分比可由亲和标签(其可以与可检测试剂相结合)来与亲和标签(例如，与可检测试剂相结合的亲和标签)所占据的位点的百分比相结合。在每个情况中，饱和水平(例如，半稳态最大值)都可作为变量的函数(诸如时间、可检测试剂浓度、以及温度)来实现。关于确定饱和度或饱和率(例如，标记或去标记后的可检测试剂或可检测试剂信号的饱和度或饱和率)，可使用参考条件。例如，100％饱和度可表示在20摄氏度下标记2小时之后可检测试剂或从可检测试剂中检测到的信号的数量(例如，每秒的光子数量)。同样地，背景信号(例如，0％饱和度)可以通过使用参考点来确定。例如，从未被标记的样品中检测到的可检测试剂或可检测试剂信号的量可用作饱和度的参考点。替代地，对照条件(例如，同种型对照、不表达所讨论的特定生物标志物的细胞、不含荧光团-缀合的二抗的一级抗体等)或特定空间区域(例如，视场的未染色区域)可以被用作背景饱和度的参考点。在一些实施例中，饱和度的参考点或可检测试剂强度可用于归一化来自对照样品或实验样品的结果。
如上所述，本文公开的用于对细胞或分子进行标记的方法可包括标准化染色或标记方案的方面，诸如使用透化剂(例如，使用包括诸如Triton X-100，Tween-20或皂甙之类的去污剂的溶液)、阻断剂(如牛血清白蛋白、酪蛋白、浮蛋白、或0.1％、0.5％、1％、2％、5％、10％、15％或20％的动物血清溶液，包括胎牛血清、兔血清、马血清、山羊血清、驴血清、大鼠血清、小鼠血清、狗血清、猪血清、猴血清、鸡血清以及如BlockAidTM之类的商业阻断剂)、含有或不含指示剂染料(如酚红)的缓冲剂(例如盐或离子，如钠、钾、钙、镁、氯化物、柠檬酸盐、硼酸盐、磷酸盐、醋酸盐、硫酸盐、三羟甲基氨基甲烷和碳酸氢盐；以及磷酸盐缓冲溶液，如磷酸盐缓冲盐水、杜尔贝科(Dulbecco’s)磷酸盐缓冲盐水、三乙醇胺缓冲盐水、HEPES、汉克(Hank’s)缓冲盐水溶液、厄尔(Earle’s)平衡盐溶液和培养基(包括杜尔贝科改良伊戈尔(Eagle’s)培养基、伊戈尔最低必需培养基、RPMI 1640)、螯合剂(诸如EDTA或肝素)、以及其他常见的标记溶液添加剂(如抗生素和杀菌剂(例如链霉素、青霉素、两性霉素B等)、L-谷氨酰胺、白蛋白、叠氮化钠、尿素以及十二烷基硫酸钠)。在某些实施例中，本文所公开的方法可包括洗涤细胞或分子或者执行抗原修复；然而，这些添加物可能增加完成细胞或分子的标记所需的时间。
在细胞被可检测试剂标记之后，可检测试剂可以被检测到。在某些情况中，可能必须连续执行标记的方法超过一次。例如，如果要使用间接免疫荧光法或如果两种不同的分子能够与样品结合(例如，连接到可检测试剂的抗体、适体或核酸)或如果采用2种、3种、4种、5种、6种、7种或8种能够与需要不相容的标记溶液的样品结合的不同类型的分子，那么可以在检测之前多次进行标记程序。
可检测试剂
可检测试剂可以是可用于识别细胞、细胞的方面或另一分子的分子或分子群。可检测试剂可用于标记(例如，将要结合)细胞或细胞的一部分，诸如感兴趣分子。可检测试剂可以包括在被刺激时产生信号(例如荧光团)的分子、染色剂、蛋白、聚合物或纳米颗粒，或可以包括在处于刺激下时产生背景信号(例如自发荧光分子)的分子和染色剂。可检测试剂可以以特异性结合感兴趣的细胞或分子或感兴趣的细胞或分子上的位点(例如，抗体，适体或核酸)的方式来结合。
可检测试剂可用于标记特定分子、分子的聚合物、或细胞结构。如此，可检测试剂可以与亲和标记(诸如适体、抗体或核酸(例如DNA或RNA))和能够与感兴趣分子或细胞杂交、接合或以其它方式结合的蛋白相结合(例如共价键合)。亲和标签(例如，适体、抗体或核酸)可以是特异性靶向细胞靶标或分子靶标(例如，感兴趣的分子，包括以下所列出的那些)。可检测试剂可以与能够结合感兴趣细胞或分子的亲和标签直接结合(例如直接偶联)，或可检测试剂可以与能够特异性结合另一分子(诸如亲和标签)进而能够如在间接免疫荧光法中那样与感兴趣的细胞或分子特异性结合的分子相结合。
适体可以包括DNA、RNA或被修饰的DNA或RNA，且适体可以用于将诸如荧光团之类的可检测试剂靶向特定靶标分子(例如，在细胞上或者在细胞中的特定靶标分子)。适体可以被酶裂解，因而从被结合的靶标分子释放可检测试剂。
抗体可以包括具有重链和轻链的蛋白，并且抗体可以直接结合到可检测分子(诸如荧光团)，或者抗体可以通过中间体部分(诸如接头分子)结合到可检测试剂。类似地，抗体(例如一抗)可以被另一抗体(例如二抗)所识别。如果一抗包括亲和标签(诸如生物素)，则与亲和素或链霉亲和素分子相结合的可检测试剂可以间接结合一抗。因为亲和素和链霉亲和素分子可以结合最多四个生物素分子，所以与分子结合的可检测试剂的数量可以通过在无亲和素或链霉亲和素分子的情况下使得生物素化抗体(例如，特异于感兴趣分子的生物素化抗体)与感兴趣分子接触来增加。替代地，与可检测试剂(例如荧光团)相结合的亲和素或链霉亲和素分子可以以类似的方式使用。通过使用诸如一抗-二抗策略、生物素-链霉亲和素策略等的方法，可放大来自样品的累积的可检测试剂信号并改进标记策略的定制。
替代地，可检测试剂可与作为在细胞内表达或被引入到细胞的融合蛋白的形式的蛋白相结合。如果其中可检测试剂(例如荧光团)形成融合蛋白的蛋白是感兴趣的分子，则可检测试剂可以是感兴趣的分子的一部分。
可检测试剂可以是可由荧光成像方法检测的试剂。如此，可检测试剂可以包括荧光团。荧光可检测试剂可以是表达分子(例如，荧光蛋白)或合成构建体(例如，染色剂或荧光纳米颗粒)。可检测试剂可以包括量子点、聚合物点、或类似的荧光纳米颗粒。荧光可检测试剂可以是小分子(例如，染色剂)或荧光蛋白。
荧光可检测试剂可以与大分子结合。因此，被标记的感兴趣分子可以包括被荧光标记的多肽(例如，被标记的蛋白和/或蛋白片段)、被荧光标记的核酸分子、被荧光标记的碳水化合物、被荧光标记的液体、被荧光标记的大环物质、被荧光标记的多酚、和/或被荧光标记的内源性大分子复合物(例如，一抗-二抗复合物)。
可检测试剂可以包括发色聚合物点(例如，聚合物点)。聚合物点可以是半导体的、非半导体的或它们的组合，并且他们可以被开发为发射具有在紫外到红外的范围内的波长(包括整个可视光谱)的信号。聚合物合成点可以包括窄带发射聚合物点，诸如硼-二吡咯亚甲基(4，4-二氟-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-二环戊二烯并苯(indacene)，BODIPY)或其衍生物。聚合物点可以通过包括官能团(例如，疏水基团或亲水基团)作为聚合物点表面的一部分而化学官能化。聚合物点可被用作荧光团(例如，可检测试剂)，因此，聚合物点可以通过聚合物点上的官能团生物偶联或连接或交联到生物分子上(例如，通过使用点击化学)。聚合物点可以与抗体、适体、核酸或其他亲和标签或接头偶联，所述亲和标签或接头又可以被导向诸如生物分子(例如，合成的或天然存在的蛋白质、糖蛋白、肽、氨基酸、代谢物、药物、毒素、核酸、核苷酸碳水化合物、糖、脂质、脂肪酸等)之类的分子。聚合物点可以是具有50nm或更小、30nm或更小、25nm或更小、20nm或更小、15nm或更小、10nm或更小或5纳米或更小的临界尺寸(例如，纳米颗粒的半径或直径)的纳米颗粒。
将包括聚合物点的可检测试剂去标记的方法可包括使用荧光猝灭剂，诸如“黑洞淬灭剂”。将包括聚合物点的可检测试剂去标记的方法还可包括使用施加的电压，或使用施加的电压与荧光猝灭剂的组合。
荧光可检测试剂可以包括非蛋白有机荧光团，诸如氧杂蒽、花青、方酸、萘、香豆素、噁二唑、蒽、芘、噁嗪、吖啶、芳基甲川和四吡咯的衍生物。荧光可检测试剂可包括：罗丹明、曙红、对甲氨基酚、荧光素、硫代荧光素、氨基荧光素、羧基荧光素、氯代荧光素、甲基荧光素、磺基荧光素、氨基对甲氨基酚、羧基对甲氨基酚、氯代对甲氨基酚、甲基对甲氨基酚、磺对甲氨基酚；氨基罗丹明、羧基罗丹明、氯代罗丹明、甲基罗丹明、磺基罗丹明、硫代罗丹明、花青、吲哚羰花青、噁羰花青、硫代花青、部花青、花青2、花青3、花青3.5，花青5，花青5.5，花青7和其他花青衍生物(如PE-Cy5.5、PE-Cy7、APC-Cy7等)多甲藻素及其衍生物(如PerCP、PerCP 5.5)、噁二唑衍生物，吡啶基噁唑(pyridyloxazole)、硝基苯并噁二唑、苯并噁二唑、芘衍生物、级联蓝、噁嗪衍生物、尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、噁嗪170、吖啶衍生物、原黄素、吖啶橙、吖啶黄、芳基次甲基(arylmethine)衍生物、金胺、结晶紫、孔雀石绿、四吡咯衍生物、卟吩、酞花青、胆红素1-二甲基氨基萘基-5-磺酸盐、1-苯胺基-8-萘磺酸盐、2-对-甲苯胺基-6-萘磺酸盐(2-p-touidinyl-6-naphthalene sulfonate)、3-苯基-7-异氰酸基香豆素，N-(对-(2-苯并噁唑基)苯基)马来酰亚胺、茋、芘、6-FAM(荧光素)、6-FAM(NHS酯)、5(6)-FAM、5-FAM、荧光素dT、5-TAMRA-尸胺(5-TAMRA-cadavarine)、2-氨基吖啶酮、HEX、JOE(NHS酯)、MAX、TET、ROX、TAMRA、TARMATM(NHS酯)、TEX 615、ATTOTM488、ATTOTM532、ATTOTM550、ATTOTM565、ATTOTMRho101、ATTOTM590、ATTOTM633、ATTOTM647N、ATTO染料的其他衍生物、TYETM563、TYETM665或TYETM705、Q570、硼二吡咯亚甲基(BODIPY)染料(例如BODIPY FL C5、BODIPY FL C5、BOPIDY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、BODIPY 493/503、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650和BODIPY 650/655)、CF610、碘化丙啶、Q670、吲哚花青绿、太平洋蓝染料、太平洋绿染料、太平洋橙染料、赫斯特(Hoeschst)染料或其任何衍生物。
在一些实施例中，荧光团是在为350nm与1500nm之间的波长下的荧光剂发射的电磁辐射，诸如被用于检测这样的试剂的发射。可用于标记例如缀合分子、抗体标签、遗传编码的融合蛋白或遗传编码的荧光蛋白之类的荧光染料的非限制性实例可包括：荧光蛋白及其任何衍生物(例如，绿色荧光蛋白(GFP))、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、RoGFP、异硫氰酸荧光素(FITC)、三叶草，黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、青色荧光蛋白(CFP)、红色荧光蛋白(RFP)、珊瑚(Discosoma sp.)红色荧光蛋白(dsRed)、突触-pH敏感型荧光蛋白(synapto-pHluorin)和m同种型蛋白及其任何衍生物(例如，mCherry、mStrawberry、mKate2、mEmerald和mNeonGreen)。类似地，诸如Hoeschst染料之类的染料及其任何衍生物可用于标记感兴趣的细胞和分子。在一些方面中，近红外染料经常包括花青染料。在本公开中用作缀合分子的荧光标记物的另外的非限制性实例包括：吖啶橙或黄、Alexa Fluors及其任何衍生物、7-放线菌素D、8-苯胺基萘-1-磺酸、金胺-罗丹明染色剂及其任何衍生物、bensantrhone、bimane，9-10-双(苯乙炔基)蒽、5，12-双(苯乙炔基)并四苯、双苯酰亚胺、脑虹(brainbow)、钙黄绿素、羰基荧光素(carbodyfluorescein)及其衍生物、1-氯-9，10-双(苯基乙炔基蒽及其任何衍生物、甲氧基染料及其任何衍生物、DiOC6、DyLight Fluors及其任何衍生物，VivoTag及其任何衍生物、ZQ800、吲哚花青绿(ICG)、艾吡可酮(epicocconeone)、溴化乙锭、FlAsH-EDT2、Fluo染料及其任何衍生物、FluoProbe及其任何衍生物、荧光素及其任何衍生物、Fura及其任何衍生物、GelGreen及其任何衍生物、GelRed及其任何衍生物、亚氨基香豆素、印度黄、indo-1及其任何衍生物、来若丹(1aurdan)、部花青及其任何衍生物、尼罗染料及其任何衍生物、苝、焰红染料、phyco染料及其任何衍生物、碘化丙锭(propidium iodide)、比染因(pyranine)、罗丹明及其任何衍生物、瑞博绿(ribogreen)、红荧烯、茋及其衍生物、磺基罗丹明及其任何衍生物、SYBR及其任何衍生物、四苯基丁二烯、tetrasodium tris、德克萨斯红、达旦黄(Titan Yellow)、TSQ、伞形酮、蒽酮紫、YOYO-1、TOTO及其任何衍生物、亲脂性染料(如，3，3′-双十八烷基羰基氰花青高氯酸盐(3，3′-Dioctadecyloxacarboncyanine perchlorate))以及荧光聚合物点和量子点。其他合适的荧光标记物包括但不限于：四甲基罗丹明(TRITC)、荧光素和荧光素染料(例如，荧光素异硫花青酸或FITC、萘并荧光素、4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、6-羧基荧光素或FAM等)、钙黄绿素、7-氨基放线菌素D(7-AAD)、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、羰花青、部花青、苯乙烯基染料、氧杂菁染料(oxonol dye)、藻红蛋白及其任何衍生物、赤藓红，曙红、别藻蓝蛋白(APC)及其任何衍生物、罗丹明染料(例如，羧基四甲基-罗丹明或TAMRA、羧基罗丹明6G、羧基-X-罗丹明(ROX)、丽丝胺罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、四甲基罗丹明(TMR)等)、香豆素和香豆素染料(例如，甲氧基香豆素、二烷基氨基香豆素、羟基香豆素、氨基甲基香豆素(AMCA)等)、俄勒冈绿(Oregon Green)染料(例如，俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514等)、德克萨斯红(Texas Red)、德克萨斯红-X、SPECTRUM RED、SPECTRUMGREEN、ALEXA FLUORTM染料及其衍生物(例如，ALEXA FLUOR 350、ALEXA FLUOR 488、ALEXAFLUOR 532、ALEXA FLUOR 546、ALEXA FLUOR 568、ALEXA FLUOR 594、ALEXA FLUOR 633、ALEXA FLUOR 660、ALEXA FLUOR 680等)、IRDye(例如，IRD40、IRD 700、IRD 800等)等等。
在一些实施例中，可使用可充当二级标记物或纯化的可检测标记物和亲和把手(affinity handle)的生物素缀合物。市售荧光生物素缀合物的非限制性实例包括Atto425-生物素、Atto 488-生物素、Atto 520-生物素、Atto-550生物素、Atto 565-生物素、Atto 590-生物素、Atto 610-生物素、Atto 620-生物素、Atto 655-生物素、Atto 680-生物素、Atto 700-生物素、Atto 725-生物素、Atto 740-生物素、荧光素生物素、生物素-4-荧光素、生物素-(5-荧光素)缀合物和生物素-B-藻红蛋白、Alexa Fluor 488生物胞素、AlexaFluor 546、Alexa Fluor 549、荧光黄、尸胺、生物素-X尸胺、Lucifer黄色生物胞素、俄勒冈绿488生物胞素、生物素-罗丹明和四甲基罗丹明生物胞素。在一些其他示例中，缀合物可以包括化学发光化合物、胶态金属、发光化合物、酶、放射性同位素和顺磁标记物。
在涉及从核酸序列表达可检测试剂的一些实施例中，可检测试剂(例如，标记物)可以采取融合蛋白的形式(其中标记物与从RNA转录的一种或多种蛋白物理连接或与从DNA或cDNA转录然后从mRNA转录的一种或多种蛋白物理连接)，或者它们可以采取单独的蛋白的形式，这种蛋白在细胞中由RNA、DNA或cDNA与另一个基因或基因片段结合产生(例如，由2A跳过序列分开)或单独产生并且不在创建后立即与另一种蛋白物理连接。
在一些实施例中，被标记的蛋白可以结合到细胞器或其他细胞结构或分子复合物的结构中，从而特异性地标记该细胞器、结构或复合物。在其他实施例中，被标记的蛋白质不是永久地结合到任何细胞器、结构或复合物中，而是可以与一种或多种细胞器、结构或复合物相结合或以其他方式暂时结合到一种或多种细胞器、结构或复合物中，以用于涉及那些细胞器、结构或复合体的定性或定量分析。在其他实施例中，可以定量或定性评估在与感兴趣的蛋白质相同的转录或翻译事件期间产生的游离标记物，以评估路径活性的存在或程度。
感兴趣分子
感兴趣分子可以为要例如通过用可检测试剂标记感兴趣分子来检测的样品中的分子。细胞可以包括感兴趣分子或多个感兴趣分子。感兴趣分子可以包括无束缚分子或与基材或细胞结构相结合的分子。
感兴趣分子可以是被容纳于细胞内的分子，或感兴趣分子可与细胞表面相结合，或感兴趣分子可以为从细胞分泌并被捕捉到基材上的分子。感兴趣分子可以包括肽、功能蛋白、非功能蛋白、脂质、抗体、细胞因子、有机或无机化合物、或核酸。核酸可以包括DNA或RNA或核酸复合物(例如，双链DNA、DNA/RNA杂合体、蛋白/DNA复合物以及蛋白/RNA复合物)。核酸还可以包括非编码RNA，诸如转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、snoRNA、微小RNA(microRNA)、siRNA、snRNA、exRNA、piRNA、和scaRNA。
