JP5892665B2 - 標識の選択的変換による接着細胞の選別方法 - Google Patents
標識の選択的変換による接着細胞の選別方法 Download PDFInfo
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Description
本出願は、参照によりその内容が本明細書に組み入れられる2010年11月22日出願の米国特許仮出願第61/416,012号の恩典を主張する。
1.発明の分野
本発明は、細胞選別の分野、即ち、関心対象の特定の特徴を有する生物学的な細胞とその関心対象の特徴を持たないその他の細胞との双方を含む細胞集団から、その関心対象の特徴を有する生物学的な細胞を選択する分野に属する。
より大きな集団から特定の特徴を有する細胞を選択するための生物学的な細胞の選別は、ゲノム研究、幹細胞研究、および細胞ベースのスクリーニングのために生物学的な実験室において頻繁に用いられる手順である。選別によって、特定の特徴を持つ個々の細胞を、カウント、より詳細な研究、採取または処理のために、同定および単離することができるようになる。選別は、一般に、細胞の集団全体を液体の担体に分散させて懸濁液を生成し、続いて、フローサイトメトリーにより懸濁液を分析して関心対象の細胞を検出しかつ分離するかまたは個々に処理するかのいずれかによって実施される。しかし、この方法は、生物学的な細胞の最も一般的な表現型である接着細胞には適切でない。接着細胞は、酵素的または機械的な手段によって非接着性とされる、つまり、それらが生育する表面からまたはそれらが接着する他の細胞から剥離され得るが、剥離は細胞の健康に悪影響を及ぼし、細胞の形態および形態に関連する細胞内プロセスを変化させる。剥離は、また、選別の根拠となる特徴をしばしば含む糸状仮足および局在型膜タンパク質などの細胞表面の様々な追跡可能なマーカーを除去する。
本明細書に開示する方法は、接着細胞を、接着状態においてのみ存在する特徴を含む細胞の任意の特徴に基づいて選別するが、該細胞が接着状態にあるかまたは非接着状態へと解放されたかどうかに依存しない手段によって選別する方法である。したがって、この方法は、選別の期間中、細胞を接着状態に維持する必要がなく、それにも関わらず、接着状態のときに観察される関心対象の特徴を持つ細胞を識別することができる。この結果は、検出可能でさらに変換可能な標識を、接着状態にある細胞集団全体に対して適用すること、および一つまたは複数の細胞亜集団を、曝露された標識を優先的な曝露を受けなかった標識と区別することができる状態へと変換する外部から適用されるエネルギーに優先的に曝露することによって達成され、この優先的な曝露は、生じた差が、細胞集団全体をひとたび接着状態から解放すると維持されるような方法で、実施される。優先的な曝露を受ける亜集団は、関心対象の特徴を有する細胞またはこれらの特徴を有する細胞以外の細胞のいずれからなってもよい。いずれの場合も、選択のベースとなる細胞の特徴は、細胞のサイズ、細胞の形状、または細胞の任意のその他の、表面もしくは細胞内特性、状態、もしくは形態であり得、さらには細胞がまだ接着状態にある間になされたものであり得る。曝露の後、細胞が依然接着状態であろうと、細胞が接着状態から解放された後であろうと、細胞は曝露された標識と曝露されていない標識との間の差に基づいて選別される。選別前に細胞が接着状態から解放される本発明の態様では、本明細書に記載されるように、標識が、細胞に適用された後に選択的に変換される場合には、前記の先行技術において見られる細胞の損傷および細胞形態の変化によって細胞の正確な選別が妨げられることはない。
[本発明1001]
生物学的な接着細胞の集団を、該集団のその他の細胞によって共有されない特徴を有する選択された細胞亜集団を検出するように選別するための方法であって、以下の工程を含む方法:
(a)集団のすべての細胞が接着性の形態である間に、エネルギーへと曝露されたときに変換可能である標識で、該集団のすべての細胞を標識し、かつ
そのように変換された標識とそのようには変換されていない標識との間の区別を可能にすべくそのように曝露された細胞上の標識を変換するために、該亜集団の細胞または該亜集団以外の該集団の細胞のいずれかを、標識を変換するエネルギーに優先的に曝露する工程;および
(b)そのように変換された標識を有する細胞を、そのようには変換されていない標識を有する細胞から区別することによって、該亜集団の細胞と該亜集団以外の細胞とを識別するように該集団を選別する工程。
