JP5892665B2 - 標識の選択的変換による接着細胞の選別方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその内容が本明細書に組み入れられる2010年11月22日出願の米国特許仮出願第61/416,012号の恩典を主張する。

発明の背景
1．発明の分野
本発明は、細胞選別の分野、即ち、関心対象の特定の特徴を有する生物学的な細胞とその関心対象の特徴を持たないその他の細胞との双方を含む細胞集団から、その関心対象の特徴を有する生物学的な細胞を選択する分野に属する。

2．先行技術の説明
より大きな集団から特定の特徴を有する細胞を選択するための生物学的な細胞の選別は、ゲノム研究、幹細胞研究、および細胞ベースのスクリーニングのために生物学的な実験室において頻繁に用いられる手順である。選別によって、特定の特徴を持つ個々の細胞を、カウント、より詳細な研究、採取または処理のために、同定および単離することができるようになる。選別は、一般に、細胞の集団全体を液体の担体に分散させて懸濁液を生成し、続いて、フローサイトメトリーにより懸濁液を分析して関心対象の細胞を検出しかつ分離するかまたは個々に処理するかのいずれかによって実施される。しかし、この方法は、生物学的な細胞の最も一般的な表現型である接着細胞には適切でない。接着細胞は、酵素的または機械的な手段によって非接着性とされる、つまり、それらが生育する表面からまたはそれらが接着する他の細胞から剥離され得るが、剥離は細胞の健康に悪影響を及ぼし、細胞の形態および形態に関連する細胞内プロセスを変化させる。剥離は、また、選別の根拠となる特徴をしばしば含む糸状仮足および局在型膜タンパク質などの細胞表面の様々な追跡可能なマーカーを除去する。

これらの特徴的な特性を失うことなく接着細胞を分析するための一つの方法は、顕微鏡で同定可能な生育表面に細胞を播種することである。しかし、このような視覚による同定は面倒であり、間違いを起こし易く、したがって、より高い正確さのために機械の視覚を利用するロボットのシステムが用いられている。しかし、選別が視覚によるものであろうと機械によるものであろうと、犠牲的な土台層の使用、関心対象の細胞が存在する表面の部分の切り出し、または個々の細胞タイプの限局的な播種のためのマイクロプレートの使用などの複雑さが伴う。

