JP2002520595A - 細胞ベースのスクリーニング用のシステム - Google Patents
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Abstract
Description
についての米国出願の一部継続出願である。
ものである。
的に基づくアッセイの開発、該アッセイの有効化、スクリーニングを生じるため
の該アッセイの最適化及び自動化、「ヒット」を同定するのに該アッセイを用い
る化合物ライブラリーの高スループットスクリーニング、ヒットの有効化及びヒ
ット化合物の有効化を含む長い複数工程プロセスである。このプロセスの出力は
前臨床に進められ、もし有効化されれば、結局は臨床試験に進められるリード化
合物である。このプロセスにおいて、該スクリーニング相はアッセイ開発相とは
区別され、生きた生物学的系における化合物有効性をテストすることを含む。
かかる遅くコスト高なプロセスである。ゲノミックス及び高スループットスクリ
ーニングの領域における開発の結果、標的同定及びスクリーニングした化合物の
容量の領域における能力及び効率の増大をもたらした。自動DNA配列決定、P
CR適用、位置クローニング、交雑アッセイ、及びバイオインフォーマティック
スにおける多いなる進歩は、潜在的薬物スクリーニング標的をコードする遺伝子
(及び遺伝子断片)の数を多いに増加させた。しかしながら、薬物スクリーニン
グのための基本的スキームは以前として同一のままである。
的の有効化は、インビボ機能的モデル、組換え蛋白質の機能的分析、及び候補遺
伝子の安定な細胞系発現のような、使用される遅く手動の方法のため薬物発見プ
ロセスにおいてネックとなった。自動配列決定を通じて獲得された一次DNA配
列データは、遺伝子機能の同定を可能としないが、既知の配列データベースと比
較した場合の共通した「モチーフ」及び特異的遺伝子相同性についての機能を提
供する。減算交雑及びRADE(差分発現の迅速増幅)のようなゲノミック方法
を用いて、病気状態モデルにおいて上昇または下降調節される遺伝子を同定する
ことができる。しかしながら、同定及び有効化は依然として同経路を遅延させる
。いくつかのプロテオミック方法は、注目する候補遺伝子を同定するのに逆遺伝
学と組み合わせて蛋白質同定(広大な発現系、2D電気泳動、コンビナトーリア
ルライブラリー)を用いる。かかる推定「病気関連配列」または無傷cDNAと
して単離されたDASはこれらの方法にとって大いに利点となるが、それらは、
コードされた蛋白質のタイプ、活性及び分布に関するいずれの情報も提供するこ
となく数百によって同定される。薬物スクリーニング標的としてのDASのサブ
セットを選択することは「ランダム」であり、かくして、病気とのメカニズム的
リンクを供するための機能データがなく極端に効率が低い。従って、生物学的機
能を確立し、それにより、薬物発見における標的の有効化及び候補の最適化を改
良するためにDASを迅速にスクリーニングする新しい技術を提供する必要があ
る。
た情報取り扱い能力を提供するツールに対する要求がある。バイオインフォーマ
ティックスはDNA配列決定システムの迅速な開発及びゲノミックスデータベー
スの進化を実らせた。ゲノミックスは潜在的新標的の同定で非常に重要な役割を
演じ始めている。プロテオニックスは、薬物相互作用を予測するために蛋白質標
的の構造と機能を関連させるのに不可欠なものとなった。しかしながら、生物学
的複雑性の次のレベルは細胞である。したがって、細胞から多次元情報を獲得し
、管理し及びサーチする必要がある。第2に、より高いスループットツールに対
する要求がある。DNA配列決定及び高スループット一次スクリーニングで既に
証明されているように、自動化は生産性を改良する鍵である。本発明は、高スル
ープットの要求に適合する細胞からの複数パラメータ情報を抽出する自動システ
ムを提供する。また、本発明は、各アッセイで必要な試薬及びテスト化合物の容
量を減少させつつ、該方法をミニチュア化し、それにより増大したスループット
を可能とする。
ながら、より多い情報、より高いスループット及びミニチュア化に対する要求は
、蛍光検出を用いることに向けてのシフトを引き起こした。蛍光ベースの試薬は
、スループット及び情報がより高く、試薬及びテスト化合物の容量を低くしか要
しない、より強力な複数パラメータッセイを生じさせることができる。また、蛍
光は放射能ベースの方法よりも安全であって安価である。
いる。レポーター分子としての修飾された緑色蛍光蛋白質(GFP)のような蛍
光蛋白質を生じさせるための、細胞の遺伝子工学に関連した膨大な文献がある。
野生型GFPのいくつかの特性はMoriseら(Biochemistry 13(1974),p.2656−2662)及びWardら(Photoch
em.Photobiol.31(1980),p.611−615)によって
開示されている。くらげAequorea victoriaのGFPは395
nmの励起最大及び510nmの発光最大を有し、蛍光活性に外因性因子を要し
ない。文献に開示されたGFPの使用は広範なものであり、細胞下オルガネラの
可視化(Rizzutoら,Curr.Biology 5(1995),p.
635−642)、分泌経路に沿っての蛋白質輸送の可視化(Kaether及
びGerdes,FEBS Letters 369(1995),p.267
−271)、植物細胞における発現(Hu及びCheng,FEBS Lett
ers 369(1995),p.331−334)及びDrosophila
胚(Davisら、Dev.Biology 170(1995),p.726
−729)のためのツールとして、及び注目するもう1つの蛋白質に融合したレ
ポーター分子として(米国特許第5,491,084号)遺伝子発現及び蛋白質
の位置決定の研究を含む(Chalfieら,Science 263(199
4),p.12501−12504)。同様に、WO96/23898は、蛋白
質キナーゼ活性化部位を有するGFP構築体を利用することによる細胞内プロセ
スに影響する生物学的活性物質の検出方法に関する。この特許及び本出願で引用
する全ての他の特許は出典明示してその全体を本明細書の一部とみなす。
/09598はGFP様蛋白質の発現を利用する注目の細胞を単離するためのシ
ステムを記載する。WO96/27675は植物におけるGFPの発現を記載す
る。WO95/21191は突然変異誘発を検出するための形質転換生物で発現
された修飾GFP蛋白質を記載する。米国特許第5,401,629号及び第5
,436,128号は細胞表面受容体を発現し、細胞表面受容体の活性に応答す
る転写調節エレメントを含むレポーター遺伝子構築体を含有する組換え細胞を用
いて細胞外信号の細胞内変換を検出し評価するためのアッセイ及び蘇生物を記載
する。
化合物及びアッセイ成分試薬の取り扱い及び加工を要する。標準的な高スループ
ットスクリーニング(「HTS」)は、96または384ウェルを備えた標準的
なマイクロタイタープレート中のウェルのアレイに負荷されたいくつかのインジ
ケータ化合物と共に化合物及び生物学的試薬の混合物を使用する。蛍光であれ発
光であれ、各ウェルから測定された信号、光学密度または放射能は、ウェル中の
全ての物質からの信号を統合し、ウェル中の全ての分子の全集団平均を与える。
eattle,WA98109)はイメージングプレートリーダーを記載する。
この系は96ウェルプレートの全面積をイメージするのにCCDカメラを用いる
。該イメージを解析してウェル中の全ての物質につきウェル当たりの全蛍光を計
算する。
)は、低角レーザースキャニング照明及びマスクを用いて、標準96ウェルプレ
ート中のウェルの底からほぼ200ミクロン内の蛍光を選択的に励起し、細胞単
層をイメージする場合にバックグラウンドを減少させるシステム(FLIPR)
を記載する。このシステムはCCDカメラを用いてプレートの底の全面積をイメ
ージする。このシステムはウェルの底の細胞単層に由来する信号を測定するが、
測定された信号はウェルの領域にわたって平均され、従って、細胞集団の平均応
答の測定と見なされる。該イメージを解析して、細胞ベースのアッセイにつきウ
ェル当たりの全蛍光を計算する。また、FLIPRのシステムのように、細胞ベ
ースのスクリーニングシステムに流体配送デバイスが一体化されて応答を開始さ
せ、次いで、これはマクロイメージングシステムを用いて全ウェル集団平均応答
として観察される。
「HCS」)は、細胞構成物の時間的−空間的ダイナミックス及びプロセスにつ
いてのより詳細な情報に対する要求に応じるために開発された。高内容スクリー
ニングは、細胞に一体化された特異的蛍光ベースの試薬に由来する多色蛍光情報
の抽出を自動化する。(Giuliano及びTaylor(1995),Cu
rr.Op.Cell Biol.7:4;Giulianoら(1995)A
nn.Rev.Biophys.Biomol.Struct.24:405)
。細胞は、空間的並びに時間的ダイナミックスを測定できる光学系を用いて分析
される。(Farkasら,(1993)Ann.Rev.Physiol.5
5:785;Giulianoら(1990))。Optical Micro
scopy for BiologyにおけるB.Herman及びK.Jac
obson編、pp.543−557。Wiley−Liss、New Yor
k、Hahnら,(1992)Nature 359:736;Waggone
rら,(1996)Hum.Pathol 27:494)。該概念は標識され
た構成要素の活性についての空間的及び時間的情報を有する「ウェル」としての
各細胞を処理するものである。
報のタイプは、イオン濃度、膜ポテンシャル、特異的トランスローケーション、
酵素活性、遺伝子発現、ならびに代謝産物、蛋白質、脂質、炭水化物、及び核酸
配列の存在、量及びパターンを含む(DeBiasioら(1996)Mol.
Biol.Cell.7:1259;Giulianoら(1995)Ann.
Rev.Biophys.Biomol.Struct.24:405;Hei
m及びTsien(1996)Curr.Biol.6:178)。
交雑プローブを用いて固定された細胞で、あるいは多色蛍光インジケータ及び「
バイオセンサ」を用いて生きた細胞で行うことができる。固定されたまたは生き
た細胞のスクリーニングの選択は必要とされる特異的細胞ベースのアッセイに依
存する。
ト様式でのまず生きた細胞のアレイは種々の化合物及びテストすべき用量で処理
することができ、従って、細胞を固定化し、特異的試薬で標識し、測定すること
ができるからである。固定化後に細胞の環境制御は必要ではない。空間的情報が
獲得されるが、1つの時点においてのみである。細胞に適用することができる何
千という抗体、リガンド及び核酸交雑プローブの利用性は、これを、細胞ベース
のスクリーニングの多くのタイプに対し魅力的なアプローチとする。固定及び標
識工程は自動化することができ、アッセイの効果的な処理を可能とする。
る。生細胞のアレイは時間及び空間にわたってスクリーニングすることができる
からである。細胞の環境制御(温度、湿度及び二酸化炭素)が測定の間に必要で
ある。というのは細胞の生理学的健康を、多重蛍光測定のために経時的に維持し
なければならないからである。細胞内での生化学及び分子活性の変化を報告でき
る蛍光生理学的インジケータ及び「バイオセンサ」の増大するリストがある。(
Giulianoら、(1995)Fluorescent and Lumi
nescent Probes for Biological Activi
tyにおけるAnn.Rev.Biophys.Biomol.Struct.
24:405;Hahnら、(1993)。W.t.Mason編、pp.34
9−359,Academic Press,San Diego)。
双方の開発を進めるのを助けてきた。多色高内容情報を自動的に抽出するための
器機の進歩は、最近、HTCを自動ツールに発展させるのを可能とした。Tay
lorらによる論文、(American Scientist 80(199
2),p.322−335)はこれらの方法の多く及びその適用を記載する。例
えば、Proffittら(Cytometry 24:204−213(19
96))は、種々の組織培養プレート様式、特に96−ウェルマイクロタイター
プレートにおいてイン・サイチュで相対的細胞数を定量するための半自動蛍光デ
ジタルイメージングシステムを記載する。該システムは、モーター化ステージ、
ビデオカメラ、イメージインテンシファイアを備えたエピ蛍光倒立顕微鏡、及び
PC−ビジョンデジタイザーを備えたマイクロコンピュータよりなる。ターボパ
スカルソフトウェアは該ステージを制御し、プレートを走査してウェル当たり複
数のイメージを採取する。該ソフトウェアはウェル当たりの全蛍光を計算し、毎
日のキャリブレーションを備え、種々の組織培養プレート様式を容易に形成する
。生細胞によって接種された場合にのみ蛍光を発するデジタルイメージ及び試薬
の閾値を用いて、過剰の蛍光試薬を除去することなくバックグラウンド蛍光を減
少させる。
1995)Experimental Cell Research 221:
311−319)及びマルチ光子顕微鏡イメージング(Denkら,(1990
) Science 248:73;Grattonら、(1994)Proc
.of the Microscopical Society of Ame
rica,pp.154−155)もまた、顕微鏡試料の高解像イメージを獲得
するためのよく確立された方法である。これらの光学系の主要な利点は非常に狭
い焦点深度であり、これは、限定された軸方向度の特徴がバックグラウンドに対
して解像されることを可能とする。例えば、細胞表面の特徴から固有の細胞の内
部細胞質特徴を解像するのを可能とする。走査型マルチ光子イメージングは必要
な高光子フラックスを達成するのに非常に短かい持続のパルスレーザー系を必要
とするので、蛍光の寿命もまたこれらの系で測定することができ(Lakowi
czら,(1992)Anal.Biochem.202:316−330;G
errittsenら(1997),J.of Fluorescence 7
:11−15))、異なる検出濃度のためのさらなる能力を提供する。レーザー
ダイオードポンプドレーザーのような小さくて信頼性がありかつ比較的安価なレ
ーザー系が、今日利用できて、マルチ光子共焦点顕微鏡がかなり日常的に適用さ
れるのを可能とする。
ell.Physiol.141:410;Giuliano,(1996)C
ell Motil.Cytoskel.35:237)ならびに細胞内に存在
する化学及び分子情報の高空間的及び時間的頻度の組合せは、現存の全マイクロ
タイタープレートリーダーを用いて細胞の集団から高内容情報を抽出するのを不
可能とする。個々に分析される細胞を用いる多色蛍光ベーススクリーニングのた
めに設計された現存の高内容スクリーニングプラットフォームはない。同様に、
特に、マイクロタイタープレートで増殖した細胞から、HCS分析によって同定
される細胞応答を誘導する能力につき化合物を系統的にスクリーニングする目的
で細胞のアレイへの自動流体配送を組み合わせる方法は現在利用できない。さら
に、高スループットウェル間測定を組み合わせて、1つのアッセイで「ヒット」
を同定し、続いてヒットとして同定されたウェルのみの同一プレートで第2の高
内容細胞間測定を行う方法は当該分野に存在しない。
グ(HCS)を組み合わせるシステム、方法及びスクリーニングを提供し、これ
は、多くの細胞スクリーニングフォーマットを蛍光ベースの分子試薬及びコンピ
ュータベースの特徴抽出、データ解析及び自動化と組み合わせることによって標
的の有効化及び候補の最適化をかなり改良し、その結果、データ収集、短縮され
たサイクル時間、及び最後には、有望な薬物候補のより速い評価の質及びスピー
ドの増大がもたらされる。また、本発明は、該方法をミニチュア化し、それによ
り、各アッセイで必要な試薬及びテスト化合物の容量を減少させつつ、増大した
スループットを可能とする。
るための十分に自動化された方法を提供する。このアプローチは、注目する受容
体の蛍光標識及び刺激された細胞における受容体内部化の自動測定を含む。
胞をテスト化合物で処理し、該細胞から発光信号を得、該発光信号をデジタルデ
ータに変換し、次いで、該デジタルデータを利用して、該テスト化合物が発光標
識細胞表面受容体蛋白質の該細胞への内部化を誘導したか否かを決定することを
含む、細胞表面受容体蛋白質の内部化を誘導または阻害する化合物を同定するた
めの方法、コンピュータ読み取り可能な記憶媒体及びキットが提供される。
間分解能及び定量を可能とする種々の好ましい実施の態様が提供される。1つの
かかる実施の態様において、膜結合受容体蛋白質の細胞外及び細胞内ドメインが
各々区別される発光マーカーで標識されて、膜受容体の外部及び内部ドメインの
相対的細胞外利用性の測定を可能とする。
は阻害する化合物を同定するための、組み合わせた高スループット及び高内容方
法及び関連コンピュータ読み取り可能な記憶媒体が提供される。この態様におい
て、細胞を注目する受容体蛋白質に対するリガンドで処理し、これは、受容体蛋
白質の刺激に対して検出可能なシグナルを生じる。次いで、該細胞をテスト化合
物で処理し、次いで、高スループットモードで走査して、リガンド−誘導検出可
能信号を呈する細胞を同定する。引き続いて、検出可能信号を呈した細胞のみを
高内容モードで走査して該テスト化合物が、発光標識細胞表面受容体蛋白質の細
胞への内部化を誘導したか否かを決定する。
明細書の一部とみなす。本明細書で用いるように、以下の用語は特別の意味を要
する。
成要素に対して高い親和性を有する発光プローブ。これらのプローブは、「標識
試薬」、「環境インジケータ」または「バイオセンサ」として使用される、小さ
な発光分子または蛍光タグドマクロ分子のいずれかであり得る。
オセンサを含めた発光標識マクロ分子、緑色蛍光蛋白質とで形成されたものを含
めた発光マクロ分子キメラ及びその突然変異体、生理学的応答に関与する細胞抗
原と反応する蛍光標識一次または二次抗体、発光染色、染料及び他の小分子を含
む。
細胞ドメインからもう1つのドメインに移動する発光タグドマクロ分子またはオ
ルガネラ。移動マーカーは細胞ドメインのマーカーに対する位置を単に報告する
か、あるいはそれは同様にいくつかの生化学または分子活性を報告する「バイオ
センサ」でもあり得る。
能性ドメイン及び発光プローブもしくは複数プローブよりなるマクロ分子。これ
らの変化を検知し報告するように設計された発光標識マクロ分子のクラスは「蛍
光蛋白質バイオセンサ」と言われてきた。バイオセンサの蛋白質成分は、高度に
進化した分子認識部位を提供する。活性部位の近くの蛋白質成分に付着した蛍光
分子は、環境変化を蛍光信号に変換し、これは、本発明の細胞スキャニング走査
系のような適当な時間的かつ空間的分解能を備えた系を用いて検出される。生細
胞内の天然蛋白質活性の変調は可逆的であるので、かつ蛍光蛋白質バイオセンサ
は蛋白質活性の可逆的変化を検知するように設計することができるので、これら
のバイオセンサは実質的に再使用可能である。
準的技術、減算交雑及びRADEのようなゲノミック方法、及び薬物候補化合物
のものであるような、逆遺伝学と組み合わせたプロテオミック方法によって同定
された核酸配列をいう。該用語は、該配列が病気状態に関連するに過ぎないこと
を意味しない。
ものではないがアポトーシス、細胞分裂、細胞接着、移行、エキソサイトーシス
及び細胞間通信を含めた細胞機能のような複雑な分子事象に対する薬物の効果を
測定することができる。多色蛍光は、複数の標的及び細胞プロセスが単一のスク
リーニングでアッセイされるのを可能とする。細胞応答の交差−相関は、標的の
有効化及びリード最適化に必要な情報の価値を生じるであろう。
のアレイを備えたプレートを保持し、プレートを移動させて顕微鏡を対物レンズ
と該位置とを整列させるための手段及び焦点合わせを行う方向にプレートを移動
させるための手段を有するのに適したXYステージを有する高倍率蛍光光学系;
デジタルカメラ;位置のアレイ中の細胞に励起光を向けるための光学手段及び細
胞から発せられた蛍光をデジタルカメラに向けるための手段を有する光源;及び
デジタルカメラからのデジタルデータを受領し加工するためのコンピュータ手段
を含み、ここに、該コンピュータ手段は該カメラからのイメージを受け取るため
のデジタルフレームグラバー、使用者の会話用ディスプレイ及びアッセイ結果の
ディスプレイ、データ記憶及び記録用のデジタル記憶媒体、及び結果の制御、獲
得、加工及び表示のための手段を含む細胞スクリーニングシステムが提供される
。
カメラに対して1−100xの倍率を持つ標準対物レンズ、及び電源2を備えた
白色光源(例えば、100W水銀アーク灯または75Wキセノンランプ)を用い
るZeiss Axiovert倒立蛍光顕微鏡のような倒立蛍光顕微鏡1を用
いる。顕微鏡対物レンズにわたってXY方向にプレート4を移動させるためのX
Yステージ3がある。Z軸フォーカスドライブ5は焦点合わせのために該対物レ
ンズをZ方向に動かす。ジョイスティック6はXYZ方向のステージの手動によ
る移動を供する。高分解能デジタルカメラ7はプレート上の各ウェルまたは位置
からイメージを獲得する。カメラ電源8、自動コントローラー9及び中央処理ユ
ニット10がある。該PC11はディスプレイ12を備え、関連ソフトウェアを
有する。プリンター13はハードコピー記録の印刷を供する。
ステージ3、Z−軸フォーカスドライブ5、ジョイスティック6、光源2及び自
動コントローラー9をより詳細に示す。コンピュータ15及び顕微鏡16へのケ
ーブルは、各々が備えられる。加えて、図2は、XY方向にXYステージ3上で
動く96ウェルマイクロタイタープレート17を示す。光源2からの光は、PC
制御シャッター18を通って、励起フィルタ20を備えたモーター化フィルタホ
イール19に通過する。光は、二色ミラー26及び発光フィルタ27を有するフ
ィルタキューブ25に通過する。励起光はマイクロタイタープレート17中のウ
ェルに対して色ミラーを反映し、蛍光28は二色ミラー26及び発光フィルタ2
7を通ってデジタルカメラ7に通過する。
ッター及び及び電源31を含むデジタルカメラ7は顕微鏡アセンブリからの蛍光
28を受け取る。デジタルケーブル30はデジタル信号をコンピュータに輸送す
る。
に生じさせるのに顕微鏡光学を用いて、検体の高分解能イメージを捕獲する。こ
の光学システムは通常「広視野」顕微鏡をいう。顕微鏡分野における当業者であ
れば、検体の高分解能イメージが、限定されるものではないが、検体にわたって
走査された照明の焦点合わせされた点または線の標準的走査型共焦点検出(Go
ら,1997,前掲)、及びマルチ光子走査型共焦点顕微鏡(Denkら,19
90,前掲)(双方はCCD検出器上にイメージを形成することができる)を含
めた種々の他の光学系によって、あるいは光電子倍増管のアナログ出力の同調デ
ジタル化によって創製できることを認識するであろう。
いて、それらの細胞の特定の特徴を利用する必要がある。細胞培養の分野の当業
者であれば、いくつかの細胞系は接触阻止され、これはそれが他の細胞に囲まれ
るようになった場合に増殖を停止し、他方、他の細胞はその条件下で増殖し続け
、該細胞は文字通り積み重なって多層を形成することを認識するであろう。かか