感兴趣分子可以由细胞(包括被检查的细胞)产生(例如由免疫细胞产生的蛋白)，或者感兴趣分子可以为人工创造的分子或人工创造的分子的产物。例如，感兴趣分子可以为合成的寡核氨酸或核糖核酸质粒。感兴趣分子(并且在某些实施例中为可检测试剂)可以从核糖核酸质粒产生。在一些情况中，感兴趣分子可以被隔离并用在本文所述的方法以及系统中。这样的实施例的非限制示例可以为运动性实验，其中肌球蛋白分子的菌苔固定在基材上，同时允许在肌球蛋白分子上转录被荧光标记的肌动蛋白丝分子。
用可检测试剂标记分子可以提供定量或定性分析感兴趣分子的手段。可以执行感兴趣分子的检测和/或分析(例如，通过用于标记分子的可检测试剂)以确定多个实验参数或临床参数，包括分子浓度、分子的持久性、分子的空间定位、分子的共定位或聚集、分子的代谢、分子的结合或抑制、分子的修饰(例如，磷酸化、去磷酸化、泛素化、SUMO化、糖化、烷基化、酰胺化、脱酰胺、糖基化、氧化、酯化、甲基化等)、分子的表达或产生水平，分子的分裂或代谢以及这些参数随时间和/或相对于其他分子的变化。
可以用可检测试剂(例如，与荧光可检测试剂缀合的抗体)标记的目标分子的非限制性列表包括：4-1BB配体(CD137L)、CD221(IGF-1R)、Aiolos、CD223、(LAG-3)、抗His标签、CD226(DNAM-1)、精氨酸酶I，CD227(MUC-1)、BrdU、CD228(MFI2、MTF1)、CD1a(T6)、CD229(Ly-9)、CD1b、CD231(TALLA)、CD1c、CD235a(血型糖蛋白A)、CD1d、CD235ab(血型糖蛋白A/B)、CD2(LFA-2)、CD243(ABCB1)、CD3(T3)、CD243(MDR-1)、CD3ε、CD244(2B4)、CD4(T4、L3T4)、CD252(OX-40L、CD134L)、CD5、CD253(TRAIL)、CD6(T12)、CD255(TWEAK)、CD7(gp40)、CD257(BAFF、BLYS)、CD8a(T8、Leu2)、CD258(LIGHT)、CD9(四跨膜蛋白)、CD261(DR4、TRAIL-R1)、CD10(CALLA)、CD262(DR5、TRAIL-R2)、CD11a(整联蛋白αL)、CD263(DcR1、TRAIL-R3)、CD11b(整联蛋白αM)、CD266(Fn14/TWEAK受体)、CD11c、CD267(TACI)、CD11c(整联蛋白αX)、CD268(BAFFR、BAFF-R)、CD13(gp150、APN)、CD269(BCMA)、CD14、CD271(NGFR)、CD15(Lewis X)、CD272(BTLA)、CD16(FCγRIII)、CD273(B7-DC、PD)-L2)、CD18、CD274(B7-H1、PD-L1)、CD18(整联蛋白β2)、CD275(ICOSL、B7H2、B7-H2)、CD19(B4)、CD275(B7-H2、B7-RP1、ICOSL))、CD20(Bp35、B1)、CD276(B7-H3)、CD21(CR2、C3dR)、CD277、CD22(Siglec-2)、CD278(ICOS)、CD23、CD279(PD-1)、CD24(热稳定)抗原)、CD281(TLR1)、CD25(IL-2Rα)、CD282(TLR2)、CD26(DPPIV胞外酶)、CD283(TLR3)、CD27(S152、T14)、CD284(TLR4)、CD28(T44、Tp44)、CD290(TLR10)、CD29(整联蛋白β1)、CD294(CRTH2)、CD30(Ki-1、Ber-H2)、CD286(TLR6)、CD31(PECAM-1)、CD300c、CD32(FCγRII)、CD298、CD33(Sig1ec-3)、CD300e(IREM-2、CMRF35-A5)、CD34、CD300F(IREM-1)、CD35、CD301(CLEC10A)、CD36(gpIIIb、gpIV)、CD303(BDCA-2)、CD36L1(SCARB1)、SR-BI)、CD304(Neuropilin-1)、CD37、CD305、CD38(T10)、CD307(FcRL5)、CD39(NTPDase-1)、CD309(VEGFR2)、CD40(BP50)、CD314(NKG2D)、CD40配体(CD154)、CD317(BST2、Tetherin)、CD41/CD61、CD318(CDCP1)、CD41(gpIIb)、CD319(CRACC)、CD41b、CD321(F11R)、CD42b(gpIbα)、CD323(JAM3)、CD43(白细胞唾液酸糖蛋白(Leukosialin))、CD324(E-钙粘蛋白)、CD44(赫尔墨斯(Hermes)、Pgp-1)、CD325(N-钙粘蛋白)、CD45、CD326(Ep-CAM)、CD45(LCA、T200)、CD328(Siglec-7)、CD45R(B220)、CD334(FGFR4)、CD45RA、CD335(NKp46)、CD45RB、CD336(NKp44、NCR2)、CD45RO、CD337(NKp30、NCR3)、CD46、CD338(ABCG2)、CD47、CD340(erbB2/HER-2)、CD48(Blast-1)、CD344(卷曲蛋白-4(Frizzled-4))、CD49a(α1整联蛋白)、CD349(卷曲蛋白-9)、CD49b(α2整联蛋白)、CD351、CD49c(α3整联蛋白)、CD357(GITR)、CD49d(α4整联蛋白)、CD360(IL-21R)、CD49e、CD365(Tim-1)、CD49e(α5整联蛋白)、CD366(Tim-3)、CD49f(α6整联蛋白)、CD369(Dectin-1/CLEC7A)、CD50(ICAM-3)、CD370(CLEC9A/DNGR1)、CD51、CD371(CLEC12A)、CD51/61(α(V)/β(3)整联蛋白)、β2-微球蛋白、CD52(CAMPATH-1)、4-1BB(CDw137)、CD53(OX44)、4-1BBL(CDw137L))、CD54、A2B5、CD55(衰变加速因子)、APCDD1(DRAPC1)、CD56(NCAM)、B7-H2(ICOSL、B7H2、CD275)、CD57、B7-H4、CD58、Bcl-6、CD59(保护素、H19)、BrdU(溴脱氧尿苷)、CD61(β3整联蛋白)、钙粘蛋白11、CD62E(E-选择蛋白)、C3AR、CD62L(L-选择蛋白)、C5L2、CD62p(P-选择蛋白)、CCL11、C D63、CCR8、CD64(FCγ RI)、CCR10、CD66a/c/e、CLEC1B(CLEC2)、CD66b(CD67)、CLEC4A、CD68、CLEC4D、CD69(极早期激活抗原)、CLEC5A、CD70、CRTAM、CD71(转铁蛋白)受体)、皮肤淋巴细胞相关抗原(CLA)、CD72(Lyb-2)、CCX-CKR(CCRL1)、CD73、CX3CR1、CD74(MIF受体)、CXCL5、CD75(乳糖胺、CDw75)、CXCL9(MIG)、CD77、CXCL16、CD79a、CXCR7、CD79b、DcR3(诱饵受体3、TR6)、CD80(B7-1)、δ阿片受体(Delta Opioid Receptor)、CD81(TAPA-1)、多巴胺受体D1(DRD1)、CD82、DR3(TRAMP)、CD83(HB15)、EGFR、CD84(Ly9b)、EGFR磷酸化(Tyr1068)、CD85a(ILT5)、EphA2、CD85d(ILT4)、erbB3/HER-3、CD85g(ILT7、ILT-7)、ERK1/2磷酸(Thr202/Tyr204)、CD85h(ILT1)、FcεRIα、CD85i(ILT2)、FcRL4、CD85k(ILT3)、FcRL6、CD86(B7-2)、FOXP3(Forkheadbox蛋白P3)、CD87(uPA-R)、FPR3(FPRL2)、CD88(C5aR)、半乳糖凝集素-3(Mac-2)、CD89、半乳糖凝集素-9、CD90(Thy-1)、神经节苷脂GD2、CD92、GARP(LRRC32)、CD93、GFP、CD94(KP43)、GITR(TNFRSF18、AITR)、CD95(Fas、APO-1)、GL7、CD96(TACTILE))、GPR19、CD97、GPR56、CD98(4F2)、GPR83、CD99、GPR183(EBI2)、CD99(E2抗原)、颗粒溶素、CD99(Ewings肉瘤标记物)、颗粒酶A(CTLA-3)、CD100、颗粒酶B、CD101、颗粒酶K、CD102(ICAM-2)、HLA-A2、CD103(整联蛋白αIEL)、HLA-A、B、C(MHC I类)、CD104(整联蛋白β 4)、HLA-B7、CD105(Endoglin)、HLA-DM、CD106(VCAM-1)、HLA-DQ、CD107a(LAMP-1)、HLA-DRB1、CD107b(LAMP-2)、HLA-DR、DP、CD108(H-SEMA、SEMAL)、HLA-DR、DP、DQ、CD109、HLA-DR(MHC II类)、CD111(Nectin-1)、HLA-E、CD112(Nectin-2)、HRF、CD114(G-CSFR)、HVEM(TR2)、CD116(GM-CSFRα)、IFN-γRβ链、CD117(c-kit)、Ig轻链κ、CD119(IFN-γRα)、Ig轻链λ、CD120b、IgD、CD122(IL-2Rβ)、IgE、CD123(IL-3Rα)、IgM、CD124(IL-4Rα)、Ikaros、CD126(IL-6Rα)、IL-22、CD127(IL-7Rα)、整联蛋白β7、CD129(IL-9R)、IRF2、CD130(gp130)、KIR2DL2/L3(NKAT2)、CD131(IL-3R共有β)、KIR3DL1(NKB1)、CD132(常见γ链)、KLRG1(MAFA)、CD134(OX40)、LAMP5、CD135(Flt-3/Flk)-2)、LAP(TGF-β1)、CDw137L(4-1BBL)、LOX-1、CD137(4-1BB)、淋巴毒素β受体(LT-βR)、CD138(Syndecan-1)、LY6G6D、CD140a(PDGF-Rα)、M-CSF、CD140b(PDGF-Rβ)、肥大细胞类胰蛋白酶、CD141(血栓调节蛋白)、MERTK、CD142、MICA/MICB、CD143(血管紧张素转换酶)、MR1、CD144(VE-钙粘蛋白)、MRGX2、CD146、MRP1(ABCC1)、CD147(神经营养素)、MRP-14(S100A9)、CD148、MS4A4A、CD150(SLAM)、MUC-13、CD151(PETA-3)、Notch1、CD152(CTLA-4)、Notch2、CD154(CD40配体)、Notch4、CD155(PVR、NTAL(LAT2)、CD156c(ADAM10)、NTB-A(NTBA)、CD158、PCNA(增殖细胞核抗原)、CD158b(KIR2DL2/L3、NKAT2)、穿孔素、CD158e1(KIR3DL1、NKB1)、磷酸酪氨酸、CD158f(KIR2DL5)、PNAd、CD160、Podoplanin、CD161、ROR1、CD162、S100A4、CD163、SCIMP、CD164(MUC-24、MGC-24)、SEMA4A、CD166、唾液酸Lewis X(二聚体)、CD 167a(DDR1)、Siglec-9、CD169(唾液酸粘附素、Siglec-1)、SIT、CDl70(Siglec-5)、SSEA-1、CD171、SSEA-3、CD172a(SIRPα)、SSEA-4、CD172b(SIRPβ)、SSEA-5、CD172a/b(SIRPα/β)、STAT2、CD172g(SIRPγ)、STRO-1、CD177(NB1)、T-bet、CD178(FasL/CD95L)、TACSTD2(TROP2)、CD179b(Igλ5)、TCL1、CD180(RP 105)、TCRVα7.2、CD181(CXCR1)、TCRVα24、CD182(CXCR2)、TCRVα24-Jα18(iNKT细胞)、CD183(CXCR3)、TCRVβ1、CD 184(CXCR4、融合素)、TCRV β5、CD 185(CXCR5)、TCRVβ5相关、CD 186(CXCR6)、TCRVβ7.1、CD 191(CCR1)、TCRVβ8、CD192(CCR2)、TCRVβ13.1、CD193(CCR3)、TCRVδ2、CD194(CCR4)、TICAM-1(TRIF)、CD195(CCR5)、TIGIT(VSTM3)、CD195(CCR5)磷酸化(Ser349)、Tim-4、CD 196(CCR6)、TLT-2、CD197(CCR7))、TM4SF20、CD199(CCR9)、TMEM8A、CD200(OX2)、TSPAN33、CD200受体、TRA-1-60-R、CD201(EPCR)、TRA-1-81、CD202b(Tie2/TEK)、TRA-2-49、CD203c(E-NPP3)、TRA-2-54/2J、CD204、TREM-1、CD206(MMR)、TSLPR(TSLP-R)、CD207(郎格素(Langerin))、TSPAN8、CD209(DC-SIGN)、TWEAK(Apo-3配体、DR3-L)、CD210(IL-10R)、uPA(PLAU)、CD213α1(IL-13Rα1)、VEGF-165、CD213a2(IL13Rα2)、VEGFR-3(FLT-4)、CD217、Veri-CellsTMCD4-Low PBMC、CD217(IL-17AR)、Veri-CellsTMPBMC、CD218a(IL-18Rα)、ZAP-70、CD220。
在一些方面中，对分子进行标记可以被认为是对细胞进行标记，这是由于分子的检测可以提供关于含有该分子或与该分子相结合的细胞的信息。例如，用于标识给定蛋白的可检测试剂可以用于跟踪细胞的移动，以评估细胞的表型、量化细胞的增值速率、或对于本领域技术人员而言明显的大范围的其他生物指标。
细胞和细胞修饰
细胞可以用于本公开文本的方法和系统中，并且细胞可以是真核的或原核的，并且可以衍生自任何物质。可对细胞进行标记、检测、去标记、刺激、固定、透化、交联到凝胶随后洗涤、和/或使用本公开文本的方法和系统来溶解。细胞可以是任何表型或基因型的初生的或永生的、或被工程改造的细胞。例如，细胞可以来自患者(例如白细胞)或来自已被建立的细胞系，其包括干细胞系，例如被诱导的多能干细胞系。本文描述的方法和系统中使用的细胞的基因型和/或表型可以代表异常状况，并且可以出于该原因对它们进行选择。所公开的方法和系统中所使用的细胞还可以是从源于患者的细胞衍生的细胞或被建立的细胞系，诸如与干细胞不同的细胞。所公开的方法和系统中所使用的细胞还可以包括多种细胞(培养物中或生物组织中的两种或更多种单独的细胞)。
可以在基材上直接培养本文所述的方法和系统中所使用的细胞(如果基材是平面的话，在基材的孔中培养或在基材的表面上培养)。可以固定本文所述的方法和系统中所使用的细胞或以其他方式将本文所述的方法和系统中所使用的细胞与基材相结合以进行分析(如果基材是平面的话，固定在基材的孔中或在基材的表面上)。细胞可以位于基材上，使得它们在基材上空间有序(例如，周期性阵列，其可以例如通过将基质蛋白或分子沉积在基材的特定部分上而生长)，或者可以例如通过将每个细胞附着到粘性贴片(例如，基质的贴片或区域，所述基质的贴片或区域已经涂有一种或多种基质蛋白质或分子、或已经被等离子体处理或已经被其他方式处理以加强或促进细胞或分子的粘附)或通过将每个细胞置于贴片阵列的孔或多个孔中来将细胞固定。细胞可以在基材上是空间无序的(例如，随机阵列)。当与基材相结合或在基材上生长的细胞覆盖了基材的面积的至少20％、至少30％至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％或汇合时，所述细胞在以随机阵列的形式时可以被标记或去标记。
本文中所述的细胞可以是活动的或固定的。细胞的固定可以包括使用醛(例如，戊二醛，甲醛和多聚甲醛)、乙醇、甲醇、福尔马林、丙酮或苦味酸盐以及其他固定剂。固定剂可以单独使用、彼此组合使用、和/或与诸如缓冲剂之类的其他试剂组合地使用。本文所述的方法和系统还可以包括在从患者和/或细胞组分培养物中采集原代细胞之后并且在检测可检测试剂之前的各种实验干预。在检测可检测试剂之前，可以对细胞进行化学固定或低温处理。在一些实施例中，在进行一种或多种检测方法(例如，显微镜检查、流式细胞术、质谱法等等)之前，可以将细胞固定并酶促地或机械地从培养物中移除或从组织中解离(或从培养物中移除或首先从组织解离随后固定)。在检测之前，可以使用透化剂(例如，洗涤剂(诸如Triton X-100、Tween 20、皂苷)、有机溶剂(诸如甲醇和丙酮)等)使细胞透化。在检测前，可刺激细胞以分泌蛋白或激活某些路径。细胞可以交联到凝胶材料，使得细胞组分(例如，蛋白和核酸)交联到凝胶，从而在标记、检测和去标记之前保留细胞和细胞组分的数量和它们的空间位置。任选地，细胞和/或细胞组分可以被洗涤以移除某些其他细胞组分(例如，脂质或酶)。如果额外的可检测试剂要用于对细胞进行标记(例如，与亲和标签相结合的可检测试剂，诸如与可检测试剂缀合、融合或以其他方式相结合的抗体)，额外的可检测试剂可以在透化之前或之后被添加到细胞。如果给定的可检测试剂在细胞的表面上或如果可检测试剂在细胞内产生，则可无需透化。
