MXPA01000583A - Un sistema de seleccion basado en celulas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona sistemas, metodos y selecciones para medir la internalizacion de un receptor en un solo paso, con automatizacion y rendimientos adecuados. Este metodo implica el marcaje luminiscente del receptor de interes y la medicion automatizada de la internalizacion del receptor a una ubicacion perinuclear.

Description

UN SISTEMA DE SELECCION BASADO EN CELULAS Campo de la invención Esta invención se encuentra en el campo de los ensayos bioquímicos celulares y moleculares basados en la fluorescencia para descubrir fármacos.

Antecedentes de la invención El descubrimiento de fármacos, como se practica actualmente en la técnica, es un proceso largo, de múltiples pasos, que implica la identificación de objetivos de enfermedades específicas, el desarrollo de un ensayo basado en un objetivo específico, la validación del ensayo, la optimización y automatización del ensayo para producir una selección, una selección de alto rendimiento de bibliotecas de compuestos utilizando el ensayo para identificar "aciertos" , la validación de acierto y la optimización del compuesto acertado. El producto de este proceso es un compuesto líder que va a ensayos preclínicos y que, si es validado, eventualmente a ensayos clínicos. En este proceso, la fase de selección es distinta a las fases de desarrollo del ensayo e implica probar la eficacia del compuesto en sistemas biológicos vivientes.

Históricamente, el descubrimiento de fármacos es un proceso lento y costoso, que dura numerosos años y que consume cientos de millones de dólares por fármaco creado. Los desarrollos en las áreas genómica y de selección de alto rendimiento han dado como resultado un incremento en la capacidad y eficiencia en las áreas de identif cación de objetivos y volumen de compuestos seleccionados. Los avances significativos en el secuenciamiento automatizado del ADN, aplicación de la PCR, clonación posicional, arreglos de hibridación, y bioinformática han incrementado en gran medida el número de genes (y fragmentos de genes) que codifican para objetivos para la selección de fármacos potenciales. Sin embargo, el esquema básico para la selección de fármacos sigue siendo el mismo. La validación de objetivos genómicos para la intervención terapéutica utilizando los métodos y protocolos existentes se ha convertido en un cuello de botella en el proceso de descubrimiento de fármacos debido a los métodos manuales, lentos, empleados, tales como los modelos funcionales in vivo, el análisis funcional de proteínas recombinantes , y la expresión de una línea celular estable de genes candidatos. Los datos de la secuencia de ADN primaria adquiridos a través del secuenciamiento automatizado no permiten la identificación de la función del gen, pero pueden proporcionar información acerca de "motivos" comunes y homología genética específica cuando se comparan con bases de datos de secuencias conocidas. Los métodos genómicos tales como la hibridación por sustracción y ARED (amplificación rápida de la expresión diferencial) pueden ser utilizados para identificar genes que son regulados de manera ascendente o descendente en un modelo de estado de enfermedad. Sin embargo, la identificación y validación siguen procediendo por la misma vía. Algunos métodos proteómicos utilizan la identificación de proteínas (arreglos de expresión global, electroforesis 2D, bibliotecas combinadas) en combinación con la genética inductiva para identificar genes candidatos de interés. Tales "secuencias asociadas con enfermedades" o SAE putativas aisladas como ADNc intacto son una gran ventaja para esos métodos, pero son identificadas por cientos sin proporcionar ninguna información con respecto al tipo, actividad y distribución de la proteína codificada. La elección de un subconjunto de SAE objetivos para seleccionar fármacos es "aleatoria", y de este modo extremadamente ineficiente, sin datos funcionales para proporcionar un enlace mecanístico con la enfermedad. Es necesario, por lo tanto, proporcionar nuevas tecnologías para SAE de selección, rápidamente, para establecer la función biológica, mejorando por lo tanto la validación del objetivo y la optimización del candidato en el descubrimiento de fármacos . Existen tres avenidas principales para mejorar la productividad del descubrimiento de fármacos inicial . Primera, existe la necesidad de herramientas que proporcionen mayor capacidad de manejo de información. La bioinformática ha florecido con el rápido desarrollo de los sistemas de secuenciamiento de ADN y la evolución de las bases de datos genómicas . La genómica está comenzando a jugar un papel crítico en la identificación de nuevos objetivos potenciales. La proteómica se ha vuelto indispensable en la relación de la estructura y función de objetivos de proteína para predecir interacciones entre fármacos. Sin embargo, el siguiente nivel de complejidad biológica es la célula. Por lo tanto, existe la necesidad de adquirir, manejar y buscar información multidimensional de las células. Segunda, existe la necesidad de herramientas de mayor rendimiento. La automatización es una clave para mejorar la productividad como ya ha sido demostrado en el secuenciamiento del ADN y la selección primaria de alto rendimiento. La presente invención proporciona sistemas automatizados que extraen información de múltiples parámetros de las células que satisfacen la necesidad de herramientas de alto rendimiento. La presente invención también se proporciona para la miniaturización de los métodos, permitiendo por lo tanto, un mayor rendimiento, disminuyendo a la vez, los volúmenes de reactivos y compuestos de prueba requeridos en cada ensayo. La radioactividad ha sido la lectura dominante en los ensayos de descubrimiento de fármacos anteriores . Sin embargo, la necesidad de más información, mayor rendimiento y miniaturización ha producido un desplazamiento hacia el uso de la detección por fluorescencia. Los reactivos basados en la fluorescencia pueden producir ensayos de múltiples parámetros, más poderosos, de mayor rendimiento y contenido de información y requieren menos volúmenes de reactivos y compuestos de prueba. La fluorescencia es también más segura y menos cara que los métodos basados en la radioactividad . La selección de células tratadas con tintes y reactivos fluorescentes es bien conocida en la técnica. Existe un cuerpo considerable de literatura relacionada con la ingeniería genética de las células para producir proteínas fluorescentes, tales como la proteína fluorescente verde modificada (PFV) , como molécula reportera. Algunas de las propiedades de la PFV son descritas por orise et al. {Biochemistry 13 (1974), p. 2656-2662), y Ward et al. (Photoche . Photobiol . 31 (1980), p. 611-615). La PFV de la medusa Aequorea victoria tiene un máximo de excitación a 395 nm y un máximo de emisión a 510 nm, y no requiere un factor exógeno para la actividad fluorescente. Los usos de la PFV descritos en la literatura son amplios e incluyen el estudio de la expresión de genes y la localización de proteínas (Chalfie et al., Science 263 (1994), p. 12501-12504)), como una herramienta para visualizar organelos subcelulares (Rizzuto et al., Curr. Biology 5(1995), p. 635-642)), visualización del transporte de proteínas a lo largo de la vía secretora (Kaether y Gerdes, FEBS Letters 369 (1995) , p 267-271) ) , expresión en células vegetales (Hu y Cheng, FEBS Letters 369 (1995), p. 331-334)) y embriones de Drosophila (Davis et al., Dev. Biology 170 (1995), p. 726-729)), y como una molécula reportera fusionada a otra proteína de interés (Patente Estadounidense No. 5,491,084). De manera similar, la W096/23898 se relaciona con métodos para detectar sustancias biológicamente activas que afectan los procesos intracelulares mediante el uso de un constructo de PFV que tiene un sitio de activación de proteína cinasa. Esta patente, y todas las otras patentes a las que se hace referencia en esta solicitud, se incorporan como referencia en su totalidad . Numerosas referencias se relacionan con proteínas PFV en sistemas biológicos. Por ejemplo la WO 96/09598 describe un sistema para aislar células de interés utilizando la expresión de una célula de interés a la PFV. La WO 96/27675 describe la expresión de la PFV en plantas. La WO 95/21191 describe la proteína PFV modificada expresada en organismos transformados para detectar mutagénesis. Las patentes Estadounidenses 5,401,629 y 5,436,128 describen ensayos y composiciones para detectar y evaluar la transducción intracelular de una señal extracelular utilizando células recombinantes que expresan receptores de la superficie celular y contienen constructos de genes reporteros que incluyen elementos reguladores transcripcionales que son responsables de la actividad de los receptores de la superficie celular.

Efectuar la selección sobre muchos miles de compuestos requiere el manejo y procesamiento paralelo de muchos compuestos y reactivos componentes del ensayo. Las selecciones de alto rendimiento estándar ("SAS") utilizan mezclas de compuestos y reactivos biológicos junto con algún compuesto indicador cargado en arreglos de pozos en placas microtituladoras estándar con 96 ó 384 pozos. La señal medida de cada pozo, ya sea emisión de fluorescencia, densidad óptica, o radioactividad integra a la señal de todo el material en el pozo, que da un promedio de la población total de todas las moléculas en el pozo. La Science Applications International Corporation (SAIC) (130 Fifth Avenue, Seattle, WA. 98109) describe un lector de placas con formación de imágenes. Este sistema utiliza una cámara CCD para formar la imagen del área completa de una placa de 96 pozos . La imagen es analizada para calcular la fluorescencia total por pozo para todo el material en el pozo. La Molecular Devices, Inc. (Sunnyvale, CA) describe un sistema (FLIPR) el cual utiliza iluminación de exploración láser de ángulo bajo y una máscara para excitar selectivamente la fluorescencia dentro de aproximadamente 200 micrones de los fondos de los pozos de placas de 96 pozos estándar, para reducir el ruido de fondo cuando se formen las imágenes de monocapas celulares. Este sistema utiliza una cámara CCD para formar la imagen del área completa del fondo de la placa. Aunque este sistema mide las señales que se originan de una monocapa celular en el fondo del pozo, la señal medida es promediada sobre el área del pozo y es por lo tanto, considerada aún una medición de la respuesta promedio de una población de células. La imagen es analizada para calcular la fluorescencia total por pozo para ensayos basados en células. También han sido incorporados dispositivos distribuidores de fluido en los sistemas de selección basados en células, tales como el sistema FLIPR, para iniciar una respuesta, la cual es entonces observada como una respuesta promedio de toda la población del pozo utilizando un sistema de formación de macroimágenes . En contraste con las selecciones de alto rendimiento, se han desarrollado varias selecciones de alto contenido ("SAC") para resolver la necesidad de información más detallada acerca de la dinámica temporal-espacial de los constituyentes y procesos celulares. Las selecciones de alto contenido automatizan la extracción de la información de fluorescencia multicolor derivada de reactivos basados en la fluorescencia específicos incorporados en las células (Giuliano y Taylor (1995) , Curr. Op. Cell Biol . 7:4; Giulano et al. (1995) Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24:405). Las células son analizadas utilizando un sistema óptico que puede medir la dinámica espacial, así como temporal. (Farkas et al (1993) Ann. Rev. Physiol. 55:785; Giuliano et al. (1990) En Optical Microscopy for Biology. B. Hernán y K. Jacobson (eds.), pp. 543-557. Wiley-Liss. New York; Hahn et al (1992) iVature 359:736; Waggoner et al. (1996) Hum. Pathol. 27:494). El concepto es tratar cada célula con un "pozo" que tiene información espacial y temporal sobre las actividades de los constituyentes marcados. Los tipos de información bioquímica y molecular ahora accesibles a través de reactivos basados en la fluorescencia aplicados a células, incluyen las concentraciones de iones, potencial de membrana, translocaciones específicas, actividades enzimáticas, expresión de genes, así como la presencia, cantidad y patrones de metabolitos, proteínas, lípidos, carbohidratos y secuencias de ácido nucleico (DeBiasio et al., (1196) Mol. Biol. Cell 7:1259; Giuliano et al., (1995) Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24:405; Heim y Tsien, (1996) Curr. Biol. 6:178).

Las selecciones de alto contenido pueden efectuarse sobre células fijadas, utilizando anticuerpos marcados de manera fluorescente, ligandos biológicos, y/o sondas de hibridación de ácido nucleico, o células vivas utilizando indicadores fluorescentes multicolor y "biosensores" . La elección de selecciones con células fijadas o vivas depende del ensayo basado en células específico requerido. Los ensayos con células fijadas son los más simples, puesto que un arreglo de células inicialmente vivientes en un formato de placa microtituladora puede ser tratado con varios compuestos y dosis que están siendo probadas, entonces las células pueden ser fijadas, marcadas con reactivos específicos, y medidas. No se requiere control ambiental de las células después de la fijación. Se adquiere información espacial, pero sólo en un punto en el tiempo. La disponibilidad de miles de anticuerpos, ligandos y sondas de hibridación de ácido nucleico que pueden aplicarse a las células hace éste un método atractivo para muchos tipos de selecciones basadas en células. Los pasos de fijación y mareaje pueden ser automatizados, permitiendo el procesamiento eficiente de los ensayos.

Los ensayos con células vivas son más sofisticados y poderosos, puesto que un arreglo de células vivientes que contiene los reactivos deseados puede ser seleccionado con el tiempo, así como en el espacio. Se requiere el control ambiental de las células (temperatura, humedad y dióxido de carbono) durante la medición, puesto que la salud fisiológica de las células debe ser mantenida para múltiples mediciones de fluorescencia con el tiempo. Existe una lista creciente de indicadores y "biosensores" fisiológicos fluorescentes que pueden reportar cambios en las actividades bioquímica y molecular dentro de las células (Giuliano et al., (1995) Ann. Rev. Biophys. Biomol . Struct. 24:405; Hahn et al., (1993) En Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. W. T. Masón, (ed) , pp. 349-359, Academic Press, San Diego) . La disponibilidad y uso de reactivos basados en la fluorescencia ha ayudado al avance del desarrollo de selecciones de alto contenido con células tanto fijadas como vivas. Los avances en la instrumentación para extraer automáticamente información de alto contenido, multicolor, recientemente ha hecho posible desarrollar SAS en una herramienta automatizada. En un artículo de Taylor, et al. {American Scientist 80 (1992), p. 332-335) se describen muchos de esos métodos y sus aplicaciones . Por ejemplo Proffitt et . al. {Cytometry 24:204-213 (1996) ) describe un sistema de formación de imágenes digitales de fluorescencia semiautomatizado para cuantificar números relativos de células in si tu en una variedad de formatos de placa de cultivo tisular, especialmente placas microtituladoras de 96 pozos. El sistema consiste de un microscopio de epifluorescencia invertido con una etapa motorizada, cámara de video, amplificador de imágenes, y una microcomputadora con un digitalizador PC-Vision. El programa Turbo Pascal controla la etapa y explora la placa tomando múltiples imágenes por pozo. El programa calcula la fluorescencia total por pozo, proporciona la calibración diaria, y se configura fácilmente para una variedad de cultivos de placa de cultivo tisular. Los umbrales de las imágenes digitales y reactivos que emiten fluorescencia sólo cuando son absorbidos por células vivientes son utilizados para reducir la fluorescencia de fondo sin remover el exceso de reactivo fluorescente. La formación de imágenes por microscopía confocal de exploración (Go et al. (1997) Analytical Biochemistry 247:210-215; Goldman et al., (1995) Experimental Cell Research 221:311-319) y la formación de imágenes por microscopía multifotónica (Denk et al., (1990) Science 248:73; Gratton et al., (1994) Proc. Of the Microscopical Society of America, pp. 154-155) son también métodos establecidos para adquirir imágenes de alta resolución de muestras microscópicas. La ventaja principal de esos sistemas ópticos es la muy poca profundidad del foco, lo cual permite que características de extensión axial limitada sean resueltas contra el fondo. Por ejemplo, es posible resolver características citoplásmicas internas de células adherentes de las características sobre la superficie celular. Debido a que la formación de imágenes multifotónicas de exploración requiere sistemas de láser pulsátil de muy corta duración para lograr el alto flujo de fotones requeridos, los tiempos de vida de la fluorescencia también pueden ser medidos en esos sistemas (Lakowicz et al., (1992) Anal. Biochem. 202:316-330; Gerrittsen et al. (1997), J. of Fluorescence 7:11-15)), proporcionando capacidad adicional para diferentes modos de detección. Sistemas láser pequeños, confiables y relativamente baratos, tales como láseres de los láseres bombeados por diodo, se encuentran ahora disponibles para permitir que la microscopía confocal multifotónica sea aplicada en una forma casi rutinaria.

Una combinación de la heterogeneidad biológica de las células en poblaciones (Bright, et al., (1989) . J. Cell. Physiol. 141:410; Giuliano, (1996) Cell Motil. Cytoskel. 35:237)), así como la alta frecuencia espacial y temporal de la información química y molecular presente dentro de las células, hace posible extraer información de alto contenido de poblaciones de células utilizando lectores de placa microtituladora completa existentes. No existe una plataforma de selección de alto contenido que haya sido diseñada para selecciones basadas en la fluorescencia, multicolor, que utilice células que sean analizadas individualmente. De manera similar, actualmente no está disponible un método que combine la distribución automatizada del fluido a arreglos de células para el propósito de seleccionar sistemáticamente compuestos por su capacidad para inducir una respuesta celular que sea identificada por el análisis SAC, especialmente de las células que crecen en placas microtituladoras . Además, no existen métodos en la técnica que combinen las mediciones pozo por pozo de alto rendimiento para identificar "aciertos" en un ensayo, seguidos por una segunda medición célula por célula de alto contenido sobre la misma placa de sólo aquellos pozos identificados como aciertos.

La presente invención proporciona sistemas, métodos y selecciones que combinan la selección de alto rendimiento (SAS) y la selección de alto contenido (SAC) que mejoran significativamente la validación del objetivo y la optimización del candidato combinando muchos formatos de selección celular con reactivos moleculares basados en la fluorescencia y la extracción de características basadas en computadora, análisis de datos, y automatización, dando como resultado una mayor cantidad y aceleración de la recolección de datos, tiempos de ciclo acortados, y, finalmente, una evaluación más rápida de fármacos candidatos prometedores. La presente invención también proporciona la miniaturización de los métodos, permitiendo por lo tanto, un mayor rendimiento, disminuyendo a la vez, los volúmenes de reactivos y compuestos de prueba requeridos en cada ensayo.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención proporciona métodos completamente automatizados para medir y analizar la internalización de la proteína receptora de la superficie celular durante la adquisición de imágenes. Este método implica el mareaje fluorescente del receptor de interés y la medición automatizada de la internalización del receptor en células estimuladas. En un aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos, medios de almacenamiento legibles en computadora, y equipos para identificar compuestos que inducen o inhiben la internalización de proteínas receptoras de la superficie celular, que comprenden tratar las células que poseen una proteína receptora de la superficie celular marcada de manera luminiscente con un compuesto de prueba, obtener señales luminiscentes de las células, convertir las señales luminiscentes en datos digitales, y utilizar los datos digitales para determinar si el compuesto de prueba ha inducido la internalización de la proteína receptora de la superficie celular marcada de manera luminiscente hacia la célula. Se proporcionan varias modalidades preferidas, que permiten la resolución y cuantificación espacial mejorada del efecto estimulador o inhibidor del compuesto de prueba sobre la internalización del receptor. En una de tales modalidades, los dominios extracelular e intracelular de una proteína receptora unida a la membrana son marcados cada uno con un marcador luminiscente distinto, para permitir la medición de la disponibilidad extracelular relativa de los dominios externo e interno de los receptores de la membrana. En otro aspecto de la invención, se proporcionan métodos combinados de alto rendimiento y alto contenido y un medio de almacenamiento legible en computadora asociado para identificar los compuestos que inducen o inhiben la internalización de las proteínas receptoras de la superficie celular. En este aspecto, las células son tratadas con un ligando para la proteína receptora de interés, el cual produce una señal detectable tras la estimulación de la proteína receptora. Las células son entonces tratadas con el compuesto de prueba, y a continuación exploradas en un modo de alto rendimiento para identificar a aquellas células que exhiben la señal detectable inducida por el ligando. Posteriormente, sólo aquellas células que exhibieron la señal detectable son exploradas en un modo de alto contenido, para determinar si el compuesto de prueba ha inducido la internalización de la proteína receptora de la superficie celular marcada de manera luminiscente a la célula . BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra un diagrama de los componentes del sistema de exploración basado en células.

La Figura 2 muestra un esquema del submontaje del microscopio. La Figura 3 muestra el submontaje de la cámara. La Figura 4 ilustra el proceso del sistema de exploración celular. La Figura 5 ilustra una interfaz de usuario que muestra las funciones principales para guiar al usuario. La Figura 6 es un diagrama de bloques de la arquitectura de dos plataformas del Sistema de Doble Modo para la Selección Basada en Células, en la cual una plataforma utiliza una lente telescópica para leer todos los pozos de una placa microtituladora y una segunda plataforma utiliza una lente de mayor amplificación para leer células individuales en un pozo. La Figura 7 es un detalle de un sistema óptico para una arquitectura de una sola plataforma del Sistema de Doble Modo para la Selección Basada en Células que utiliza una lente "telescópica" móvil para leer todos los pozos de una placa microtituladora y una lente de mayor amplificación móvil para leer células individuales en un pozo. La Figura 8 es una ilustración del sistema de distribución de fluido para adquirir datos cinéticos sobre el Sistema de Selecciona Basado en Células . La Figura 9 es un diagrama de flujo de los pasos de procesamiento para un sistema de exploración basado en células . La Figura 10 A-J ilustra la estrategia del Ensayo de Translocación Nuclear. La Figura 11 es un diagrama de flujo que define los pasos de procesamiento en el Sistema de Doble Modo para la Selección Basado en Células que combina la selección de alto rendimiento y alto contenido de las placas microtituladoras . La Figura 12 es un diagrama de flujo que define los pasos de procesamiento en el modo de Alto Rendimiento del Sistema de Selección Basado en Células. La Figura 13 es un diagrama de flujo que define los pasos de procesamiento en el modo de Alto Contenido del Sistema para la Selección Basado en Células. La Figura 14 es un diagrama de flujo que define los pasos de procesamiento requeridos para adquirir datos cinéticos en el modo de Alto Contenido del Sistema para la Selección Basado en Células.

La Figura 15 es un diagrama de flujo que define los pasos de procesamiento efectuados dentro de un pozo durante la adquisición de datos cinéticos. La Figura 16 es un ejemplo de datos de un inhibidor de la translocación conocido. La Figura 17 es un ejemplo de datos de un estimulador de la translocación conocido. La Figura 18 ilustra la presentación de datos en una representación visual gráfica. La Figura 19 es una ilustración de los datos del modo de Alto Rendimiento del Sistema para la Selección Basada en Células, un ejemplo de los datos pasados al modo de Alto Contenido, los datos adquiridos en el modo de alto contenido, y los resultados del análisis de esos datos. La Figura 20 muestra la medición de un citoplasma inducido por fármaco para la translocación nuclear. La Figura 21 ilustra una interfaz gráfica de usuario de la medición mostrada en la Figura 20. La Figura 22 ilustra la interfaz gráfica de usuario de la medición mostrada en la Figura 20.

La Figura 23 es una gráfica que representa los datos cinéticos obtenidos de las mediciones descritas en la Figura 20. La Figura 24 detalla la selección de alto contenido de apoptosis inducida por fármaco. La Figura 25 es una representación gráfica de datos de ensayos de validación de la selección de internalización PTHR. La Figura 26 es un diagrama de flujo para el procesamiento de señales. La Figura 27 es un diagrama de flujo para un procedimiento de autoenfoque a ser utilizado en el procesamiento de señales . La Figura 28 es un diagrama de flujo para el procedimiento de procesamiento de objetos a ser utilizado en el procesamiento de señales. La Figura 29 muestra una representación visual representativa de una pantalla de PC que muestra los datos de internalización del receptor presentando el conteo puntual de pozos individuales. La Figura 30 muestra una representación visual representativa de una pantalla de PC que muestra los datos de internalización del receptor presentados sobre una base de campo por campo.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Todas las patentes, solicitudes de patentes y otras referencias han sido incorporadas aguí como referencia en su totalidad. Como se utilizan aguí, los siguientes términos tienen los significados especificados : Marcadores de dominios celulares . Las sondas luminiscentes que tienen alta afinidad por constituyentes celulares específicos incluyendo organelos o moléculas específicas. Esas sondas pueden ser moléculas luminiscentes pequeñas o moléculas marcadas de manera fluorescente utilizadas como "reactivos de mareaje", "indicadores ambientales", o "biosensores" . Reactivos de mareaje. Los reactivos de mareaje incluyen, pero no se limitan a, macromoléculas marcadas de manera luminiscente incluyendo análogos de proteínas fluorescentes y biosensores, quimeras macromoleculares luminiscentes, incluyendo aquéllas formadas con la proteína fluorescente verde y mutantes de las mismas, anticuerpos primarios o secundarios marcados de manera luminiscente que reaccionan con los antígenos celulares implicados en una respuesta fisiológica, tinciones luminiscentes, tintes, y otras moléculas pequeñas.

Marcadores de translocaciones celulares. acromoléculas u organelos marcados de manera luminiscente que se mueven de un dominio celular a otro durante algún proceso celular o respuesta fisiológica. Los marcadores de la translocación pueden simplemente reportar la ubicación relativa a los marcadores de los dominios celulares o también pueden ser "biosensores" que reportan también alguna actividad bioquímica o m olecular . Biosensores. Macromoléculas que consisten de un dominio funcional biológico y una sonda o sondas luminiscentes que reportan los cambios ambientales que ocurren ya sea internamente o sobre su superficie. Una clase de macromoléculas marcadas de manera luminiscente diseñadas para detectar y reportar esos cambios han sido llamadas "biosensores proteicos fluorescentes" . El componente proteico del biosensor proporciona una porción de reconocimiento molecular altamente evolucionada. Una molécula fluorescente unida al componente proteico cerca de un sitio activo, transduce cambios ambientales en señales de fluorescencia que son detectadas utilizando un sistema con un resolución temporal y espacial apropiada, tal como el sistema de exploración celular de la presente invención. Debido a que la modulación de la actividad de la proteína nativa dentro de la célula viviente es reversible, y debido a que pueden diseñarse biosensores proteicos fluorescentes para detectar cambios reversibles en la actividad de la proteína, esos biosensores son esencialmente reutilizables. Secuencias asociadas con enfermedades ("SAE"). Este término se refiere a secuencias de ácido nucleico identificadas por técnicas estándar, tales como datos de secuencias de ADN primarias, métodos genómicos tales como la hibridación por sustracción y RADE, y métodos proteónticos en combinación con la genética inversa, como si se tratara de compuestos candidatos. El término no significa que la secuencia está asociada sólo con un estado de enfermedad. La selección de' alto contenido (SAC) puede ser utilizada para medir los efectos de fármacos sobre eventos moleculares complejos tales como vía de transducción de señales, así como funciones celulares, incluyendo, pero sin limitarse a, apoptois, división celular, adhesión celular, locomoción, exocitosis, y comunicación célula-célula. La fluorescencia multicolor permite que sean ensayados múltiples objetivos y procesos celulares en una sola selección. La correlación cruzada de respuestas celulares producirá una abundancia de información requerida para la validación de objetivos y conducir a la optimización. En un aspecto de la presente invención, se proporciona un sistema de selección celular que comprende un sistema óptico de fluorescencia de alta amplificación que tiene un objetivo de microscopio, una platina XY adaptada para sostener una placa con un arreglo de lugares para sostener células y que tiene medios para mover la placa para alinear los lugares con el objetivo del microscopio y medios para mover la placa en la dirección par efectuar el enfoque; una cámara digital; una fuente de luz que tiene medios ópticos para dirigir la luz de excitación a las células en el arreglo de lugares y medios para dirigir la luz fluorescente emitida de las células a la cámara digital; y medios de computadora para recibir y procesar datos digitales de la cámara digital, donde los medios de computadora incluyen: un sujetador de cuadro digital para recibir las imágenes de la cámara, un dispositivo de representación visual para la interacción del usuario y el dispositivo de representación visual de los resultados del ensayo, medios de almacenamiento digitales para almacenar y archivar, y medios de control, adquisición, procesamiento y presentación de resultados.