る細胞系の例はHEK293(ATCC CRL−1573)系である。多層調
整物中で単一細胞層のイメージを獲得できる光学系は、層を形成する傾向にある
細胞系で使用するのに必要である。広視野顕微鏡の視野の大きな深度は、細胞の
多層を通じて突出があるイメージを生じ、細胞下空間分布の分析を層形成細胞に
おいて極端に困難とする。あるいは、共焦点顕微鏡で達成することができる視野
の非常に浅い深度(約1ミクロン)は、高分解能での単一細胞層の区別を可能と
し、細胞下空間分布の測定を単純化する。同様に、共焦点イメージングは、蛍光
寿命イメージングのような検出モードが必要とされる場合に好ましい。
、前記した他の細胞スクリーニングシステムの実施の態様によって生じたイメー
ジと同一のフォーマットに変換することができ、従って、それらのイメージと正
確に同様に処理することができる。この実施の態様における総じての制御、獲得
及び分析は実質的に同一である。共焦点顕微鏡システムの光学立体配置は、イル
ミネータ及び検出器を除いて前記したものと実質的に同一である。共焦点顕微鏡
で必要とされる照明及び検出系は、本発明のそれのような標準顕微鏡光学系に付
着されるようにアクセサリーとして設定されている(Zeiss,ドイツ)。従
って、これらの代替光学系は前記したように該系に容易に取り込むことができる
。
/N 08/865,341に記載された、マイクロプレート41上のマイクロ
ウェル40中に細胞アレイがある本発明の別の実施の態様を示す。典型的には、
マイクロプレートは、86mm×129mmである標準96ウェルマイクロタイ
タープレートと比較して20mm×30mmである。マイクロプレート上の細胞
の高密度アレイは、顕微鏡が、高スループット用の画素当たり数ミクロンの低い
分解能でイメージされることを可能とし、顕微鏡上の特定の位置が画素当たり0
.5ミクロン未満のより高い分解能でイメージされることを可能とする。これら
の2つの分解モードは該系の総スループットを改良するのを助ける。
配送系として働く。マイクロプレートチャンバー42中のマイクロプレート41
はXYマイクロプレートリーダー43中におかれる。デジタルデータは前記した
ように処理される。このマイクロプレート系の小さなサイズはスループットを増
大させ、試薬容量を最小化し、速くかつ正確な細胞ベースの分析のため細胞の分
布及び配置の制御を可能とする。処理されたデータはPCスクリーン11上に表
示でき、バイオインフォーマティックスデータベース44の一部とできる。この
データベースは、本発明の方法を介して得られたデータの記憶及び検索を可能と
するのみならず、細胞に関連する外部データの獲得及び記憶を可能とする。図5
はソフトウェアの操作を説明するPCディスプレイである。
ーム上または2つの別の(局所領域ネットワークを介して)電気的に結合した別
のプラットフォーム上でHCSと直接カップリングされる。二重モード光学系と
いわれる本発明のこの実施の態様は、それをHTSとカップリングさせることに
よってHCSのスループットを増加させる利点を有し、それにより、カップリン
グされたHTSでの応答を示すウェルの小さなサブセット上のみのより遅い高分
解能データ獲得及び分析を要する。
通常、非常に多数の化合物をスクリーニングするのに使用されるHTSシステム
の構成要素として使用される(Beggs(1997),J.of Biomo
lec.Screening 2:71−78;Macaffreyら,(19
96)J.Biomolec.Screening 1:187−190)。
ープット獲得が1つのプラットフォーム上で起こり、高内容獲得が第2のプラッ
トフォーム上で起こる2プラットフォーム構造体が提供される(図6)。処理は
独立して各プラットフォームで起こり、結果はネットワークインターフェイスに
わたって通過し、あるいは単一のコントローラーを用いて両プラットフォームか
らのデータを処理する。
学器機、高スループットプラットフォーム60及び高内容プラットフォーム65
よりなり、これは、マイクロプレート上のマイクロタイタープレートまたはマイ
クロウェルアレイで培養された細胞から発せられた蛍光信号を読み取り、電子的
結合64を介して相互に連絡する。高スループットプラットフォーム60はプレ
ート全体の全てのウェルを平行してまたは迅速に連続的に分析する。スクリーニ
ングの分野の当業者であれば、二重モード細胞ベースのスクリーニングシステム
に取り込むことができる多くのかかる商業的に入手可能な高スループットリーダ
ー系があることを認識するであろう(Topcount(Packard In
struments,Meriden,CT);Spectramax,Lum
iskan(Molecular Devices,Sunnyvale,CA
);Fluoroscan(Labsystems,Beverly,MA))
。前記した高内容プラットフォーム65はウェル間を走査し、ウェル内の個々の
細胞から収集された高分解能イメージデータを獲得し分析する。
器機を制御し、結果はモニター61上に表示される。そのコンピュータシステム
67に存在するHCSソフトウェアは高内容器機ハードウェア65、任意デバイ
ス(例えば、プレートローダー、環境チャンバー、流体分注器)を制御し、プレ
ートからのデジタルイメージデータを解析し、モニター66に結果を表示し、測
定されたデータを統合されたデータベース中で管理する。 また、2つのシステ
ムは単一のコンピュータを共有し、その場合、データを移動させるための局所領
域ネットワークに対する必要性なくして、全てのデータはそのコンピュータで収
集され、処理され、表示される。当該分野でよく知られているように、マイクロ
タイタープレートは、手動によりまたはロボットプレート移動デバイスによって
高スループット系から高内容システム63に移される(Beggs(1997)
,前掲;Mcaffrey(1996),前掲)。
テムを利用する(図7)。それは、2つの別々の光学モジュール、HCSモジュ
ール203、及びHTSモジュール209よりなり、これは、ただ1つが一度に
使用されてマイクロタイタープレート201からデータを収集するように独立的
にまたは集合的に移動することができる。マイクロタイタープレート201はモ
ーター化X、Yステージに取り付けられ、従って、それはHTSまたはHCSモ
ードいずれかでのイメージング用に位置させることができる。後記するようにH
TSイメージデータを収集し解析した後、HTS光学モジュール209を光学経
路から離れるように移動させ、HCS光学モジュール203を所定の位置に移動
させる。
3及び二色ミラー210よりなり、これらは通常のランプ系(示さず)からの特
定波長バンドでプレートの全底を照明するのに利用される。蛍光発光は、センサ
ー215と共にカメラ216上でイメージを形成するレンズ212によって二色
ミラー210及び発光波長フィルタ211を通じて収集される。
7及び二色ミラー204よりなり、これらは顕微鏡対物レンズ202の逆開口を
照明するのに使用され、それにより、その対物レンズの視野は標準的な顕微鏡照
明システム(図示せず)を形成させる。蛍光発光は顕微鏡対物レンズ202によ
って収集され、二色ミラー204及び発光波長フィルタ205を通過し、チュー
ブレンズ206によって焦点を結び、これはセンサー215を備えた同カメラ2
16上でイメージを形成する。
細胞スクリーニングの方法の生細胞実施の態様で使用される流体配送デバイスを
含む(後記参照)。図8は本発明の該システムで使用される流体配送デバイスを
例示する。それは単一モータードライブによって駆動された12個のシリンジポ
ンプ701のバンクよりなる。各シリンジ702は各ウェルに配送される容量に
従ったサイズであり、典型的には1及び100μLの間である。各シリンジは柔
軟なチューブ703を介して、標準的なピペットチップ705を許容するコネク
ターの同様のバンクに取り付けられる。ピペットチップのバンクは、それらをマ
イクロタイタープレート706に対して下降させ上昇させて各ウェルに流体をデ
リバーできるようにドライブシステムに取り付けられる。該プレートはX、Yス
テージ上に取り付けられ、データ収集目的で光学系707に対する移動を可能と
する。このセットアップは一組のピペットチップまたは単一のピペットチップさ
えプレート上の全てのウェルに試薬をデリバーさせるのを可能とする。シリンジ
ポンプのバンクを用いて流体を同時に12個のウェルに、またはチップのいくつ
かを除去することによってより少ないウェルにデリバーすることができる。
、ここに、該細胞は1以上の蛍光レポータ分子を含有し;細胞を含有する位置の
各々において複数細胞を走査して、細胞中の蛍光レポータ分子からの蛍光信号が
得られ;蛍光信号をデジタルデータに変換し;次いで、該デジタルデータを利用
して、細胞内の蛍光レポータ分子の分布、環境または活性を決定することを特徴
とする細胞を分析する方法を提供する。
することは、細胞及び試薬の平行した取り扱いのために細胞のアレイを調整する
ことを必要とする。9mmピッチで6mm直系ウェルを備えた、86mm×12
9mmである標準96ウェルマイクロタイタープレートが、現行の自動ローディ
ング及びロボット取り扱いシステムでの適合性のため使用される。該マイクロプ
レートは、約500ミクロンのピッチで寸法が100−200ミクロンであるウ
ェル位置を持ち、典型的には20mm×30mmである。マイクロプレートを作
成する方法は、出典明示してその全体を本明細書の一部とみなす米国特許出願番
号第08/865,341に記載されている。マイクロプレートは細胞が付着し
ない物質でパターン化された、細胞が付着する物質の共平面層、または同様にパ
ターン化された物質のエッチングされた三次元表面よりなることができる。以下
の議論の目的では、用語「ウェル」及び「マイクロウェル」は細胞が付着し、そ
の中に細胞がイメージされるいずれの構築のアレイにおける位置をもいう。また
、マイクロプレートはウェル間の空間に流体配送チャンネルを含むことができる
。マイクロプレートのより小さなフォーマットは、スキャニング操作で必要な調
整及び全移動の間の試薬、記憶及び取り扱いの量を最小化することによってシス
テムの全効率を増大させる。加えて、マイクロプレートの全面積をより効果的に
イメージして、本明細書で後記するようにマイクロプレートリーダー用の操作の
第2のモードを可能とすることができる。
クロ分子及びオルガネラの時間的及び空間的分布、含有量及び活性を測定するの
に使用される蛍光及び発光試薬の継続して増大するファミリーである。これらの
試薬のクラスは、生細胞及び固定細胞中の分子の分布及び量を測定する標識試薬
、時間及び空間における信号変換事象を報告するための環境インジケータ、及び
生細胞内で標的分子活性を測定するための蛍光蛋白質バイオセンサを含む。単一
細胞中でいくつかの試薬を組み合わせるマルチパラメータプローチは薬物発見の
ための強力な新しいツールである。
性に基づく。特異的構成要素に対する親和性は、イオン相互反応、共有結合のよ
うな物理的力(これは、蛋白質ベースのクロモフォア、フルオロフォア及びルミ
フォアでのキメラ融合を含む)、並びに疎水性相互作用、電気的ポテンシャル、
及びある場合には細胞構成要素内の単純な捕獲によって支配される。発光プロー
ブは小分子、標識されたマクロ分子または遺伝子工学により作成された蛋白質で
あり得るが、緑色蛍光蛋白質キメラを含むがそれに限定されるものではない。
雑プローブのような蛍光標識生体分子を含めた、本発明で使用することができる
多様な蛍光レポータ分子を認識するであろう。同様に、結合または会合の特定の
化学的特性にて特異的に合成された蛍光試薬が蛍光レポーター分子として使用さ
れてきた。(Barakら,(1997),J.Biol.Chem.272:
27497−27500;Southwickら,(1990),Cytome
try 11:418−430;Methods in Cell Biolo
gyにおけるTsien(1989),Vol.29 Taylor及びWan
g編,pp.127−156)。蛍光標識抗体は、細胞または組織と同程度に複
雑な分子の混合物中で単一の分子標的に付着する特異性のその高い程度のため特
に有用なレポーター分子である。
送、信号−配列−媒介輸送、及びエンドサイトーシスもしくはピノサイトーシス
摂取を含めたいくつかの非機械的様式を介して細胞に輸送することができる。当
該分野でよく知られた機械的大量負荷方法を用いて蛍光プローブを生細胞に負荷
することもできる(Barberら,(1996),Neuroscience
Letters 207:17−20; Brightら、(1996),C
ytometry 24:226−233;Methods in Cell BiologyにおけるMcNeil(1989),Vol.29,Taylo
r及びWang編,pp.153−173)。これらの方法はエレクトロポレー
ション及びスクレープ−ローディング、ビード−ローディング、インパクト−ロ
ーディング、シリンジ−ローディング、高張及び低張ローディングのような他の
機械的方法を含む。さらに、細胞を遺伝子工学により作成して、従前に記載して
いるように注目する蛋白質にカップリングした(GFPのような、レポーター分
子を発現させることができる(Chalfie及びPrasher米国特許第5
,491,084;Cubittら,(1995),Trends in Bi
ochemical Science 20:448−455)。
相互作用または信号−配列−媒介輸送のような分子標的化の他のモードの結果と
してその標的ドメインに蓄積する。蛍光標識レポーター分子は、レポーターの位
置、量及び化学的環境を測定するのに有用である。例えば、レポーターが親油性
膜環境にあるかまたはより水性の環境にあるかを決定することができる(Giu
lianoら,(1995),Ann.Rev.of Biophysics
and Biomolecular Structure 24:405−43
4;Giuliano及びTaylor(1995),Methods in Neuroscience 27:1−16)。レポーターのpH環境を測定す
ることができる(Brightら,(1989),J.Cell Biolog
y 104:1019−1033;Giulianoら,(1987),Ana
l.Biochem.167:362−371;Thomasら,(1979)
,Biochemistry 18:2210−2218)。キレート化基を有
するレポーターがCa++のようなイオンに結合しているか否かを決定すること
ができる(Methods in Cell BiologyにおけるBrig
htら,(1989),,Vol.30,Taylor及びWang編,pp.
157−192;Shimouraら,(1988),J.of Bioche
mistry(Tokyo)251:405−410;Methods in
Cell BiologyにおけるTsien(1989),Vol.30,T
aylor及びWang編、pp.127−156)。
的に標識できる構成要素を含むことができる。例えば、上皮細胞はしばしば偏光
膜構成要素を含有する。すなわち、これらの細胞は原形質膜に沿ってマクロ分子
を非対称に分布させる。結合または支持組織細胞は、しばしば、その細胞タイプ
に特異的な分子(例えば、ヘパリン、ヒスタミン、セロトニン等)が捕獲された
顆粒を含有する。ほとんどの筋肉組織細胞は筋形質小胞体、その機能が細胞質内
のカルシウムイオン濃度を調整すべき特殊化されたオルガネラを含有する。多く
の神経組織細胞は、神経ホルモンまたは神経伝達物質が捕獲された分泌顆粒及び
小胞を含有する。従って、蛍光分子は、特異的細胞内の特異的構成要素のみなら
ず、混合細胞タイプの集団内の特異的細胞をも標識するように設計することがで
きる。
例えば、いくつかの蛍光レポーター分子は励起または発光スペクトルの変化を定
義し、いくつかは共鳴エネルギー移行を呈し、ここに、1つの蛍光レポーターは
蛍光を失い、他方第2のものは蛍光を獲得し、いくつかのものは蛍光の喪失(消
光)または出現を呈し、他方、いくつかは合理的な移動を報告する(Giuli
anoら,(1995),Ann.Rev.of Biophysics an
d Biomol.Structure 24:405−434;Giulia
noら,(1995),Methods in Neuroscience 2
7:1−16)。
ラメータ、試料内の蛍光信号の分布に基づく細胞スクリーニングシステムによる
データ獲得、及び会話形データ総括及び分析を含む好ましい実施の態様が提供さ
れて細胞を分析する。自動スキャンの開始において、オペレーターは試料を記載
し、使用されるべき生物学的標識及び求められる情報にマッチするフィルタ設定
及び蛍光チャンネルを特定し、次いで、試料の鮮度に適合するようにカメラ設定
を調整する情報100をエンターする。ある範囲の試料を取り扱う柔軟性のため
、ソフトウェアは核及び細胞質を同定するのに使用される種々のパラメータ設定
の選択、及び異なる蛍光試薬の選択、形態または鮮度、及びウェル当たりに分析
される細胞数に基づく注目細胞の同定を可能とする。これらのパラメータは各自
動的実行用の容易な検索のためシステムのデータベースに記憶される。システム
の会話形細胞同定モードは、分析すべき細胞のサイズ、形状及び強度の範囲のよ
うな形態学的パラメータ制限の選択を単純化する。使用者は、プレートのいずれ
のウェルをシステムが走査するか、及びどれくらい多くの視野またはどれくらい
多くの細胞を各ウェルで分析するかを特定する。工程101で使用者によって選
択されたセットアップモードに応じて、システムはプレート102の「焦点発見
」に対するオートフォーカス手法を用いて走査すべきプレートの領域を自動的に
あらかじめ焦点合わせするか、あるいは使用者は、走査すべき矩形領域を規定す
る3つの「タグ」点を選択することによってスキャニング領域を会話形で予め焦
点合わせする103。次いで、最小二乗適合「焦点平面モデル」をこれらのタグ
点から計算して、自動スキャンの間の各ウェルの焦点を見積もる。各ウェルの焦
点は、スキャンの間に焦点平面モデルから内挿することによって見積もられる。
、それらが獲得される各独立波長のイメージ、それが決定される各ウェルについ
てのスクリーニングの結果を含めたスキャン状態を動的に表示する。プレート4
(図1)は曲がりくねったスタイルで走査される。というのはソフトウェアはモ
ータ化顕微鏡XYステージ3を、ウェル間から96−ウェルプレートの各ウェル
内の視野間に自動的に移動させる。プログラミング分野の当業者であれば24、
48及び384ウェルプレートのような他のミクロプレートフォーマットのスキ
ャニングのためにソフトウェアを適合させるやり方を認識するであろう。プレー
ト全体のスキャンパターンならびに各ウェル内の視野のスキャンパターンをプロ
グラムする。該システムはZ軸焦点ドライブ5を通じて自動焦点合わせ手法10
4にて試料焦点を調整し(図9)、モーター化フィルタホイール19を介してフ
ィルタ選択を制御し、4つまでの異なる色(「チャンネル」または「波長」)の
イメージを獲得し分析する。
択頻度で要求され、次いで、各ウェル内の4ないし5視野ごとに1回要求される
。該自動焦点合わせ手法は、予め計算された平面焦点モデルから内挿することに
よって出発Z軸点を計算する。この設定点上または下のプログラム可能距離で開
始し、該手法は機械的Z軸を多数の異なる位置を通じて移動させ、各位置でイメ
ージを獲得し、各イメージのコントラストを見積もる計算された焦点スコアの最
大を見い出す。最大焦点スコアを持つイメージのZ位置は特定の視野につき最良
の焦点を決定する。当業者であれば、Cytometry 5(1984)にお
けるHarmsら,236−243,Cytometry 6(1985)にお
けるGroenら,81−91,及びCytometry 12(1991)に
おけるFirestoneら,195−206に記載された自動フォーカシング
アルゴリズムの変形としてこれを認識するであろう。
ャンネルからの高品質イメージを保証する。ソフトウェア手法を使用者のオプシ
ョンで要求して、いずれかのさらなる測定の前に波長間の直線(X及びY)シフ
トを占めることによって波長間の登録シフトにつき補正する。電子シャッター1
8を、試料のフォトブリーチングが最小に維持されるように制御する。バックグ
ラウンド遮光及び均一な照明は当該分野で公知の方法を用いるソフトウェアによ
って補正することができる(Brightら,(1987),J.Cell B
iol.104:1019−1033)。
一次マーカー105(図9)(典型的には、DAPIまたはPI蛍光色素で逆染
色された細胞核)につきイメージを獲得する。適合閾値手法106を用いて、バ
ックグラウンドからの細胞を分離するためにイメージの閾値を動的に選択する。
蛍光色素での細胞の染色は、マイクロタイタープレート試料中での細胞を横切っ
てならびにマイクロタイタープレートの各ウェル内で細胞の視野のイメージ内で
未知の程度変化し得る。この変化は試料調製及び/または細胞の動的性質の結果
として起こり得る。広範な閾値が完全なイメージにつき計算されて、細胞をバッ
クグラウンドから分離し、視野間変化を説明する。これらの広範な技術は当該分
野で記載されているものの変形である(Computer Vision,Gr
aphics and Image Processing 30(1985)
におけるKittlerら,125−147,IEEE Trans.Syst
ems,Man and Cybernetics(1978)におけるRid
lerら,630−632)。
利用する。局所領域のイメージ分析は、良好な総細分化に至る。というのは、細
胞核(ならびに他の標識構成要素)の染色はイメージを横切って変化し得るから
である。この広範/局所手法を用い、低下した分解能イメージ(2ないし4のフ
ァクターだけサイズが低下)をまず(適合閾値決定を用いて)全体的に細分化し
てイメージにおける注目領域を見いだす。次いで、これらの領域をガイドとして
働かせて、十分な分解能の同一領域をより十分に分析する。次いで、より局所化
された閾値を(再度、適合閾値決定を用いて)注目する各領域につき計算する。
、バックグラウンドは黒色である。当該分野でマスクと呼ばれるこのバイナリー
イメージを用いて、視野が対象107を含有するかを決定する。該マスクは小斑
点標識アルゴリズムで標識し、それにより、各対象(または小斑点)はそれに帰
属されるユニークな数を有する。小斑点の領域及び形状のような形態学的特徴を
用いて、人工物であるものからの細胞であるような小斑点を区別する。使用者は
、既知の細胞の形態学的特徴においてタイプ分けすることによって、あるいは会
話形トレイニングユーフィリティーを用いることによって形態学的選択基準を予
め設定する。もし注目する対象が視野で見いだされれば、全ての他のチャンネル
108につきイメージを獲得し、さもなければステージを現行ウェル中で次の視
野109に前進させる。注目する各対象はさらなる分析110のためにイメージ
中に入れる。ソフトウェアは、その形態学的特徴(サイズ及び形状)を測定する
ことによって、対象が有効な細胞核111についての基準に適合するかを決定す
る。各有効細胞につき、XYZステージ位置を記録し、細胞の小さなイメージを
記憶し、特徴を測定する112。
って細胞試料で多くの異なるアッセイを行って、同時に複数波長で特徴を測定す