可以在单层培养物中将细胞培养在基材上。细胞可以是来自患者的组织活检或来自动物的组织切片的一部分。可对细胞进行标记、检测、去标记、刺激、固定、交联到凝胶、和/或在基材上溶解。所有流体和试剂可以通过流动池(例如，微流体设备)递送到细胞或基质，并且用于递送这些流体和试剂的过程可以是自动化的。
可检测试剂的检测
可以通过检测相关联的可检测试剂来检测感兴趣分子。可以使用各种检测器来检测给定的可检测试剂，对所述给定的可检测试剂的选择可取决于对正在被检测的可检测试剂的标识和性质。例如，可以由光检测器来检测可检测试剂。在一些实施例中，荧光可检测试剂可由流式细胞计来检测。在其他的实施例中，荧光可检测试剂可由显微镜来检测。在其他的实施例中，荧光可检测试剂可由相机来检测。可检测试剂的检测可以在标记或去对细胞进行标记或感兴趣分子的过程之前、之后或期间被执行。
可通过使用显微镜来检测可检测试剂。另外，可检测试剂的存在或不存在可以由光学显微镜来检测。显微镜可以为荧光显微镜。荧光显微镜可为单光子成像或双光子成像或多光子成像。另外，显微镜可以用于检测可检测试剂在细胞的细胞器或质粒薄膜中的位置。例如，显微镜可用于检测位于细胞核中的荧光团。
检测器所记录的空间分辨率可以通过使用例如高功率显微镜物镜、高像素相机图像反卷积算法、和光学透明成像介质(例如，安装介质和合适的物镜油)来改进。以此方式，检测的分辨率可以小至5微米、4微米、3微米、2微米、1微米、0.5微米、0.25微米、0.1微米或更小。
检测具有荧光标记的细胞(例如，荧光可检测试剂)可以包括在微滴定板容器中或在微流体设备中或在具有能够激发荧光团的波长的光的基材上对细胞进行刺激，使得其在该荧光团的理论发射光谱内发射光子并且使用光学检测器来记录那些被发射的光子。检测在培养物或组织中携带荧光标记的细胞可以它们在培养物中或在组织中的过程上的任何时间点发生，并且可以在实验期间发生多次(例如，当观察细胞的变化或细胞在时间过程上的行为时)。检测与基材相结合的荧光标记的细胞还可以在它们与基材相结合的时间的过程上的任何时间点发生，并且可以在实验期间发生多次。
本文所描述的方法和系统允许可检测试剂的高灵敏度检测。在一些实施例中，使用本文所述的方法和系统，可在给定探测器通道中可检测少至10000个可检测试剂分子、5000个可检测试剂分子、1000个可检测试剂分子、500个可检测试剂分子、100个可检测试剂分子、50个可检测试剂分子、10个可检测试剂分子、或甚至低至1个可检测试剂分子。在一些实施例中，可被检测到的可检测试剂的量可以少于1ng、少于100pg、少于10pg、少于1pg、少于100fg、少于10fg、少于1fg、少于100ag、少于10ag、少于1ag、少于100zg、少于10zg、少于1zg或少于0.1zg。
多种类型的可检测试剂可以用于极快标记、去标记、循环极快标记、或多重极快标记。在此方面，可同时用在本文所述的方法和系统中的可检测试剂的数量(与可检测试剂分子相反，可检测试剂分子可以指代单个颗粒或分子而不是不同类别或类型的可检测试剂)可以是1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13，至少14，或至少15。不同类型的可检测试剂可产生不同的信号频谱，所述不同的信号频谱在不同的波长范围上可具有不同的强度。通过协调选择在单轮极快标记中使用的可检测试剂的类型(独立于任何其他实验或与其他步骤或多轮极快循环成像协调)，可以检测每种可检测试剂并将其与已经在同一时间所使用的或如果必要的话在前几轮标签中所使用的其他可检测试剂区分开来。在一些实施例中，在将用可检测试剂标记的样品去标记期间可以保留猝灭剂，所述可检测试剂需要用于去标记的猝灭剂。例如，在一个或多个后续循环荧光成像中检测一个或多个感兴趣分子的情况下(例如，在通过至少一个去标记步骤所分开的多轮检测中)，可以基于其对基于电压的去标记的相对抗性来选择多种可检测试剂(该多种可检测试剂被选择用于标记将在一轮或多轮后续循环荧光成像中检测到的一个或多个感兴趣分子)中的一种或多种可检测试剂。非限制性示例可包括：使用需要猝灭剂进行去标记的可检测试剂来标记将在多于一轮检测中检测到的分子；以及在中间去标记步骤中保留所需的猝灭剂，从而允许在用可检测试剂标记的其他分子(例如，已知对基于电压的去标记敏感的可检测试剂)被去标记时该分子保留标记。例如，在每一轮都要追踪感兴趣细胞或分子的一些实施例中，可以包括需要猝灭剂进行去标记的可检测试剂的这种使用。因此，在随后的几轮标记中将使用的(一种或多种)可检测试剂类型的协调可与未被去标记或在前几轮中未被完全去标记的可检测试剂的类型相协调。
可以将用于最大化检测灵敏度的规定结合到用于测量和记录可检测试剂信号的系统中。例如，在检测期间来自样品和检测器的环境光、在其与可检测试剂接触后的样品、使用封闭缓冲剂和反应剂、和通过例如避免使用固定剂和自发荧光基质来限制自发荧光。
基材
本公开文本的各种方面包括提供如下基材：该基材可与细胞相结合并且在该基材中可以对细胞进行标记、去标记和/或检测并且该基材可以提高对细胞进行标记和去标记的过程的效率。与基材相关的电池也可以被加热、冷却、施加电压、并经受相对于电池移动的流体流动(例如，通过在通道中流动的流体或通过振动或搅动基材)。基材可为平面的。基材可为有盖培养皿。基材可以是流体或微流体系统或设备的一部分，诸如形成流动通道或孔阵列的底板。基材可以包括单个容器或多个容器，并且容器可以是培养物的孔或孔板(例如，微滴定板、96孔板、或者384孔板)。容器的底部可以是平坦的、圆锥的、金字塔形的、或用于执行本方法的任何合适的配置。孔截面可以是圆形的、方形的、矩形的、三角形的、梯形的或任何其他合适的截面配置。在标记期间增加抗体或其他亲和试剂的浓度可能增加成本，所以相对于标记的总体成本来说，使用包括需要最小容积的尺寸的孔或容器或通道的基材可以是有利的。使用流体设备或微流体设备用于引入亲和试剂可以减少在标记期间所需的容量，并且可以增加标记的速度，因为可以快速地交换溶液且通过自动化流程来交换溶液。流体流动(例如，流体相对于细胞的移动)的存在还可以促进对细胞进行标记和/或去标记。
将感兴趣的细胞或分子与基材相结合可以包括细胞粘附、交联、抗体介入捕捉、共价键合、非特异性吸收或流体诱导的结合(例如，通过正或负流体压力)、机械诱导的结合(例如，通过搅拌或离心)、电诱导结合(例如，通过电泳或介电电泳或其组合)或磁诱导的结合(例如，通过使用磁性材料或颗粒)。细胞或多个细胞与基质的结合可包括一般粘合力、重力、离心力、流体流动力、流体压力、摩擦力、或表面张力(例如，放置在基底上而不是在基底上生长的组织)、或电动力或介电力或磁力。样品(例如细胞，组织或分子)与基材的结合可以是暂时的(例如，放置在基质上的组织)、永久性的(例如，与基材交联的粘附细胞)、或有条件的(例如，需要二价离子以保持附着在基材上的未被固定的粘附细胞)。
基材可以包括单细胞阵列(图21)。单细胞阵列可以是规则阵列或随机阵列。包括规则阵列的本公开内容的系统和方法的实施例可以以周期性方式布置。随机阵列可以包括覆盖粘附区域的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。
在一些方面中，使用本公开内容的单细胞阵列涉及包括以下步骤的方法：当细胞在液相中运输时，容纳或物理捕获或表面附着单个细胞；和在该阶段的流动路径之后，转移到物理限定的位置并由于随后的基于流动的力或表面粘附力而驻留在限定的位置。在另一种情况下，当流体流动路径相对于入口到出口是连续的时细胞被顺序捕获。在另一种情况下，由于入口和出口之间的细胞可以同时经历多个流动路径，因此多个流体流动路径和相应的多个单个细胞以平行方式被捕获/隔离。在一些情况下，阵列可具有拥有各种潜在的尺寸和形状以及表面特性的腔室。尺寸和形状以及表面特性会影响平行流动陷阱设计。在一些方面中，设备的腔室可以是孔。该设备可以从溶液(诸如，珠、细胞等)捕获单个颗粒/细胞，并且可以平行布置多个孔以形成该设备。
在一些方面中，单细胞阵列可以与本领域技术人员已知的用于分析核酸的方法一起使用。在一些方面，核酸的分析可包括荧光原位杂交(FISH)或聚合酶链式反应(PCR)。在使用单分析物阵列来执行PCR的情况下，所有腔室可用流体中的单分析物填充。可密封(例如，使用油以密封)每个腔室，并且可平行地对每个单分析物执行PCR。可使用多种技术以检测被包含在单分析物阵列的单独的孔或腔室中的分析物。例如，孔中的分析物或腔室可以使用显微镜来成像。在一些方面中，显微镜可以包括亮场显微镜。在一些方面中，显微镜可以包括荧光显微镜。在显微镜的任何情况下，样品可以放置在载台上。在某些情况下，可以手动操作载台。在其他情况下，载台可以是可由计算机程序控制的自动平移载台。在显微镜的任何情况下，可通过CCD相机来采集图像。
基材可包括被涂覆的表面或未涂覆的表面或图案化表面、或者具有化学图案(例如，粘附贴片的周期阵列)或形貌图案(例如，周期性阵列或凸起区域或凹陷区域或孔)，其可通过基材上所提供的细胞或分子来选择。涂层可包括化学物质、生物分子、核酸、蛋白、捕获剂、肽、脂质、碳水化合物、凝胶、聚合物、导体、半导体、非导体、有机分子、或无机分子。可以选择基材材料或基材涂层以使其能够排斥或锚定细胞(例如，明胶、纤连蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、聚集蛋白聚糖、骨粘连蛋白、弹性蛋白、纤维蛋白原、肌原纤蛋白、肌腱蛋白、或其他细胞外基材化合物)。可以选择基质或其包衣组成的(一种或多种)材料的特性，以允许系统排斥或捕获与细胞相结合或从细胞分泌的所期望的分子。基材可以是膜，并且可以包括导体，例如石墨烯。基底也可具有形貌图案。基材也可以具有形貌图案。
可以设计基材以促进细胞粘附，或基材可以采用不同的机制将细胞固定在其表面上。例如，具有连接到抽吸源或流体压力源的孔(或多个孔)的基材可用于通过在细胞存在时经由孔抽吸负流体压力(例如，真空)来固定孔中的带电或固定的细胞。可以设计基材以最大化捕获与细胞相关或分泌的分子；或者基材可以被设计成最小化与细胞相关或从细胞分泌的分子的非特异性结合，例如，通过物理构型(例如，微流体设备的流动通道中的几何形状或基材的形貌特征)、选择合适的衍生基材和/或其涂层的材料(例如，定位于基材区域或覆盖培养区域的特定粘附蛋白、或疏水或亲水表面化学或水凝胶)或功能能力(诸如抽吸手段或流体压力(例如，负压或正压))。
基材本身可包括金属、金属合金或非金属，并且可设计成相对于细胞增强或改变电场或施加的电压。基材也可以设计成使其对电场或施加的电压几乎没有影响(例如，由非导电的非磁性材料而制成的基材)。基材还可以被设计为包括导电材料，该导电材料帮助形成或施加被施加到细胞的电压或电场、执行测量(例如，细胞增殖或迁移的测量)和/或递送刺激(例如，用于修饰细胞表型或用于技术目的(诸如，电穿孔))。基材可包括磁体(例如，永磁体或电磁体)以为了创建或修改电压或电场或为了将分子(如包括磁标签的亲和标签)施加到细胞或分子。基材还可以包括加热细胞的手段和/或在细胞上创建电压的手段。基材还可以包括测量细胞的温度或细胞周围的温度的手段。基材还可以包括测量被施加到细胞的电压或电场的量的手段。基材还可以包括测量施加的电压所产生的反应化学物质(诸如反应氧物质)的量的手段。基材还可以包括用于递送及移除反应剂(诸如可检测试剂和缓冲物)的流动池(例如，微流体设备)。基材可以包括用于实现或增强对细胞的成像的透明材料，诸如玻璃或透明塑料。
基材可以永久性地附着到检测器(例如，生物分析仪或接近度检测器的托盘)或基材可为可移除单元。基材可以是可堆叠的(例如可堆叠多滴定板)以用于多重化策略。
流动池
本公开内容的方法和系统还可包括被连接到基材的流动池(例如，流体管理系统)。流体管理系统可以包括流动通道，所述流动通道用于将流体供应到样品细胞(例如，生物细胞的环境，诸如基材)和/或用于从样品细胞的环境(例如，生物细胞的环境)移除流体。流动池可以包括蠕动泵、输注泵、注射泵、微泵(例如，微机电系统或MEMS泵)、真空泵、机械泵、或重力泵。流动池可以包括储存器、小瓶、管、阀、管道、流动通道和分叉的系统，其可以集成到基材中或者可以从基材移除或者可以在基材外部并且可以用于容纳试剂(诸如固定剂、细胞透化剂、洗涤缓冲剂、可检测试剂、废液、细胞培养基、交联剂、细胞刺激剂、捕获分子、药物等)。流动池及其相关特征(例如泵和阀)可由计算机处理器操作并自动化。
流体管理系统可以包括流体系统或微流体系统，所述流体系统或微流体系统与基材永久地相结合、或者相对于基材可移除、或者是基材的一部分、或者在基材外部。例如，微流体设备可以集成到基材中或者微流体设备是基材的一部分，或者它可以包括通过将上部固定到基材上(例如，通过抽吸或通过夹子、螺杆或其他锁定机构)而形成的腔室。
通过流动池供应给细胞的流体可包括：细胞培养基、激动剂、拮抗剂、药物、兴奋剂、酸、碱、缓冲剂、固定剂、细胞透化剂、捕获剂、交联化学品、核酸杂交或去杂交剂以及可检测的试剂。流动池可以用于向细胞供应如这些之类的物质和溶液，以用于：培养细胞、刺激细胞、捕获细胞产生的分子、固定细胞、使细胞透化、交联成凝胶、嵌入细胞、附着细胞、分离细胞、洗涤细胞、保湿细胞、对细胞进行标记、或对细胞进行去标记。
温度控制装置
本公开内容的方法和系统可以包括温度控制装置(该温度控制装置可以包括温度控制设备)以用于调节本文所述的方法和系统中使用的细胞和/或流体的温度。因此，通过限定目标温度或温度设定点，可以将受控(例如，被调节)的温度施加到细胞。通过控制样品(例如，细胞，分子或可检测试剂)的温度，可以显著改进细胞、分子或可检测试剂被标记和/或去标记的速度。
在一些实施例中，可以使用多个温度控制设备，例如以改进基材的各个容器上的温度均匀性。温度控制合并可用于在样品、组、测定和实验之间保持一致的实验条件，并且可用于改进标记或去标记的效率。通过在对细胞或分子进行标记的过程中增加细胞和亲和标签或可检测试剂(例如，可检测标记)的温度，可减少对细胞或分子进行标记所需的时间量。通过在对细胞或分子进行去标记的过程中增加或降低细胞和亲和标签或可检测试剂(例如，可检测标记)的温度，还可减少将细胞或分子去标记所需的时间量或可改进将细胞或分子去标记的效率或程度。
温度控制设备可包括加热元件，该加热元件用于增加样品(例如细胞、分子或可检测试剂)或样品周围的温度。加热元件可包括电加热元件、对流加热元件、空气加热元件、珀耳帖(Peltier)加热元件、电阻加热元件、燃烧加热元件、感应加热元件(其可与包括感应线圈等的基材一起使用)、化学加热元件或光加热元件(例如，红外光)。可以基于对在附近产生的施加的电压或电场的影响、在很少或没有变化或噪声的情况下精确且准确地在样品(例如，感兴趣的细胞或分子)中诱导规定温度的能力、以及对特定应用的适用性的考虑来选择加热元件机构。温度控制设备还可包括冷却元件，该冷却元件用于降低样品(例如细胞，分子或可检测试剂)或样品周围的温度。冷却元件例如可以包括珀耳帖设备。
温度控制装置可包括能够随时间而改变温度的系统。可独立地或与其他实验条件(例如，施加的电压或电场、细胞的去标记、细胞的标记、可检测试剂向细胞的递送、或细胞和/或与其相结合的可检测试剂的检测)一致地规定(手动地或数字地)一个温度控制装置或多个温度控制装置以随时间来改变细胞的温度、细胞的一部分、基材或基材的部分。以这种方式，细胞、分子或基材的加热和/或冷却可以是循环的。
温度控制设备还可包括散热器或冷却元件，诸如制冷单元。
温度控制装置可包括热电偶和/或珀耳帖热泵。可通过将温度控制设备(其可以包括升高温度的装置、检测温度的装置、和/或降低温度的装置)结合到基质中或通过将温度控制设备定位在感兴趣的细胞或分子附近或通过控制感兴趣的基材或细胞周围的温度来使用温度控制设备(例如，手动地或通过计算机处理器可执行的程序)控制感兴趣的细胞或分子的温度。通过计算机处理器的控制反馈回路、诸如热电偶之类的温度检测元件、以及加热元件或冷却元件，可通过不超过0.25℃、不超过0.5℃、不超过0.75℃、不超过1℃、不超过2℃、不超过3℃、不超过4℃、或不超过5℃的变化来控制样品(例如，细胞、分子或可检测剂)的温度，该变化可相对于温度设定点进行测量。
温度设定点可以是要进行实验(例如标记、去标记或检测)的目标温度。温度设定点可以由存储在计算机存储器中的编程协议规定，或者可以由用户手动规定(例如，通过诸如触摸屏或键盘之类的输入接口)。
通过在标记期间加热细胞来提高标记效率可以相对于主观参考温度(例如，高于室温13摄氏度)或者可以基于给定大气条件下的温度范围(例如，在30摄氏度和80℃之间且在一个大气压下)来规定。因此，温度控制装置(或多个温度控制装置)可用于将感兴趣的细胞或分子加热至至少26℃、至少30℃、至少31℃、至少32℃、至少33℃、至少34℃、至少35℃、至少36℃、至少37℃、至少38℃、至少39℃、至少40℃、至少45℃、至少50℃、至少55℃、至少60℃、至少65℃、至少70℃、至少75℃、或至少80℃的温度。
去标记的方法
除了用可检测试剂标记感兴趣的细胞或分子(例如，样品)之外，本文所述的方法和系统可以提高对感兴趣的细胞或分子进行去标记的效率，作为其自身的端部或作为循环荧光成像方案的一部分(例如，如图3至图8中所述)。
去标记可以包括：破坏可检测试剂；化学修饰可检测试剂(例如，通过化学反应，例如氧化)；可检测试剂与细胞、目标分子或亲和标签(例如，适体、抗体或核酸)的解离；亲和标签与来自感兴趣的细胞或分子的可检测试剂的解离；或永久地或暂时地降低可检测试剂的信号。去标记可以包括：对样品进行去染色；可检测试剂的化学反应，其使得样品不可检测或不太可检测；光漂白或光猝灭或光催化可检测试剂；或用猝灭剂来淬灭可检测试剂信号。