La Figura 1 es un diagrama esquemático de una modalidad preferida del sistema de exploración celular. Se utiliza un microscopio de fluorescencia invertida 1, tal como un microscopio de fluorescencia invertida Ze ss Axiovert, el cual utiliza objetivos estándar con amplificación de l-100x a la cámara, y una fuente de luz blanca (por ejemplo, lámpara de arco de mercurio de 100W o lámpara de xenón de 75W) con una fuente de energía 2. Existe una platina XY 3 para mover la placa 4 en la dirección XY sobre el objetivo del microscopio. Una unidad de foco en el eje Z 5 mueve el objetivo en la dirección Z para el enfoque. Una palanca de control manual é proporciona el movimiento manual de la platina en la dirección XYZ. Una cámara digital de alta resolución 7. adquiere imágenes de cada pozo o lugar sobre la placa. Existe una fuente de energía para la cámara 8., un controlador de automatización ¿ y una unidad de procesamiento central 10_. La PC 11 proporciona un dispositivo de representación visual 12 y tiene programas y sistemas de programación asociados. La impresora 13 proporciona la impresión de un registro impreso. La Figura 2 es un esquema de una modalidad del montaje del microscopio i de la invención, que muestra con mayor detalle la platina XY 3_, la unidad de enfoque del XZ 5_, la palanca de control manual 6_, la fuente de luz 2, y el controlador de automatización 2- Se proporcionan cables para la computadora 15 y el microscopio 16., respectivamente. Además, la Figura 2 muestra una placa microtituladora de 96 pozos 17. la cual se mueve sobre la platina XY 3 en la dirección XY. La luz de la fuente de luz 2 pasa a través del obturador controlado por la PC 1£ hacia una rueda de filtración motorizada JL9_ con filtros de excitación 20. La luz pasa hacia el cubo del filtro 25. el cual tiene un espejo dicróico 2£ y un filtro de emisión 27. La luz de excitación se refleja del espejo dicróico hacia los pozos en la placa microtituladora 17. y la luz fluorescente ¿8. pasa a través del espejo dicróico 26 y el filtro de emisión 27 en la cámara digital - La Figura 3 muestra un dibujo esquemático de un montaje de cámara preferido. La cámara digital 1, la cual contiene un obturador automático para el control de exposición y una fuente de energía 21, recibe luz fluorescente 28. del montaje del microscopio. Un cable digital ¿0 transporta señales digitales hacia la computadora . Las configuraciones ópticas estándar descritas anteriormente utilizan dispositivos ópticos microscópicos para producir directamente una imagen amplificada del espécimen sobre el sensor de la cámara para capturar una imagen de alta resolución del espécimen. Este sistema óptico se conoce comúnmente como microscopio de "campo amplio" . Aquellos expertos en la técnica de la microscopía reconocerán que una imagen de alta resolución del espécimen puede ser creada por una variedad de otros sistemas ópticos, incluyendo, pero sin limitarse, a la detección confocal de exploración estándar de un punto o línea de iluminación enfocada explorada sobre el espécimen (Go et al. 1997, supra) , y microscopía confocal de exploración multifotónica (Denk et al., 1990, supra), ambas de las cuales pueden formar imágenes sobre un detector CCD o por digitalización sincrónica de la salida analógica de un tubo fotomul iplicador . En aplicaciones de selección, con frecuencia es necesario utilizar una línea o cultivo celular primario particular, para tomar ventaja de las características particulares de aquellas células. Aquellos expertos en la técnica del cultivo celular reconocerán que algunas líneas celulares son inhibidas al contacto, lo que significa que dejarán de crecer cuando se vean rodeadas por otras células, mientras que otras líneas celulares continuarán creciendo bajo aquellas condiciones y las células literalmente se apilarán, formando muchas capas. Un ejemplo de una de tales líneas celulares es la línea HEK 293 (ATCC CRL-1573) . Se requiere un sistema óptico que pueda adquirir imágenes de una sola capa de células en preparaciones de capas múltiples para utilizarse con líneas celulares que tiendan a formar capas. La gran profundidad del campo de los microscopios de campo amplio produce una imagen que es una proyección a través de las muchas capas de células, haciendo el análisis de distribuciones espaciales subcelulares extremadamente difícil en células que forman capas. De manera alternativa, la muy poca profundidad del campo que puede lograrse en un microscopio confocal, (aproximadamente de 1 micrón) , permite la discriminación de una sola capa de células con alta resolución, simplificando la determinación de la distribución espacial subcelular. De manera similar, la formación de imágenes confocales es preferible cuando se requieren modos de detección tales como la formación de imágenes de un tiempo de vida de fluorescencia. El resultado de un aditamento de formación de imágenes confocales estándar para un microscopio es una imagen digital que puede ser convertida al mismo formato que las imágenes producidas por otras modalidades de sistemas para seleccionar o separar células descritas anteriormente, y por lo tanto, puede ser procesada exactamente de la misma manera que aquellas imágenes. El control, adquisición y análisis total de esta modalidad es esencialmente el mismo. La configuración óptica del sistema del microscopio confocal , es esencialmente la misma que se describió anteriormente, excepto por el eliminador y los detectores. Los sistemas de iluminación y detección requeridos para la microscopía confocal han sido diseñados como accesorios para ser unidos a sistemas ópticos de microscopios estándar cada uno de la presente invención (Zeiss, Alemania) . Esos sistemas ópticos alternativos por lo tanto pueden ser fácilmente integrados al sistema como se describió anteriormente. La Figura 4 ilustra una modalidad alternativa de la invención en la cual los arreglos celulares están en micropozos 4_0_ sobre una microplaca 41, descrita en la Solicitud Estadounidense copendiente S/N 08/865,341, incorporada aquí como referencia en su totalidad. Típicamente, la microplaca es de 20 mm por 30 mm en comparación con una placa microtituladora de 96 pozos estándar, la cual es de 86 mm por 129 mm. El arreglo de alta densidad de células sobre una microplaca permite que la imagen de la microplaca sea formada a una baja resolución, de unos cuantos micrones por pixel para lugares de alto rendimiento y particulares sobre la microplaca cuya imagen va a ser formada a una mayor resolución, de menos de 0.5 micrones por pixel. Esos dos modos de resolución ayudan a mejorar el rendimiento total del sistema. La cámara de la microplaca 42 sirve como sistema de distribución microfluidico para la adición de compuestos a células. La microplaca 4JL en la cámara de la microplaca 42. es colocada en un lector de microplacas XY 43. Los datos digitales son procesados como se describió anteriormente. El pequeño tamaño de este sistema de microplaca incrementa el rendimiento, reduce al mínimo el volumen de reactivo y permite el control de la distribución y colocación de las células para un análisis basado en células rápido y preciso. Los datos procesados pueden ser presentados sobre la pantalla de una PC n y hacerse parte de una base de datos de bioinformática 44. Esta base de datos no sólo permite almacenar y recuperar los datos obtenidos a través de los métodos de esta invención, sino que también permite la adquisición y almacenamiento de datos externos relacionados con células. La Figura 5 es un dispositivo de representación visual de PC que ilustra la operación de los programas y sistemas de programación. En una modalidad alternativa, un sistema de alto rendimiento (SAR) está acoplado directamente con la SAC sobre la misma plataforma o sobre dos plataformas separadas conectadas electrónicamente (por ejemplo vía una red de área local) . Esta modalidad de la invención, referida como un sistema óptico de doble modo, tiene la ventaja de incrementar el rendimiento de un SAC mediante el acoplamiento con un SAR y por lo tanto requiere una adquisición de análisis de datos de alta resolución más lenta sólo sobre el subconjunto pequeño de pozos que muestran una respuesta en el SAR acoplado . Los sistemas lectores de 'placa completa' de alto rendimiento son bien conocidos en la técnica y se utilizan comúnmente como un componente de un sistema SAR utilizado para seleccionar un gran número de compuestos (Beggs (1997), J. of Biomolec. Screening, 2:71-78, Macaffrey et al., (1996) J. Biomolec. Screening, 1:187-190) . En una modalidad de la selección basada en células de doble modo, se proporciona una arquitectura de dos plataformas en la cual la adquisición de alto rendimiento ocurre en una plataforma y la adquisición de alto contenido ocurre en una segunda plataforma (Figura 6) . El procesamiento ocurre en cada plataforma independientemente, con los resultados pasados sobre una interfaz o interconexión de red, o se utiliza un solo controlador para procesar los datos de ambas plataformas . Como se ilustra en la Figura 6, un sistema óptico de doble modo de dos plataformas ejemplificado consiste de dos instrumentos ópticos de luz, una plataforma de alto rendimiento £0_ y una plataforma de alto contenido £5, los cuales leen señales fluorescentes emitidas de células cultivas en placas microtituladoras sobre arreglos de micropozos sobre una microplaca, y se comunican entre sí vía una conexión electrónica <£ . La plataforma de alto rendimiento fLQ_ analiza todos los pozos en toda la placa ya sea en forma paralela o en serie rápidamente. Aquellos expertos en la técnica de la selección de separación reconocerán que existen muchos de tales sistemas lectores de alto rendimiento comercialmente disponibles que podrán ser integrados en un sistema de selección basadas en células de doble modo (Topcount (Packark Instruments, eriden, CT) ; Spectramax, Lumiskan (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) ; Fluoroscan (Labsystems, Beverly, MA) ) . La plataforma de alto contenido 65., como se describió anteriormente explora de pozo a pozo y adquiere y analiza datos de imágenes de alta resolución recolectados de células individuales dentro de un pozo. Programas y sistemas de programación SAR, que residen en la computadora del sistema £2, controlan el instrumento de alto rendimiento, y los resultados son presentados sobre el monitor 61. Los programas y sistemas de programación SAR, que residen en su sistema de computadora 6_Z, controlan los componentes físicos del instrumento de alto contenido 65_, dispositivos opcionales (por ejemplo cargados de placas, la cámara ambiental, el distribuidor de fluido) , analizan los datos de las imágenes digitales de la placa, presentan los resultados sobre el monitor £JL y manejan y administran los datos medidos en una base de datos integrada. Los dos sistemas también pueden compartir una sola computadora, caso en el cual todos los datos serían recolectados, procesados y presentados en esa computadora, sin la necesidad de una red de área local para transferir los datos. Las placas microtituladoras son transferidas del sistema de alto rendimiento al sistema de alto contenido 6_3 ya sea manualmente o por un dispositivo de transferencia de placas robótico, como es bien sabido en la técnica (Beggs (1997), supra; Macaffrey (1996) , supra) . En una modalidad preferida, el sistema óptico de doble modo utiliza un sistema de una sola plataforma (Figura 7) . Este consiste de dos módulos ópticos separados, un módulo SAC 203 y un módulo SAS 209 que pueden ser movilizados independiente o colectivamente, de modo que uno a la vez sea utilizado para recolectar datos de la placa microtituladora 201. La placa microtituladora 201 se encuentra montada en una platina X,Y motorizada, de modo que puede ser colocada para formar imágenes en cualquiera de los modos SAS o SAC. Después de recolectar y analizar los datos de los modos SAS como se describe más adelante, el módulo óptico SAS 209 se mueve fuera de la trayectoria óptica y el módulo óptico SAC 203 se mueve hacia la placa. El módulo óptico para la SAS 209 consiste de una lente de producción 214. un filtro de longitud de onda de excitación 213 y un espejo dicróico 210 , los cuales son utilizados para iluminar todo el fondo de la placa con una banda de longitud específica de un sistema de lámpara de microscopio convencional (no ilustrado) . La emisión de fluorescencia es recolectada a través del espejo dicróico 210 y el filtro de longitud de onda de ignición 211 por una lente 212. la cual forma una imagen sobre la cámara 216 con el sensor 215. El módulo óptico para la SAC 203 consiste de una lente de producción 208. un filtro de longitud de onda de excitación 207 y un espejo dicróico 204. los cuales son utilizados para iluminar la abertura posterior del objetivo del microscopio 202. y por lo tanto el campo de ese objetivo, de un sistema de iluminación de microscopio estándar (no mostrado) . La emisión de fluorescencia es recolectada por el objetivo del microscopio 202. pasa a través del espejo dicróico 204 y el filtro de longitud de onda de emisión 205 y es enfocada por una lente tubular 206 la cual forma una imagen sobre la misma cámara 216 con el sensor 215. En una modalidad alternativa de la presente invención, el sistema de selección o separación de células comprende además un dispositivo distribuidor de fluido para utilizarse con la modalidad de células vivas del método de selección o separación de células (véase más adelante) . La Figura 8 ejemplifica un dispositivo para distribuir fluido para utilizarse con el sistema de la invención. Este consiste de un banco de 12 bombas de jeringa 701 accionadas por un solo dispositivo de accionamiento de motor. Cada jeringa 702 tiene un tamaño de acuerdo al volumen a ser distribuido a cada pozo, típicamente de entre 1 y 100 µ??. Cada jeringa está unida vía una tubería flexible 703 a un banco similar de conectores, los cuales aceptan puntas de pipetas estándar 705. El banco de puntas de pipeta está unido a un sistema de accionamiento el cual puede ser bajado y elevado con relación a la placa microtituladora 706 para distribuir fluido a cada pozo. La placa está montada sobre una platina X, Y, que permite el movimiento con relación al sistema óptico 707 para propósitos de recolección de datos. Este montaje le permite a uno colocar las puntas de pipeta, o aún solo una punta de pipeta, para distribuir reactivo a todos los pozos sobre la placa. El banco de bombas de jeringa puede ser utilizado para distribuir fluido a 12 pozos simultáneamente, o a menos pozos removiendo algunas de las puntas . En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para analizar células, que comprende proporcionar un arreglo de lugares, los cuales contienen múltiples células, donde las células contienen una o más moléculas reporteras fluorescentes; explorar múltiples células en cada uno de los lugares que contienen células para obtener señales fluorescentes de la molécula reportera fluorescente en las células; convertir las señales digitales en células fluorescentes; y utilizar los datos digitales para determinar la distribución; ambiente o actividad de la molécula reportera fluorescente dentro de las células.

Arreglos Celulares Seleccionar grandes números de compuestos por su actividad con respecto a una función biológica particular requiere preparar arreglos de células para el manejo paralelo de células y reactivos. Las placas microtituladoras de 96 pozos estándar son de 86 mm por 129 mm, con diámetros de pozo de 6 mm con una separación de 9 mm, son utilizadas por su compatibilidad con los sistemas de carga automatizada y manejo robotico actuales. La microplaca es típicamente de 20 mm por 30 mm, con lugares para células que son de 100-200 micrones de dimensión con una separación de aproximadamente 500 micrones. Los métodos para fabricar microplacas se describen en la solicitud de Patente Estadounidense No. de Serie 08/865,341, incorporada aquí como referencia en su totalidad, las microplacas pueden consistir de capas coplanares de materiales a los cuales se adhieren células, con patrones de materiales a los cuales no se adhieren células, o las superficies tridimensionales grabadas con materiales con patrones similares. Para el propósito de la siguiente discusión, el término "pozo" y "micropozo" se refiere a un lugar en un arreglo de cualquier construcción al cual se adhieren células y dentro del cual se forman imágenes de las células . Las microplacas también pueden incluir canales para distribuir fluidos en los espacios entre los pozos. A más pequeño el formato de una microplaca se incrementa la eficiencia total del sistema reduciendo al mínimo las cantidades de reactivos, almacenamiento y manipulación durante la preparación y el movimiento total requerido para la operación de exploración. Además, toda el área de la microplaca puede ser sometida a la información de imágenes de manera más eficiente, permitiendo un segundo modo de operación para el lector de microplacas como se describe más adelante en este documento. Moléculas Reporteras de Fluorescencia Un componente principal del nuevo paradigma de descubrimiento de fármacos es una familia de reactivos fluorescentes y luminiscentes que crece continuamente, que son utilizados para medir la distribución temporal y espacial, el contenido, y actividad de iones ultracelulares , metabolitos , macromoléculas y organelos . Las clases de esos reactivos incluyen reactivos de mareaje que miden la distribución y cantidad de moléculas en células vivientes y fijadas, indicadores ambientales para reportar los eventos de transducción de señales en tiempo y espacio, y biosensores de proteínas fluorescentes para medir actividades moleculares objetivo dentro del células vivientes. Un método de parámetros múltiples que combina varios reactivos en una sola célula es una herramienta poderosa para el descubrimiento de f rmacos . El método de la presente invención se basa en la alta afinidad de moléculas fluorescentes o luminiscentes por componentes celulares específicos. La afinidad por componentes específicos es gobernada por fuerzas físicas tales como interacciones iónicas, unión covalente (la cual incluye la fusión quimérica con cromóforos, fluoróforos y lumíforos, basados en proteínas) , así como interacciones hidrofóbicas , potencial eléctrico, y, en algunos casos la captura simple dentro de un componente celular. Las sondas luminiscentes pueden ser moléculas pequeñas, macromoléculas marcadas, o proteínas diseñadas genéticamente, incluyendo pero sin limitarse a quimeras de proteína fluorescente verde. Aquellos expertos en la técnica reconocerán una amplia variedad de moléculas reportadas fluorescentes que pueden ser utilizadas en la presente invención, incluyendo, pero sin limitarse a, biomoléculas marcadas de manera fluorescente tales como proteínas, fosfolípidos y sondas de hibridación de ADN. De manera similar, han sido utilizados reactivos fluorescentes sintetizados específicamente con propiedades químicas de unión o asociación particulares como moléculas reporteras fluorescentes (Barak et al., (1997), J. Biol. Chem. 272-27497-27500; Southwick et al., (1990), Cytometry 11:418-430; Tsien (1989) en Methods in Cell Biology, Vol . 29 Taylor y Wang (eds., pp. 127-156). Los anticuerpos marcados de manera fluorescente son moléculas reporteras particularmente útiles debido a su alto grado de especificidad por la unión a un solo objetivo molecular en una mezcla de moléculas tan complejas como una célula o un tejido. Las sondas luminiscentes pueden ser sintetizadas dentro de la célula viviente o pueden ser transportadas hacia la célula vía varios modos no mecánicos, incluyendo la difusión, transporte facilitado o activo, transporte mediado por secuencia de señales, y absorción endocitótica o pinocitótica . Los métodos de carga a granel mecanizados, los cuales son bien conocidos en la técnica, también pueden ser utilizados para cargar sondas luminiscentes en células vivientes (Barber et al. (1996), Neuroscience Letters 207:17-20, Bright et al. (1996), Cytometry 24:226-233; McNeil (1989) en Methods in Cell Biology, Mol. 29, Taylor y Wang (eds.), pp. 153-173) . Esos métodos incluyen la electroporación y otros métodos mecánicos tales como la carga por decapado, la carga con perlas, la carga por impacto, la carga con jeringa, la carga hipertónica e hipotónica. Adicionalmente, las células pueden ser diseñadas genéticamente para expresar moléculas reporteras, tales como la PFV, acoplada a una proteína de interés como se describió anteriormente (Patente Estadounidense No. 5,491,084 de Chalfie y Prasher; Cubitt et al. (1995), Trends in Biochemical Science 20:448-455). Una vez en la célula, las sondas luminiscentes se acumulan en su dominio objetivo como resultado de interacciones específicas y de alta afinidad con el dominio objetivo u otros modos de inyección molecular tales como el transporte mediado por secuencias de señales. Las moléculas reporteras marcadas de manera fluorescente son útiles para determinar la ubicación, cantidad y ambiente químico del reportero. Por ejemplo, puede determinarse si el reportero está en un ambiente de membrana lipofílica o en un ambiente más acuoso (Giuliano et al . (1995J, Ann. Rev. Of Biophysics and Biomolecular Structure 24:405-434; Giuliano y Taylor (1995), Methods in Neuroscience 27:1-16). Cuando se ha determinado el pH del ambiente el reportero (Bright et al. (1989), J". Cell Biology 104:1019-1033; Giuliano et al. (1987), Anal. Biochem. 167:362-371; Thomas et al. (1979), Biochemistry 18:2210-2218). Puede determinarse si un reportero tiene un grupo quelante unido a un anión, tal como de Ca++, o no (Bright et al. (1989), En Methods in Cell Biology, Vol. 30, Taylor y ang (eds.), pp.157-192; Shimoura et al. (1988) J". of Biochemistry (Tokyo) 251:405-410; Tsien (1989) En Methods in Cell Biology, Vol. 30, Taylor y Wang (eds . ) , pp. 127-156) . Además, ciertos tipos de células dentro de un organismo pueden contener componentes que pueden ser marcados específicamente que pueden o no encontrarse en otros tipos de células. Por ejemplo, las células epiteliales con frecuencia contienen componentes de la membrana polarizados. Es decir, que esas células distribuyen asimétricamente macromoléculas a lo largo de la membrana plasmática. Las células del tejido conectivo o de soporte con frecuencia contienen gránulos en los cuales están atrapadas moléculas específicas para ese tipo de células (por ejemplo, heparina, histamina, serotonina, etc.) . La mayoría de las células del tejido muscular contienen un retículo sarcoplásmico, un organelo especializado cuya función es regular la concentración de iones calcio dentro del citoplasma celular. Muchas células del tejido nervioso contienen gránulos secretores y vesículas en las cuales se encuentran atrapadas neurohormonas o neurotransmisores . Por lo tanto, las moléculas fluorescentes pueden ser diseñadas para marcar no sólo componentes específicos dentro de células específicas, sino también células específicas dentro de una población de tipos de células mezcladas . Aquellos expertos en la técnica reconocerán una amplia variedad de formas de medir la fluorescencia. Por ejemplo, algunas moléculas reporteras fluorescentes exhiben un cambio en el espectro de excitación o emisión, algunas exhiben transferencia de energía de resonancia donde un reportero fluorescente pierde fluorescencia, mientras que un segundo gana fluorescencia, algunas exhiben una pérdida (enfriamiento) o aparición de fluorescencia, mientras que algunas reportan movimientos rotacionales (Giuliano, et al. (1995), Ann. Rev. of Biophysics and Biomol . Structure 24:405-434; Giuliano et al. (1995), Methods in Neuroscience 27:1-16).