発明の簡単な概要
本明細書に開示する方法は、接着細胞を、接着状態においてのみ存在する特徴を含む細胞の任意の特徴に基づいて選別するが、該細胞が接着状態にあるかまたは非接着状態へと解放されたかどうかに依存しない手段によって選別する方法である。したがって、この方法は、選別の期間中、細胞を接着状態に維持する必要がなく、それにも関わらず、接着状態のときに観察される関心対象の特徴を持つ細胞を識別することができる。この結果は、検出可能でさらに変換可能な標識を、接着状態にある細胞集団全体に対して適用すること、および一つまたは複数の細胞亜集団を、曝露された標識を優先的な曝露を受けなかった標識と区別することができる状態へと変換する外部から適用されるエネルギーに優先的に曝露することによって達成され、この優先的な曝露は、生じた差が、細胞集団全体をひとたび接着状態から解放すると維持されるような方法で、実施される。優先的な曝露を受ける亜集団は、関心対象の特徴を有する細胞またはこれらの特徴を有する細胞以外の細胞のいずれからなってもよい。いずれの場合も、選択のベースとなる細胞の特徴は、細胞のサイズ、細胞の形状、または細胞の任意のその他の、表面もしくは細胞内特性、状態、もしくは形態であり得、さらには細胞がまだ接着状態にある間になされたものであり得る。曝露の後、細胞が依然接着状態であろうと、細胞が接着状態から解放された後であろうと、細胞は曝露された標識と曝露されていない標識との間の差に基づいて選別される。選別前に細胞が接着状態から解放される本発明の態様では、本明細書に記載されるように、標識が、細胞に適用された後に選択的に変換される場合には、前記の先行技術において見られる細胞の損傷および細胞形態の変化によって細胞の正確な選別が妨げられることはない。
[本発明1001]
生物学的な接着細胞の集団を、該集団のその他の細胞によって共有されない特徴を有する選択された細胞亜集団を検出するように選別するための方法であって、以下の工程を含む方法：
（a）集団のすべての細胞が接着性の形態である間に、エネルギーへと曝露されたときに変換可能である標識で、該集団のすべての細胞を標識し、かつ
そのように変換された標識とそのようには変換されていない標識との間の区別を可能にすべくそのように曝露された細胞上の標識を変換するために、該亜集団の細胞または該亜集団以外の該集団の細胞のいずれかを、標識を変換するエネルギーに優先的に曝露する工程；および
（b）そのように変換された標識を有する細胞を、そのようには変換されていない標識を有する細胞から区別することによって、該亜集団の細胞と該亜集団以外の細胞とを識別するように該集団を選別する工程。
[本発明1002]
工程（a）と工程（b）との間において前記集団のすべての細胞を非接着性の形態に転換すること、および該集団の非接着性の形態のすべての細胞に対して工程（b）を実施することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
工程（a）が、既定の二次元アレイに配置された前記集団のすべての細胞を用いて実施され、かつ
工程（a）が、
該アレイにおける前記亜集団の細胞のそれぞれの二次元座標を決定すること、および標識を変換するエネルギーを、該座標かまたは該座標以外の該アレイの位置かのいずれかに対して方向付けること
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
標識を変換するエネルギーが、光エネルギーである、本発明1001の方法。
[本発明1005]
標識を変換するエネルギーが、熱エネルギーである、本発明1001の方法。
[本発明1006]
標識を変換するエネルギーが、高周波エネルギーである、本発明1001の方法。
[本発明1007]
標識が、光活性化可能蛍光標識であり、かつ標識を変換するエネルギーが、光エネルギーである、本発明1001の方法。
[本発明1008]
標識が、光切り替え可能な（photoswitchable）蛍光標識であり、かつ標識を変換するエネルギーが、光エネルギーである、本発明1001の方法。
[本発明1009]
標識が、蛍光標識であり、かつ標識を変換するエネルギーが、入射光に対して該標識を非反応性とするのに十分な光エネルギーであり、そうでなければ該入射光は、該標識の蛍光発光反応を作動させるものである、本発明1001の方法。
[本発明1010]
標識が、磁気的に反応性の粒子であり、かつ標識を変換するエネルギーが、該粒子を消磁するのに十分な熱エネルギーである、本発明1001の方法。
[本発明1011]
標識が、磁気的に分極した粒子であり、かつ標識を変換するエネルギーが、該粒子の分極の変化をもたらすのに十分な熱エネルギーである、本発明1001の方法。
[本発明1012]
標識が、感光性プローブであり、かつ標識を変換するエネルギーが、該プローブを検出可能とするのに十分な光エネルギーである、本発明1001の方法。
[本発明1013]
標識が、脂質ナノカプセルに被包された検出可能な種であり、かつ標識を変換するエネルギーが、該脂質ナノカプセルを破裂させてそれによって検出可能な該種を放出させるのに十分な光エネルギーである、本発明1001の方法。
[本発明1014]
工程（a）が、既定の二次元アレイに配置された前記集団のすべての細胞を用いて実施され、かつ工程（a）の優先的曝露が、標識を変換するエネルギーの供給源を用いて該アレイを走査することによって実施される、本発明1001の方法。
[本発明1015]
走査がレーザーによって実施される、本発明1014の方法。
[本発明1016]
工程（a）が、既定の二次元アレイに配置された前記集団のすべての細胞を用いて実施され、かつ工程（a）の優先的曝露が、二次元にパターン化されたエネルギー伝達によって該アレイ全体で同時に実施される、本発明1001の方法。
[本発明1017]
二次元にパターン化されたエネルギー伝達が、空間的な光モジュレーターによって達成される、本発明1016の方法。

発明の詳細な説明
「接着細胞」は、原核性または真核性に関わらず、基材の表面に結合、固定、またはそうでなければ接触したままであり、洗浄もしくは培地交換の手順を経てもその状態を維持する細胞、細胞株、および細胞系を指す。接着細胞として生育または表面上に固定され得る細胞の例は、主たる肝細胞および肝臓上皮細胞を含む肝臓の細胞または肝臓由来の細胞、一般的な上皮細胞、一般的な内皮細胞、神経細胞、間葉細胞、膵臓細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、癌由来の細胞、骨髄細胞、ランゲルハンス島、副腎髄質細胞、骨芽細胞、破骨細胞、Tリンパ球、ニューロン、グリア細胞、神経節細胞、網膜細胞、および筋芽細胞である。幹細胞も用いられ得る；例は間葉幹細胞、神経幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、マウス胚幹細胞、およびヒト胚幹細胞である。その他の多くの例が存在し、当業者には容易に明らかである。

