JP2018087811A - 細胞表面に存在する分子の結合による細胞間相互作用を計測する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】細胞表面に存在する分子の結合による細胞間相互作用を計測する方法を提供する。【解決手段】第一の細胞の細胞表面に存在する分子と第二の細胞の細胞表面に存在する分子の結合による細胞間相互作用を計測する方法であって、第一の分子と第一の蛍光タンパク質とが融合されて細胞膜上に発現された第一の細胞、および任意の蛍光分子で蛍光標識された第二の細胞を提供する工程であって、前記蛍光分子は前記第一の蛍光タンパク質と蛍光波長が異なる、工程、前記第一の細胞と前記第二の細胞とを接触させる工程、フローサイトメトリーを用いて前記第一の細胞からの蛍光および前記第二の細胞からの蛍光を検出する工程、および前記検出する工程で検出された蛍光強度から、前記第一の細胞と前記第二の細胞とが結合して形成された結合細胞を解析する工程を含む。【選択図】図２Ｂ
Description
本発明は、細胞表面に存在する分子の細胞間相互作用を計測する方法に関し、特に、フローサイトメトリーを利用した細胞膜上のレセプター分子、リガンド分子等の分子による細胞間相互作用を計測する方法に関する。
細胞間の相互作用は、発生過程や組織・器官の維持に関係し、免疫系の細胞ネットワークでも中心的な役割を担っている。例えば、細胞膜上に存在するレセプター分子（タンパク質）がその機能を発揮するには、液性因子（サイトカイン、ホルモン等）との結合に加えて、他の細胞の細胞膜上に発現するリガンド分子（タンパク質）との結合も重要である。このような細胞間における分子結合が重要となる場合としては、神経細胞間や免疫細胞間の接合、神経・免疫細胞と他の標的細胞との接合や、細胞結合による組織形成など多岐にわたる。また、例えば癌の免疫チェックポイント療法においては、細胞間における分子結合の阻害を目的とする。従って、細胞表面に存在する分子による分子結合、またはこれらの分子結合による細胞間の相互作用を定量化して分析する手法は重要である。
細胞間の分子結合を分析するための従来の手法としては、例えば、精製したリガンドタンパク質分子を蛍光物質で標識し、その標識分子のレセプター発現細胞への結合をフローサイトメトリーで計測する手法が挙げられる。この手法は、細胞への液性因子の結合を測定する方法としても知られている。また、別の手法としては、レセプター分子、リガンド分子を各々精製した後に、それらの結合をＳＰＲ（表面共鳴プラズモン）変化により計測する手法が挙げられる。このような分子精製を伴う手法では、当然ながら精製条件の最適化に多くの時間を要することに加えて、精製過程で分子が変性する可能性がある。さらに、そもそも細胞膜上に存在しない状態の精製したリガンド分子とレセプター分子の結合、またはこれらの精製分子と細胞膜上の分子が結合しうる条件を調べても、これらの分子同士が細胞膜上に存在する状態で細胞の結合を誘導する条件を調べたことにはならない。なぜなら、分子精製された浮遊状態のリガンド分子が細胞膜上に発現するレセプター分子に結合する場合の結合速度・解離定数と、細胞膜上に発現したリガンド分子が同じく細胞膜上に発現したレセプター分子と細胞膜間（細胞間）で結合する場合の結合速度・解離定数とが異なる可能性があることなど、生理学的な環境下特有の要因が考慮されていないからである。以上の点から、分子精製を伴う既存のタンパク質分析の手法には、計測の効率性や精度の観点で問題点がある。従って、生理学的な環境下、すなわち細胞膜上に発現した状態におけるタンパク質同士の結合もしくはこれらのタンパク質の結合により誘導される細胞間の結合を直接計測できる簡便な手法が存在すれば、これらの問題点は解決される。
細胞膜上のタンパク質同士の結合による細胞間の結合を計測する最も直接的な方法の一つは、顕微鏡による観察である。一方、顕微鏡観察以外に細胞間の相互作用を分析する手法として、バルク状態で２種類の細胞群をそれぞれ蛍光波長の異なる蛍光物質で標識した後に、２色フローサイトメトリーを利用してドットプロット上で両方の蛍光物質からの蛍光を保持する群を結合細胞として検出する方法が提案されている（非特許文献１）。また、細胞間の結合・凝集と関連する後方散乱光の増大をフローサイトメトリーにより検出する手法も提案されている（非特許文献２）。
Segal and Stephany, The Measurement of Specific Cell:Cell Interactions by Dual-Parameter Flow Cytometry, Cytometry 5:169-181 (1984)
Simon et al., Flow Cytometric Analysis and Modeling of Cell-Cell Adhesive Interactions: The Neurotrophil As a Model, J. Cell. Biol., Vol. 111 (1990) 2747-2756
しかしながら、非特許文献１および２で提案されるように蛍光標識が利用される場合、蛍光の検出により細胞種の特定は可能であるものの、その蛍光強度は細胞間の分子結合に関係する分子（細胞表面に存在するリガンドまたはレセプター分子）の種類や状態や密度を反映するものではない。また、非特許文献２のように単一細胞の凝集を散乱光で計測する場合には、そもそも結合に関わっている細胞の種類を特定できないため、細胞表面に存在して結合に関与する分子の情報は得られない。従って、これらの従来の手法では、細胞間の結合を、細胞表面に存在する分子による特異的分子結合（レセプター・リガンドの結合など）の観点から定性的・定量的に理解することができない。そのため、例えば細胞間の分子結合を標的とする薬剤の開発において定量的な評価を行うなどの目的で用いる計測法としては、さらなる改良の余地があった。
本発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、細胞表面に存在する分子の結合による細胞間相互作用を計測する方法を提供することを目的としている。
上記の目的を達成するために、本発明の一局面では、第一の細胞の細胞表面に存在する分子と第二の細胞の細胞表面に存在する分子の結合による細胞間相互作用を計測する方法であって、
第一の分子と第一の蛍光タンパク質とが融合されて細胞膜上に発現された第一の細胞、および任意の蛍光分子で蛍光標識された第二の細胞を提供する工程であって、前記蛍光分子は前記第一の蛍光タンパク質と蛍光波長が異なる、工程、
前記第一の細胞と前記第二の細胞とを接触させる工程、
フローサイトメトリーを用いて前記第一の細胞からの蛍光および前記第二の細胞からの蛍光を検出する工程、および
前記検出する工程で検出された蛍光強度から、前記第一の細胞と前記第二の細胞とが結合して形成された結合細胞を解析する工程
を含む、方法が提供される。
第一の分子と第一の蛍光タンパク質とが融合されて細胞膜上に発現された第一の細胞、および任意の蛍光分子で蛍光標識された第二の細胞を提供する工程であって、前記蛍光分子は前記第一の蛍光タンパク質と蛍光波長が異なる、工程、
前記第一の細胞と前記第二の細胞とを接触させる工程、
フローサイトメトリーを用いて前記第一の細胞からの蛍光および前記第二の細胞からの蛍光を検出する工程、および
前記検出する工程で検出された蛍光強度から、前記第一の細胞と前記第二の細胞とが結合して形成された結合細胞を解析する工程
を含む、方法が提供される。
ここで、前記第二の細胞を蛍光標識する蛍光分子が、第二の分子と第二の蛍光タンパク質とが融合されて細胞膜上に発現された融合タンパク質分子であってもよい。
また、前記第一の細胞がさらに、第三の分子と第三の蛍光タンパク質とが融合されて細胞膜上に発現されており、
前記第二の細胞がさらに、第四の分子と第四の蛍光タンパク質とが融合されて細胞膜上に発現されており、
前記第一から第四の蛍光タンパク質は互いに蛍光波長が異なっていてもよい。
また、前記第一の細胞がさらに、前記第二の分子と第三の蛍光タンパク質とが融合されて細胞膜上に発現されており、
前記第一から第三の蛍光タンパク質は互いに蛍光波長が異なっていてもよい。
また、前記接触させる工程において、前記第一の分子と前記第二の分子との相互作用を阻害可能な結合阻害剤を添加してもよい。
また、前記第一の細胞がさらに、第三の分子と第三の蛍光タンパク質とが融合されて細胞膜上に発現されており、
前記第二の細胞がさらに、第四の分子と第四の蛍光タンパク質とが融合されて細胞膜上に発現されており、
前記第一から第四の蛍光タンパク質は互いに蛍光波長が異なっていてもよい。
また、前記第一の細胞がさらに、前記第二の分子と第三の蛍光タンパク質とが融合されて細胞膜上に発現されており、
前記第一から第三の蛍光タンパク質は互いに蛍光波長が異なっていてもよい。
また、前記接触させる工程において、前記第一の分子と前記第二の分子との相互作用を阻害可能な結合阻害剤を添加してもよい。
本発明によれば、細胞表面に存在する分子の結合による細胞間相互作用を計測する方法が提供される。