Exploración de arreglos de células Refiriéndose a la Figura 9, se proporciona una modalidad preferida para analizar células que comprende parámetros dirigidos por el operador siendo seleccionados en base al ensayo que esté siendo conducido, la adquisición de datos por el sistema para seleccionar o separar células sobre la distribución de señales fluorescentes dentro de una muestra, y la revisión y análisis de datos interactivos. Al inicio de una exploración automatizada, el operador introduce información 100 que describe la muestra, especifica los parámetros del filtro y los canales fluorescentes para comparar las marcas biológicas que están siendo utilizadas y la información buscada, y a continuación ajusta los parámetros de la cámara para comparar la brillantez de la muestra. Por flexibilidad para manejar una gama de muestra, los programas permiten la detección de varios ajustes de parámetros utilizados para identificar los núcleos y el citoplasma, y la selección de diferentes reactivos fluorescentes, la identificación de células de interés en base a la morfología o brillantez, y los números de células a ser analizadas por pozo. Esos parámetros son almacenados en la base de datos del sistema para facilitar la recuperación por cada ensayo automatizado. El modo de identi icación de células, interactivo, del sistema, simplifica la selección de los límites del parámetro morfológico tales como el intervalo de tamaño, forma, e intensidad de las células a ser analizadas. El usuario especifica cuales pozos de la placa explorará el sistema y cuantos campos o cuantas células analizará en cada pozo. Dependiendo del modo de funcionamiento seleccionado por el usuario en el paso 101 , el sistema preenfoca automáticamente la región de la placa a ser explorada utilizando un procedimiento de autoenfoque para "encontrar el foco" de la placa 102 o el usuario preenfoca interactivamente 103 la región de exploración seleccionando tres puntos de "mareaje" que definen el área rectangular a ser explorada. A continuación se calcula el "modelo del plano focal" por ajuste por mínimos cuadrados de esos puntos de mareaje para estimar el foco de cada pozo durante una exploración automatizada. El foco de cada pozo es estimado interpolando de modelo del plano focal durante una exploración . Durante una exploración automatizada, los programas y sistemas de programación presentan dinámicamente el estado de exploración, incluyendo el número de células analizadas, el pozo que está siendo analizado actualmente, las imágenes de cada longitud de onda independiente a medida que se adquieren, y el resultado de la selección por cada pozo cuando se ha determinado. La placa 4 (Figura 1) es explorada en un tipo de serpentina a medida que los programas y sistemas de programación mueven automáticamente la platina XY del microscopio motorizado 3. de pozo a pozo y de campo a campo dentro de cada pozo de una placa de 96 pozos. Aquellos expertos en la técnica de la programación reconocerán como adaptar los programas y sistemas de programación para explorar otros formatos de microplaca tales como placas de 24, 48 y 384 pozos. El patrón de exploración de toda la placa, así como el patrón de exploración de los campos dentro de cada pozo son programados. El sistema ajusta el foco de la muestra con un procedimiento de autoenfoque 104 (Figura 9) a través de la unidad de enfoque del eje Z controla la selección del filtro vía una rueda de filtración motorizada JL9_, y adquiere y analiza imágenes de hasta cuatro diferentes colores ("canales" o "longitudes de onda") . El procedimiento de autoenfoque es invocado a una frecuencia seleccionada por el usuario, típicamente para el primer campo en cada pozo y a continuación una vez cada 4 a 5 campos dentro de cada pozo. El procedimiento de autoenfoque calcula el punto del eje Z inicial interpolando del modelo focal del plano precalculado . Comenzando una distancia programable por encima o por debajo de este punto fijo, el procedimiento mueve el eje Z mecánico a través de un número de diferentes posiciones, adquiere una imagen en cada punto, y encuentra el máximo de un punto de enfoque calculado que estima el contraste de cada imagen. La posición Z de la imagen con el punto de enfoque máximo determina el mejor foco para un campo particular. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que esta es una variante de los algoritmos de enfoque automático descritos en Harms et al. en Cytometry 5 (1984), 236-243, Groen et al. en Cytometry 6 (1985), 81-91, y Firestone et al. en Cytometry 12 (1991) , 195-206. Para la adquisición de la imagen, el tiempo de exposición de la cámara es ajustado por separado por cada tinte para asegurar una imagen de alta calidad de cada canal . Pueden ser invocados procedimientos de los programas y sistemas de programación, a opción del usuario, para corregir desviaciones de registro en las longitudes de onda tomando en cuenta las desviaciones lineales (X y Y) entre las longitudes de onda antes de hacer cualesquier mediciones adicionales . El obturador electrónico 18. es controlado de modo que la fotodecoloración de la muestra se mantenga en un mínimo. El desvanecimiento del fondo y la iluminación no uniforme pueden ser corregidas por los programas y sistemas de programación utilizando los métodos conocidos en la técnica (Bright et al. (1987), J. Cell Biol. 104:1019-1033) . En un canal, se adquieren imágenes de un marcador primario 105 (Figura 9) (típicamente núcleos celulares contrateñidos con tintes fluorescentes DAPI o PI) las cuales son segmentadas ("identificadas") utilizando un procedimiento de umbral adaptable. El procedimiento de umbral adaptable 106 se utiliza para seleccionar dinámicamente el umbral de una imagen para separar células del fondo. La tinción de las células con tintes fluorescentes puede variar en un grado desconocido a través de las células en una muestra de placa microtituladora, así como dentro de imágenes de un campo de células dentro de cada pozo de una placa microtituladora. Esta variación puede ocurrir como resultado de la preparación de la muestra y/o la naturaleza dinámica de las células. Se calcula un umbral global para la imagen completa para separar las células del fondo y contabilizar la variación de campo a campo. Esas técnicas adaptables globales son variantes de aquellas descritas en la técnica. (Kittler et al. en Computer Vision, Graphics, and Image Processing 30 (1985) , 125-147, Ridler et al. en IEEE Trans . Systems, Man, and Cybernetics (1978), 630-632. Un modelo de umbral adaptable alternativo utiliza el umbral de la región total en contraste con el umbral de la imagen global. El análisis de imágenes de regiones locales conduce a una segmentación total mejor, puesto que la tinción de los núcleos celulares (así como otros componentes marcados) puede variar a través de una imagen. Utilizando este procedimiento global/local, una imagen de resolución reducida (reducida en tamaño en un factor de 2 a 4) es segmentada primero globalmente (utilizando el umbral adaptable) , para encontrar regiones de interés en la imagen. Esas regiones sirven entonces como guías para analizar más completamente las mismas regiones a toda resolución. Se calcula entonces un umbral más localizado (utilizando nuevamente el umbral adaptable) para cada región de interés. El resultado del procedimiento de segmentación es una imagen binaria donde los objetos son blancos y el fondo es negro. Esta imagen binaria, también llamada máscara en la técnica, se utiliza para determinar si el campo contiene objetos 107. La máscara es marcada con un algoritmo de mareaje o puntos o manchas por lo que cada objeto (o punto o mancha) tiene un número único asignado a éste. Las características morfológicas, tales como el área y forma, de los puntos o manchas se utilizan para diferenciar puntos o manchas que probablemente sean células de aquéllos que son considerados artefactos. El usuario preestablece los criterios de selección morfológicos amplificando características morfológicas celulares conocidas o utilizando el dispositivo de capacitación interactiva. Si los objetos de interés se encuentran en el campo, se adquieren las imágenes para todos los otros canales interactivos 108. de otro modo la platina se hace avanzar al siguiente campo 109 en el pozo actual. Cada objeto de interés es localizado en la imagen para su análisis adicional 110. Los programas y sistemas de programación determinan si el objeto satisface los criterios para un núcleo celular válido 111 midiendo sus características morfológicas (tamaño y forma) . Por cada célula válida, se registra la ubicación de la platina XYZ, se almacena una imagen pequeña de la célula, y se miden las características 112. El método de exploración celular de la presente invención puede ser utilizado para efectuar muchos ensayos diferentes sobre muestras celulares aplicando un número de métodos analíticos simultáneamente para medir características a múltiples longitudes de onda. Un ejemplo de uno de tales ensayos se proporciona para las siguientes mediciones: 1. La intensidad fluorescente total dentro del núcleo celular para los colores 1-4 2. El área del núcleo celular para el color 1 (el marcador primario) 3. La forma de núcleo celular para el color 1 es descrita por las características de forma: a) área cuadrada perimetral b) relación de la altura y el ancho 4. La intensidad fluorescente promedio dentro del núcleo celular para los colores 1-4 (es decir #1 dividido por #2) 5. La intensidad fluorescente total de un anillo fuera del núcleo (véase la Figura 10) que representa la fluorescencia del citoplasma de la célula (máscara citoplásmica) para los colores 2-4 6. El área de la máscara citoplásmica 7. La intensidad fluorescente de la máscara citoplásmica para los colores 2-4 (es decir #5 dividido por #6) 8. La relación de la intensidad fluorescente promedio de la máscara citoplásmica a la intensidad fluorescente promedio dentro del núcleo celular para los colores 2-4 (es decir #7 dividido por #4) 9. La diferencia de la intensidad fluorescente promedio de la máscara citoplásmica y la intensidad fluorescente promedio dentro del núcleo celular para los colores 2-4 (es decir #7 menos #4) 10. El número de dominios fluorescentes (también llamados manchas, puntos o granos) dentro del núcleo celular para los colores 2-4. Las características 1 hasta 4 son características generales de los diferentes ensayos de selección de células de la invención. Esos pasos se utilizan comúnmente en una variedad de aplicaciones de análisis de imágenes y son bien conocidos en la técnica (Russ (1992) The Image Processing Handbook, CRC Press Inc.; Gonzales et al. (1987), Digital Image Processing. Addison- esley Publishing Co. pp 391-448) . Las características 5-9 han sido desarrolladas específicamente para proporcionar mediciones de una molécula fluorescente de la célula dentro de la región citoplásmica local de la célula y la translocación (es decir movimiento de moléculas fluorescentes del citoplasma al núcleo) . Esas características (pasos 5-9) son utilizadas para analizar células de microplacas para la inhibición de la translocación nuclear. Por ejemplo, la inhibición de la translocación nuclear de factores de la transcripción proporciona un método novedoso para seleccionar o separar células intactas (más adelante se proporcionarán ejemplos detallados de otros tipos de selecciones) . Un algoritmo específico mide la cantidad de sonda en la región nuclear (característica 4) contra la región citoplásmica local (característica 7) de cada célula. La cuantificación de la diferencia entre esos dos compartimientos subcelulares proporciona una medida de la translocación citoplásmica-nuclear (característica 9) . La característica 10 describe una selección utilizada para contabilizar sondas de ADN o AR dentro de la región nuclear en los colores 2-4. Por ejemplo, se encuentran comercialmente disponibles sondas para identificar secuencias de ADN específicas de cromosomas (Life Technologies, Gaithesburg, MD; Genosys, Woodlands, TX; Biotechnologies, Inc., Richmond, CA; B o 101, Inc., Vista, Ca) . Las células son de naturaleza tridimensional y cuando se examinan a una alta amplificación bajo un microscopio una sonda puede estar en foco mientras que otra puede estar completamente fuera de foco. El método de selección de células de la presente invención se proporciona para detectar sondas tridimensionales en núcleos adquiriendo imágenes de planos focales múltiples. Los programas y sistemas de programación mueven el dispositivo de accionamiento de motor del eje Z 5 (Figura 5) en pequeños pasos de la distancia del paso es seleccionada por el usuario para tomar en cuenta una amplia gama de diferentes diámetros nucleares. En cada uno de los pasos focales, se adquiere una imagen. La intensidad del nivel de gris máximo de cada pixel en cada imagen se encuentra y almacena en una imagen de proyección máxima resultante. La imagen de proyección máxima es entonces utilizada para contar las sondas. El algoritmo anterior trabaja bien en el conteo de sondas que no están apiladas directamente encima o debajo de otras. Para contar las sondas apiladas encima de otras en la dirección Z, el usuario puede seleccionar una opción para analizar las sondas en cada uno de los planos focales adquiridos. De este modo, el sistema de selección ejecuta el algoritmo de proyección del plano máximo como se discutió anteriormente, detecta las regiones de sondeo de interés en esta imagen, a continuación analiza además esas regiones en todas las imágenes del plano focal . Después de medir las características celulares 112 (Figura 9) , el sistema verifica si existen algunos objetos no procesados en el campo actual 113. Si existen algunos objetos no procesados, localiza el siguiente objeto 110 y determina si satisface los criterios para un núcleo celular válido 111. y mide sus características. Una vez que todos los objetos en el campo actual son procesados, el sistema determina si el análisis de la placa actual es completo 11 ; y si no, determina la necesidad de encontrar más células en el pozo actual 115. Si existe la necesidad, el sistema hace avanzar la platina XYZ al siguiente campo 109 o hace avanzar la platina al siguiente pozo 116 de la placa. Después de completar la exploración de una placa, las imágenes y datos pueden ser revisados son los dispositivos para revisar imágenes, revisar datos y revisar el resumen del sistema. Todas las imágenes, datos y parámetros para una exploración se archivan en la base de datos del sistema para ser revisados posteriormente o para interconectarse con un sistema administrador de información de la red. Los datos también pueden ser exportados a paquetes estadísticos de una tercera parte para tabular los resultados y generar otros reportes. Los usuarios pueden revisar las imágenes solas de cada célula analizada por el sistema con un procedimiento de revisión de imágenes interactivo 117. El usuario puede revisar los datos sobre una base célula por célula utilizando una combinación de gráficas interactivas, una hoja de cálculo de datos de las características medidas, y las imágenes de todos los canales de fluorescencia de una célula de interés con el procedimiento de revisión de datos célula por célula interactivos 118. Se proporcionan capacidades para elaborar gráfica en las cuales los datos pueden ser analizados vía gráficas interactivas tales como histogramas y gráficas de dispersión. Los usuarios pueden revisar los datos del resumen que se acumularon y resumieron para las células dentro de cada pozo de una placa con un procedimiento de revisión de datos pozo por pozo interactivo 119. Pueden ser impresas copias de gráficas e imágenes en una amplia gama de impresoras estándar.

Como una fase final de una exploración compuesta, pueden generarse reportes sobre una o más estadísticas de las características medidas. Los usuarios pueden generar un reporte gráfico de datos resumidos sobre una base pozo por pozo para la región explorada de la placa utilizando un procedimiento de generación de reporte interactivo 120. Este reporte incluye un resumen de las estadísticas por pozo en formato tabular y gráfico de información de identificación sobre la muestra) . La ventana de reporte permite al operador introducir comentarios acerca de la exploración para su recuperación posterior. Pueden ser generados múltiples reportes sobre muchas estadísticas e imprimirse tocando un botón. Los reportes pueden ser previsualizados para su emplazamiento y datos antes de ser impresos . La modalidad del método explicada anteriormente opera en un solo modo de alta resolución conocido como el modo de selección de alto contenido (SAC) . El modo SAC proporciona una resolución espacial suficiente dentro de un pozo (del orden de 1 µp?) para definir la distribución de material dentro del pozo, así como dentro de células individuales en el pozo. El alto grado de contenido de información accesible en ese modo, es a expensas de la velocidad y complejidad del procesamiento de señales requerido . En una modalidad alternativa, un sistema de alto rendimiento (SAR) es acoplado directamente con el SAC ya sea en la misma plataforma o en dos plataformas separadas conectadas electrónicamente (por ejemplo vía una red de área local) . Esta modalidad de la invención, conocida como sistema óptico de doble modo, tiene la ventaja de incrementar el rendimiento de un SAC acoplándose con un SAR requiriendo por lo tanto una adquisición de análisis de datos de alta resolución más lenta únicamente en el pequeño subconjunto de pozos que muestren una respuesta en el SAR acoplado. Los sistemas lectores de 'placa completa' de alto rendimiento son bien conocidos en la técnica y comúnmente se utilizan como un componente de un sistema SAR utilizado para seleccionar grandes números de comunicación (Beggs (1997), s pra; McCaffrey et al., (1996) supra) . El SAR de la presente invención se lleva a cabo en una placa microtituladora o arreglo de micropozos leyendo muchos o todos los pozos en la placa simultáneamente con una resolución suficiente para hacer determinaciones sobre una base pozo por pozo. Es decir, que los cálculos se hacen promediando la salida de la señal total de muchas o todas las células o el volumen del material en cada pozo. Los pozos que exhiben alguna respuesta definida en el SAR (los 'aciertos') son marcados por el sistema. A continuación sobre la misma placa microtituladora o arreglo de micropozos, cada pozo identificado como un acierto es medido vía SAC como se describió anteriormente. De este modo, el proceso de doble modo implica: 1. Medir rápidamente numerosos pozos de una placa microtituladora o arreglo de micropozos, 2. Interpretar los datos para determinar la actividad total de las moléculas reporteras marcadas de manera fluorescente en las células sobre una base pozo por pozo para identificar "aciertos" (pozos que exhiben una respuesta definida) , 3. Formar las imágenes de numerosas células en cada pozo "acertado" , y 4. Interpretar los datos de las imágenes digitales para determinar la distribución, ambiente o actividad de las moléculas reporteras marcadas de manera fluorescente en las células individuales (es decir las mediciones intracelulares) y la distribución de las células para probar las funciones biológicas específicas) .

En una modalidad preferida del procedimiento de doble modo (Figura 11) , el inicio de un ensayo 301 , el operador introduce información 302 que describe la placa y su contenido, especifica los parámetros del filtro y los canales fluorescentes para comparar las marcas biológicas que estén siendo utilizadas, la información buscada y los parámetros de la cámara para comparar la brillantez de la muestra. Esos parámetros son almacenados en la base de datos del sistema para ser recuperados fácilmente por cada ensayo automatizado. La placa microtituladora o un arreglo de pozos se carga en el sistema de selección celular 303 ya sea manualmente o automáticamente controlando un dispositivo de carga robotico. Una cámara ambiental opcional 304 es controlada por el sistema para mantener la temperatura, humedad y niveles de C02 en el aire que rodea a las células vivientes en la placa microtituladora o arreglo de micropozos. Un dispositivo distribuidor de fluido opcional 305 (véase la Figura 8) es controlado por el sistema para distribuir fluidos hacia los pozos durante la exploración. El procesamiento de alto rendimiento 306 se efectúa primero sobre la placa microtituladora o el arreglo de pozos adquiriendo y analizando la señal de cada uno de los pozos en la placa. El procesamiento efectuado en el modo de alta resolución 307 se ilustra en la Figura 12 y se describe más adelante. Los pozos que exhiben alguna respuesta a la intensidad seleccionada en este modo de alta resolución ("aciertos") son identificados por el sistema. El sistema efectúa una operación condicional 308 que prueba los aciertos. Si se encuentran aciertos, aquellos pozos con aciertos específicos son analizados adicionalmente en el modo de alto contenido (de micronivel) 309. El procesamiento efectuado en el modo de alto nivel 312 se ilustra en la Figura 13. El sistema actualiza entonces 310 la base da datos informática 311 con los resultados de las mediciones de la placa. Si existen más placas a ser analizadas 313 el sistema característica la siguiente placa 303 ; de otro modo termina el análisis de las placas 314. La siguiente discusión describe el modo de alto rendimiento ilustrado en la Figura 12. Se describirá la modalidad preferida del sistema, el sistema de selección de doble modo de una sola plataforma. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que operativamente el sistema de dos plataformas simplemente implica mover la placa entre dos sistemas ópticos en lugar de mover los dispositivos ópticos. Una vez que el sistema ha sido instalado y la placa cargada, el sistema comienza la adquisición y análisis SAR 401. El módulo óptico SAR es seleccionado mediante el control de un dispositivo de posicionamiento óptico motorizado 402 sobre el sistema de doble modo. En un canal de fluorescencia, son obtenidos los datos de un marcador primario sobre la placa 403 y los pozos son aislados del fondo de la placa utilizando un procedimiento de enmascaramiento 404. Las imágenes también son adquiridas en otros canales de fluorescencia que estén siendo utilizados 405. La región en cada imagen que corresponde a cada pozo 406 es medida 407. Una característica calculada de las mediciones de un pozo particular se compara con un umbral predefinido o respuesta de intensidad 408. y en base al resultado el pozo es marcado como un "acierto" 409 o no. La ubicación de los pozos marcados como aciertos son registrados por el procesamiento por el modo del alto contenido posterior. Si existen pozos restantes que tienen que ser procesados 410. el programa se vuelve cíclico 406 hasta que todos los pozos han sido procesados 411 y el sistema sale del modo de alto rendimiento. Después del análisis SAR, el sistema comienza el procesamiento del modo de alto contenido 501 definido en la Figura 13. El sistema selecciona el módulo óptico SAC 502 controlando el sistema de posicionamiento motorizado. Por cada pozo con un "acierto" identificado en el modo de alto rendimiento, la ubicación de la platina X, Y del pozo es recuperado de la memoria o en disco y la platina es movida entonces a la ubicación de la platina seleccionada 503. El procedimiento de autoenfoque 504 es llamado por el primer campo en cada pozo con un acierto a continuación una vez cada 5 a 8 campos dentro de cada pozo. En un canal, se adquieren las imágenes del marcador primario 505 (típicamente los núcleos celulares contrateñidos con tintes fluorescentes DAPI , Hoechst o PI) . Las imágenes son entonces segmentadas (separadas) en regiones de núcleos y sin núcleos) utilizando el procedimiento de determinación de un umbral adaptable en 506. El resultado del procedimiento de segmentación es una máscara binaria donde los objetos son blancos y el fondo es negro. Esta imagen binaria, también conocida como máscara en la técnica, se utiliza para determinar si el campo contiene objetos 507. La máscara es marcada con un algoritmo de mareaje de manchas o puntos por lo que cada objeto (mancha o punto) tiene un número único asignado a éste. Si los objetos se encuentran en el campo, se adquieren las imágenes para todos los otros canales activos 508. de otro modo la platina se hace avanzar al siguiente campo 514 en el pozo actual. Cada objeto se localiza en la imagen para su análisis adicional 509. Las características morfológicas, tales como el área y forma de los objetos, se utilizan para seleccionar objetos que probablemente sean núcleos celulares 510 , y desecha (no procesa adicionalmente) aquéllos que son considerados artefactos. Por cada núcleo celular válido, se registra la ubicación de la platina X, Y, se almacena una imagen pequeña de la célula, y se miden características específicas del ensayo 511. El sistema efectúa entonces múltiples pruebas sobre las células aplicando varios métodos analíticos para medir características a cada una de las diferentes longitudes de onda. Después de medir las características de la célula, el sistema verifica si existen algunos objetos sin procesar en el campo actual 512. Si existen algunos objetos no procesados, localiza el siguiente objeto 509 y determina si satisface los criterios para un núcleo de célula válido 510. y mide sus características. Después de procesar todos los objetos en el campo actual, el sistema determina si necesita encontrar mas células o campos en el pozo actual 513. Si necesita encontrar más células o campos en el pozo actual hace avanzar la platina XZ al siguiente campo del pozo actual 515. De otro modo, el sistema verifica si tiene algunos pozos con aciertos restantes que medir 515. Si es así, hace avanzar el siguiente pozo con aciertos 503 y procede a través de otro ciclo de adquisición y análisis, de otro modo finaliza el modo SAC 516. En una modalidad alternativa de la presente invención, se proporciona un método para seleccionar células vivas cinéticamente. Las modalidades de la invención descritas anteriormente son utilizadas para caracterizar la distribución espacial de los componentes celulares en un punto específico en el punto, el tiempo de la fijación química. Por lo tanto, esas modalidades tienen utilidad limitada para implementar selecciones basadas en la cinética, debido a la naturaleza secuencial de la adquisición de imágenes, y la cantidad de tiempo requerida para leer todos los pozos sobre una placa. Por ejemplo, puesto que una placa puede requerir 31-60 minutos para ser leída a través de todos los pozos, todos los procesos cinéticos muy lentos pueden ser medidos preparando solamente una placa de células vivas y a continuación leyendo a través de todos los pozos más de una vez. Los procesos cinéticos más rápidos pueden ser medidos tomando múltiples lecturas de cada pozo antes de proceder al siguiente pozo, pero el tiempo transcurrido entre el primer y el último pozo sería demasiado grande, y los procesos cinéticos rápidos probablemente serían completados antes de alcanzar el último pozo. La extensión cinética de la célula viva de la invención permite el diseño y uso de selecciones en las cuales un proceso biológico es caracterizado por su genética en lugar de, o además de, sus características espaciales. En muchos casos, puede medirse una respuesta en células vivas agregando un reactivo a un pozo específico y haciendo múltiples mediciones sobre ese pozo con el tiempo apropiado. Esta modalidad dinámica de la célula viva de la invención incluye por lo tanto aparatos para distribuir fluidos a pozos individuales del sistema para distribuir reactivos a cada pozo a un tiempo específico antes de leer el pozo. Esta modalidad por lo tanto permite hacer mediciones cinéticas con resoluciones temporales de segundos a minutos en cada pozo de la placa. Para mejorar la eficiencia total del sistema dinámico de células vivas, se amplificó el programa de control de adquisición para permitir la recolección de datos repetitivos de subregiones de la placa, permitiéndole al sistema leer otros pozos entre los puntos temporales requeridos para un pozo individual .

La Figura 8 describe un ejemplo de un dispositivo distribuidor de fluido para utilizarse con la modalidad de células vivas de la invención y también se describió anteriormente. Este montaje le permite a uno colocar las puntas de pipeta 705. o a una sola punta de pipeta, para distribuir reactivo a todos los pozos sobre la placa. El banco de bombas de jeringa 701 puede ser utilizado para distribuir fluido a 12 pozos simultáneamente, o a menos pozos removiendo algunas de las puntas 705. La resolución temporal del sistema puede ser ajustada por lo tanto, sin sacrificar la eficiencia de la recolección de datos, cambiando el número de puntas y el patrón de exploración como sigue. Típicamente, la recolección de análisis de los datos de un solo pozo toma aproximadamente 5 segundos . Moviéndose de pozo a pozo y enfocar en un foco requiere aproximadamente 5 segundos, de modo que el tiempo del ciclo total para un pozo es de aproximadamente 10 segundos. Por lo tanto, si se utiliza una sola punta de pipeta para distribuir fluido a un solo pozo, los datos son recolectados repetitivamente de ese pozo, las mediciones pueden hacerse con una resolución temporal de aproximadamente 5 segundos. Si se utilizan 16 puntas de pipeta para distribuir fluidos o 6 pozos simultáneamente, y el sistema explora repetitivamente los 6 pozos, cada exploración requerirá 60 segundos, estableciendo por lo tanto la resolución temporal . Para procesos más lentos los cuales sólo requieren la resolución de datos cada 8 minutos, los fluidos pueden ser distribuidos a la mitad de la placa, moviendo la placa durante la fase de distribución de fluido, y a continuación explorando repetitivamente la mitad de la placa. Por lo tanto, ajustando el tamaño de la subregión que esté siendo explorada sobre la placa, la resolución temporal puede ajustarse sin tener que insertar tiempos de espera entre las adquisiciones. Debido a que el sistema está explorando y adquiriendo datos continuamente, el tiempo total para recolectar un conjunto de datos cinéticos de la placa es entonces simplemente el tiempo para efectuar una sola exploración de la placa, multiplicado por el número de puntos temporales requeridos. Típicamente, un punto temporal antes de la adición de los compuestos y dos o tres puntos temporales después de la adición deberán ser suficientes para propósitos de selección. En la Figura 14 muestra la secuencia de adquisición utilizada por el análisis cinético. El inicio del procesamiento 801 es la confirmación del sistema, mucha de la cual es idéntica a la configuración SAC estándar. Además, el operador debe introducir información específica para el análisis cinético que esté siendo efectuado 802. tal como el tamaño de la subregión, el número de puntos temporales requeridos, y el incremento de tiempo requerido. Una subregión es un grupo de pozos que serán explorados repetitivamente para acumular datos cinéticos. El tamaño de la subregión se ajusta de modo que el sistema pueda explorar una subregión completa una vez durante un solo incremento de tiempo, reduciendo de este modo los tiempos de espera. El tamaño de subregión óptimo se calcula a partir de los parámetros de instalación o montaje, y son ajustados si es necesario por el operador. El sistema mueve entonces la placa hacia la primera subregión 803. y hacia el primer pozo en esa subregión 804 para adquirir los puntos temporales de preestimulación (tiempo = 0) . La secuencia de adquisición efectuada en cada pozo es exactamente la misma que es requerida por la SAC que está siendo efectuada en el modo cinético. La Figura 15 da los detalles de un diagrama de flujo para ese procesamiento. Todos los pasos entre el inicio 901 y el retorno 902 son idénticos a aquéllos descritos como pasos 504 - 514 en la Figura 13. Después de procesar cada pozo en una subregión, el sistema verifica para ver si todos los pozos en la subregión han sido procesados 806 (Figura 14) , y los ciclos a través de todos los pozos hasta la región completa han sido procesados. El sistema mueve entonces la placa hacia la posición para la adición de fluido y controla al sistema fluídico que distribuye fluidos a toda la subregión 807. Esto puede requerir múltiples adiciones para subregiones las cuales abarcan varias hileras sobre la placa, con el sistema moviendo la placa sobre la platina X,Y entre adiciones. Una vez que han sido agregados los fluidos, el sistema se mueve hacia el primer pozo en la subregión 808 para comenzar la adquisición de puntos temporales. Los datos son adquiridos de cada pozo 809 y como anteriormente el sistema circula a través de todos los pozos en la subregión 810. Después de cada paso a través de la subregión, el sistema verifica si todos los puntos temporales han sido recolectados 811 y si no, hace pausas 813 si es necesario 812 para permanecer sincronizado con el incremento del tiempo solicitado. De otro modo, el sistema verifica para subregiones adicionales sobre la placa 814 y se mueve a la siguiente subregión 803 o finaliza 815. De este modo, el modo de análisis cinético comprende la identificación por el operador de las subregiones de la placa microtituladora o micropozos a ser seleccionados, en base a la respuesta cinética a ser investigada, con la adquisición de datos dentro de una subregión antes de la adquisición de datos en subregiones subsecuentes .

Selecciones específicas En otro aspecto de la invención, se proporciona un medio de almacenamiento legible en una máquina que contiene un programa que contiene un conjunto de instrucciones para hacer que un sistema de selección de células ejecute procedimientos para definir la distribución y actividad de los constituyentes y procesos celulares específicos. En una modalidad preferida, el sistema de selección de células comprende un sistema óptico de fluorescencia de alta amplificación con una platina adaptada para sostener células y medios para mover la platina, una cámara digital, una fuente de luz para recibir y procesar los datos digitales de la cámara digital, y medios de computadora para recibir y procesar los datos digitales de la cámara digital. Este aspecto de la invención comprende programas que dan instrucciones al sistema de selección de células para definir la distribución y actividad de los constituyentes y procesos celulares específicos, utilizando sondas luminiscentes, el sistema óptico de formación de imágenes, y los programas y sistemas de programación de reconocimiento de patrones de la invención. Las modalidades preferidas del medio de almacenamiento legible en la máquina comprenden programas que consisten de un conjunto de instrucciones para hacer que un sistema de selección de células ejecute los procedimientos expuestos en las Figuras 9, 11, 12, 13, 14, 15 ó 28. Otra modalidad preferida comprende un programa que consiste de un conjunto de instrucciones para hacer que todos los sistemas de selección celular ejecuten procedimientos para detectar la distribución y actividad de los constituyentes y procesos celulares específicos. En las modalidades más preferidas, los procesos celulares incluyen, pero no se limitan a, translocación nuclear de una proteína, hipertrofia celular, apoptosis, internalización del receptor transmembranal, y translocación de una proteína inducida por una proteasa. Se pretende que los siguientes ejemplos sirvan para propósitos de ilustración únicamente y que no se constituyan en limitantes del alcance de la invención, de acuerdo a lo definido en las reivindicaciones anexas a la presente .