在每个标记实验中可以检测的不同类型的可检测试剂的数量可能受到检测器或检测方案的能力的限制。因此，通过检测器或检测方案一次检测到的需要分析细胞、一个细胞(或多个细胞)的方面或分子的实验研究将需要额外的实验，其中在感兴趣的细胞或分子上的剩余的未测试的细胞或分子可以用可检测试剂来测量。由于针对新细胞或目标分子的可检测试剂的重复实验可能是时间和资源密集型过程，因此对样品(例如，感兴趣的细胞或分子)进行去标记和重新标记的能力允许增加实验效率。此外，减少对细胞或分子进行去标记所需的时间是增加这样的实验的效率的重要方面。
极快去标记的过程可以包括图3中所述的步骤。具体地，极快去标记可包括提供用与基材(301)相结合或接触的可检测试剂标记的感兴趣的细胞或分子，其可涉及在多滴定板上或在组织培养板上培养或维持所需状态的细胞。极快去标记可以进一步包括：例如用位于使得电压施加在样品上的产生电压的电极来向细胞、分子或可检测试剂(302)施加电压；以及任选地，使用如上所述的检测方法检测可检测试剂来验证可检测的试剂信号已经减弱或变得不存在或基本上不存在(例如，通过破坏或抑制可检测的试剂，这可能通过暴露于电压应用期间产生的活性氧物质而发生)(303)。
图10A至图10H示出了对被染色的MCF-7细胞进行去标记的结果。图10A至图10H中的MCF-7细胞在进行去标记之前用两种不同的可检测试剂(PE-抗-EpCAM和PE-抗-细胞角蛋白)染色，如本公开内容的方法中所述的那样。可以通过将8伏特的电压施加至于细胞和/或可检测试剂接触的溶液来快速去标记被标记的细胞(图10A和图10E)。在30秒的非光漂白电压施加之后(图10B和图10F)，可检测试剂信号(例如，藻红蛋白信号)已显著降低。在仅经受60秒的被施加的电压之后(图10C和图10G)，可检测剂信号已急剧减少。图10D和图10H是明场图像，其示出了通过极快去标记过程细胞本身未被改变或从基材上抬起。
图11A至图11D示出了施加电压对可检测试剂信号(PE-抗-EpCAM)猝灭或去除的令人惊讶的非线性效应(图11A和图11B)。在0伏特和1伏特之间，处理5分钟后可检测试剂信号的减少小于15％；然而，当施加的电压增加到3伏特持续5分钟时，可检测试剂信号减少了超过80％。施加8伏特的电压持续5分钟，可检测试剂不再为可检测的。如图11C和图11D中看见的，在8伏特电压下的可检测试剂信号的猝灭发生得非常快。通过90秒的去标记，可检测试剂信号已被减少超过99％。
去标记和去染色可以指降低可检测试剂产生的信号的过程。去标记可能涉及破坏可检测试剂、使可检测试剂无法产生信号而不破坏和去除可检测试剂(暂时地或永久地)、或使可检测试剂与分子或细胞解离，以使得来自可检测试剂的信号不太能够被检测到。
可执行去标记以便减少来自一种可检测试剂(或多种可检测试剂)的一个信号(或多个信号)。同样地，可以执行标记以创建或增强可检测信号的量，该可检测信号的量与感兴趣的细胞或分子相关联。细胞的去标记和标记可以独立地或连续地执行，从而通过利用快速去标记和标记方法或由所述方法提供的高的标记和去标记效率或者以上两者来提高每个过程的效率或每个过程或对细胞或多个分子进行去标记和标记(例如，脱色和染色)的重复循环的性能。
将分子去标记可涉及减少可检测试剂的信号。特别地，当向/跨可检测试剂和/或与其相关的细胞和/或向与可检测试剂接触的溶液施加电压(如图3的302中所述；还参见图10A至图10H、图11A至图11D、图12A至图12C、图13A至图13T、图14A至图14F和图15A至图15C)时，可以以惊人的效率(与本领域已知的技术相比)实现可检测试剂的去标记。当对可检测试剂和/或与可检测试剂相结合的溶液和/或对与可检测试剂接触的溶液细胞施加至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75或100伏特的电压时，可实现可检测的药剂信号降低至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％。提高对感兴趣细胞或分子的去标记的效率(对感兴趣细胞或分子的去标记可涉及可检测试剂的猝灭(例如，去标记的过程，其中来自可检测试剂的信号被降低而不从与其相结合的分子中去除可检测试剂)和破坏(例如，使可检测的试剂不能产生信号))可通过施加至少1伏特、至少2伏特、至少3伏特、至少4伏特的电压、至少5伏特、至少6伏特、至少7伏特、至少8伏特、至少9伏特、至少10伏特、至少15伏特、至少25伏特、至少50伏特、至少75伏特或至少100伏特的电压至可检测试剂或与可检测试剂相关的细胞或分子或与可检测试剂接触的溶液来实现。在一些实施例中，可以将电压施加至感兴趣的细胞、分子或与感兴趣的细胞或分子接触的溶液不超过30秒、不超过45秒、不超过60秒、不超过75秒、不超过90秒、不超过2分钟、不超过2.5分钟、不超过3分钟、不超过3.5分钟、不超过4分钟、不超过4.5分钟、不超过5分钟或不超过10分钟。可以使用上述方法在少于20分钟、15分钟、少于10分钟、少于9分钟、少于8分钟、少于7分钟、少于6分钟、少于5分钟、少于4分钟、少于3分钟、少于2分钟、少于1.5分钟、少于1分钟、少于0.75分钟或少于0.5分钟的程度内完成样品(例如，细胞、分子或可检测试剂)的去标记。通过在去标记期间将样品(例如，细胞、分子或可检测试剂)加热至高于26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、45℃、50℃、60℃、70℃或80℃和/或通过引入流体流过样品(例如，细胞、分子或可检测试剂)和/或通过物理搅拌(例如，摇动或旋转)样品，可实现去标记效率的进一步改进。可以在去标记之前、之后或期间执行检测可检测试剂。
可以在连续、间歇、定时和受控的流体流动或其组合的存在下进行分子或细胞的去标记。例如，被标记的细胞在连续流体流动的存在下被去标记(如图14A至图14C中所述)或存在受控和定时施加的流体流动(图14D至图14F)。
当样品(例如，细胞、分子或可检测试剂)被去标记(例如，猝灭)时，样品可含有一些能够产生可检测信号(例如，可检测试剂信号)的可检测试剂。这可以描述为残留的可检测试剂信号，并且在荧光可检测试剂的情况下，可以将其描述为残留荧光。残留可检测试剂信号(例如，残留荧光)可以例如相对于在去标记之前或在标记之前的可检测试剂信号来确定，相对于未被去标记的第二类似标记的样品来确定，相对于标记(例如，自发荧光)之前来自细胞或分子的背景信号来确定，相对于上一轮去标记后的残留可检测信号或残余荧光来确定，相对于可检测信号的饱和水平(例如，在20摄氏度下用可检测试剂标记1小时后的荧光)来确定，或作为细胞位点的百分比来确定(例如，给定的可检测试剂可特异性结合的位点的百分比)。残留荧光(如在去标记之前测量可检测试剂荧光)可相对于可检测试剂信号的强度(例如，每秒的光子数和/或可检测试剂发射的光子的相对能量)来确定。极快去标记后的残余荧光可少于5％、少于2％、少于1％、少于0.5％或少于0.1％。为了验证残留荧光已达到所期望的水平，可以在去标记验证之后或在去标记期间检测或成像一部分被去标记的细胞，因此可以在已达到所期望的残留荧光信号之后终止去标记过程。
该结果可以通过许多非排他性机制获得，每种非排他性机制都可以用于本公开内容的方法和系统，非排他性机制包括：向细胞或可检测试剂或者与细胞或可检测试剂接触的溶液施加电压或者电场；使用化学信号猝灭剂(例如黑洞猝灭剂，诸如可从Sigma-Aldrich获得的，例如BHQ-1，BHQ-2或BHQ-3)；光漂白；将可检测试剂连接到感兴趣的亲和标签或分子的接头的切割(例如，二硫键的化学切割、接头的水解、接头的葡萄糖切割、用光切割接头、热诱导的DNA接头的切割、DNA/PNA(肽核酸)链交换(例如，关于接头溶解)、pH诱导的结构变化以改变DNA接头、基于酶的DNA接头切割、基于DNA适体的切割系统(存在三磷酸腺苷的情况下))；可检测试剂的化学反应或化学还原或化学氧化；可检测试剂的光转换或光猝灭(例如，光转换或用光猝灭聚合物点)；Forster共振能量转移(FRET)可检测试剂和猝灭剂的交联；可检测试剂的电化学氧化；或用剥离缓冲剂来剥离抗体亲和标签。这些机制可以彼此互补并因此组合以进一步提高去标记的性能和效率。
去标记可以在流体流动的存在下进行，这可以提高去标记的速度和/或效率和/或在给定时间段内去标记的程度。例如，在基于化学反应的去标记或在向与可检测试剂接触的溶液施加电压时电化学氧化可检测试剂的情况下，流体流动将增强反应化学物质或氧物质传输到可检测试剂，从而改进去标记的速度和/或效率或去标记的程度。例如，可以通过使流体通道或流动池中的流体流过感兴趣的细胞或分子或相对于可检测的试剂或细胞而流动来引入流体流动。流体流动可以是相对于可检测的试剂或感兴趣的细胞或分子的任何流体运动，并且可以例如通过流体搅动或摇动来引入。
用于去标记的电压的产生
可以产生电压、电流或电场以帮助将分子或细胞去标记(如图2的步骤202中所述)。可以使用麦克斯韦(Maxwell)方程描述电压，电流或电场的产生，并且样品(例如，细胞、分子或可检测试剂)经历的电压、电场强度、电流方向性或其他参数可以使用这些关系来规定以用于在极快去标记程序中所使用的极快去标记协议和/或系统的设计。可以在电极(例如，至少2、3、4、5、6、7或8个电极)之间特定地施加电压，使得样品暴露于所期望的电压或时间相关的电压模式。还可以将电压施加到一个电极(例如，以产生反应化学或反应氧物质)，使得样品暴露于所期望的电压或时间相关的电压模式，以实现最有效的去标记条件。施加到感兴趣的细胞或分子的电压或电场可以是直流(DC)、交流(AC)或AC和DC的组合。也就是说，电压或电场的极性或方向性可在施加期间改变。施加的电压或电场的幅度和/或极性和/或方向性可包括正弦模式、锯齿模式、斜坡模式、阶梯函数模式、方波模式，这些模式的实施例包括电压或电场的极性或方向性的变化。电压或电场在去标记期间可为恒定的或其可为脉冲的或间歇施加的。
电压或电场可由附接到电源的单个电极或多个电极产生。电压可以由单个电极、两个电极之间或连接到电源的多个电极之间产生。产生电压或电流或电场的电极的数量和布置可以影响电压图案或电场的形状以及细胞、分子或可检测试剂所经历的电压或电流或电场(例如，关于电压或电场强度和/或极性和/或方向性并且符合麦克斯韦方程)。
电极可以包括导体或半导体，并且可以由金属、非金属、合金或其组合来组成。在一些情况下，电极可以被整合到基材(细胞位于该基材中)中，而在其他的情况下，电极可以被整合到显微镜或流体装置中。替代地，电极可以是独立的。在一些实施例中，电极可以是铂电极、金电极、铑电极、铜电极、锌电极、铅电极、银电极、钛电极、黄铜电极、钯电极、石墨和碳电极、或混合金属氧化物电极。
当电极集成到装置或基材(例如，芯片或单元阵列)中时，可以设计电极的定位，使得细胞、分子或可检测的试剂经历适当的电压、电流或电场几何形状、方向性和强度。此外，将电极集成到基材或装置中减少了实验之间的可变性的量，并减少了在实验之前校准电压或电场产生系统所需的时间和计算。将电极集成到基材或装置中可以减少在电极处产生的反应化学物质(诸如反应氧物质)到达细胞或目标分子或可检测试剂以进行去标记的时间量。
即使当电极集成到基材或装置中时，用于校正电极定位的机构也可以结合到基材或装置中。例如，电极可以附接到可移动的臂或平台，所述可移动的臂或平台可以包括齿轮(例如，用于移动样品平台或托盘的齿轮)并且可以将电极连接到基材或装置或与可检测试剂接触的溶液。这种可移动的臂或平台可手动或通过微调机构(例如，齿条和小齿轮齿轮机构)来进行调节。在一些实施例中，电极可以与其所连接的基材或装置分离。电压源或电场源(例如电极)可以距样品至少1mm、距样品至少5mm、距样品至少1cm、距样品至少2cm、距样品至少3cm、距样品至少4cm或距样品至少5cm。在距样品至少1cm的距离处，为至少0.5V、至少1V、至少2V、至少3V、至少4V、至少5V、至少6V、至少7V、至少8V、至少9V、至少10V、至少15V、至少20V、至少25V、至少50V或至少100V的电压可被施加到细胞或与细胞接触的溶液以用于去标记。在距样品至少1mm的距离处，为至少0.5V、至少1V、至少2V、至少3V、至少4V、至少5V、至少6V、至少7V、至少8V、至少9V、至少10V、至少15V、至少20V、至少25V、至少50V或至少100V的电压可被施加到细胞或与细胞接触的溶液以用于去标记。通过其施加电压的电极可浸入与细胞/可检测试剂接触的溶液中，并且电极位于距最远的细胞或可检测试剂至少1mm、距最远的细胞或可检测试剂至少5mm、距最远的细胞或可检测试剂至少1cm、距最远的细胞或可检测试剂至少2cm、距最远的细胞或可检测试剂至少3cm、距最远的细胞或可检测试剂至少4cm、距最远的细胞或可检测试剂至少5cm、距最远的细胞或可检测试剂至少10cm、距最远的细胞或可检测试剂至少20cm、或者距最远的细胞或可检测试剂至少30cm。在距最远的细胞或可检测试剂至少1cm的距离处，为至少0.5V、至少1V、至少2V、至少3V、至少4V、至少5V、至少6V、至少7V、至少8V、至少9V、至少10V、至少15V、至少20V、至少25V、至少50V或至少100V的电压可被施加到可检测试剂或与可检测试剂接触的溶液以用于去标记。在距最远的细胞或可检测试剂至少1mm的距离处，为至少0.5V、至少1V、至少2V、至少3V、至少4V、至少5V、至少6V、至少7V、至少8V、至少9V、至少10V、至少15V、至少20V、至少25V、至少50V或至少100V的电压可被施加到可检测试剂或与可检测试剂接触的溶液以用于去标记。
当电极是独立的时，可以为电极相对于样品(例如，细胞、分子或可检测试剂)的定位提供更大的灵活性。在基材、流体系统或检测系统的几何形状或尺寸不允许电极在整个实验中保持就位的实施例中，独立的电极可以是有用的，因为独立的电极在不正被使用时或在使用的模态变化时可以容易地被移除或重新定位。
当用于产生电压或电场的装置包括单个电极时，电极可以用作负电荷源并且可以采用单独的接地，诸如位于局部环境中的导体(例如，成像装置或支撑结构的框架、位于电极附近的布线、或电极局部的流体，诸如流体系统中使用的缓冲剂)。电极也可用作正电荷源。通过在电极处发生电化学反应，电极还可以用作反应化学物质(诸如反应氧物质)的来源。在一些实施例中，基材、流体、诸如计算机框架或仪器壳体之类的金属物体可用作电极或接地。
电场也可以由磁体或磁性元件引发。用于产生电场的磁体可以是永磁体或电磁体。
电场本身可以是任何形状或取向并且可以被创建(例如，通过相对于样品的电极的定位或电场的大小)为使得电场通过样品(例如，细胞、分子或可检测的试剂)。在一些实施例中，通过调节电极定位或改变提供给电极或磁体的电流的大小或方向，可在去标记期间调节或反转电场的方向性。
循环去标记和标记
被标记的细胞可以被标记和去标记或去标记并且按顺序或循环标记至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少10次或至少50次。例如，如图15A至图15C中所述，可以进行至少九个标记和去标记循环而细胞上没有明显的表位损伤。循环标记和去标记可以通过依次进行去标记(例如，如上所述)和标记(例如，如上所述)的方法过程来完成，并且对细胞或分子进行去标记和标记的组合过程可以循环地(例如，重复地、以多轮的方式)进行，以便分析更大数量的分子或利用更多可检测试剂组合。在一些实施例中，可以在去标记和标记的步骤之间执行洗涤步骤；然而，洗涤步骤不是必需的，并且在一些实施方案中，可在不需要在去标记和标记步骤之间包括洗涤步骤的情况下实现更高效率。在其他实施例中，可能需要洗涤步骤以在标记之前洗掉细胞周围的外来分子。在又一实施例中，同时引入新的可检测试剂的标记步骤可以用作洗涤步骤。以该方式，可以在少于20分钟、15分钟、少于10分钟、少于9分钟、少于8分钟、少于7分钟、少于6分钟、少于5分钟、少于4分钟、少于3分钟、少于2分钟、少于1.5分钟、少于1分钟、少于0.75分钟或少于1分钟内对感兴趣的细胞或分子进行去标记和标记。
图16示出了用于极快荧光成像的系统。计算机处理器1601可用用户输入通过信令样本托盘1606打开从而启动染色。在用户插入其上具有细胞的基材1602之后，用户通过将命令输入到计算机处理器或通过推动托盘关闭来信令托盘齿轮关闭。在命令流动池1607从基材和单元1602移除那些试剂之前，计算机处理器1601执行程序以命令流动池1607将固定剂和透化剂从试剂储存器1608递送到基材1602上的细胞。或者，用户可以将没有任何细胞的基材插入样品托盘1606中，之后用户通过向计算机处理器输入命令(例如，通过键盘、鼠标、触摸屏或其他用户接口)向托盘齿轮发信号或者通过推动托盘关闭来关闭托盘。计算机处理器1601执行程序以命令流动池1607在来自试剂储存器1608的固定剂和/或透化剂和/或洗涤液输送到细胞之前将细胞从细胞贮存器或容器递送到基材并将细胞结合或固定(例如，粘附)在基材上，所述细胞在命令流动池从基材和单元1602移除那些试剂之前与基材1602相结合或相对于基材1602固定不动。在又一实施例中，用户可以将没有结合的细胞的基材插入样品托盘1606中，之后用户通过向计算机处理器输入命令或通过推动托盘关闭来信令托盘齿轮以关闭托盘。在另一个实施方案中，用户可以将没有相关细胞的基质插入样品托盘1606中，之后用户通过向计算机处理器输入命令或通过推动托盘关闭来发信号通知托盘齿轮以关闭托盘。然后，计算机处理器1601从其板载存储器执行程序，通过启动温度控制设备1604来加热基材和细胞1602。通过热电偶1603提供的反馈，计算机处理器将基材和细胞的温度控制在可接受的公差范围内。然后，计算机处理器1601启动流动池1607以将第一组可检测试剂从试剂储存器子系统1608通过流动池1607的通道输送到基板1602上的细胞。或者，计算机处理器1601可以执行程序在流动池1607完成将第一组可检测试剂递送到基板1602上的细胞之后加热基板和细胞1602。在计算机处理器1601命令流动池1607从细胞和基材移除可检测试剂之前，允许细胞经受标记持续少于10分钟(例如，如在例如图1和图2中所描述的以及图9A至图9G中所示的)。计算机处理器1609命令检测器1607对细胞进行成像。任选地，计算机处理器1609在成像之前命令将细胞和基材冷却到较低温度或室温。然后，计算机处理器1601命令电压发生器1605产生不小于5伏特的电压达不超过6分钟，对细胞进行去标记(如上所述和在图3中所述并如图10A至图10H、图12A至图12C、图18A至图18B和图19A至图19D中所示)。任选地，计算机处理器1601可以命令温度控制装置1604在电压施加之前或期间达到设定温度。计算机处理器1601随后命令流动池1607将第二组可检测试剂递送到细胞，用第二组可检测试剂对细胞进行标记。任选地，计算机处理器1601可以命令检测器1607在电压施加期间或之后对细胞进行成像以验证充分的去标记。如前所述，计算机处理器1601命令检测器1609在极快标记完成之后对细胞进行成像，然后指示电压发生器1605施加电压并且第二次对细胞进行去标记。