ることができる。1つのかかるアッセイの例は以下の測定を提供する: 1.色1−4につき細胞各内の全蛍光強度 2.色1についての細胞核の領域(一次マーカー) 3.色1についての細胞核の形状は3つの形状特徴によって記載される。
る) 5.色2−4についての細胞の細胞質(細胞質マスク)の蛍光を表す核の外側
のリングの全蛍光強度(図10参照) 6.細胞質マスクの面積 7.色2−4についての細胞質マスクの平均蛍光強度(すなわち、#5を#6
で割る) 8.色2−4についての細胞核内の平均蛍光強度に対する細胞質マスクの平均
蛍光強度の比率(すなわち、#7を#4で割る) 9.色2−4についての細胞質マスクの平均蛍光強度及び細胞核内の平均蛍光
強度の差異(すなわち、#7から#4を差し引く) 10.色2−4について細胞核内の蛍光ドメイン(スポット、ドットまたは粒
ともいう)の数 特徴1ないし4は、本発明のスクリーニングアッセイの一般的特徴である。こ
れらの工程は種々のイメージ分析で共通して使用され、当該分野でよく知られて
いる(Russ(1992)The Image Processing Ha
ndbook,CRC Press Inc.;Gonzalesら,(198
7),Digital Image Processing.Addison−
Wesley Publishing Co.pp.391−448)。特徴5
−9が特異的に開発されて、細胞の局所細胞質領域内の細胞の蛍光分子の測定及
び細胞質から核への蛍光分子の移行(すなわち、移動)の測定が供されている。
これらの特徴(工程5−9)は、核移動の阻害につきマイクロプレート中で細胞
を分析するのに使用される。例えば、転写ファクターの核移動の阻害は、無傷細
胞をスクリーニングする新規アプローチを提供する(他のタイプのスクリーニン
グの詳細な説明を後記で掲げる)。具体的アルゴリズムは各細胞の核領域(特徴
4)−対−局所細胞質領域(特徴7)中でプローブの量を測定する。これらの2
つの細胞下区画の間の差異の定量は、細胞質−核移動の尺度を供する(特徴9)
。
グで使用されるスクリーニングを記載する。例えば、プローブは染色体−特異的
DNA配列を同定するために商業的に入手可能である(Life Techno
logies,Gaithersburg,MD;Genosys,Woodl
ands,TX;Biotechnologies,Inc.,Richmon
d,CA;Bio 101,Inc.,Vista,CA)。細胞は性質が三次
元的であり、顕微鏡下で高倍率で調べると、1つのプローブは焦点内にあるが、
もう1つのプローブは完全に焦点外であり得る。本発明の細胞スクリーニング方
法は、多重焦点平面からイメージを獲得することによって核中の三次元プローブ
を提供する。ソフトウェアは小数工程でZ軸モータードライブを移動させ(図1
)、ここに、該工程距離は使用者が選択して、広い範囲の異なる核直径を占める
。焦点工程の各々において、イメージが獲得される。各イメージ中の各画素から
の最大灰色レベル強度が見出され、得られた最大映写イメージに記憶する。次い
で、最大映写イメージを用いてプローブをカウントする。前記アルゴリズムは、
相互に直接上下に積まれていないプローブをカウントするのによく作動する。Z
−方向で相互の頂部に積まれたプローブを説明するために、使用者は獲得された
焦点平面の各々中のプローブを分析するオプションを選択することができる。こ
のモードにおいて、スキャニングシステムは前記したように最大平面映写アルゴ
リズムを行い、このイメージにおいて注目プローブ領域を検出し、次いで、さら
に全ての焦点平面イメージにおいてこれらの領域を分析する。
かの未処理対象があるかをチェックする。もしいずれかの未処理対象があれば、
それは次の対象110を突き止め、それが有効細胞核111についての基準を満
たすかを決定し、特徴を測定する。一旦全ての現行視野にある対象が処理されれ
ば、システムは現行プレートの分析が完了したかを決定し114;もしそうでな
ければ、現行ウェル115にさらに細胞を見出す必要性を決定する。もし該必要
性が存在すれば、システムはXYZステージを現行ウェル109内の次の視野に
前進させるか、あるいはステージをプレートの次のウェル116に前進させる。
ー、及び要約レビュー機構でイメージ及びデータを総括することができる。スキ
ャンからの全てのイメージ、データ及び設定は、後の総括のため、あるいはネッ
トワーク情報管理システムでのインターフェーシングのために、システムのデー
タベースに記録される。また、データを他の第三者統計パッケージに送り出して
、結果を表化し、他のレポートを生成させることができる。使用者は会話形イメ
ージレビュー手法117でシステムによって解析された各細胞のイメージ単独を
レビューすることができる。使用者は、会話形細胞間データレビュー手法118
にて、会話形グラフ、測定された特徴のデータスプレッドシート、及び注目細胞
の全ての蛍光チャンネルのイメージを用いて細胞間ベースでデータをレビューす
ることができる。グラフプロッティング能力が提供され、ここに、データはヒス
トグラム及び変動プロットのような会話形グラフを介して解析することができる
。使用者は会話形ウェル間データレビュー手法119にて、プレートの各ウェル
内の全ての細胞につき蓄積され要約された要約データをレビューすることができ
る。グラフ及びイメージのハードコピーは広範囲の標準的プリンターで印刷する
ことができる。
トを作成することができる。使用者は会話形レポート創製手法120を用いるプ
レートの走査された領域につきウェル間ベースで要約されたデータのグラフレポ
ートを作成することができる。このレポートは、表及びグラフ様式のウェルによ
る統計の要約及び試料についての同定情報を含む。レポートウィンドウは、オペ
レータが、後の検索のためにスキャンにつき注釈をエンターすることを可能とす
る。複数レポートを多くの統計につき作成し、1つのボタンに触れて印刷するこ
とができる。レポートは印刷される前に位置及びデータにつき予備レビューする
ことができる。
ばれる単一高分解能モードで作動する。HCSモードは(1μmのオーダーで)
ウェル内での十分な空間分解能を備えて、ウェル内、ならびにウェル中の個々の
細胞内での物質の分布を規定する。そのモードでアクセス可能な高度な情報内容
は、所要の信号処理のスピード及び複雑性を犠牲として出現する。
トフォーム上または(例えば、局所領域ネットワークを介して)電子的に結合し
た2つの別のプラットフォーム上でHCSとカップリングさせる。二重モード光
学系という本発明のこの実施の態様は、それをHTSとカップリングさせ、それ
により、カップリングされたHTSにおいて遅い応答を示すウェルの小さなサブ
セットにのみ基づいた、より遅い高分解能データ獲得及び解析しか要しないこと
によって、HCSのスループットを増加させる利点を有する。
おり、通常は、非常に多数の化合物をスクリーニングするのに使用されるHTS
の構成要素として使用される(Beggsら,(1997),前掲;McCaf
freyら,(1996),前掲)。本発明のHTSは、十分な分解能にてプレ
ート中の多くのまたは全てのウェルを同時に読み取ってウェル間ベースで測定を
行うことによって、マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイで行
われる。すなわち、各ウェル中の多くのまたは全ての細胞または多量の物質の全
信号出力を平均することによって計算がなされる。HTSにおいていくつかの規
定された応答を呈するウェル(「ヒット」)がシステムによって標識される。次
いで、同一マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイ上で、ヒット
として同定された各ウェルが前記したようにHCSを介して測定される。かくし
て、二重モードプロセスは以下のものを含む: 1.マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイの多数のウェルの
迅速な測定 2.データを解釈してウェル間ベースで細胞中の蛍光標識レポーター分子の全
活性を決定し、「ヒット」(規定された応答を呈するウェル)を同定 3.各「ヒット」ウェル中で多数の細胞をイメージング、及び、 4.デジタルイメージデータを解釈して、個々の細胞中の蛍光標識レポーター
分子の分布、環境または活性(すなわち、分子内測定)及び特定の生物学的機能
についてテストするための細胞の分布を決定。
時に、オペレータは、プレート及びその内容を記載する情報302をエンターし
、フィルタ設定及び蛍光チャンネルを特定して、使用すべき生物学的標識、求め
られる情報及びカメラ設定を適合させ、試料の鮮度を適合させる。各自動ランに
ついての容易な検索のために、これらのパラメータをシステムのデータベースに
記憶する。ロボット負荷デバイスを制御することによって、手動または自動にて
、マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイを細胞スクリーニンド
システム303に負荷する。該システムによって光学環境チャンネル304を制
御して、マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイ中の生細胞を囲
む空気における温度、湿度及びCO2レベルを維持する。光学流体デリバリデバ
イス305(図8参照)をシステムによって制御して、スキャンの間に流体をウ
ェルに分注する。
クロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイで高スループット処理306
を行う。高スループットモード307で行う処理は図12に示し、後記する。高
スループットモードである程度の選択された強度応答を呈するウェル(「ヒット
」)がシステムによって同定される。システムは、ヒットにつきテストする条件
付操作308を行う。もしヒットが見出されると、それらの特異的ヒットウェル
は、さらに、高内容(ミクロレベル)モード309で解析する。高内容モード3
12で行われる処理を図13に示す。次いで、システムはインフォーマティック
スデータベース311を更新し310、測定の結果はプレート上にある。もし分
析されるべきより多くのプレートがあれば313、システムは次のプレートを負
荷し303;さもなければ、プレートの解析は終了する314。
ましい実施の態様である単一プラットフォーム二重モードスクリーニングシステ
ムを記載する。当業者であれば、操作的に、二重プラットフォームシステムは単
にオプィクスを動かすよりむしろ2つの光学系の間のプレートを動かすことを認
識するであろう。一旦システムが設定され、プレートが負荷されれば、システム
はHTS獲得及び解析を開始する401。HTS光学モジュールは、二重モード
システムでモーター化光学位置決定デバイス402を制御することによって選択
される。1つの蛍光チャンネルにおいて、プレート上の一次マーカーからのデー
タが獲得され403、ウェルはマスキング手法を用いてプレートバックグラウン
ドから分離される404。また、使用される他の蛍光チャンネルにおいてイメー
ジが獲得される405。各ウェル406に対応する各イメージ中の領域が測定さ
れる407。特定のウェルについての測定から計算される特徴を、所定の閾値ま
たは強度応答と比較し408、結果に基づいて、ウェルを「ヒット」として標識
するか409、またはしない。ヒットとして標識されたウェルの位置を、引き続
いての高内容モード処理のために記録する。もし処理すべき残存ウェルがあれば
410、プログラムは、全てのウェルが処理されるまで411、ループバックさ
れ406、システムは高スループットモードから出る。
ステムは、モーター位置決定システムを制御することによってHCS光学モジュ
ール502を選択する。高スループットモードで同定された各「ヒット」ウェル
では、ウェルのXYステージ位置がメモリーまたはディスクから検索され、次い
で、ステージは選択されたステージ位置503まで移動される。オートフォーカ
ス手法504が、各ヒットウェル中の第1視野で要求され、次いで、各ウェル内
で5ないし8視野毎に1回要求される。1つのチャンネルにおいて、一次マーカ
ー505(典型的には、DAPI、HoechstまたはPI蛍光色素で逆染色
した細胞核)でイメージが獲得される。次いで、適合閾値決定手法506を用い
てイメージが細分化される(核及び非核の領域に分離される)。細分化手法の出
力はバイナリーマスクであり、ここに、対象は白色であって、バックグラウンド
は黒色である。当該分野でマスクとも呼ばれるこのバイナリーイメージを用いて
、視野が対象507を含むかを決定する。マスクを小斑点標識アルゴリズムで標
識し、それにより、各対象(または小斑点)はそれに帰属されたユニークな数を
有する。もし対象が視野で見出されれば、全ての他の活性チャンネル508につ
きイメージが獲得され、さもなければ現行ウェルにおいてステージを次の視野5
14に前進させる。各対象はさらなる分析509のためにイメージ中に位置する
。対象の面積及び形状のような形態学的特徴を用いて、細胞核510でありそう
な対象を選択し、人工物であると考えられるものは捨てる(それについてはさら
なる処理は行わない)。各有効な核では、XYZステージ位置が記録され、細胞
の小イメージが記憶され、アッセイ特異的特徴が測定される511。次いで、シ
ステムは、いくつかの分析方法を適用していくつかの波長の各々での特徴を測定
することによって細胞につき複数テストを行う。細胞特徴を測定した後、システ
ムは、現行視野512にいずれかの未処理対象があるかをチェックする。もしい
ずれかの未処理対象があれば、それは次の対象509を突き止め、有効な細胞核
510についての基準に適合するかを決定し、その特徴を測定する。現行視野中
の全ての対象を処理した後、システムは、現行ウェル513中でより多くの細胞
または視野が必要か否かを決定する。もし現行ウェル中でより多くの細胞または
視野を見出す必要があれば、それはXYZステージを現行ウェル515内の次の
視野に進行させる。さもなければ、システムは、それが測定すべきいずれかの残
存するヒットウェルを有するか否かをチェックする515。 もし有すれば、そ
れは次のヒットウェル503まで進行させ、獲得及び解析のもう1つのサイクル
を通じて進み、さもなければ、HCSモードは終了する516。
れる。本発明の既に記載した実施の態様を用いて、時間の特定の時点、化学的固
定の時刻において細胞構成要素の空間的分布を特徴付けする。それ自体、これら
の実施の態様は、イメージ獲得の逐次の性質、及びプレート上の全てのウェルを
読み取るのに要する時間の量のため、動的ベースのスクリーニングを実行するの
に限定された利用性しか有しない。例えば、プレートは全てのウェルを通じて読
み取るのに30−60分を要しかねないので、単に生細胞のプレートを調製し、
次いで、一回を超えて全てのウェルを通じて読み取ることによって非常に遅い動
的プロセスしか測定することができない。より速い動的プロセスは、次のウェル
に進行する前に各ウェルの複数読み取りを採用することによって測定することが
できるが、最初及び最後のウェルの間で経過した時間はあまりにも長く、速い動
的プロセスは最後のウェルに到達する前に完了するであろう。
えてその動態によって生物学的プロセスが特徴付けされるスクリーニングの設計
及び使用を可能とする。多くの場合、試薬を特異的ウェルに添加し、適当なタイ
ミングにてそのウェルにつき複数測定を行うことによって生細胞における応答を
測定することができる。従って、本発明のこの動的生細胞実施の態様は、ウェル
を読み取る進行中の特定時間において試薬を各ウェルにデリバーするための、シ
ステムの個々のウェルに流体をデリバーする装置を含む。それにより、この実施
の態様は、動的測定が、プレートの各ウェルにつき数秒ないし数分の時間分解能
で成されることを可能とする。動的生細胞系の全効率を改良するには、プレート
の小区画からの反復データ収集を可能とするように獲得制御プログラムを修飾し
、個々のウェルで要求される時点間で他のウェルをシステムが読み取るのを可能
とする。
、それは前記した。この設定は、ピペットチップ705の1つの組または単一の
ピペットチップでさえが、プレート上の全てのウェルに試薬をデリバーするのを
可能とする。シリンジポンプ701のバンクを用いて、流体を12個のウェルに
同時にデリバーし、あるいはチップ705のいくつかを除去することによって、
より少数のウェルにデリバーすることができる。従って、以下のようにチップの
数及びスキャンパターンを変更することによって、データ収集効率を犠牲にする
ことなく、システムの時間的分解能を調整することができる。典型的には、単一
のウェルからのデータ収集及び解析は約5秒を要する。ウェルに移動し、ウェル
中で焦点合わせをするのは約5秒を要し、従って、ウェルについての全サイクル
時間は約10秒である。従って、単一のピペットチップを用いて流体を単一のウ
ェルにデリバーし、かつデータをそのウェルから反復して収集するならば、約5
秒の空間的分解能にて測定を行うことができる。もし6個のピペットチップを用
いて流体を6個のウェルに同時にデリバーし、かつシステムが全ての6つのウェ
ルを反復して走査すれば、各スキャンは60秒を要し、それにより、時間的分解
能を確立する。8分毎にデータ収集を要するにすぎないより遅いプロセスでは、
流体デリバー相の間にプレートを移動させ、次いで、プレートのその半分を反復
的に走査することによって、流体をプレートの半分までデリバーすることができ
る。従って、プレート上で走査すべき小区画のサイズを調整することによって、
獲得間に待機時間を挿入する必要なくして時間的分解能を調整することができる
。システムは継続的にデータを走査し獲得するので、従って、プレートからの動
的データ組を収集するための全時間は、単に、プレートの単一スキャンを行う時
間に要する時点の数を掛け合わせたものである。典型的には、化合物の添加前の
1つの時点及び添加に続いて2または3回の時点がスクリーニング目的で十分な
はずである。
の機器構成であり、その多くは標準的なHCS機器構成と同一である。加えて、
オペレータは、小区画サイズ、必要な時点の数及び必要な時間増分のような、実
行すべき動的解析に特異的な情報802をエンターしなければならない。小区画
は、動的データを獲得するために反復して走査されるであろうウェルの群である
。単一時間増分の間にシステムが全小区画を1回スキャンでき、かくして待機回
数を最小化するように小区画のサイズを調整する。最適小区画サイズは設定パラ
メータから計算し、要すればオペレータによって調整される。次いで、システム
はプレートを最初の小区画803まで、及びプレ刺激(時刻=0)時点を獲得す
るためにその小区画804中の最初のウェルまで移動させる。各ウェルで行われ
る獲得手順は動的モードで実行すべき特異的HCSに必要なものと正確に同一で
ある。図15はその処理についてのフローチャートの詳細を示す。スタート90
1及びリターン902の間の工程の全ては図13中の工程504−514として
記載されたものと同一である。
理されたか806(図14)、及び全領域が処理されるまでの全てのウェルを通
じてのサイクルをチェックする。次いで、システムはプレートを流体添加用の位
置まで移動させ、流体の全小区画807への流体システム配送を制御する。これ
は、プレート上のいくつかの列にわたる小区画で複数添加を必要とし、システム
はプレートを添加の間のX、Yステージ上に移動させる。一旦流体が添加されれ
ば、システムは小区画808中の第1ウェルまで移動させて、時点の獲得を開始
する。各ウェル809からデータが獲得され、前記したように、システムは小区
画810中の全てのウェルを通って循環する。各々が小区画を通った後、システ
ムは、全ての時点が収集されたかをチェックし811、もしそうでなければ、よ
うすれば812、休止して813、必要な時間増分にて同調を保つ。さもなけれ
ば、システムは、プレート814上のさらなる小区画につきチェックし、次の小
区画803まで移動させるか、あるいは終了する815。かくして、動的解析モ
ードは調べるべき動的応答に基づいて、スクリーニングするマイクロタイタープ
レートまたはマイクロウェルの小区画のオペレータによる同定を含み、引き続い
ての小区画でのデータ獲得に先立って小区画内でデータ獲得される。
胞構成要素の分布及び活性ならびにプロセスを規定するための手順を実行するよ
うにする指令の組を含有するプログラムを含む機械読み取り可能な記憶媒体が提
供される。好ましい実施の態様において、細胞スクリーニングシステムは、細胞
を保持するのに適したステージ及び該ステージを移動させるための手段を備えた
高倍率蛍光光学系、デジタルカメラ、該デジタルカメラからデジタルデータを受
け取り処理するための光源、及び該デジタルカメラからのデジタルデータを受け
取り処理するためのコンピュータ手段を含む。本発明のこの態様は、発光プロー
ブ、光学イメージングシステム、及び本発明のパターン認識ソフトウェアを用い
、特異的細胞構成要素の分布及び活性ならびにプロセスを規定するように細胞ス
クリーニングシステムに指令するプログラムを含む。機械読み取り可能な記憶媒
体の好ましい実施の態様は、細胞スクリーニングシステムが図9、11、12、
13、14、15または28に記載された手順を実行するようにさせる指令の組
よりなるプログラムを含む。もう1つの好ましい実施の態様は、細胞スクリーニ
ングシステムが特異的細胞構成要素の分布及び活性ならびにプロセスを検出する
ための手順を実行させるような指令の組よりなるプログラムを含む。最も好まし
い実施の態様において、細胞プロセスは、限定されるものではないが、蛋白質の
核移動、細胞肥大、アポトーシス、膜貫通受容体の内部化、及び蛋白質のプロテ
アーゼ−誘導移動を含む。
る本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきものではない。
a Chemical(St.Louis,MO),Molecular Pr
obes(Eugene,OR),Aldrich Chemical Com
pany(Milwaukee,WI),Accurate Chemical
Company(Westbury,NY),Jackson Immuno
labs,and Clontech(Palo Alto,CA)のように入
手源から商業的に入手可能である。
ニング いくつかの遺伝子の転写の調節は細胞質中の転写因子の活性化を含み、その結
果、その因子は核に輸送され、そこでそれは特定の遺伝子または複数遺伝子の転
写を開始することができる。転写因子分布のこの変化は、特定の遺伝子または遺
伝子の群の転写を阻害または誘導する化合物を検出するための細胞ベースのスク
リーニングシステム用のスクリーニングの基礎である。スクリーニングの一般的
記載に続いて具体的実施例をあげる。
フォアで核を標識し、特異的蛍光抗体で転写因子を標識することによって測定さ
れる。Hoechst標識核に対するオートフォーカシングの後、20×倍率で
細胞ベーススクリーニングシステムにて核のイメージが獲得され、前記したよう
に、これを用いて、いくつかの任意の閾値決定方法のうちの1つによってマスク
を作成する。該マスクによって規定された領域の形態学的記述子を使用者が規定