変換可能な標識の例は、蛍光標識、放射性標識、酵素標識、ナノ粒子、ならびに磁気性のナノ粒子および微小粒子を含む微小粒子である。細胞内および細胞外の双方の感光性ケージド化合物も用いることができる。感光性ケージド化合物は、活性分子を検出可能な形態へと放出することによって光の照射に対して反応する活性分子の前駆体である。感光性細胞内プローブの例は、ATP、ADP、GTP、GTP-γ-S、GDP-β-S、サイクリックAMP、サイクリックGMP、イノシトール1,4,5-トリホスフェート、無機ホスフェート、カルシウムキレート剤nitr-5、nitr-7、DM-ニトロフェン、およびジアゾ-2である。感光性細胞外プローブの例は、カルバコール、アドレナリン、ノルアドレナリン、ドーパミン、イソプレナリン、プロプラノロール、セロトニン、グルタメート、MK-801、アスパルテート、GABA、グリシン、アラキドン酸、および一酸化窒素である。カプセルが光アドレス可能な（light-addressable）脂質であるナノカプセル化された標識も用いられ得る。これらの標識は、フルオロフォア、ナノ粒子、および生体分子を含み、光アドレス性（light-addressability）は、光へと脂質が曝露されたときの脂質カプセルからの標識の遊離である。フルオロフォアは、蛍光化合物、ならびに活性化された場合にのみ蛍光性である化合物、例えばアクリドン、CMNB-ケージドフルオレセイン（即ち、フルオレセインビス-(5-カルボキシメトキシ-2-ニトロベンジル)エーテル)、およびCMNB-ケージドカルボキシフルオレセインを含む。

標識の細胞への連結は、当業者に公知の手段によって達成することができる。蛍光標識の連結は、例えば、細胞膜または細胞内部へのいずれかに連結する結合メンバーによって達成され得る。結合メンバーの例は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、非抗体タンパク質、レクチン、糖質、短鎖ペプチド、膜挿入色素、およびタグ付き核酸プローブである。放射性標識または酵素の連結は、蛍光標識において有用なものと同じ結合メンバーの多くによって達成され得る。ナノ粒子または微小粒子の連結は、カルボキシの官能性を持たせたまたはアミンの官能性を持たせた粒子を用いることによって、カルボキシまたはアミンの官能基を介して、例えばカルボジイミド介在性の結合プロセスを経由して、粒子をリガンドまたは抗体に結合させることによって達成することができる。脂質ナノカプセルの連結は、通常の脂質化学により達成することができる。粒子である標識は、蛍光性もしくは磁気的に反応性のいずれかであるか、または両者であってよい。一部の態様においては常磁性の粒子は特に関心対象であり、ポリスチレン、ポリエチレン、およびその他のポリマーなどの材料から作成されてもよく、またはマグネシウム、モリブデン、リチウム、およびタンタルなどの金属であってもよい。

変換可能な蛍光標識の例は、光エネルギーまたは特定の波長の光に曝露された際に蛍光性の変化を起こすものである。標識のこのような一つのクラスは、可逆性の光活性化を示すものおよび不可逆性の光活性化を示すものを含む光活性化可能な蛍光標識である。光活性化可能な蛍光標識の一つの例は、非活性化形態では非蛍光性であり、活性化されると緑色の光を発するクラゲのオワンクラゲ属（Aequorea genus）に由来する光活性化可能な蛍光タンパク質である。203位のヒスチジン置換を含むもののように、このタンパク質の強化された形態が開発されており、文献、特にStepanenko, O.V., et al., "Fluorescent proteins as biomarkers and biosensors: throwing color lights and molecular and cellular processes," Curr. Protein Pept. Sci. 9: 338-369 (2008)に報告されている。ヒスチジン置換されたタンパク質は400nmの強い光照射に曝露されると、490nmにおいて100倍の吸光の増大および蛍光発光の対応する増強を示す。光に曝露されて赤色の蛍光を発するその他のタンパク質は、Dendra2、IrisFP、tdEosFP、mEos2、PA-Cherry1、mKikGR、Fast-FT、Medium-FT、およびSlow-FTである。さらなる例は、Kindling蛍光タンパク質として当技術分野において公知の525〜570nmにおいて活性化可能なタンパク質および400nmで活性化可能なDronpaタンパク質である。Kindlingタンパク質はChudakov, D.M., et al., "Chromophore environment provides clue to kindling fluorescent protein riddle," J. Biol. Chem., 278(9): 7215-7219 (2003)に記載され、Dronpaタンパク質はAndo, R., et al., "Regulated Fast Nucleocytoplasmic Shuttling Observed by Reversible Protein Highlighting," Science 306(5700): 1370-1373 (2004)に記載されている。非タンパク質の光活性化可能な蛍光化合物の例は、一重項酸素およびヒドラジドと反応するオレフィン、ならびに一重項酸素またはペルオキシドと反応して同時またはその後に結合が開裂して蛍光性化合物が得られるヒドラゾンである。例えば、ジヒドロメロシアニン染料を含む白色蛍光染料は、一重項酸素によって容易に酸化され、それによって蛍光性を付与される。

変換可能な蛍光標識の別のクラスは光切り替え可能な（photoswitchable）蛍光標識であり、これは光に曝露されると発光波長のシフトが起こる標識である。D. M. Chudakov, et al., "Photoswitchable cyan fluorescent protein for protein tracking," Nature Biotechnol. 22: 1435-1439 (2004)に記載された一部のKindlingタンパク質は光切り替え可能である。これらのタンパク質は、405nmでの照射までは402nmをピークとする最大発光を有し、その後、最大発光は511nmにシフトする。別の例は、Ando, R., et al., "An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(20): 12651-12656 (2002)において記載されたKaedeである。Kaedeの最大発光は、350〜400nmで照射すると518nmから582nmにシフトする。非タンパク質の光切り替え可能な蛍光化合物の例は、Das, S.ら、米国特許第6,951,692号B1（発行日2005年10月4日）により開示されたアルコキシスチロベンゾニトリルである。一部の染料は、波長に応じて、光活性化可能および光切り替え可能の双方に分類可能である。

蛍光標識の変換はまた、光退色によって、または、入射光に対して反応性でない形態へと標識（そうでなければ同じ入射光によって活性化すると蛍光反応を示す標識）を転換することによって、達成され得る。光退色は永続性でもまたは一過性でもよく、光への蛍光標識の強力なまたは長期の曝露によって容易に達成される。光は、それ以外では標識を蛍光発光させるために用いられる同一の波長であり得る。

磁気的なまたは磁気的に反応性の粒子の変換は、粒子をより低い磁気性もしくは非磁気性の状態に転換することによって、または選別が分極の差に基づいて達成され得るような方法の場合は磁気的に分極した粒子の分極を変化させることによって達成することができる。これらの変換は、粒子を消磁エネルギーに曝露することによって達成可能であり、主な例は熱である。限局的な熱は、光エネルギー、マイクロ波エネルギー、または高周波エネルギー、および当技術分野において公知のその他の手段によって発生させることができる。

前記のパラグラフにおいて記載される標識変換エネルギーおよびその他の標識変換エネルギーは、連続する単一ポイントの曝露か、またはより詳細に以下に説明される通り、曝露されるべきすべての部位の、パターン化された同時曝露かのいずれかによって、適用することができる。

関心対象の細胞の同定は、集団全体を標識する前または後のいずれに実施してもよい。特に接着細胞が、それらが接着する基材上の既定の二次元アレイに配置される場合の同定の一つの手段は、接着細胞を含む試料を、試料の二次元画像を作成して画像内の関心対象の細胞の二次元座標を図に示す走査および画像化システムの焦点面に置くことである。この画像は、例えば電荷結合素子（CCD）に記録して、関心対象の特徴を有する細胞の座標を決定するコンピュータシステムに転送することができる。このタイプの走査および画像化システムに関する記載は、Palssonら、米国特許第7,505,618号B2（発行日 2009年3月17日）に見出される。続いて、図に示された座標は、これらの座標の細胞にエネルギーを方向付けるために用いることができ、または関心対象の細胞以外の細胞を変換させるべき場合は、図に示された座標以外の位置にエネルギーを方向付けることができる。いずれの場合も、エネルギーは、区画パターン化された方法、即ち、関心対象の細胞の既定の位置と一致する二次元パターンで適用される。

変換されるべき細胞が同定されると、細胞のパターン化された曝露は単一ポイントの連続した方法（1回に1個の細胞、または各ウェルに細胞が含まれるマルチウェルアレイの1回に1個のウェル）もしくは一度にすべてのいずれか、または、連続する行または列を曝露するライン走査を含めて、接着細胞によって占有される区画（またはマルチウェルアレイ）のセグメントが連続して曝露される組み合わせで達成され得る。光エネルギーは、用いることのできるエネルギーの一つの形ではあるが、標識およびその標識を変換させる手段によってはその他の形を用いることもできる。熱エネルギーおよび高周波エネルギーはエネルギーのその他の形の例である。

単一ポイントの連続した曝露は、例えば、前記のパラグラフの同定の工程で得られて保存された座標に対してエネルギーを方向付けるようにプログラムされた走査レーザーによって達成され得る。このような手順の一例は同様に、上記のPalssonらの特許に開示される。

光エネルギーの同時または半同時の曝露は、空間的光モジュレーターなどのパターン化されたエネルギー伝達装置の使用によって達成することができる。二次元空間的光モジュレーターは、位相または振幅の点で空間的に変化する光を提供することができ、独立して制御可能なピクセルを作るためにフォトリソグラフィー法により個々の電極へとパターン化された酸化インジウムスズなどの透明な導体を用いて、それぞれに独立して対処される強誘電性液晶ピクセルのアレイからなり得る。位相の調節は、液晶材料の軸と平行に直線偏光された光によって達成され、個々のピクセルに適用される電圧によって調節される。振幅の調節は入力偏光の回転によって達成される。調節は反射モードでも達成され得る。双安定性マイクロミラーアレイのような光電子ディジタル光加工システムは反射調節を提供し、双安定性のシステムの回折性類似物も同様である。マイクロミラーのシステムおよびその操作については、1997年3月11日に発行されたSampsell、米国特許第5,610,625号（Texas Instruments Incorporated）に記載されている。

選択された細胞亜集団の標識の変換であろうと、選択された亜集団以外の標識の変換であろうと、標識の変換が達成されれば、その後、関心対象の細胞が残りの細胞から区別され、細胞集団全体を、それが接着する表面または本体から剥離し、続いて剥離した状態で、変換された標識に基づいて選別することができる。剥離は当技術分野において公知の方法によって容易に達成され、中でも顕著なものはトリプシン処理であり、この場合、細胞は、細胞を基材に結びつけている化学結合を切断するプロテアーゼであるトリプシンに曝露される。多くの場合、かき取り道具の使用によるような機械的な剥離も有効である。

変換された標識と変換されていない標識との識別を介した選別は、接着状態の細胞または接着状態から細胞を解放した後のいずれに達成してもよい。細胞の解放後および標識の蛍光に基づく選別のためには、非接着細胞は担体液体中に懸濁して、蛍光標示式細胞分取法（FACS）または任意の同等の技術によりフローサイトメーターで選別することができる。蛍光標示式細胞分取法に関する記載は、Bonner, W.A., et al., "Fluorescence Activated Cell Sorting," Rev. Sci. Instr. 43(1), 404-409 (1972)、および1973年9月25日に発行されたDittrich, W.M., et al., 米国特許第3,761,187号に見出される。磁性または分極に基づく選別は、当業者に公知である適切なソーターの使用によって同様に達成され得る。

本明細書に添付される特許請求の範囲において、「一つ（a）」または「一つ（an）」という用語は「一つまたは複数」を意味することを意図し、「含む（comprise）」ならびに「含む（comprises）」および「含んでいる（comprising）」のようなその変化形は、工程または要素の詳述に先行する場合は、さらなる工程または要素の付加が任意であり、除外されないことを意味することを意図する。本明細書に引用されるすべての特許、特許出願、およびその他の刊行された参考資料は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。本明細書に引用される任意の参考資料または一般的な任意の先行技術と本明細書の明示的な教示との間の矛盾はいずれも、本明細書における教示を支持して解消されることを意図する。これは、単語またはフレーズに関して当技術分野で理解されている定義と、同一の単語またはフレーズに関して本明細書で例示的に示される定義との間のあらゆる矛盾を含む。

Claims (19)

1. 生物学的な接着細胞の集団を、該集団のその他の細胞によって共有されない特徴を有する選択された細胞亜集団を検出するように選別するための方法であって、以下の工程を含む方法：
   （a）該集団のすべての細胞が接着性の形態である間に、
   （i）エネルギーへと曝露されたときに変換することができる変換可能な標識で、該亜集団の細胞および該亜集団の細胞ではない細胞を標識する工程であって、変換が、該エネルギーに曝露されていない標識と比較して標識に検出可能な差をもたらし、検出可能な差が、標識された細胞を接着性の形態から非接着性の形態に変換させたときに維持される、前記工程
   （ii）該亜集団に属するかまたは該亜集団に属さない該集団の個々の細胞を同定する工程、および
   （iii）そのように同定された個々の細胞を標識を変換するエネルギーに特異的に曝露し、そのように曝露された細胞上の標識を変換する工程；
   （b）その後、該集団の接着性の形態の細胞を非接着性の形態に変換する工程；ならびに
   （c）該集団の細胞が非接着性の形態である間、かつ標識を変換するエネルギーに曝露されている標識と標識を変換するエネルギーに曝露されていない標識との間の差が検出可能である間に、そのように変換された標識を有する細胞を、そのようには変換されていない標識を有する細胞から区別することによって、該亜集団の細胞と該亜集団以外の細胞とを識別するように該集団を選別する工程。
2. 工程（a）が、既定の二次元アレイに配置された前記集団のすべての細胞を用いて実施され、かつ
   工程（a）が、
   該アレイにおける前記亜集団の細胞のそれぞれの二次元座標を決定すること、および標識を変換するエネルギーを、該座標かまたは該座標以外の該アレイの位置かのいずれかに対して方向付けること
   をさらに含む、請求項1記載の方法。
3. 標識を変換するエネルギーが、光エネルギーである、請求項1記載の方法。
4. 標識が、光活性化可能蛍光標識であり、かつ標識を変換するエネルギーが、光エネルギーである、請求項1記載の方法。
5. 標識が、光切り替え可能な（photoswitchable）蛍光標識であり、かつ標識を変換するエネルギーが、光エネルギーである、請求項1記載の方法。
6. 標識が、蛍光標識であり、かつ標識を変換するエネルギーが、入射光に対して該標識を非反応性とするのに十分な光エネルギーであり、そうでなければ該入射光は、該標識の蛍光発光反応を作動させるものである、請求項1記載の方法。
7. 標識が、感光性プローブであり、かつ標識を変換するエネルギーが、該プローブを検出可能とするのに十分な光エネルギーである、請求項1記載の方法。
8. 標識が、脂質ナノカプセルに被包された検出可能な種であり、かつ標識を変換するエネルギーが、該脂質ナノカプセルを破裂させてそれによって検出可能な該種を放出させるのに十分な光エネルギーである、請求項1記載の方法。
9. 工程（a）が、既定の二次元アレイに配置された前記集団のすべての細胞を用いて実施され、かつ工程（a）の優先的曝露が、標識を変換するエネルギーの供給源を用いて該アレイを走査することによって実施される、請求項1記載の方法。
10. 走査がレーザーによって実施される、請求項9記載の方法。
11. 工程（a）が、既定の二次元アレイに配置された前記集団のすべての細胞を用いて実施され、かつ工程（a）の優先的曝露が、二次元にパターン化されたエネルギー伝達によって該アレイ全体で同時に実施される、請求項1記載の方法。
12. 二次元にパターン化されたエネルギー伝達が、空間的な光モジュレーターによって達成される、請求項11記載の方法。
13. 前記同定する工程が画像解析により行われる、請求項1記載の方法。
14. 前記特徴が、集団の細胞が接着性の形態であるときのみに存在する、請求項1記載の方法。
15. 前記特徴が、細胞表面上のマーカーから生じる、請求項1記載の方法。
16. 前記特徴が、細胞のサイズ、細胞の形状、および細胞の形態からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
17. 工程（c）が、蛍光表示式細胞分取法（FACS）を用いて実行される、請求項1記載の方法。
18. 光活性化可能蛍光標識がタンパク質である、請求項4記載の方法。
19. タンパク質が、Dendra2、IrisFP、tdEosFP、mEos2、PA-Cherry 1、mKik:GR、Fast-FT、Medium-FT、Slow-FT、Kindling蛍光タンパク質、およびDronpaタンパク質からなる群より選択される、請求項18記載の方法。