[本発明1002]
工程(a)と工程(b)との間において前記集団のすべての細胞を非接着性の形態に転換すること、および該集団の非接着性の形態のすべての細胞に対して工程(b)を実施することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
工程(a)が、既定の二次元アレイに配置された前記集団のすべての細胞を用いて実施され、かつ
工程(a)が、
該アレイにおける前記亜集団の細胞のそれぞれの二次元座標を決定すること、および標識を変換するエネルギーを、該座標かまたは該座標以外の該アレイの位置かのいずれかに対して方向付けること
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
標識を変換するエネルギーが、光エネルギーである、本発明1001の方法。
[本発明1005]
標識を変換するエネルギーが、熱エネルギーである、本発明1001の方法。
[本発明1006]
標識を変換するエネルギーが、高周波エネルギーである、本発明1001の方法。
[本発明1007]
標識が、光活性化可能蛍光標識であり、かつ標識を変換するエネルギーが、光エネルギーである、本発明1001の方法。
[本発明1008]
標識が、光切り替え可能な(photoswitchable)蛍光標識であり、かつ標識を変換するエネルギーが、光エネルギーである、本発明1001の方法。
[本発明1009]
標識が、蛍光標識であり、かつ標識を変換するエネルギーが、入射光に対して該標識を非反応性とするのに十分な光エネルギーであり、そうでなければ該入射光は、該標識の蛍光発光反応を作動させるものである、本発明1001の方法。
[本発明1010]
標識が、磁気的に反応性の粒子であり、かつ標識を変換するエネルギーが、該粒子を消磁するのに十分な熱エネルギーである、本発明1001の方法。
[本発明1011]
標識が、磁気的に分極した粒子であり、かつ標識を変換するエネルギーが、該粒子の分極の変化をもたらすのに十分な熱エネルギーである、本発明1001の方法。
[本発明1012]
標識が、感光性プローブであり、かつ標識を変換するエネルギーが、該プローブを検出可能とするのに十分な光エネルギーである、本発明1001の方法。
[本発明1013]
標識が、脂質ナノカプセルに被包された検出可能な種であり、かつ標識を変換するエネルギーが、該脂質ナノカプセルを破裂させてそれによって検出可能な該種を放出させるのに十分な光エネルギーである、本発明1001の方法。
[本発明1014]
工程(a)が、既定の二次元アレイに配置された前記集団のすべての細胞を用いて実施され、かつ工程(a)の優先的曝露が、標識を変換するエネルギーの供給源を用いて該アレイを走査することによって実施される、本発明1001の方法。
[本発明1015]
走査がレーザーによって実施される、本発明1014の方法。
[本発明1016]
工程(a)が、既定の二次元アレイに配置された前記集団のすべての細胞を用いて実施され、かつ工程(a)の優先的曝露が、二次元にパターン化されたエネルギー伝達によって該アレイ全体で同時に実施される、本発明1001の方法。
[本発明1017]
二次元にパターン化されたエネルギー伝達が、空間的な光モジュレーターによって達成される、本発明1016の方法。
「接着細胞」は、原核性または真核性に関わらず、基材の表面に結合、固定、またはそうでなければ接触したままであり、洗浄もしくは培地交換の手順を経てもその状態を維持する細胞、細胞株、および細胞系を指す。接着細胞として生育または表面上に固定され得る細胞の例は、主たる肝細胞および肝臓上皮細胞を含む肝臓の細胞または肝臓由来の細胞、一般的な上皮細胞、一般的な内皮細胞、神経細胞、間葉細胞、膵臓細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、癌由来の細胞、骨髄細胞、ランゲルハンス島、副腎髄質細胞、骨芽細胞、破骨細胞、Tリンパ球、ニューロン、グリア細胞、神経節細胞、網膜細胞、および筋芽細胞である。幹細胞も用いられ得る;例は間葉幹細胞、神経幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、マウス胚幹細胞、およびヒト胚幹細胞である。その他の多くの例が存在し、当業者には容易に明らかである。
Claims (19)
- 生物学的な接着細胞の集団を、該集団のその他の細胞によって共有されない特徴を有する選択された細胞亜集団を検出するように選別するための方法であって、以下の工程を含む方法:
(a)該集団のすべての細胞が接着性の形態である間に、
(i)エネルギーへと曝露されたときに変換することができる変換可能な標識で、該亜集団の細胞および該亜集団の細胞ではない細胞を標識する工程であって、変換が、該エネルギーに曝露されていない標識と比較して標識に検出可能な差をもたらし、検出可能な差が、標識された細胞を接着性の形態から非接着性の形態に変換させたときに維持される、前記工程
(ii)該亜集団に属するかまたは該亜集団に属さない該集団の個々の細胞を同定する工程、および
(iii)そのように同定された個々の細胞を標識を変換するエネルギーに特異的に曝露し、そのように曝露された細胞上の標識を変換する工程;
(b)その後、該集団の接着性の形態の細胞を非接着性の形態に変換する工程;ならびに
(c)該集団の細胞が非接着性の形態である間、かつ標識を変換するエネルギーに曝露されている標識と標識を変換するエネルギーに曝露されていない標識との間の差が検出可能である間に、そのように変換された標識を有する細胞を、そのようには変換されていない標識を有する細胞から区別することによって、該亜集団の細胞と該亜集団以外の細胞とを識別するように該集団を選別する工程。 - 工程(a)が、既定の二次元アレイに配置された前記集団のすべての細胞を用いて実施され、かつ
工程(a)が、
該アレイにおける前記亜集団の細胞のそれぞれの二次元座標を決定すること、および標識を変換するエネルギーを、該座標かまたは該座標以外の該アレイの位置かのいずれかに対して方向付けること
をさらに含む、請求項1記載の方法。 - 標識を変換するエネルギーが、光エネルギーである、請求項1記載の方法。
- 標識が、光活性化可能蛍光標識であり、かつ標識を変換するエネルギーが、光エネルギーである、請求項1記載の方法。
- 標識が、光切り替え可能な(photoswitchable)蛍光標識であり、かつ標識を変換するエネルギーが、光エネルギーである、請求項1記載の方法。
- 標識が、蛍光標識であり、かつ標識を変換するエネルギーが、入射光に対して該標識を非反応性とするのに十分な光エネルギーであり、そうでなければ該入射光は、該標識の蛍光発光反応を作動させるものである、請求項1記載の方法。
- 標識が、感光性プローブであり、かつ標識を変換するエネルギーが、該プローブを検出可能とするのに十分な光エネルギーである、請求項1記載の方法。
- 標識が、脂質ナノカプセルに被包された検出可能な種であり、かつ標識を変換するエネルギーが、該脂質ナノカプセルを破裂させてそれによって検出可能な該種を放出させるのに十分な光エネルギーである、請求項1記載の方法。
- 工程(a)が、既定の二次元アレイに配置された前記集団のすべての細胞を用いて実施され、かつ工程(a)の優先的曝露が、標識を変換するエネルギーの供給源を用いて該アレイを走査することによって実施される、請求項1記載の方法。
- 走査がレーザーによって実施される、請求項9記載の方法。
- 工程(a)が、既定の二次元アレイに配置された前記集団のすべての細胞を用いて実施され、かつ工程(a)の優先的曝露が、二次元にパターン化されたエネルギー伝達によって該アレイ全体で同時に実施される、請求項1記載の方法。
- 二次元にパターン化されたエネルギー伝達が、空間的な光モジュレーターによって達成される、請求項11記載の方法。
- 前記同定する工程が画像解析により行われる、請求項1記載の方法。
- 前記特徴が、集団の細胞が接着性の形態であるときのみに存在する、請求項1記載の方法。
- 前記特徴が、細胞表面上のマーカーから生じる、請求項1記載の方法。
- 前記特徴が、細胞のサイズ、細胞の形状、および細胞の形態からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 工程(c)が、蛍光表示式細胞分取法(FACS)を用いて実行される、請求項1記載の方法。
- 光活性化可能蛍光標識がタンパク質である、請求項4記載の方法。
- タンパク質が、Dendra2、IrisFP、tdEosFP、mEos2、PA-Cherry 1、mKik:GR、Fast-FT、Medium-FT、Slow-FT、Kindling蛍光タンパク質、およびDronpaタンパク質からなる群より選択される、請求項18記載の方法。
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