したパラメータを比較し、有効な核マスクが同定され、転写因子分布を抽出する
ための以下のアルゴリズムで用いる。各有効な核マスクを侵食させてわずかによ
り小さな核領域を規定する。次いで、元の核マスクを2工程で膨張させて核のま
わりのリング形状の領域を規定し、これは細胞質領域を表す。これらの2つの領
域の各々における平均抗体蛍光を測定し、これらの平均間の差異をNucCyt
差異と定義する。核移動を測定する2つの例は後に議論し、図10A−Jに示す
。図10Aは青色フルオロフォアで標識されたその核200及び緑色フルオロフ
ォアで標識された細胞質201を持つ未刺激細胞を示す。図10Bは細胞ベース
のスクリーニングシステムによって誘導された核マスク202を示す。図10C
は緑色波長でイメージした未刺激細胞の細胞質203を示す。図10Dは、核マ
スク202が一旦侵食(還元)されて、最小細胞質分布を持つ核サンプリング領
域204を規定することを示す。核境界202を数回膨張(拡大)して2−3画
素幅であるリングを形成させ、これを用いて同一細胞につき細胞質サンプリング
領域205を規定する。図10Eは、さらに、核サンプリング領域204及び細
胞質サンプリング領域205を示す側面図を例示する。これらの2つのサンプリ
ング領域を用い、細胞間ベースに基づく細胞ベースのスクリーニングシステムに
よって核移動に関するデータを自動的に分析することができる。図10F−Jは
刺激された細胞における核移動を示す戦略を示す。図10Fは青色フルオロフォ
アで標識したその核206及び緑色フルオロフォアで標識した細胞質207中の
転写因子を持つ刺激細胞を示す。図10G中の核マスク208は細胞ベースのス
クリーニングシステムによって誘導される。図10Hは緑色波長でイメージされ
た刺激細胞の細胞質209を示す。図10Iは刺激細胞の核サンプリング領域2
11及び細胞質サンプリング領域212を示す。図10Jは、さらに、核サンプ
リング領域211及び細胞質サンプリング領域212を示す側面図を例示する。
いられた。ヒト細胞系を96ウェルマイクロタイタープレートで平板培養した。
ウェルのいくつかの列をアゴニスト(特異的核転写因子の公知のインデューサー
)で力価測定した。次いで、転写因子及びHoechst33423に対するフ
ルオレセイン標識抗体での標準的な方法によって細胞を固定し染色した。細胞ベ
ースのスクリーニングシステムを用いてこのプレートからのイメージを獲得し分
析し、図16に示すように、NucCyt差異はウェルに添加されたアゴニスト
の量と強く相関することが判明した。第2の実験において、アゴニストについて
の受容体に対するアンタゴニストをアゴニストの存在下で力価測定し、転写因子
のアゴニスト−誘導移動が徐々に阻害された。図17に示すように、NucCy
t差異は移動のこの阻害と強く相関することが判明した。
って一致した結果を与え、従って、これは特異的核移動活性につき化合物ライブ
ラリをスクリーニングするのに日常的に使用できることを示した。さらに、同方
法は生細胞及び固定細胞において他の転写因子またはGFP−転写因子キメラに
対する抗体で用いて、この及び他の遺伝子の転写の調節に対する効果をスクリー
ニングすることができる。
ある。グラフ1 180は核サンプリング領域及び細胞質サンプリング領域にお
ける平均抗体蛍光間の差異をプロットする(NucCyt差異−対−ウェル#)
。グラフ2 181は核サンプリング領域における抗体の平均蛍光をプロットす
る(NP1平均−対−ウェル#)。グラフ3 182は細胞質サンプリング領域
における平均抗体蛍光をプロットする(LIP1平均−対−ウェル#)。当該ソ
フトウェアは各細胞からのデータの表示を可能とする。例えば、図18は細胞#
26についてのスクリーンディスプレイ183、核イメージ184及び蛍光抗体
イメージ185を示す。
(蛍光レポータ分子)強度及び平均核プローブ(蛍光レポータ分子)強度の間の
差異である。図18のグラフ2 181で言及したNP1平均は核サンプリング
領域内の細胞質プローブ(蛍光レポータ分子)強度の平均である。図18のグラ
フ3 182で言及したLiP1平均は細胞質サンプリング領域内の平均プロー
ブ(蛍光レポータ分子)強度である。
ニング 心臓筋細胞における肥大は遺伝子発現における改変のカスケードに関連付けら
れ、細胞サイズの改変によって細胞培養で特徴付けることができ、これはカバー
グラス上で増殖する接着性細胞で明瞭に目に見える。スクリーンは以下の戦略を
用いて実行される。96ウェルプレートで培養した筋細胞系QM7(ウズラ筋肉
クローン7;ATCC CRL−1962)を種々の化合物で処理し、次いで、
固定し、細胞表面マーカーに対する蛍光抗体及びHoechstのようなDNA
標識で標識することができる。Hoechst標識核につき焦点合わせした後、
2つのイメージを獲得する(Hoechst標識核の1つ及び蛍光抗体の1つ)
。マスクを作成するために閾値決定し、次いで、マスクの形態学的記述子を使用
者が規定した記述子値と比較することによって核を同定する。次いで、蛍光抗体
イメージ中の同一領域についての局所動的市来操作によって、それらの領域にお
ける細胞の限界を規定する。侵食及び膨張の手順を用いて、わずかに触れる細胞
を分離し、形態学的記述子の第2の組みを用いて、単一細胞を同定する。個々の
細胞の領域を表化して、正常及び肥大細胞からのサイズデータとの比較のために
細胞サイズの分布を規定する。加えて、主要筋肉蛋白質アクチンまたはミオシン
のような特定の細胞蛋白質に対する第2の蛍光抗体を含ませることができる。第
2の抗体のイメージを獲得し、後のレビューのために、前記イメージに関して記
憶して、肥大細胞におけるこれらの蛋白質の分布の類似性を同定するか、あるい
はアルゴリズムを開発して、これらのイメージにおける標識蛋白質の分布を自動
的に解析する。
蛋白質とのその相互作用を介して細胞外環境からの信号を細胞質に伝達する7つ
の膜貫通ドメイン細胞表面受容体の大きなクラスである。リガンド結合によるこ
れらの受容体の活性化は関連G−蛋白質についてのGTPに代えてのGDPの交
換を促進し、その結果、G−蛋白質が活性なCα−GTP及びGβγサブユニッ
トに解離する。これらのサブユニットとそのエフェクターとの相互作用は、環状
AMP(cAMP)及びイノシトール三リン酸(IP3)の生産、CA++動員
、及び種々のキナーゼの活性化のような細胞中の二次信号のカスケードを刺激す
る。限定するものではないが、匂い、味、光の認識、血圧の制御、神経伝達、内
分泌及び外分泌機能、走化性、エキソサイトーシス、胚形成、発生、細胞増殖及
び分化、及び癌形成を含めた広い範囲の生物学的機能がGPCRsと関連づけら
れる。従って、GPCRsは種々の治療ユニットのための主要な潜在的標的とな
った。
ムへの比較的遅い速度のエキソサイトーシスを受ける。メカニズム的にはあまり
よく理解できないが、アゴニストの存在が受容体内部化の速度を劇的に増加させ
ることが知られている。エンドソームに一旦内部化されれば、GPCRsは原形
質膜にリサイクルして戻されるか、あるいは分解のためにリソソームに標的化さ
れる。GPCRsの隔離の重要性は未だ十分には理解されていない。受容体内部
化は、継続した刺激の存在下で二次メッセンジャーを生じる受容体の能力の減少
として示される脱感作(機能的応答の喪失)で役割を演じるらしい。しかしなが
ら、表面からの受容体の喪失の速度は通常はあまりにも遅くて脱感作の迅速な速
度を説明できない(Tobin,A.B.ら,(1992)Mol.Pharm
acol.42:1042−1048)、及び2つのプロセスがカップリングさ
れていないことが示されている例がある(Baumgold,J.ら,(198
9)Neuropharmacology 28:1253−1261;Kan
be,S.ら,(1990)Biochem.Pharmacol.40:10
05−1014)。
生じる細胞の能力の再確立)に関与できるらしい。β2−アドレナリン作動性受
容体(β2−AR)につき、隔離欠損突然変異体ならびに隔離をブロックする剤
で処理した受容体は再感作しないことが示されている(Yu,S.S.ら(19
93)J.Biol.Chem.268(1):337−341;Barak,
L.S.ら(1994)J.Biol.Chem.269(4):2790−2
795)。β2ARについては、アゴニスト刺激の結果、プロテインキナーゼA
及びβ2−アドレナリン作動性受容体キナーゼ(β−ARK)による受容体リン
酸化がもたらされる。従って、受容体に対するβ−アレスチンの漸増及び結合の
結果としてそのG−蛋白質からの受容体の未カップリングがあり、クラスリン−
コートしたピットを介する受容体の内部化が開始される。酸性エンドソームpH
はホスファターゼの活性に好都合であり、かくして、受容体の脱リン酸化を増強
し(Krueger,K.M.ら,(1997)J.Biol.Chem.27
2(1):5−8)、及び原形質膜へリサイクルするのに利用できる受容体をG
−蛋白質と再会合させる。しかしながら、M4ムスカリン作動性受容体のような
他の受容体の再感作はエンドサイトーシスによって支援されることが示されてい
る(Bogatekewitsch,G.S.ら(1996)Mol.Phar
macol.50:424−429)。受容体内部化の機能的重要性が受容体ク
ラスの間で変化し得るという事実にもかかわらず、内部化が受容体の活性化及び
機能の経路において重要な工程であることは依然として明らかである。
ニングのための重要な標的とする。GPCR−リガンド相互作用及び受容体内部
化をモニターする当該分野の技術水準は、単一事象(例えば、受容体−リガンド
相互作用または原形質膜からの受容体の喪失)の測定に限定される。現在の手法
は、全細胞または単離された膜画分への(通常は放射能標識された)標識リガン
ドの結合(WO/97/04214;von Zastrow及びKobilk
a,J.Biol.Chem.269:18448−18452(1994);
Kochら,J.Biol.Chem.273:13652−13657(19
98);Tiberiら,J.Biol.Chem.271:3771−377
8(1996))、遠心を介して解像された細胞下画分への種々のマーカと共に
受容体の同時移動(Seiboldら、J.Biol.Chem.273:76
37−7642(1998);Stefanら,Mol.Biol.Cell.
9:885−899(1998))、固定細胞における受容体への蛍光標識リガ
ンドの結合の可視化(Tarasovaら、J.Biol.Chem.272:
14817−14824(1997))、受容体を同定するための(直接的また
はエピトープタグへの)抗体標識(von Zastrow及びKobilka
,J.Biol.Chem.269:18448−18452(1994);S
egredoら,(1997)J.Neurochem.68:2395−24
04;Kruegerら,(1997)J.Biol.Chem.272(1)
:5−8;Tiberiら,(1996)J.Biol.Chem.271(7
):3771−3778))の測定を含む。より最近では、緑色蛍光蛋白質(G
FP)−受容体融合が用いられており、これは生細胞におけるGPCR受容体ト
ラフィッキングの可視化を可能とする(Kallal,L.ら,(1998)J
.Biol.Chem.273(1):322−328;Tarasova,N
.I.ら,(1997)J.Biol.Chem.272(23):14817
−14824)。しかしながら、これは、三次元情報を得て、受容体が内部化さ
れるか、あるいは原形質膜の面中に単に移動したかを区別するのに共焦点イメー
ジングを必要とする。GPCR、それらのリガンド、及びそれらの活性を変調す
る化合物の同定用の方法も開示されている(WO98/13353及びWO97
/48820)。しかしながら、これらの方法は、受容体へのリガンドの結合及
びレポータ遺伝子の活性化によって間接的にG−蛋白質活性化を検出する。いず
れの方法も受容体を直接標識したり、あるいは受容体活性化の表示として受容体
の内部化を直接測定しない。
容体活性化の尺度として高い空間的及び時間的分解能を持ってリガンド−誘導受
容体内部化を直接的に測定する方法に対する要求が当該分野に依然としてある。
で記載するが、これは適当な自動化及びスループットをもって単一工程での受容
体内部化の測定を可能とする。このアプローチは、GPCRの蛍光標識及び刺激
細胞でのGPCR内部化の自動測定を含む。本明細書に記載する別の新規アプロ
ーチは、細胞内ドメインを特異的に標識するための受容体のカルボキシル末端の
GFPまたはルシフェラーゼのような分子ベースのクロモフォアに加えて、その
細胞外ドメインを区別して標識するための受容体のアミノ末端に特異的な標識を
含む二重標識受容体を含む。かかるキメラ蛋白質−発現DNA構築体の構築のた
めの方法は当該分野においてよく知られている(Molecular Clon
ing:A Laboratory Manual(Sambrookら198
9,Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s),Gene Expression Technology(Method
s in Enzymology,Vol.185,D.Goeddel編,1
991.Academic Press,San Diego,CA);PCR Protocols:A Guide to Methods and Ap
plications (Innisら1990 Academic Pres
s, San Diego,CA);Gene Transfer and E
xpression Protocols,pp.109−128,E.J.M
urray編,The Humana Press Inc.,Clifton
,N.J.)。
体のアミノ末端は標識するために利用できるに過ぎないが、他方受容体は原形質
膜に挿入されるので、未浸透化細胞における2つの標識の比率を用いて受容体の
内部化の程度を測定することができる。現在、膜受容体の外部及び内部ドメイン
の相対的細胞外利用性を同時に測定する既知の技術はない。
いて、生細胞は正常もしくは形質転換細胞の連続系から得られ、あるいは動物か
ら直接的に得られた初代正常もしくは形質転換細胞から得られる。受容体が機能
を保持するように、そのアミノもしくはカルボキシル末端においてまたは内部に
おいて分子ベースのクロモフォアに融合した注目GPCRを発現するDNA構築
体(プラスミドまたはウイルスベースのいずれか)で適当な細胞を一過的または
安定して形質移入することができる。有用な分子ベースのクロモフォアの例は、
限定されるものではないが、GFP及びその種々の突然変異体のいずれかを含む
(Heim及びTsien(1996)Current Biology 6:
178−182;Zhangら(1996)Biochem.Biophys.
Res.Comm.227:707−711)。加えて、ルシフェラーゼ及びそ
の突然変異体のいずれも使用することができるであろう。これは新規な標識技術
であろう。と言うのは、現在までのこの分子ベースのクロモフォアの使用の例は
遺伝子活性の受容体Yangら,(1998)J.Biol.Chem.273
(17):10763−10770;Pengら,(1998)J.Biol.
Chem.273(27):17286−17295;Baldariら,(1
998)Biologicals 26(1):1−5))及びバイオセンサの
構築(Campbell及びPatel(1983)Biochem.J.21
6:185−194;Sala−Newby及びCampbell(1992)
FEBS Lett.307:241−244;Jenkinsら,(1990
)Biochem.Soc.Trans.18:463−464としての使用を
含むが、特定の蛋白質標的をマークするためのキメラとしての使用は含まないか
らである。GPCR−発光蛋白質融合の発現は構成的(限定されるものではなが
CMV、SV40、RSV、アクチン、EFを含めた種々のプロモーターのうち
のいずれかによって駆動)であるかまたは誘導性であり得る(限定されるもので
はないが、テトラサイクリン、エクジソン、ステロイド−反応性を含めた多数の
誘導性プロモータのいずれかによって駆動)。
Rを発現するDNA構築体(プラスミドまたはウイルスベースのいずれか)で一
過的または安定して形質移入される。エピトープタグは、受容体が依然として機
能的であるようにアミノもしくはカルボキシル末端、または内部に融合させるこ
とができるか、あるいは別法として、GPCRは2つの区別されるエピトープタ
グで標識することができ、1つはGPCRの各端部に融合される。エピトープタ
グのいくつかの例は、限定されるものではないが、FLAG(Sigma Ch
emical,St.Louis,MO)、myc(9E10)(Invitr
ogen,Carlsbad,CA),6−His(Invitrogen;N
ovagen,Madison,WI)、及びHA(Boehringer M
anheim Biochemicals)を含む。GPCR融合の発現は構成
的または誘導的であり得る。
びそのカルボキシル末端の分子ベースクロモフォアに融合した注目GPCRを発
現するDNA構築体(プラスミドまたはウイルスベースのいずれか)で一過的ま
たは安定して形質移入される。別法として、GPCRはそのカルボキシル末端の
エピトープタグ及びそのアミノ末端の分子ベースのクロモフォアに融合させるこ
とができる。GPCR融合の発現は構成的または誘導性であるあり得る。
レイは96、384、1536またはそれ以上の個々のウェルを含む複数ウェル
プレートであり得る。該細胞はCellChipTM System(米国特許
出願番号第08,865,341号)を用いて「実質的ウェル」のマイクロアレ
イに配置することもできる。これらのマイクロアレイは同一の細胞タイプであり
得るが、区別される化合物の組合せで処理されるか、別法として、該マイクロア
レイは1以上の化合物で処理した細胞タイプの組合せであり得る。
れらを薬物またはリガンドの溶液で処理して受容体内部化を阻害または刺激する
。流体配送システムが手動、ロボット、またはCellChip System
のマイクロ流体(米国特許出願番号第08,865,341号)であり得る。適
当なインキュベーション時間後に、化学架橋剤で固定し、発光ベースの試薬で染
色する。これらの試薬は、限定されるものではないが、GPCRと反応する蛍光
標識一次または二次抗体、エピトープタグ、またはGPCRの内部化で補正する
ように決定された他の細胞抗原を含む。発光染色、色素及び他の小分子を用いて
薬物に対する細胞の生理学的応答を測定することもできる。これらの試薬を用い
て、薬物によって誘導されたイオン、代謝産物、マクロ分子及びオルガネラの時
間的及び空間的変化を測定する。細胞生理学のマクロ分子ベースのインジケータ
をアッセイで用いることもできる。
で処理し、生理学的応答を、適当なインキュベーション期間後に、単一の生細胞
の集団内で時間的及び空間的に測定する。発光染色、色素及び他の小分子を用い
て、薬物に対する生細胞の生理学的応答を測定することができる。(GFP及び
その突然変異体のような)細胞それ自体によって発現された分子ベースのクロモ
フォアが生細胞測定に対して特に適する。これらの試薬を用いて薬物によって誘
導されたイオン、代謝産物、マクロ分子及びオルガネラの時間的及び空間的分子
内変化を測定することができる。また、細胞生理学のマクロ分子ベースのインジ
ケータをアッセイで用いることもできる。これらの発光アナログ及びバイオセン
サを用いて、薬物処理に応答しての、蛋白質、DNA、RNA、脂質及び炭水化
物のようなマクロ分子の分布及び活性の時間的及び空間的変化を測定することが
できる。
し、リガンドの運命は高内容スクリーニングのパラメータとして以下のようであ
る。
チャンネルを用いることによって異なるGPCRを同一細胞中で分析できるよう
に、細胞は1を超える区別されて標識された受容体を含有することができる。同
様に、ウェルまたはマイクロアレイは細胞の混合集団を含有することができ、各
集団はスペクトル的に区別されるフルオロフォアで標識された異なる受容体を含
有する。これらの実施例において異なる受容体の蛍光のチャンネルを区別するこ
とができる、本発明の細胞スクリーニングシステムのような細胞スクリーニング
システムを利用することによって単一ランで異なる受容体に対する薬物の効果を
測定するのが可能である。このようにして、複数受容体タイプに影響する化合物
につき、あるいは逆に1の受容体タイプには影響するが他のタイプには影響しな
い化合物につきスクリーニングすることができる。
を適用できるのは当該分野においては明白であろう。GPCRsのいくつかの公
知の例はアドレナリン作動性受容体;ムスカリンアセチルコリン受容体;オピオ
イド受容体;ケモカイン受容体;神経ペプチド受容体;プロスタグランジン受容
体;上皮小体ホルモン受容体;コレシストキニン受容体;セレクチン受容体;ロ
ドプシン;ドーパミン受容体;セロトニン受容体;オドラント受容体;ヒスタミ
ン受容体;アンジオテンシン受容体;ガストリン受容体;小胞刺激ホルモン受容
体;黄体ホルモン受容体;メタボトロピックグルタメート受容体;グルカゴン受
容体である(公知のGPCRs及びそのリガンドのより完全なリストはBeck
−Sickinger,A.G(1996)Drug Discovery T
oday 1(12):502−513)に見出すことができる。本発明はGP
CRsに限定されず;本発明を適用し得る他の受容体の例はPDGF(Held
inら,(1982)J.Biol.Chem.257(8):4216−42
21;Kapellerら,(1993)Mol.Cell.Biol.13(
10):6052−6063)及びEGF(Zidovetzkiら,(198
1)Proc.Natl.Acad.Sci.78(11):6981−698
5;Beguinotら,(1984)Proc.Natl.Acad.Sci
.81(8):2384−2388;Emletら,(1997)J.Biol
.Chem.272(7):4079−4086)のような成長因子受容体、ト
ランスフェリン受容体(Klausnerら,(1983)J.Biol.Ch
em.258(8):4715−4724;Ciechanoverら,(19
83)J.Cell.Biochem.23(1−4):107−130)、及
びインスリン受容体(Baldwinら,(1980)Proc.Natl.A
cad.Sci.77(10):5975−5978;Di Guglielm
oら,(1998)Mol.Cell.Biochem.182(1−2):5
9−63)を含む。本発明は特異的リガンド及び/またはエフェクターがそれに
つき知られていないみなし児受容体に適用することができる。
れるG−蛋白質がカップリングした受容体(GPCR)の活性化についてのスク
リーニングである。この実施例は、細胞ベースのスクリーニングについての二重
モードシステムで高スループットスクリーニングがいかにして高内容スクリーニ
ングとカップリングできるかを説明する。
光蛋白質(BFP)とのGPCRの安定なキメラを運ぶ細胞にFluo−3のア
セトキシメチルエステル形、該エステルの加水分解により生細胞に捕獲される細
胞浸透性カルシウムインジケータ(緑色蛍光)を負荷した。次いで、それらをマ