可以在任何循环去标记和标记期间的任何时间点(例如，通过光学荧光显微术)检测可检测试剂和/或细胞结构。也就是说，可以在任何一轮标记或去标记之前、之后或期间检测可检测的试剂。在一些实施例中，可以在每个标记步骤之后和每个去标记步骤之前对样品进行检测步骤(例如，用激光刺激可检测试剂并且检测可检测试剂发射的光子)。在一些实施例中，可以在去标记步骤之后并且在随后的标记步骤之前执行单独的检测步骤，以便例如验证来自(一种或多种)可检测试剂的信号已经减少或确定从其可以归一化后续检测事件的基线。为此目的，对样品的子集(例如，一部分感兴趣的细胞或分子)进行检测就足够。
在一些实施例中，可能需要不同的条件(例如，可检测试剂的温度或浓度)以用某些可检测试剂对细胞或分子进行标记，例如，用荧光抗体和荧光核酸对细胞进行标记。在这些情况下，可以在每轮标记、去标记和/或检测执行多轮标记(每轮标记包括适合于正在该轮标记中被使用的可检测试剂的实验条件(例如，温度、与可检测试剂接触的时间、与样品接触时可检测试剂的浓度等))。类似地，各个可检测试剂的最佳去标记可能需要针对可检测试剂的每个各个组合的不同实验条件(例如，除了施加电压之外还使用黑洞淬火剂)；因此，可以对每轮标记和/或检测进行多轮去标记。
在一些实施例中，可用比检测器或检测系统更多种的可检测试剂来标记样品而无需重新配置。因此，标记步骤可以包括重新配置检测器或检测系统。重新配置检测器或检测系统还可以在标记后续步骤之间、在后续去标记步骤之间、或在标记和去标记步骤之间发生。例如，可以改变显微镜上的滤光片立方体，以便可以检测细胞上的每种可检测试剂。作为另一示例，激发源(例如，具有不同输出光(诸如波长或强度)的LED或激光)或相机(例如，对不同波长的光具有不同的灵敏度或具有不同的像素尺寸和像素灵敏度或量子效率)可以改变以便可以检测细胞上的每种可检测试剂。在诸如这些的情况下，作为本文所述方法的一部分，可以对每轮标记和/或去标记进行多轮检测。然后可以通过对细胞进行去标记和重新标记来重复使用相同的检测通道。
因为可检测试剂的检测可以在细胞或分子的标记或去标记之前、期间或之后发生，并且可以循环地进行细胞的标记和/或去标记，从而通过可检测的试剂在实验过程中对于给定的细胞或分子检测可检测试剂可以发生多次。
除了图4至图6中描述的方法，极快循环荧光成像可包括冷却样品(例如，感兴趣的细胞或分子707、807)的步骤，其可包括例如允许样品被动地辐射热量、暴露于流体或与流体对流(例如，与样品和/或基材接触的液体、诸如与样品和/或基材相接触或与样品接触的流体相接触的液氮的空气或气相之类的气体)、或冷冻样品和/或其环境(例如，基材和/或与样品或基材接触的气相)。在一些实施例中，冷却样品可包括限定设定点温度(例如，20℃、25℃、30℃)并将温度控制在设定点温度的0.25℃内、在设定点温度的0.5℃内、在设定点温度的1℃内、在设定点温度的2℃内、在设定点温度的3℃内、在设定点温度的4℃内以及在设定点温度的5℃内。在一些实施例中，温度控制设备可包括冷却样品或试剂的装置(例如，试剂储存器中的流体，该试剂储存器作为冷却样品的手段与样品接触)。
循环极快荧光标记和去标记中的冷却步骤(如图7和图8中的一些实施例中所述)或极快荧光标记(如图2中所述)可紧接在加热样品(例如，感兴趣的细胞、分子或可检测试剂702、803)之前、紧接在样品与可检测试剂(103、104、203、205、403、503、603、703、802)接触之前、紧接在检测到来自可检测试剂的信号之前(例如，在103和106之间、在203和208之间，在403和404之间、在503和504之间、在603和604之间、在703和704之间或在803和804之间)、或紧接在对样品施加电压或电场之前(例如，在301和302之间、在504和505之间、在604和605之间、在704和705之间或在804和805之间)发生。可以包括冷却细胞、分子或可检测试剂的冷却步骤也可以任选地紧接在验证基本上不存在可检测信号(例如，可检测信号显著地减少)之前发生(例如，在302和303之间、在405和406之间、在505和506之间、在605和606之间、在705和706之间或在805和806之间)。
作为独立方法或作为极快循环荧光成像的一部分的对样品进行标记和/或去标记可包括对样品施加机械力。在一些实施例中，对样品施加机械力可包括使流体在样品上流动或搅动细胞和/或与样品接触的基材或流体。这种机械力的施加可以在极快标记、去标记或循环荧光成像中的任何时间点发生，并且可以被执行以改进可检测试剂与样品的接触或改进可检测试剂的洗涤/去除或改进去标记。样品上的流体流动也可用于改进标记期间的质量转移(例如，质量运输)(例如，通过改进可检测试剂向感兴趣的细胞或分子的运输)或去标记(例如，通过改进反应化学物质(诸如反应氧物质)从电极区域到细胞/可检测试剂的运输)。因此，涉及流体流动的步骤可以在极快标记、去标记、成像或循环荧光成像方法中的任何时间点处并入，如本文所述。流体流动步骤可涉及使用流动池。
复用和自动化
分子的循环去标记、标记和检测的过程可以自动化和/或复用，以进一步提高过程的效率。在这种复用方法中，可以快速连续地处理(例如，标记、去标记、洗涤、刺激、检测等)多个基材，所述基材中的每一个基材都含有感兴趣细胞或分子。为了促进复用，可以通过可移动的样品托盘将基材堆叠并移动到用于标记和/或去标记过程的各个步骤(例如，加热、标记、检测、施加电压或电场等)的位置，该可移动的样品托盘能够将基板单独移动到用于每个步骤的位置。该将基材移动到针对每个步骤的位置可以包括操作样品托盘的齿轮，且该齿轮可以由计算机处理器操作作为预建立的程序的一部分，其进而可以被定制以用于要用于实验中的各个协议或可检测试剂。在一些实施例中，诸如标记和检测或检测和去标记之类的多个步骤可以在相同位置发生，而无需样品在步骤之间移动。
激活和停用(一个或多个)流动池、(一个或多个)电压或电场发生器、(一个或多个)温度控制设备、移动(一个或多个)显微镜载物台和(一个或多个)滤光片立方体以及(一个或多个)检测器的过程可以自动化，使得细胞(或感兴趣的分子)被标记、去标记并且检测可检测的试剂(或多种可检测的试剂)而无需用户的额外干预。由于这些过程可以根据上述方法循环地进行，因此多组可检测试剂可以用于对细胞进行标记并且可以通过采用本文所述的方法和系统在令人惊讶的短时间内被检测。因此，在一些实施例中，系统可以包括开放或封闭系统，其中用户启动程序(例如，执行标记、去标记或标记和去标记样本的方法的预编程或用户定义的程序)并且程序的所有其他步骤由系统自动执行。在一些实施例中，仅在开始时(例如，插入基材和/或细胞和/或可检测试剂、启动程序或计算机处理器)并且在结束时(例如，从计算机处理器获取结果以及从系统移除反应剂/废弃物)需要用户干预。
由本文所述方法的复用和自动化赋予的细胞的标记、去标记和成像效率的改进可以将细胞染色和去染色和检测方案的吞吐量提高至平均每分钟至少10个孔、每分钟至少20个孔、每分钟至少30个孔、每小时至少40个孔、每小时至少50个孔、每小时至少100个孔、每秒至少10个细胞、每秒至少100个细胞、每秒至少1000个单元、每秒至少2500个细胞、每秒至少5000个细胞、每个检测通道每秒至少10个细胞、每个检测通道每秒至少100个细胞、每个检测通道每秒至少1000个细胞、每个检测通道每秒至少2500个细胞或每个检测通道每秒至少5000个细胞。
数据处理
本文中描述的装置和方法可包括数字处理设备或其使用。数字处理设备可以包括执行设备功能的一个或多个硬件中央处理单元(CPU)。数字处理设备可以进一步包括被配置为执行可执行指令的操作系统。在一些实施例中，数字处理设备任选地连接到计算机网络，任选地连接到因特网以使其访问万维网，或者任选地连接到云计算基础设施。在其他实施例中，所述数字处理设备任选地连接至内联网。在其他实施例中，所述数字处理设备任选地连接至数据存储设备。
根据本文的描述，作为非限制性示例，合适的数字处理设备可以包括服务器计算机、台式计算机和便携式计算设备。数字处理设备还可以包括被配置为执行可执行指令的操作系统。所述操作系统可以是例如包括程序和数据的软件，所述软件可管理所述设备的硬件并且提供用于执行应用的服务。
在一些实施例中，所述设备包括存储和/或存储器设备。所述存储和/或存储器设备可以是用于暂时性或永久性基础上存储数据或程序的一个或多个物理装置。在一些实施例中，所述设备是易失性存储器并且需要功率来维持所存储的信息。在其他的实施例中，所述设备是非易失性存储器并且在数字处理设备未被供电时保留所存储的信息。所述设备可为存储设备，作为非限制性示例，包括：CD-ROM、DVD、闪存设备、磁盘驱动器、磁带驱动器、光盘驱动器、以及基于云计算的存储。存储和/或存储设备也可以是诸如本文所公开的那些之类的设备的组合。
数字处理设备可以包括用于向用户发送视觉信息的显示器。在一些实施例中，显示器包括触摸屏。数字处理设备还可以包括用于从用户接收信息的输入设备。例如，输入设备可以是键盘、鼠标、触摸屏等。
非瞬态计算机可读存储介质
在一些实施例中，本文公开的系统、装置和方法可以包括编码有程序的一个或多个非暂时性计算机可读存储介质，该程序包括可由可选联网的数字处理设备的操作系统执行的指令。通过非限制性示例，计算机可读存储介质包括：CD-ROM、DVD、闪存设备、固态存储器、磁盘驱动器、磁带驱动器、光盘驱动器、云计算系统和服务等。在一些情况下，所述程序和指令被永久地、基本上永久地、半永久地、或非瞬态地编码在介质上。
计算机程序
本文公开的系统、装置和方法可包括至少一个计算机程序或其使用。计算机程序包括被写入以执行指定任务的、在数字处理设备的CPU中可执行的指令序列。在一些实施例中，计算机可读指令实现为执行特定任务或实现特定抽象数据类型的程序模块，比如功能、对象、应用编程接口(API)、数据结构等。鉴于在此所提供的公开内容，本领域技术人员将认识到，在某些实施例中任选地用各种语言的各种版本来写计算机程序。
除非另外定义，否则在本文中所使用的所有技术和科学术语具有与所要求保护的主题所属于的领域的普通技术人员所通常理解相同的含义。应当理解上述总体描述和以下详细说明仅是示例性和说明性的，且不限制任何所要求保护的主题。
在本申请中，单数的使用包括复数，除非另有具体说明。还必需注意到，如本说明书以及所附权利要求中所使用的，单数形式的“一个”、“一种”以及“该”包括复数引用，除非上下文另外明确地指出并非如此。除非另有说明，否则在本申请中“或”的使用意味着“和/或”。此外，使用术语包括(including)以及其他形式(诸如包括(includes)、包括(includes)和包括(included))是非限制性的。
如本文所使用的，范围和量可以被表达为“约”是特定的值或范围。“约”也包括精确量。因此“约5μL”意思是“约5μL”且也为“5μL”通常，术语“约”包括期望为在实验误差内的量。
本文中所使用的章节标题仅用于组织目的，并且不被解释为限制描述的主题。
示例
包括以下示例以进一步描述本公开内容的实施例，并且不应该用于限制本发明的范围。
示例1
在基材上对细胞进行固定和标记
该示例描述用可检测试剂对细胞进行固定和极快标记，如图1和图2中所述并且如图4中所示。
将MCF-7细胞接种到Eagle′s最小必需培养基(含有L-谷氨酰胺)的培养皿中，所述Eagle′s最小必需培养基补充有在37℃和5％CO2下的10％的胎牛血清和1％的青霉素(50Uml-1)-链霉素(5μg/ml-1)并允许生长直至80％汇合。然后用PBS洗涤细胞，并在室温下用4％多聚甲醛/PBS固定15分钟，然后用PBS洗涤三次。将细胞加热至37℃(如图1的步骤102)，并将1μg/ml PE-抗-人CD326(EpCAM)抗体应用于细胞(如图1的步骤103)。在洗去游离的PE缀合的抗体后，使用拥有Xe灯源的荧光显微镜(Nikon Eclipse TE2000)在环境条件下检测被标记的细胞(如图1的步骤106)。通过556nm长通和585/42nm带通滤波器过滤荧光信号，并且使用计算机软件套件来记录和分析被PE染色的细胞的图像。
对固定的MCF-7细胞进行极快标记5分钟导致平均亮度比使用常规标记方案(例如，在室温下标记，即，约24℃，使用1∶10可检测剂相对于超快标记方案稀释)标记的细胞的平均亮度高6倍。图9G显示使用流式细胞术使用极快标记(例如，10x，37℃，5分钟)标记的细胞的信号强度，并且表明极快标记方法导致高效标记，这从流式细胞术中的细胞显示的高阳性荧光强度显而易见。同时，极快标记与利用通常的标记方法所获得的非特异性结合相比维低的非特异性结合。
示例2
用施加的电压对细胞进行去标记
该示例描述用施加的电压对细胞进行极快去标记，如图3中所述并且如图10A至图10H、图11A至图11D、图12A至图12C、图13A至图13T、图14A至图14F以及图15A至图15C中所示。
在培养皿中培养至80％汇合并且如示例1中用PE-抗-EpCAM标记的MCF-7细胞被定向，使得基材在一对铂电极之间，该一对铂电极能够产生电压并发射电场并且与其中浸有细胞的1x PBS(pH7.3)溶液接触，并置于基材或流体入口和出口(301)的任一侧。电极中的一个连接到电源并且另一个连接到接地线，从而形成电路。与基材上的细胞接触的溶液暴露于8伏特的电压达60秒(302)。电源被断开；任选地，并且验证可检测试剂的去标记，具有被去标记的细胞的基材在环境条件下被移动到具有Xe灯源的荧光显微镜上的位置以供成像。细胞被如示例1中那样成像和分析，以验证可检测试剂信号已被减少了99％(303)。
在8伏特下的极快去标记将可检测试剂信号强度减少到比来自未被去标记90秒之后的样品的信号的10％更小(见图11C以及图1D)并且减少到比来自未被去标记90秒之后的样品的信号的1％更小(见图11C以及图11D)
示例3
极快标记的非特异性结合
该示例描述极快标记的非特异性结合，如图17A至图17D中所不。
对B细胞和B细胞/T细胞混合物进行极快和正常标记方法，以评估与正常标记相比由极快标记产生的非特异性背景信号。使用正常标记方法标记的细胞在室温下用0.125μg/mL-抗-CD28PE-抗体处理5分钟。使用正常标记方法标记的细胞在37℃下用1.25μg/mL-抗-CD28PE-抗体处理5分钟。然后使用具有灯源的Nikon Eclipse TE2000荧光显微镜在环境条件下对细胞进行成像。用556nm长通和585/42nm带通滤波器过滤从样品中检测到的信号，并记录PE染色细胞的图像并使用计算机软件套件进行分析。
结果显示B细胞的非特异性染色是最小的并且与正常和极快标记方法相当(参见图17A至图17D，比较图17A和图17B与图17C和图17D)，两者都在仅B细胞悬浮液和B细胞/T细胞混合悬浮液中。注意，B细胞不表达与PE抗体结合的蛋白，且因此用作阴性对照并用于确定非特异性染色的水平；T细胞表达结合PE-抗体的蛋白质，且因此用作阳性对照。图17A和图17C表示图像的后处理，其中图像的增益在计算机中增加相同的量以说明细胞的存在。因此，发现在用极快标记方法染色的细胞中非特异性背景染色(例如，非特异性可检测试剂信号)最小。
示例4
用黑洞猝灭剂对细胞进行去标记
该实施例描述了使用可检测的试剂信号猝灭剂对被标记的细胞进行极快去标记，如图19A至图19D所示。
如实施例1中那样对细胞进行标记，除了链霉抗生物素蛋白缀合的聚合物点抗体用作可检测试剂而不是PE-抗-EpCAM用作可检测试剂。使用与链霉抗生物素蛋白缀合的聚合物点，终浓度为5ppm。在与链霉抗生物素蛋白缀合的聚合物点接触之前，用生物素化的抗EpCAM对细胞进行标记。图19A和图19B分别显示用生物素-抗-EpCAM和链霉抗生物素蛋白-聚合物点标记后的细胞的明场图像和荧光图像。BHQ2-NH2黑洞淬灭器(一种以约600nm为中心的宽吸收光谱猝灭剂)在DMSO中制备成约2mM的物料浓度且在施加到细胞上达90秒之前用1x PBS(pH 7.3)稀释至60μM的终浓度。用1x PBS来洗涤细胞，并任选地对该细胞进行成像(如实施例2和图3，步骤303)以验证可检测试剂信号已降低了95％(参见图19C)。随后使用PE-抗-EpCAM对细胞进行去染色(参见图19D)。
示例5
细胞的极快标记和去标记
该实施例描述细胞的极快标记、检测和去标记，如图4中所述和如图20A至图20I中所示。