Los diferentes compuestos químicos, reactivos, tintes y anticuerpos a los que se hace referencia en los siguientes ejemplos se encuentran comercialmente disponibles de fuentes tales como Sigma Chemical (ST. Louis, O) , Molecular Probes (Eugene, OR) , Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI) , Accurate Chemical Company (Westbury, NY) ) , Jackson Immunolabs, y Clontech (Palo Alto, CA) .

Ejemplo 1. Selección Automatizada de Compuestos que Inducen o Inhiben la Translocación Nuclear de un Factor de Transcripción del ADN La regulación de la transcripción de algunos genes implica la activación de un factor de transcripción en el citoplasma, dando como resultado que el factor sea transportado hacia el núcleo donde pueden iniciar la transcripción de un gen o genes particulares. Este cambio en la distribución del factor de transcripción es la base de una selección para el sistema de selección basado en células para detectar compuestos que inhiben o inducen la transcripción de un gen o grupo de genes particular. Una descripción general de la descripción se da seguida por un ejemplo específico.

La distribución del factor de transcripción es determinada marcado los núcleos con un fluoróforo específico para el ADN tal como el Hoeschst 33423 y el factor de transcripción con un anticuerpo fluorescente específico. Después del autoenfoque sobre el núcleo marcado con Hoeschst, se adquiere una imagen de los núcleos en el sistema de selección basado en células a una amplificación de 20x y se utiliza para crear una máscara por uno o varios métodos de determinación de umbral opcionales, de acuerdo a lo descrito supra. Los descriptores morfológicos de las regiones definidas por la máscara son comparados con los parámetros definidos por el usuario y las máscaras nucleares válidas son identificadas y utilizadas con el siguiente algoritmo para extraer las distribuciones por factor de transcripción. Cada máscara nuclear válida se erosiona para definir una región nuclear ligeramente más pequeña. La máscara nuclear original es entonces dilatada en dos pasos para definir una región de forma anular alrededor del núcleo, la cual representa una región citoplásmica . Se determina la fluorescencia promedio para unir el anticuerpo en cada una esas dos regiones, y la diferencia entre esos promedios se define como la diferencia NucCyt. Más adelante se discuten e ilustran dos ejemplos de determinación de la translocación nuclear en la Figura 10 A-J. La Figura 10A ilustra una célula estimulada con su núcleo 200 marcado con un fluoróforo azul y un factor de transcripción en el citoplasma 201 marcado con un fluoróforo verde. La Figura 10B ilustra la máscara nuclear 202 derivada por el sistema de selección basado en células. La Figura 10C ilustra el citoplasma 203 de la célula no estimulada cuya imagen se formó a una longitud de onda verde. La Figura 10D ilustra la máscara nuclear 210 erosionada (reducida) una vez para definir una región de muestre nuclear 204 con distribución citoplásmica mínima. El límite del núcleo 202 se dilató (expandió) varias veces para formar un anillo que es de 2-3 pixeles de ancho que se utilizó pata definir la región de muestreo citoplásmico 205 para la misma célula. La Figura 10C ilustra además una vista lateral la cual muestra la región de muestreo nuclear 204 y la región de muestreo citoplásmico 205. Utilizando esas dos regiones de muestreo, los datos sobre la translocación nuclear pueden ser analizados automáticamente por el sistema de selección basado en células sobre una base de célula por célula. La Figura 10F-J ilustra una estrategia para determinar la translocación local en una célula estimulada. La Figura 10F ilustra una célula estimulada con su núcleo 206 marcado con un fluoróforo azul y un factor de transcripción en el citoplasma 207 marcado con un fluoróforo verde. La máscara nuclear 208 en la Figura 10G se deriva por el sistema de la selección basada en células. La Figura 10H ilustra el citoplasma 209 de una célula estimulada cuya imagen se formó con una longitud de onda verde. La Figura 101 ilustra la región de muestreo nuclear 211 y la región de muestreo citoplásmico 212 de la célula estimulada. La Figura 10J ilustra además una vista lateral que muestra la región del muestreo nuclear 211 y la región de muestreo citoplásmico 212. Una aplicación específica de este método ha sido utilizada para validar este método como una selección o tamiz. Una línea celular humana fue cultivada en placas microtituladoras de 96 pozos. Algunas de las hileras de pozos fueron tituladas con agonistas, o un inductor conocido de un factor de la transcripción nuclear específico. Las células fueron entonces fijadas y teñidas por métodos con un anticuerpo marcado con fluoresceína para el factor de transcripción, y Hoeschst 33423. El sistema de selección basado en células fue utilizado para adquirir y analizar imágenes de esta placa y se encontró que la Diferencia NucCyt se correlacionaba fuertemente con la cantidad de agonista agregado a los pozos como se ilustra en la Figura 16. En un segundo experimento, el agonista para el receptor del agonista se tituló en presencia de agonista, inhibiendo progresivamente la translocación inducida por el agonista del factor de transcripción. Se encontró que la Diferencia NucCyt se correlacionaba fuertemente con esta inhibición de la translocación, como se ilustra en la Figura 17. Experimentos adicionales han mostrado que la Diferencia NucCyt da resultados consistentes sobre el amplio intervalo de densidades celulares y concentraciones de reactivo, y que por lo tanto puede ser utilizada de manera rutinaria para seleccionar bibliotecas de compuestos por su actividad en la translocación nuclear específica. Además, el mismo método puede ser utilizado con anticuerpos para otros factores de transcripción, o quimeras de PFV-factor de transcripción, en células vivas y fijadas, para seleccionar los efectos sobre la regulación de la transcripción de éste y otros genes. La Figura 18 es una conducción representativa de una pantalla de PC de los datos que se obtuvieron de acuerdo con al Ejemplo 1. La Gráfica 1 180 gráfica la diferencia entre la fluorescencia del anticuerpo en región de muestreo nuclear y la región de muestreo citoplásmico , Diferencia NucCyt contra # de Pozo. La Gráfica 2 181 gráfica la fluorescencia promedio del anticuerpo en la región de muestreo nuclear, NPI promedio, contra el # de Pozo. La gráfica 3 182 gráfica la fluorescencia promedio del anticuerpo en la región de muestreo citoplásmico, LIP1 promedio, contra el # de Pozo. Lo programas y sistemas de programación permiten presentar los datos de cada célula. Por ejemplo, la Figura 18 muestra la representación visual de una selección 183. la imagen nuclear 184. y la imagen fluorescente del anticuerpo 185 para la célula #26. La Diferencia NucCyt a la que se hace referencia en la gráfica 1 180 de la Figura 18 es la diferencia entre la intensidad promedio de la sonda citoplásmica (molécula reportera fluorescente) y la intensidad promedio de la sonda nuclear (molécula reportera fluorescente) . La NPI promedio a la que se hace referencia en la gráfica 2 181 de la Figura 18 es la intensidad promedio de la sonda citoplásmica (molécula reportera fluorescente) dentro de la región de muestreo nuclear. La L1P1 a la que se hace referencia en la gráfica 3 183 de la Figura 18 es la intensidad promedio de la sonda (molécula reportera fluorescente) dentro de la región de muestreo citoplásmico .

Ejemplo 2. Selección Automatiza de Compuestos que Inducen o Inhiben la Hipertrofia en Miocitos Cardiacos La hipertrofia en los miocitos cardiacos ha sido asociada con una cascada de alteraciones en la expresión genética y puede caracterizarse en cultivo celular por una alteración en el tamaño celular, que es claramente visible en células adherentes que crecen sobre un cubreobjetos. Se implemento una selección o separación utilizando la siguiente estrategia. La línea celular de miocitos QM7 (clona de músculo Quail 7; ATCC CRL-1962) cultivada en placas de 96 pozos, puede ser tratada con varios compuestos y a continuación fijada y marcada con un anticuerpo fluorescente a un marcador de la superficie celular y una marca de ADN tal como Hoechst. Después de enfocar sobre los núcleos marcados con Hoechst, se adquirieron dos imágenes, uno de los núcleos marcados con Hoeschst y una del anticuerpo fluorescente. Los núcleos se identificaron por umbral para crear una máscara y a continuación comparando las descripciones morfológicas de la marca con un conjunto de valores descriptivos definidos por el usuario. Las regiones locales que contienen células son definidas alrededor de los núcleos. Los límites de las células en aquellas regiones son entonces definidos por una operación de umbral dinámico local sobre la misma región en la imagen fluorescente del anticuerpo. Se utilizó una secuencia de erosiones y dilataciones para separar células ligeramente en contacto y se utilizó un segundo conjunto de descriptores morfológicos para identificar células únicas. El área de las células individuales se tabuló para definir la distribución de tamaños celulares para la comparación con datos de tamaño de células normales e hipertróficas. Además, puede ser incluido un segundo anticuerpo fluorescente para una proteína celular particular, tal como una de las proteínas musculares principales, actina o miosina. Las imágenes de este segundo anticuerpo pueden ser adquiridas y almacenadas con las imágenes anteriores, para revisarse más tarde, para identificar anomalías en la distribución de esas proteínas en células hipertróficas, o pueden desarrollarse algoritmos para analizar automáticamente las distribuciones de las proteínas marcadas en esas imágenes .

Ejemplo 3. Selecciones Automatizadas de Compuestos que Inducen o Inhiben la Internalización del Receptor Receptores acoplados a la proteína G Los receptores acoplados a la proteína G (RAPG) son una clase grande de 7 receptores de la superficie celular del dominio transmembranal que transmiten señales del ambiente extracelular al citoplasma celular vía su interacción con proteína G heterotriméricas . La activación de esos receptores por promotores de la unión del ligando del intercambio de GDP a GTP en la proteína G asociada, dando como resultado la disociación de la proteína G en las subunidades Ga-GTP y sß?. La interacción de esas subunidades con sus efectores estimula una cascada de señales secundarias en la célula, tales como la producción de A P cíclico (AMPc) y trifosfato de inositol (IP3) , la inmovilización de Ca*", y la activación de una variedad de cinasas. Una amplia gama de funciones biológicas está asociada con los RAPG, incluyendo, pero sin limitarse a, olores fuertes, sabor, percepción de la luz, control de la presión sanguínea, neurotransmisión, función endocrina e exócrina, quimiotaxis, exocitosis, embriogénesis y desarrollo, crecimiento y diferenciación celular, y oncogénesis. Los RAPG se han vuelto, por lo tanto, un objetivo potencial principal para una variedad de unidades terapéuticas.

Los RAPG abarcan la membrana plasmática y experimentan una velocidad de endocitosis relativamente lenta de la superficie de la célula a los endosomas en células no estimuladas. Aunque mecanísticamente pobremente entendida, se sabe que la presencia de agonista incrementa la velocidad de internalización del receptor dramáticamente. Una vez internalizados en los endosomas, los RAPG pueden ser reciclados de regreso a la membrana plasmática o ser dirigidos a los lisosomas para su degradación. El significado de este secuestro de RAPG no es aún completamente comprendido. La internalización del receptor puede jugar un papel en la desensibilización (pérdida de la respuesta funcional exhibida como una reducción en la capacidad del receptor para generar un segundo mensajero en presencia de estimulación continua. Sin embargo, la velocidad de pérdida del receptor de la superficie es usualmente demasiado baja para tomar en cuenta la rápida velocidad de sensibilización (Tobin, A.B. et al. (1992) Mol. Pharmacol. 42:1042-1048) , y existen ejemplos donde los dos procesos han mostrado no estar acoplados (Baumgold, J. et al. (1989) Neuropharwacology 28:1253-1261; Kanbe, S. et al. (1990) Bioche . Pharmacol. 40:1005-1014) .

Es probable que la endocitosis de los receptores pueda estar implicada en la resensibilización (el restablecimiento de la capacidad de la célula para producir un segundo mensajero en respuesta a la estimulación) . Se ha demostrado para el receptor ß2-adrenérgico (2-AR) que el secuestro de mutantes deficientes así como de receptores tratados con agentes que bloquean el secuestro no se resensibilizan (Yu, S.S. et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(1): 337-341; Barak, L.S. et al. (1994) J. Biol. Chem 269 (4): 2790-2795). Para el ß2??, el estímulo del agonista da como resultado la estimulación del receptor de la proteína cinasa A y la proteína ß.-receptor adrenérgico cinasa (ß-ARK) . Posteriormente, existe el desacoplamiento del receptor de su proteína como resultado del reclutamiento y unión de ß-arrestina al receptor, y se inicia la internalización del receptor vía depresiones cubiertas con claritina. El pH endosomal ácido favorece la actividad de la fosfatasa, aumentando de este modo la desfoforilación del receptor (Krueger, K.M. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(1): 5-8) y haciendo el receptor disponible para reciclarse a la membrana plasmática para reasociarse con una proteína G. Sin embargo, la resensibilización de otros receptores, como los receptores muscarínicos M4( ha mostrado ser retrasada por la endocitosis (Bogatekewitsch, G.S. et al (1996) Mol. Pharmacol. 50:424-429). A pesar del hecho de que la importancia funcional de la internalización del receptor puede variar entre clases de receptores, sigue estando claro que la internalización es un paso significativo en la vía de la activación o función del receptor. La importancia fundamental de los procesos celulares que implican RAPG los hace un objetivo significativo para la selección de fármacos. El estado de la técnica para verificar las interacciones RAPG- ligando y la internalización del receptor se limita a mediciones de un solo evento (por ejemplo, interacción receptor-ligando o pérdida de receptor de la membrana plasmática) . Los procedimientos actuales incluyen mediciones de unión de ligando marcado (usualmente marcado radiactivamente) a células completas o fracciones de membrana aisladas (WO/97/04214 ; von Zastro y Kobilka, J. Biol . Chem. 269:18448-18452 (1994); Koch et al., J. Biol . Chem 273:13652-13657 (1998); Tiberi et al., J. Biol. Chem. 271:3771-3778 (1996)), la migración coincidente de receptores con varios marcadores hacia fracciones celulares resueltas a través de centrifugación (Seibold et al., J. Biol. Chem. 273:7637-7642 (1998); Stefan et al . , Mol. Biol. Cell. 9:885-899 (1998)), visualización de ligandos marcados de manera fluorescentes unidos a receptores en células fijadas (Tarasova et al., J. Biol. Chem. 272:14817-14824 (1997)), o mareaje con anticuerpos (ya sea directamente o a marcas de epitopo) para identificar receptores (von Zastrow y Kobilka, J. Biol. Chem. 269:18448-18452 (1994); Segredo et al. (1997) J. Neurochem. 68:2395-2404; Krueger et al. (1997) J. Biol. Chem. 272 (l):5-8; Tiberi et al. (1996) J. Biol. Chem 271(7): 3771-3778)). Más recientemente, han sido utilizadas funciones de receptor de proteína fluorescente verde (PFV) , las cuales permiten la visualización del tráfico de receptor de RAPG en células vivas. (Kallal, L. et al. (1998) J". Biol. Chem. 273 (1) : 322-328 ; Tarasova, N.I. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(23): 14817-14824). Sin embargo, esto requiere la formación de imágenes confocales para obtener información tridimensional para distinguir si un receptor se ha internalizado o simplemente se ha medido en el plano de la membrana plasmática. También han sido descritos métodos para la identificación de RAPG, sus ligandos, y compuestos que modulan su actividad (WO 98/13353 y WO 97/48820) . Esos métodos, sin embargo, detectan la activación de la protelna G directamente por la unión de ligando al receptor y la activación del gen reportero. Ningún método marca directamente el receptor o mide directamente la internalización de los receptores como una indicación de la activación del receptor. Aunque los métodos existentes han proporcionado información y medios para medir la función del receptor, sigue existiendo la necesidad en la técnica de un método para medir directamente la internalización del receptor inducida por el ligando con una resolución espacial y temporal alta como medida de la activación del receptor. Por lo tanto, se describe aquí un método novedoso para medir la internalización del receptor que permite la internalización del receptor en un solo paso como la automatización y rendimiento apropiados. Este método implica el mareaje fluorescente de RAPG y la medición automatizada de la internalización de RAPG en células estimuladas. Un método novedoso alternativo descrito aquí implica utilizar receptores previamente marcados, que comprenden una marca específica para el amino terminal del receptor para marcar distintivamente su dominio extracelular, además de un cromóforo basado molecularmente tal como la PFV o luciferasa sobre el carboxi terminal del receptor para marcar específicamente el dominio intracelular. Los métodos para la construcción de tales constructos de ADN que expresan proteína quimérica son bien conocidos en la técnica. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) , Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol . 185, editado por D. Goeddel, 1991. Academic Press. San Diego, CA) ; PCR Protocole; A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, CA) ; Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed E . J. Murray, The Human Press Inc., Clifton, N.J.). La relación de la intensidad de la fluorescencia de las dos marcas en células no estimuladas y estimuladas. Puesto que el amino terminal del receptor está únicamente disponible para el mareaje mientras el receptor sea insertado en la membrana plasmática, la relación de las dos marcas en células no permeabilizadas puede ser utilizada para medir el grado de internalización del receptor. Actualmente no existe una tecnología para medir simultáneamente la disponibilidad extracelular relativa de los dominios externo e interno de los receptores de membranas . En una modalidad preferida de la sel moduladores de RAPG, las células vivientes se líneas continuas de células normales o transformadas, o células o primarias o transformadas obtenidas directamente de animales . Las células apropiadas pueden ser transíectadas de manera transitoria o estable con un constructo de ADN (ya sea en plásmido o basado en virus) que exprese el RAPG de interés fusionado a un cromóforo ya sea un plásmido o basado en un virus) que exprese el RAPG de interés fusionado a un cromóforo molecularmente basado en su amino o carboxi terminal o internamente, de modo que el receptor obtenga su función. Los ejemplos de cromóforos molecularmente basados útiles incluyen, pero no se limitan a PFV y cualquiera de sus varios mutantes (Heim y Tsien (1996) Current Biology 6: 178-182; Zhang et al. (1996) Biochem. Biophys . Res. Comm. 227:707-711). Además, también podría utilizarse cualquiera de las luciferasas y sus mutantes. Esto sería una técnica de montaje novedosa puesto que los ejemplos de uso de este cromóforo molecularmente basado a la fecha han incluido el uso de un reportero de la actividad genética (Yang et al. (1998) J. Biol . Chem. 273 (17): 10763-10770; Peng et al. (1998) J. Biol. Chem. 273 ( (27) : 17286-17295; Baldari et al. (1998) Biologicals 26(1): 1-5)) y constructos de biosensores (Campbell y Patel (1983) Biochem. J. 216:185-194; Sala-Newby y Campbell (1992) FEBS Lett. 307:241-244; Jenkins et al. (1990) Biochem. Soc . Trans . 18:463-464) pero no quimeras para producir un objetivo de proteína particular. La expresión de la fusión de RAPG-proteína luminiscente puede ser constitutiva (dirigida por cualquiera de una variedad de promotores, incluyendo pero sin limitarse a CMV, SV40, RSV, actina, EF) o inducible (dirigible por cualquiera de un número de promotores inducibles, incluyendo, pero sin limitarse a tetraciclina , ecdisona, sensible a esteroide) . De manera alternativa, las células son transíectadas de manera transitoria o estable con un constructo de ADN (ya sea plásmido o basado en virus) que exprese RAPG de interés fusionado a un péptido o marca epitópica. La marca epitópica puede ser fusionada al amino o carboxi terminal, o internamente de modo que el receptor permanezca funcional, o, de manera alternativa, el RAPG puede ser marcado con dos marcas epitópicas distintas, con una siendo fusionada a cada extremo del RAPG. Algunos ejemplos de marcas epitópicas incluyen, pero no se limitan a FLAG (Sigma Chemical, ST. Louis, MO) , myc (9E10) (Invitrogen, Carlsbad, CA) , 6-His ( Invitrogen; Novagen, Madison, WI) , y HA (Boehringer anheim Biochemicals) . La expresión de la fusión de RAPG puede ser constitutiva o inducible.

En otra modalidad, las células son transfectadas de manera transitoria o estable con un constructo de ADN (ya sea basado en un plásmido o viral) que expresa los RAPG de interés fusionados a una marca epitópica en su amino terminal y un cromóforo basado molecularmente y su carboxi terminal . De manera alternativa, el RAPG puede ser fusionado a una marca epitópica en su carboxi terminal y un cromóforo basado molecularmente en su amino terminal . La expresión de la fusión de RAPG puede ser constitutiva o inducible. Las células apropiadas son entonces arregladas en un patrón para su tratamiento y análisis. Esos arreglos pueden ser placas de múltiples pozos que contiene 96, 384, 1536 o más pozos individuales. Las células también pueden ser arregladas en microarreglos de "pozos virtuales" utilizando el Sistema CellChipMR (Solicitud de Patente Estadounidense No. de Serie 08/865,341) . Esos microarreglos pueden ser del mismo tipo de célula y ser tratados con una combinación de compuestos distintos o, de manera alternativa, los microarreglos pueden ser una combinación de tipos de células tratadas con uno o más compuestos . Una vez que las células elegidas son arregladas en un patrón en pozos o microarreglos, son tratadas con soluciones de fármaco o ligandos para inhibir o estimular la internalización del receptor. El sistema de distribución fluídico puede ser manual, robótico, o el sistema microfluídico del Sistema CellChipMR (Solicitud de Patente Estadounidense No. de Serie 08/865,341). Después de un periodo de incubación apropiado, las células son fijadas con un agente reticulador químico y teñidas con reactivos basados en la luminiscencia. Esos reactivos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos primarios o secundarios marcados de manera luminiscente que reaccionan con el RAPG, la marca epitópica, u otros antígenos celulares determinados para correlacionarse con la internalización del RAPG. Las tinciones luminiscentes, tintes y otras moléculas pequeñas también pueden ser utilizadas para medir la respuesta fisiológica de las células a los fármacos. Esos reactivos se utilizan para medir los cambios temporales y espaciales en iones, metabolitos, macromoléculas y organelos inducidos por fármacos. Los indicadores de la fisiología celular basados en macromoléculas también pueden ser utilizados en el ensayo. En otra modalidad, las células en pozos o microarreglos son tratadas con fármacos, y la respuesta fisiológica es medida temporal o parcialmente dentro de una relación de células vivientes únicas después de un periodo de incubación apropiado. Las tinciones luminiscentes, tintes, y otras moléculas pequeñas pueden ser utilizadas para medir la respuesta fisiológica de células vivientes a fármacos. Los cromóforos basados molecularmente expresados por las células en sí (tales como RAPG y sus mutantes) son particularmente adecuados para mediciones de células vivas. Esos reactivos pueden ser utilizados para medir los cambios intracelulares temporales y espaciales de iones, metabolitos, macromoléculas, y organelos inducidos por fármacos. Los indicadores de la fisiología celular basados en macromoléculas también pueden ser utilizados en el ensayo. Esos análogos luminiscentes y biosensores pueden ser utilizados para medir los cambios temporales y espaciales en la distribución y actividad de macromoléculas tales como proteínas, ADN, ARN, lípidos, y carbohidratos en respuesta al tratamiento de fármacos . En otra modalidad, el ligando marcado de manera fluorescente es utilizado para inducir el secuestro del receptor y el destino del ligando es seguido como un parámetro de la selección de alto contenido. En otra modalidad, las células pueden contener más de un receptor marcado de manera distinta, de modo que pueden ser analizados en diferentes RAPG en las mismas células pero utilizando diferentes canales de fluorescencia para recolectar aquellos datos. De manera similar, los pozos o microarreglos pueden contener poblaciones mezcladas de células, cada población conteniendo un receptor diferente marcado con un fluoróforo espectralmente distinto. Es posible medir los efectos de fármacos sobre diferentes receptores en un solo ensayo utilizando un sistema de selección celular, tal como el sistema de selección celular de la presente invención, que es capaz de distinguir los canales de fluorescencia de diferentes receptores en esos ejemplos. De esta manera, se pueden seleccionar compuestos que afecten a múltiples tipos de receptores o, por el contrario, compuestos que afecten a un tipo de receptor y a otros no. Será obvio para un experto en la técnica que esta invención puede ser aplicada a muchos receptores de la superficie celular que experimentan internalización en respuesta a la estimulación agonista. Algunos ejemplos de RAPG conocidos son los receptores adrenérgicos ; receptores muscarínicos de acetil colina; receptores opioides; receptores de quimocina; receptores neuroeptídicos ; receptores de prostaglandina; receptor de la hormona paratiroidea; receptor de colecistocinina ; receptor de secretina; rodopsina; receptores de dopamina; receptores de serotonina receptores odoríferos; receptores de histamina; receptores de angiotensina ; receptores de gastrina; receptor de la hormona folículo estimulante; receptor de la hormona luteinizante ; receptores metabotrópicos de glutamato; receptor de glucagon (una lista más completa de RAPG conocidos y sus ligandos puede encontrarse en Beck-Sickinger , A.G. (1996) Drug Discovey Today 1(12): 502-513). Esta invención no se limita a los RAPG; los ejemplos de otros receptores a los cuales esta invención podría ser aplicada incluyen, pero no se limitan a, receptores del factor del crecimiento tales como el PDGF (Heldein et al. (1982) J. Biol . Chem. 257(8) : 4216-4221; Kapeller et al (1993) Mol. Cell. Biol. 13(10): 6052-6063) y EGF (Zidovetski et al. (1981) Proc . Nati. Acad. Sci. 78(11) : 6981-6985; Beguinot et al. (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. 81(8) : 2384-2388; Emlet et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(7) : 4079-4086), el receptor de la transferrina (Klausner et al. (1983) J. Biol. Chem. 258(8) : 4715-4724; Ciechanover et al. (1983) J. Cell. Biochem. 23(1-4) : 107-130), y el receptor de la insulina (Baldwin et al. (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. 77(10): 5975-5978; Di Gugliemo et al. (1998) Mol. Cell . Biochem. 182(1-2): 59-62). Esta invención también puede ser aplicada a receptores huérfanos para los cuales un ligando y/o efector específico se desconoce. El siguiente ejemplo es una selección de la activación de un receptor acoplado a la proteína G (RAPG) detectado por la translocación del RAPG de la membrana plasmática a un lugar nuclear proximal . Este ejemplo ilustra como puede ser acoplada una selección de alto rendimiento con una selección de alto contenido en el sistema de doble modo para la Selección Basada en Células . La Figura 19 ilustra una selección de doble modo para la activación de un RAPG. Las células que contienen una quimera estable del RAPG con una proteína fluorescente azul (PFA) son cargadas con una forma del acetoximetiléster del Fluo-3, un indicador de calcio permeable de la célula (fluorescencia verde) que es atrapado en células vivientes por la hidrólisis de los ésteres. Ellas son entonces depositadas en los pozos de una placa microtituladora 601. Los pozos son entonces tratados con un arreglo de compuestos de prueba utilizando un sistema de distribución de fluido, y se adquiere una secuencia corta de imágenes de Fluo-3 de la placa microtituladora completa y se analiza para determinar los pozos que exhiben una respuesta al calcio (es decir, el modo de alto rendimiento) . Las imágenes aparecen como la ilustración de la placa microtituladora 601 en la Figura 19. Un pequeño número de pozos, tales como los pozos C4 y E9 en la ilustración, fluorescerían más br llantemente debido a la liberación de Ca*+ tras la estimulación de los receptores. Las ubicaciones de los pozos que contienen compuestos que indujeron una respuesta 602. serían entonces transferidas al programa SAC y los dispositivos ópticos cambiados a un análisis detallado célula por células de la fluorescencia azul tras la evidencia de la translocación del RAPG a la región perinuclear. El fondo de la Figura 19 ilustra los dos resultados posibles del análisis de los datos celulares de alta resolución. La cámara forma la imagen de una subregión 604 del área del pozo 603. produciendo imágenes de las células fluorescentes 605. En el pozo C4, la distribución uniforme de la fluorescencia en las células indica que el receptor no se internalizó, implicando que la respuesta al Ca++ observada fue el resultado de la estimulación de algún otro sistema de señalización en la célula. Las células en el pozo E9 606 por otro lado, indican claramente una concentración del receptor en la región perinuclear, indicando claramente la completa activación del receptor. Debido a que han sido analizados unos cuantos pozos con aciertos con alta resolución, el resultado total del sistema de doble modo puede ser muy alto, comparado con el sistema de alta resolución solo.