以下、本発明の実施形態について、必要に応じて、添付の図面を参照して例示の実施例により説明する。
従来、細胞間の相互作用の測定は、単に細胞を蛍光標識し、光学的手法を用いて計測するものであった。例えば、非特許文献１では、体内の免疫反応を模倣した実験系、すなわち、抗体分子が結合した脾臓細胞（antibody-coated spleen cell）と、抗体を認識するレセプター分子（Fc-receptor）を発現する免疫細胞マクロファージ（mouse macrophage P388D1）を用いて、それらの細胞の結合をフローサイトメトリーにより検出している。各細胞は、蛍光低分子であるＦＩＴＣ（緑色蛍光）またはＸＲＩＴＣ（赤色蛍光）と混合することにより蛍光標識された後、２群の細胞が混合されて、フローサイトメトリーのドットプロット上で結合細胞が検出される。また、非特許文献２では、好中球（neutrophil）の凝集を、ＬＤＳ−７５１（緑色蛍光分子）などの蛍光標識の計測値の増大、前方散乱光の増大により測定している。
このように、従来の手法は、単一細胞レベルでの光学的な分析が可能であるというフローサイトメトリーの特徴を利用して、蛍光標識した細胞を用いてバルク状態で細胞の結合・凝集を測定することに留まっていた。すなわち、従来の手法では、細胞間の相互作用に関係している細胞表面に存在する分子のレベルで、生理学的環境下での分子結合を定性的・定量的に分析したり、分子の結合が細胞間の結合をどのように制御しているかを分析したりすることは困難であった。
本発明は、上記のような課題を解決したものであり、細胞間相互作用を計測するための手法としてこれまでに提案されていなかった新たなコンセプトを提供するものである。
図１は、本発明に係る細胞表面に存在する分子の結合による細胞間相互作用の計測を説明するための概念図である。本発明では、細胞表面に存在する分子を蛍光標識した細胞を用いて、分子の結合による細胞間相互作用を光学的手法を用いて計測する。すなわち、本発明の例示的な一実施形態では、対象の分子（レセプター・リガンド等）にそれぞれ蛍光波長が異なる蛍光タンパク質を融合させた融合分子を細胞膜上に発現させた細胞を用いて、分子の結合による細胞間の結合を多色フローサイトメトリーによりバルク状態でリアルタイムに検出し、結合分子量と細胞結合量を同時に計測する。
より具体的には、本発明の第一の実施形態では、第一の細胞の細胞表面に存在する分子と第二の細胞の細胞表面に存在する分子との細胞間相互作用を計測する方法であって、
第一の分子と第一の蛍光タンパク質とが融合されて細胞膜上に発現された第一の細胞、および任意の蛍光分子で蛍光標識された第二の細胞を提供する工程であって、前記蛍光分子は前記第一の蛍光タンパク質と蛍光波長が異なる、工程、
前記第一の細胞と前記第二の細胞とを接触させる工程、
フローサイトメトリーを用いて前記第一の細胞からの蛍光および前記第二の細胞からの蛍光を検出する工程、および
前記検出する工程で検出された蛍光強度から、前記第一の細胞と前記第二の細胞とが結合して形成された結合細胞を解析する工程
を含む。
第一の分子と第一の蛍光タンパク質とが融合されて細胞膜上に発現された第一の細胞、および任意の蛍光分子で蛍光標識された第二の細胞を提供する工程であって、前記蛍光分子は前記第一の蛍光タンパク質と蛍光波長が異なる、工程、
前記第一の細胞と前記第二の細胞とを接触させる工程、
フローサイトメトリーを用いて前記第一の細胞からの蛍光および前記第二の細胞からの蛍光を検出する工程、および
前記検出する工程で検出された蛍光強度から、前記第一の細胞と前記第二の細胞とが結合して形成された結合細胞を解析する工程
を含む。
また、本発明の第二の実施形態では、前記第二の細胞を蛍光標識する蛍光分子が、第二の分子と第二の蛍光タンパク質とが融合されて細胞膜上に発現された融合タンパク質分子である。
例えば、図１に示すように、第一の細胞１の細胞表面には、第一の分子１１（例えば、レセプター分子）と第一の蛍光タンパク質１２（例えば、緑色蛍光タンパク質）とが融合されて細胞膜上に発現されている。また、第二の細胞２の細胞表面には、第二の分子２１（例えば、リガンド分子）と第二の蛍光タンパク質２２（例えば、青色蛍光タンパク質）とが融合されて細胞膜上に発現されている。ここで、第一の蛍光タンパク質１２と第二の蛍光タンパク質２２とは、互いに蛍光波長が異なっている。なお、第一の細胞１および第二の細胞２は、それぞれ別々に培養され、フローサイトメトリーで計測するための試料３を調製する際に混合されて接触する。
試料３は、フローサイトメトリーの流路４に導入され、所定の励起波長のレーザー光を照射したときの蛍光が検出される。このとき、第一の細胞１の第一の分子１１と第二の細胞２の第二の分子２１とが結合して形成された結合細胞５からは、第一の蛍光タンパク質１２の蛍光と第二の蛍光タンパク質２２の蛍光との２色が検出される。一方、第一の分子１１と第二の分子２１とが結合していない、単独の第一の細胞１または第二の細胞２からは、それぞれ第一の蛍光タンパク質１２の蛍光または第二の蛍光タンパク質２２の蛍光の１色が検出される。
ここで、検出された蛍光から、細胞表面に存在する結合分子の量を求めることができる。従って、以下で詳述するように適切なコンペンセーション（多色計測下における蛍光値補正）・キャリブレーション（蛍光計測値から分子密度への変換）を行うことにより、細胞膜上の結合分子の密度と、分子結合による細胞の結合の進行との相関関係の有無などを計測することができる。
また、本実施形態では、フローサイトメトリーで継続的に経時計測することで、リアルタイムに細胞間結合を計測できる。なお、フローサイトメトリーでの計測時には、細胞の非特異的な凝集を防ぐ観点から、試料３に穏やかな振盪を与えながら計測を行うことが好ましく考慮される。
また、本実施形態では、大量の細胞結合ペアを高速に計測でき、バルク測定に好適である。一方で、フローサイトメトリーのドットプロット上の一点は一つの細胞結合ペアに相当するので、一細胞ペアレベルでの結合の計測が可能である。
また、細胞結合数の経時計測の結果を用いて、分子結合による細胞間の結合解離定数、結合速度（ｋｏｎ、ｋｏｆｆ）が求められる。これらは、細胞間の結合に関与する分子の本来の生理学的環境下（細胞間）における熱力学的・速度論的係数であると考えられる。
なお、図示していないが、試料３には第一の分子１１と第二の分子２１との相互作用を阻害可能な結合阻害剤を添加することもできる。この場合には、細胞表面に存在する分子の細胞間相互作用に対する結合阻害剤の影響を定量的に計測することができる。
例えば、任意のレセプター・リガンド分子のペア（例えば、以下の実施例４に示すようなＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１）に、それぞれ蛍光波長の異なる蛍光タンパク質（ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＢＦＰなど）を融合させて、それぞれ別々の細胞（Ｈｅｋ２９３細胞など）に遺伝子工学的に導入する。それらを別々に培養して、各蛍光タンパク質を発現させた細胞を得る。その後、両細胞を混合してフローサイトメトリーを用いて細胞間の結合を計測する際に、Ａｎｔｉ ＰＤ−１抗体などの結合阻害剤を加えることにより、細胞間結合に対する結合阻害剤の影響を定量的に計測することができる。
本実施形態において、第一の細胞および第二の細胞としては、計測対象となるレセプターやリガンド分子の発現量が十分に低く、蛍光タンパク質との融合遺伝子を導入しない状態では結合や凝集を生じない細胞である限りにおいて特に制限されず、例えば、Ｈｅｋ２９３細胞などを使用することができる。なお、Ｈｅｋ２９３細胞を用いると、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ（０．０２％）の添加のみで細胞を培養プレートから簡単に剥離して、フローサイトメトリーに導入することできるので、計測の簡便さの観点などから好ましい。
第一の蛍光タンパク質および第二の蛍光タンパク質としては、互いに蛍光波長が異なるものが選択される。例えば、ＴａｇＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）、ＡｃＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＬＳＳｍＫａｔｅ２（赤色蛍光タンパク質）、ｉＲＦＰ（近赤外蛍光タンパク質）などが挙げられるが、これらに限定されない。
第一の分子および第二の分子としては、例えばレセプター・リガンドのように、互いに相互作用することが知られている分子を用いることができる。例えば、レセプター・リガンドのペアとして、ＥｐｈＢ１とｅｐｈｒｉｎＢ２、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１などが挙げられるが、これらに限定されない。
また、第一の分子および第二の分子としては、免疫系、癌の免疫細胞療法、ウイルス感染など、細胞の（細胞膜間の）相互作用が重要となる系において役割を果たす分子を用いることができる。例えば、上述したＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１や、ＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などは、癌免疫療法に関わる中心的な分子として知られている。
ここで、本発明の別の実施形態では、図１に示した第一の細胞１がさらに、第三の分子と第三の蛍光タンパク質とが融合されて細胞膜上に発現されており、第二の細胞２がさらに、第四の分子と第四の蛍光タンパク質とが融合されて細胞膜上に発現されている。ここで、前記第一から第四の蛍光タンパク質は互いに蛍光波長が異なっている。
第三の分子および第四の分子としては、上述した第一の分子および第二の分子と同様に、レセプター・リガンドのように、互いに相互作用することが知られている分子を用いることができる。
この実施形態では、例えば、第一の分子と第二の分子とを特定のレセプター・リガンドの組み合わせとし、第三の分子と第四の分子とを別のレセプター・リガンドの組み合わせとすることによって、２種類の異なるレセプター・リガンドの組み合わせが共存する条件下における、細胞間の結合の促進や形態変化を計測することができる。
また、本発明の別の実施形態では、図１に示した第一の細胞１がさらに、第二の分子２１と第三の蛍光タンパク質とが融合されて細胞膜上に発現されている。ここで、第一から第三の蛍光タンパク質は互いに蛍光波長が異なっている。
この実施形態では、例えば、第一の分子を特定のレセプターとし、第二の分子を当該レセプターと相互作用可能なリガンドとすることによって、同一細胞内におけるレセプター・リガンド結合が、細胞間におけるレセプター・リガンド結合を競争的に阻害する程度を定量的に計測することができる。
また、本発明では、結合相手となるリガンド分子やレセプター分子が判明していない細胞膜上の分子（そのうちレセプターとして機能すると考えられる分子の場合はＯｒｐｈａｎレセプターと呼ばれる、例えばＡＤＧＲＡ１分子など）を第一の分子とし、第二の分子として、リガンド分子またはレセプター分子の候補を含む遺伝子ライブラリーまたは細胞のライブラリーを用いることもできる。
例えば、Ｏｒｐｈａｎレセプターに対する未知のリガンドを探索することを目的として、大量の細胞（Ｈｅｋ２９３細胞など）に任意の蛍光タンパク質（ＴａｇＢＦＰなど）を融合した目的のＯｒｐｈａｎレセプターを発現させる。一方、リガンドの発現が予想される組織を採取した後に単一細胞レベルまで剥離・分散させた後、これらの細胞をＣａｌｃｅｉｎ等の非特異的に細胞を染色できる蛍光分子で蛍光標識する。その後、両者を混合して、フローサイトメトリーによる計測を行い、Ｏｒｐｈａｎレセプターに標識した蛍光分子と組織由来細胞を標識した蛍光分子の両者を含むシグナルをドットプロット上検出することで細胞間の結合を計測する。検出された結合細胞はセルソーター機能により分離し採取する。このようにして得られた結合細胞を手がかりに、当該Ｏｒｐｈａｎレセプターに対するリガンド分子を調べることができる。なお、リガンド分子の調査手法は、得られる細胞数などの諸条件により適宜選択される。
このように、本発明によれば、細胞表面に存在する分子による分子結合と、細胞間の分子結合を引き起こすまたは阻害する細胞表面に存在する分子の密度とを同時に、リアルタイムに、バルク状態で、かつ単一細胞結合ペアのレベルで計測することができる。
また、本発明によれば、従来の手法のようにタンパク質分子などのレセプター分子やリガンド分子の精製をすることなく、そして細胞表面（細胞膜上）という生理学的な（本来の）環境下におけるレセプター・リガンド分子の結合を計測することができる。加えて、複数の分子結合ペアによる協奏的な細胞結合、細胞内分子結合による細胞間相互作用の競争的阻害など、これまで計測が困難であった複雑な細胞間相互作用の計測が可能になる。
また、本発明によれば、従来の手法のようにタンパク質分子などのレセプター分子やリガンド分子の精製をすることなく、そして細胞表面（細胞膜上）という生理学的な（本来の）環境下におけるレセプター・リガンド分子の結合を計測することができる。加えて、複数の分子結合ペアによる協奏的な細胞結合、細胞内分子結合による細胞間相互作用の競争的阻害など、これまで計測が困難であった複雑な細胞間相互作用の計測が可能になる。
すなわち、本発明の技術は、細胞表面（細胞膜上）という生理学的環境下における分子結合、およびその分子結合による細胞の結合（細胞間相互作用）を直接的かつ簡便に計測できるという特徴がある。それに加えて、生体内と同じく、複数のレセプター・リガンド分子が細胞膜上に共存するような場合に、どの分子結合ペアが優先され、または競合するのか、システムとしての細胞の動作・挙動を解析することが可能になる。
また、本発明によれば、細胞結合に関係するレセプターやリガンド分子を十分量発現する細胞を一部用いて計測することも可能である。この場合、例えば免疫抑制遺伝子ＰＤ−Ｌ１を発現する癌細胞に対して、蛍光タンパク質を融合したＰＤ−１タンパク質を異なる発現量で発現するＨｅｋ２９３細胞を構築して、癌細胞に作用するために必要なＰＤ−１分子の発現量を知ることや、その作用を阻害するために必要な阻害薬の量の計測などを行うことができる。そしてこの場合、癌細胞におけるＰＤ−Ｌ１の発現量は、別途蛍光標識したＰＤ−Ｌ１抗体を利用してフローサイトメトリーにより計測することができる。
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
＜実験プロトコルの記載＞
［細胞材料］
Ｈｅｋ２９３細胞はＤＭＥＭ培地中で培養した。Ｄａｕｄｉ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞はＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。なお、これらの培地は、１０％ＦＢＳを含む。
［細胞材料］
Ｈｅｋ２９３細胞はＤＭＥＭ培地中で培養した。Ｄａｕｄｉ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞はＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。なお、これらの培地は、１０％ＦＢＳを含む。
［遺伝子材料］
ＥｐｈＢ１、ｅｐｈｒｉｎＢ２、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ１９は、ＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ） バイオテクノロジーセンター 生物資源課）から入手したｃＤＮＡを必要に応じて改変したものを用いた。キメラ抗原レセプター（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ−ａｎｔｉ ＣＤ１９））は、遺伝子合成されたもの（ＩＤＴ社）を用いた。
ＥｐｈＢ１、ｅｐｈｒｉｎＢ２、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ１９は、ＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ） バイオテクノロジーセンター 生物資源課）から入手したｃＤＮＡを必要に応じて改変したものを用いた。キメラ抗原レセプター（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ−ａｎｔｉ ＣＤ１９））は、遺伝子合成されたもの（ＩＤＴ社）を用いた。
ＣＡＲの遺伝子配列は、Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）， ＮＥＪＭに記載されている配列と同じである。ＣＤ１９細胞外ドメインを認識する一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｃＦｖ、クローン名ＦＭＣ６３）の遺伝子を細胞外（Ｎ末端側）に発現し、その下流（Ｃ末端側）にヒトＣＤ８αの細胞貫通ドメイン、そして４−１−ＢＢ・ＣＤ３ζの細胞内ドメインを連結させた融合遺伝子である。
それぞれの遺伝子の全長（または必要な一部）を、ｐＡｃＧＦＰ−Ｎ１（ｔａｋａｒａ（旧Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ））、ｐＴａｇＢＦＰ−Ｎ１（ｐＡｃＧＦＰ−Ｎ１のＡｃＧＦＰをＴａｇＢＦＰ（ｅｖｒｏｇｅｎ社）に置き換えたベクター）、ｐＬＳＳ−ｍＫａｔｅ２−Ｎ１（Ｖｌａｄｉｓｌａｖ Ｖｅｒｋｈｕｓｈａ博士から入手）、ｐｉＲＦＰ−Ｎ１ （Ｖｌａｄｉｓｌａｖ Ｖｅｒｋｈｕｓｈａ博士から入手）、ｐＴａｇＲＦＰ−Ｎ１（ｐＡｃＧＦＰ−Ｎ１のＡｃＧＦＰをＴａｇＲＦＰ（ｅｖｒｏｇｅｎ社）に置き換えたベクター）、ｐＴａｇＲＦＰ６５７−Ｎ１（Ｖｌａｄｉｓｌａｖ Ｖｅｒｋｈｕｓｈａ博士から入手）などの、蛍光タンパク質を有するプラスミドＤＮＡベクターへ遺伝子工学的に導入した。目的とするレセプターやリガンドの分子と蛍光タンパク質が融合されて細胞膜上に発現するように遺伝子をデザインした。なお、蛍光タンパク質は細胞内に発現されるように予めデザインされている。
［細胞培養およびトランスフェクション］
任意の細胞（主にＨｅｋ２９３細胞）を培養用プレート等に播種する。
上記の細胞培養液中に、トランスフェクション用リポソーム剤（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ社）など）と１種または２種以上のプラスミドＤＮＡとの混合溶液を添加する。ＤＮＡ混合量（２種以上含む場合は混合比）を変えることで、発現するタンパク質の量が一定程度コントロールできる。
一定期間（遺伝子導入方法に依存する。例えば、１〜２日。）が経過すると、導入した遺伝子から細胞内にタンパク質が発現される。
任意の細胞（主にＨｅｋ２９３細胞）を培養用プレート等に播種する。
上記の細胞培養液中に、トランスフェクション用リポソーム剤（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ社）など）と１種または２種以上のプラスミドＤＮＡとの混合溶液を添加する。ＤＮＡ混合量（２種以上含む場合は混合比）を変えることで、発現するタンパク質の量が一定程度コントロールできる。
一定期間（遺伝子導入方法に依存する。例えば、１〜２日。）が経過すると、導入した遺伝子から細胞内にタンパク質が発現される。
なお、ＤＮＡ量やリポソーム量は細胞によって最適値は異なることが理解される。また、遺伝子導入の方法としては上記の方法に限られず、従来知られている遺伝子導入法を用いることができる。例えば、リン酸カルシウム法、またはウイルスによる遺伝子導入などが挙げられる。
［細胞結合実験］
プレート（主として２４ウェルマイクロプレートなど）に培養され遺伝子導入されたＨｅｋ２９３細胞に対して、培地を吸引除去した後、適当量（２４−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ の場合は５００ｕＬなど）のＰＢＳ−ＥＤＴＡ（０．０２％）を加えてピペッティングにより細胞を剥離する。
結合を計測したい細胞のペアをそれぞれ剥離して別々のチューブに採取する。
別々のチューブに採取した細胞のペアを混合して、フローサイトメトリーにセットして計測を行う。計測結果は、後述するコンペンセーションにより各タンパク質のシグナルに変換される。蛍光各チャネルと同時に、前方散乱光、後方散乱光も同時に計測する。
プレート（主として２４ウェルマイクロプレートなど）に培養され遺伝子導入されたＨｅｋ２９３細胞に対して、培地を吸引除去した後、適当量（２４−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ の場合は５００ｕＬなど）のＰＢＳ−ＥＤＴＡ（０．０２％）を加えてピペッティングにより細胞を剥離する。
結合を計測したい細胞のペアをそれぞれ剥離して別々のチューブに採取する。
別々のチューブに採取した細胞のペアを混合して、フローサイトメトリーにセットして計測を行う。計測結果は、後述するコンペンセーションにより各タンパク質のシグナルに変換される。蛍光各チャネルと同時に、前方散乱光、後方散乱光も同時に計測する。
計測時間中以外は、混合した細胞を含むチューブは、装置外において回転式チューブミキサーを用いて振盪を加え続けることで細胞の沈殿による凝集の誘導など、特異的分子間結合以外の理由による細胞の結合を防ぐ。その結果、分子−分子結合をチューブ内で計測する場合と類似した環境下で細胞−細胞結合を計測できる。従って、本発明の細胞−細胞結合の計測結果に対しても、これまでに分子結合を解析するために樹立された反応速度論や熱力学の計算手法や考え方を適用・援用して解析できると考えられる。
なお、本発明では、フローサイトメトリーを使うことから、流路内における高速移動とそれに伴うせん断力が生じるため、試料中で弱い非特異的な分子結合による細胞の凝集が多少生じたとしても、フローサイトメトリーによる計測の前の地点でそのような細胞の凝集は解消されていると考えられる。このことは、以下の実施例に示すように、コントロールとして用いたＨｅｋ２９３細胞（Ｎｕｌｌ細胞）では、非特異的な結合が観察されなかったことからも支持される。
また、フローサイトメトリーの装置構成として、セットしたチューブを適宜自動的に振盪するようなシステムがある場合（例えば、ソニー製セルソーターＳＨ８００の場合）、さらに非特異的な分子結合による細胞の凝集が抑制されると考えられる。一方、サンプルの振盪やフローサイトメトリー装置内で必要とされる流路内の高速流速の形成が、特異的な分子結合による細胞結合について阻害したり、一旦結合した細胞対を剥離したりする可能性も考えられる。しかし、以下の実施例に示す実験結果は、スタンダードなフローサイトメトリーの計測条件下において行われた場合に、この条件下におけるサンプルの振盪やフローサイトメトリー流路内における高速流速等が、上述した特異的な分子結合による細胞結合の阻害や一旦結合した細胞対の剥離の何れも起こさないことを示している。
また、フローサイトメトリーにおいて、オートサンプラーなどロボット的な自動サンプル充填・混合・振盪システムを組み合わせることによって、大量サンプルのハイスループット計測に応用することも可能であると考えられる。
［解析の基本操作１．コンペンセーションと色組み合わせ］
通常のフローサイトメトリー計測と同様、コンペンセーション（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）の操作を行う。この操作では、まず無色（遺伝子導入を行っていない細胞）、単色（各々の蛍光タンパク質融合遺伝子だけを含む細胞）を別々にフローサイトメトリーに導入して各々蛍光を計測する。その結果から形成される逆行列を用いて、実際のサンプルを用いた実験において全てのチャネルにおける実測結果から本来のタンパク質量を計算する。（予めコンペンセーションのための計測を行い、コンペンセーション用の逆行列を計算した後（計測ソフトウェアを用いて行う）は、計測結果が自動的に変換される）
通常のフローサイトメトリー計測と同様、コンペンセーション（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）の操作を行う。この操作では、まず無色（遺伝子導入を行っていない細胞）、単色（各々の蛍光タンパク質融合遺伝子だけを含む細胞）を別々にフローサイトメトリーに導入して各々蛍光を計測する。その結果から形成される逆行列を用いて、実際のサンプルを用いた実験において全てのチャネルにおける実測結果から本来のタンパク質量を計算する。（予めコンペンセーションのための計測を行い、コンペンセーション用の逆行列を計算した後（計測ソフトウェアを用いて行う）は、計測結果が自動的に変換される）
例えば、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の蛍光波長のピークは緑色（〜５４０ｎｍ付近）であるが、スペクトルにすると青色から赤色まで裾野が広がる。その結果、フローサイトメトリーの検出器においても、緑色蛍光のチャネルの他、青色や赤色蛍光を検出するためのチャネルでも信号が検出される、つまり蛍光Ｅｍｉｓｓｉｏｎスペクトルの裾野の部分が少しずつ漏れていくのである。これは全ての蛍光タンパク（またはタンパクに限らず殆ど全ての有機系の蛍光分子）に共通する。従って、それぞれの分子だけを含む系でどれだけ他のチャネルに漏れるか計測し、またバックグラウンド（無色）を計測しておくことで、複数の蛍光タンパク質が混在するような場合でも、逆算することで各々の実際のシグナルに分離できる。この操作がコンペンセーションである。
本発明においては、サンプル調製の観点からは、ＴａｇＢＦＰ、ＡｃＧＦＰ、Ｌｓｓ−ｍＫａｔｅ２およびｉＲＦＰの４種の蛍光タンパク質を、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、６４３ｎｍのレーザーで励起するという実験条件が、幅広いダイナミックレンジでコンペンセーションが非常にうまくいく組み合わせとなることを見出した。また、別の組み合わせとして、同じレーザー光による励起により、ＴａｇＢＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＲＦＰ６５７、ｉＲＦＰの４種の蛍光タンパク質の組み合わせも好ましい。
なお、コンペンセーションは、数学的にはどんな場合でもうまくいくはずであるが、実際には、それぞれの蛍光タンパク質の明るさが全く異なることなどによりうまくいかない場合も多い。例えば、ｉＲＦＰを含む近赤外波長域に蛍光を保つ分子の蛍光が比較的微弱であるので、緑色レーザーで励起される赤色蛍光タンパク質（ＴａｇＲＦＰやｍＣｈｅｒｒｙなど。殆どの分子がｉＲＦＰに比べて圧倒的に明るい）を用いると、ｉＲＦＰの蛍光シグナルを覆い隠してしまう、などの結果になることがある。一方、Ｌｓｓ−ｍＫａｔｅ２は、青色レーザーにより比較的微弱な赤色蛍光を発するため、上述したような問題は軽微である。
［解析の基本操作２．蛍光強度のキャリブレーション］
細胞の蛍光強度を分子数に換算することを目的とする。
（前提）細胞で検出される蛍光の大半は、蛍光タンパク質由来である。また全てのレセプター・リガンドは蛍光タンパク質との融合体として細胞内に発現している。従って、レセプターもしくはリガンド分子数と蛍光タンパク質分子数との比は、１：１である。
（換算方法）リポソームを利用する。リン脂質（ＤＯＰＣ：ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）に、Ｐｅｒｙｌｅｎｅ（青色蛍光の細胞膜導入性の疎水性分子）またはＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＤＨＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏ社、緑色蛍光標識した脂質分子）をそれぞれ一定割合で混合させて平均直径が１３０ｎｍのリポソームを作製する。
そしてこれらのリポソームをフローサイトメトリーで蛍光強度を計測し、キャリブレーションに用いる。リポソームはそのサイズや表面積から平均的に含まれるリン脂質の分子数がわかるので、そこから各色素の含有割合に応じてリポソームに含まれる蛍光色素の分子数もわかる。その結果、フローサイトメトリーの計測値と蛍光分子数との関係値（キャリブレーション用の直線）が求められる。
最後に、フローサイトメトリーにおける検出器と同じ条件下で蛍光分光器を用いて、蛍光タンパク質（ＴａｇＢＦＰ、ＡｃＧＦＰなど）とｐｅｒｙｌｅｎｅ、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＤＨＰＥとをそれぞれ比較して、分子あたりの蛍光強度の比を求める。
以上を組み合わせると、ＴａｇＢＦＰ、ＡｃＧＦＰなどの蛍光タンパク質のフローサイトメトリーの計測値を、ＰｅｒｙｌｅｎｅやＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＤＨＰＥあたりの蛍光値に変換し、それをリポソーム計測で求められた直線を利用してキャリブレーションすることで、各細胞あたりの分子数が求められる。
細胞の蛍光強度を分子数に換算することを目的とする。
（前提）細胞で検出される蛍光の大半は、蛍光タンパク質由来である。また全てのレセプター・リガンドは蛍光タンパク質との融合体として細胞内に発現している。従って、レセプターもしくはリガンド分子数と蛍光タンパク質分子数との比は、１：１である。
（換算方法）リポソームを利用する。リン脂質（ＤＯＰＣ：ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）に、Ｐｅｒｙｌｅｎｅ（青色蛍光の細胞膜導入性の疎水性分子）またはＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＤＨＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏ社、緑色蛍光標識した脂質分子）をそれぞれ一定割合で混合させて平均直径が１３０ｎｍのリポソームを作製する。
そしてこれらのリポソームをフローサイトメトリーで蛍光強度を計測し、キャリブレーションに用いる。リポソームはそのサイズや表面積から平均的に含まれるリン脂質の分子数がわかるので、そこから各色素の含有割合に応じてリポソームに含まれる蛍光色素の分子数もわかる。その結果、フローサイトメトリーの計測値と蛍光分子数との関係値（キャリブレーション用の直線）が求められる。
最後に、フローサイトメトリーにおける検出器と同じ条件下で蛍光分光器を用いて、蛍光タンパク質（ＴａｇＢＦＰ、ＡｃＧＦＰなど）とｐｅｒｙｌｅｎｅ、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＤＨＰＥとをそれぞれ比較して、分子あたりの蛍光強度の比を求める。
以上を組み合わせると、ＴａｇＢＦＰ、ＡｃＧＦＰなどの蛍光タンパク質のフローサイトメトリーの計測値を、ＰｅｒｙｌｅｎｅやＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＤＨＰＥあたりの蛍光値に変換し、それをリポソーム計測で求められた直線を利用してキャリブレーションすることで、各細胞あたりの分子数が求められる。
［ＥｐｈＢ１発現細胞とｅｐｈｒｉｎＢ２発現細胞の細胞間結合の計測］
＜実施例１＞
ＥｐｈＢ１にＴａｇＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）を融合させ、Ｈｅｋ２９３細胞に遺伝子工学的に導入した。この細胞を培養し、融合タンパク質を発現させたＨｅｋ２９３細胞（ＥｐｈＢ（Ｂ））を得た。
同様にして、ＥｐｈＢ１にＡｃＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を融合して発現させたＨｅｋ２９３細胞（ＥｐｈＢ（Ｇ））、ｅｐｈｒｉｎＢ２にＴａｇＢＦＰを融合して発現させたＨｅｋ２９３細胞（ｅｐｈｒｉｎＢ（Ｂ））、ｅｐｈｒｉｎＢ２にＡｃＧＦＰを融合して発現させたＨｅｋ２９３細胞（ｅｐｈｒｉｎＢ（Ｇ））、およびＥｐｈＢ１もｅｐｈｒｉｎＢ２も発現していないコントロールのＨｅｋ２９３細胞（Ｎｕｌｌ細胞）をそれぞれ別々に作製した。
＜実施例１＞
ＥｐｈＢ１にＴａｇＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）を融合させ、Ｈｅｋ２９３細胞に遺伝子工学的に導入した。この細胞を培養し、融合タンパク質を発現させたＨｅｋ２９３細胞（ＥｐｈＢ（Ｂ））を得た。
同様にして、ＥｐｈＢ１にＡｃＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を融合して発現させたＨｅｋ２９３細胞（ＥｐｈＢ（Ｇ））、ｅｐｈｒｉｎＢ２にＴａｇＢＦＰを融合して発現させたＨｅｋ２９３細胞（ｅｐｈｒｉｎＢ（Ｂ））、ｅｐｈｒｉｎＢ２にＡｃＧＦＰを融合して発現させたＨｅｋ２９３細胞（ｅｐｈｒｉｎＢ（Ｇ））、およびＥｐｈＢ１もｅｐｈｒｉｎＢ２も発現していないコントロールのＨｅｋ２９３細胞（Ｎｕｌｌ細胞）をそれぞれ別々に作製した。
これらの細胞を、それぞれ細胞濃度０．５×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにサンプルを調製し、フローサイトメトリー（ソニー製セルソーターＳＨ８００）を用いて青色蛍光チャネルと緑色蛍光チャネルにて蛍光強度を計測した。結果を図２Ａに示す。
図２Ａのヒストグラム上に示した点線は、細胞における自家蛍光の値の上限値を表している。本実施例では、この上限値より大きいシグナルを、遺伝子導入により発現された蛍光タンパク質からの有意なシグナルと見積もった。
図２Ａの上段は、青色蛍光チャネルによる計測結果である。Ｎｕｌｌ、ＥｐｈＢ（Ｇ）、ｅｐｈｒｉｎＢ（Ｇ）からはほとんど青色蛍光が検出されず、ヒストグラムの左側、細胞膜上のＴａｇＢＦＰ分子密度換算で１／μｍ２以下にシグナルが現れているのに対して、ＥｐｈＢ（Ｂ）およびｅｐｈｒｉｎＢ（Ｂ）は、ヒストグラムの右側にシグナルが現れている。図２Ａの下段は、緑色蛍光チャネルによる計測結果である。Ｎｕｌｌ、ＥｐｈＢ（Ｂ）およびｅｐｈｒｉｎＢ（Ｂ）は、ヒストグラムの左側にシグナルが現れているのに対して、ＥｐｈＢ（Ｇ）およびｅｐｈｒｉｎＢ（Ｇ）は、ヒストグラムの右側にシグナルが現れている。
このように、使用した蛍光タンパク質の色と計測された色とが対応していることから、対象の分子に蛍光タンパク質を融合して発現させた細胞を、フローサイトメトリーを用いた蛍光強度測定により計測することができることが確認された。
なお、蛍光分子の実数は、フローサイトメトリーにおける細胞からの蛍光シグナル強度測定値を、標準サンプルの蛍光シグナル強度測定値を利用してキャリブレーションすることにより求めている。（その結果、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＢＦＰ融合分子存在下の標準実験条件下では、それぞれの検出チャネルにおけるフローサイトメトリーの信号値１０００に対して、ＡｃＧＦＰが７．１／μｍ２、ＴａｇＢＦＰが２７．２／μｍ２と求められた。なお、（／μｍ２）の単位は、細胞表面積一平方マイクロメートルあたりのタンパク質数を意味する。すなわち、実験に用いたＨｅｋ２９３細胞の平均細胞直径１３μｍから算出される細胞表面の分子密度に換算されている。
キャリブレーションに用いる標準サンプルとしてはリポソームを用いる。サイズと分子数の均一性が高く一定割合の蛍光標識分子を含む平均直径１３０ｎｍのリポソームを、フローサイトメトリーで同一条件下計測する。３通り以上の異なる割合で蛍光脂質分子を含むリポソームを形成する。ＴａｇＢＦＰ、ＡｃＧＦＰのキャリブレーションのためには、両者に近い蛍光波長をもつＰｅｒｙｌｅｎｅ、ＢｏｄｉｐｙＦＬ−ＤＨＰＥを含むリポソームを用いる。蛍光標識脂質分子と精製されたＴａｇＢＦＰ、ＡｃＧＦＰ分子の蛍光強度は蛍光分光計を用いて、フローサイトメトリーのレーザー光（励起波長）・検出チャネル（蛍光波長）と同等の条件下で比較する。この比較値を、リポソームのフローサイトメトリー計測結果（各蛍光脂質分子あたりのフローサイトメトリーでの計測値）に適用し、タンパク分子蛍光強度に変換した結果をプロットした直線をキャリブレーションに用いる。
キャリブレーションに用いる標準サンプルとしてはリポソームを用いる。サイズと分子数の均一性が高く一定割合の蛍光標識分子を含む平均直径１３０ｎｍのリポソームを、フローサイトメトリーで同一条件下計測する。３通り以上の異なる割合で蛍光脂質分子を含むリポソームを形成する。ＴａｇＢＦＰ、ＡｃＧＦＰのキャリブレーションのためには、両者に近い蛍光波長をもつＰｅｒｙｌｅｎｅ、ＢｏｄｉｐｙＦＬ−ＤＨＰＥを含むリポソームを用いる。蛍光標識脂質分子と精製されたＴａｇＢＦＰ、ＡｃＧＦＰ分子の蛍光強度は蛍光分光計を用いて、フローサイトメトリーのレーザー光（励起波長）・検出チャネル（蛍光波長）と同等の条件下で比較する。この比較値を、リポソームのフローサイトメトリー計測結果（各蛍光脂質分子あたりのフローサイトメトリーでの計測値）に適用し、タンパク分子蛍光強度に変換した結果をプロットした直線をキャリブレーションに用いる。
＜実施例２＞
実施例１で作製した各細胞を、以下に示す４通りの組み合わせで最終細胞濃度０．５×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように混合し、１分後および６０分後に、フローサイトメトリーを用いて青色蛍光・緑色蛍光の２色同時測定を行った。
・ＥｐｈＢ（Ｂ）とＥｐｈＢ（Ｇ）
・ｅｐｈｒｉｎＢ（Ｂ）とｅｐｈｒｉｎＢ（Ｇ）
・ＥｐｈＢ（Ｂ）とｅｐｈｒｉｎＢ（Ｇ）
・ＥｐｈＢ（Ｇ）とｅｐｈｒｉｎＢ（Ｂ）
また、対照として、ＥｐｈＢ（Ｂ）およびｅｐｈｒｉｎＢ（Ｇ）についても同様に２色同時測定を行った。結果を図２Ｂに示す。
実施例１で作製した各細胞を、以下に示す４通りの組み合わせで最終細胞濃度０．５×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように混合し、１分後および６０分後に、フローサイトメトリーを用いて青色蛍光・緑色蛍光の２色同時測定を行った。
・ＥｐｈＢ（Ｂ）とＥｐｈＢ（Ｇ）
・ｅｐｈｒｉｎＢ（Ｂ）とｅｐｈｒｉｎＢ（Ｇ）
・ＥｐｈＢ（Ｂ）とｅｐｈｒｉｎＢ（Ｇ）
・ＥｐｈＢ（Ｇ）とｅｐｈｒｉｎＢ（Ｂ）
また、対照として、ＥｐｈＢ（Ｂ）およびｅｐｈｒｉｎＢ（Ｇ）についても同様に２色同時測定を行った。結果を図２Ｂに示す。
図２Ｂ（ならびに実施例３以降の２色同時測定のドットプロット上）においては、図２Ａのヒストグラム上に示した点線を青色蛍光と緑色蛍光の両者に導入してドットプロット上を４つの区画に分割するが、その様子をグレーのボックスで表示する。
図２Ｂにおいて、ＥｐｈＢ（Ｂ）、ｅｐｈｒｉｎＢ（Ｇ）、ＥｐｈＢ（Ｂ）とＥｐｈＢ（Ｇ）、ｅｐｈｒｉｎＢ（Ｂ）とｅｐｈｒｉｎＢ（Ｇ）では、右上の区画にはほとんどプロットが現れていない。これに対して、ＥｐｈＢ（Ｂ）とｅｐｈｒｉｎＢ（Ｇ）、およびＥｐｈＢ（Ｇ）とｅｐｈｒｉｎＢ（Ｂ）では、１分後および６０分後のいずれのドットプロットにおいても右上の区画にプロットが多数出現している。右上区画には青色蛍光と緑色蛍光の両方がポジティブとなる、すなわちＴａｇＢＦＰ、ＡｃＧＦＰを発現する細胞の両方を含むサンプルがプロットとして検出されることから、これらのプロットが、ＥｐｈＢ１とｅｐｈｒｉｎＢ２の特異的分子結合によって形成された結合細胞であることがわかる。なおドットプロット上の右上区画に示す数値は、全プロット数における右上区画に検出されたプロット数の割合である。
図２Ｂにおいて、ＥｐｈＢ（Ｂ）、ｅｐｈｒｉｎＢ（Ｇ）、ＥｐｈＢ（Ｂ）とＥｐｈＢ（Ｇ）、ｅｐｈｒｉｎＢ（Ｂ）とｅｐｈｒｉｎＢ（Ｇ）では、右上の区画にはほとんどプロットが現れていない。これに対して、ＥｐｈＢ（Ｂ）とｅｐｈｒｉｎＢ（Ｇ）、およびＥｐｈＢ（Ｇ）とｅｐｈｒｉｎＢ（Ｂ）では、１分後および６０分後のいずれのドットプロットにおいても右上の区画にプロットが多数出現している。右上区画には青色蛍光と緑色蛍光の両方がポジティブとなる、すなわちＴａｇＢＦＰ、ＡｃＧＦＰを発現する細胞の両方を含むサンプルがプロットとして検出されることから、これらのプロットが、ＥｐｈＢ１とｅｐｈｒｉｎＢ２の特異的分子結合によって形成された結合細胞であることがわかる。なおドットプロット上の右上区画に示す数値は、全プロット数における右上区画に検出されたプロット数の割合である。
なお、本実施例では、混合後の細胞サンプル中に含まれる細胞総数のうち、ＥｐｈＢ１発現細胞とｅｐｈｒｉｎＢ２発現細胞をそれぞれ１０％（合計で２０％）とし、残りの８０％は、ＥｐｈＢ１もｅｐｈｒｉｎＢ２も発現していないコントロールのＨｅｋ２９３細胞（Ｎｕｌｌ）とした。また、対照の細胞サンプルでは、ＥｐｈＢ（Ｂ）、ｅｐｈｒｉｎＢ（Ｇ）を細胞総数の２０％とし、残りの８０％をＮｕｌｌ細胞とした。Ｎｕｌｌ細胞は蛍光タンパク質も発現していないので、図２Ｂの各ドットプロットでは左下の区画（青色蛍光と緑色蛍光の両方がネガティブ、すなわち細胞の自家蛍光以下の大きさで検出される）に現れているプロットに対応している。
［細胞間結合の実効的な解離定数・結合速度定数の計測］
＜実施例３＞
実施例１と同様にして作製したＥｐｈＢ（Ｂ）とｅｐｈｒｉｎＢ（Ｇ）を用いて、ＥｐｈＢ１発現細胞の濃度を一定に保持して、リガンドであるｅｐｈｒｉｎＢ２発現細胞の濃度を変化させることにより、ＥｐｈＢ１発現細胞とｅｐｈｒｉｎＢ２発現細胞とＮｕｌｌ細胞の細胞数の比を、以下の表１に示す通りとした混合サンプルを調製した。各条件間においてサンプル中の細胞濃度は０．５×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで一定値とし、総細胞数も一定（０．５×１０６ ｃｅｌｌｓ）とした。
＜実施例３＞
実施例１と同様にして作製したＥｐｈＢ（Ｂ）とｅｐｈｒｉｎＢ（Ｇ）を用いて、ＥｐｈＢ１発現細胞の濃度を一定に保持して、リガンドであるｅｐｈｒｉｎＢ２発現細胞の濃度を変化させることにより、ＥｐｈＢ１発現細胞とｅｐｈｒｉｎＢ２発現細胞とＮｕｌｌ細胞の細胞数の比を、以下の表１に示す通りとした混合サンプルを調製した。各条件間においてサンプル中の細胞濃度は０．５×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで一定値とし、総細胞数も一定（０．５×１０６ ｃｅｌｌｓ）とした。
これらの混合サンプルについて、フローサイトメトリーを用いて青色蛍光・緑色蛍光の２色同時測定を行い、ＥｐｈＢ１発現細胞とｅｐｈｒｉｎＢ２発現細胞の結合細胞数割合の経時変化を計測した。結果を図３Ａに示す。
また、それぞれの混合サンプルにおける結合細胞数割合が結合の飽和状態で達する最大値を、ＥｐｈＢ１発現細胞とｅｐｈｒｉｎＢ２発現細胞の細胞数の比についてプロットした結果を図３Ｂに示す。この結合細胞数割合の最大値は、表１に示した混合サンプルの各条件下での細胞間結合を１次反応と仮定して得られた近似曲線（図３Ａにおける近似曲線）から得られた外挿値である。なお、図３Ｂにおいて、ＥｐｈＢ１発現細胞とｅｐｈｒｉｎＢ２発現細胞の細胞数の比を、ｂ／Ｂと表記する。
細胞膜上のレセプター分子に対して、濃度の異なる可溶性のリガンド分子を添加してその分子結合の飽和状態における結合量を計測した場合においても図３Ｂと同様のプロットが得られ、分子結合を一次反応に近似した場合においてはプロットへの近似曲線から解離定数が求められる。図３Ｂのプロットでは細胞間結合反応についても分子間結合反応と同様に計算することで、一次反応近似下における近似曲線（図の点線）から、細胞間結合に関わる実効的な解離定数が、４６％細胞濃度（本実験の条件下、すなわち０．５×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度となるＥｐｈＢ（Ｂ）細胞を用いた場合、０．２３×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）と求まる。ここで、実測値ではなく細胞濃度を基本単位としたのは、ＥｐｈＢ１とｅｐｈｒｉｎＢ２との結合による細胞結合では、以下の実施例５および図５に示すように、本実施例における細胞濃度の数倍の範囲で結合速度に大きな差が見られなかったためである。すなわち、細胞濃度を基本単位とすることにより、細胞濃度が変化した場合であっても、その都度換算することができるようになる。以下で示す結果についても同様である。
細胞膜上のレセプター分子に対して、濃度の異なる可溶性のリガンド分子を添加してその分子結合量の時間変化を計測した場合においても図３Ａと同様のプロットが得られ、分子結合を一次反応に近似した場合においてはプロットへの近似曲線からみかけの分子結合速度定数ｋｏｂｓが求められる。図３Ｃは、細胞間結合反応についても分子間結合反応と同様に、表１に示した混合サンプルの各条件下での結合反応を１次反応近似して得られた近似曲線（図３Ａにおける近似曲線）から、見かけの反応速度定数ｋｏｂｓ を各々の細胞数比の条件下で求めてプロットした結果である。ｋｏｂｓのプロットに対する一次近似（直線）からｋｏｎ、ｋｏｆｆを求めると、細胞結合反応に関わる実効的な結合・解離の速度定数は、ｋｏｎ ＝ ０．３９ （ｍｉｎ−１ 細胞濃度単位−１）、ｋｏｆｆ， 〜 ０．０ （ｍｉｎ−１）となる。この結果は、解離速度が非常に遅いことを意味している。
図３Ｄは、表１に示した混合サンプルの各条件下で計測したフローサイトメトリーのドットプロット上における、全細胞と結合細胞（ドットプロット上の右上区画）それぞれの前方散乱光（フローサイトメトリーで同時計測）の平均値である。図３Ｄでのプロットの図形は、それぞれ、図３Ａと対応している。図３Ｄにおいて、下側に位置しているプロット（黒色、サイズ小）が全細胞、そして上側に位置しているプロット（灰色、サイズ大）が結合細胞のそれぞれの前方散乱光の平均値を示している。いずれの条件においても、結合細胞は共通に前方散乱光が大きくなる（物理的なサイズが大きいので散乱光が増す）が、その散乱光の平均値は時間が経っても大きく変化していないことから、０〜６０分間の間では、形成された細胞結合塊のサイズには大きな変化が無いと考えられる。すなわち、本発明の計測方法では、細胞の巨大な凝集が形成されず、２〜３個程度の細胞による結合（細胞間相互作用）を計測できることが確認された。
［ＰＤ−１発現細胞とＰＤ−Ｌ１発現細胞の細胞間結合の計測］
＜実施例４−１＞
蛍光タンパク質に融合させる分子をＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１としたこと以外は実施例１と同様にして、ＰＤ−１にＡｃＧＦＰを融合して発現させたＨｅｋ２９３細胞（ＰＤ−１（Ｇ））、およびＰＤ−Ｌ１にＴａｇＢＦＰを融合して発現させたＨｅｋ２９３細胞（ＰＤ−Ｌ１（Ｂ））、をそれぞれ別々に作製した。
＜実施例４−１＞
蛍光タンパク質に融合させる分子をＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１としたこと以外は実施例１と同様にして、ＰＤ−１にＡｃＧＦＰを融合して発現させたＨｅｋ２９３細胞（ＰＤ−１（Ｇ））、およびＰＤ−Ｌ１にＴａｇＢＦＰを融合して発現させたＨｅｋ２９３細胞（ＰＤ−Ｌ１（Ｂ））、をそれぞれ別々に作製した。
これらの細胞を用いて、ＰＤ−１発現細胞の濃度を一定に保持して、リガンドであるＰＤ−Ｌ１発現細胞の濃度を変化させることにより、ＰＤ−１発現細胞とＰＤ−Ｌ１発現細胞とＮｕｌｌ細胞の細胞数の比を、以下の表２に示す通りとした混合サンプルを調製した。各条件間においてサンプル中の細胞濃度は０．５×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで一定値とし、総細胞数も一定（０．５×１０６ ｃｅｌｌｓ）とした。
これらの混合サンプルについて、フローサイトメトリーを用いて青色蛍光・緑色蛍光の２色同時測定を行い、ＰＤ−１発現細胞とＰＤ−Ｌ１発現細胞の結合細胞数割合の経時変化を計測した。結果を図４Ａに示す。
また、それぞれの混合サンプルにおける結合細胞数割合が結合の飽和状態で達する最大値を、ＰＤ−１発現細胞とＰＤ−Ｌ１細胞の細胞数の比についてプロットした結果を図４Ｂに示す。この結合細胞数割合の最大値は、表１に示した混合サンプルの各条件下での細胞間結合を１次反応と仮定して得られた近似曲線（図３Ａにおける近似曲線）から得られた外挿値である。なお、図４Ｂにおいて、ＰＤ−Ｌ１発現細胞とＰＤ−１発現細胞の細胞数の比を、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１と表記する。
細胞膜上のレセプター分子に対して、濃度の異なる可溶性のリガンド分子を添加してその分子結合の飽和状態における結合量を計測した場合においても図４Ｂと同様のプロットが得られ、分子結合を一次反応に近似した場合においてはプロットへの近似曲線から解離定数が求められる。図４Ｂのプロットでは細胞間結合反応についても分子間結合反応と同様に計算することで、一次反応近似下における近似曲線（図の点線）から、細胞間結合に関わる実効的な解離定数が、６８％細胞濃度（本実験の条件下、すなわち０．５×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度となるＰＤ−１（Ｇ）細胞を用いた場合、０．３４×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）と求まる。ここで、実測値ではなく細胞濃度を基本単位としたのは、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との結合による細胞結合では、以下の実施例５および図５に示すように、本実施例における細胞濃度の数倍の範囲で結合速度に大きな差が見られなかったためである。すなわち、細胞濃度を基本単位とすることにより、細胞濃度が変化した場合であっても、その都度換算することができるようになる。以下で示す結果についても同様である。
細胞膜上のレセプター分子に対して、濃度の異なる可溶性のリガンド分子を添加してその分子結合量の時間変化を計測した場合においても図４Ａと同様のプロットが得られ、分子結合を一次反応に近似した場合においてはプロットへの近似曲線からみかけの分子結合速度定数ｋｏｂｓが求められる。図４Ｃは、細胞間結合反応についても分子間結合反応と同様に、表２に示した混合サンプルの各条件下での結合反応を１次反応近似して得られた近似曲線（図４Ａにおける近似曲線）から、見かけの反応速度定数ｋｏｂｓ を各々の細胞数比の条件下で求めてプロットした結果である。ｋｏｂｓのプロットに対する一次近似（直線）からｋｏｎ、ｋｏｆｆを求めると、細胞結合反応に関わる実効的な結合・解離の速度定数は、ｋｏｎ ＝ ０．１３ （ｍｉｎ−１ 細胞濃度単位−１）、ｋｏｆｆ， 〜 １．３０ （ｍｉｎ−１）となる。この結果は、解離速度が速いことを意味している。
［ＣＡＲ発現細胞と、Ｂ細胞およびＴ細胞との細胞間結合の計測］
＜実施例４−２＞
抗ＣＤ１９を含むキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）にＴａｇＢＦＰを融合して発現させたＨｅｋ２９３細胞（２９３−ＣＡＲ）を作製し、この２９３−ＣＡＲと、Ｂ細胞由来細胞株（Ｄａｕｄｉ細胞）およびＴ細胞由来細胞株（Ｊｕｒｋａｔ細胞）との結合を計測した。結果を図４Ｄに示す。
＜実施例４−２＞
抗ＣＤ１９を含むキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）にＴａｇＢＦＰを融合して発現させたＨｅｋ２９３細胞（２９３−ＣＡＲ）を作製し、この２９３−ＣＡＲと、Ｂ細胞由来細胞株（Ｄａｕｄｉ細胞）およびＴ細胞由来細胞株（Ｊｕｒｋａｔ細胞）との結合を計測した。結果を図４Ｄに示す。
図４Ｄの左側に示したドットプロットでは、右上の区画にはほとんどプロットが現れていないため、２９３−ＣＡＲとＪｕｒｋａｔ細胞とでは、細胞間結合がほとんど発生しないことがわかる。
一方、図４Ｄの右側に示したドットプロットでは、右上の区画に多数のプロットが現れており、２９３−ＣＡＲとＤａｕｄｉ細胞との結合によって形成された結合細胞が計測された。
なお、図４Ｄにおいて、Ｘ軸は細胞膜上のＣＡＲ−ＴａｇＢＦＰ分子密度を示す。Ｙ軸は細胞透過性分子（Ｃａｌｃｅｉｎ（カルセイン））により単純に染色したＪｕｒｋａｔ細胞またはＤａｕｄｉ細胞からのＣａｌｃｅｉｎ蛍光シグナル計測値であり、結合分子であるＣＤ１９の分子密度を示してはいない。
［細胞間結合における細胞濃度依存性の検証］
＜実施例５＞
実施例１と同様にして作製した（ＥｐｈＢ（Ｂ））と（ｅｐｈｒｉｎＢ（Ｇ））、および実施例４−１と同様にして作製した（ＰＤ−１（Ｇ））と（ＰＤ−Ｌ１（Ｂ））を用いて、細胞間結合における細胞濃度依存性を確認した。結果を図５に示す。
＜実施例５＞
実施例１と同様にして作製した（ＥｐｈＢ（Ｂ））と（ｅｐｈｒｉｎＢ（Ｇ））、および実施例４−１と同様にして作製した（ＰＤ−１（Ｇ））と（ＰＤ−Ｌ１（Ｂ））を用いて、細胞間結合における細胞濃度依存性を確認した。結果を図５に示す。
図５に示す計測においては、細胞結合反応の溶液量を一定に保ちながら、溶液中の細胞濃度を変化させた。またそれぞれの反応において、（ＥｐｈＢ（Ｂ））と（ｅｐｈｒｉｎＢ（Ｇ））、（ＰＤ−１（Ｇ））と（ＰＤ−Ｌ１（Ｂ））の細胞は１：１となるように混合されている。
図５の結果から理解されるように、細胞濃度が０．５×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの条件を中心に、細胞濃度が１／２〜２倍程度変化した場合でも、結合細胞の割合（フローサイトメトリーのドットプロット上における右上区画の結合細胞数の割合）に大幅な変化は見られない。また、時間経過における顕著な差は見られなかった。細胞の混合による反応開始直後（０．５分後）でも９０分後でも、当該細胞濃度範囲においては、結合細胞数比における細胞濃度依存性は弱いと考えられる。
［複数の結合分子ペアの共存下における分子結合速度と結合プロファイル］
＜実施例６＞
まず、共結合を形成する２つの結合分子ペア（Ｅｐｈ：ｅｐｈｒｉｎ、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１）について、それぞれの単独での結合プロファイルの検討を行った。
＜実施例６＞
まず、共結合を形成する２つの結合分子ペア（Ｅｐｈ：ｅｐｈｒｉｎ、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１）について、それぞれの単独での結合プロファイルの検討を行った。
図６Ａの左側は、ＥｐｈＢ１とｅｐｈｒｉｎＢ２との結合を計測したドットプロットである。図６Ａの右側は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との結合を計測したドットプロットである。各々の結合反応の条件は実施例３および実施例４−１と同様とし、細胞の混合による反応開始から６０分後に計測を行った。
ＥｐｈＢ１とｅｐｈｒｉｎＢ２のペア、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１のペアを比較すると、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との結合（図６Ａ（右））では、右上の区画に現れたプロットが直線状になっており、これは、ＰＤ−１の分子密度が低い細胞はＰＤ−Ｌ１の分子密度が低い細胞との結合が優先され、ＰＤ−１の分子密度が高い細胞はＰＤ−Ｌ１の分子密度が高い細胞との結合が優先されることを意味している。すなわち、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との結合においては細胞膜上のタンパク質分子の分子密度依存性が顕著に現れることが確認された。
この結果は、両者の解離速度定数（ｋｏｆｆ）の違い（図３Ｃ、図４Ｃ）で説明できる。すなわちＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との結合による細胞間結合は比較的解離しやすいため、各細胞結合においてリガンドとレセプターの分子密度バランスを揃えることで系全体の自由エネルギーを低下させる方向へ進むが、ＥｐｈＢ１とｅｐｈｒｉｎＢ２とによる細胞間結合は解離しにくいため近接する細胞と一旦結合が生じるとそのままの結合状態が続き、系全体の自由エネルギーの低減は遅いと考えられる。
次に、ＰＤ−１にＴａｇＢＦＰを融合させ、ＥｐｈＢ１にＬＳＳｍＫａｔｅ２を融合して共発現させたＨｅｋ２９３細胞（ＰＤ−１（Ｂ）/Ｅｐｈ（Ｒ））、およびＰＤ−Ｌ１にＡｃＧＦＰを融合させ、ｅｐｈｒｉｎＢ２にｉＲＦＰを融合して共発現させたＨｅｋ２９３細胞（ＰＤ−Ｌ１（Ｇ）/ｅｐｈｒｉｎ（Ｐ））を、それぞれ別々に作製した。
これらの細胞を混合し、それぞれ細胞濃度０．５×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにサンプルを調製し、細胞の混合による反応開始から６０分後にフローサイトメトリーを用いて細胞間の結合を計測した。結果を図６Ｂに示す。
図６Ｂから理解されるように、Ｅｐｈ：ｅｐｈｒｉｎ、およびＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１の２つの結合分子ペアの共存下では、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との結合様式（分子密度依存性）が優先されることがわかる。また、予測された通り、Ｅｐｈとｅｐｈｒｉｎ、およびＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の共結合が可能であることにより、細胞間の結合速度自体が速くなることもわかる。
［細胞内・細胞間結合の競合の計測］
＜実施例７＞
ＥｐｈＢ１にＴａｇＢＦＰを融合させ、ｅｐｈｒｉｎＢ２にＡｃＧＦＰを融合して共発現させたＨｅｋ２９３細胞（ＥｐｈＢ（Ｂ）/ｅｐｈｒｉｎＢ（Ｇ））、およびｅｐｈｒｉｎＢ２にｉＲＦＰを融合して発現させたＨｅｋ２９３細胞（ｅｐｈｒｉｎＢ（Ｐ））を、それぞれ別々に作製した。
＜実施例７＞
ＥｐｈＢ１にＴａｇＢＦＰを融合させ、ｅｐｈｒｉｎＢ２にＡｃＧＦＰを融合して共発現させたＨｅｋ２９３細胞（ＥｐｈＢ（Ｂ）/ｅｐｈｒｉｎＢ（Ｇ））、およびｅｐｈｒｉｎＢ２にｉＲＦＰを融合して発現させたＨｅｋ２９３細胞（ｅｐｈｒｉｎＢ（Ｐ））を、それぞれ別々に作製した。
これらの細胞を混合し、それぞれ細胞濃度０．５×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにサンプルを調製し、細胞の混合による反応開始から０．５、６０分後にフローサイトメトリーを用いて細胞間の結合を計測した。これにより、同一細胞内におけるＥｐｈＢ１−ｅｐｈｒｉｎＢ２の結合が、細胞間におけるＥｐｈＢ１−ｅｐｈｒｉｎＢ２の結合を競争的に阻害する程度が計測される。
本実施例では、ＥｐｈＢ（Ｂ）/ｅｐｈｒｉｎＢ（Ｇ）細胞において、それぞれの蛍光タンパク質と融合されたＥｐｈＢ１とｅｐｈｒｉｎＢ２（同一細胞内）とが１：０、２：１、１：１、１：２の比で発現されるように遺伝子導入量を設計した細胞結合実験を行った。図７Ａおよび図７Ｂは、これら同一細胞内に異なる発現量比を示す細胞に対して、同一量の細胞（ｅｐｈｒｉｎＢ（Ｐ））を結合させて、０．５、６０分後にフローサイトメトリーを用いて細胞間の結合を計測した結果である。図７Ａの各ドットプロットは、Ｘ軸側は青色蛍光（ＥｐｈＢ（Ｂ））、Ｙ軸側は近赤外蛍光（ｅｐｈｒｉｎＢ（Ｐ））のシグナルを表す。また、図７Ｂの棒グラフは、全プロット数における右上区画に検出された結合細胞プロット数の割合を、それぞれの条件下において求めたものである。
図７Ａおよび図７Ｂより、同一細胞内のｅｐｈｒｉｎＢ２量が増加するに従って、同一細胞膜表面上のＥｐｈＢ１、ｅｐｈｒｉｎＢ２分子間の結合が生じることにより細胞間での分子結合の結合速度が著しく低下する（競合阻害が発生する）ことがわかる。特に、ＥｐｈＢ（Ｂ）：ｅｐｈｒｉｎＢ（Ｇ）比が１：２となる細胞では０．５分後にはほとんど細胞間の結合が検出されない。しかしながら、６０分後には同条件においても多くの細胞間結合が発生することがわかった。したがって、細胞同士の接触の後、時間が経過するにつれて、細胞内の分子結合に比べて、細胞間での結合がやがては優先されていく様子が確認された。
以上、本発明の実施形態を詳述してきたが、具体的な形態はこれらの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲における設計の変更等があっても本発明に含まれる。
Claims (5)
- 第一の細胞の細胞表面に存在する分子と第二の細胞の細胞表面に存在する分子の結合による細胞間相互作用を計測する方法であって、
第一の分子と第一の蛍光タンパク質とが融合されて細胞膜上に発現された第一の細胞、および任意の蛍光分子で蛍光標識された第二の細胞を提供する工程であって、前記蛍光分子は前記第一の蛍光タンパク質と蛍光波長が異なる、工程、
前記第一の細胞と前記第二の細胞とを接触させる工程、
フローサイトメトリーを用いて前記第一の細胞からの蛍光および前記第二の細胞からの蛍光を検出する工程、および
前記検出する工程で検出された蛍光強度から、前記第一の細胞と前記第二の細胞とが結合して形成された結合細胞を解析する工程
を含む、方法。 - 前記第二の細胞を蛍光標識する蛍光分子が、第二の分子と第二の蛍光タンパク質とが融合されて細胞膜上に発現された融合タンパク質分子である、請求項１に記載の方法。
- 前記第一の細胞がさらに、第三の分子と第三の蛍光タンパク質とが融合されて細胞膜上に発現されており、
前記第二の細胞がさらに、第四の分子と第四の蛍光タンパク質とが融合されて細胞膜上に発現されており、
前記第一から第四の蛍光タンパク質は互いに蛍光波長が異なる、請求項２に記載の方法。 - 前記第一の細胞がさらに、前記第二の分子と第三の蛍光タンパク質とが融合されて細胞膜上に発現されており、
前記第一から第三の蛍光タンパク質は互いに蛍光波長が異なる、請求項２に記載の方法。 - 前記接触させる工程において、前記第一の分子と前記第二の分子との相互作用を阻害可能な結合阻害剤を添加する、請求項２に記載の方法。
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2017
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