将MCF-7细胞接种到Eagle′s最小必需培养基(含有L-谷氨酰胺)的培养皿中，所述Eagle′s最小必需培养基补充有在37℃和5％CO2下的10％的胎牛血清和1％的青霉素(50Uml-1)-链霉素(5μg/ml-1)并允许生长直至80％汇合。然后用PBS清洗细胞，并在室温下用4％多聚甲醛/PBS固定15分钟，然后用PBS清洗三次。在使用类似如示例1中的实验标记条件来将细胞与1μg/ml PE-抗-人CD326(EpCAM)抗体(如图403的步骤5)接触达5分钟之前，将细胞加热至37℃(如图4的步骤402)。随后在环境条件下用具有Xe灯源的荧光极快标记对细胞进行成像(404)。用556nm长通和585/42nm带通滤波器过滤从样品中检测到的信号，并记录PE染色细胞的图像并使用计算机软件套件进行分析。可在图20A中看见来自标记的代表性结果(上面板。明场；下面板，荧光检测)。细胞接着经受了强度为8伏特的电压达5分钟(步骤405)。在此之后，再次对细胞进行成像以确认可检测试剂的去标记(步骤406和图20B)
示例6
细胞的极快标记和去标记
该实施例描述细胞的极快标记、检测和去标记，如图4中所述和图20A至图20I中所示。
测定了在用于标记、去标记和重新标记MCF-7细胞的方案中周期性地应用超快标记和去标记方法的优点。如实施例5中所述的超快速标记方法用于用1μg/ml PE-抗细胞角蛋白标记并成像细胞。然后如实施例5中所述对细胞进行极快去标记，然后进行极快标记和去标记步骤四次(图20C至图20I)。
即，在室温下用4％多聚甲醛/PBS将细胞固定15分钟，洗涤，加热，并根据实施例5中描述的方法与PE-抗细胞角蛋白接触，然后在显微镜上成像(图20A)。然后将细胞暴露于8伏电压达5分钟(类似于实施例5的方法)以使细胞去标记，并对细胞成像以确认去标记(图20B)。然后使用1μg/ml PE-抗-MUC1抗体以及与第一轮标记中相同的条件(例如，使样品达到37℃的温度并标记5分钟)再次对细胞进行标记。然后使用与用于PE-抗细胞角蛋白检测的相同设置(图20C)对样品进行成像，然后对样品进行去标记和成像(图20D)。重复去标记、标记和检测的过程以用PE-抗HER2将相同的样品标记(图20E)并去标记(图20F)，以用PE-抗-EpCAM将相同的样品标记(图20G)和去标记(图20H)，并且用PE-抗EGFR标记(图20I)相同的样品。实验结果表明，关于可检测试剂的细胞的标记、检测和去标记过程可在10-15分钟或更短的时间内完成，这表明细胞的顺序标记和去标记可以显著地提高成本效益并且显著地减少了时间和精力。
示例7
对细胞的复用的极快循环荧光成像
该实施例描述对细胞的自动的复用的极快标记、检测和去标记，如以上图4中所述和图20A至图20I中所示。
通过将包含感兴趣细胞的基材堆叠放入连接到分析器托盘中以对细胞进行多重极快循环荧光成像，该分析器托盘连接到：荧光显微镜(包括具有蓝色LED(以480nm发射波长为中心)的落射荧光显微镜和快门以及配备556nm长通和585/42nm带通滤波器的光学检测器)；电压或电场源(该电压或电场源连接到电源)；加热元件，该加热元件连接到热电偶，使得加热元件以及热电偶两者都可以放置成与基材和微流体系统接触，该微流体系统包括蠕动泵、用于固定剂的试剂储存器、缓冲剂和每种可检测试剂；废液储存器；以及连接基板、泵和储存器的多个流体通道和阀。包括每循环要应用的可检测试剂的所期望量的参数、可检测试剂激发源、可检测试剂与样品之间的接触时间、检测方法(例如，待分析的基材的孔、细胞暴露于光激发的时间、检测器的积分时间、滤波器的位置等)以及标记和去标记的轮数通过用户界面输入计算机。在用户启动时，计算机执行程序，该程序使微流体装置从一个流体储存器向基板上的细胞递送20ul的4％多聚甲醛/PBS和0.25％的Triton X-100(一种细胞透化剂)。15分钟后，计算机命令微流体装置将多聚甲醛除去到废液储存器，并将含有150μM BlockAidTM的20μl的洗涤缓冲级递送到基材上达5分钟。然后，计算机处理器自动启动加热元件(和涉及热电偶的负反馈回路)来将基材上的细胞加热到37℃，然后使用微流体系统递送20ul的含有1μg/mlPE-的PBS-抗-EpCAM、1μg/ml的APC-抗细胞角蛋白、1μg/ml的FITC-抗-MUC1、1μg/ml的AlexaFluor594-抗-HER2和1μg/ml的PE-Cy7-抗-EGFR到基材上的细胞。允许可检测试剂与细胞接触5分钟，然后根据来自计算机处理器的命令，通过微流体装置将含有可检测试剂的上清液除去到废物储存器中。使用荧光显微镜对细胞成像。通过使用不同的滤光片立方体对不同颜色的抗体成像，如由计算机处理器执行的程序所指示的。然后通过系统的样品托盘齿轮机构将基板移动到装置的电屏蔽区域，容纳电压源并暴露于8伏特的电压达60秒。当此发生时，将第二基材移动就位并使用与用于标记第一基材的方法相同的方法标记5分钟。当在其他基材上的细胞被成像或去标记时，第一基材用第二组可检测试剂(1μg/ml的PE-抗E-钙粘蛋白、1μg/ml的APC-CD49d、1μg/ml的PE-Cy7-抗-CD 11b、1μg/ml的AlexaFluor594-抗-ckit、1μg/ml的FITC-抗-EpCAM、1μg/ml的BODIPY R6G-抗-CD68、1μg/ml的Cy5.5-APC-抗-CD45)标记并再次成像。当能够同时标记第一样品和第二样品的去标记的系统不可用时，对单个样品连续进行标记和去标记步骤，而不同时处理第二样品。以这种方式继续该过程，直到所有基材上的所有细胞都被标记并且用实验所需的所有可检测试剂被检测。
当被多重标记的细胞的去标记需要猝灭剂来对已用于对细胞进行标记的一种可检测试剂进行去标记时，需要可检测试剂的极快循环标记方案的步骤由用户通过在计算机处理器启动程序之前的用户界面来限定，并且处理器命令流动池在适当的步骤将淬火剂从适当的试剂储存器递送到适当的基材(例如，基板的适当的孔)。
虽然在此已经示出并描述了本发明的优选实施例，但对本领域技术人员将明显的是，此类实施例仅是通过举例来提供的。本领域普通技术人员能想到不背离本发明的各种变化、改变、以及替换。应当理解在本文中描述的本发明各实施例的各种替代方案可在实施本发明时采用。所附权利要求旨在限定本发明的范围，而且覆盖在这些权利要求的范围内的方法和结构及其等价物。
示例8
在连续流体流动下的对细胞的去标记
该实施例描述了在连续流体流动下的对细胞进行去标记，如图14A至图14C所述。
将MCF-7细胞接种到Eagle′s最小必需培养基(含有L-谷氨酰胺)的培养皿中，所述Eagle′s最小必需培养基补充有在37℃和5％CO2下的10％的胎牛血清和1％的青霉素(50Uml-1)-链霉素(5μg/ml-1)并允许生长直至80％汇合。然后用PBS清洗细胞，并在室温下用4％多聚甲醛/PBS固定15分钟，然后用PBS清洗三次。将细胞加热至37℃(如图1的步骤102)，并将1μg/ml PE-抗人CD326(EpCAM)抗体应用于细胞(如图1的步骤103)。在洗去游离的PE缀合的抗体后，使用拥有Xe灯源的荧光显微镜(Nikon Eclipse TE2000)在环境条件下检测被标记的细胞(如图1的步骤106)。通过556nm长通和585/42nm带通滤波器过滤荧光信号，并且使用计算机软件套件来记录和分析被PE染色的细胞的图像(图14B)。
然后使PE-抗EpCAM标记的MCF-7细胞经受强度为5V的电压达180秒，并且将连续的缓冲剂流施加到通道中。图14C示出MCF-7细胞以高的效率被标记。
示例9
在受控且定时的流体流动下的对细胞的去标记
该实施例描述了在受控且定时的流体流动下的对细胞进行去标记，如图14D至图14F所述。
将MCF-7细胞接种到Eagle′s最小必需培养基(含有L-谷氨酰胺)的培养皿中，所述Eagle′s最小必需培养基补充有在37℃和5％CO2下的10％的胎牛血清和1％的青霉素(50Uml-1)-链霉素(5μg/ml-1)并允许生长直至80％汇合。然后用PBS清洗细胞，并在室温下用4％多聚甲醛/PBS固定15分钟，然后用PBS清洗三次。将细胞加热至37℃(如图1的步骤102)，并将1μg/ml PE-抗人CD326(EpCAM)抗体应用于细胞(如图1的步骤103)。在洗去游离的PE缀合的抗体后，使用拥有Xe灯源的荧光显微镜(Nikon Eclipse TE2000)在环境条件下检测被标记的细胞(如图1的步骤106)。通过556nm长通和585/42nm带通滤波器过滤荧光信号，并且使用计算机软件套件来记录和分析被PE染色的细胞的图像(图14E)。
然后使PE-抗EpCAM标记的MCF-7细胞经受强度为4V的电压达180秒，并且将连续的缓冲剂流施加到通道中。图14C示出MCF-7细胞以高的效率被标记。
示例10
在无表位损伤的情况下的对细胞的标记和去标记
该实施例描述在9次循环中对细胞标记和去标记而没有显见表位损伤，如图15A至图15C中所示。该示例证明了实施九次标记和去标记循环(例如，10次成像循环)而不在细胞上引起显见的表位损伤。
将MCF-7细胞接种到Eagle′s最小必需培养基(含有L-谷氨酰胺)的培养皿中，所述Eagle′s最小必需培养基补充有在37℃和5％CO2下的10％的胎牛血清和1％的青霉素(50Uml-1)-链霉素(5μg/ml-1)并允许生长直至80％汇合。然后用PBS清洗细胞，并在室温下用4％多聚甲醛/PBS固定15分钟，然后用PBS清洗三次。将细胞加热至37℃(如图1的步骤102)，并将0.1μg/ml PE-抗人CD326(EpCAM)抗体应用于细胞(如图1的步骤103)。在洗去游离的PE缀合的抗体后，使用拥有Xe灯源的荧光显微镜(Nikon Eclipse TE2000)在环境条件下检测被标记的细胞(如图1的步骤106)。通过556nm长通和585/42nm带通滤波器过滤荧光信号，并且使用计算机软件套件来记录和分析被PE染色的细胞的图像(图15B)。
MCF-7细胞经受9次去标记的循环(每次循环4V持续3分钟，然后用0.1μg/ml的PE-抗-EpCAM抗体对细胞进行标记)。如图15B中所示，明场图像和荧光显微术示出在与图15A中的控制(没有电压施加)相比在亮度上无显著的差异，由此指示在细胞上无显见的表位损伤。
沿着图15A和图15B中的线的亮度分布也证明了两个代表性图像的亮度水平之间无明显差异(图15C)，由此指示了没有明显的表位损伤。
示例11
产生用于循环荧光单细胞成像的单细胞阵列
本示例描述了产生单细胞阵列以与对细胞进行标记和去标记的方法一起使用，如图21中所示。本示例说明了用于循环荧光单细胞成像的单细胞阵列的制备和使用。
首先使用抵抗对细胞的吸附的层(例如PEG(聚乙二醇)涂层)来涂覆玻璃基材。在施加了该涂层后，用图案化技术来产生膜片(patch)阵列，其中单个细胞牢牢地附着到每个膜片(例如，每个膜片一个细胞)。在抵抗细胞吸收的涂层背景中产生的该膜片阵列可以使用各种已建立的方法产生，诸如光刻(如图21中所用)或本领域所述的软光刻。单细胞附着的膜片表面也可以选自多种表面化学物质，诸如APTES(3-氨基丙基三乙氧基硅烷)(如图21中所用)或聚-L-赖氨酸。
取代用抵抗细胞吸收的层(例如，PEG)涂覆表面然后图案化单个细胞附着的“粘性”膜片，首先在玻璃上形成用于细胞附着的“粘性”贴片、接着应用一层抵抗细胞吸收的表面化学物质来覆盖未被“粘性”膜片占据的区域也可以是有效的。可用数种方法来实现该目标，包括将PEG分子附着至被暴露的Si-OH基团(所述被暴露的Si-OH基团未被“粘性”膜片覆盖)。
另外，“粘性”膜片可以是平坦表面，或者可以是凹陷的(例如，如孔)，这取决于应用的需求以及微制造方法两者。凹陷的膜片可使用本领域已知的微制造的工具和图案化表面化学物质来快速地产生，并提供了进一步保护细胞免受流体流所引起的脱离的益处。

Claims (128)

1.一种对细胞进行标记和去标记的方法，所述方法包括：
提供与基材相结合的细胞；
使所述细胞与可检测试剂相接触；
用所述可检测试剂来标记所述细胞的多个位点；
在所述细胞两端施加电压；以及
对所述细胞进行去标记，其中去标记包括移除或猝灭所述细胞上的所述可检测试剂。
2.一种对细胞进行标记和去标记的方法，所述方法包括：
提供与基材相结合的细胞；
使所述细胞与可检测试剂相接触；
用所述可检测试剂来标记所述细胞的多个位点；
将电压施加到与所述细胞相接触的溶液；以及
对所述细胞进行去标记。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中将电压施加到与所述细胞相接触的溶液产生一个或多个反应化学物质。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中对所述细胞进行去标记包括使所述可检测试剂与所述一个或多个反应化学物质相接触。
5.如权利要求1或2所述的方法，进一步包括在对所述多个位点进行标记之后检测所述可检测试剂。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述检测包括光学检测所述可检测试剂。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述标记和去标记在少于20分钟、少于15分钟、少于10分钟、少于9分钟、少于8分钟、少于7分钟、少于6分钟、少于5分钟、少于4分钟或少于3分钟内被执行。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法被重复至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少10次或至少50次。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述方法在30分钟内被执行至少2次、在45分钟内被执行至少3次、在60分钟内被执行至少4次、在75分钟内被执行至少5次或者在90分钟内被执行至少6次。
10.如权利要求1至8中任一项所述的方法，进一步包括用多个可检测试剂来对所述细胞进行标记。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，进一步包括对用多个可检测试剂标记的所述细胞进行成像。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中所述多个可检测试剂单独地或组合地接触所述细胞。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，进一步包括将所述细胞的温度控制在26℃至60℃、30℃至45℃、35℃至45℃、35℃至40℃、36.5℃至37.5℃。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中所述温度控制在温度设定点的0.5摄氏度内、在温度设定点的1摄氏度内、在温度设定点的2摄氏度内或在温度设定点的3摄氏度内。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述可检测试剂与抗体共价连接，其中所述抗体在所述标记期间具有的浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至10μg/ml或0.1μg/ml至5μg/ml之间。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述可检测试剂与CD4抗体共价连接，其中所述CD4抗体在所述标记期间具有的浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至10μg/ml或0.1μg/ml至5μg/ml之间。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述可检测试剂与CD3抗体共价连接，其中所述CD3抗体在所述标记期间具有的浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至10μg/ml或0.1μg/ml至5μg/ml之间。
18.如权利要求15所述的方法，其中所述可检测试剂与CD28抗体共价连接，其中所述CD28抗体在所述标记期间具有的浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至10μg/ml或0.1μg/ml至5μg/ml之间。
19.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述可检测试剂与核酸共价连接，其中所述核酸在所述标记期间具有的浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至50μg/ml或0.1μg/ml至5μg/ml之间。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述可检测试剂与核糖核酸共价连接，其中所述核糖核酸在所述标记期间具有的浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至50μg/ml或0.1μg/ml至5μg/ml之间。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述可检测试剂与脱氧核糖核酸共价连接，其中所述脱氧核糖核酸在所述标记期间具有的浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至50μg/ml或0.1μg/ml至5μg/ml之间。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，进一步包括使所述细胞与所述可检测试剂接触长达以下时间：10秒至15分钟、30秒至10分钟、1分钟至8 分钟或2分钟至6分钟、不超过5分钟、不超过7.5分钟或不超过10分钟。