イクロタイタープレート601のウェルに沈積させる。次いで、流体デリバリシ
ステム、及びそのマイクロタイタープレートがカルシウム応答を呈するウェルに
つき獲得及び分析されるFluo−3イメージの短い配列を用いてウェルをテス
ト化合物のアレイで処理する(すなわち、高スループットモード)。イメージは
図19のマイクロタイタープレート601の説明と似ている。該説明におけるウ
ェルC4及びE9のような少数のウェルは、受容体の刺激に際して放出されるC
a++のため、より鮮明に蛍光を発するであろう。応答602を誘導した化合物
を含有したウェルの位置を、HCSプログラムまで移動させ、核周辺領域へのG
PCR移動の証拠のための青色蛍光の細胞分析によって詳細な細胞につき光学系
をスイッチする。図19の底は高分解能細胞データの分析の2つの可能な結果を
示す。カメラはウェル領域603の小区画604をイメージし、蛍光細胞605
のイメージを生じさせる。ウェルC4において、細胞中での蛍光の均一な分布は
、受容体が内部化されなかったことを示し、これは観察されたCa++応答が細
胞中のいくつかの他のシグナリング系の刺激の結果であったことを意味する。他
方、ウェルE9 606中の細胞は、核周辺領域における受容体の濃縮を明瞭に
示し、これは受容体の十分な活性化を明瞭に示す。少数のヒットウェルを高分解
能で分析しなければならなかったに過ぎないので、二重モードシステムの全スル
ープットはかなり高く、高スループットシステム単独と匹敵し得る。
ECH,Palo Alto,CA)についてのコーディング配列を含有する真
核生物発現プラスミドを用いてGFP−ヒト上皮小体ホルモン受容体(PTHR
,GenBank#L04308)キメラを得た。
TCC NO.CRL−1573)を形質移入した。GFP−PTHRキメラを
安定に発現するクローン系は、ネオマイシンアナログGeneticin(ゲネ
チシン)(0.5mg/ml;Life Technologies,Gait
hersburg,MD)での抗生物質選択によって確立された。細胞を調製し
、25mM緩衝液(炭酸水素ナトリウム無し)、10%ウシ胎児血清(FCS)
、ペニシリン.ストレプトアビジン(PS)、及び2mM L−グルタミンを含
有するDMEM/F12培地(Life Technologies)中で平板
培養する。ウェル当たり200ulの容量にて96−ウェルマイクロタイタープ
レート中、ウェル当たり4×104の密度にて細胞を平板培養する。室温にて細
胞をほぼ30分間沈積させ、次いで、プレートを37℃の湿潤化空気インキュベ
ーター中に入れる。
)を用い、ウシ上皮小体ホルモン(PTH)、アミノ酸1−34(Bachem
,King of Prussia,PA)の100μMストックを調製する。
GFP−PTHRキメラの内部化を誘導するために、500nM PTHの50
ulの各ウェルへの添加によって細胞を刺激する(DMEM/F12、10%F
CS、PS、2mM L−グルタメートに希釈)。この容量をウェル中に既にあ
る200ulに添加し、100nM PTHの最終濃度を得る。光からフルオロ
フォアを保護するためにアルミニウムホイルで被覆しつつ、プレートを室温で2
時間インキュベートする。2時間のPTH刺激に続き、培地をプレートからデカ
ントし、細胞を固定し、3.7%ホルマリン(Sigma)及び1ug/ml Hoechst 33342(Molecular Probes,Eugen
e,Oregon)を含有する200ulのハンクスの平衡塩溶液(HBSS)
の添加によって核を染色する。室温での10分間のインキュベーション後、溶液
をプレートからデカントし、200ul/ウェルのHBSSの添加によって細胞
を洗浄し、プレートを新鮮なHBSS(200ul/ウェル)で分析し/記憶す
る。
核についての応答フォーカシング101(図27)後に、核102のイメージを
20×倍率で獲得する。使用者によって選択されるか、あるいは使用者がそれか
ら選択される2つの他の方法のうちの1つによって得られた(イソデータアルゴ
リズムまたはピーク内挿)閾値を用い、核イメージを閾値決定103によって細
分化する。次いで、イメージ中の全ての核の画素における全面積を単一合計10
4として計算する。次いで、GFP蛍光のイメージを20×倍率で獲得する10
5(図26)。このようにしてイメージしたプレートの面積は視野と呼ばれる。
該イメージは、有効な対象を後に検出するのに使用される閾値よりも高いユーザ
選択強度値における閾値とする。得られたイメージで検出された全ての対象を標
識し、そのサイズ(画素の数)を測定する。ユーザ特殊化サイズよりも大きいい
ずれの物体も人工物として処理する。全てのかかる物体をコピーし、新しいブラ
ンクのイメージ、人工物イメージに移す。人工物イメージをわずかに膨張させて
、人工物が完全に欠失することを確実とする。次いで、人工物イメージを元のG
FPイメージから差し引いて、中間イメージを得る。
ットトランスフォーム107に付す(図26)。このトランスフォームは、(a
)灰色スケール侵食(その隣における最小値による各画素値の置き換え)、(b
)バックグラウンドイメージを生じる、(a)と同一サイズ近隣にての灰色スケ
ール膨張(その隣における最大値による各画素値の置き換え)、及び(c)小さ
な鮮やかなスポットを含む対象イメージを生じさせるための、元のインプットイ
メージからの得られたバックグラウンドイメージの差し引きよりなる。前記工程
(a)及び(b)で使用される近隣のサイズを、イメージ中の全ての注目対象よ
りもわずかに大きくなるように選択される。その結果、侵食(a)及び膨張(b
)後に全てのかかる対照はバックグラウンドイメージから存在しない。しかしな
がら、元のイメージのバックグラウンドにおける少しずつの変動はバックグラウ
ンドイメージに保持される。従って、差し引き工程(c)はバックグラウンドに
おけるこれらの変動を対象イメージから除去する。
容体を表すかを決定する。このプロセスは、使用者によって設定された輝度閾値
及び最小サイズを使用する。対象イメージは輝度閾値で閾値決定して、バイナリ
対象マスク108を得る(図26)。バイナリ対象マスクにおける対象を標識し
、それらのサイズを画素中である。最小サイズに適合するまたはそれを超える対
照は有効なスポット109であり;(図28)残りは無視する。
ットのカウントを増大させる110。画素の数は先にカウントした。各有効なス
ポットについては、その標識を持つ領域をバイナリ対象マスクから抽出して、単
一−スポットのバイナリマスクを得る。単一−スポットのバイナリマスクを元の
対象イメージに適用して、各スポットの灰色スケールスポットイメージを得る。
灰色スケールスポットイメージ中の画素の強度を合計して、スポット111の総
強度を得る。いったん全てのスポットが処理されれば、有効なスポットの面積の
全てを合計して、視野112につき総スポット面積を得る。スポットの総強度を
合わせて、視野の総スポット強度を得る。視野(またはウェル)に対する最終ス
コアから選択するいくつかの統計量がある:(a)有効スポットの数;(b)有
効スポットの総面積;(c)有効スポットの総強度;(d)有効スポットの総強
度を核の全面積で割ったもの。1を超える視野を各ウェル内で分析する場合、ウ
ェルの全ての視野についての値をいっしょに平均して、ウェル113についての
総統計量(図26)を得る。
間で見出された差異を説明する。未刺激細胞の核をDNA−特異的Hoechs
t染料で標識し、近−UV蛍光フィルタセットでイメージする。同細胞を青色蛍
光フィルタセットでイメージし、これはGFP蛍光の分布を示す。核−標識イメ
ージに閾値を適用することによって核マスクを誘導し、GFPイメージの灰色ス
ケール侵食及び膨張によってバックグラウンドイメージを誘導し、これはバック
グラウンド強度の変動を示す。次いで、GFPイメージからバックグラウンドイ
メージを差し引くことによって対象イメージを誘導し、かすかなスポットが得ら
れる。次いで、対象イメージに閾値を適用することによって対象マスクが誘導さ
れる。閾値決定によっていくつかのかすかなスポットが排除される。いくつかの
他のものは有効スポットに対する要件よりも閾値上でより少数の画素を有する。
その結果、未刺激細胞のイメージにおいては非常に少数の有効スポットしか見出
されない。スポットカウント、総スポット面積、及び総スポット輝度は全て低い
値を有する。
標識し、これまでの実施例におけるようにイメージする。自動閾値決定法によっ
て核マスクが誘導され、GFPイメージの灰色スケール侵食及び膨張によってバ
ックグラウンドイメージが誘導され、これはバックグラウンド強度の変動を示す
。GFPイメージからバックグラウンドイメージを差し引くことによって対象イ
メージが誘導され、その結果鮮やかなスポットが得られる。対象イメージに閾値
を適用することによって対象マスクが誘導される。対象マスクで多くのスポット
が観察され、スポットの多くは有効スポットに対する要件に適合する閾値を超え
る十分な画素を有する。スポットカウント、総スポット面積、及び総スポット輝
度は全て高い値を有する。これらの実施例と同様の実験からの結果が図25で先
に示された。
リーンの代表的なディスプレイを示す。各データ点は、ウェルの視野のスポット
カウントを一緒に合計することによって計算された、プレートの単一ウェルのス
ポットカウントを表す。グラフ300は個々の曲線を示し、各々は96ウェルプ
レートの単一列を表す。各曲線の最も左の6つの点は未処理細胞のスポットカウ
ントを表し、他方、最も右の6つの点は処理細胞を表す。スポットカウント特徴
(図中「objカウント」)はリスト302を用いて選択することができる。全
ての列に対する数値をスプレッドシートフォーマット303に示す。グラフ30
0及びスプレッドシート303は印刷することができ、スプレッドシートはMi
crosoft ExcelTM のようなスプレッドシートプログラムへの入
力のためにコンマ−分離フォーマットで送り出すことができる。
0)。頂部304、305及び306における各グラフを計算した統計量のうち
のいずれか1つ(ウェルの視野にわたる平均)対ウェル数をプロットするように
設定することができる。スプレッドシート307は視野間ベースで計算された数
値データを示す。スプレッドシートからのラインの選択は、対応するHoech
st308及びGFP309イメージの表示が成されるようにする。スプレッド
シート305はMicrosoft ExcelTMのようなスプレッドシート
プログラムへの入力のためにASCIIファイルフォーマットで印刷するかまた
は送り出すことができる。
は入力GFPイメージで検出された有効スポットの数である。本発明は、カメラ
からのデジタル信号をこのパラメータに変換するために、及びパラメータ対−ウ
ェル数をプロットするためのコンピュータ手段を提供する。
示す。総スポット面積は入力GFPイメージで検出された全ての有効スポットの
合計面積である。本発明は、カメラからのデジタル信号をこのパラメータに変換
するために、及びこのパラメータ対ウェル数をプロットするためのコンピュータ
手段を提供する。
」)を示す。正規化スポット強度比率は入力GFPイメージで検出された有効ス
ポットにおける全ての画素の合計強度を、対応するHoechstイメージにお
ける核マスク中の画素の合計数で割ったものである。本発明は、カメラからのデ
ジタル信号をこのパラメータに変換するための、及びパラメータ対−ウェル数を
プロットするためのコンピュータ手段を提供する。
である。該図面は、最小(「最小応答」=未刺激)及び最大(「最大応答」=刺
激)についてのデータが異なるプレート間で一致することを示し(差は統計的に
有意ではない)、一致し許容される範囲内のc.o.v.(分散計数)を与える
。
た。ウェルの視野を横切ってスポットカウントを合計し、同様に処理されたウェ
ル間で平均した。プレートの未処理の半分はプレートの未処理半分の69.3±
17.7(平均±標準偏差)倍のスポットカウントを有し、26%の分散計数(
COV、標準偏差を平均で割ったもの)を与えた。プレートの処理半分の視野か
らの値は404.2±41.2のスポットカウントを有し、(10%)のCOV
を与えた。処理半分の平均スポットカウントは未処理半分の平均スポットカウン
トの5.83倍であった。
ストまたはアンタゴニストとしての化合物の能力を定義するには十分ではないで
あろう。もう1つの実施の態様において、細胞を薬物で処理し、薬物処理に続い
て種々の時点でデータを収集して、受容体内部化の動態を定量する。これらの動
的アッセイは前記したように生細胞で行うことができるか、あるいは薬物処理に
続いて細胞の異なるウェルを種々の注目時点の各々において固定することができ
る。いずれの場合においても、前記した試薬及び方法を用いて細胞を標識するこ
とができる。かかる動的測定は測定の間の能力についての情報を提供するのみな
らず、かなり長い時間に対するデータの外挿を可能とするであろう。
スループットまたは超高スループットモードで蛍光の1つのチャンネルで成され
る。この応答は内部化プロセスそれ自体よりも受容体特異的ではなく、それは限
定されるものではないがCa2+、cAMP、またはIP3濃度の変化、または
種々のキナーゼのうちのいずれかの活性化を含むことができる。次いで、このパ
ラメータからの所望の出力を呈するウェルを、細胞間ベースでかなり詳細な時間
的及び空間的情報につきHCSモードで分析する。
、生細胞または固定細胞の発光信号を分析する。
びそれらのリガンド もう1つの実施の態様において、各端部に融合した特異的ペプチド配列を含有
するように膜受容体を修飾して、細胞外及び細胞内ドメインを区別可能に標識す
る。2つの標識の蛍光強度の比率は未処理及び処理細胞において得られる;とい
うのは、受容体のアミノ末端は標識のために利用できるに過ぎず、他方受容体は
原形質膜に挿入され、未浸透細胞における2つの標識を用いて受容体の内部化の
程度を測定することができるからである。現在、膜受容体の外部及び内部ドメイ
ンの相対的細胞外利用性を同時に測定するための知られた技術はない。
分子ベースのクロモフォアに融合した注目GPCRを発現するDNA構築体(プ
ラスミドまたはウイルスベースいずれか)で一過的にまたは安定に形質移入され
る。別法として、GPCRはそのカルボキシル末端のエピトープ及びそのアミノ
末端の分子ベースクロモフォアに融合させることができる。GPCR融合の発現
は構成的であるかまたは誘導的である。
igma,Chemical,St.,Louis,MO)、myc(9E10
)(Invitrogen,Carlsbad,CA)、6−His(Invi
trogen;Novagen,Madison,WI)、及びHA(Boeh
ringer Mannheim Biochemicals)を含む。GPC
R融合の発現は構成的であるかまたは誘導的であり得る。
FP及びその種々の突然変異体のいずれかを含む(Heim及びTsien(1
996)Current Biology 6:178−182;Zhangら
,(1996),Biochem.Biophys.Res.Comm.227
:707711)。加えて、ルシフェラーゼ及びそれらの突然変異体のいずれか
を用いることもできる。キメラ標的蛋白質の一部としてのルシフェラーゼの使用
は新規標識技術を含む。というのは、現在まで、この分子−ベースのクロモフォ
アの使用の例は遺伝子活性のレポーター(Yangら(1998)J.Biol
.Chem.273(17);10763−10770;Pengら,(199
8)J.Biol.Chem.273(27);17286−17295;Ba
ldariら,(1998)Biologicals 26(1):1−5)及
びバイオセンサの構築8Campbell及びPatel(1983)Bioc
hem.J.216:185−194;Sala−Newby及びCampbe
ll(1992)FEBS Lett.307:241−244;Jenkin
sら,(1990)Biochem.Soc.Trans.18:404)とし
ての使用を含むが、特定の蛋白質標的を作成するためのキメラとして使用含まな
いからである。膜蛋白質−発光蛋白質融合の発現は構成的(限定されるものでは
ないが、CMV、SV40、RSV、アクチン、EFを含めた種々のプロモータ
ーのいずれかにより駆動)または誘導的(限定されるものではないが、テトラサ
イクリン、エクジソン、ステロイド−応答性を含めた多数の誘導性プロモーター
のうちのいずれかにより駆動)であり得る。
端部に融合している)に融合した注目膜蛋白質を発現するDNA構築体(プラス
ミドまたはウイルスベースのいずれか)で一過的にまたは安定に形質移入される
。
ち、挿入された配列の外部利用可能性の比率は、受容体内部化の大きさの直接的
な尺度を提供する。これは二重−標識受容体を取り込む高内容スクリーニングで
ある。挿入された配列の外部利用可能性は、単一アプローチまたはいくつかのア
プローチの組合せを用いて測定することができる。
ピトープに対する抗体の結合は、組織化学、放射性、または蛍光方法を用いて測
定することができる。可能なエピトープは限定されるものではないが、表Iに示
されたものを含む。
存在するtrp.tyr及びpheの天然フルオロフォアに加えて、他の蛍光蛋
白質配列を挿入することができる。GFP配列またはその突然変異体のうちの1
つを、受容体をコードする配列に挿入することができる。ルシフェラーゼをコー
ドする配列及びその突然変異体も挿入することができる。フルオロフォアをコー
ドするまたはそれと相互作用するいずれのペプチド配列もこの方法で用いること
ができる。挿入された配列は、各々からの蛍光信号が独立して測定できるように
、異なる蛍光特性を持って蛍光蛋白質を発現するように構築することができる。
な(<1000 Mr)リガンドに結合するペプチドをコードすることができる
。従って、これらの小さな分子は発光または放射能標識することができる他の分
子またはマクロ分子に対して密接な架橋を形成する。挿入された配列は、各々か
らの信号が独立して測定できるように、区別して標識された分子またはマクロ分
子に結合する異なる架橋分子に結合するように構築することができる。例えば、
ペプチド配列−HHHHHH−は、多座酢酸部位(例えば、ニトリロ酢酸)とで
密接な架橋を形成するであろう金属イオン(例えば、Ni2+、Cu2+等)に
結合するであろう。該酸部位は、発光、放射能、または光吸収性である分子に共
有結合することができる。これらの分子は、発光または放射性標識を含有する蛋
白質のような発光染料またはマクロ分子であり得る。挿入されたペプチド配列の
他の例は、それらが、発光または放射能標識することができる他の分子またはマ
クロ分子に対して密な架橋を形成するステロイドホルモン、ビタミン及び炭水化
物を含む他の小さな分子に対して高い親和性を有するものである。
のGTCR)は、その局所化が原形質膜からの内部化の尺度を提供するヒト上皮
腎臓細胞(HEK 293)に形質移入される。修飾されたGPCRはN−末端
(細胞外)及びC−末端(細胞内)のGFP−分子を含有する。リガンド処理後
にGPCR内部化を測定するために、細胞をHoechst33342(DNA
−結合蛍光色素)及びエピトープタグに対する区別される発光標識抗体で固定し
標識する。比率イメージを用いる、本発明の細胞のスクリーニングシステムのよ
うな細胞スクリーニングシステムを用いて、原形質膜の外側からのGPCR−エ
ピトープの喪失及び細胞内のGFP−唯一−標識受容体の増加によりGPCRの
内部化を計算する。リガンド−誘導受容体内部化を測定するこのアプローチは内
部化メカニズムとは独立しており、従って、それは公知及び未知の機能の広い範
囲の受容体に適用することができる。
・グルココルチコイド受容体(hGR)、細胞の複雑な環境応答機械中の単一「
センサー」は、細胞中に拡散するステロイド分子に結合する。リガンド−受容体
複合体は核に移動し、そこで転写の活性化が起こる(Htunら,Proc.N
atl.Acad.Sci.93:4845,1996)。
端に存在するので優れた薬物標識である。従ってhGR移動の高内容スクリーニ
ングはインビトロでのリガンド−受容体結合アッセイよりも優れた区別される利
点を有する。本発明の細胞スクリーニング系における蛍光の2以上までのチャン
ネルの利用性は、該スクリーニングが、他の受容体、他の区別される標識または
他の細胞プロセスのような、2つのさらなるパラメータを平行して含むことを可
能とする。
P−hGR)キメラについてのコーディング配列を含有する真核生物発現プラス
ミドはGFP突然変異体を用いて調製した(Palmら,Nat.Struct
.Biol.4:361(1997))。該構築体を用いてヒト頸カルシノーマ
細胞系(HeLa)を形質移入した。
)をトリプシン処理し、トランスフェクションに12−24時間先立って、5%
木炭/ブキストラン−処理ウシ胎児血清(FBS)(HyClone)及び1%
ペニシリン−ストレプトマイシン(C−DMEM)を含有するDMEMを用いて
平板培養し、37℃及び5%CO2でインキューベートした。トランスフエクシ
ョンはリン酸カルシウム共沈殿(Graham及びVan der Eb,Vi
rology 52:456,1973;Sambrookら,(1989),
Molecular Cloning:A Laboratory Manua
l,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory
Press,Cold Spring Harbor,1989)またはリポフ
ェクタミン(Life Technologies,Gaithersburg
,MD)によって行った。リン酸カルシウム共沈殿では、トランスフェクション
に先立って、5%木炭/デキストラン−処理FBSを含有するDMEMで培地を
置き換えた。37℃及び5%CO2で4−5時間、細胞をリン酸カルシウム−D
NA沈殿と共にインキュベートし、DMEMで3−4回洗浄して沈殿を除去し、
続いて、C−DMEMを添加した。
chnologies,Gaithersburg,MD)に従って抗体なくし
て無血清DMEM中で行った。DNA−リポソーム複合体との2−3時間のイン
キュベーションに続き、培地を取り出し、C−DMEMで置き換えた。96−ウ
ェルマイクロタイタープレート中の全ての形質移入細胞を、薬物処理に先立って
、33℃及び5%CO2にて24−48時間インキュベートした。実験は、He
La細胞において一過的に発現させた受容体で行った。
るために、形質移入した細胞の核を、まず、33℃及び5%CO2においてC−
DMEM中で20分間、5μg/ml Hoechst 33342(Mole
cular Probes)で標識した。細胞をハンクスの平衡塩溶液(HBS
S)で1回洗浄し、続いて、1%木炭/デキストラン−処理FBSを含むHBS
S中の100nMデキサメタゾンを添加した。固定時点デキサメタゾン力価測定
データを得るために、形質移入したHeLa細胞を、まず、DMEMで洗浄し、
次いで、1%木炭/デキストラン−処理FBSを含有するDMEM中の0−10
00 nMデキサメタゾンの存在下で33℃及び5%CO2にて1時間インキュ
ベートした。細胞を生きたまま分析するか、またはそれらをHBSSですすぎ、
HBSS中の3.7%ホルムアルデヒドで15分間固定し、Hoechst33