Ejemplo 4. Selección de alto contenido de la ínternalización del receptor de la hormona paratiroldea inducida por ligando Constructo Plasmídico. Se utilizó un plásmido de expresión eucariótico que contenía la secuencia que codifica para un imitante de la PFV humanizado (pEGFP-N2, CLONTECH, Palo Alto, CA) para crear una quimera de PFV-receptor de la hormona paratiroidea humana (RHTP. GenBank #L04308) . Preparación celular. El constructo plasmídico fue utilizado para transfectar una línea de células de riñon embriónicas humanas (HEK 293) (ATCC NO. CRL-1573) . Las líneas clónales que expresaron de manera estable la quimera PFV-RHPT se establecieron por medio de la selección de antibiótico con el análogo de la neomicina geneticina (0.5 mg/ml; Life Technologies, Gaithersburg, MD) . Las células se prepararon y cultivaron en medio DMEM/F12 (Life Technologies) que contenía amortiguador HEPES 25mM (sin bicarbonato de sodio) , 10% de suero de carnero fetal (FCS) , penicilina/estreptomicina (PS) , y L-glutamina 2mM. Las células se cultivaron a una densidad de 4xl04 por pozo en una placa microtituladora de 96 pozos en un volumen de 200ul por pozo. Las células se dejaron sedimentar durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente y la placa se colocó entonces en un incubador con aire humidificado a 37°C. Inducción de la internalizacion de PFV-RHPT por hormona para iroidea. Se preparo un patrón de 100 µ? de hormona paratiroidea (HPT) bovina, aminoácidos 1-34 (Bachem, King de Prussia, PA) , utilizando agua acidificada (pH 4-4.5). Para inducir la internalizacion de la quimera de PFV-RHPT, las célula se estimularon mediante la adición de 50 ul de HPT 500 nm a cada pozo (diluida en DMEM/F12, 10% de SCF, PS, L-glutamina 2 mM) . Este volumen se agregó a los 200 ul del medio ya en el pozo, produciendo una concentración final de HPT de 100 nM. La placa se incubó a temperatura ambiente durante dos horas mientras permaneció cubierta con una hoja delgada de aluminio para proteger el fluoróforo de la luz. Después de la estimulación de dos horas con HPT, los medios se decantaron de la placa y las células se fijaron y los núcleos se tiñeron mediante la adición de 200 ul de solución salina Balanceada de Hank (SSBH) que contenía 3.7% de formalina (Sigma) y 1 ug/ml de Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, Oregon) . Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, la solución se decantó de la placa, las células se lavaron mediante la adición de 200 ul/pozo de SSBH, y las placas se analizaron/almacenaron con SSBH fresco (200 ul/pozo) . Adquisición y análisis de imágenes . (Véase la Figura 26 para una vista general) . Después de autoenfocar 1Q1 (Figura 27) sobre los núcleos marcados con Hoechst, se adquirió una imagen de los núcleos 102 a una amplificación de 20 x. La imagen del núcleo se segmentó por umbral 103. utilizando un valor umbral seleccionado por el usuario u obtenido por uno de otros dos métodos de los cuales el usuario puede seleccionar (algoritmo de isodatos o interpolación de pico) . El área total en los pixeles para todos los núcleos en la imagen se calculó entonces como una sola suma 10 . Entonces se adquirió la imagen de la fluorescencia de la PFV a una amplificación de 2x 105 (Figura 26) . El área de la imagen de la placa formada de esta manera es llamada un campo. Los artefactos grandes son removidos de la imagen de la PFV como sigue 106 (Figura 26) . A la imagen se le asigna a un umbral a un valor de intensidad seleccionado por el usuario el cual es mayor que el umbral utilizado para detectar objetos válidos más tarde. Todos los objetos detectados en la imagen resultante son marcados y su tamaño (número de pixeles) es medido. Cualesquier objetos mayores de un tamaño especificado por el usuario son tratados como artefactos. Todos aquellos objetos son copiados y pegados sobre una nueva imagen en blanco, la imagen del artefacto. La imagen del artefacto es ligeramente dilatada para asegurar que los artefactos sean suprimidos completamente. La imagen del artefacto es entonces sustraída de la imagen de la PFV original, produciendo la imagen intermedia. Para remover variaciones en la fluorescencia de fondo, la imagen intermedia es sometida a una transformación superior 107. (Figura 26) . Esta transformación consiste de una (a) de erosión de la escala de gris (reemplazo del valor de cada pixel por el valor mínimo en su vecindad) (b) una dilatación de la escala de gris (reemplazo del valor de cada pixel por el valor máximo en su vecindad) con la vecindad del mismo tamaño como (a) , produciendo una imagen de fondo, y (c) sustracción de la imagen de fondo resultante de la imagen alimentada originalmente para producir la imagen del objeto, la cual contiene pequeños puntos brillantes. El tamaño de la vecindad utilizada para los pasos (a) y (b) se seleccionó de modo que fueran ligeramente mayor que todos los objetos de interés en la imagen. Como resultado, todos los objetos están ausentes de la imagen de fondo después de la erosión (a) y dilatación (b) . sin embargo, las variaciones graduales en el fondo de la imagen original son retenidas en la imagen de fondo. Por lo tanto, el paso de sustracción (c) remueve esas variaciones en el fondo de la imagen del objeto. La imagen del objeto es procesada para determinar cuales puntos brillantes representan al receptor internalizado en las células estimuladas. Este proceso utiliza un umbral de brillantez y un tamaño mínimo fijado por el usuario. A la imagen del objeto se le asigna un umbral al umbral de brillantez para crear una máscara de objeto binaria 108 (Figura 26) . Los objetos en la máscara de objetos binaria son marcados y sus tamaños son medidos en pixeles. Aquellos objetos que satisfacen no exceden en tamaños mínimos son manchas o puntos válidos 109 (Figura 28) , los restantes se ignoraron . A continuación se determinan entonces las siguientes mediciones por cada punto válido. (Figura 28) .

El conteo de manchas o puntos en el campo se incrementa 110. El número de pixeles fue previamente contado. Por cada mancha o punto válido, la región con su marca es extraída en la máscara de objeto binaria para crear la máscara binaria de un solo punto. La máscara binaria de un solo punto es aplicada a la imagen del objeto original para obtener la imagen en punto en escala de gris de punto respectivo. Las intensidades de los pixeles en la imagen del punto de la escala de gris se suman para obtener la intensidad agregada de la mancha o punto 111. Una vez que todas las manchas o puntos han sido procesados, la suma de todas las áreas de las manchas o puntos válidos se suman para obtener el área puntual agregada para el campo 112. La intensidad agregada de los puntos es totalizada para obtener la intensidad puntual agregada del campo. Existen varias estadísticas para elegir el valor final para el campo (o pozo) : (a) el número de manchas o puntos válidos; (b) el área agregada de las manchas o puntos válidos; (c) la intensidad agregada de los puntos válidos; (d) la intensidad agregada de los puntos válidos dividida por el área total de los núcleos. Cuando se analiza más de un campo dentro de cada pozo, los valores para todos los campos del pozo son promediados en conjunto para obtener una estadística agregada para el pozo 103 (Figura 26) . Los siguientes ejemplos de determinación de la internalización del receptor utilizando las técnicas anteriores ilustran las diferencias encontrada entre células tratadas y no tratadas. Los núcleos de las células estimuladas se marcaron con la tinción de Hoechst específica para el ADN y sus imágenes se formaron con un juego de filtro de fluorescencia de UV cercana. Las imágenes de las mismas células se formaron con un juego de filtros de fluorescencia azul que muestra la distribución de la fluorescencia de la PFV. La máscara nuclear se derivó aplicando un umbral a la imagen marcada del núcleo, y la imagen de fondo se derivó por la remoción y dilatación de la escala de gris de la imagen de la PFV, mostrando la variación en la intensidad de fondo. La imagen del objeto se derivó entonces sustrayendo la imagen de fondo de la imagen de la PFV, dando como resultado manchas o puntos débiles. La máscara del objeto se derivó entonces aplicando el umbral a la imagen del objeto. Algunos puntos débiles se eliminaron por medio del umbral. Algunos otros tienen menos pixeles sobre el umbral que el requerimiento para una mancha o punto válido. Como resultado, se encontraron muy pocos puntos válidos en la imagen de células no estimuladas. El conteo de manchas o puntos, las áreas de manchas o puntos agregados, y la brillantez de los puntos agregados tuvieron todas valores bajos. En un segundo ejemplo, los núcleos de células estimuladas se marcaron con la tinción de Hoechst específica para el ADN y sus imágenes se formaron como en el ejemplo precedente. La máscara nuclear se derivó por el método de asignación de umbral automatizado, y la imagen del fondo se derivó por la erosión y dilatación de la escala de gris de la imagen de la PFV, mostrando las variaciones en la intensidad del fondo. La imagen del objeto se derivó sustrayendo la imagen de fondo de la imagen de la PFV, dando como resultado manchas o puntos brillantes. La máscara del objeto se derivó aplicando el umbral a la imagen del objeto. Muchas manchas o puntos se observaron en la máscara del objeto, y muchas de aquellas marcas o puntos tienen suficientes pixeles sobre el umbral para satisfacer el requerimiento de manchas o puntos válidos. La cuenta de manchas, áreas de manchas agregadas y brillantez de las manchas agregadas, todos tuvieron valores altos. Los resultados de experimentos similares a esos ejemplos fueron mostrados anteriormente en la Figura 25.

La Figura 29 muestra una representación visual representativa de una pantalla de PC que muestra los datos que fueron obtenidos por los métodos descritos en los ejemplos anteriores. Cada dato puntual representa el Conteo de Manchas o puntos de un solo pozo de la placa, calculado sumando en subconjunto los conteos de manchas o puntos de los campos del pozo. La gráfica 300 muestra curvas individuales, cada una representando una sola hilera de la placa de 96 pozos. Los seis puntos más a la izquierda de cada curva representan los conteos de manchas o puntos de los pozos no tratados, mientras que los seis puntos más a la derecha representan los puntos tratados. La característica de Conteo de manchas o puntos ("conteo de objetos" en la ilustración) puede seleccionarse utilizando la lista 303. Los valores numéricos para todas las hileras se muestran en un formato de hoja electrónica de cálculo 303. La gráfica 300 y la hoja electrónica de cálculo 303 pueden ser impresas, y la hoja electrónica de cálculo puede ser exportada en un formato separado por una coma para introducirse en un programa de hoja electrónica de cálculo tal como Microsoft ExcellMR. De manera alternativa, los datos pueden ser presentados sobre una base de campo por campo (Figura 30) . Cada gráfica en la parte superior 304, 305 y 306 puede ser ajustada para graficar cualquiera de las estadísticas calculadas (promediadas sobre los campos de los pozos) contra el número de pozos. La hoja electrónica de cálculo 307 muestra los datos numéricos cálculos sobre una base de campo por campo. La selección de una línea de la hoja electrónica de cálculo reduce la presentación de las imágenes del Hoechst 308 y la PFV 309 correspondientes a ser presentadas. La hoja electrónica de cálculo 305 puede ser impresa o exportada en un formato de archivo ASCII para alimentarla a un programa de hoja electrónica de cálculo tal como el Microsoft ExcelR . La gráfica 305 muestra el conteo de manchas o puntos contra el número de pozos . El conteo de manchas o puntos es el número de manchas o puntos válidos detectados en las imágenes de la PFV alimentadas. La invención proporciona medios de computadora para convertir la señal digital de la cámara en este parámetro y para graficar el parámetro contra el número de pozos. La gráfica 305 muestra el área de manchas o puntos agregados ("área total de manchas o puntos" en la ilustración) contra el número de pozos. El área de manchas o puntos agregados es las áreas sumadas de todas las áreas o puntos válidos detectados en las imágenes de la PFV alimentadas. La invención proporciona medios de computadora para convertir la señal digital de la cámara en este parámetro para graficar este parámetro contra el número de pozos . La gráfica 306 muestra la relación de la intensidad de la mancha o punto normalizada ("Relación de la Intensidad de la Mancha o Punto x 100" en la ilustración) contra el número de pozos. La relación de la intensidad de manchas o puntos normalizada es las intensidades sumadas de todos los pixeles en las manchas o puntos válidos detectados en las imágenes de la PFV alimentadas, divididas por el número de pixeles sumados en la máscara del núcleo de la imagen de Hoechst correspondiente. La invención proporciona medios de computadora para convertir la señal digital de la cámara en este parámetro para graficar el parámetro contra el número de pozos . La Figura 25 es una representación gráfica de los datos de ensayos de validación de la selección de la internalización de RHPT. La figura ilustra que los datos para min. ("respuesta mínima = no estimulada) y max. ("respuesta máxima = estimulado) son consistentes entre diferentes placas (las diferencias no son estadísticamente significativas), dando c.o.v. (coeficientes de varianza) dentro de un intervalo consistente y aceptable. En un ejemplo específico de una selección de alto contenido, se adquirieron cuatro campos en cada pozo. El Conteo de Manchas o Puntos se sumó a través de los campos de un pozo, y se promedió entre los pozos tratados de manera similar. Colocando la placa sin tratar tuvo un Conteo de Manchas o Puntos de 69.3 ± 17.7 (media ± Desviación Estándar) veces la mitad de la placa sin tratar, dando un Coeficiente de Variación (COV, la Desviación Estándar dividida por la media) de 26%. Los valores de los campos de la mitad de la placa tratada tuvieron un Conteo de Manchas o Puntos de 404.2 + 41.2, dando un COV de (10%) . El Conteo de Manchas o Puntos de la mitad tratada fue 5.83 veces el Conteo de Manchas o Puntos de la mitad no tratada.

Ejemplo 5. Selección Cinética de Alto Contenido Detectar solo el punto final como internalizado o no, puede no ser suficiente para definir la potencia de un compuesto como un agonista o antagonista del receptor. En otra modalidad, las células son tratadas con fármaco y los datos son recolectados a varios puntos en el tiempo después del tratamiento con fármaco para cuantificar la cinética de internalización del receptor. Esos ensayos cinéticos pueden efectuarse en células vivas como se describió anteriormente, o pueden ser fijados diferentes pozos de células a cada uno de los diferentes puntos en el tiempo de interés después del tratamiento con fármaco. En cualquier caso, las células pueden ser marcadas utilizando los reactivos y métodos descritos anteriormente. Tales mediciones cinéticas proporcionarían la información no sólo acerca de la potencia durante el curso temporal de la medición, sino que también permitirían la extrapolación de los datos a periodos de tiempo mucho mayores. En una modalidad preferida, las mediciones cinéticas se hacen primero en un canal de fluorescencia en un modo de alto rendimiento o rendimiento ultraalto para una respuesta celular asociada con la internalización del receptor. Esta respuesta es menos específica que la del receptor que el proceso de internalización en si y puede incluir, pero no se limita a, cambios en las concentraciones de Ca++, AMPC, o IP3 o activación de cualquiera de una variedad de cinasas. Los pozos que exhiben el resultado deseado de este parámetro son entonces analizados en el modo CAC para información temporal y espacial altamente detallada sobre una base de células por célula. Los señales de luminiscencia de las células vivas o fijadas se analizan utilizando un sistema de exploración celular, tal como el sistema de exploración celular de la presente invención.

Ejemplo 6. Secuencias Insertadas y sus Ligandos para Selecciones de Alto Contenido que Incorporan Receptores Doblemente Marcados En otra modalidad, un receptor de la membrana se modificó para que tuviera secuencias peptídicas específicas fusionadas a cada extremo para marcar de manera distinta los dominios extracelular e intracelular . Se hizo una relación de la intensidad de la fluorescencia de las dos marcas en células no estimuladas y estimuladas; puesto que el amino terminal del receptor está sólo disponible para el mareaje mientras el receptor esté insertado en la membrana plasmática, la relación de las dos marcas en células no permeabilizadas puede ser utilizada para medir el grado de internalización del receptor. Actualmente no existe tecnología conocida para medir simultáneamente la disponibilidad extracelular relativa de los dominios externo e interno de los receptores de la membrana. Las células apropiadas son transíectadas de manera transitoria o estable con un constructo de ADN (ya sea plasmídico o viralmente basado) que expresa el RAPG de interés fusionado a una marca epitópica en su amino terminal y un cromóforo basado molecularmente en su carboxi terminal. De manera alternativa, el RAPG puede ser fusionado a una marca epitópica en su carboxilo terminal y un cromóforo basado molecularmente en su amino terminal. La expresión de la fusión del RAPG puede ser constitutiva o inducible. Algunos ejemplos de marcas epitópicas incluyen, pero no se limitan a (Sigma Chemical, St . Louis, MO) , myc (OE19= (Invitrogen, Carlsbad, CA) , 6-His (Invitrogen; Novagen, Madison, I) , y HA (Boehringer, Mannheim Biochemicals) . La expresión de la fusión del RAPG puede ser constitutiva o inmiscible. Los ejemplos de cromóforos basados molecularmente útiles incluyen, pero no se limitan a PFV, y cualquiera de sus diferentes mutantes (Heim y Tsien (1996) Current Biology 6: 178-182; Zhang et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Comm. 227: 707-711). Además, puede ser utilizada cualquiera de las luciferasas y sus mutantes . El uso de una luciferasa como parte de una proteína quimérica objetivo comprende una técnica de mareaje novedosa puesto que los ejemplos de uso de este cromóforo basado molecularmente a la fecha han incluido el uso como reportero de la actividad genética (Yang et al. (1998) J. Biol. Chem. 273(17): 10763-10770; Peng et al. (199B) J. Biol. Chem. 273(27): 17286-17295; Baldari et al. (1998) Biologicals 26(1): 1-5)) y construcción de biosensores (Campbell y Patel (1983) Biochem. J. 216: 185-194; Sala-Newby y Campbell (1992) FEBS Lett . 307: 241-244; Jenkins et al. (1990) Biochem. Soc . Trans . 18: 463-464) pero no como una quimera para marcas un objeto proteico particular. La expresión de la fusión de la proteína de la membrana-proteína luminiscente puede ser constitutiva (dirigida por cualquiera de una variedad de promotores, incluyendo pero sin limitarse a CMV, SV40, RSV, actina, EF) o inducible (dirigida por cualquiera de un número de promotores inducibles incluyendo, pero sin limitarse a, tetraciclina, eedisona, respuesta a esteroides) . De manera alternativa, las células son transfectadas de manera transitoria o estable con un constructo de ADN (ya sea plasmídico o basado viralmente que expresa la proteína de la membrana de interés fusionada a dos marcas epitópicas distintas, con una estando fusionada a cada extremo de la proteína de la membrana . La disponibilidad externa de las secuencias insertadas depende del estado de internalización del receptor. Es decir, que la relación de la disponibilidad externa de las secuencias insertadas proporciona una medida directa de la magnitud de internalización del receptor. Esta es una selección de alto contenido que incorpora receptores doblemente marcados . La disponibilidad externa de la secuencia insertada puede ser medida utilizando un solo método o una combinación de varios métodos : 1. Una o más de las secuencias insertadas pueden ser epitopos para anticuerpos específicos. La unión del anticuerpo al epitopo puede ser medida utilizando métodos histoquímicos , radioactivos o de fluorescencia. Los posibles epitopos incluyen, pero no se limitan a aquéllos mostrados en la Tabla I.

TABLA I. EPITOPOS PEPTIDICOS Y SUS ANTICUERPOS CORRESPONDIENTES ANTICUERPO EPITOPO FUENTE Y FLAG MDYKDDDDK Sigma yc EQKLISEEDL Invitrogen, Boehringer- Mannheim Biochemical (BMB) 6-His HHHHHH Invitrogen, BMB, Berkley Antibody Company (BAbCO) AU1 DTYRYI BabCO AU5 TDFYLK BabCO Glu-Glu EEEEYMPME BAbCO HA YPYDVPDYA BMB, BAbCO IRS NPDSEIARYIRS BAbCO KT-3 KPPTPPPEPET BAbCO Proteína C EDQVDPRLIDGK BMB TABLA I. EPITOPOS PEPTIDICOS Y SUS ANTICUERPOS CORRESPONDIENTES (continuación) 2. Las secuencias insertadas pueden codificar para proteínas fluorescentes. Además de los fluoróforos naturales de trp, tyr, y phe que existen en muchas proteínas, pueden insertarse otras secuencias de proteína fluorescente. La secuencia de la PFV o uno de sus variantes mutantes puede ser insertada en la secuencia que codifica para el receptor. Las secuencias que codifican para la luciferasa y sus variantes mutantes también pueden ser insertadas. Cualquier secuencia peptídica que codifique para o interactúe con un fluoróforo puede ser utilizada en este método. Las secuencias insertadas pueden ser estructuradas para expresar proteínas fluorescentes con diferentes propiedades fluorescentes de modo que las señales fluorescentes de cada una puedan ser medidas independientemente . 3. Las secuencias insertadas pueden codificar para péptidos que se unan a pequeños ligandos (<1000 Mr) con alta afinidad (Kd < 10"9) y especificidad. Esas pequeñas moléculas forman entonces un fuerte puente con otras moléculas o macromoléculas que pueden ser marcadas de manera luminiscente o radioactiva. Las secuencias insertadas pueden ser estructuradas para unirse a diferentes moléculas que forman puentes que se unen de manera distinta a moléculas o macromoléculas marcadas de modo que las señales de cada una pueden ser medidas independientemente. Por ejemplo, la secuencia peptídica -HHHHHH- se unirá a un ion metálico (por ejemplo, Ni2+, Cu2+, etc.) que formará un puente fuerte con una porción de ácido acético polidentado (por ejemplo, ácido nitriloacético) . La porción ácida puede ser ligada covalentemente a moléculas que son luminiscentes, radioactivas, o absorben luz de otro modo. Esas moléculas pueden ser tintes o macromoléculas luminiscentes tales como proteínas que contienen una marca luminiscente o radioactiva. Otros ejemplos de secuencias peptídicas insertadas son aquéllos que tienen una alta afinidad por otras moléculas pequeñas que incluyen hormonas esteroides, vitaminas y carbohidratos que forman un puente fuerte con otras moléculas o macromoléculas que pueden ser marcadas de manera luminiscente o radioactiva.

Ejemplo 7. Una Selección de Alto Contenido de la Internalización del receptor Doblemente Marcado Generalizada Un receptor acoplado a la proteína G modificada (RAPG de función conocida o huérfana) se transfecta en células de riñon epiteliales humanas (HEK 293) donde su localización proporciona una medida de la internalización desde la membrana plasmática. El RAPG modificado contiene un epitopo (por ejemplo FLAG) marcado en el N terminal (extracelular) y una molécula de PFV en el C terminal ( intracelular) . Para medir la internalización del RAPG después del tratamiento del ligando, las células son fijadas y marcadas con Hoechst 3342 (un tinte fluorescente que se une al ADN) y un anticuerpo marcado de manera luminiscente distinto contra la marca epitópica. Se utiliza un sistema de selección celular, tal como el sistema de selección celular de la presente invención, utilizando la formación de la relación, para calcular la internalización del RAPG debido a la pérdida del epi opo del RAPG del lado externo de la membrana plasmática y un incremento en el receptor marcado sólo con PFV dentro de la célula. Este método para medir la internalización del receptor inducida por el ligando es independiente del mecanismo de internalización, por lo que es aplicable a una amplia gama de receptores de función tanto conocida como desconocida.

Ejemplo 8 Selección de alto contenido de la translocación del receptor de glucocorticoide humano Una clase de SAC implica la distribución dinámica de los constituyentes intracelulares inducida por f rmacos . El receptor del glucocorticoide humano (RGh) un "sensor" único en la maquinaria de la respuesta ambiental compleja de la célula, se une a moléculas esteroideas que se han difundido en la célula. El complejo ligando-receptor se transloca al núcleo cuando ocurre la activación transcripcional (Htun et al., Proc. Nati. Acad. Sci . 93:4845, 1996). En general, los receptores de hormonas son objetivos de fármacos excelentes debido a que su actividad se encuentra en el vértice de la vía de señalización intracelular clave. Por lo tanto, una selección de alto contenido de la traslocación del RGh tiene distintas ventajas sobre los ensayos de unión ligando-receptor in vitro. La disponibilidad de hasta dos o más canales de fluorescencia en el sistema de selección celular de la presente invención permite la selección del contenido de otros parámetros adicionales en paralelo, tales como otros receptores, otros objetivos u otros procesos celulares distintos.

Constructo plasmídíco . Se preparó un plásmido de expresión eucariótico que contiene una secuencia que codifica para una quimera de proteína fluorescente verde-receptor de glucocorticoide humano (PFV-RGh) utilizando una parte de PFV (Palm et al., Nat. Struct. Biol . 4:361 (1997) . El constructo se utilizó para transfectar una línea de células de carcinoma cervical humana (HeLa) . Preparación y transfeccion celular. Las células HeLa (ATCC CCL-2) fueron tripsinizadas y cultivas utilizando DMEM con un contenido del 5% de suero bovino fetal (SBF) (HyClone) tratado con carbón/dextran y 1% de penicilina-estreptomicina (C-DMEM) 12-24 horas antes de la transfeccion y se incubaron a 37°C y 5% de C02. Las transfecciones se efectuaron por coprecipitación con fosfato de calcio (Graham y Van der Eb, Virology 52:456, 1973,· Sambrook et al., (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989) o con Lipofectamina Life Techonologies, Gaithersburg, MD) . Para las transfecciones con fosfato de calcio, el medio fue reemplazado, antes de la transfección, con DMEM con un contenido del 5% de SBF tratado con carbón/dextran . Las células fueron incubadas con el precipitado de fosfato de calcio del ADN durante 4-5 horas a 37°C y 5% de C02, se lavaron 3-4 veces con DMEM para remover el precipitado, seguido por la adición de C-DMEM. Las tranfecciones con lipofectamina se efectuaron en DMEM libre de suero sin antibióticos de acuerdo a las intrucciones del fabricante (Life Technologies, Gaithersburg, MD) . Después de la incubación de 2-3 horas con los complejos de ADN-liposoma, el medio fue removido y reemplazado con C-DMEM. Todas las células transfectadas en las placas microtituladoras de 96 pozos fueron incubadas a 33°C y 5% de C02 durante 24-48 antes del tratamiento con fármaco. Los experimentos se efectuaron con el receptor expresado transitoriamente en células HeLa.

Inducción de la translocación de PFV-RGh con dexametasona. Para obtener los datos cinéticos de translocación de receptor- ligando, los núcleos de las células transfectadas fueron marcados primero con 5ng/ml de Hoechst 33342 (Molecular Probes) en C-DMEM durante 20 minutos a 33 °C y 5% de C02. Las células fueron lavadas una vez con solución salina balanceada de Hank (SSBH) seguida por la adición del dexametasona de 10 nM en SSBH con 1% de SBF tratado con carbón/dextran . Para obtener datos de titulación de dexametasona puntuales en el tiempo fijos, las células HeLa transfectadas fueron lavadas primero con DMEM y a continuación incubadas a 33°C y 5% de C02 durante una hora en presencia de 0-1000 nM de dexametasona en DMEM con un contenido del 1% de SBF tratado con carbón/dextran. Las células se analizaron vivas o fueron enjuagadas con SSDH, fijadas durante 15 minutos con formaldehído a 3.7% en SSBH, teñidas con Hoechst 33342, y lavadas antes del análisis. La señal de la fluorescencia de PFV-RGh intracelular no disminuyó por este procedimiento de fijación. Adguisición de análisis de imágenes. Los datos cinéticos se recolectaron adquiriendo pares de imágenes de fluorescencia (PFV-RGh) y núcleos marcados con Hoechst 33342 de campos de células vivientes a intervalos de 1 minuto durante 30 minutos después de la adición de la dexametasona . De igual modo, se obtuvieron pares de imágenes de cada pozo de las placas de selección de puntos en el tiempo fijos 1 hora después de la adición de dexametasona. En ambos casos, los pares de imágenes obtenidos en cada punto temporal se utilizaron para definir las regiones nuclear y citoplásmica en cada célula. La translocación de PFV-RGh se calculó dividiendo la intensidad de la fluorescencia integrada de PFV-RGh en el núcleo por la intensidad fluorescente integrada de la quimera en el citoplasma o como una diferencia nuclear-citoplásmica de la fluorescencia de la PFV. En la selección puntual temporal fija esta relación de translocación se calculó de los datos obtenidos de al menos 200 células a cada concentración de dexametasona probada. La translocación de PFV-RGh inducida por el fármaco del citoplasma al núcleo se correlacionó por lo tanto por un incremento en la relación de translocación. Resultados. La Figura 20 presenta esquemáticamente la translocación del citoplasma 253 al núcleo 252 inducida por el fármaco del receptor del glucocorticoide humano. El par superior de los diagramas esquemáticos describe la localización de PFV-RGh dentro de la célula antes 250 (A) y después 251 (B) de la estimulación con dexametasona . Bajo esas condiciones experimentales, el fármaco induce una gran porción del PFV-RGh citoplásmicos a translocarse hacia el núcleo. Esta redistribución es cuantificada determinando la relación de intensidades integradas de la fluorescencia citoplásmica y nuclear en células tratadas 255 y no tratadas 254. El par inferior de micrográficas de fluorescencia muestra la redistribución dinámica de PFV-RGh en una sola célula, antes 254 y después 255 del tratamiento. La SAC se efectuó sobre pozos que contenían de cientos a miles de células transíectadas y la translocación se cuantificó por cada célula en el campo que exhibe fluorescencia de PFV. Aunque el uso de una línea celular transfectada de manera estable produciría las células marcadas de manera más consistente, los niveles heterogéneos de expresión de PFV-RGh inducidos por la transfección transitoria no interfirieron el análisis por el sistema de selección celular de la presente invención. Para ejecutar la selección, el sistema de selección celular explora cada pozo de la placa, forma imágenes de una población de células en cada uno, y analiza las células individualmente. Aquí, se utilizaron dos canales de fluorescencia para definir la distribución citoplásmica y nuclear de PFV-Rh dentro de cada célula. Descrita en la Figura 21 se encuentra la interfaz gráfica del usuario del sistema de selección celular cerca del fin de una selección de PFV-RGh. La interfaz del usuario describe la recolección de datos en paralelo y la capacidad de análisis del sistema. Las ventanas marcadas como "Núcleos" 261 y "PFV-RGh" 262 muestran el par de imágenes de fluorescencia que están siendo obtenidas y analizadas en un solo campo. La ventana marcada como "Superposición de Color" 260 se forma pseudocoloreando las imágenes anteriores y fundiéndolas de modo que el usuario pueda identificar inmediatamente cambios celulares. Dentro de la ventana "Regiones de Objeto Almacenado" 265. una imagen que contiene cada célula analizada y sus vecinas es presentada como si estuviera archivada. Además, a medida que los datos de la SAC están siendo recolectados, son analizados, en este caso para la translocación de PFV-RGh, traducidos en una respuesta de "acierto" inmediata. La placa de 96 pozos descrita en la ventana inferior de la pantalla 267 muestra cuáles pozos han satisfecho un conjunto de criterios de selección definidos por el usuario. Por ejemplo, un pozo coloreado de blanco 269 indica que la translocación inducida por el fármaco ha excedido un valor umbral predeterminado del 50%. Por otro lado, un pozo coloreado de negro 270 indica que el fármaco que está siendo probado indujo una translocación de menos del 10%. Los pozos coloreados de gris 268 indican "aciertos" donde el valor de la translocación cayó entre el 10% y el 50%. La hilera "E" sobre la placa de 96 pozos está siendo analizada 266 muestra una titulación con un fármaco que se sabe activa la translocación de PFV-RGh, dexametasona . Esta selección ejemplar utilizó únicamente dos canales de fluorescencia. Dos canales adicionales (Canales 3 263 y 4 264 ) están disponibles para el análisis paralelo de otros objetivos específicos, procesos celulares o citotoxicidad para crear selecciones de múltiples parámetros. Existe un enlace entre la base de datos de imágenes y la base de datos de información que es una herramienta poderosa durante el proceso de validación de nuevas selecciones. Al completar una selección, el usuario tiene acceso total a las imágenes y datos calculados (Figura 22) . El paquete de análisis de datos completo del sistema de selección celular permite al usuario examinar datos de SAC a múltiples niveles. Las imágenes 276 y los datos detallados en una hoja electrónica de cálculo 279 para células individuales pueden verse en forma separada, o pueden graficarse los datos resumidos. Por ejemplo, los resultados calculados de un solo parámetro en cada célula en una placa de 96 pozos son mostrados en el panel marcado como Gráfica 1 275. Seleccionando un solo punto en la gráfica, el usuario puede presentar todo el conjunto de datos para una célula particular que sea recuperable una base de datos existente. Mostrado aquí se encuentran un par de imágenes 276 y los datos de fluorescencia y morfometricos detallados de una sola célula (célula # 118, línea gris 221) - El inserto gráfico grande 278 muestra los resultados de la concentración de dexametasona sobre la translocación de PFV-RGh. Cada punto es el promedio de datos de al menos 200 células. La CE50 calculada para la dexametasona en este ensayo es de 2 nM. Un aspecto poderoso de la SAC con el sistema de selección celular es la capacidad de mediciones cinéticas utilizando parámetros de fluorescencia y morfométricos multicolor en células vivientes. Pueden hacerse mediciones temporales y espaciales sobre células únicas dentro de una población de células en un campo. La figura 23 muestra datos cinéticos para la translocación de PFV-RGh inducida por dexametasona en varias células dentro de un solo campo. Las células HeLa transíectadas con PFV-RGh fueron tratadas con 100 nM de dexametasona y la translocación del PFV-RGh se midió con el tiempo en una población de células únicas. La gráfica muestra la respuesta de las células transfectadas 285. 286. 287 y 288 y células no transfectadas 289. Esos datos también ilustran la capacidad para analizar células en diferentes niveles de expresión. Ejemplo 9 Selección de alto contenido de apoptosis inducida por fármacos. La apoptosis es un programa celular complejo que implica miles de eventos y vías moleculares. Para comprender los mecanismos de acción en este proceso, es esencial medir tantos de esos eventos dentro de la célula como sea posible con resolución temporal y espacial . Por lo tanto, una selección de apoptosis que requiera poca preparación de la muestra celular y proporcione a la vez una lectura automatizada de varios parámetros relacionados con apoptosis sería ideal. Ha sido utilizado un ensayo basado en células diseñado para el sistema de selección celular para cuantificar simultáneamente varias marcas morfológicas, de organelos y macromoleculares de la apoptosis inducida por paclitaxel. Preparación celular. Las células elegidas para este estudio fueron fibroblastos de tejido conectivo de ratón (L-929, ATCC CCL-l) y una línea celular de glioblastoma altamente invasivo (SNB-19; ATCC CRL-2219) (Welch et al., In Vitro Dev. Biol. 31:610, 1995). El día antes del tratamiento con un fármaco que induce a apoptosis, se colocaron 3500 células en cada pozo de una placa de 96 pozos y se incubaron durante la noche a 37 °C en una atmósfera con 5% de C02, humidificada . Al siguiente día, el medio de cultivo fue removido de cada pozo y reemplazado con medio fresco que contenía varias concentraciones de paclitaxel (0 - 50 µ?) de un patrón de 20 mM hecho en DMSO. La concentración máxima del DMSO utilizada en esos experimentos fue de 0.25%. Las células fueron entonces incubadas durante 26 h como anteriormente. Al final del periodo de tratamiento con paclitaxel, cada pozo recibió medio fresco que contenía Rojo de Mito Tracker 750 nM (Molecular Probes; Eugene, OR) y 3 µ9/p?1 de tinte que une al ADN Hoechst 33342 (Molecular Probes) y se incubó como anteriormente durante 20 minutos. Cada pozo sobre la placa fue entonces lavado con SSBH y fijado con 3.7% de formaldehído en SSBH durante 15 minutos a temperatura ambiente. El formaldehído fue lavado con SSBH y las células fueron permeabilizadas durante 90 s con Tritón X-100 0.5% (volumen/volumen) , lavados son SSBH, incubados con 2 U mi"1 de falacidina Bodipy FL (Molecular Probes) durante 30 minutos, y se lavaron con SSBH. Los pozos sobre las placas fueron entonces llenados con 200 µ? de SSBH, sellados, y la placa almacenada a 4°C si era necesario. Las señales de fluorescencia de las placas almacenadas de esta manera fueron estables durante al menos dos semanas después de la preparación. Como en el ensayo de translocación nuclear, pueden diseñarse reactivos de fluorescencia para convertir este ensayo en una selección de alto contenido de células vivas. Adquisición de análisis de imágenes sobre el Sistema ArrayScan . La intensidad de la fluorescencia del Rojo Mito Tracker intracelular, Hoechst 33342, y falacidina Bodipy FL se midió con el sistema de selección celular como se describió supra. También se obtuvieron los datos morfométricos de cada par de imágenes obtenidas de cada pozo para detectar cada objeto en el campo de la imagen (por ejemplo, células y núcleos) , y para calcular su tamaño, forma e intensidad integrada. Cálculos y resultados . Se midieron un total de 50-250 pozos por campo de imagen. Por cada campo de células, se efectuaron los siguientes cálculos: (1) Se calculó el área nuclear promedio (µp?2) dividiendo el área total nuclear en un campo por el número de núcleos detectados. (2) Se calculó el perímetro nuclear promedio (µp?) dividiendo la suma de los perímetros de todos los núcleos en un campo por el número de núcleos detectados en ese campo. Los núcleos apoptóticos altamente convolucionados tuvieron los valores de perímetro nuclear más grandes. (3) Se calculó la brillantez nuclear promedio dividiendo la intensidad integrada de todo el campo de núcleos por el número de núcleos en ese campo. Un incremento en la brillantez nuclear se correlacionó con un incremento en el contenido de ADN. (4) Se calculó la brillantez celular promedio dividiendo la intensidad integrada de un campo completo de células teñidas con tinte Mito Tracker por el número de núcleos en ese campo. Debido a que la cantidad de tinte Mito Tracker que se acumule dentro de la mitocondria es proporcional al potencial mitocondrial , un incremento en la brillantez celular promedio es consistente con un incremento en el potencial mitocondrial. (5) También se calculó la brillantez celular promedio dividiendo la intensidad integrada de un campo completo de células teñidas con tinte falacidina Bodipy FL por el número de núcleos en ese campo. Debido a que las falotoxinas se unen con alta afinidad a la forma polimerizada de la actina, la cantidad del tinte de falacidina Bodipy FL que se acumula dentro de las células es proporcional al estado de polimerización de la actina. Un incremento en la brillantez celular promedio es consistente con un incremento en la polimerización de la actina. Resultados. La Figura 24 (páneles superiores) muestra los cambios inducidos por el paclitaxel en la morfología nuclear de las células L-929. El incremento de las cantidades de paclitaxel hizo que los núcleos se alargaran y fragmentaran 293. una marca de la apoptosis. Los análisis cuantitativos de esas y otras imágenes obtenidas por el sistema de selección celular se presentan en la misma figura. Cada parámetro medido mostró que las células L-929 296 fueron menos sensibles a bajas concentraciones de paclitaxel de lo que fueron las células SNB-19 297. Aunque a altas concentraciones, las células L-929 mostraron una respuesta por cada parámetro medido. El método de parámetros múltiples de ese ensayo es útil para disectar los mecanismos de acción del fármaco. Por ejemplo, el área, brillantez, y fragmentación de los núcleos 298 y los valores de polimerización de la actina 294 alcanzaron un valor máximo cuando las células SNB-19 fueron tratadas con paclitaxel 10 mM (Figura 24; gráficas superior e inferior) . Sin embargo, el potencia mitocondrial 295 fue mínimo a la misma concentración de paclitaxel (Figura 24; gráfica media) . El hecho de que todos los parámetros medidos se aproximaron a los niveles control a concentraciones mayores de paclitaxel (>10 nM) sugiere que las células SNB-19 tienen baja afinidad metabólica por el fármaco o vías de eliminación que son compensatorias a niveles suficientemente altos del fármaco. Contrastando con la sensibilidad del fármaco de las células SNB-19 297. las L-929 mostraron una respuesta diferente al paclitaxel 296. Esas células fibroblásticas mostraron una respuesta máxima en muchos parámetros a 5 µ? de paclitaxel, una dosis 500 veces mayor que la de las células SNB-19. Además, las células L-929 no mostraron una disminución aguda en el potencial mitocondrial 295 a cualquiera de las concentraciones de paclitaxel probadas. Este resultado es consistente con la presencia de vías de apoptosis únicas entre una línea celular normal y una cancerosa. Por lo tanto, esas células indican que un protocolo de mareaje de confluencia relativamente simple puede ser acoplado con el sistema de selección celular de la presente invención para producir una selección de alto contenido de eventos clave implicados en la muerte celular programada.

Ejemplo 10. Translocación inducida por proteasa de una enzima de señalización que contiene una secuencia asociada con una enfermedad del citoplasma al núcleo. Constructo plasmídico . Se preparó una quimera de plásmido de expresión eucariótico que contenía una secuencia que codifica para una proteína fluorescente verde - caspasa (Cohén (1997), Bioche ical J. 326:1-16; Liang et al. (1997); J. of Molec. Biol . 274:291-302) utilizando imitante de PFV. El constructo se utilizó para transfectar células eucarióticas . Preparación y transfeccion celular. Las células se tripsinizaron y cultivaron 24 horas antes de la transmisión transfeccion y se incubaron a 37°C y 5% de C02. Las transfecciones se efectuaron por métodos incluyendo, pero sin limitarse a la precipitación con fosfato de calcio o lipofección. Las células se incubaron con el precipitado de fosfato de calcio-ADN durante 4-5 horas a 37°C y 5% de C02, se lavaron 3-4 veces con DMEM para remover el precipitado, seguido por la adición de C-DMEM. Las transíecciones con lipofectamina se efectuaron en DMEM libre de suero sin antibióticos de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Después de una incubación de 2-3 horas con complejos de ADN-liposoma, el medio se removió y reemplazó con C-DMEM.

Inducción apoptótica de la translocación de Caepasa-PFV . Para obtener datos cinéticos de la translocación de la caspasa-PFV, los núcleos transfectados de las células se marcaron primero con 5 ng/ml de Hoechst 33342 (Molecular Probes) en C-DMEM durante 20 minutos a 37°C y 5% de C02. Las células se lavaron una vez con solución salina balanceada de Hank (SSBH) seguida por la adición de los compuestos que inducen la apoptosis. Esos compuestos incluyen, pero no se limitan al paclitaxel, estaurosporina, ceramida, y factor de la necrosis tumoral . Para obtener los datos de titulación puntuales temporalmente fijos, las células transfectadas se lavaron primero con DMEM y a continuación se incubaron a 37°C y 5% de C02 durante 1 h en presencia de 0-1000 nM del compuesto DMEM. Las células se analizaron vivas o se enjuagaron con SSBH, se fijaron durante 15 minutos con 3.7% de formaldehído en SSBH, se tiñeron con Hoechst 33342, y se lavaron antes del análisis . Adquisición y análisis de imágenes. Los datos cinéticos se recolectaron pares de imágenes de fluorescencia (Caspasa-PFV y núcleos marcados con Hoechst 33342) de campos de células vivientes a intervalos de 1 minuto durante 30 minutos después de la adición del compuesto. De igual modo, se obtuvieron pares de imágenes de cada pozo de las placas de selección puntuales temporales fijas una hora después de la adición del compuesto. En ambos casos, los pares de imágenes obtenidas en cada punto temporal se utilizaron para definir regiones nucleares y citoplásmicas en cada célula. La translocación de la Caspasa-PFV se calculó dividiendo la intensidad de la fluorescencia integrada de la caspasa-PFV en el núcleo por la intensidad de la fluorescencia integrada de la quimera en el citoplasma o como una diferencia nuclear-citoplásmica de la fluorescencia de la PFV. En las selecciones puntuales temporales fijas esta relación de translocación se calculó de los datos obtenidos de al menos 200 células a cada concentración de compuesto probado. La translocación de la Caspasa-PFV inducida por el fármaco del citoplasma al núcleo se correlacionó por lo tanto con un incremento en la relación de translocación. Se utilizan bibliotecas de interacción molecular incluyendo, pero sin limitarse a aquéllas que comprenden activadores o inhibidores putativos de enzimas activadas por apoptosis para seleccionar las líneas celulares indicadoras e identificar un ligando específico para las SAE, y una vía activada por la actividad del compuesto.

E emplo 21. Identificación de receptores esteroideos novedosos de SAE Se requieren dos fuentes de material y/o información para hacer uso de esta modalidad, la cual permite la evaluación de la función de un gen no caracterizado. Primero, pueden ser utilizados bancos de secuencias asociadas con enfermedades que contengan secuencias de ADNc adecuadas para la transfección en células de mamífero. Debido a que cada AERD genera diferentes experimentos de expresión de hasta varios cientos de secuencias, es posible generar un amplio suministro de SAE. Segunda, la información de búsquedas de bases de datos de secuencias primarias puede ser utilizada para colocar las SAE en categorías amplias, incluyendo, pero sin limitarse, a aquéllas que contienen secuencias de señales, siete nativos transmembranales, dominios de sitio activo de proteasa conservados, u otros nativos identificables . En base a la información adquirida de esas fuentes, se seleccionan los tipos de algoritmos y linajes de células indicadoras a ser transíectadas . Un gran número de motivos ya están bien caracterizados y codificados en las secuencias lineales contenidas dentro del gran número de genes en las bases de datos genómicas existentes. En una modalidad, se efectúan los siguientes pasos : 1) La información del experimento de identificación de SAE (incluyendo las búsquedas en bases de datos) se utilizó como la base para seleccionar los procesos biológicos relevantes. (Por ejemplo, buscar las SAE de una línea tumoral para la modulación del ciclo celular, apoptosis, proteasas metastáticas, etc.) . 2) Clasificación de las secuencias de ADN o SAE por motivos identificables (es decir secuencias de señal, 7 dominios transmembranales , dominios de sitio activo de proteasa conservados, etc.) . Este agrupamiento inicial determinará las estrategias de montaje fluorescente, líneas celulares huésped, líneas celulares indicadores, y bancos de moléculas bioactivas a ser seleccionadas, como se describió supra. 3) El uso bien establecido de los métodos de biología molecular, SAE ligada en un vector de expresión diseñado para este propósito. Los vectores de expresión generalizados contienen promotores, amplificadores y terminadores para los cuales el nivel de secuencias objetivo a la célula para la expresión transitoria. Tales vectores también pueden contener secuencias de montaje de anticuerpo, secuencias de asociación directa, secuencias de fusión de cromóforo tales como la PFV, etc., para facilitar la detección cuando sean expresadas por el huésped. 4) Transfectar de manera transitoria células con vectores que contienen SAE utilizando protocolos de transfección estándar incluyendo: coprecipitación con fosfato de calcio, mediada por liposoma, mediada por dextran-DEAE, mediada policatiónicamente, mediada viralmente, o electroporación, y cultivar en placas microtituladoras o arreglos de pozos. De manera alternativa, la transfección puede efectuarse directamente en la placa microtituladora en sí. 5) Llevar a cabo los métodos de selección celular como se describió supra. En esta modalidad, la SAS mostró poseer un motivo que sugiere el potencial de activación transcripcional (por ejemplo, domino de unión de ADN, dominio modulador de amino terminal, región articulada o de bisagra, dominio de unión de ligando carboxi terminal) utilizado para identificar receptores de esteroides novedosos .

La definición de las marcas fluorescentes para este experimento implica la identificación de los núcleos a través de tinción, y el mareaje de las SAE creando una quimera de PFV vía la inserción de SAE en un vector de expresión, fusionado cerca del gen que codifica para la PFV. De manera alternativa, podría ser construido un fragmento de anticuerpo de una sola cadena con alta afinidad a una porción de la SAE expresada utilizando la tecnología disponible en la técnica (Cambridge Antibody Technologies) y ligarse a un fluoróforo (FITC) para marcar el activador/receptor transcripcional putativo en las células. Esta alternativa proporcionaría una marca externa que no requiere la transfección de ADN y por lo tanto sería útil si los datos de distribución fueran a ser recabados de cultivos primarios originales utilizados para generar la SAE . Constructo plasmídico. La quimera de plásmido de expresión eucariótico que contiene una secuencia que codifica para una proteína fluorescente verde -SAE se preparó utilizando mutantes de PFV. El constructo se utilizó para transfectar células HeLa. El plásmido, cuando es transfectado en la célula huésped, produce una PFV fusionada al producto proteico de la SAE, designado como PFV-SAEpp.

Preparación y transfacción celular. Las células HeLa se tripsinizaron y se cultivaron utilizando DMEM con un contenido del 5% de suero bovino fetal (SBF) tratado con 5% de carbón/dextran (Hyclone) y 1% de penicilina-estreptomicina (C-DMEM) 12-24 horas antes de la transfección y se incubaron a 37°C y 5% de C02. Las transfecciones se efectuaron por precipitación con fosfato de calcio o con Lipofectamina (Life Technologies) . Para las transfecciones con fosfato de calcio, el medio es reemplazado, antes de la transfección, con DMEM con un contenido del 5% de SBF tratado con carbón/dextran. Las células se incubaron con el precipitado de fosfato de calcio-ADN durante 4-5 horas a 37°C y 5% de C02, y se lavaron 3-4 veces con DMEM para remover el precipitado, seguido por la adición de C-DMEM.

Las transfecciones con lipofectamina se efectuaron en DMEM libre de suero sin antibióticos de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Después de 2-3 horas de incubación con los complejos de ADN-liposoma, el medio se removió y reemplazó con C-DMEM. Todas las células transfectadas fueron incubadas en placas microtituladoras de 96 pozos a 33 °C y 5% de C02 durante 24-48 horas antes del tratamiento con fármaco. Los experimentos se efectuaron con el receptor expresado transitoriamente a las células HeLa. Localización de PFV-SAEpp expresada dentro de las células. Para obtener datos de distribución celular, los núcleos de células transfectadas se marcaron con 5 Hg/ml de Hoechst 33342 (Molecular Probes) en C-DMEM durante 29 minutos a 33°C y 30% de C02. Las células se lavaron una vez en solución salina balanceada de Hank (SSBH) . Las células se analizaron vivas o se enjuagaron con SSBH, se fijaron durante 15 minutos con 3.7% de formaldehído en SSBH, se tiñeron con Hoechst 33342, y se lavaron antes del análisis. En una modalidad preferida, la adquisición de análisis de las imágenes se efectuaron utilizando el sistema de selección celular de la presente invención. La señal de fluorescencia de PFV-SAEpp intracelular se recolectó adquiriendo pares de fluorescencia (PFV-SAEpp y núcleos marcados con Hoechst 33342) de las células del campo. Los pares de imágenes obtenidos en cada punto en el tiempo se utilizaron para definir las regiones nuclear y citoplásmica en cada célula. Los datos que demuestran la señal dispersa en el citoplasma serían consistentes con los receptores de esteroides conocidos que son activadores transcripcionales de ADN.

Selección de la Inducción de la translocación de PFV-SAEpp . Utilizando el constructo anterior, confirmado por la expresión apropiada de PFV-SAEpp, como una línea celular indicadora, se efectuó una selección de varios ligandos utilizando una serie de ligandos del tipo esteroideo incluyendo, pero sin limitarse a: estrógeno, progesterona, retinoides, factores del crecimiento, andrógenos, y muchos otros esteroides y moléculas basadas en esteroides. La adquisición y análisis de las imágenes se efectuaron utilizando el sistema de selección de la invención. La señal de fluorescencia de PFV-SAEpp intracelular se recolectó adquiriendo pares de imágenes de fluorescencia (PFV-SAEpp y núcleos marcados con Hoechst 33342) de las células de los campos. Los pares de imágenes obtenidos en cada punto temporal se utilizaron para definir regiones nucleares y citoplásmicas en cada célula. La translocación de PFV-SAEpp se calculó dividiendo la intensidad de la fluorescencia integrada de la PFV-SAEpp en el núcleo por la intensidad de la fluorescencia integrada de la quimera en el citoplasma o como una diferencia nuclear-citoplásmica de la fluorescencia de la PFV. Una translocación del citoplasma en el núcleo indica la activación de la unión de ligando de la PFV-SAEpp identificando de este modo la clase y acción del receptor potencial . Combinando estos datos con otros datos obtenidos en una forma similar utilizando inhibidores y modificadores conocidos de los receptores esteroideos, la SAEpp sería validada como un objetivo, o se generarían más datos de las diferentes fuentes.

Ejemplo 12. Selecciones adicionales Translocación entre la membrana plasmática y el citoplasma: Disociación compleja de la profilactina y la unión de la profilina a la membrana plasmática. En una modalidad, se preparó un biosensor de proteína fluorescente de la unión de la profilina a la membrana marcando profilina purificada (Federov et al. (1994), J. Molec, Biol . 241 ,-480-482 Lanbrechts et al. (1995), Eur. J. Biochem. 230:281-286) con una sonda que poseía un tiempo de vida de la fluorescencia del intervalo de 2-300 ns . La profilina marcada se introdujo en las células indicadoras vivientes utilizando la metodología de carga a granel y las células indicadoras se trataron con compuestos de prueba. La microscopía de formación de imágenes por anisotropía de fluorescencia (Gough y Taylor (1993), J. Cell . Biol. 121:1095-1107) se utilizó para medir el movimiento dependiente del compuesto de prueba derivado fluorescente de la profilina entre el citoplasma y la membrana durante un periodo de tiempo después del tratamiento que fluctúa de 0.1 a 10 Translocación del complejo Rho-RhoGDI hacia la membrana. En otra modalidad, las células indicadoras se trataron con los compuestos de prueba y a continuación se fijaron, lavaron y permeabilizaron . La membrana plasmática, el citoplasma y el núcleo de la célula indicadora se marcaron todos con distintos marcadores coloreados seguidos por la inmunolocalización de la proteína Rho (Self et al. (1995), Methods in Enzymology 256:3-10; Tanaka et al. (1195), Methods in Enzymology 256:41-49) con anticuerpos marcados con un cuarto color. Cada una de las cuatro etiquetas fue sometida a la formación de imágenes por separado utilizando el sistema de selección celular, y las imágenes se utilizaron para calcular la cantidad de inhibición o activación de la translocación efectuada por el compuesto de prueba. Al hacer este cálculo, las imágenes de las sondas utilizadas para marcar la membrana plasmática y el citoplasma se utilizaron para enmascarar la imagen de la sonda inmunológica marcando la ubicación de la proteína Rho intracelular . La brillantez integrada por unidad de área bajo cada máscara se utilizó para formar un cociente de translocación dividiendo la brillantez/área integrada de la membrana plasmática por la brillantez/área integrada citoplasmática . Comparando los valores del cociente de translocación de los pozos control y experimentales, se calculó el por ciento de translocación de cada compuesto líder potencial. Translocación de la /?-arrestina a la membrana plasmática tras la activación del receptor de la proteína G En otra modalidad, una selección de alto contenido de la translocación del citoplasma a la membrana, se midió la translocación de la proteína ß-arrestina del citoplasma a la membrana plasmática en respuesta al tratamiento de la célula. Para medir la translocación, se trataron celular indicadoras vivientes que contenían marcadores del dominio luminiscente con compuestos de prueba y se midió el movimiento del marcador de ß-arrestina en el tiempo y espacio utilizando el sistema de selección celular de la presente invención. En una modalidad preferida, las células indicadoras contienen marcadores luminiscentes que consisten de una quimera de proteína fluorescente verde y proteína ß-arrestina (PFV-p-arrestina) (Barak et al. (1997), J. Biol. Che . 272:27497-27500: Daaka et al. (1998), J. Biol. Chem. 273:685-688) que es expresada con la célula indicadora a través del uso de la transfección celular transitoria o estable y otros reporteros utilizados para marcar los dominios citoplásmico y membranal. Cuando las células indicadoras están en el estado de reposo, las moléculas marcadoras de dominio se reparten predominantemente en la membrana plasmática o en el citoplasma. La selección de alto contenido, sus marcadores se utilizan para delinear el citoplasma celular y la membrana plasmática en distintos canales de fluorescencia. Cuando las células indicadoras son tratadas con un compuesto de prueba, la distribución dinámica de la PFV-p-arrestina se registra como una serie de imágenes sobre una escala de tiempo que fluctúa de 0.1 s a lOh. En una modalidad preferida, la escala de tiempo es de lh. Cada imagen es analizada por un método que cuantifica el movimiento de la quimera proteica PFV-ß-arrestina entre la membrana plasmática y el citoplasma. Para hacer este cálculo, las imágenes de las sondas utilizadas para marcar la membrana plasmática y el citoplasma se utilizan para enmascarar la imagen de la sonda de PFV-p-arrestina que marca la ubicación de la proteína PFV-p-arrestina intracelular . La brillantez integrada por unidad de área bajo cada máscara se utiliza para formar un cociente de translocación dividiendo la brillantez/área integrada de la membrana plasmática por la brillantez/área integrada citoplásmica . Comparando los valores del cociente de translocación de los pozos control y experimentales, se calcula el por ciento de translocación para cada compuesto líder potencial. El resultado de la selección de alto contenido se relaciona con los datos cuantitativos que describen la magnitud de la translocación dentro de un gran número de células individuales que han sido tratadas con los compuestos de prueba de interés.

Translocación entre el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi : En una modalidad de una selección de alto contenido de translocación del retículo endoplásmico al aparato de Golgi, se midió la translocación de una proteína VSVG de la cepa mutante ts045 del virus de la estomatitis viral (Ellenberg et al., (1997), J. Cell. Biol. 138:1193-1206; Presley et al. (1997) Nature 389:81-85) del retículo endoplásmico al dominio del aparato de Golgi en respuesta al tratamiento de la célula. Para medir la translocación, se trataron células indicadoras que contenía reporteros luminiscentes con compuestos de prueba y el movimiento de los reporteros se midió en espacio y tiempo utilizando el sistema de selección celular de la presente invención. Las células idicadoras contienen reporteros luminiscentes que consisten de una quimera proteica de PFV-VSVG que es expresada por la célula indicadora a través del uso de la transfección celular transitoria y estable u otros marcadores de dominio utilizados para medir la localización de los dominios del retículo endoplásmico y el aparato de Golgi. Cuando las células indicadoras están en su estado de reposo a 40°C, las moléculas de la quimera proteica PFV-VSVG son repartidas predominantemente en el retículo endoplásmico. En esta selección de alto contenido, se utilizan marcadores de dominio de distintos colores para delinear el dominio del retículo endoplásmico y el aparato de Golgi en distintos canales de fluorescencia. Cuando las células indicadoras son tratadas con un compuesto de prueba y la temperatura es bajada simultáneamente a 32°C, la distribución dinámica de la quimera proteica PFV-VSVG es registrada como una serie de imágenes sobre una escala de tiempo que fluctúa de 0.1 s a 10 h. Cada imagen es analizada por un método que cuantifica el movimiento de la quimera proteica de PFV-VSVG entre los dominios del retículo endoplásmico y el aparato de Golgi. Para hacer este cálculo, las imágenes de las células utilizadas para marcar los dominios del retículo endoplásmico y el aparato de Golgi se utilizan para enmascarar la imagen de la sonda de PFV-VSVG que marca la ubicación de la proteína PFV-VSVG intracelular . La brillantez integrada por unidad de área bajo cada máscara se utiliza para formar un cociente de translocación dividiendo la brillantez/área integrada del retículo endoplásmico por la brillantez/área integrada del aparato de Golgi. Comparando los valores del cociente de translocación de pozos control y experimentales, se calcula el por ciento de translocación de cada compuesto líder potencial. El resultado de la selección de alto contenido se relaciona con datos cuantitativos que describen la magnitud de la translocación dentro de un gran número de células individuales que han sido tratadas con compuestos de prueba de interés a concentraciones finales que fluctúan de 10~12 M a 10"3 M durante un periodo que va de 1 minuto a 10 h. Inducción e inhibición de la función de los organelos Estabilidad del microtúbulo intracelular . En una modalidad de una selección de alto contenido de la función de los organelos, se midió el estado del montaje de los microtúbulos intracelulares en respuesta al tratamiento de la célula. Para medir el estado del montaje del microtúbulo, se trataron células indicadoras que contenían reporteros luminiscentes con compuestos de prueba y se midió la distribución de los reporteros en espacio y tiempo utilizando el sistema de selección celular de la presente invención. En una modalidad preferida, el montaje del microtúbulo intracelular es el MAP 4 (Bulinski et al. (1997), J. Cell. Science. 110:3055-3064), una proteína asociada con el microtúbulo, ubicua, que se sabe interactúa con los microtúbulos en células en interfaz y mitóticas. Las células indicadoras contienen reporteros luminiscentes que consisten de una quimera de PFV-MAP 4 que es expresada por las células indicadoras a través del uso de la transfección celular transitoria o estable y otros reporteros son utilizados para medir la ubicación de los componentes citoplásmicos y membranales . Un constructo de PFV-MAP 4 se prepara como sigue: se efectúa una amplificación por PCR de moléculas de PFV nativas o mutantes utilizando cebadores para introducir sitios de enzima de restricción. El producto de la PCR se liga al ADNc del MAP 4 dentro de un vector de expresión eucariótico. Las células indicadoras son entonces transfectadas con el vector de expresión para producir células indicadoras transfectadas de manera transitoria o estable . Las células indicadoras son tratadas con compuestos de prueba a concentraciones finales que fluctúan de 1012 M a 10"3 M durante un periodo que fluctúa de 1 minuto a 10 horas. Se agrega el medio de crecimiento que contiene el reactivo de mareaje para marcar al núcleo y el citoplasma. Después de la incubación, las células son lavadas con solución salina balanceada de Hank (SSBH) , son fijadas con formaldehído al 3.7% durante 10 minutos a temperatura ambiente, y lavadas y almacenadas en SSBH. Los de las imágenes se obtuvieron de células indicadoras tanto fijadas como vivas. Para extraer datos morfométricos de cada una de las imágenes obtenidas se utilizó el siguiente método de análisis: 1. El umbral de cada imagen del núcleo y citoplásmica para producir una máscara que tiene un valor de = 0 para pixel fuera del límite de núcleo o célula. 2. La superposición de la máscara sobre la imagen original, detecta cada objeto en el campo (es decir, el núcleo o célula) , y calcula su tamaño, forma e intensidad integrada. 3. La superposición de la máscara celular completa obtenida anteriormente sobre la imagen del PFV-MAP 4 correspondiente y el uso de una medición automatizada de resistencia del borde de rutina (Kolega et al. (1993). Biolmaging 1:136-150) para calcular la resistencia total del borde dentro de cada célula. Para normalizar el tamaño de la célula, la resistencia total del borde es dividida por el área de la célula para dar un valor de "fibrosidad" . Los valores de fibrosidad están asociados con los valores de resistencia fuerte del borde y por lo tanto son máximos en células que contienen diferentes estructuras microtubulares . De igual modo, los valores de fibrosidad pequeña están asociados con una resistencia del borde débil y son mínimos en células como microtúbulos despolimerizados . El intervalo fisiológico de los valores de fibrosidad se establece tratando las células con el fármaco paclitaxel (10 µ?) que estabiliza los microtúbulos o el fármaco nocodazol (10 µg/ml) que despolimeriza a los microtúbulos.

Selecciones de alto contenido que implican la localización funcional de macromoléculas Dentro de esta clase de selección de alto contenido, se mide la localización funcional de macromoléculas en respuesta a estímulos externos dentro de células vivientes. Regulación de la actividad de enzimas glicolíticas . En una modalidad preferida de una selección de alto contenido de actividad enzimática celular, se mide la actividad de enzimas reguladoras glicolíticas clave en células tratadas. Para medir la actividad enzimática, las células indicadoras que contienen agentes de mareaje luminiscentes son tratadas con compuestos de prueba y la actividad de los reporteros se mide en espacio y tiempo utilizando sistemas de selección celular de la presente invención. En una modalidad, el reportero de la actividad enzimática celular es la fructosa-6-fosfato, 2-cinasa/fructosa-2 , 6-bifosfatasa (PFK-2) , una enzima reguladora cuyo estado de fosforilación indica el anabolismo o catabolismo de carbohidratos intracelulares (Deprez et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:17269-17275; Kealer et al. (1996) FEBS Letters 395:225-227; Lee et al. (1996), Biochemistry 35:6010-6019) . Las células indicadoras contiene reporteros luminiscentes que consisten de un biosensor de proteína fluorescente de la fosforilación de PF -2. El biosensor de proteína fluorescente se construye introduciendo un tinte fluorescente ambientalmente sensible cerca del sitio de fosforilación conocido de la enzima (Deprez et al. (1997), supra; Giuliano et al. (1995), supra) . El tinte puede ser de la clase de la cetocianina (Jessler y Wolbeis (1991), Spectrochi-nica Acta 47A:187-192) o cualquier clase que contenga una porción reactiva con proteínas y un fluorocromo cuyo espectro de excitación o emisión sea sensible a la polaridad en solución. El biosensor de proteína fluorescente es introducido en las células indicadoras utilizando la metodología de carga a granel. Las células indicadoras vivientes son tratadas con los compuestos de prueba, a concentraciones finales que fluctúan de 1CT12 M a 103 NI para tiempos que fluctúan de 0.1 s a 10 h. En una modalidad preferida, los datos de la imagen de la relación se obtienen de células indicadoras vivientes tratadas recolectando un par espectral de imágenes de fluorescencia en cada punto temporal . Para extraer datos morfométricos de cada punto temporal , se hace una relación entre cada par de imágenes dividiendo numéricamente las dos imágenes espectrales en catalizador punto temporal, pixel por pixel . Cada valor del pixel es entonces utilizado para calcular la fosforilación fraccional de PF -2. A valores fracciónales pequeños de fosforilación, la PFK-2 estimula el catabolismo de carbohidratos. A valores fracciones altos de fosforilación, la PFK-2 estimula el anabolismo de los carbohidratos .

Actividad de la proteina cinasa A y localización de subunidades. En otra modalidad de una selección de alto contenido, se midieron tanto la localización del dominio como la actividad de la proteína cinasa A (PKA) dentro de las células indicadoras en respuesta al tratamiento con compuestos de prueba. Las células indicadoras contienen reporteros luminiscentes que incluyen un biosensor de proteína fluorescente de activación de PKA. El biiosensor de proteína fluorescente se construye introduciendo un tinte fluorescente ambientalmente sensible en la subunidad catalítica de la PKA cerca del sitio que se sabe interactúa con la subunidad reguladora de la PKA (Harootunian et al. (1993), Mol. Biol . of the Cell 4:993-1002; Johnson et al. (1996), Cell 85:149-158; Giuliano et al. (1995), supra) . El tinte puede ser de la clase de cetocianina (Kessler, y Wolfbeis (1991) , Spretrochimica Acta 47A: 187-192) o cualquier clase que contenga una porción reactiva con proteínas y un fluorócromo cuyo espectro de excitación o emisión sea sensible a la polaridad en solución. El biosensor de proteína fluorescente de la activación de la PKA es introducido en las células indicadoras utilizando la metodología de carga a granel . En una modalidad, las células indicadoras vivientes son tratadas con compuestos de prueba, en concentraciones finales que fluctúan de 10~12 M a 10"3 M durante tiempos que fluctúan de 0.1 s a 10 h. En una modalidad preferida, los datos de la imagen de la relación se obtienen de células indicadoras vivientes tratadas . Para extraer datos del biosensor de cada punto temporal , se hace una relación entre cada par de imágenes, y cada valor del pixel es entonces utilizado para calcular la activación fraccional de PKA (por ejemplo, separación de las subunidades catalíticas y reguladoras después de la unión del AMPc) . A valores fracciónales altos de actividad, la PFK-2 estimula las cascadas bioquímicas dentro de la célula viviente.

Para medir la translocación de la subunidad catalítica de la PKA, las células indicadoras que contienen reporteros luminiscentes son tratadas con compuestos de prueba y el movimiento de los reporteros medidos es medido en espacio y tiempo utilizando el sistema de selección celular. Las células indicadoras contienen reporteros luminiscentes que consisten de marcadores de dominio utilizados para medir la localización de los dominios citoplásmico y nuclear. Cuando las células indicadoras son tratadas con un compuesto de prueba, la redistribución dinámica, de un biosensor de proteína fluorescente de PKA es registrada intracelularmente con una serie de imágenes sobre una escala de imágenes que fluctúa de 0.1 s a 10 h. Cada imagen es analizada por un método que cuantifica el movimiento de la PKA entre los dominios citoplásmico y nuclear. Para hacer este cálculo, las imágenes de las sondas utilizadas para marcar los dominios citoplásmico y nuclear son utilizadas para enmascarar la imagen del biosensor de proteína fluorescente de PKA. La brillantez integrada por unidad de área bajo cada máscara es utilizada para formar un cociente de translocación dividiendo la brillantez/área integrada citoplásmica por la brillantez/área integrada nuclear. Comparando los valores del cociente de translocación de los pozos control y experimentales, se calcula el por ciento de translocación por cada compuesto líder potencial. El resultado de la selección de alto contenido se relaciona con datos cuantitativos que describen la magnitud de la translocación dentro de un gran número de células individuales que han sido tratadas con compuesto de prueba en el intervalo de concentración de 10~12 NI a 103 M.

Selecciones de alto contenido que implican la inducción o inhibición de la expresión de un gen Bíosensores fluorescentes basados en ARN Transcripción de la proteína citoesquelética y localización de mensajes. La regulación de las fuerzas generales de las respuestas fisiológicas celulares que incluyen la adhesión célula-sustrato, adhesión célula-célula, transducción de señales, eventos del ciclo celular, metabolismo de moléculas intermediarias y de señalización, locomoción celular, comunicación célula-célula, y muerte celular pueden implicar la alteración de la expresión genética. Las selecciones de alto contenido también pueden ser diseñadas para medir esta clase de respuesta fisiológica.

En una modalidad, el reportero de la expresión del gen intracelular es un oligonucleótido que puede hibridarse con el ARNm objetivo y alterar su señal de fluorescencia. En una modalidad preferida, el oligonucleótido es un abanico molecular (Tyagi y Kramer (1996) Wat. Biotechnol. 14:303-308), un reactivo basado en la luminiscencia cuya señal de fluorescencia depende de las interacciones moleculares o intramoleculares. El biosensor fluorescente se construye introduciendo un par de transferencia de energía de fluorescencia de tintes fluorescentes como los que existen uno en cada extremo (5' y 3') del reactivo. Los tintes pueden ser de cualquier clase de reactivo que contenga una porción reactiva con proteínas y fluorocromos cuyos espectros de excitación y emisión se superpongan lo suficiente para proporcionar transferencia de energía de fluorescencia entre tintes en el estado de reposo, incluyendo pero sin limitarse a, fluoresceína y rodamina (Molecular Probes, Inc.) . En una modalidad preferida, se inserta una porción del mensaje que codifica para la ß-actina (Kislauskis et al. (1994), J. Cell Biol . 127:441-451; McCann et al (1997) , Proc. Nati. Acad. Sci . 94:5679-5684; Sutoh (1982), Biochemistry 21:3654-3661) en la región de la vuelta o bucle de un oligonucleótido en forma de horquilla con los extremos enhebrados juntos debido a la hibridación intramolecular. En cada extremo del biosensor un donador de fluorescencia ( fluoresceína) y un receptor de fluorescencia (rodamina) están unidos covalentemente . En el estado atado, la transferencia de energía de fluorescencia es máxima y por lo tanto indicativa de una molécula no hibridada. Cuando se híbrida con el ARNm que codifica para la ß-acitina, el ronzal se rompe y la transferencia de energía se pierde. El biosensor fluorescente completo es introducido en las células indicadoras utilizando la metodología de carga a granel. En una modalidad, las células indicadoras vivientes son tratadas con compuestos de prueba, a concentraciones finales que fluctúan de 10"12 M a 10"3 M durante tiempos que fluctúan de 0.1 s a 10 h. En una modalidad preferida, los datos de la imagen de la relación se obtienen de células indicadoras vivientes tratadas. Para extraer datos morfométricos de cada punto temporal, se hace una relación entre cada par de imágenes, y cada valor del pixel es entonces utilizado para calcular la hibridación fraccional del nucleotido marcado. A valores fracciónales pequeños de hibridación está indicada poca expresión de la ß-acitina. A altos valores fracciónales de hibridación, está indicada una expresión máxima de ß-acitina. Además, la distribución de moléculas hibridadas dentro del citoplasma de las células indicadoras es también una medida de la respuesta fisiológica de las células indicadoras.

Unión de la superficie celular de un ligando Unión de la insulina marcada a su receptor de al superficie celular en células vivientes. Las células cuyo dominio de la membrana plasmática ha sido marcado con un reactivo de mareaje de un color particular son incubadas con una solución que contiene moléculas de insulina (Lee et al. (1997), Bioche istry 36:2701-2708; Martínez -Zaguilan et al. (1996), A . J. Physiol. 270 : C1438-C1446) que están marcadas con una sonda luminiscente de un color diferente durante un tiempo apropiado bajo las condiciones apropiadas. Después de la incubación, las moléculas de insulina no unida son lavadas, las células son fijadas y la distribución y concentración de la insulina sobre la membrana plasmática es medida. Para hacer esto, la imagen de la membrana celular es utilizada como una mascara para la imagen de la insulina. La intensidad integrada de al imagen de la insulina enmascarada es comparada con un juego de imágenes que contiene cantidades conocidas de insulina marcada. La cantidad de insulina unida a la célula es determinada de los estándares y utilizada en conjunto con la concentración total de insulina incubada con la célula para calcular una constante de disociación o insulina para el receptor de la superficie celular.

Mareaje de los compartimientos celulares Mareaje de la célula completa El mareaje de la célula completa se efectúa marcando los componentes celulares de modo que pueda medirse la dinámica de la forma celular y la motilidad de la célula con el tiempo analizando las imágenes de fluorescencia de las células. En una modalidad, se introducen moléculas fluorescentes reactivas pequeñas en células vivientes. Las moléculas que permean la membrana se difunden y reaccionan con los componentes proteicos en la membrana plasmática. Las moléculas de tinte reaccionan con moléculas intracelulares para incrementar la señal de fluorescencia emitida de cada molécula y para atrapar el tinte fluorescente dentro de células vivientes. Esas moléculas incluyen derivados de clorometilo reactivos de aminocumarinas , hidroxicumarinas , diacetato de eosina, diacetato de fluoresceína, algunos derivados de tinte de Bodipy, y tetrametilrodamina . La actividad de esos tintes hacia macromoléculas incluye grupos amino primarios libres y grupos sulfhidrilo libres. En otra modalidad, la superficie celular es marcada permitiendo que la célula interactúe con anticuerpos o lecitinas marcadas de manera fluorescente (Sigma Chemical Company, ST. Louis, MO) que reaccionan específicamente con moléculas en la superficie celular. Las quimeras de proteína de la superficie celular expresadas por la célula de interés que contiene un componente de proteína fluorescente verde, o un muíante del mismo, también pueden ser utilizadas para marcar de manera fluorescente toda la superficie celular. Una vez que toda la superficie es marcada, las imágenes de toda la célula o arreglo de célula pueden convertirse en un parámetro en selecciones de alto contenido, que implican la medición de la forma celular, motilidad, tamaño y crecimiento y división.

Mareaje de la membrana plasmática En una modalidad, el mareaje de la membrana plasmática completa emplea algunas de las metodologías descritas anteriormente para marcar células completas. Las moléculas luminiscentes que marcan a toda la superficie celular actúan para delinear la membrana plasmática . En una segunda modalidad los subdominios de la membrana plasmática, la superficie extracelular , la bicapa lipídica, y la superficie intracelular pueden ser marcados por separado y utilizados como componentes de selecciones de alto contenido. En la primera modalidad, la superficie extracelular el tratamiento con una molécula fluorescente reactiva tal como el succinimidil éster o derivados de yodoacetamida de tintes fluorescentes tales como las fluoresceínas , rodamina, cianinas y Bodipys . En una tercera modalidad, la superficie extracelular es marcada utilizando macromoléculas marcadas de manera fluorescente con una alta afinidad por las moléculas de la superficie celular. Esas incluyen lecitinas marcas de manera fluorescente tales como la fluoresceína, rodamina y derivados de cianina y lecitinas derivadas de judías (Con A), frijol rojo (eritroaglutinina PHA-E) o germen de trigo. En una cuarta modalidad, se utilizan anticuerpos marcados de manera fluorescente con una alta afinidad por componentes de la superficie celular para marcar la región extracelular de la membrana plasmática.

Las regiones extracelulares de los receptores de la superficie celular y canales de iones son ejemplos de proteínas que pueden ser marcadas con anticuerpos. En una quinta modalidad, la bicapa lipídica de la membrana plasmática es marcada con moléculas fluorescentes. Esas moléculas incluyen tintes fluorescentes unidos a moléculas hidrofóbicas de cadena larga que interactúan fuertemente con la región hidrofóbica en el centro de la bicapa lipídica de la membrana plasmática. Ejemplos de esos tintes incluyen a la serie de tintes de PKH (U.S. 4,783,401, 4,762,701 y 4,659,584; comercialmente disponibles de Sigma Chemical Company, St . Louis, MO) , fosfolípidos fluorescentes, tales como la nitrobenzoxadiazol glicerofosfoetanolamina y dihexadecanoilglicerofosfoetanolamina derivada de la fluoresceína, ácidos grasos fluorescentes tales como el ácido 5-butil-4 , -difluoro-4-bora-3a, 4a-diazo-s-indacen-3-nonanoico y el ácido 1-pirendecanoico (Molecular Probes, Inc.), esteróles fluorescentes incluyendo el 4,4-difluoro-5, 7-dimetil-4-bora-3a, 4a-diazo-s-indacen-3-dodecanoato de colesterol y e-pirenhexanoato de colesterol, y proteínas marcadas de manera fluorescente que interactúan específicamente con componentes de la bicapa lipídica tales como el derivado de la fluoresceína de anexina V (Caltag Antibody Co, Burlingame, CA) . En otra modalidad, el componente intracelular de la membrana plasmática es marcado con moléculas fluorescentes. Los ejemplos de esas moléculas son los componentes intracelulares del receptor de la proteína G trimérica, adenilil ciclasa, y proteínas que transportan iones . Esas moléculas pueden ser marcadas como resultado de la fuerte unión a anticuerpo específico marcado de manera fluorescente o por la incorporación de una quimera de proteína fluorescente que está comprendida de una proteína asociada a la membrana y la proteína fluorescente verde, y mutantes de las mismas.

Mareaje con fluorescencia del endosoma En una modalidad, los ligandos que son transportados a las células por endocitosis mediada por receptor son utilizados para trazas la dinámica de los organelos endosómicos . Los ejemplos de ligandos marcados incluyen complejos de lipoproteína de baja densidad marcado con Bodipy FL, análogos de la tetrametilrodamin transíerrina, y factor del crecimiento epidérmico marcado de manera fluorescente (Molecular Probes, Inc.).

En una segunda modalidad, son utilizados anticuerpos primarios o secundarios marcados de manera fluorescente (Sigma Chemical Co.; Molecular Probes; Caltag Antibody Co.) que marcan específicamente ligandos endosómicos para marcar el compartimiento endosómico en las células. En una tercera modalidad, los endosomas son marcados de manera fluorescente en células que expresan quimeras proteicas formadas por la fusión de una proteína fluorescente verde, mutantes de la misma, con un receptor cuya internalización marca los endosomas. Las quimeras de EGF, transíerrina, y receptores de lipoproteína de baja densidad son ejemplos de esas moléculas.

Marea e del lisosoma En una modalidad, se utilizan reactivos luminiscentes específicos del lisosoma que permean la membrana para marcar el compartimiento lisosómico de células vivientes y fijadas. Esos reactivos incluyen a las moléculas luminiscentes del rojo neutro, N-(3-((2,4-dinitrofenil ) amino) propil) -N- (3-aminopropil ) metilamina, y sondas LysoTracker que reportan el pH intralisosómico son como la distribución dinámica de los lisosomas (molecular Probes , Inc . ) .

En una segunda modalidad, se utilizan anticuerpos contra antígenos lisosómicos (Sigma Chemical Co.; Molecular Probes; Caltag Antibody Co.) para marcar los componentes lisosómicos que están localizados en dominios lisosómios específicos. Los ejemplos de esos componentes son enzimas degenerativas implicadas en la hidrólisis del éster de colesterol, proteasas de la proteína membranal, y nucleasas así como la bomba de protones lisosómica dirigida por el ATP. En una tercera modalidad, son utilizadas quimeras proteicas que consisten de una proteína lisosómica fusionada genéticamente a una proteína intrínsecamente luminiscente tal como la proteína fluorescente verde, mutantes de la misma, para marcar el dominio lisosómico. Los ejemplos de esos componentes son las enzimas degradativas implicadas en la hidrólisis del éster de colesterol, las proteasas de la proteína membranal, y nucleasas, así como la bomba de protones lisosómica dirigida por el ATP.

Mareaje con fluorescencia en citoplasma En una modalidad, los tintes fluorescentes que permean la célula (Molecular Probes, Inc.) con un grupo reactivo se hacen reaccionar con células vivientes. Los tintes reactivos incluyendo al monobromobimano, diacetato de 5-clorometilfluoresceína, succimidil éster de diacetato de carboxi fluoresceína , y clorometil tetrametilrodamina son ejemplos de tintes fluorescentes que permean la membrana que son utilizados para el mareaje a largo plazo del citoplasma de las células. En una segunda modalidad, se introducen moléculas marcadoras polares tales como el amarillo de Lucifer y la cascada de tintes fluorescentes a base de azul (Molecular Probes, Inc.) en las células utilizando los métodos de carga a granel y también se utilizan para el mareaje citoplásmico . En una tercera modalidad, se utilizan anticuerpos contra componentes citoplásmicos (Sigma Chemical Co.; Molecular Probes,- Caltag Antibody Co.) para marcar de manera fluorescente el citoplasma. Los ejemplos de antígenos citoplásmicos son muchas de las enzimas implicadas en el metabolismo intermediario. La enolasa, fosfofructocinasa, y acetil-CoA deshidrogenasa son ejemplos de antígenos citoplásmicos distribuidos uniformemente . En una cuarta modalidad, las quimeras proteicas que consisten de una proteína citoplásmica fusionada genéticamente a una proteína intrínsecamente luminiscente tal como la proteína fluorescente verde, o mutantes de la misma, son utilizadas para marcar el citoplasma. Las quimeras luorescentes de proteínas distribuidas uniformemente son utilizadas para marcar a todo el dominio citoplásmico. Los ejemplos de esas proteínas son muchas de las proteínas implicadas en el metabolismo intermediario e incluyen a la enolasa, lactato deshidrogenase y hexocinasa. En una quinta modalidad, son utilizados anticuerpos contra antígenos citoplásmicos (Sigma Chemical Co.; Molecular Probes, Inc.; Caltag Antibody Co.) para marcar componentes citoplásmicos que se localizan en subdominios citoplásmicos específicos. Los ejemplos de esos componentes son las proteínas citoesqueléticas actina, tubulina y citoqueratina . Una población de esas proteínas dentro de las células se monta en estructuras discretas, las cuales en este caso, son fibrosas. El mareaje con fluorescencia de esas proteínas con reactivos basados en anticuerpos marca por lo tanto un subdominio específico del citoplasma. En una sexta modalidad, se utilizan moléculas marcadas de manera fluorescente no basadas en anticuerpos que ínteractúan fuertemente con las proteínas citoplásmicas para marcar componentes citoplásmicos específicos. Un ejemplo es un análogo fluorescente de la enzima ADNasa I (Molecular Probes, Inc.). Los análogos fluorescentes de esta invención se unen fuerte y específicamente a la actina citoplásmica, marcando de este modo un subdominio del citoplasma. En otro ejemplo, se utilizan análogos fluorescentes de la toxina de hongo faloidina o el fármaco paclitaxel (Molecular Probes, Inc.) para marcar componentes de los citoesqueletos de actina y microtúbulos, respectivamente. En una séptima modalidad, las quimeras proteicas que consisten de una proteína citoplásmica fusionada genéticamente a una proteína intrínsecamente luminiscente tal como la proteína fluorescente verde, mutantes de la misma, se utilizan para marcar dominios específicos del citoplasma. Las proteínas fluorescentes de proteínas altamente localizadas se utilizan para marcar dominios subdominios citoplásmicos . Los ejemplos de esas proteínas son muchas de las proteínas implicadas en la regulación del citoesqueleto . Ellas incluyen las proteínas estructurales actina, tubulina y citoqueratina, así como el microtúbulo de proteínas reguladoras asociado con la proteína 4 y la a-actinina.

Mareaje Nuclear En una modalidad, se utilizan reactivos luminiscentes o específicos del ácido nucleico que permea la membrana (Molecular Probes, Inc.) para marcar el núcleo de células vivas y fijadas. Esos reactivos incluyen tintes a base de cianina (por ejemplo, ????", ????"1, y BOBOMR) , fenantidinas y acridinas (por ejemplo, bromuro de etidio, yoduro de propidio, y anaranjado de acridina) , índoles e imidazoles (por ejemplo, Hoechst 33258, Hoechst 33342, y 4 ' , 6 -diamidino-2 - fenilindol ) , y otros reactivos similares (por ejemplo, 7-aminoactimicina D, hidroxiestilbamidina y psoralenos) . En una segunda modalidad, se utilizan anticuerpos contra antígenos nucleares (Sigma Chemical Co. ; Molecular Probes, Inc.; Caltag Antibody Co.) para marcar los componentes nucleares que se localizan en dominios nucleares específicos. Los ejemplos de esos componentes son las macromoléculas implicadas en el mantenimiento de la estructura y función del ADN. El ADN, ARN, histonas, ADN polimerasa, ADN polimerasa, lamininas y variantes nucleares de proteínas citoplásmicas tales como la actina son ejemplos de antígenos nucleares. En una tercera modalidad, se utilizan quimeras proteicas que consisten de una proteína nuclear fusionada genéticamente a una proteína intrínsecamente luminiscente tal como la proteína fluorescente verde, o mutantes de la misma, para marcar el dominio nuclear. Los ejemplos de esas proteínas son muchas de las proteínas implicadas en el mantenimiento de la estructura y función del ADN. Las histonas, ADN polimerasa, ARN polimerasa, lamininas y variantes nucleares de proteínas citoplásmicas tales como la actina son ejemplos de proteínas nucleares.

Mareaje mitocondrial En una modalidad, se utilizan reactivos luminiscentes específicos mitocondriales que permean la membrana (Molecular Probes, Inc.) para marcar la mitocondria de células vivientes y fijadas. Esos reactivos incluyen a la rodamina 123, tetrametil rosamina, JC-1, y los tintes reactivos MitoTracker. En una segunda modalidad, se utilizan anticuerpos contra antígenos mitocondriales (Sigma Chemical Co.; Molecular Probes, Inc.; Caltag Antibody Co.) para marcar los componentes mitocondriales que se localizan en dominios mitocondriales específicos. Los ejemplos de esos componentes son las moléculas implicadas en el mantenimiento de la estructura y función del ADN mitocondrial. El ADN, ARN, histonas, ADN polimerasa, ARN polimerasa y variantes mitocondriales de las moléculas citoplásmicas tales como el ARNt mitocondrial y el ARNr son ejemplos de antígenos mitocondriales . Otros ejemplos de antígenos mitocondriales son los componentes del sistema de fosforilación oxidativa encontrado en la mitocondria (por ejemplo, citocromo c, citocromo c oxidasa, y succinato deshidrogenasa) . En una tercera modalidad, se utilizan quimeras proteicas que consisten de una proteína mitocondrial fusionada genéticamente a una proteína intrínsecamente luminiscente tal como la proteína fluorescente verde, mutantes de la misma, para marcar el dominio mitocondrial. Los ejemplos de esos componentes son las macromoléculas implicadas en el mantenimiento de la estructura y función del ADN mitocondrial. Los ejemplos incluyen histonas, ADN polimerasa, ARN polimerasa y los componentes del sistema de fosforilación oxidativa encontrado en la mitocondria (por ejemplo, citocromo c, citocromo c oxidasa, y succinato deshidrogenasa) .

Mareaje del retículo endoplásmico En una modalidad, se utilizan reactivos luminiscentes específicos del retículo endoplásmico que permean la membrana (Molecular Probes, Inc.) para marcar el retículo endoplásmico de células vivientes y fijadas.

Esos reactivos incluyen tintes de carbocianina de cadena corta (por ejemplo, DiOCc y DiOC3) , tintes de carbocianina de cadena larga (por ejemplo, DiICls y DiIC18) , y lecitinas marcadas de manera luminiscente tales como la concanavalina A. En una segunda modalidad, se utilizan anticuerpos contra antígenos del retículo endoplásmico (Sigma Chemical Co.; Molecular Probes, Inc.; Caltag Antibody Co.) para marcar componentes del retículo que se localizan en dominios del retículo endoplásmico específicos. Los ejemplos de esos componentes son las macromoléculas implicadas en el sistema de alargamiento del ácido graso, glucosa-6-fosfatasa, y HMB CoA-reductasa . En una tercera modalidad, se utilizan quimeras proteicas que consisten de una proteína del retículo endoplásmico fusionada genéticamente a una sonda intrínsecamente luminiscente tal como la proteína fluorescente verde, o mutantes de la misma, para marcar al dominio del retículo endoplásmico. Los ejemplos de esos componentes son las macromoléculas implicadas en los sistemas de alargamiento de ácido graso, glucosa-6-fosfatasa, y HMG Coa-reductasa .

Mareaje del aparato de Golgi En una modalidad, se utilizan reactivos luminiscentes específicos para el aparato de Golgi que permean la membrana (Molecular Probes, Inc.) para marcar el aparato de Golgi de células vivientes y fijadas. Esos reactivos incluyen macromoléculas marcadas de manera luminiscente tales como la aglutinan del germen de trigo y la Brefeldia A así como la ceramida marcada de manera luminiscente. En una segunda modalidad, se utilizan anticuerpos contra antígenos del aparato de Golgi (Sigma Chemical Co.; Molecular Probes Inc.; Caltag Antibody Co.) para marcar los componentes del aparato de Golgi que se localizan en dominios del aparato de Golgi específicos. Los ejemplos de esos componentes son la N-acetilglucosamina fosfotransferasa, fosfodiesterasa específica del aparato de Golgi y proteína receptora de malosa-6-fosfato . En una tercera modalidad, se utilizan quimeras proteicas que consisten de una proteína del aparato de Golgi fusionadas genéticamente a una proteína intrínsecamente luminiscente tal como la proteína fluorescente verde, o mutantes de la misma para marcar el dominio del aparato de Golgi . Los ejemplos de esos componentes son la N-acetilglucosamina fosfotransferasa, fosfodiesterasa especifica del aparato de Golgi y proteína receptora de malosa-6 -fosfato. Aunque muchos de los ejemplos presentados implican la medición de procesos celulares únicos, esto se pretende de nuevo que sirva para propósitos de ilustración. Pueden ser producidas selecciones de alto contenido de parámetros múltiples combinando varias selecciones de un solo parámetro en una selección de alto contenido múltiples o agregando parámetros celulares a cualesquier selecciones de alto contenido existentes. Además, aunque cada ejemplo se describió como si se basara en células vivas o fijadas, cada selección de alto contenido puede ser diseñada para ser utilizada con células vivas o fijadas. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que puede desarrollarse una amplia variedad de selecciones o tamices distintos basándose en la descripción proporcionada aquí. Existe una lista grande y en crecimiento de procesos bioquímicos y moleculares conocidos en células que implican translocaciones o reorganizaciones de componentes específicos dentro de las células. La vía de señalización de la superficie celular hacia los sitios objetivo dentro de la célula implica la translocación de proteínas asociadas con la membrana plasmática al citoplasma. Por ejemplo, se sabe que una de las proteínas tirosina cinasas de la familia src, pp60c-src ( alker et al (1993), J. Biol . Hem. 268:19552-19558) se transloca de la membrana plasmática al citoplasma tras la estimulación de los fibroblastos con factor del crecimiento derivado de las plaquetas (FCDP) . Adicionalmente, los objetivos para la selección pueden en sí ser convertidos en reactivos a base de fluorescente que reportan tales moléculas, incluyendo la unión del ligando y modificaciones postraslocacionales . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. 7. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque comprende, además, medir al menos uno de los siguientes: (a) un número de objetos que se determinó representan receptores de la superficie celular internalizados válidos; (b) una área agregada de los objetos que se determinó representan al receptor de la superficie celular internalizados válidos; (c) una intensidad agregada de los objetos que se determinó representan receptores de la superficie celular internalizados válidos; o (d) una intensidad agregada normalizada de los objetos que se determinó representan receptores de la superficie celular internalizados válidos. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las subregiones del arreglo de ubicaciones que contienen múltiples células se muestrean múltiples veces a intervalos para proporcionar la medición cinética de la internalización de la proteína receptora de la superficie celular hacia la célula.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un método automatizado para identificar compuestos que inducen la internalización de proteínas receptoras de la superficie celular, caracterizado porque comprende: proporcionar un arreglo de ubicaciones que contienen múltiples células a ser tratadas con un compuesto, donde las células poseen una proteína receptora de la superficie celular de interés, y donde la proteína receptora de la superficie celular es expresada como una proteína marcada de manera luminiscente, o es marcada de manera luminiscente por el contacto de la célula con una molécula marcada de manera luminiscente que se une al receptor de la superficie celular de interés, donde un contacto puede llevarse a cabo ya sea antes o después del tratamiento con el compuesto de prueba; tratar las células con un compuesto de prueba ; explorar múltiples células en cada una de las ubicaciones que contiene múltiples células para obtener señales luminiscentes de la proteína receptora de la superficie celular marcada de manera luminiscente; - convertir las señales luminiscentes en datos digitales; y utilizar los datos digitales para determinar automáticamente si el compuesto de prueba ha inducido la internalización de la proteína receptora de la superficie celular marcada de manera luminiscente. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende determinar un número de células que tienen internalizada la proteína receptora de la superficie celular marcada de manera luminiscente. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende determinar un número total de células. . El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la determinación del número total de células comprende los pasos de: a. adquirir una imagen de los núcleos de las células ; b. segmentar la imagen de los núcleos de las células; y c. calcular el área total de todos los núcleos en la imagen de los núcleos de las células. 5. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la determinación del número de células que tienen internalizada la proteína receptora de la superficie celular marcada de manera luminiscente comprende los pasos de: a. adquirir la imagen de un objeto de la proteína receptora de la superficie celular marcada de manera luminiscente en o sobre las células; b. segmentar la imagen del objeto; y c. determinar si los objetos en la imagen del objeto segmentada representa proteínas receptoras de la superficie celular marcadas de manera luminiscente internalizadas válidas. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque comprende, además, al menos uno de los siguientes: a. remover artefactos de la imagen del objeto; o b. corregir la luminiscencia de fondo. 9. Un método para identificar compuestos que inhiben la internalización de proteínas receptoras de la superficie celular, caracterizado porque comprende: proporcionar un arreglo de ubicaciones que contienen múltiples células a ser tratadas con un compuesto, donde las células poseen una proteína receptora de la superficie celular de interés, y donde la proteína receptora de la superficie celular es expresada como una proteína marcada de manera luminiscente, o es marcada de manera luminiscente por el contacto de la célula con una molécula marcada de manera luminiscente que se une al receptor de la superficie celular de interés, donde un contacto puede llevarse a cabo ya sea antes o después del tratamiento con el compuesto de prueba ; tratar las células con un compuesto de prueba ; tratar las células con un ligando que hace que la proteína receptora de la superficie celular se internalice en ausencia del compuesto de prueba; explorar múltiples células en cada una de las ubicaciones que contienen múltiples células para obtener señales luminiscentes de la proteína receptora marcada de manera luminiscente; convertir las señales luminiscentes en datos digitales; y utilizar los datos digitales para determinar si el compuesto de prueba ha inhibido la internalización inducida por el ligando de la proteína receptora de la superficie celular marcada de manera luminiscente hacia la célula. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque comprende determinar un número de células que tienen internalizada la proteína receptora de la superficie celular marcada de manera luminiscente. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque comprende, además, determinar un número total de células. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la determinación del número total de células comprende los pasos de: a. adquirir una imagen de los núcleos de las células ; b. segmentar la imagen de los núcleos de las células; y c. calcular el área total de todos los núcleos en la imagen de los núcleos de las células. 13. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la determinación de un número de células que tienen internalizada la proteína receptora marcada de manera luminiscente comprende los pasos de : a. adquirir la imagen de un objeto de la proteína receptora de la superficie celular marcada de manera luminiscente en o sobre las células ,- b. segmentar la imagen del objeto; y c. determinar si los objetos en la imagen del objeto segmentada representa proteínas receptoras de la superficie celular marcadas de manera luminiscente internalizadas válidas. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque comprende, además, al menos uno de los siguientes: a . remover artefactos de la imagen del objeto; o b. corregir la luminiscencia de fondo. 15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque comprende, además, medir al menos uno de los siguientes: (a) un número de objetos que se determinó representan receptores de la superficie celular internalizados válidos (b) una área agregada de los objetos que se determinó representan al receptor de la superficie celular internalizados válidos; (c) una intensidad agregada de los objetos que se determinó representan receptores de la superficie celular internalizados válidos; o (d) una intensidad agregada normalizada de los objetos que se determinó representan receptores de la superficie celular internalizados válidos. 16. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque las subregiones del arreglo de ubicaciones que contienen múltiples células se muestrean múltiples veces a intervalos para proporcionar la medición cinética de la internalización de la proteína receptora de la superficie celular hacia la célula. 17. Un método para identificar los compuestos que inhiben la internalización de proteínas receptoras de la superficie celular, caracterizado porque comprende: proporcionar un arreglo de ubicaciones que contienen múltiples células a ser tratadas con un compuesto, donde las células poseen una proteína receptora de la superficie celular de interés, y donde la proteína receptora de la superficie celular es expresada como una proteína marcada de manera luminiscente, o es marcada de manera luminiscente por el contacto de la célula con una molécula marcada de manera luminiscente que se une al receptor de la superficie celular de interés, donde un contacto puede llevarse a cabo ya sea antes o después del tratamiento con el compuesto de prueba ,· tratar las células con un indicador que produce una señal detectable con la estimulación de la proteína receptora; tratar a las células con un compuesto de prueba; explorar las células en un modo de alto rendimiento para identificar aquellas células que exhiben la señal detectable; explorar selectivamente sólo un subconjunto de células en un modo de alto contenido para obtener señales luminiscentes de la proteína receptora marcada de manera luminiscente, donde el subconjunto consiste de células que exhiben la señal detectable durante la exploración en el modo de alto rendimiento ; convertir las señales luminiscentes en datos digitales; y utilizar los datos digitales para determinar si el compuesto de prueba ha inducido la internalización del receptor de la superficie celular marcado de manera luminiscente en la célula. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque comprende, además, determinar un número de células que tienen internalizada la proteína receptora de la superficie celular marcada de manera luminiscente. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque comprende, además, determinar un número total de células. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la determinación del número total de células comprende los pasos de : a. adquirir una imagen de los núcleos de las células ; b. segmentar la imagen de los núcleos de las células; y c. calcular el área total de todos los núcleos en la imagen de los núcleos de las células. 21. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la determinación de un número de células que tienen internalizada la proteína receptora marcada de manera luminiscente comprende los pasos de: a. adquirir la imagen de un objeto de la proteína receptora de la superficie celular marcada de manera luminiscente en o sobre las células; b. segmentar la imagen del objeto; y c. determinar si los objetos en la imagen del objeto segmentada representa proteínas receptoras de la superficie celular marcadas de manera luminiscente internalizadas válidas. 22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque comprende, además, al menos uno de los siguientes: a. remover artefactos de la imagen del objeto; o b. corregir la luminiscencia de fondo. 23. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque comprende, además, medir al menos uno de los siguientes: (a) un número de objetos que se determinó representan receptores de la superficie celular internalizados válidos; (b) una área agregada de los objetos que se determinó representan al receptor de la superficie celular internalizados válidos; (c) una intensidad agregada de los objetos que se determinó representan receptores de la superficie celular internalizados válidos; o (d) una intensidad agregada normalizada de los objetos que se determinó representan receptores de la superficie celular internalizados válidos. 24. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque las subregiones del arreglo de ubicaciones que contienen múltiples células se muestrean múltiples veces a intervalos para proporcionar la medición cinética de la internalización del receptor de la superficie celular. 25. Un método automatizado para identificar los compuestos que inhiben la internalización de proteínas receptoras de la superficie celular, caracterizado porque comprende: proporcionar un arreglo de ubicaciones que contienen múltiples células a ser tratadas con un compuesto de prueba, donde las células poseen una proteína receptora de la superficie celular de interés, y donde la proteína receptora de la superficie celular es expresada como una proteína marcada de manera luminiscente, o es marcada de manera luminiscente por el contacto de la célula con una molécula marcada de manera luminiscente que se une al receptor de la superficie celular de interés, donde un contacto puede llevarse a cabo ya sea antes o después del tratamiento con el compuesto de prueba; tratar las células con un indicador que produce una señal detectable tras la estimulación de la proteína receptora; tratar las células con un compuesto de prueba ; tratar las células con un ligando que hace que la proteína receptora de la superficie celular se internalice hacia la célula en ausencia del compuesto de prueba ; - explorar las células en un modo de alto rendimiento para identificar aquellas células que exhiben una señal detectable inducida por el indicador; explorar selectivamente sólo un subconjunto de células en un modo de alto contenido para obtener señales luminiscentes de la proteína receptora marcada de manera luminiscente, donde el subconjunto consiste de células que exhiben la señal detectable durante la exploración en el modo de alto rendimiento; convertir las señales luminiscentes en datos digitales; y utilizar los datos digitales para determinar si el compuesto de prueba ha inhibido la internalización inducida por el ligando de la proteína receptora de la superficie celular marcada de manera luminiscente hacia la célula. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque comprende, además, determinar un número de células que tienen internalizada la proteína receptora de la superficie celular marcada de manera luminiscente. 27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque comprende, además, determinar un número total de células. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la determinación del número total de células comprende los pasos de: a. adquirir una imagen de los núcleos de las células ; b. segmentar la imagen de los núcleos de las células; y c. calcular el área total de todos los núcleos en la imagen de los núcleos de las células. 29. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la determinación de un número de células que tienen internalizada la proteína receptora marcada de manera luminiscente comprende los pasos de: a. adquirir la imagen de un objeto de la proteína receptora de la superficie celular marcada de manera luminiscente en o sobre las células; b. segmentar la imagen del objeto; y c. determinar si los objetos en la imagen del objeto segmentada representa proteínas receptoras de la superficie celular marcadas de manera luminiscente internalizadas válidas. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque comprende, además, al menos uno de los siguientes: a. remover artefactos de la imagen del objeto; o b. corregir la luminiscencia de fondo. 31. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque comprende, además, medir al menos uno de los siguientes: (a) un número de objetos que se determinó representan receptores de la superficie celular internalizados válidos; (b) una área agregada de los objetos que se determinó representan al receptor de la superficie celular internalizados válidos; (c) una intensidad agregada de los objetos que se determinó representan receptores de la superficie celular internalizados válidos; o (d) una intensidad agregada normalizada de los objetos que se determinó representan receptores de la superficie celular internalizados válidos. 32. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque las subregiones del arreglo de ubicaciones que contienen múltiples células se muestrean múltiples veces a intervalos para proporcionar la medición cinética de la internalización del receptor de la superficie celular. 33. Un medio de almacenamiento legible en computadora, caracterizado porque comprende un programa que contiene un conjunto de instrucciones para hacer que un sistema seleccione células para ejecutar el método de conformidad con la reivindicación 1, donde el sistema de selección de células comprende un sistema óptico con una platina adaptada para sostener una placa que contiene células, medios para mover la platina o el sistema óptico, una cámara digital, medios para dirigir la luz emitida desde las células hacia la cámara digital, y medios de computadora para recibir y procesar los datos digitales de la cámara digital. 34. Un medio de almacenamiento legible en computadora, caracterizado porque comprende un programa que contiene un conjunto de instrucciones para hacer que un sistema seleccione células para ejecutar el método de conformidad con la reivindicación 9, donde el sistema de selección de células comprende un sistema óptico con una platina adaptada para sostener una placa que contiene células, medios para mover la platina o el sistema óptico, una cámara digital, y medios para dirigir la luz emitida desde las células hacia la cámara digital, y medios de computadora para recibir y procesar los datos digitales de la cámara digital . 35. Un medio de almacenamiento legible en computadora, caracterizado porque comprende un programa que contiene un conjunto de instrucciones para hacer que un sistema seleccione células para ejecutar el método de conformidad con la reivindicación 17, donde el sistema de selección de células comprende un sistema óptico con una platina adaptada para sostener una placa que contiene células, medios para mover la platina o el sistema óptico, una cámara digital, y medios para dirigir la luz emitida desde las células hacia la cámara digital, y medios de computadora para recibir y procesar los datos digitales de la cámara digital . 36. Un medio de almacenamiento legible en computadora, caracterizado porque comprende un programa que contiene un conjunto de instrucciones para hacer que un sistema seleccione células para ejecutar el método de conformidad con la reivindicación 25, donde el sistema de selección de células comprende un sistema óptico con una platina adaptada para sostener una placa que contiene células, medios para mover la platina o el sistema óptico, una cámara digital, y medios para dirigir la luz emitida desde las células hacia la cámara digital, y medios de computadora para recibir y procesar los datos digitales de la cámara digital. 37. Un equipo para identificar compuestos que inducen o inhiben la internalización de proteínas receptoras de la superficie celular, caracterizado porque comprende : (a) al menos un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a una proteína receptora de la superficie celular de interés; y (b) instrucciones para utilizar el anticuerpo para identificar compuestos que inducen o inhiben la internalizacion de la proteína receptora de la superficie celular de interés hacia las células. 38. El equipo de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la proteína receptora de la superficie de interés es un receptor acoplado a la proteína G. 39. El equipo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el receptor acoplado a la proteína G es un receptor de la hormona paratiroidea.