23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述细胞的所述多个位点中的一部分被标记，所述一部分为至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或至少95％。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述细胞的所述位点中的所述一部分用所述可检测试剂在以下时间内标记：不超过15分钟、不超过10分钟、不超过7.5分钟、不超过5分钟、不超过4分钟、不超过3分钟、不超过2分钟或不超过1分钟。
25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中在所述细胞上的所述多个可检测试剂的饱和度大于相比于在除了在20℃下执行第二细胞的标记达1小时之外的相同条件下标记的所述第二细胞的饱和度的25％、50％、75％或90％。
26.如权利要求1至25中任一项所述的方法，其中施加到与所述细胞相接触的所述溶液的所述电压可为1V至100V、1V至50V、1V至25V、或5V至15V、或至少8V。
27.如权利要求24所述的方法，其中所述电压被施加到所述细胞长达1秒至20分钟、10秒至10分钟、20秒至5分钟、30秒至3分钟或50秒至150秒。
28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述电压为直流电(DC)、交流电(AC)或DC和AC的组合。
29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中流体的连续流、间歇流、定时流、或受控流、或它们的组合被施加到被标记的细胞。
30.如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述多个位点中的至少90％在少于15分钟、少于10分钟、少于6分钟、少于5分钟、少于4分钟、少于3分钟、少于2分钟、少于1分钟或少于30秒的时间内被去标记。
31.如权利要求1至30中任一项所述的方法，其中在所述细胞上的所述多种可检测试剂中的至少95％在少于10分钟、少于5分钟、少于4分钟、少于3分钟、少于2分钟或少于1分钟的时间内被去标记。
32.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中在所述细胞上的所述多种可检测试剂中的至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％被去标记。
33.如权利要求1至32中任一项所述的方法，其中从所述细胞检测到的残留荧光少于5％、少于2％、少于1％、少于0.5％或少于0.1％。
34.如权利要求1至33中任一项所述的方法，进一步包括使所述被标记的细胞与猝灭剂相接触。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述猝灭剂是黑洞猝灭剂。
36.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述多个可检测试剂包括荧光可检测试剂。
37.如权利要求1至36中任一项所述的方法，其中所述多个可检测试剂共价连接到亲和标签。
38.如权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述亲和标签是适体。
39.如权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述亲和标签是抗体。
40.如权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述亲和标签是核酸。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述亲和标签是核糖核酸。
42.如权利要求40所述的方法，其中所述亲和标签是脱氧核糖核酸。
43.如权利要求1至42中任一项所述的方法，其中所述基材包括芯片。
44.如权利要求1至43中任一项所述的方法，其中所述基材包括单细胞阵列。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述单细胞阵列是规则阵列，其包括以周期格式布置的多个细胞。
46.如权利要求1至45中任一项所述的方法，其中所述单细胞阵列是随机阵列，其包括覆盖超过所述基材的30％、超过所述基材的40％、超过所述基材的50％、超过所述基材的60％、超过所述基材的70％、超过所述基材的80％、超过所述基材的90％的多个细胞的单层。
47.如权利要求1至43中任一项所述的方法，其中所述多个细胞包括组织。
48.如权利要求1至47中任一项所述的方法，进一步包括使用流动池将流体递送到所述基材。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述流动池是微流体设备。
50.如权利要求1至49中任一项所述的方法，其中所述基材是平面基材。
51.一种对细胞进行标记的方法，所述方法包括：
提供与基材相结合的细胞；
将所述细胞加热到受控的温度；
使用流动池来将可检测试剂递送到所述细胞；以及
使所述细胞与所述可检测试剂相接触。
52.如权利要求51所述的方法，进一步包括在对所述多个位点进行标记之后检测所述可检测试剂。
53.如权利要求51或52所述的方法，其中所述检测包括光学检测所述可检测试剂。
54.如权利要求51至53中任一项所述的方法，进一步包括用多个可检测试剂来对所述细胞进行标记。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述多个可检测试剂单独地或组合地接触所述细胞。
56.如权利要求51至55中任一项所述的方法，所述受控的温度是26℃至60℃、30℃至45℃、35℃至45℃、35℃至40℃、36.5℃至37.5℃。
57.如权利要求52或56所述的方法，其中所述受控的温度在温度设定点的0.5摄氏度、在温度设定点的1摄氏度、在温度设定点的2摄氏度或在温度设定点的3摄氏度内。
58.如权利要求51至57中任一项所述的方法，其中所述可检测试剂与抗体共价连接，其中所述抗体在所述标记期间浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至10μg/ml或0.1μg/ml至5μg/ml之间。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述可检测试剂与CD4抗体共价连接，其中所述CD4抗体在所述标记期间具有的浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至10μg/ml或0.1μg/ml至5μg/ml之间。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述可检测试剂与CD3抗体共价连接，其中所述CD3抗体在所述标记期间具有的浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至10μg/ml或0.1μg/ml至5μg/ml之间。
61.如权利要求59所述的方法，其中所述可检测试剂与CD28抗体共价连接，其中所述CD28抗体在所述标记期间具有的浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至10μg/ml或0.1μg/ml至5μg/ml之间。
62.如权利要求52至58中任一项所述的方法，其中所述可检测试剂与核酸共价连接，其中所述核酸在所述标记期间具有的浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至50μg/ml或0.1μg/ml至5μg/ml之间。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述可检测试剂与核糖核酸共价连接，其中所述核糖核酸在所述标记期间具有的浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至50μg/ml或0.1μg/ml至5μg/ml之间。
64.如权利要求62所述的方法，其中所述可检测试剂与脱氧核糖核酸共价连接，其中所述脱氧核糖核酸在所述标记期间具有的浓度为0.01μg/ml至500μg/ml、0.01μg/ml至100μg/ml、0.05μg/ml至50μg/ml或0.1μg/ml至5μg/ml之间。
65.如权利要求51至64中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述可检测试剂接触长达以下时间：10秒至15分钟、30秒至10分钟、1分钟至8分钟或2分钟至6分钟、不超过5分钟、不超过7.5分钟或不超过10分钟。
66.如权利要求51至65中任一项所述的方法，其中所述细胞的多个位点中的至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％被标记。
67.如权利要求65所述的方法，其中在所述细胞上的所述多个可检测试剂的饱和度大于相比于在除了在20℃下执行第二细胞的标记达1小时之外的相同条件下标记的第二细胞的饱和度的25％、50％、75％或90％。
68.如权利要求51至67中任一项所述的方法，其中所述多个可检测试剂包括荧光可检测试剂。
69.如权利要求51至68中任一项所述的方法，其中所述多个可检测试剂共价连接到亲和标签。
70.如权利要求51至69中任一项所述的方法，其中所述亲和标签是适体。
71.如权利要求51至70中任一项所述的方法，其中所述亲和标签是抗体。
72.如权利要求51至70中任一项所述的方法，其中所述亲和标签是核酸。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述亲和标签是核糖核酸。
74.如权利要求72所述的方法，其中所述亲和标签是脱氧核糖核酸。
75.如权利要求51至74中任一项所述的方法，其中所述基材包括芯片。
76.如权利要求51至75中任一项所述的方法，其中所述基材包括单细胞阵列。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述单细胞阵列是规则阵列，其包括以周期格式布置的多个细胞。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述单细胞阵列是随机阵列，其包括覆盖超过所述基材的30％、超过所述基材的40％、超过所述基材的50％、超过所述基材的60％、超过所述基材的70％、超过所述基材的80％、超过所述基材的90％的多个细胞的单层。
79.如权利要求51至78中任一项所述的方法，其中所述多个细胞包括组织。
80.如权利要求51至79中任一项所述的方法，其中所述流动池是微流体设备。
81.如权利要求51至80中任一项所述的方法，其中所述基材是平面基材。
82.一种对被标记的细胞进行去标记的方法，所述方法包括：
提供与基材相结合的细胞，其中所述细胞用多个可检测试剂标记；
将电压施加到所述被标记的细胞；以及
在少于15分钟内对在所述被标记的细胞上的所述多个可检测试剂中的至少75％进行去标记。
83.一种对被标记的细胞进行去标记的方法，所述方法包括：
提供与基材相结合的细胞，其中所述细胞用多个可检测试剂标记；
将电压施加到与所述细胞相接触的溶液；以及
在少于15分钟内对在所述被标记的细胞上的所述多个可检测试剂中的至少75％进行去标记。
84.如权利要求82或83所述的方法，其中将电压施加到与所述细胞相接触的溶液产生一个或多个反应化学物质。
85.如权利要求82或83所述的方法，其中将所述细胞去标记包括使所述可检测试剂与所述一个或多个反应化学物质相接触。
86.如权利要求82或85所述的方法，进一步包括在对所述多个位点进行去标记之后检测所述可检测试剂。
87.如权利要求82至86中任一项所述的方法，其中所述检测包括光学检测所述可检测试剂。
88.如权利要求82至87中任一项所述的方法，其中所述被施加的电压为1V至100V、1V至50V、1V至25V、5V至15V、至少7V或至少8V。
89.如权利要求82至88中任一项所述的方法，其中所述电压被施加到所述被标记的细胞长达1秒至20分钟、10秒至10分钟、20秒至5分钟、30秒至3分钟或50秒至150秒。
90.如权利要求82至89中任一项所述的方法，其中所述电压为直流电(DC)、交流电(AC)或DC和AC的组合。
91.如权利要求82至90中任一项所述的方法，其中所述细胞的多个位点中的至少95％在少于15分钟、少于10分钟、少于6分钟、少于5分钟、少于4分钟、少于3分钟、少于2分钟、少于1分钟或少于30秒的时间内被去标记。
92.如权利要求82至91中任一项所述的方法，其中在所述细胞上的所述多种可检测试剂中的至少95％在少于10分钟、少于5分钟、少于4分钟、少于3分钟、少于2分钟或少于1分钟的时间内被去标记。
93.如权利要求82至92中任一项所述的方法，其中在所述细胞上的所述多种可检测试剂中的至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％在少于10分钟内被去标记。
94.如权利要求82至93中任一项所述的方法，其中从所述细胞检测到的残留荧光少于5％、少于2％、少于1％、少于0.5％或少于0.1％。
95.如权利要求82至94中任一项所述的方法，进一步包括使所述被标记的细胞与猝灭剂相接触。
96.如权利要求95所述的方法，其中所述猝灭剂是黑洞猝灭剂。
97.如权利要求82至96中任一项所述的方法，其中所述多个可检测试剂包括荧光可检测试剂。
98.如权利要求82至97中任一项所述的方法，其中所述多个可检测试剂共价连接到亲和标签。
99.如权利要求82至98中任一项所述的方法，其中所述亲和标签是适体。
100.如权利要求82至96中任一项所述的方法，其中所述亲和标签是抗体。
101.如权利要求82至96中任一项所述的方法，其中所述亲和标签是核酸。
102.如权利要求101所述的方法，其中所述亲和标签是核糖核酸。
103.如权利要求101所述的方法，其中所述亲和标签是脱氧核糖核酸。
104.如权利要求82至103中任一项所述的方法，其中所述基材包括芯片。
105.如权利要求82至104中任一项所述的方法，其中所述基材包括单细胞阵列。
106.如权利要求105所述的方法，其中所述单细胞阵列是规则阵列，其包括以周期格式布置的多个细胞。
107.如权利要求105所述的方法，其中所述单细胞阵列是随机阵列，其包括覆盖超过基材的30％、超过基材的40％、超过基材的50％、超过基材的60％、超过基材的70％、超过基材的80％、超过基材的90％的多个细胞的单层。
108.如权利要求82至107中任一项所述的方法，其中所述多个细胞包括组织。
109.如权利要求82至108中任一项所述的方法，进一步包括使用流动池将流体递送到所述基材。
110.如权利要求109所述的方法，其中所述流动池是微流体设备。
111.如权利要求82至110中任一项所述的方法，其中所述基材是平面基材。
112.一种用于对细胞进行标记和去标记的系统，所述系统包括：
基材，所述基材被配置为保持细胞；
第一可检测试剂；
流动池，所述流动池被配置为跨所述细胞传递流体；
电压源；
温度控制设备，所述温度控制设备被配置为将所述细胞加热到温度设定点，其中所述细胞的所述温度被控制为在温度设定点的3摄氏度内；
检测器，所述检测器被配置为检测第一可检测试剂；
计算设备，所述计算设备被配置为操作所述电压源和所述检测器，所述计算设备包括处理器以及非瞬态有形计算机可读存储介质，所述存储介质存储指令集，所述指令集在由所述处理器执行时，使得：
所述检测器检测所述第一可检测试剂信号；并且
所述电压源将电压施加到与所述细胞相接触的所述溶液。
113.如权利要求112所述的系统，其中所述检测器具有的空间分辨率低于5微米、4微米、3微米、2微米、1微米、0.5微米或0.1微米。
114.如权利要求112或113所述的系统，其中所述检测器的成像灵敏度能够检测少于10000种可检测试剂、少于5000种可检测试剂、少于1000种可检测试剂、少于500种可检测试剂、少于100种可检测试剂、少于50种可检测试剂或少于10种可检测试剂。
115.如权利要求112至114中任一项所述的系统，其中每检测信道每秒可成像至少10个细胞、每检测信号每秒可成像至少100个细胞、每检测信号每秒可成像至少1000个细胞、每检测信道每秒可成像至少5000个细胞。
116.如权利要求112至115中任一项所述的系统，其中所述温度控制设备被配置为将所述细胞的所述温度控制到不超过温度设定点的2℃、不超过温度设定点的1℃、不超过温度设定点的0.5℃的范围内。
117.如权利要求112至116中任一项所述的系统，其中所述温度控制设备被配置为将所述细胞加热到至少26℃、至少30℃、至少35℃、至少40℃、至少45℃、至少60℃的温度。
118.如权利要求112至117中任一项所述的系统，进一步包括电压源，所述电压源被配置为将至少1伏特、至少3伏特、至少5伏特、至少7伏特，至少8伏特、至少9伏特、至少10伏特的电压施加至与所述细胞相接触的所述溶液。