342で染色し、分析前に洗浄した。細胞内GFP−hGR蛍光信号はこの固定
手法によって消失しなかった。
、生細胞の視野から蛍光イメージ対(GFP−hGR及びHoechst333
42−標識核)を獲得することによって動的データを収集した。同様に、デキサ
メタゾンの添加1時間後に、固定時点スクリーニングプレートの各ウェルからイ
メージを得た。両方の場合、各時点において得られたイメージ対を用いて、各ウ
ェル中で核及び細胞質領域を規定した。GFP−hGRの移動は、核におけるG
FP−hGRの積分した蛍光強度を、細胞質中の該キメラの積分した蛍光強度で
割ることによって、あるいはGFP蛍光の核−細胞質差異として計算した。固定
した時点のスクリーニングにおいて、この移動比率は、テストしたデキサメタゾ
ンの各濃度において少なくとも200細胞から得られたデータから計算した。従
って、細胞質から核へのGFP−hGRの薬物−誘導移動は移動比率の増加と相
関した。
から核252への移動を模式的に示す。該模式図の上方対は、デキサメタゾンで
の250(A)刺激前及びの251(B)刺激後における細胞内でのGFP−h
GRの局所化を示す。これらの実験条件下で、当該薬物は核中へ移動する細胞質
GFP−hGRの大きな割合を誘導する。この再分布は、処理255及び未処理
254細胞における細胞質及び核蛍光の積分強度比率を測定することによって定
量する。蛍光顕微鏡写真の下方の対は、処理前254及び後255における、単
一細胞中でのGFP−hGRの動的再分布を示す。該HCSは数百ないし数千の
形質移入された細胞を含有するウェルで行い、該移動は、GFP蛍光を呈する視
野中での各細胞につき定量する。安定に形質移入された細胞系の使用は最も首尾
一貫して標識細胞を生じるであろうが、一過性トランスフェクションによって誘
導されたGFP−hGR発現の不均一レベルは、本発明の細胞スクリーニングシ
ステムによる分析に干渉しなかった。
各ウェルを走査し、各々における細胞の集団をイメージし、個々に細胞を分析す
る。ここに、2つのチャンネルの蛍光を用いて、各細胞内でのGFP−hGRの
細胞質及び核分布を規定する。GFP−hGRスクリーンの端部近くの細胞スク
リーニングシステムのグラフ表示ユーザインターフェイスを図21に示す。ユー
ザインターフェイスは、当該システムの平行したデータ収集及び分析能力を示す
。ウインドウ標識「Nucleus」261及び「GFP−hGR」262 、
単一視野で得られ解析した蛍光イメージの対を示す。ウインドウ標識「Colo
r Overlay」260は、前記イメージを偽着色、それらを合体させるこ
とによって形成され、そこで、使用者は細胞変化をただちに同定することができ
る。「記録された対象領域」ウインドウ265内で、各分析された細胞及びその
隣接物を含有するイメージは記録されているのでそれが提示される。さらに、H
CSデータが収集されている時に、それは分析され、GFP−hGR移動の本ケ
ースでは、直後の「ヒット」応答に翻訳される。スクリーン267の下部ウイン
ドウに示された96ウェルプレートは、使用者が規定したスクリーン基準の組に
いずれのウェルが適合したかを示す。例えば、白色ウェル269は、薬物−誘導
移動が50%の所定の閾値を超えたことを示す。他方、黒色ウェル270は、テ
ストされる薬物が10%未満の移動を誘導したことを示す。灰色ウェル268は
、移動値が10%及び50%の間となる「ヒット」を示す。分析されるべき96
ウェルプレート266上の列「E」は、GFP−hGR移動を達成することが知
られている薬物であるデキサメタゾンでの力価測定を示す。この例のスクリーニ
ングは2つの蛍光チャンネルのみを用いた。2つのさらなるチャンネル(チャン
ネル3 263及び4 264)は、複数パラメータスクリーニングを生じさせ
るために、他の特異的標的、細胞プロセスまたは細胞毒性の平行した分析で利用
できる。
データベース及び上方データベースの間のリンクがある。スクリーニングの完了
の時点で、使用者はイメージ及び計算されたデータ全てにアクセスできる(図2
2)。細胞スクリーニングシステムの包括的なデータ解析パッケージは、使用者
が複数レベルでHCSデータを調査するのを可能とする。個々の細胞についての
スプレッドシート279におけるイメージ276及び詳細なデータは別々にレビ
ューすることができるか、あるいは要約データをプロットすることができる。例
えば、96ウェルプレート中の各細胞についての単一パラメータの計算結果はパ
ネル標識グラフ1 275に示す。該グラフ中で単一点を選択することによって
、使用者は、現存データベースから要求される特定の細胞についての全データ組
を表示することができる。ここでは、単一細胞(細胞#118、灰色の線277
)からのイメージ対276ならびに詳細な蛍光及び形態学的データを示す。大き
なグラフインサート278 は、GFP−hGRの移動に対するデキサメタゾン
濃度の結果を示す。各点は少なくとも200細胞からのデータの平均である。こ
のアッセイにおけるデキサメタゾンについての計算されたEC50は2nMであ
る。
及び形態的パラメータを用いる動的測定の能力である。時間的及び空間的測定は
視野中の細胞集団内の単一細胞に対して行うことができる。図23は単一視野内
のいくつかの細胞におけるGFP−hGRのデキサメタゾン−誘導移動について
の動的データを示す。GFP−hGRで形質移入したヒトHeLa細胞を100
nMデキサメタゾンで処理し、単一細胞の集団で経時的にGFP−hGRの移動
を測定した。当該グラフは形質移入された細胞285、286、287及び28
8ならびに非形質移入細胞289の応答を示す。また、これらのデータは異なる
発現レベルで細胞を分析する能力を示す。
ある。このプロセスに対する薬物作用のメカニズムを理解するためには、時間的
及び空間的分解能にて出来る限り多くの細胞内でのこれらの事象を測定するのが
必須である。生きた試料調製物をほとんど必要としないが、いくつかのアポトー
シス−関連パラメータの自動読みだしを供するアポトーシススクリーニングが理
想的であろう。細胞スクリーニングシステムにつき設計された細胞ベースのアッ
セイを用いて、パクリタキセル−誘導アポトーシスの形態学的、オルガネラ及び
マクロ分子のホールマークのいくつかが同時に定量されている。
9;ATCC CCL−1)及び高度に侵入的な神経膠腫細胞系(SNB−19
;ATCC CRL−2219)であった(Welchら,In Bitro Cell.Dev.Biol.31:610,1995)。アポトーシス誘導薬
物での処理の前日に、3500細胞を96−ウェルプレートの各ウェルに入れ、
湿潤化された5%CO2雰囲気中、37℃で一晩インキュベートした。翌日、培
養培地を各ウェルから取り出し、DMSO中で作成した20mMストックからの
パクリタキセル(0−50μM)の種々の濃度のものを含有する新鮮な培地で置
き換えた。これらの実験で用いたDMSOの最大濃度は0.25%であった。次
いで、細胞を前記したように26時間インキュベートした。パクリタキセル処理
時間の最後に、各ウェルに、750nM Mito Tracker Red(
Molecular Probes;Eugene,OR)及び3μg/ml
Hoechst33342 DNA−結合染料(Molecular Prob
es)を含有する新鮮な培地を摂取させ、前記したように20分間インキュベー
トした。次いで、プレート上の各ウェルをHBSSで洗浄し、室温にて、15分
間、HBSS中の3.7%ホルムアルデヒドで固定した。該ホルムアルデヒドを
HBSSで洗浄し、0.5%(v/v)トリトン−X−100を細胞に90秒間
あらかじめ浸透させ、HBSSで洗浄し、2 U ml−1 Bodipy F
Lファラチジン(Molecular Probes)とともに30分間インキ
ュベートし、HBSSで洗浄した。次いで、プレート上のウェルに200μlの
HBSSを満たし、シールし、要すればプレートを4℃で保存した。このように
保存したプレートからの蛍光信号は調製後少なくとも2週間安定であった。核移
動アッセイにおけるように、蛍光試薬は、このアッセイを生細胞高内容スクリー
ニングに変換するように設計することができる。
ファラチジンの蛍光強度を前記したように細胞スクリーニングシステムで測定し
た。また、各ウェルから得られたイメージの各対からの形態データを得て、イメ
ージ視野中の各対象(例えば、細胞及び核)を検出し、そのサイズ、形状及び積
分強度を計算した。
の各視野では、以下の計算を行った:(1)視野中の全核面積を検出された核の
数で割ることによって平均各面積(μm2)を計算した。(2)視野中の全ての
核の周囲の合計をその視野中で検出された核の数で割ることによって平均各周囲
(μm)を計算した。かなり複雑なアポトーシス核は最大核周囲値を有した。(
3)核の全視野の積分強度をその視野中の核の数で割ることによって平均核輝度
を計算した。核輝度の増加は増大したDNA含有量と相関した。(4)Mito
Tracker染料で染色した細胞の全視野の積分強度をその視野中の核の数
で割ることによって平均細胞輝度を計算した。ミトコンドリア内に蓄積するMi
to Tracker染料の量はミトコンドリアポテンシャルに比例するので、
平均細胞輝度の増加はミトコンドリアポテンシャルの増加に一致する。(5)B
odipy FLファラチジン染料で染色した細胞の全視野の積分強度をその視
野中の核の数で割ることによって平均細胞輝度を計算した。ファロトキシンはア
クチンの重合形態に高い親和性を持って結合するので、細胞内に蓄積するBod
ipy FLファラチジン染料の量はアクチン重合状態に比例する。平均細胞輝
度の増加はアクチン重合の増加と一致する。
キセルの変化を示す。パクリタキセルの量を増加させると、核は拡大し細分化す
る293(アポトーシスのホールマーク)。細胞スクリーニングシステムによっ
て得られたこれら及び他のイメージの定量的分析を同図に呈する。各測定したパ
ラメータは、L−929細胞296がSNB−19細胞297よりも低濃度のパ
クリタキセルに対して感受性が低いことを示した。より高濃度では、L−929
細胞は測定された各パラメータについての応答を示した。このアッセイのマルチ
パラメータプローチは、薬物の作用のメカニズムを解明するのに有用である。例
えば、核298の面積、輝度及び細分化ならびにアクチン重合値294は、SN
B−19細胞を10nMパクリタキセルで処理した場合に最大値に達した(図面
24;頂部及び底部グラフ)。しかしながら、ミトコンドリアのポテンシャル2
95は同一モードのパクリタキセルで最小であった(図24;中央のグラフ)。
測定した全てのパラメータが増大するパクリタキセル濃度(>10nM)におい
て対照レベルに近づいたという事実は、SNB−19細胞が、十分に高レベルの
薬物で補償的である低親和性薬物代謝またはクリアランス経路を有することを示
唆する。SNB−19細胞297の薬物感受性を対照すると、L−929はパク
リタキセル296に対して異なる応答を示した。これらの繊維芽細胞は、5μM
パクリタキセル(SNB−19細胞よりも500倍高い用量)において多くのパ
ラメータで最大応答を示した。さらに、L−929細胞は、テストしたパクリタ
キセル濃度のいずれにおいてもミトコンドリアポテンシャル295の鋭敏な減少
を示さなかった。この結果は、正常及び癌細胞系の間のユニークなアポトーシス
経路の存在と合致する。従って、これらの結果は、比較的単純な蛍光標識プロト
コルを本発明の細胞スクリーニングシステムとカップリングさせて、プログラム
された細胞の死滅に関与する鍵となる事象の高内容スクリーニングを生じること
を示す。
誘導移動 プラスミド構築体。緑色蛍光蛋白質−カスターゼ(Cohen(1997),
Biochemical J.326:1−16;Liangら,(1997)
,J.of Molec.Biol.274:291−302)キメラについて
のコーディング配列を含有する真核生物発現プラスミドはGFP突然変異体を用
いて調製される。該構築体を用いて真核生物細胞を形質移入する。
ェクションの24時間前に平板培養し、37℃及び5%CO2でインキュベート
する。トランスフェクションは、限定されるものではないがリン酸カルシウム共
沈殿またはリポフェクションを含めた方法によって行われる。37℃及び5%C
O2において4−5時間、細胞をリン酸カルシウム−DNA沈殿と共にインキュ
ベートし、DMEMで3−4回洗浄して沈殿を除去し、続いてC−DMEMを添
加した。リポフェクタミントランスフェクションは製造業者の指示に従って抗生
物質なくして無血清DMEM中で行う。DNA−リポソーム複合体との2−3時
間インキュベーション後に、培地を取り出し、G−DMEMで置き換える。
的データを得るために、形質移入された細胞の核を、まず、37℃及び5%CO 2 にて、20分間、C−DMEM中の5μg/ml Hoechst33342
(Molecular Probes)で標識する。細胞をハンクスの平衡塩溶
液(HBSS)中で1回洗浄し、続いてアポトーシスを誘導する化合物を添加す
る。これらの化合物は、限定されるものではないが、パクリタキセル、スタウロ
スポリン、セラミド及び腫瘍壊死因子を含む。固定された時点の力価測定データ
を得るために、形質移入された細胞をまずDMEMで洗浄し、次いで、DMEM
中の0−1000nM化合物の存在中、37℃及び5%CO2で1時間インキュ
ベートする。細胞を生きたまま分析するか、あるいはそれらをHBSSですすぎ
、HBSS中の3.7%ホルムアルデヒドで15分間固定し、Hoechst3
3342で染色し、分析前に洗浄する。
、生細胞の視野から蛍光イメージ対(カスパーゼ−GFP及びHoechst3
3342−標識核)を獲得することによって収集する。同様に、イメージ対は、
化合物の添加から1時間後に、固定された時点のスクリーニングプレートの各ウ
ェルから得られる。両方の場合、各時点で得られたイメージ対を用いて各細胞中
の核及び細胞質領域を規定する。核中のカスパーゼ−GFPの積分蛍光強度を細
胞質中のキメラの積分蛍光強度で割ることによって、あるいはGFP蛍光の核−
細胞質差異として、ガスパーゼ−GFPの移動を計算する。固定時点スクリーニ
ングにおいて、この移動比率は、テストした化合物の各濃度において少なくとも
200の細胞から得られたデータから計算される。従って、ガスパーゼ−GFP
の細胞質から核への薬物−誘導移動は移動比率の増加に相関する。限定されるも
のではないがアポトーシス−活性化酵素の推定アクチベータまたはインヒビター
を含むものを含めた分子相互作用ライブラリを用いて、インジケータ細胞系をス
クリーニングし、DASについての特異的リガンド及び化合物活性によって活性
化された経路を同定する。
これは特徴付けされていない遺伝子の機能の評価を可能とする。まず、哺乳動物
細胞へのトランスフェクションに適したcDNA配列を含有する病気関連配列バ
ンク(類)を用いることができる。各RADEまたは示差発現実験は数百までの
配列を生じるので、DASの豊富な供給を生じさせることができる。第2に、一
次配列データベースサーチからの情報を用いて、限定されるものではないが、シ
グナル配列、7つの膜貫通モチーフ、保存されたプロテアーゼ活性部位ドメイン
、または他の同定可能なモチーフを含有するものを含めた広いカテゴリーにDA
Sをおくことができる。これらの源から獲得された情報に基づいて、アルゴリズ
ムタイプ及び形質移入すべきインジケータ細胞系を選択する。非常に多数のモチ
ーフが既によく特徴付けされており、現存のゲノムデータベースにおける非常に
多数の遺伝子内に含まれる線状配列にコードされている。
学的プロセスを選択するための基礎として用いる(例えば、細胞周期変調、アポ
トーシス、転移性プロテアーゼ等についての腫瘍系からのDASを見られたし)
。
存されたプロテアーゼ活性ドメイン等)によるDNA配列またはDASの分類。
この最初のグループ分けは、前記したように、蛍光タギング戦略、宿主細胞系、
インジケータ細胞系、及びスクリーニングすべき生物活性分子のバンクを決定す
るであろう。
発現ベクターにDASが連結される。一般化された発現ベクターは、一過性発現
のために細胞に標的配列をデリバーするためのプロモーター、エンハンサー及び
ターミネーターを含有する。また、かかるベクターは、宿主によって発現された
場合に検出を容易にするために、抗体タギング配列、直接会合配列、クロモフォ
ア融合配列様GFPを含有することができる。
リカチオン媒介、ウイルス媒介またはエレクトロポレーションを含めた標準的な
トランスフェクションプロトコルを用いてDAS含有ベクターで細胞を一過的に
形質移入し、マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイに平板培養
する。別法として、トランスフェクションはマイクロタイタープレートそれ自体
中で直接行うことができる。
DNA結合ドメイン、アミノ末端変調ドメイン、ヒンジ領域またはカルボキシル
末端リガンド結合ドメイン)を保有することが示されているDASを利用して新
規ステロイド受容体を同定する。
合した発現ベクターへのDASの挿入を介してGFPキメラを創製することによ
る、DASを染色しタギングすることを介する核の同定を含む。別法として、発
現されたDASのいくつかの部分に対して高親和性を持つ一本鎖抗体断片は、当
該分野で利用できる技術(Cambridge Antibody Techn
ologies)を用いて構築でき、フルオロフォア(FITC)に連結して、
細胞中の推定転写アクチベータ/受容体にタグすることができるであろう。この
別法は、DNAトランスフェクションを要しない外部タグを提供し、従って、も
し分布データがDASを生じさせるのに用いる元の初代培養から集めるべきであ
れば有用であろう。
列を含有する真核生物発現プラスミドはGFP突然変異体を用いて調製される。
該構築体を用いてHeLa細胞を形質移入する該プラスミドは、宿主細胞に形質
移入されると、GFP−DASppと命名されたDAS蛋白質産物に融合したG
FPを生じる。
%木炭/デキストラン−処理ウシ胎児血清(FBS)(Hyclone)及び1
%ペニシリン−ストレプトマイシン(C−DMEM)を含有するDMEMを用い
て、トランスフェクションに12−24時間先立って平板培養し、37℃及び5
%CO2でインキュベートする。トランスフェクションはリン酸カルシウム共沈
殿によってまたはディポフェクタミン(Life Technologies)
で行う。リン酸カルシウムトランスフェクションでは、5%木炭/デキストラン
−処理FBSを含有するDMEMで、トランスフェクションに先立って、培地を
置き換える。細胞を37℃及び5%CO2にて4−5時間、リン酸カルシウム−
DNA沈殿と共にインキュベートし、DMEMで3−4回洗浄して沈殿を除去し
、続いてC−DMEMを添加する。リポフェクタミントランスフェクションは製
造業者の指示に従って抗生物質なくして無血清DMEM中で行う。DNA−リポ
ソーム複合体との2−3時間インキュベーションに続き、培地を取り出し、C−
DMEMで置き換える。96−ウェルのマイクロタイタープレート中の全ての形
質移入された細胞を、薬物処理に先立って24−48時間、33℃及び5%CO 2 でインキュベートする。実験はHeLa細胞中で一過的に発現される受容体で
行う。
ために、形質移入された細胞の核を、まず、33℃及び5%CO2で20分間、
C−DMEM中の5μg/ml Hoechst33342(Molecula
r Probes)で標識する。細胞をハンクスの平衡塩溶液(HBSS)中で
洗浄する。細胞は生きたまま分析するか、あるいはそれらはHBSSですすぎ、
HBSS中の3.7%ホルムアルデヒドで15分間固定し、Hoechst33
342で染色し、分析前に洗浄する。
リーニングシステムを用いて行われる。細胞内GFP−DASpp蛍光信号は、
視野細胞からの蛍光イメージ対(GFP−DASpp及びHoechst333
42−標識核)を獲得することによって収集される。各時点で得られたイメージ
対を用いて、各細胞における核及び細胞質領域を規定する。細胞質において分散
した信号を示すデータは、DNA転写アクチベーターである公知のステロイド受
容体と一致するであろう。
た、GFP−DASpp移動の同定のためのスクリーニング。前記構築体を用い
、種々のリガンドのスクリーニングは、限定されるものではないが、エストロゲ
ン、プロゲステロン、成長因子、アンドロゲン、及び多くの他のステロイド及び
ステロイドベースの分子を含めた一連のステロイドタイプのリガンドを用いて行
われる。イメージの獲得及び分析は、本発明の細胞スクリーニングシステムを用
いて行われる。細胞内GFP−DASpp蛍光信号は、視野細胞からの蛍光イメ
ージ対(GFP−DASpp及びHoechst33342−標識核)を獲得す
ることによって収集される。各時間で得られたイメージ対を用いて、各細胞にお
ける核及び細胞質領域を規定する。GFP−DASppの移動は、核中のGFP
−DASppの積分蛍光強度を細胞質中の該キメラの積分蛍光強度で割ることに
よって、あるいはGFP蛍光の核−細胞質差異として計算される。核へり細胞質
からの移動は、DASppのリガンド結合活性化を示し、かくして、潜在的受容
体のクラス及び作用を同定する。ステロイド受容体の公知のインヒビター及びモ
ディファイアーを用いて同様にして得られた他のデータとこのデータとを組み合
わせると、標的としてのDASppを有効化し、あるいはより多くのデータが種
々の源から生じるであろう。
態様において、プロフィン膜結合の蛍光蛋白質バイオセンサは、精製されたプロ
フィリン(Federovら,(1994),J.Molec.Biol.24
1:480−482;Lanbrechtsら(1995),Eur.J.Bi
ochem.230:281−286)を、2−300ナノ秒の範囲の蛍光寿命
を保有するプローブで標識することによって調製される。標識されたプロフィリ
ンを、バルクローディング方法及びインジケータ細胞を用いて生細胞インジケー
タ細胞に導入し、テスト化合物で処理する。蛍光異方性イメージング顕微鏡(G
ough及びTaylor(1993),J.Cell.Biol.121:1
095−1107)を用いて、0.1秒ないし10時間の範囲の処理後における
時間の間の細胞質及び膜の間のプロフィンの蛍光誘導体のテスト−化合物依存性
移動を測定する。
インジケータ細胞をテスト化合物で処理し、次いで、固定し、洗浄し、浸透させ
る。インジケータ細胞の原形質膜、細胞質及び核を全て区別した色の付いたマー
カーで標識し、続いて、第4の色で標識した抗体でRho蛋白質で免疫位置決定
する(Selfら,(1995),Methods in Enzymolog
y 256:3−10;Tanakaら,(1995),Methods in
Enzymology 256:41−49)。4つの標識の各々を細胞スク
リーニングシステムを用いて別々にイメージし、イメージを用いて、テスト化合
物によって行われた移動の阻害または活性化の量を計算する。この計算を行うた
めに、原形質膜及び細胞質をマークするのに使用したプローブのイメージを用い
て、細胞内Rho蛋白質の位置をマークする免疫学的プローブのイメージをマス
クする。各マスク下の単位面積当たりの積分輝度を用いて、原形質積分膜輝度/
面積を細胞質積分輝度/面積によって割ることによって移動商を形成する。対照
及び実験ウェルからの移動商値を組み合わせることによって、パーセント移動を
各潜在的リード化合物につき計算する。
て、細胞質から原形質膜へのβ−アレスチン蛋白質の移動は細胞処理に応答して
測定される。移動を測定するには、発光ドメインマーカーを含有するインジケー
タ生細胞をテスト化合物で処理し、β−アレスチンマーカーの移動を、本発明の
細胞スクリーニングシステムを用いて時間及び空間内で測定する。好ましい実施
の態様において、インジケータ細胞は、一過的または安定な細胞トランスフェク
ションの使用を通じてインジケータ細胞によって発現される緑色蛍光蛋白質β−
アレスチン(GFP−β−アレスチン)蛋白質キメラ(Barakら,(199
7),J.Biol.Chem.,272:27497−27500;Daak
aら,(1998),J.Biol.Chem.,273:685−688)よ
りなるマーカー及び細胞質及び膜ドメインをマークするのに使用される他のレポ
ーターを含有する。インジケータ細胞が休止状態にある場合、ドメインマーカー
分子は原形質膜または細胞質に支配的に分配される。高内容スクリーニングにお
いて、これらのマーカーを用いて、蛍光の区別されるチャンネルにおける細胞質
及び原形質膜を示す。インジケータ細胞をテスト化合物で処理すると、GFP−
β−アレスチンの動的再分布が、0.1秒ないし10時間の範囲のタイムスケー
ルにわたって一連のイメージとして記録される。好ましい実施の態様において、
タイムスケールは1時間である。各イメージは、原形質膜及び細胞質の間のGF
P−β−アレスチン蛋白質キメラの移動を定量する方法によって分析される。こ
の計算を行うために、プローブのイメージを用いて原形質膜をマークし、細胞質
を用いて、細胞内GFP−β−アレスチン蛋白質の位置をマークするGFP−β
−アレスチンプローブのイメージをマスクする。各マスク下で面積当たりの積分
輝度を用い、原形質膜積分輝度/面積を細胞質積分輝度/面積で割ることによっ
て、移動商を形成する。対照及び実験ウェルからの移動商を比較することによっ
て、パーセント移動を各潜在的リード化合物につき計算する。高内容スクリーニ
ングの出力は、注目するテスト化合物で処理されている非常に多数の個々の細胞
内の移動の大きさを記載する定量的データに関する。
て、水泡性口内炎ウイルスのts045突然変異体からのVSVG蛋白質(El
lenbergら,(1997),J.Cell Biol.138:1193
−1206;Presleyら,(1997)Nature 389:81−8
5)の小胞体からゴルジ体ドメインへの移動は細胞処理に応答して測定される。
移動を測定するには、発光レポーターを含有するインジケータ細胞テスト化合物
で処理し、レポーターの移動は、本発明の細胞スリーニングシステムを用いて交
換及び時間にて測定される。インジケータ細胞は、一過的または安定な細胞トラ
ンスフェクションの使用を通じてインジケータ細胞によって発現されるGFP−
VSVG蛋白質キメラ及び小胞体及びゴルジ体ドメインの位置を測定するのに使
用される他のドメインマーカーよりなる発光レポーターを含有する。インジケー
タ細胞が40℃のその休止状態にあると、GFP−VSVG蛋白質キメラ分子は
小胞体に支配的に分配される。この高内容スクリーニングにおいて、区別される
色のドメインマーカーを用いて、蛍光の区別されるチャンネル中の小胞体及びゴ
ルジ体ドメインを示す。インジケータ細胞をテスト化合物で処理し、かつ温度を
同時に32℃まで低下させると、GFP−VSVG蛋白質キメラの動的再分布は
、0.1秒ないし10時間の範囲のタイムスケールにわたって一連のイメージと
して記録される。各イメージは、小胞体及びゴルジ体ドメインの間のGFP−V
SVG蛋白質キメラの移動を定量する方法によって分析される。この計算を行う
には、小胞体及びゴルジ体ドメインをマークするのに使用されるプローブのイメ
ージを用いて、GFP−VSVGプローブをマスクし、細胞内GFP−VSVG
蛋白質の位置をマークする。各マスク下の単位面積当たりの積分輝度を用い、小
胞体積分輝度/面積をゴルジ体積分輝度/面積で割ることによって移動商を形成
する。対照及び実験ウェルからの移動商値を比較することによって、各潜在的リ
ード化合物につきパーセント移動を計算する。高内容スクリーニングの出力は、
1分ないし10時間の範囲の間、10−12Mないし10−3Mの範囲の最終濃
度において注目するテスト化合物で処理されている非常に多数の個々の細胞内の
移動の大きさを記載する定量的データに関する。
の態様において、細胞内微小管のアセンブリ状態は細胞処理に応答して測定され
る。微小管アセンブリ状態を測定するには、発光レポーターを含有するインジケ
ータ細胞をテスト化合物で処理し、レポーターの分布を、本発明の細胞スクリー
ニングシステムを用いて空間及び時間において測定する。
inskiら,(1997),J.Cell Science 110:305
5−3064)、間期及び有糸分裂細胞において微小管と相互作用することが知
られている普遍微小管関連蛋白質である。インジケータ細胞は、一過的または安
定な細胞トランスフェクションの使用を通じてインジケータ細胞によって発現さ
れるGFP−MAP 4キメラ及び細胞質及び膜構成要素の位置を測定するのに
使用される他のレポーターよりなる発光レポーターを含有する。GFP−MAP
4は以下のように調製される:制限酵素部位を導入するためのプライマーを用
いる天然または突然変異体GFP分子のPCR増幅が好ましい。PCR産物を真
核生物発現ベクター内のMAP 4 cDNAに連結する。次いで、インジケー
タ細胞を発現ベクターで形質移入して、一過的にまたは安定に形質移入されたイ
ンジケータ細胞を得る。
0−3Mの範囲の最終濃度のテスト化合物で処理する。核及び細胞質をマークす
るための標識試薬を含有する増殖培地を添加する。インキュベーションの後、細
胞をハンクスの平衡塩溶液(HBSS)で洗浄し、室温にて3.7%ホルムアル
デヒドで10分間固定し、洗浄し、HBSS中で保存する。
から形態データを抽出するために、以下の分析方法を用いる: 1.核または細胞境界の外側の各画素につき値=0を有するマスクを生じさせ
るための各核及び細胞質イメージに閾値を付与する。
)を検出し、そのサイズ及び積分強度を計算する。
ね、エッジ強度ルーチンの自動測定(Kolegaら,(1993)BioIm
aging 1:136−150)を用いて、各細胞内の全エッジ強度を計算す
る。細胞サイズを正規化するために、全エッジ強度を細胞面積で割って「強靭性
」を得る。大きな強靭性は強いエッジ強度値に関連し、従って、区別される微小
管構造を含有する細胞において最大である。同様に、小さな強靭値は弱いエッジ
強度に関連し、脱重合微小管を持つ細胞において最小である。強靭性値の生理学
的範囲は、微小管安定化薬物パクリタキセル(10μM)または微小管脱重合薬
物ノコダゾール(10μg/ml)いずれかで細胞を処理することによって設定
される。
の機能的位置は生細胞内である。
様において、鍵となる解糖調節酵素の活性を処理細胞で測定する。酵素活性を測
定するには、発光標識試薬を含有するインジケータ細胞をテスト化合物で処理し
、レポーターの活性を、本発明の細胞スクリーニングシステムを用いて空間及び
時間において測定する。
−リン酸、2−キナーゼ/フラクトース−2,6−ビスホスファターゼ(PFK
−2)、そのリン酸化状態が細胞内炭水化物の同化及び異化を示す調節酵素であ
る(Deprezら,(1997)J.Biol.Chem.272:1726
9−17275;Kealerら,(1996)FEBS Letters 3
95:225−227;Leeら,(1996),Biochemistry
35:6010−6019)。インジケータ細胞はPFK−2リン酸化の蛍光蛋
白質バイオセンサよりなる発光レポーターを含有する。蛍光蛋白質バイオセンサ
は、環境的に感受性の蛍光染料を当該酵素の既知のリン酸化部位近くに導入する
ことによって構築される(Deprezら,(1997),前掲;Giulli
anoら,(1995),前掲)。該染料はケトシアニンのクラスのものであり
得るか(Kessler及びWolfbeis(1991),Spectroc
himica Acta 47A:187−192)、あるいは蛋白質反応性部
位及びその励起または発光スペクトルが溶液の極性に感受性であるフルオロクロ
ムを含有するいずれかのクラスのものであり得る。蛍光蛋白質バイオセンサはバ
ルクローディング方法を用いてインジケータ細胞に導入される。
いし10−3Mの範囲の最終濃度でテスト化合物で処理する。好ましい実施の態
様において、比率イメージデータは、各時点において蛍光イメージのスペクトル
部分を収集することによって処理したイメージデータ細胞から得られる。各自点
から形態データを抽出するために、各自点における2つのスペクトルイメージを
画素間で数字的に分割することによって、比率をイメージの各対の間で出す。次
いで、各画素値を用いて、PFK−2のリン酸化分率を計算する。リン酸化の小
さな分率値では、PFK−2は炭水化物代謝を刺激する。リン酸化の高い分率値
では、PFK−2は炭水化物異化を刺激する。
もう1つの実施の態様において、インジケータ内のプロテインキナーゼA(PK
A)のドメイン位置及び活性双方をテスト化合物での処理に応答して測定する。
ターを含有する。蛍光蛋白質バイオセンサは、PKAの調節サブユニッと相互作
用することが知られている部位近くのPKAの触媒サブユニッに環境感受性蛍光
染料を導入することによって構築される(Harootunianら,(199
3),Mol.Biol.of the Cell 4:993−1002;J
ohnsonら,(1996),Cell 85:149−158;Giuli
anoら,(1995),前掲)。該染料はケトシアニンクラスのものであり得
るか(Kessler及びWolfbeis(1991),Spectroch
imica Acta 47A:187−192)、あるいは蛋白質反応性部位
及びその励起または発光スペクトルが溶液の極性に感受性であるフルオロクロム
を含有するいずれかのクラスのものであり得る。PKA活性化の蛍光蛋白質バイ
オセンサはバルクローディング方法を用いてインジケータ細胞に導入される。
の範囲の間、10−12Mないし10−3Mの範囲の最終濃度でテスト化合物で
処理する。好ましい実施の態様において、比率イメージデータは、処理されたイ
ンジケータ生細胞から得られる。各時点からバイオセンサデータを抽出するには
、イメージの各対の間で比率を求め、次いで、各画素値を用いてPKAの活性化
分率を計算する(例えば、cAMP結合後における触媒及び調節サブユニットの
分離)。活性の高分率値では、PFK−2は生細胞内で生化学的カスケードを刺
激する。
るインジケータ細胞をテスト化合物で処理し、レポーターの移動を、細胞スクリ
ーニングシステムを用いて空間及び時間において測定する。インジケータ細胞は
、細胞質及び核ドメインの位置を測定するのに使用されるドメインマーカーより
なる発光レポーターを含有する。インジケータ細胞をテスト化合物で処理すると
、PKA蛍光蛋白質バイオセンサの動的再分布が、0.1秒ないし10時間のタ
イムスケールにわたって一連のイメージとして細胞内で記録される。細胞質及び
核ドメインの間のPKAの移動を定量する方法によって各イメージを分析する。
この計算をなすには、細胞質及び核ドメインをマークするのに使用されるプロー
ブのイメージを用いて、PKA蛍光蛋白質バイオセンサのイメージをマスクする
。各マスク下の単位面積当たりの積分輝度を用い、細胞質積分輝度/面積を核積
分輝度/面積で割ることによって移動商を求める。対照及び実験ウェルからの移
動商値を比較することによって、各潜在的リード化合物につきパーセント移動を
計算する。高内容スクリーニングの出力は、10−12Mないし10−3Mの濃
度範囲のテスト化合物で処理してある非常に多数の個々の細胞内の移動の大きさ
を記載する定量的データに関する。
号変換、細胞間事象、仲介及びシグナリング分子代謝、細胞移行、細胞間通信及
び細胞死滅を含めた細胞生理学応答の一般的クラスの調節は遺伝子発現の改変に
関連し得る。また、高内容スクリーニングはこのクラスの生理学的応答を測定す
るように設計することができる。
とハイブリダイズすることができ、その蛍光シグナルを改変することができるオ
リゴヌクレオチドである。好ましい実施の態様において、オリゴヌクレオチドは
分子ビーコン(Tyagi及びKramer(1996)Nat.Biotec
hnol.14:303−308)、その蛍光信号が分子間及び分子内相互津要
に依存している発光ベースの試薬である。蛍光バイオセンサは、試薬の各端部(
5’及び3’)に1つがあるように、蛍光染料の蛍光エネルギー移行対を導入す
ることによって構築される。該染料は、蛋白質反応性部位及び、その励起及び発
光スペクトルが十分に重複して、限定されるものではないが、フルオレセイン及
びローダミンを含めた、休止状態における染料間の蛍光エネルギー移行を供する
フルオロクロムを含有する(Molecular Probes,Inc.)。
好ましい実施の態様において、β−アクチンをコードするメッセージの一部(K
iskauskisら,(1994),J.Cell Biol.127:44
1−451;McCannら,(1996),Proc.Natl.Acad.
Sci.94:5679−5684;Sutoh(1982),Biochem
istry 21:3654−3661)を、分子内交雑のため一緒に連結され
た端部を持つヘアピン−形状のオリゴヌクレオチドのループ領域に挿入される。
バイオセンサの各端部において、蛍光デナー(フルオレセイン)及び蛍光アクセ
プター(ローダミン)が共有結合する。連結状態において、蛍光エネルギー移動
は最大であり、従って、未ハイブリダイズド分子の指標となる。β−アクチンを
コードするmRNAとハイブリダイズすると、連結は破壊され、エネルギー移動
は喪失する。完全な蛍光バイオセンサは、バルクローディング方法を用いてイン
ジケータ細胞に導入される。
の範囲の間、10−12Mないし10−3Mの範囲の最終濃度のテスト化合物で
処理する。好ましい実施の態様において、処理されたインジケータ生細胞から比
率イメージデータが得られる。各自点からの形態データを抽出するために、イメ
ージの各対の間で比率を求め、次いで、各画素値を用いて標識ヌクレオチドの交
雑分率を計算する。小さな分率値の交雑において、β−アクチンの発現はほとん
ど示されない。高い分率値の交雑において、β−アクチンの最大発現が示される
。さらに、インジケータ細胞の細胞質内のハイブリダイズした分子の分布もまた
インジケータ細胞の生理学的応答の尺度である。
ドメインが特定の色の標識試薬で標識されている細胞を、適当な条件下で適当な
時間、異なる色の発光プローブで標識されたインスリン分子(Leeら,(19
97),Biochemistry 36:2701−2708;Martin
ez−Zaguilanら,(1996),Am.J.Physiol.270
:C1438−C1446)を含有する溶液と共にインキュベートする。インキ
ュベーションの後に、未結合インスリン分子を洗浄除去し、細胞を固定し、原形
質膜上のインスリンの分布及び濃度を測定する。これを行うために、細胞膜イメ
ージをインスリンイメージ用のマスクとして使用する。マスクしたインスリンイ
メージからの積分強度を、標識インスリンの既知量を含有するイメージの組と比
較する。細胞に結合したインスリンの量は標準から決定され、該細胞と共にイン
キュベートした全濃度のインスリンと組み合わせて用いて、解離定数またはその
細胞表面受容体に対するインスリンを計算する。
ージを分析することによって経時的に測定することができるように、細胞構成要
素を標識することによって達成される。
らの膜−浸透性分子は原形質膜中の蛋白質構成要素を通じて拡散すると共にそれ
と反応する。染料分子は細胞内分子と反応して、各分子から発せられた蛍光信号
を増加させると共に、生細胞内に蛍光染料を捕獲する。これらの分子はアミノク
マリンの反応性クロロメチル誘導体、ヒドロキシクマリン、エオシン二酢酸塩、
フルオレセイン二酢酸塩、いくつかのBodipy染料誘導体及びテトラメチル
ローダミンを含む。マクロ分子に向けてのこれらの染料の反応性は遊離一次アミ
ノ基及び遊離スルフヒドリル基を含む。
識抗体またはレクチン(Sigma Chemical Company,St
.Louis,MO)と細胞とを相互作用させることによって細胞表面を標識す
る。緑色蛍光蛋白質またはその突然変異体を含有する注目細胞によって発現され
た細胞表面蛋白質キメラを用いて全細胞表面を蛍光標識することもできる。いっ
たん全細胞が標識されれば、全細胞または細胞アレイは、細胞の形状、移動度、
サイズ、ならびに増殖及び分裂の測定に関連する、高内容スクリーニングでのパ
ラメータとなり得る。
記と同一の方法のうちのいくつかを使用する。全細胞表面を標識する発光分子は
原形質膜を描くように作用する。
及び細胞内表面を別々に標識し、高内容スクリーニングの構成要素として用いる
。第1の実施の態様において、スクシンイミジルエステルのような反応性蛍光分
子またはフルオレセイン、ローダミン、シアニン及びBodipyのような蛍光
染料のヨードアセトアミド誘導体での簡単な処理を用いて細胞外表面を標識する
。
識マクロ分子を用いて細胞外表面を標識する。これらはフルオレセイン、ローダ
ミンのような蛍光標識レクチン、及びタチナタマメ(Con A)、インゲンマ
メ(エリスロアグルチニン PHA−E)、小麦胚芽に由来するレクチンのシア
ニン誘導体を含む。
識抗体を用いて、原形質膜の細胞外領域を標識する。細胞表面受容体及びイオン
チャンネルの細胞外領域は抗体で標識することができる蛋白質の例である。
らの分子は、原形質膜脂質二層の中心にある疎水性領域と強く相互作用する長鎖
疎水性分子に付着した蛍光染料を含む。これらの染料の例は染料のPKHシリー
ズ(米国特許第4,783,401号、第4,762,701号及び第4,85
9,584号;Sigma Chemical Company,St.Lou
is,MO.)、ニトロベンズオキサジアゾールグリセロホスフォエタノールア
ミン及びフルオレセイン−誘導体化ジヘキサデカノイルグリセロホスフォエタノ
ールアミンのような蛍光リン脂質、5−ブチル−4,4−ジフルオロ−4−ボラ
−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−ノナン酸及び1−ピレンデカン酸
のような蛍光脂肪酸(Molecular Probes,Inc.)、4,4
−ジフルオロー5,7−ジメチル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダ
セン−3−ドデカン酸コレステリル及び1−ピレンヘキサン酸コレステリルを含
めて蛍光ステロール、アネキシンVのフルオレセイン誘導体のような脂質二層構
成要素と特異的に相互作用する蛍光標識蛋白質(Caltag Antibod
y Co,Burlingame,CA)を含む。
する。これらの分子の例はトリマG−蛋白質受容体、アデニリルシクラーゼ及び
イオン輸送蛋白質の細胞内構成要素である。これらの分子は、蛍光標識特異的抗
体への密接な結合の結果として、あるいは膜−会合蛋白質及び緑色蛍光蛋白質か
ら構成される蛍光蛋白質キメラ、及びその突然変異体の取り込みによって標識す
ることができる。
輸送されたリガンドを用いてエンドソームオルガネラのダイナミッスを追跡する
。標識リガンドの例はBodipy FL−標識低密度リポ蛋白質複合体、テト
ラメチルローダミントランスフェリンアナログ、及び蛍光標識表皮細胞成長因子
(Molecular Probes,Inc.)を含む。
識一次または二次抗体(Sigma Chemical Co.St.Loui
s,MO.;Molecular Probes,Inc.,Eugene,O
R;Caltag Antibody Co.)を用いて細胞中のエンドソーム
区画をマークする。
緑色蛍光蛋白質またはその突然変異体とを融合させることによって形成された蛋
白質キメラを発現する細胞中でエンドソームを蛍光標識する。EGF、トランス
フェリン及び低密度リポ蛋白質受容体のキメラがこれらの分子の例である。
生細胞及び固定細胞のリソソーム区画を標識する。これらの試薬は発光分子のニ
ュートラルレッド、N−(3−((2,4−ジニトロフェニル)アミノ)プロピ
ル)−N−(3−アミノプロピル)−メチルアミン、及びリソソーム内pHなら
びにリソソームの動的分布を報告するLysoTrackerプローブ(Mol
ecular Probes Inc.)を含む。
emical Co.;Molecular Probes Inc.;Cal
tag Antibody Co.)を用いて、特別のリソソームドメインに位
置するリソソーム区画を標識する。これらの構成要素の例はコレステロールエス
テルの加水分解に関与する分解酵素、膜蛋白質プロテアーゼ、及びヌクレアーゼ
ならびにATP−駆動リソソームプロトンポンプである。
有発光蛋白質に遺伝的に融合したリソソーム蛋白質よりなる蛋白質キメラを用い
てリソソームドメインを標識する。これらの構成要素の例はコレステロールエス
テルの加水分解に関与する分解酵素、膜蛋白質プロテアーゼ、及びヌクレアーゼ
ならびにATP−駆動リソソームプロトンポンプである。
ular Probes Inc.)を生細胞と反応させる。モノブロモビマン
、5−クロロメチルフルオレセイン二酢酸塩、カルボキシフルオレセイン二酢酸
塩スクシンイイジルエステル、及びクロロメチルテトラメチルローダミンを含め
た反応性染料は、細胞の細胞質の長期間標識で使用される細胞浸透性蛍光染料の
例である。
蛍光染料(Molecular Probes Inc.)のような極性トレー
サー分子をバルクローディング方法を用いて細胞に導入し、これはまた細胞質標
識に使用される。
ical Co.;Molecular Probes Inc.;Calta
g Antibody Co.)を用いて細胞質を蛍光標識する。細胞質抗原の
実施例は媒介代謝に関与する酵素の多くである。エノラーゼ、ホスフォフルクト
キナーゼ、及びアセチル−CoAデヒドロゲナーゼは均一に分布した細胞質抗原
の例である。
有発光蛋白質に遺伝的に融合した細胞質蛋白質よりなる蛋白質キメラを用いて細
胞質を標識する。均一に分布した蛋白質の蛍光キメラを用いて全細胞質ドメイン
を標識する。これらの蛋白質の例は媒介代謝に関与する蛋白質の多くであり、エ
ノラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ及びヘキソキナーゼを含む。
mical Co.;Molecular Probes Inc.;Calt
ag Antibody Co.)を用いて、特別の細胞質サブドメインに位置
する細胞質構成要素を標識する。これらの構成要素の例は細胞骨格蛋白質アクチ
ン、チュービュリン及びサイトケラチンである。細胞内のこれらの蛋白質の集団
は離散的構造に組み立てられ、この場合には繊維状である。従って、抗体ベース
の試薬でのこれらの蛋白質の蛍光標識は細胞質の特別のサブドメインを標識する
。
蛍光標識分子を用いて特別の細胞質構成要素を標識する。1つの例は酵素DNA
seIの蛍光アナログである(Molecular Probes Inc.)
。この酵素の蛍光アナログは細胞質アクチンに密にかつ特異的に結合し、かくし
て、細胞質のサブドメインを標識する。もう1つの実施の態様において、キノコ
毒のファロイジンまたは薬物パクリタキセルの蛍光アナログ(Molecula
r Probes Inc.)を用いて、各々、アクチン−及び微小管−細胞骨
格の構成要素を標識する。
有発光蛋白質に遺伝的に融合した細胞質蛋白質よりなる蛋白質キメラを用いて細
胞質の特別のドメインを標識する。高度に局所化された蛋白質の蛍光キメラを用
いて細胞質サブドメインを標識する。これらの蛋白質の例は細胞骨格の調節に関
与する蛋白質の多くである。それらは構造蛋白質のアクチン、チュービュリン及
びサイトケラチンならびに調節蛋白質の微小管関連蛋白質4及びα−アクチニン
を含む。
らの試薬はシアニンベースの染料(例えば、TOTO、YOYO、BOBOTM 、フェナンチジン及びアクリジン(例えば、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウ
ム及びアクリジンオレンジ)、インドール及びイミダゾール(例えば、Hoec
hst33258、Hoechst33342及び4’,6−ジアミジノ−2−
フェニルインドール)、及び他の同様の試薬(例えば、7−アミノアクチノマイ
シンD、ヒドロキシスチルバミジン及びプソラレン)を含む。
al Co.;Molecular Probes Inc.;Caltag
Antibody Co.)を用いて、特別の核ドメインに位置する核構成要素
を標識する。これらの構成要素の例はDNAの構造及び機能の維持に関与するマ
クロ分子である。DNA、RNA、ヒストン、DNAポリメラーゼ、RNAポリ
メラーゼ、ラミン、及びアクチンのような細胞質蛋白質の核変異体は核抗原の実
施例である。
有発光蛋白質に遺伝的に融合した核蛋白質よりなる蛋白質キメラを用いて核ドメ
インを標識する。これらの蛋白質の例はDNAの構造及び機能の維持に関与する
蛋白質の多くである。ヒストン、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、ラ
ミン、及びアクチンのような細胞質蛋白質の核変異体は核蛋白質の例である。
lecular Probes Inc.)を用いて生細胞及び固定細胞のミト
コンドリアを標識する。これらの試薬はローダミン123、テトラメチルロサミ
ン、JC−1、Mito Tracker反応性染料を含む。
Chemical Co.;Molecular Probes Inc.;C
altag Antibody Co.)を用いて、特別のミトコンドリアドメ
インに位置するミトコンドリア構成要素を標識する。これらの構成要素の実施例
はミトコンドリアDNAの構造及び機能の維持に関与するマクロ分子である。D
NA、RNA、ヒストン、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、ミトコン
ドリアtRNA及びrRNAのような細胞質マクロ分子のミトコンドリア変異体
はミトコンドリア抗原の例である。ミトコンドリア抗原の他の例はミトコンドリ
アに見出される酸化的リン酸化系の構成要素である(例えば、チトクロームc、
チトクロームcオキシダーゼ、及びコハク酸デヒドロゲナーゼ)。
の変異体に遺伝的に融合したミトコンドリア蛋白質よりなる蛋白質キメラを用い
てミトコンドリアドメインを標識する。これらの構成要素の実施例はミトコンド
リアDNAの構造及び機能に関与するマクロ分子である。その実施例はヒストン
、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、及びミトコンドリアで見出される
酸化的リン酸化系の構成要素である(例えば、チトクロームc、チトクロームc
オキシダーゼ、及びコハク酸デヒドロゲナーゼ)。
lar Probes Inc.)を用いて生細胞及び固定細胞の小胞体を標識
する。これらの試薬は短鎖カルボシアニン染料(例えば、DiOC6及びDiO
C3)、長鎖カルボシアニン染料(例えば、DiIC16及びDiIC18)、
及びコンカナバリンAのような発光標識レクチンを含む。
ical Co.;Molecular Probes Inc.;Calta
g Antibody Co.)を用いて、特異的小胞体ドメインに存在する小
胞体構成要素を標識する。これらの構成要素の実施例は脂肪酸伸長システム、グ
ルコース−6−ホスファターゼ、及びHMG CoA−レダクターゼに関与する
マクロ分子である。
有発光蛋白質に遺伝的に融合した小胞体蛋白質よりなる蛋白質キメラを用いて小
胞体ドメインを標識する。これらの構成要素の実施例は脂肪酸伸長システム、グ
ルコース−6−ホスファターゼ、及びHMG CoA−レダクターゼに関与する
マクロ分子である。
ular Probes Inc.)を用いて生細胞及び固定細胞のゴルジ体を
標識する。これらの試薬は小麦胚芽アグルチミン及びブレフェルジンAのような
発光標識マクロ分子ならびに発光標識セラミドを含む。
mical Co.;Molecular Probes Inc.;Calt
ag Antibody Co.)を用いて、特別のゴルジ体ドメインに存在す
るゴルジ体構成要素を標識する。これらの構成要素の例はN−アセチルグルコサ
ミンホスフォトランスフェラーゼ、ゴルジ体−特異的ホスフォジエステラーゼ、
及びマンノース−6−リン酸受容体蛋白質である。
光蛋白質に遺伝的に融合したゴルジ体蛋白質よりなる蛋白質キメラを用いてゴル
ジ体ドメインを標識する。これらの構成要素の例はN−アセチルグルコサミンホ
スフォトランスフェラーゼ、ゴルジ体−特異的ホスフォジエルテラーゼ、及びマ
ンノース−6−リン酸受容体蛋白質である。
的を意図するに過ぎない。いくつかの単一パラメータスクリーニングをマルチパ
ラメータ高内容スクリーニングに組み合わせることによって、あるいは細胞パラ
メータをいずれかの既存高内容スクリーニングに付加することによって、複数パ
ラメータ高内容スクリーニングを生じさせることができる。さらに、各実施例は
生細胞または固定細胞いずれかを基礎とするが、各高内容スクリーニングを生細
胞及び固定細胞双方で使用されるように設計することができる。
常に多様な区別されるスクリーニングを認識するであろう。細胞内の特別の構成
要素の移動または再組織化に関係する細胞中の既知の生化学及び分子プロセスの
大きくかつ増えつつあるリストがある。細胞内の標的部位への細胞表面からのシ
グナリング経路は原形質膜−会合蛋白質の細胞質への移動を含む。例えば、蛋白
質チロシンキナーゼのsrcファミリーのうちの1つ、pp60c−src(W
alkerら,(1993),J.Biol.Chem.268:19552−
19558)は、繊維芽細胞の血小板由来成長因子(PDGF)での刺激に際し
て原形質膜から細胞質に移動することが知られている。加えて、スクリーニング
のための標的それ自体は、リガンド−結合及び移動後修飾を含めた分子変化を報
告する蛍光ベースの試薬に変換することができる。
示する。
フォーム構築のブロックダイアグラムであり、1のプラットフォームは望遠鏡レ
ンズを用いてマイクロタイタープレートの全てのウェルを読み取り、第2のプラ
ットフォームはより高い倍率のレンズを用いてウェル中の個々の細胞を読み取る
。
な「望遠鏡」レンズ及びウェル中の個々の細胞を読み取るための移動可能なより
高い倍率のレンズを用いる細胞ベーススクリーニング用の二重モードシステムの
単一プラットフォーム構築のための光学系の詳細図である。
流体配送システムの説明図である。
である。
グを組み合わせる細胞ベースのスクリーニング用の二重モードシステムにおける
処理過程段階を規定するフローチャートである。
おける処理過程段階を規定するフローチャートである。
理過程段階を規定するフローチャートである。
タを獲得するのに必要な処理過程段階を規定するフローチャートである。
フローチャートである。
、高内容モードへと通過したデータの例、高内容モードで獲得されたデータ、及
びそのデータの解析の結果の説明図である。
る。
る。
ートである。
すPCスクリーンの代表的なディスプレイを示す。
の代表的ディスプレイを示す。
Claims (39)
- 【請求項1】 テスト化合物で処理すべき複数細胞を含有する位置のアレイを
備え、ここに、該細胞は注目する細胞表面受容体蛋白質を保有し、ここに、該細
胞表面受容体蛋白質は発光標識蛋白質として発現されるか、あるいは注目する細
胞表面受容体に結合する発光標識分子と該細胞とを接触させることによって発光
標識され、ここに、該接触は該テスト化合物での処理の前または後のいずれかで
行うことができ; 該細胞をテスト化合物で処理し; 複数細胞を含有する位置の各々において複数細胞を走査して、発光標識細胞表
面受容体蛋白質からの発光信号を得; 発光信号をデジタルデータに変換し;及び、 該デジタルデータを利用して、該テスト化合物が発光標識された細胞表面受容
体蛋白質の内部化を誘導したか否かを自動的に決定することを特徴とする細胞表
面受容体蛋白質の内部化を誘導する化合物を同定するための自動化方法。 - 【請求項2】 さらに、発光標識細胞表面受容体蛋白質を内部化した多数の細
胞を測定することを含む請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 さらに、全細胞数を測定することを含む請求項2に記載の方法
。 - 【請求項4】 全細胞数の測定が、 a.細胞核のイメージを獲得し; b.細胞核のイメージを細分化し;及び、 c.細胞核のイメージ中の全ての核の全面積を計算する工程を含む請求項3に
記載の方法。 - 【請求項5】 発光標識細胞表面受容体蛋白質を内部化した多数の細胞の測定
が、 a.細胞中または細胞上の発光標識細胞表面受容体蛋白質の対象イメージを獲
得し; b.対象イメージを細分化し;及び、 c.細分化対象イメージ中の対象が有効な内部化発光標識細胞表面受容体蛋白
質を表すか否かを測定する工程を含む請求項2に記載の方法。 - 【請求項6】 さらに、以下の a.対象イメージからの人工物を除去するか;または b.バックグラウンド発光を補正する; のうちの少なくとも1つを含む請求項5に記載の方法。
- 【請求項7】 さらに、以下の (a)有効な内部化細胞表面受容体を表すと決定された多数の対象; (b)有効な内部化細胞表面受容体を表すと決定された対象の総面積; (c)有効な内部化細胞表面受容体を表すと決定された対象の総強度;または (d)有効な内部化細胞表面受容体を表すと決定された対象の正規化総強度; のうちの少なくとも1つを測定することを含む請求項5に記載の方法。
- 【請求項8】 複数細胞を含有する位置のアレイの小区画が、該細胞への細胞
表面受容体蛋白質内部化の動的測定を供する間隔で複数回サンプリングされる請
求項1に記載の方法。 - 【請求項9】 テスト化合物で処理されるべき複数細胞を含有する位置のアレ
イを備え、ここに、該細胞は注目する細胞表面受容体蛋白質を保有し、該細胞受
容体蛋白質は発光標識蛋白質として発現されるか、あるいは注目する細胞表面受
容体に結合する発光標識分子と該細胞とを接触させることによって発光標識され
、該接触は該テスト化合物での処理の前または後で行うことができ; 該細胞をテスト化合物で処理し; テスト化合物の不存在下で細胞表面受容体蛋白質が内部化されるようにするリ
ガンドで該細胞を処理し; 細胞を含有する位置の各々において複数細胞を走査して、発光標識受容体蛋白
質から発光信号を得; 発光信号をデジタルデータに変換し;及び、 該デジタルデータを利用して、発光標識細胞標識表面受容体蛋白質の該細胞へ
のリガンド−誘導内部化を該テスト化合物が阻害したか否かを決定することを特
徴とする細胞表面受容体蛋白質の内部化を阻害する化合物を同定する方法。 - 【請求項10】 さらに、発光標識細胞表面受容体蛋白質を内部化した多数の
細胞を測定することを含む請求項9に記載の方法。 - 【請求項11】 さらに、全細胞数を測定することを含む請求項10に記載の
方法。 - 【請求項12】 細胞数の測定が、 a.細胞核のイメージを獲得し; b.細胞核のイメージを細分化し;及び、 c.細胞核のイメージ中の全ての核の全面積を計算する; 工程を含む請求項11に記載の方法。
- 【請求項13】 発光標識受容体蛋白質を内部化した多数の細胞の測定が、 a.該細胞中または細胞上の発光標識細胞表面受容体蛋白質の対象イメージを
獲得し; b.対象イメージを細分化し;及び、 c.細分化対象イメージ中の対象が有効な内部化発光標識細胞表面受容体蛋白
質を表すか否かを決定する; 工程を含む請求項10に記載の方法。 - 【請求項14】 さらに、以下の a.対象イメージから人工物を除去し;または b.バックグラウンド発光につき補正する; のうちの少なくとも1つを含む請求項13に記載の方法。
- 【請求項15】 さらに、以下の (a)有効な内部化細胞表面受容体を表すと決定された多数の対象; (b)有効な内部化細胞表面受容体を表すと決定された対象の総面積; (c)有効な内部化細胞表面受容体を表すと決定された対象の総強度;または (d)有効な内部化細胞表面受容体を表すと決定された対象の正規化総強度; のうちの少なくとも1つを測定することを含む請求項13に記載の方法。
- 【請求項16】 複数細胞を含有する位置のアレイの小区画が、該細胞への細
胞表面受容体蛋白質内部化の阻害の動的測定を供する間隔で複数回サンプリング
される請求項9に記載の方法。 - 【請求項17】 テスト化合物で処理すべき複数細胞を含有する位置のアレイ
を備え、ここに、該細胞は注目する細胞表面受容体蛋白質を保有し、ここに、該
細胞表面受容体蛋白質は発光標識蛋白質として発現されるか、あるいは注目する
細胞表面受容体に結合する発光標識分子と該細胞とを接触させることによって発
光標識され、該接触はテスト化合物での処理の前または後いずれかに行うことが
でき; 受容体蛋白質の刺激に際して検出可能な信号を生ずるインジケータで該細胞を
処理し; 該細胞をテスト化合物で処理し; 高スループットモードで該細胞を走査して、検出可能な信号を呈する細胞を同
定し; 高内容モードで該細胞のサブセットのみを選択的に走査して、発光標識受容体
蛋白質からの発光信号が得られ、ここに、該サブセットは高スループットモード
でのスキャニングでの間に検出可能な信号を呈する細胞よりなり; 発光信号をデジタルデータに変換し;及び、 該デジタルデータを利用して、テスト化合物が発光標識細胞表面受容体の該細
胞への内部化を誘導したか否かを決定することを特徴とする細胞表面受容体蛋白
質の内部化を誘導する化合物を同定する方法。 - 【請求項18】 さらに、発光標識細胞表面受容体蛋白質を内部化した多数の
細胞を決定することを含む請求項17に記載の方法。 - 【請求項19】 さらに、全細胞数を決定することを含む請求項18に記載
の方法。 - 【請求項20】 全細胞数の決定が、 a.細胞核のイメージを獲得し; b.細胞核のイメージを細分化し;及び、 c.細胞核のイメージ中の全ての核の全面積を計算する; 工程を含む請求項19に記載の方法。
- 【請求項21】 発光標識受容体蛋白質を内部化した多数の細胞の決定が、 a.細胞中または細胞上の発光標識細胞表面受容体蛋白質の対象イメージを獲
得し; b.細胞イメージを細分化し;及び、 c.細分化対象イメージ中の対象が有効な内部化発光標識細胞表面受容体蛋白
質を表すか否かを決定する; 工程を含む請求項18に記載の方法。 - 【請求項22】 さらに、以下の a.対象イメージからの人工物を除去し;または b.バックグラウンド発光につき補正する; のうちの少なくとも1つを含む請求項21に記載の方法。
- 【請求項23】 さらに、以下の (a)有効な内部化細胞表面受容体を表すと決定された多数の対象; (b)有効な内部化細胞表面受容体を表すと決定された対象の総面積; (c)有効な内部化細胞表面受容体を表すと決定された対象の総強度;または (d)有効な内部化細胞表面受容体を表すと決定された対象の正規化総強度; のうちの少なくとも1つを測定することを含む請求項21に記載の方法。
- 【請求項24】 多数の細胞を含有する位置のアレイの小区画が、細胞表面
受容体内部化の動的測定を供する間隔で複数回サンプリングされる請求項17に
記載の方法。 - 【請求項25】 テスト化合物で処理すべき複数細胞を含有する位置のアレ
イを備え、ここに、該細胞は注目する細胞表面受容体蛋白質を保有し、ここに、
該細胞表面受容体蛋白質は発光標識蛋白質として発現されるか、あるいは注目す
る細胞表面受容体に結合する発光標識分子と該細胞とを接触させることによって
発光標識され、該接触はテスト化合物での処理の前または後いずれかに行うこと
ができ; 受容体蛋白質の刺激に際して検出可能な信号を生ずるインジケータで該細胞を
処理し; 該細胞をテスト化合物で処理し; テスト化合物の不存在下で、細胞表面受容体蛋白質が該細胞に内部化されるよ
うにするリガンドで該細胞を処理し; 高スループットモードで該細胞を走査して、インジケータ−誘導の検出可能な
信号を呈しない細胞を同定し; 高内容モードで該細胞のサブセットのみを選択的に走査して、発光標識受容体
蛋白質からの発光信号が得られ、ここに、該細胞の該サブセットは高スループッ
トモードでのスキャニングでの間に所望の検出可能な信号を呈しない細胞よりな
り; 発光信号をデジタルデータに変換し;及び、 該デジタルデータを利用して、テスト化合物が発光標識細胞表面受容体の該細
胞へのリガンド−誘導の内部化を阻害したか否かを決定することを特徴とする細
胞表面受容体蛋白質の内部化を阻害する化合物を同定する方法。 - 【請求項26】 さらに、発光標識細胞表面受容体蛋白質を内部化した多数
の細胞を決定することを含む請求項25に記載の方法。 - 【請求項27】 さらに、全細胞数を決定することを含む請求項26に記載
の方法。 - 【請求項28】 全細胞数の決定が、 a.細胞核のイメージを獲得し; b.細胞核のイメージを細分化し;及び、 c.細胞核のイメージ中の全ての核の全面積を計算する; 工程を含む請求項27に記載の方法。
- 【請求項29】 発光標識受容体蛋白質を内部化した多数の細胞の決定が、 a.細胞中または細胞上の発光標識細胞表面受容体蛋白質の対象イメージを獲
得し; b.細胞イメージを細分化し;及び、 c.細分化対象イメージ中の対象が有効な内部化発光標識細胞表面受容体蛋白
質を表すか否かを決定する; 工程を含む請求項26に記載の方法。 - 【請求項30】 さらに、以下の a.対象イメージからの人工物を除去し;及び b.バックグラウンド発光につき補正する; のうちの少なくとも1つを含む請求項29に記載の方法。
- 【請求項31】 さらに、以下の (a)有効な内部化細胞表面受容体を表すと決定された多数の対象; (b)有効な内部化細胞表面受容体を表すと決定された対象の総面積; (c)有効な内部化細胞表面受容体を表すと決定された対象の総強度;または (d)有効な内部化細胞表面受容体を表すと決定された対象の正規化総強度; のうちの少なくとも1つを測定することを含む請求項29に記載の方法。
- 【請求項32】 多数の細胞を含有する位置のアレイの小区画が、細胞表面
受容体内部化の動的測定を供する間隔で複数回サンプリングされる請求項25に
記載の方法。 - 【請求項33】 細胞スクリーニングシステムが請求項1に記載の方法を実
行するようにする指令の組を含有するプログラムを含み、ここに、該細胞スクリ
ーニングシステムは細胞を含有するプレートを保持するのに適したステージを持
つ光学系、該ステージまたは該光学系を移動させるための手段、デジタルカメラ
、該細胞から発せられた光を該デジタルカメラに向ける手段、及び該デジタルカ
メラからのデジタルデータを受領し、加工するためのコンピュータ手段を含むこ
とを特徴とするコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。 - 【請求項34】 細胞スクリーニングシステムが請求項9に記載の方法を実
行するようにする指令の組を含有するプログラムを含み、ここに、該細胞スクリ
ーニングシステムは細胞を含有するプレートを保持するのに適したステージを持
つ光学系、該ステージまたは該光学系を移動させるための手段、デジタルカメラ
、該細胞から発せられた光を該デジタルカメラに向ける手段、及び該デジタルカ
メラからのデジタルデータを受領し、加工するためのコンピュータ手段を含むこ
とを特徴とするコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。 - 【請求項35】 細胞スクリーニングシステムが請求項17に記載の方法を
実行するようにする指令の組を含有するプログラムを含み、ここに、該細胞スク
リーニングシステムは細胞を含有するプレートを保持するのに適したステージを
持つ光学系、該ステージまたは該光学系を移動させるための手段、デジタルカメ
ラ、該細胞から発せられた光を該デジタルカメラに向ける手段、及び該デジタル
カメラからのデジタルデータを受領し、加工するためのコンピュータ手段を含む
ことを特徴とするコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。 - 【請求項36】 細胞スクリーニングシステムが請求項25に記載の方法を
実行するようにする指令の組を含有するプログラムを含み、ここに、該細胞スク
リーニングシステムは細胞を含有するプレートを保持するのに適したステージを
持つ光学系、該ステージまたは該光学系を移動させるための手段、デジタルカメ
ラ、該細胞から発せられた光を該デジタルカメラに向ける手段、及び該デジタル
カメラからのデジタルデータを受領し、加工するためのコンピュータ手段を含む
ことを特徴とするコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。 - 【請求項37】 (a)注目する細胞表面受容体蛋白質に特異的に結合する
少なくとも1つの抗体またはその断片;及び (b)該抗体を用いて注目する細胞表面受容体蛋白質の細胞への内部化を誘導
または阻害する化合物を同定するための指令; を含むことを特徴とする細胞表面受容体蛋白質の内部化を誘導または阻害する化
合物を同定するためのキット。 - 【請求項38】 注目する細胞表面受容体蛋白質がG−蛋白質にカップリン
グした受容体である請求項37に記載のキット。 - 【請求項39】 該G−蛋白質にカップリングした受容体が副甲状腺ホルモ
ン受容体である請求項38に記載のキット。
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