119.如权利要求112至118中任一项所述的系统，进一步包括成像设备。
120.如权利要求112至119中任一项所述的系统，其中所述第一可检测试剂为荧光可检测试剂。
121.如权利要求112至120中任一项所述的系统，进一步包括光源，所述光源被配置为激发所述荧光可检测试剂。
122.如权利要求112至121中任一项所述的系统，进一步包括第二可检测试剂。
123.如权利要求112至121中任一项所述的系统，进一步包括检测器，所述检测器被配置为检测所述第二可检测试剂。
124.如权利要求112至123中任一项所述的系统，其中所述基材包括芯片。
125.如权利要求112至124中任一项所述的系统，其中所述计算设备进一步被配置成用于操作所述流动池。
126.如权利要求112至125中任一项所述的系统，进一步包括流体储存器，所述流体储存器连接到所述流动池。
127.如权利要求112至126中任一项所述的系统，其中所述流动池包括微流体设备。
128.如权利要求112至127中任一项所述的系统，其中所述基材封围在所述装置内。
CN201780083120.4A 2016-11-16 2017-11-16 用于循环荧光成像的系统和方法 Pending CN110192140A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662422956P 2016-11-16 2016-11-16
US62/422,956 2016-11-16
PCT/US2017/062104 WO2018094113A1 (en) 2016-11-16 2017-11-16 Systems and methods for cyclic fluorescence imaging

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110192140A true CN110192140A (zh) 2019-08-30

Family

ID=62146773

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780083120.4A Pending CN110192140A (zh) 2016-11-16 2017-11-16 用于循环荧光成像的系统和方法

Country Status (5)

Country Link
US (2) US11668713B2 (zh)
EP (1) EP3541314A4 (zh)
JP (3) JP2020513796A (zh)
CN (1) CN110192140A (zh)
WO (1) WO2018094113A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110819656A (zh) * 2019-11-11 2020-02-21 中国科学院上海高等研究院 一种基于同步光源的x-射线多色遗传标记探针及其制备方法以及应用
CN112630438A (zh) * 2021-03-08 2021-04-09 信纳克(北京)生化标志物检测医学研究有限责任公司 抗体组合物及其筛查髓系疾病及检测免疫检查点的应用
CN114213540A (zh) * 2022-02-22 2022-03-22 北京大学人民医院 一组用于髓系肿瘤免疫分型的抗体组合物及其应用

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020242486A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Rotating levitated particle imaging
WO2021061522A1 (en) * 2019-09-26 2021-04-01 University Of Washington Device, system, and method for trapping tissue samples
WO2024089488A1 (en) 2022-10-24 2024-05-02 Ricoh Company, Ltd. Management apparatus, management system, management method, and recording medium

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080118916A1 (en) * 2006-11-16 2008-05-22 General Electric Company Sequential analysis of biological samples
CN101971029A (zh) * 2007-11-26 2011-02-09 英国政府创新、大学与技能部 电化学检测金属标记的分析物
CN102539506A (zh) * 2010-11-30 2012-07-04 希森美康株式会社 待测物的电化学检测方法
US20120329665A1 (en) * 2001-04-20 2012-12-27 Yale University Systems and methods for automated analysis of cells and tissues
CN103201630A (zh) * 2010-10-29 2013-07-10 恩德莱斯和豪瑟尔测量及调节技术分析仪表两合公司 利用生物分析仪测定液体样品的被分析物含量的方法
CN104114713A (zh) * 2011-12-23 2014-10-22 通用电气公司 染料的光敏化化学漂白
CN104620107A (zh) * 2012-07-17 2015-05-13 通用电气公司 检测生物样品中dna、rna和蛋白质的方法
CN104955958A (zh) * 2012-11-09 2015-09-30 吉尼亚科技公司 使用标记的核酸测序
CN105586403A (zh) * 2006-02-09 2016-05-18 凯乐普生命科学公司 在微流体装置中产生热熔化曲线的方法和设备

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5215883A (en) * 1990-07-09 1993-06-01 The Research Foundation Electrophoretic mobility of fluorophore labeled particles in gels by fluorophore movement after photobleaching
US7910753B2 (en) 2004-09-10 2011-03-22 Anaspec Incorporated Cyanine dyes and their applications as luminescence quenching compounds
JP5584954B2 (ja) 2007-09-27 2014-09-10 富士通株式会社 被検体評価方法
US20120034156A1 (en) * 2010-08-03 2012-02-09 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Artificial cells
WO2011057295A2 (en) 2009-11-09 2011-05-12 University of Washington Center for Commercialization Functionalized chromophoric polymer dots and bioconjugates thereof
BR112015013403A2 (pt) * 2012-12-11 2017-07-11 Clarient Diagnostic Services Inc métodos para sondar alvos múltiplos em uma amostra biológica, para analisar amostra biológica de multiplexação de alto rendimento e para usar um kit, série de pelo menos duas imagens que representam alvos biológicos opticamente marcados, kit para alvejar um sinal para sondar alvos múltiplos em uma amostra biológica, e, processo automatizado para alvejamento químico fotoativado de uma amostra biológica
US9193998B2 (en) * 2013-03-15 2015-11-24 Illumina, Inc. Super resolution imaging
KR20150088083A (ko) * 2014-01-23 2015-07-31 연세대학교 산학협력단 적외선 제어 전기 형광소자

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120329665A1 (en) * 2001-04-20 2012-12-27 Yale University Systems and methods for automated analysis of cells and tissues
CN105586403A (zh) * 2006-02-09 2016-05-18 凯乐普生命科学公司 在微流体装置中产生热熔化曲线的方法和设备
US20080118916A1 (en) * 2006-11-16 2008-05-22 General Electric Company Sequential analysis of biological samples
CN101971029A (zh) * 2007-11-26 2011-02-09 英国政府创新、大学与技能部 电化学检测金属标记的分析物
CN103201630A (zh) * 2010-10-29 2013-07-10 恩德莱斯和豪瑟尔测量及调节技术分析仪表两合公司 利用生物分析仪测定液体样品的被分析物含量的方法
CN102539506A (zh) * 2010-11-30 2012-07-04 希森美康株式会社 待测物的电化学检测方法
CN104114713A (zh) * 2011-12-23 2014-10-22 通用电气公司 染料的光敏化化学漂白
CN104620107A (zh) * 2012-07-17 2015-05-13 通用电气公司 检测生物样品中dna、rna和蛋白质的方法
CN104955958A (zh) * 2012-11-09 2015-09-30 吉尼亚科技公司 使用标记的核酸测序

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110819656A (zh) * 2019-11-11 2020-02-21 中国科学院上海高等研究院 一种基于同步光源的x-射线多色遗传标记探针及其制备方法以及应用
CN112630438A (zh) * 2021-03-08 2021-04-09 信纳克(北京)生化标志物检测医学研究有限责任公司 抗体组合物及其筛查髓系疾病及检测免疫检查点的应用
CN112630438B (zh) * 2021-03-08 2021-06-22 信纳克(北京)生化标志物检测医学研究有限责任公司 抗体组合物及其筛查髓系疾病及检测免疫检查点的应用
CN114213540A (zh) * 2022-02-22 2022-03-22 北京大学人民医院 一组用于髓系肿瘤免疫分型的抗体组合物及其应用
CN114213540B (zh) * 2022-02-22 2022-07-01 北京大学人民医院 一组用于髓系肿瘤免疫分型的抗体组合物及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022169784A (ja) 2022-11-09
EP3541314A1 (en) 2019-09-25
US20230251258A1 (en) 2023-08-10
WO2018094113A1 (en) 2018-05-24
JP2022169783A (ja) 2022-11-09
JP2020513796A (ja) 2020-05-21
US20200057060A1 (en) 2020-02-20
EP3541314A4 (en) 2020-06-17
US11668713B2 (en) 2023-06-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110192140A (zh) 用于循环荧光成像的系统和方法
McKinnon Flow cytometry: an overview
Michalet et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics
US20100248257A1 (en) Compiled Methods for Analysing and Sorting Samples
CN107532333A (zh) 微筛选装置、方法和产品
WO2013003498A2 (en) Acoustic cytometry methods and protocols
EP3277846B1 (en) Optical painting and fluorescence-activated sorting of adherent cells
FR3027396A1 (fr) Procede d'analyse du contenu de gouttes et appareil associe
Dean et al. High-speed multiparameter photophysical analyses of fluorophore libraries
Xu et al. Labeling cytosolic targets in live cells with blinking probes
CN108519484A (zh) 利用自连接标签的双分子荧光互补技术成像和追踪活细胞内的蛋白质相互作用
Sands et al. Measuring and sorting cell populations expressing isospectral fluorescent proteins with different fluorescence lifetimes
US20240301342A1 (en) Cell treatment system, cell treatment method, and learning data creation method
Zheng et al. Improving flow bead assay: Combination of near-infrared optical tweezers stabilizing and upconversion luminescence encoding
WO2007055302A1 (ja) 生体物質と生体物質結合性物質との結合性評価方法
JP5892665B2 (ja) 標識の選択的変換による接着細胞の選別方法
JP7510881B2 (ja) 免疫細胞の分析方法及び細胞分析装置
Graham et al. Proximity-assisted photoactivation (PAPA): Detecting molecular interactions in live-cell single-molecule imaging
JP2013188193A (ja) 細胞間相互作用を検出する方法
JP2018087811A (ja) 細胞表面に存在する分子の結合による細胞間相互作用を計測する方法
Liubchenko et al. Modern fluorescent techniques to investigate the mechanisms of lymphocyte activation
Kushida et al. Biomimetic Chemical Sensing by Fluorescence Signals Using a Virus-like Particle-Based Platform
EP4343326A1 (en) Biological conjugates having an photogenerated acidic or basic releasable detection moiety on top of biological tissues
WO2024091949A1 (en) Methods and systems for encoded effector screening
WO2022043023A1 (en) Releasable reagents for cell separation

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination