JP3466568B2 - 細胞ベースのスクリーニング用のシステム - Google Patents

細胞ベースのスクリーニング用のシステム

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】（関連文献） 本出願は１９９８年７月１３日に出願された特許Ｓ／Ｎ
６０／０９２，６７１についての米国出願の一部継続出
願である。
【０００２】（発明の分野） 本出願は薬物発見のための蛍光ベースの細胞及び分子生
化学アッセイの分野のものである。
【０００３】（発明の背景） 現在当該分野で実行されている薬物発見は、特異的病気
標的の同定、特異的標的に基づくアッセイの開発、該ア
ッセイの有効化、スクリーニングを生じるための該アッ
セイの最適化及び自動化、「ヒット」を同定するのに該
アッセイを用いる化合物ライブラリーの高スループット
スクリーニング、ヒットの有効化及びヒット化合物の有
効化を含む長い複数工程プロセスである。このプロセス
の出力は前臨床に進められ、もし有効化されれば、結局
は臨床試験に進められるリード化合物である。このプロ
セスにおいて、該スクリーニング相はアッセイ開発相と
は区別され、生きた生物学的系における化合物有効性を
テストすることを含む。
【０００４】歴史的には、薬物の発見は何年にもわた
り、創製された薬物当たり数億ドルもかかる遅くコスト
高なプロセスである。ゲノミックス及び高スループット
スクリーニングの領域における開発の結果、標的同定及
びスクリーニングした化合物の容量の領域における能力
及び効率の増大をもたらした。自動ＤＮＡ配列決定、Ｐ
ＣＲ適用、位置クローニング、交雑アッセイ、及びバイ
オインフォーマティックスにおける多いなる進歩は、潜
在的薬物スクリーニング標的をコードする遺伝子（及び
遺伝子断片）の数を多いに増加させた。しかしながら、
薬物スクリーニングのための基本的スキームは以前とし
て同一のままである。
【０００５】現行方法及びプロトコルを用いる治療介入
のためのポイントとしてのゲノム標的の有効化は、イン
ビボ機能的モデル、組換え蛋白質の機能的分析、及び候
補遺伝子の安定な細胞系発現のような、使用される遅く
手動の方法のため薬物発見プロセスにおいてネックとな
った。自動配列決定を通じて獲得された一次ＤＮＡ配列
データは、遺伝子機能の同定を可能としないが、既知の
配列データベースと比較した場合の共通した「モチー
フ」及び特異的遺伝子相同性についての機能を提供す
る。減算交雑及びＲＡＤＥ（差分発現の迅速増幅）のよ
うなゲノミック方法を用いて、病気状態モデルにおいて
上昇または下降調節される遺伝子を同定することができ
る。しかしながら、同定及び有効化は依然として同経路
を遅延させる。いくつかのプロテオミック方法は、注目
する候補遺伝子を同定するのに逆遺伝学と組み合わせて
蛋白質同定（広大な発現系、２Ｄ電気泳動、コンビナト
ーリアルライブラリー）を用いる。かかる推定「病気関
連配列」または無傷ｃＤＮＡとして単離されたＤＡＳは
これらの方法にとって大いに利点となるが、それらは、
コードされた蛋白質のタイプ、活性及び分布に関するい
ずれの情報も提供することなく数百によって同定され
る。薬物スクリーニング標的としてのＤＡＳのサブセッ
トを選択することは「ランダム」であり、かくして、病
気とのメカニズム的リンクを供するための機能データが
なく極端に効率が低い。従って、生物学的機能を確立
し、それにより、薬物発見における標的の有効化及び候
補の最適化を改良するためにＤＡＳを迅速にスクリーニ
ングする新しい技術を提供する必要がある。
【０００６】初期の薬物発見生産性を改良するのに３つ
の主要な方法がある。まず、増大した情報取り扱い能力
を提供するツールに対する要求がある。バイオインフォ
ーマティックスはＤＮＡ配列決定システムの迅速な開発
及びゲノミックスデータベースの進化を実らせた。ゲノ
ミックスは潜在的新標的の同定で非常に重要な役割を演
じ始めている。プロテオニックスは、薬物相互作用を予
測するために蛋白質標的の構造と機能を関連させるのに
不可欠なものとなった。しかしながら、生物学的複雑性
の次のレベルは細胞である。したがって、細胞から多次
元情報を獲得し、管理し及びサーチする必要がある。第
２に、より高いスループットツールに対する要求があ
る。ＤＮＡ配列決定及び高スループット一次スクリーニ
ングで既に証明されているように、自動化は生産性を改
良する鍵である。本発明は、高スループットの要求に適
合する細胞からの複数パラメータ情報を抽出する自動シ
ステムを提供する。また、本発明は、各アッセイで必要
な試薬及びテスト化合物の容量を減少させつつ、該方法
をミニチュア化し、それにより増大したスループットを
可能とする。
【０００７】放射能は初期の薬物発見アッセイにおいて
支配的な読み出しであった。しかしながら、より多い情
報、より高いスループット及びミニチュア化に対する要
求は、蛍光検出を用いることに向けてのシフトを引き起
こした。蛍光ベースの試薬は、スループット及び情報が
より高く、試薬及びテスト化合物の容量を低くしか要し
ない、より強力な複数パラメータッセイを生じさせるこ
とができる。また、蛍光は放射能ベースの方法よりも安
全であって安価である。
【０００８】染料及び蛍光試薬で処理した細胞のスクリ
ーニングは当該分野で良く知られている。レポーター分
子としての修飾された緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のよう
な蛍光蛋白質を生じさせるための、細胞の遺伝子工学に
関連した膨大な文献がある。野生型ＧＦＰのいくつかの
特性はＭｏｒｉｓｅら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１３
（１９７４），ｐ．２６５６−２６６２）及びＷａｒｄ
ら（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．３１
（１９８０），ｐ．６１１−６１５）によって開示され
ている。くらげＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａの
ＧＦＰは３９５ｎｍの励起最大及び５１０ｎｍの発光最
大を有し、蛍光活性に外因性因子を要しない。文献に開
示されたＧＦＰの使用は広範なものであり、細胞下オル
ガネラの可視化（Ｒｉｚｚｕｔｏら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ ５（１９９５），ｐ．６３５−６４２）、分
泌経路に沿っての蛋白質輸送の可視化（Ｋａｅｔｈｅｒ
及びＧｅｒｄｅｓ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３６９
（１９９５），ｐ．２６７−２７１）、植物細胞におけ
る発現（Ｈｕ及びＣｈｅｎｇ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ ３６９（１９９５），ｐ．３３１−３３４）及びＤ
ｒｏｓｏｐｈｉｌａ胚（Ｄａｖｉｓら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ １７０（１９９５），ｐ．７２６−７２９）
のためのツールとして、及び注目するもう１つの蛋白質
に融合したレポーター分子として（米国特許第５，４９
１，０８４号）遺伝子発現及び蛋白質の位置決定の研究
を含む（Ｃｈａｌｆｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３
（１９９４），ｐ．１２５０１−１２５０４）。同様
に、ＷＯ９６／２３８９８は、蛋白質キナーゼ活性化部
位を有するＧＦＰ構築体を利用することによる細胞内プ
ロセスに影響する生物学的活性物質の検出方法に関す
る。この特許及び本出願で引用する全ての他の特許は出
典明示してその全体を本明細書の一部とみなす。
【０００９】多数の文献が生物学的系におけるＧＦＰ蛋
白質に関連する。例えば、ＷＯ９６／０９５９８はＧＦ
Ｐ様蛋白質の発現を利用する注目の細胞を単離するため
のシステムを記載する。ＷＯ９６／２７６７５は植物に
おけるＧＦＰの発現を記載する。ＷＯ９５／２１１９１
は突然変異誘発を検出するための形質転換生物で発現さ
れた修飾ＧＦＰ蛋白質を記載する。米国特許第５，４０
１，６２９号及び第５，４３６，１２８号は細胞表面受
容体を発現し、細胞表面受容体の活性に応答する転写調
節エレメントを含むレポーター遺伝子構築体を含有する
組換え細胞を用いて細胞外信号の細胞内変換を検出し評
価するためのアッセイ及び蘇生物を記載する。
【００１０】数千もの多い化合物についてスクリーニン
グを行うことは、平行して、多くの化合物及びアッセイ
成分試薬の取り扱い及び加工を要する。標準的な高スル
ープットスクリーニング（「ＨＴＳ」）は、９６または
３８４ウェルを備えた標準的なマイクロタイタープレー
ト中のウェルのアレイに負荷されたいくつかのインジケ
ータ化合物と共に化合物及び生物学的試薬の混合物を使
用する。蛍光であれ発光であれ、各ウェルから測定され
た信号、光学密度または放射能は、ウェル中の全ての物
質からの信号を統合し、ウェル中の全ての分子の全集団
平均を与える。
【００１１】Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ（ＳＡＩＣ）（１３０ Ｆｉｆｔｈ Ａｖｅｎｕｅ，
Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ９８１０９）はイメージングプレ
ートリーダーを記載する。この系は９６ウェルプレート
の全面積をイメージするのにＣＣＤカメラを用いる。該
イメージを解析してウェル中の全ての物質につきウェル
当たりの全蛍光を計算する。
【００１２】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉ
ｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）は、低角レーザー
スキャニング照明及びマスクを用いて、標準９６ウェル
プレート中のウェルの底からほぼ２００ミクロン内の蛍
光を選択的に励起し、細胞単層をイメージする場合にバ
ックグラウンドを減少させるシステム（ＦＬＩＰＲ）を
記載する。このシステムはＣＣＤカメラを用いてプレー
トの底の全面積をイメージする。このシステムはウェル
の底の細胞単層に由来する信号を測定するが、測定され
た信号はウェルの領域にわたって平均され、従って、細
胞集団の平均応答の測定と見なされる。該イメージを解
析して、細胞ベースのアッセイにつきウェル当たりの全
蛍光を計算する。また、ＦＬＩＰＲのシステムのよう
に、細胞ベースのスクリーニングシステムに流体配送デ
バイスが一体化されて応答を開始させ、次いで、これは
マクロイメージングシステムを用いて全ウェル集団平均
応答として観察される。
【００１３】高スループットスクリーニングとは対照的
に、種々の高内容スクリーニング（「ＨＣＳ」）は、細
胞構成物の時間的−空間的ダイナミックス及びプロセス
についてのより詳細な情報に対する要求に応じるために
開発された。高内容スクリーニングは、細胞に一体化さ
れた特異的蛍光ベースの試薬に由来する多色蛍光情報の
抽出を自動化する。（Ｇｉｕｌｉａｎｏ及びＴａｙｌｏ
ｒ（１９９５），Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．７：４；Ｇｉｕｌｉａｎｏら（１９９５）Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ
ｔ．２４：４０５）。細胞は、空間的並びに時間的ダイ
ナミックスを測定できる光学系を用いて分析される。
（Ｆａｒｋａｓら，（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ．５５：７８５；Ｇｉｕｌｉａｎｏら（１９
９０））。Ｏｐｔｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｆ
ｏｒ ＢｉｏｌｏｇｙにおけるＢ．Ｈｅｒｍａｎ及び
Ｋ．Ｊａｃｏｂｓｏｎ編、ｐｐ．５４３−５５７。Ｗｉ
ｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｈａｈｎら，
（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５９：７３６；Ｗａｇｇ
ｏｎｅｒら，（１９９６）Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ ２
７：４９４）。該概念は標識された構成要素の活性につ
いての空間的及び時間的情報を有する「ウェル」として
の各細胞を処理するものである。
【００１４】細胞に適用された蛍光ベースの試薬を通じ
て今や接近可能な生化学及び分子情報のタイプは、イオ
ン濃度、膜ポテンシャル、特異的トランスローケーショ
ン、酵素活性、遺伝子発現、ならびに代謝産物、蛋白
質、脂質、炭水化物、及び核酸配列の存在、量及びパタ
ーンを含む（ＤｅＢｉａｓｉｏら（１９９６）Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．７：１２５９；Ｇｉｕｌｉａｎｏ
ら（１９９５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉ
ｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２４：４０５；Ｈｅｉｍ及び
Ｔｓｉｅｎ（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７
８）。
【００１５】高内容スクリーニングは、蛍光標識抗体、
生物学的リガンド及び／または拡散交雑プローブを用い
て固定された細胞で、あるいは多色蛍光インジケータ及
び「バイオセンサ」を用いて生きた細胞で行うことがで
きる。固定されたまたは生きた細胞のスクリーニングの
選択は必要とされる特異的細胞ベースのアッセイに依存
する。
【００１６】固定化細胞アッセイは最も簡単である。と
いうのは、マイクロタイタープレート様式でのまず生き
た細胞のアレイは種々の化合物及びテストすべき用量で
処理することができ、従って、細胞を固定化し、特異的
試薬で標識し、測定することができるからである。固定
化後に細胞の環境制御は必要ではない。空間的情報が獲
得されるが、１つの時点においてのみである。細胞に適
用することができる何千という抗体、リガンド及び核酸
交雑プローブの利用性は、これを、細胞ベースのスクリ
ーニングの多くのタイプに対し魅力的なアプローチとす
る。固定及び標識工程は自動化することができ、アッセ
イの効果的な処理を可能とする。
【００１７】生細胞アッセイは最も技巧的かつ強力であ
る。というのは所望の試薬を含有する。生細胞のアレイ
は時間及び空間にわたってスクリーニングすることがで
きるからである。細胞の環境制御（温度、湿度及び二酸
化炭素）が測定の間に必要である。というのは細胞の生
理学的健康を、多重蛍光測定のために経時的に維持しな
ければならないからである。細胞内での生化学及び分子
活性の変化を報告できる蛍光生理学的インジケータ及び
「バイオセンサ」の増大するリストがある。（Ｇｉｕｌ
ｉａｎｏら、（１９９５）Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａ
ｎｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＡｃｔｉｖｉｔｙにおけるＡ
ｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒ
ｕｃｔ．２４：４０５；Ｈａｈｎら、（１９９３）。
Ｗ．ｔ．Ｍａｓｏｎ編、ｐｐ．３４９−３５９，Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）。
【００１８】蛍光ベースの試薬の利用性及び使用は、固
定及び生細胞高内容スクリーニング双方の開発を進める
のを助けてきた。多色高内容情報を自動的に抽出するた
めの器機の進歩は、最近、ＨＴＣを自動ツールに発展さ
せるのを可能とした。Ｔａｙｌｏｒらによる論文、（Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ ８０（１９９
２），ｐ．３２２−３３５）はこれらの方法の多く及び
その適用を記載する。例えば、Ｐｒｏｆｆｉｔｔら（Ｃ
ｙｔｏｍｅｔｒｙ ２４：２０４−２１３（１９９
６））は、種々の組織培養プレート様式、特に９６−ウ
ェルマイクロタイタープレートにおいてイン・サイチュ
で相対的細胞数を定量するための半自動蛍光デジタルイ
メージングシステムを記載する。該システムは、モータ
ー化ステージ、ビデオカメラ、イメージインテンシファ
イアを備えたエピ蛍光倒立顕微鏡、及びＰＣ−ビジョン
デジタイザーを備えたマイクロコンピュータよりなる。
ターボパスカルソフトウェアは該ステージを制御し、プ
レートを走査してウェル当たり複数のイメージを採取す
る。該ソフトウェアはウェル当たりの全蛍光を計算し、
毎日のキャリブレーションを備え、種々の組織培養プレ
ート様式を容易に形成する。生細胞によって接種された
場合にのみ蛍光を発するデジタルイメージ及び試薬の閾
値を用いて、過剰の蛍光試薬を除去することなくバック
グラウンド蛍光を減少させる。
【００１９】走査型共焦点顕微鏡イメージング（Ｇｏら
（１９９７）ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ２４７：２１０−２１５；Ｇｏｌｄｍａｎら，
（１９９５）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ ２２１：３１１−３１９）及びマルチ
光子顕微鏡イメージング（Ｄｅｎｋら，（１９９０）
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：７３；Ｇｒａｔｔｏｎら、
（１９９４）Ｐｒｏｃ．ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｃｒｏｓｃ
ｏｐｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃ
ａ，ｐｐ．１５４−１５５）もまた、顕微鏡試料の高解
像イメージを獲得するためのよく確立された方法であ
る。これらの光学系の主要な利点は非常に狭い焦点深度
であり、これは、限定された軸方向度の特徴がバックグ
ラウンドに対して解像されることを可能とする。例え
ば、細胞表面の特徴から固有の細胞の内部細胞質特徴を
解像するのを可能とする。走査型マルチ光子イメージン
グは必要な高光子フラックスを達成するのに非常に短か
い持続のパルスレーザー系を必要とするので、蛍光の寿
命もまたこれらの系で測定することができ（Ｌａｋｏｗ
ｉｃｚら，（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２
０２：３１６−３３０；Ｇｅｒｒｉｔｔｓｅｎら（１９
９７），Ｊ．ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ７：１
１−１５））、異なる検出濃度のためのさらなる能力を
提供する。レーザーダイオードポンプドレーザーのよう
な小さくて信頼性がありかつ比較的安価なレーザー系
が、今日利用できて、マルチ光子共焦点顕微鏡がかなり
日常的に適用されるのを可能とする。
【００２０】集団における細胞の生物学的不均一性（Ｂ
ｒｉｇｈｔら（１９８９）．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ．１４１：４１０；Ｇｉｕｌｉａｎｏ，（１９９
６）Ｃｅｌｌ Ｍｏｔｉｌ．Ｃｙｔｏｓｋｅｌ．３５：
２３７）ならびに細胞内に存在する化学及び分子情報の
高空間的及び時間的頻度の組合せは、現存の全マイクロ
タイタープレートリーダーを用いて細胞の集団から高内
容情報を抽出するのを不可能とする。個々に分析される
細胞を用いる多色蛍光ベーススクリーニングのために設
計された現存の高内容スクリーニングプラットフォーム
はない。同様に、特に、マイクロタイタープレートで増
殖した細胞から、ＨＣＳ分析によって同定される細胞応
答を誘導する能力につき化合物を系統的にスクリーニン
グする目的で細胞のアレイへの自動流体配送を組み合わ
せる方法は現在利用できない。さらに、高スループット
ウェル間測定を組み合わせて、１つのアッセイで「ヒッ
ト」を同定し、続いてヒットとして同定されたウェルの
みの同一プレートで第２の高内容細胞間測定を行う方法
は当該分野に存在しない。
【００２１】本発明は、高スループットスクリーニング
（ＨＴＳ）及び高内容スクリーニング（ＨＣＳ）を組み
合わせるシステム、方法及びスクリーニングを提供し、
これは、多くの細胞スクリーニングフォーマットを蛍光
ベースの分子試薬及びコンピュータベースの特徴抽出、
データ解析及び自動化と組み合わせることによって標的
の有効化及び候補の最適化をかなり改良し、その結果、
データ収集、短縮されたサイクル時間、及び最後には、
有望な薬物候補のより速い評価の質及びスピードの増大
がもたらされる。また、本発明は、該方法をミニチュア
化し、それにより、各アッセイで必要な試薬及びテスト
化合物の容量を減少させつつ、増大したスループットを
可能とする。
【００２２】（発明の概要） 本発明は、イメージ獲得の間に細胞表面受容体蛋白質の
内部化を測定し解析するための十分に自動化された方法
を提供する。このアプローチは、注目する受容体の蛍光
標識及び刺激された細胞における受容体内部化の自動測
定を含む。
【００２３】本発明の１つの態様において、発光タグド
細胞表面受容体蛋白質を保有する細胞をテスト化合物で
処理し、該細胞から発光信号を得、該発光信号をデジタ
ルデータに変換し、次いで、該デジタルデータを利用し
て、該テスト化合物が発光標識細胞表面受容体蛋白質の
該細胞への内部化を誘導したか否かを決定することを含
む、細胞表面受容体蛋白質の内部化を誘導または阻害す
る化合物を同定するための方法、コンピュータ読み取り
可能な記憶媒体及びキットが提供される。
【００２４】受容体内部化に対するテスト化合物の刺激
的または抑制的効果の改良された空間分解能及び定量を
可能とする種々の好ましい実施の態様が提供される。１
つのかかる実施の態様において、膜結合受容体蛋白質の
細胞外及び細胞内ドメインが各々区別される発光マーカ
ーで標識されて、膜受容体の外部及び内部ドメインの相
対的細胞外利用性の測定を可能とする。
【００２５】本発明のもう１つの態様において、細胞表
面受容体蛋白質の内部化を誘導または阻害する化合物を
同定するための、組み合わせた高スループット及び高内
容方法及び関連コンピュータ読み取り可能な記憶媒体が
提供される。この態様において、細胞を注目する受容体
蛋白質に対するリガンドで処理し、これは、受容体蛋白
質の刺激に対して検出可能なシグナルを生じる。次い
で、該細胞をテスト化合物で処理し、次いで、高スルー
プットモードで走査して、リガンド−誘導検出可能信号
を呈する細胞を同定する。引き続いて、検出可能信号を
呈した細胞のみを高内容モードで走査して該テスト化合
物が、発光標識細胞表面受容体蛋白質の細胞への内部化
を誘導したか否かを決定する。
【００２６】（発明の詳細な説明） 全ての引用された特許、特許出願及び他の文献は、出典
明示してその全体を本明細書の一部とみなす。本明細書
で用いるように、以下の用語は特別の意味を要する。
【００２７】細胞ドメインのマーカー。特異的オルガネ
ラまたは分子を含めた特異的細胞構成要素に対して高い
親和性を有する発光プローブ。これらのプローブは、
「標識試薬」、「環境インジケータ」または「バイオセ
ンサ」として使用される、小さな発光分子または蛍光タ
グドマクロ分子のいずれかであり得る。
【００２８】標識試薬。標識試薬は限定されるものでは
ないが蛍光蛋白質アナログ及びバイオセンサを含めた発
光標識マクロ分子、緑色蛍光蛋白質とで形成されたもの
を含めた発光マクロ分子キメラ及びその突然変異体、生
理学的応答に関与する細胞抗原と反応する蛍光標識一次
または二次抗体、発光染色、染料及び他の小分子を含
む。
【００２９】細胞移動のマーカー。いくつかの細胞プロ
セスまたは生理学的応答の間に１の細胞ドメインからも
う１つのドメインに移動する発光タグドマクロ分子また
はオルガネラ。移動マーカーは細胞ドメインのマーカー
に対する位置を単に報告するか、あるいはそれは同様に
いくつかの生化学または分子活性を報告する「バイオセ
ンサ」でもあり得る。
【００３０】バイオセンサ。内部またはその表面で起こ
る環境変化を報告する、生物学的機能性ドメイン及び発
光プローブもしくは複数プローブよりなるマクロ分子。
これらの変化を検知し報告するように設計された発光標
識マクロ分子のクラスは「蛍光蛋白質バイオセンサ」と
言われてきた。バイオセンサの蛋白質成分は、高度に進
化した分子認識部位を提供する。活性部位の近くの蛋白
質成分に付着した蛍光分子は、環境変化を蛍光信号に変
換し、これは、本発明の細胞スキャニング走査系のよう
な適当な時間的かつ空間的分解能を備えた系を用いて検
出される。生細胞内の天然蛋白質活性の変調は可逆的で
あるので、かつ蛍光蛋白質バイオセンサは蛋白質活性の
可逆的変化を検知するように設計することができるの
で、これらのバイオセンサは実質的に再使用可能であ
る。
【００３１】病気関連配列（「ＤＡＳ」）。この用語
は、一次ＤＮＡ配列データのような標準的技術、減算交
雑及びＲＡＤＥのようなゲノミック方法、及び薬物候補
化合物のものであるような、逆遺伝学と組み合わせたプ
ロテオミック方法によって同定された核酸配列をいう。
該用語は、該配列が病気状態に関連するに過ぎないこと
を意味しない。
【００３２】高内容スクリーニング（ＨＣＳ）を用い
て、信号変換経路、並びに限定されるものではないがア
ポトーシス、細胞分裂、細胞接着、移行、エキソサイト
ーシス及び細胞間通信を含めた細胞機能のような複雑な
分子事象に対する薬物の効果を測定することができる。
多色蛍光は、複数の標的及び細胞プロセスが単一のスク
リーニングでアッセイされるのを可能とする。細胞応答
の交差−相関は、標的の有効化及びリード最適化に必要
な情報の価値を生じるであろう。
【００３３】本発明の１つの態様において、顕微鏡対物
レンズ、細胞を保持するための位置のアレイを備えたプ
レートを保持し、プレートを移動させて顕微鏡を対物レ
ンズと該位置とを整列させるための手段及び焦点合わせ
を行う方向にプレートを移動させるための手段を有する
のに適したＸＹステージを有する高倍率蛍光光学系；デ
ジタルカメラ；位置のアレイ中の細胞に励起光を向ける
ための光学手段及び細胞から発せられた蛍光をデジタル
カメラに向けるための手段を有する光源；及びデジタル
カメラからのデジタルデータを受領し加工するためのコ
ンピュータ手段を含み、ここに、該コンピュータ手段は
該カメラからのイメージを受け取るためのデジタルフレ
ームグラバー、使用者の会話用ディスプレイ及びアッセ
イ結果のディスプレイ、データ記憶及び記録用のデジタ
ル記憶媒体、及び結果の制御、獲得、加工及び表示のた
めの手段を含む細胞スクリーニングシステムが提供され
る。
【００３４】図１は細胞スキャニング系の好ましい実施
の態様の模式ダイアグラムである。カメラに対して１−
１００ｘの倍率を持つ標準対物レンズ、及び電源２を備
えた白色光源（例えば、１００Ｗ水銀アーク灯または７
５Ｗキセノンランプ）を用いるＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖ
ｅｒｔ倒立蛍光顕微鏡のような倒立蛍光顕微鏡１を用い
る。顕微鏡対物レンズにわたってＸＹ方向にプレート４
を移動させるためのＸＹステージ３がある。Ｚ軸フォー
カスドライブ５は焦点合わせのために該対物レンズをＺ
方向に動かす。ジョイスティック６はＸＹＺ方向のステ
ージの手動による移動を供する。高分解能デジタルカメ
ラ７はプレート上の各ウェルまたは位置からイメージを
獲得する。カメラ電源８、自動コントローラー９及び中
央処理ユニット１０がある。該ＰＣ１１はディスプレイ
１２を備え、関連ソフトウェアを有する。プリンター１
３はハードコピー記録の印刷を供する。
【００３５】図２は本発明の顕微鏡アセンブリ１の１つ
の実施の態様の模式図であり、ＸＹステージ３、Ｚ−軸
フォーカスドライブ５、ジョイスティック６、光源２及
び自動コントローラー９をより詳細に示す。コンピュー
タ１５及び顕微鏡１６へのケーブルは、各々が備えられ
る。加えて、図２は、ＸＹ方向にＸＹステージ３上で動
く９６ウェルマイクロタイタープレート１７を示す。光
源２からの光は、ＰＣ制御シャッター１８を通って、励
起フィルタ２０を備えたモーター化フィルタホイール１
９に通過する。光は、二色ミラー２６及び発光フィルタ
２７を有するフィルタキューブ２５に通過する。励起光
はマイクロタイタープレート１７中のウェルに対して色
ミラーを反映し、蛍光２８は二色ミラー２６及び発光フ
ィルタ２７を通ってデジタルカメラ７に通過する。
【００３６】図３は好ましいカメラアセンブリの模式図
を示す。露出制御のための自動シャッター及び及び電源
３１を含むデジタルカメラ７は顕微鏡アセンブリからの
蛍光２８を受け取る。デジタルケーブル３０はデジタル
信号をコンピュータに輸送する。
【００３７】前記した標準光学立体配置は、カメラ上の
検体の拡大されたイメージを直接的に生じさせるのに顕
微鏡光学を用いて、検体の高分解能イメージを捕獲す
る。この光学システムは通常「広視野」顕微鏡をいう。
顕微鏡分野における当業者であれば、検体の高分解能イ
メージが、限定されるものではないが、検体にわたって
走査された照明の焦点合わせされた点または線の標準的
走査型共焦点検出（Ｇｏら，１９９７，前掲）、及びマ
ルチ光子走査型共焦点顕微鏡（Ｄｅｎｋら，１９９０，
前掲）（双方はＣＣＤ検出器上にイメージを形成するこ
とができる）を含めた種々の他の光学系によって、ある
いは光電子倍増管のアナログ出力の同調デジタル化によ
って創製できることを認識するであろう。
【００３８】スクリーニング適用において、しばしば、
特定の細胞系または初代細胞系を用いて、それらの細胞
の特定の特徴を利用する必要がある。細胞培養の分野の
当業者であれば、いくつかの細胞系は接触阻止され、こ
れはそれが他の細胞に囲まれるようになった場合に増殖
を停止し、他方、他の細胞はその条件下で増殖し続け、
該細胞は文字通り積み重なって多層を形成することを認
識するであろう。かかる細胞系の例はＨＥＫ２９３（Ａ
ＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）系である。多層調整物中で
単一細胞層のイメージを獲得できる光学系は、層を形成
する傾向にある細胞系で使用するのに必要である。広視
野顕微鏡の視野の大きな深度は、細胞の多層を通じて突
出があるイメージを生じ、細胞下空間分布の分析を層形
成細胞において極端に困難とする。あるいは、共焦点顕
微鏡で達成することができる視野の非常に浅い深度（約
１ミクロン）は、高分解能での単一細胞層の区別を可能
とし、細胞下空間分布の測定を単純化する。同様に、共
焦点イメージングは、蛍光寿命イメージングのような検
出モードが必要とされる場合に好ましい。
【００３９】顕微鏡用の標準共焦点イメージングの出力
はデジタルイメージであり、これは、前記した他の細胞
スクリーニングシステムの実施の態様によって生じたイ
メージと同一のフォーマットに変換することができ、従
って、それらのイメージと正確に同様に処理することが
できる。この実施の態様における総じての制御、獲得及
び分析は実質的に同一である。共焦点顕微鏡システムの
光学立体配置は、イルミネータ及び検出器を除いて前記
したものと実質的に同一である。共焦点顕微鏡で必要と
される照明及び検出系は、本発明のそれのような標準顕
微鏡光学系に付着されるようにアクセサリーとして設定
されている（Ｚｅｉｓｓ，ドイツ）。従って、これらの
代替光学系は前記したように該系に容易に取り込むこと
ができる。
【００４０】図４は、出典明示してその全体を本明細書
の一部とみなす同時係属米国出願Ｓ／Ｎ ０８／８６
５，３４１に記載された、マイクロプレート４１上のマ
イクロウェル４０中に細胞アレイがある本発明の別の実
施の態様を示す。典型的には、マイクロプレートは、８
６ｍｍ×１２９ｍｍである標準９６ウェルマイクロタイ
タープレートと比較して２０ｍｍ×３０ｍｍである。マ
イクロプレート上の細胞の高密度アレイは、顕微鏡が、
高スループット用の画素当たり数ミクロンの低い分解能
でイメージされることを可能とし、顕微鏡上の特定の位
置が画素当たり０．５ミクロン未満のより高い分解能で
イメージされることを可能とする。これらの２つの分解
モードは該系の総スループットを改良するのを助ける。
【００４１】マイクロプレートチャンバー４２は化合物
の細胞への付加のためのミクロ流体配送系として働く。
マイクロプレートチャンバー４２中のマイクロプレート
４１はＸＹマイクロプレートリーダー４３中におかれ
る。デジタルデータは前記したように処理される。この
マイクロプレート系の小さなサイズはスループットを増
大させ、試薬容量を最小化し、速くかつ正確な細胞ベー
スの分析のため細胞の分布及び配置の制御を可能とす
る。処理されたデータはＰＣスクリーン１１上に表示で
き、バイオインフォーマティックスデータベース４４の
一部とできる。このデータベースは、本発明の方法を介
して得られたデータの記憶及び検索を可能とするのみな
らず、細胞に関連する外部データの獲得及び記憶を可能
とする。図５はソフトウェアの操作を説明するＰＣディ
スプレイである。
【００４２】別の実施の態様において、高スループット
系（ＨＴＳ）は、同一プラットフォーム上または２つの
別の（局所領域ネットワークを介して）電気的に結合し
た別のプラットフォーム上でＨＣＳと直接カップリング
される。二重モード光学系といわれる本発明のこの実施
の態様は、それをＨＴＳとカップリングさせることによ
ってＨＣＳのスループットを増加させる利点を有し、そ
れにより、カップリングされたＨＴＳでの応答を示すウ
ェルの小さなサブセット上のみのより遅い高分解能デー
タ獲得及び分析を要する。
【００４３】高スループット「プレート全体」リーダー
系は当該分野で良く知られており、通常、非常に多数の
化合物をスクリーニングするのに使用されるＨＴＳシス
テムの構成要素として使用される（Ｂｅｇｇｓ（１９９
７），Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎ
ｇ ２：７１−７８；Ｍａｃａｆｆｒｅｙら，（１９９
６）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ １：
１８７−１９０）。
【００４４】二重モード細胞ベースのスクリーニングの
１つの実施の態様において、高スループット獲得が１つ
のプラットフォーム上で起こり、高内容獲得が第２のプ
ラットフォーム上で起こる２プラットフォーム構造体が
提供される（図６）。処理は独立して各プラットフォー
ムで起こり、結果はネットワークインターフェイスにわ
たって通過し、あるいは単一のコントローラーを用いて
両プラットフォームからのデータを処理する。
【００４５】図６に示すように、例示的２プラットフォ
ーム二重モード光学系は、２光の工学器機、高スループ
ットプラットフォーム６０及び高内容プラットフォーム
６５よりなり、これは、マイクロプレート上のマイクロ
タイタープレートまたはマイクロウェルアレイで培養さ
れた細胞から発せられた蛍光信号を読み取り、電子的結
合６４を介して相互に連絡する。高スループットプラッ
トフォーム６０はプレート全体の全てのウェルを平行し
てまたは迅速に連続的に分析する。スクリーニングの分
野の当業者であれば、二重モード細胞ベースのスクリー
ニングシステムに取り込むことができる多くのかかる商
業的に入手可能な高スループットリーダー系があること
を認識するであろう（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒ
ｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，Ｃ
Ｔ）；Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ，Ｌｕｍｉｓｋａｎ（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌ
ｅ，ＣＡ）；Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ（Ｌａｂｓｙｓｔｅ
ｍｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））。前記した高内容プラ
ットフォーム６５はウェル間を走査し、ウェル内の個々
の細胞から収集された高分解能イメージデータを獲得し
分析する。
【００４６】システムのコンピュータ６２に存在するＨ
ＴＳソフトウェアは高スループット器機を制御し、結果
はモニター６１上に表示される。そのコンピュータシス
テム６７に存在するＨＣＳソフトウェアは高内容器機ハ
ードウェア６５、任意デバイス（例えば、プレートロー
ダー、環境チャンバー、流体分注器）を制御し、プレー
トからのデジタルイメージデータを解析し、モニター６
６に結果を表示し、測定されたデータを統合されたデー
タベース中で管理する。 また、２つのシステムは単一
のコンピュータを共有し、その場合、データを移動させ
るための局所領域ネットワークに対する必要性なくし
て、全てのデータはそのコンピュータで収集され、処理
され、表示される。当該分野でよく知られているよう
に、マイクロタイタープレートは、手動によりまたはロ
ボットプレート移動デバイスによって高スループット系
から高内容システム６３に移される（Ｂｅｇｇｓ（１９
９７），前掲；Ｍｃａｆｆｒｅｙ（１９９６），前
掲）。
【００４７】好ましい実施の態様において、二重モード
光学系は単一プラットフォームシステムを利用する（図
７）。それは、２つの別々の光学モジュール、ＨＣＳモ
ジュール２０３、及びＨＴＳモジュール２０９よりな
り、これは、ただ１つが一度に使用されてマイクロタイ
タープレート２０１からデータを収集するように独立的
にまたは集合的に移動することができる。マイクロタイ
タープレート２０１はモーター化Ｘ、Ｙステージに取り
付けられ、従って、それはＨＴＳまたはＨＣＳモードい
ずれかでのイメージング用に位置させることができる。
後記するようにＨＴＳイメージデータを収集し解析した
後、ＨＴＳ光学モジュール２０９を光学経路から離れる
ように移動させ、ＨＣＳ光学モジュール２０３を所定の
位置に移動させる。
【００４８】ＨＴＳ２０９用の光学モジュールは映写レ
ンズ２１４、励起波長フィルタ２１３及び二色ミラー２
１０よりなり、これらは通常のランプ系（示さず）から
の特定波長バンドでプレートの全底を照明するのに利用
される。蛍光発光は、センサー２１５と共にカメラ２１
６上でイメージを形成するレンズ２１２によって二色ミ
ラー２１０及び発光波長フィルタ２１１を通じて収集さ
れる。
【００４９】ＨＴＳ２０３用の光学モジュールは映写レ
ンズ２０８、励起波長フィルタ２０７及び二色ミラー２
０４よりなり、これらは顕微鏡対物レンズ２０２の逆開
口を照明するのに使用され、それにより、その対物レン
ズの視野は標準的な顕微鏡照明システム（図示せず）を
形成させる。蛍光発光は顕微鏡対物レンズ２０２によっ
て収集され、二色ミラー２０４及び発光波長フィルタ２
０５を通過し、チューブレンズ２０６によって焦点を結
び、これはセンサー２１５を備えた同カメラ２１６上で
イメージを形成する。
【００５０】本発明の別の実施の態様において、細胞ス
クリーニングシステムは、さらに、細胞スクリーニング
の方法の生細胞実施の態様で使用される流体配送デバイ
スを含む（後記参照）。図８は本発明の該システムで使
用される流体配送デバイスを例示する。それは単一モー
タードライブによって駆動された１２個のシリンジポン
プ７０１のバンクよりなる。各シリンジ７０２は各ウェ
ルに配送される容量に従ったサイズであり、典型的には
１及び１００μＬの間である。各シリンジは柔軟なチュ
ーブ７０３を介して、標準的なピペットチップ７０５を
許容するコネクターの同様のバンクに取り付けられる。
ピペットチップのバンクは、それらをマイクロタイター
プレート７０６に対して下降させ上昇させて各ウェルに
流体をデリバーできるようにドライブシステムに取り付
けられる。該プレートはＸ、Ｙステージ上に取り付けら
れ、データ収集目的で光学系７０７に対する移動を可能
とする。このセットアップは一組のピペットチップまた
は単一のピペットチップさえプレート上の全てのウェル
に試薬をデリバーさせるのを可能とする。シリンジポン
プのバンクを用いて流体を同時に１２個のウェルに、ま
たはチップのいくつかを除去することによってより少な
いウェルにデリバーすることができる。
【００５１】もう１つの態様において、本発明は、複数
細胞を含有する位置のアレイを備え、ここに、該細胞は
１以上の蛍光レポータ分子を含有し；細胞を含有する位
置の各々において複数細胞を走査して、細胞中の蛍光レ
ポータ分子からの蛍光信号が得られ；蛍光信号をデジタ
ルデータに変換し；次いで、該デジタルデータを利用し
て、細胞内の蛍光レポータ分子の分布、環境または活性
を決定することを特徴とする細胞を分析する方法を提供
する。
【００５２】細胞アレイ 特定の生物学的機能に関する活性につき非常に多数の化
合物をスクリーニングすることは、細胞及び試薬の平行
した取り扱いのために細胞のアレイを調整することを必
要とする。９ｍｍピッチで６ｍｍ直系ウェルを備えた、
８６ｍｍ×１２９ｍｍである標準９６ウェルマイクロタ
イタープレートが、現行の自動ローディング及びロボッ
ト取り扱いシステムでの適合性のため使用される。該マ
イクロプレートは、約５００ミクロンのピッチで寸法が
１００−２００ミクロンであるウェル位置を持ち、典型
的には２０ｍｍ×３０ｍｍである。マイクロプレートを
作成する方法は、出典明示してその全体を本明細書の一
部とみなす米国特許出願番号第０８／８６５，３４１に
記載されている。マイクロプレートは細胞が付着しない
物質でパターン化された、細胞が付着する物質の共平面
層、または同様にパターン化された物質のエッチングさ
れた三次元表面よりなることができる。以下の議論の目
的では、用語「ウェル」及び「マイクロウェル」は細胞
が付着し、その中に細胞がイメージされるいずれの構築
のアレイにおける位置をもいう。また、マイクロプレー
トはウェル間の空間に流体配送チャンネルを含むことが
できる。マイクロプレートのより小さなフォーマット
は、スキャニング操作で必要な調整及び全移動の間の試
薬、記憶及び取り扱いの量を最小化することによってシ
ステムの全効率を増大させる。加えて、マイクロプレー
トの全面積をより効果的にイメージして、本明細書で後
記するようにマイクロプレートリーダー用の操作の第２
のモードを可能とすることができる。
【００５３】蛍光レポータ分子 新しい薬物発見パラダイムの主要な構成要素は、細胞内
イオン、代謝産物、マクロ分子及びオルガネラの時間的
及び空間的分布、含有量及び活性を測定するのに使用さ
れる蛍光及び発光試薬の継続して増大するファミリーで
ある。これらの試薬のクラスは、生細胞及び固定細胞中
の分子の分布及び量を測定する標識試薬、時間及び空間
における信号変換事象を報告するための環境インジケー
タ、及び生細胞内で標的分子活性を測定するための蛍光
蛋白質バイオセンサを含む。単一細胞中でいくつかの試
薬を組み合わせるマルチパラメータプローチは薬物発見
のための強力な新しいツールである。
【００５４】本発明の方法は、特異的細胞構成要素に対
する蛍光または発光分子の高い親和性に基づく。特異的
構成要素に対する親和性は、イオン相互反応、共有結合
のような物理的力（これは、蛋白質ベースのクロモフォ
ア、フルオロフォア及びルミフォアでのキメラ融合を含
む）、並びに疎水性相互作用、電気的ポテンシャル、及
びある場合には細胞構成要素内の単純な捕獲によって支
配される。発光プローブは小分子、標識されたマクロ分
子または遺伝子工学により作成された蛋白質であり得る
が、緑色蛍光蛋白質キメラを含むがそれに限定されるも
のではない。
【００５５】当業者であれば、限定されるものではない
が、蛋白質、リン脂質及びＤＮＡ交雑プローブのような
蛍光標識生体分子を含めた、本発明で使用することがで
きる多様な蛍光レポータ分子を認識するであろう。同様
に、結合または会合の特定の化学的特性にて特異的に合
成された蛍光試薬が蛍光レポーター分子として使用され
てきた。（Ｂａｒａｋら，（１９９７），Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２７４９７−２７５００；Ｓｏ
ｕｔｈｗｉｃｋら，（１９９０），Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ
１１：４１８−４３０；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅ
ｌｌ ＢｉｏｌｏｇｙにおけるＴｓｉｅｎ（１９８
９），Ｖｏｌ．２９ Ｔａｙｌｏｒ及びＷａｎｇ編，ｐ
ｐ．１２７−１５６）。蛍光標識抗体は、細胞または組
織と同程度に複雑な分子の混合物中で単一の分子標的に
付着する特異性のその高い程度のため特に有用なレポー
ター分子である。
【００５６】発光プローブは生細胞内で合成できるか、
あるいは拡散、促進もしくは活性輸送、信号−配列−媒
介輸送、及びエンドサイトーシスもしくはピノサイトー
シス摂取を含めたいくつかの非機械的様式を介して細胞
に輸送することができる。当該分野でよく知られた機械
的大量負荷方法を用いて蛍光プローブを生細胞に負荷す
ることもできる（Ｂａｒｂｅｒら，（１９９６），Ｎｅ
ｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅＬｅｔｔｅｒｓ ２０７：１７−
２０； Ｂｒｉｇｈｔら、（１９９６），Ｃｙｔｏｍｅ
ｔｒｙ ２４：２２６−２３３；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙにおけるＭｃＮｅｉｌ（１９
８９），Ｖｏｌ．２９，Ｔａｙｌｏｒ及びＷａｎｇ編，
ｐｐ．１５３−１７３）。これらの方法はエレクトロポ
レーション及びスクレープ−ローディング、ビード−ロ
ーディング、インパクト−ローディング、シリンジ−ロ
ーディング、高張及び低張ローディングのような他の機
械的方法を含む。さらに、細胞を遺伝子工学により作成
して、従前に記載しているように注目する蛋白質にカッ
プリングした（ＧＦＰのような、レポーター分子を発現
させることができる（Ｃｈａｌｆｉｅ及びＰｒａｓｈｅ
ｒ米国特許第５，４９１，０８４；Ｃｕｂｉｔｔら，
（１９９５），Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０：４４８−４５５）。
【００５７】一旦細胞内に入ると、発光プローブは標的
ドメインとの特異的かつ高い親和性相互作用または信号
−配列−媒介輸送のような分子標的化の他のモードの結
果としてその標的ドメインに蓄積する。蛍光標識レポー
ター分子は、レポーターの位置、量及び化学的環境を測
定するのに有用である。例えば、レポーターが親油性膜
環境にあるかまたはより水性の環境にあるかを決定する
ことができる（Ｇｉｕｌｉａｎｏら，（１９９５），Ａ
ｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓａｎｄ Ｂ
ｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２４：
４０５−４３４；Ｇｉｕｌｉａｎｏ及びＴａｙｌｏｒ
（１９９５），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＮｅｕｒｏｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２７：１−１６）。レポーターのｐＨ環境を
測定することができる（Ｂｒｉｇｈｔら，（１９８
９），Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０４：１０１
９−１０３３；Ｇｉｕｌｉａｎｏら，（１９８７），Ａ
ｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６７：３６２−３７１；Ｔ
ｈｏｍａｓら，（１９７９），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ １８：２２１０−２２１８）。キレート化基を有す
るレポーターがＣａ＋＋のようなイオンに結合している
か否かを決定することができる（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｃｅｌｌ ＢｉｏｌｏｇｙにおけるＢｒｉｇｈｔら，
（１９８９），，Ｖｏｌ．３０，Ｔａｙｌｏｒ及びＷａ
ｎｇ編，ｐｐ．１５７−１９２；Ｓｈｉｍｏｕｒａら，
（１９８８），Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
（Ｔｏｋｙｏ）２５１：４０５−４１０；Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎＣｅｌｌ ＢｉｏｌｏｇｙにおけるＴｓｉｅｎ
（１９８９），Ｖｏｌ．３０，Ｔａｙｌｏｒ及びＷａｎ
ｇ編、ｐｐ．１２７−１５６）。
【００５８】さらに、生物内のある種の細胞タイプは、
他の細胞タイプで起こり得ない特異的に標識できる構成
要素を含むことができる。例えば、上皮細胞はしばしば
偏光膜構成要素を含有する。すなわち、これらの細胞は
原形質膜に沿ってマクロ分子を非対称に分布させる。結
合または支持組織細胞は、しばしば、その細胞タイプに
特異的な分子（例えば、ヘパリン、ヒスタミン、セロト
ニン等）が捕獲された顆粒を含有する。ほとんどの筋肉
組織細胞は筋形質小胞体、その機能が細胞質内のカルシ
ウムイオン濃度を調整すべき特殊化されたオルガネラを
含有する。多くの神経組織細胞は、神経ホルモンまたは
神経伝達物質が捕獲された分泌顆粒及び小胞を含有す
る。従って、蛍光分子は、特異的細胞内の特異的構成要
素のみならず、混合細胞タイプの集団内の特異的細胞を
も標識するように設計することができる。
【００５９】当業者であれば蛍光を測定するための非常
に多様な方法を認識するであろう。例えば、いくつかの
蛍光レポーター分子は励起または発光スペクトルの変化
を定義し、いくつかは共鳴エネルギー移行を呈し、ここ
に、１つの蛍光レポーターは蛍光を失い、他方第２のも
のは蛍光を獲得し、いくつかのものは蛍光の喪失（消
光）または出現を呈し、他方、いくつかは合理的な移動
を報告する（Ｇｉｕｌｉａｎｏら，（１９９５），Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｂ
ｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２４：４０５−４３
４；Ｇｉｕｌｉａｎｏら，（１９９５），Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２７：１−１
６）。
【００６０】細胞アレイのスキャニング 図９を参照し、実行すべきアッセイに基づいて選択され
るオペレーター指向パラメータ、試料内の蛍光信号の分
布に基づく細胞スクリーニングシステムによるデータ獲
得、及び会話形データ総括及び分析を含む好ましい実施
の態様が提供されて細胞を分析する。自動スキャンの開
始において、オペレーターは試料を記載し、使用される
べき生物学的標識及び求められる情報にマッチするフィ
ルタ設定及び蛍光チャンネルを特定し、次いで、試料の
鮮度に適合するようにカメラ設定を調整する情報１００
をエンターする。ある範囲の試料を取り扱う柔軟性のた
め、ソフトウェアは核及び細胞質を同定するのに使用さ
れる種々のパラメータ設定の選択、及び異なる蛍光試薬
の選択、形態または鮮度、及びウェル当たりに分析され
る細胞数に基づく注目細胞の同定を可能とする。これら
のパラメータは各自動的実行用の容易な検索のためシス
テムのデータベースに記憶される。システムの会話形細
胞同定モードは、分析すべき細胞のサイズ、形状及び強
度の範囲のような形態学的パラメータ制限の選択を単純
化する。使用者は、プレートのいずれのウェルをシステ
ムが走査するか、及びどれくらい多くの視野またはどれ
くらい多くの細胞を各ウェルで分析するかを特定する。
工程１０１で使用者によって選択されたセットアップモ
ードに応じて、システムはプレート１０２の「焦点発
見」に対するオートフォーカス手法を用いて走査すべき
プレートの領域を自動的にあらかじめ焦点合わせする
か、あるいは使用者は、走査すべき矩形領域を規定する
３つの「タグ」点を選択することによってスキャニング
領域を会話形で予め焦点合わせする１０３。次いで、最
小二乗適合「焦点平面モデル」をこれらのタグ点から計
算して、自動スキャンの間の各ウェルの焦点を見積も
る。各ウェルの焦点は、スキャンの間に焦点平面モデル
から内挿することによって見積もられる。
【００６１】自動スキャンの間に、ソフトウェアは、分
析される細胞の数、分析される電流、それらが獲得され
る各独立波長のイメージ、それが決定される各ウェルに
ついてのスクリーニングの結果を含めたスキャン状態を
動的に表示する。プレート４（図１）は曲がりくねった
スタイルで走査される。というのはソフトウェアはモー
タ化顕微鏡ＸＹステージ３を、ウェル間から９６−ウェ
ルプレートの各ウェル内の視野間に自動的に移動させ
る。プログラミング分野の当業者であれば２４、４８及
び３８４ウェルプレートのような他のミクロプレートフ
ォーマットのスキャニングのためにソフトウェアを適合
させるやり方を認識するであろう。プレート全体のスキ
ャンパターンならびに各ウェル内の視野のスキャンパタ
ーンをプログラムする。該システムはＺ軸焦点ドライブ
５を通じて自動焦点合わせ手法１０４にて試料焦点を調
整し（図９）、モーター化フィルタホイール１９を介し
てフィルタ選択を制御し、４つまでの異なる色（「チャ
ンネル」または「波長」）のイメージを獲得し分析す
る。
【００６２】自動焦点合わせ手法は典型的には各ウェル
における第１の視野につきユーザ選択頻度で要求され、
次いで、各ウェル内の４ないし５視野ごとに１回要求さ
れる。該自動焦点合わせ手法は、予め計算された平面焦
点モデルから内挿することによって出発Ｚ軸点を計算す
る。この設定点上または下のプログラム可能距離で開始
し、該手法は機械的Ｚ軸を多数の異なる位置を通じて移
動させ、各位置でイメージを獲得し、各イメージのコン
トラストを見積もる計算された焦点スコアの最大を見い
出す。最大焦点スコアを持つイメージのＺ位置は特定の
視野につき最良の焦点を決定する。当業者であれば、Ｃ
ｙｔｏｍｅｔｒｙ ５（１９８４）におけるＨａｒｍｓ
ら，２３６−２４３，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ６（１９８
５）におけるＧｒｏｅｎら，８１−９１，及びＣｙｔｏ
ｍｅｔｒｙ １２（１９９１）におけるＦｉｒｅｓｔｏ
ｎｅら，１９５−２０６に記載された自動フォーカシン
グアルゴリズムの変形としてこれを認識するであろう。
【００６３】イメージ獲得には、カメラの露光時間を、
各色素につき別々に調整して、各チャンネルからの高品
質イメージを保証する。ソフトウェア手法を使用者のオ
プションで要求して、いずれかのさらなる測定の前に波
長間の直線（Ｘ及びＹ）シフトを占めることによって波
長間の登録シフトにつき補正する。電子シャッター１８
を、試料のフォトブリーチングが最小に維持されるよう
に制御する。バックグラウンド遮光及び均一な照明は当
該分野で公知の方法を用いるソフトウェアによって補正
することができる（Ｂｒｉｇｈｔら，（１９８７），
Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０４：１０１９−１０３
３）。
【００６４】１つのチャンネルにおいて、適合閾値手法
を用いて細分化（「同定」）された一次マーカー１０５
（図９）（典型的には、ＤＡＰＩまたはＰＩ蛍光色素で
逆染色された細胞核）につきイメージを獲得する。適合
閾値手法１０６を用いて、バックグラウンドからの細胞
を分離するためにイメージの閾値を動的に選択する。蛍
光色素での細胞の染色は、マイクロタイタープレート試
料中での細胞を横切ってならびにマイクロタイタープレ
ートの各ウェル内で細胞の視野のイメージ内で未知の程
度変化し得る。この変化は試料調製及び／または細胞の
動的性質の結果として起こり得る。広範な閾値が完全な
イメージにつき計算されて、細胞をバックグラウンドか
ら分離し、視野間変化を説明する。これらの広範な技術
は当該分野で記載されているものの変形である（Ｃｏｍ
ｐｕｔｅｒ Ｖｉｓｉｏｎ，Ｇｒａｐｈｉｃｓ ａｎｄ
Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ３０（１９８
５）におけるＫｉｔｔｌｅｒら，１２５−１４７，ＩＥ
ＥＥ Ｔｒａｎｓ．Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｎ ａｎｄ
Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ（１９７８）におけるＲｉｄｌ
ｅｒら，６３０−６３２）。
【００６５】別の適合閾値方法は広範なイメージ閾値決
定とは対照的に局所領域閾値決定を利用する。局所領域
のイメージ分析は、良好な総細分化に至る。というの
は、細胞核（ならびに他の標識構成要素）の染色はイメ
ージを横切って変化し得るからである。この広範／局所
手法を用い、低下した分解能イメージ（２ないし４のフ
ァクターだけサイズが低下）をまず（適合閾値決定を用
いて）全体的に細分化してイメージにおける注目領域を
見いだす。次いで、これらの領域をガイドとして働かせ
て、十分な分解能の同一領域をより十分に分析する。次
いで、より局所化された閾値を（再度、適合閾値決定を
用いて）注目する各領域につき計算する。
【００６６】細分化手法の出力はバイナリーイメージで
あり、ここに、対象は白色であって、バックグラウンド
は黒色である。当該分野でマスクと呼ばれるこのバイナ
リーイメージを用いて、視野が対象１０７を含有するか
を決定する。該マスクは小斑点標識アルゴリズムで標識
し、それにより、各対象（または小斑点）はそれに帰属
されるユニークな数を有する。小斑点の領域及び形状の
ような形態学的特徴を用いて、人工物であるものからの
細胞であるような小斑点を区別する。使用者は、既知の
細胞の形態学的特徴においてタイプ分けすることによっ
て、あるいは会話形トレイニングユーフィリティーを用
いることによって形態学的選択基準を予め設定する。も
し注目する対象が視野で見いだされれば、全ての他のチ
ャンネル１０８につきイメージを獲得し、さもなければ
ステージを現行ウェル中で次の視野１０９に前進させ
る。注目する各対象はさらなる分析１１０のためにイメ
ージ中に入れる。ソフトウェアは、その形態学的特徴
（サイズ及び形状）を測定することによって、対象が有
効な細胞核１１１についての基準に適合するかを決定す
る。各有効細胞につき、ＸＹＺステージ位置を記録し、
細胞の小さなイメージを記憶し、特徴を測定する１１
２。
【００６７】本発明の細胞スキャニング方法を用いて、
多数の分析方法を適用することによって細胞試料で多く
の異なるアッセイを行って、同時に複数波長で特徴を測
定することができる。１つのかかるアッセイの例は以下
の測定を提供する： １．色１−４につき細胞各内の全蛍光強度 ２．色１についての細胞核の領域（一次マーカー） ３．色１についての細胞核の形状は３つの形状特徴によ
って記載される。
【００６８】ａ）周辺平方面積 ｂ）ボックス面積比率 ｃ）高さ長さ比率 ４．色１−４についての細胞核内の平均蛍光強度（すな
わち、＃１を＃２で割る） ５．色２−４についての細胞の細胞質（細胞質マスク）
の蛍光を表す核の外側のリングの全蛍光強度（図１０参
照） ６．細胞質マスクの面積 ７．色２−４についての細胞質マスクの平均蛍光強度
（すなわち、＃５を＃６で割る） ８．色２−４についての細胞核内の平均蛍光強度に対す
る細胞質マスクの平均蛍光強度の比率（すなわち、＃７
を＃４で割る） ９．色２−４についての細胞質マスクの平均蛍光強度及
び細胞核内の平均蛍光強度の差異（すなわち、＃７から
＃４を差し引く） １０．色２−４について細胞核内の蛍光ドメイン（スポ
ット、ドットまたは粒ともいう）の数 特徴１ないし４は、本発明のスクリーニングアッセイの
一般的特徴である。これらの工程は種々のイメージ分析
で共通して使用され、当該分野でよく知られている（Ｒ
ｕｓｓ（１９９２）Ｔｈｅ Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏｃｅｓ
ｓｉｎｇ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉ
ｎｃ．；Ｇｏｎｚａｌｅｓら，（１９８７），Ｄｉｇｉ
ｔａｌ Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．Ａｄｄｉ
ｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．
ｐｐ．３９１−４４８）。特徴５−９が特異的に開発さ
れて、細胞の局所細胞質領域内の細胞の蛍光分子の測定
及び細胞質から核への蛍光分子の移行（すなわち、移
動）の測定が供されている。これらの特徴（工程５−
９）は、核移動の阻害につきマイクロプレート中で細胞
を分析するのに使用される。例えば、転写ファクターの
核移動の阻害は、無傷細胞をスクリーニングする新規ア
プローチを提供する（他のタイプのスクリーニングの詳
細な説明を後記で掲げる）。具体的アルゴリズムは各細
胞の核領域（特徴４）−対−局所細胞質領域（特徴７）
中でプローブの量を測定する。これらの２つの細胞下区
画の間の差異の定量は、細胞質−核移動の尺度を供する
（特徴９）。
【００６９】特徴１０は、色２−４における核領域内の
ＤＮＡまたはＲＮＡのカウンティングで使用されるスク
リーニングを記載する。例えば、プローブは染色体−特
異的ＤＮＡ配列を同定するために商業的に入手可能であ
る（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈ
ｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ；Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｗｏｏｄｌａ
ｎｄｓ，ＴＸ；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ；Ｂｉｏ １０１，Ｉｎ
ｃ．，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）。細胞は性質が三次元的であ
り、顕微鏡下で高倍率で調べると、１つのプローブは焦
点内にあるが、もう１つのプローブは完全に焦点外であ
り得る。本発明の細胞スクリーニング方法は、多重焦点
平面からイメージを獲得することによって核中の三次元
プローブを提供する。ソフトウェアは小数工程でＺ軸モ
ータードライブを移動させ（図１）、ここに、該工程距
離は使用者が選択して、広い範囲の異なる核直径を占め
る。焦点工程の各々において、イメージが獲得される。
各イメージ中の各画素からの最大灰色レベル強度が見出
され、得られた最大映写イメージに記憶する。次いで、
最大映写イメージを用いてプローブをカウントする。前
記アルゴリズムは、相互に直接上下に積まれていないプ
ローブをカウントするのによく作動する。Ｚ−方向で相
互の頂部に積まれたプローブを説明するために、使用者
は獲得された焦点平面の各々中のプローブを分析するオ
プションを選択することができる。このモードにおい
て、スキャニングシステムは前記したように最大平面映
写アルゴリズムを行い、このイメージにおいて注目プロ
ーブ領域を検出し、次いで、さらに全ての焦点平面イメ
ージにおいてこれらの領域を分析する。
【００７０】細胞特徴１１２を測定した後（図９）、シ
ステムは、現行視野１１３にいずれかの未処理対象があ
るかをチェックする。もしいずれかの未処理対象があれ
ば、それは次の対象１１０を突き止め、それが有効細胞
核１１１についての基準を満たすかを決定し、特徴を測
定する。一旦全ての現行視野にある対象が処理されれ
ば、システムは現行プレートの分析が完了したかを決定
し１１４；もしそうでなければ、現行ウェル１１５にさ
らに細胞を見出す必要性を決定する。もし該必要性が存
在すれば、システムはＸＹＺステージを現行ウェル１０
９内の次の視野に前進させるか、あるいはステージをプ
レートの次のウェル１１６に前進させる。
【００７１】プレートスキャンが完了した後、システム
のイメージレビュー、データレビュー、及び要約レビュ
ー機構でイメージ及びデータを総括することができる。
スキャンからの全てのイメージ、データ及び設定は、後
の総括のため、あるいはネットワーク情報管理システム
でのインターフェーシングのために、システムのデータ
ベースに記録される。また、データを他の第三者統計パ
ッケージに送り出して、結果を表化し、他のレポートを
生成させることができる。使用者は会話形イメージレビ
ュー手法１１７でシステムによって解析された各細胞の
イメージ単独をレビューすることができる。使用者は、
会話形細胞間データレビュー手法１１８にて、会話形グ
ラフ、測定された特徴のデータスプレッドシート、及び
注目細胞の全ての蛍光チャンネルのイメージを用いて細
胞間ベースでデータをレビューすることができる。グラ
フプロッティング能力が提供され、ここに、データはヒ
ストグラム及び変動プロットのような会話形グラフを介
して解析することができる。使用者は会話形ウェル間デ
ータレビュー手法１１９にて、プレートの各ウェル内の
全ての細胞につき蓄積され要約された要約データをレビ
ューすることができる。グラフ及びイメージのハードコ
ピーは広範囲の標準的プリンターで印刷することができ
る。
【００７２】完全なスキャンの最終相として、測定され
た特徴の１以上の統計につきレポートを作成することが
できる。使用者は会話形レポート創製手法１２０を用い
るプレートの走査された領域につきウェル間ベースで要
約されたデータのグラフレポートを作成することができ
る。このレポートは、表及びグラフ様式のウェルによる
統計の要約及び試料についての同定情報を含む。レポー
トウィンドウは、オペレータが、後の検索のためにスキ
ャンにつき注釈をエンターすることを可能とする。複数
レポートを多くの統計につき作成し、１つのボタンに触
れて印刷することができる。レポートは印刷される前に
位置及びデータにつき予備レビューすることができる。
【００７３】該方法の前記引用実施の態様は、高内容ス
クリーニング（ＨＣＳ）モードと呼ばれる単一高分解能
モードで作動する。ＨＣＳモードは（１μｍのオーダー
で）ウェル内での十分な空間分解能を備えて、ウェル
内、ならびにウェル中の個々の細胞内での物質の分布を
規定する。そのモードでアクセス可能な高度な情報内容
は、所要の信号処理のスピード及び複雑性を犠牲として
出現する。
【００７４】別の実施の態様において、高スループット
システム（ＨＴＳ）は、同一プラットフォーム上または
（例えば、局所領域ネットワークを介して）電子的に結
合した２つの別のプラットフォーム上でＨＣＳとカップ
リングさせる。二重モード光学系という本発明のこの実
施の態様は、それをＨＴＳとカップリングさせ、それに
より、カップリングされたＨＴＳにおいて遅い応答を示
すウェルの小さなサブセットにのみ基づいた、より遅い
高分解能データ獲得及び解析しか要しないことによっ
て、ＨＣＳのスループットを増加させる利点を有する。
【００７５】高スループット「プレート全体」リーダー
システムは当該分野でよく知られており、通常は、非常
に多数の化合物をスクリーニングするのに使用されるＨ
ＴＳの構成要素として使用される（Ｂｅｇｇｓら，（１
９９７），前掲；ＭｃＣａｆｆｒｅｙら，（１９９
６），前掲）。本発明のＨＴＳは、十分な分解能にてプ
レート中の多くのまたは全てのウェルを同時に読み取っ
てウェル間ベースで測定を行うことによって、マイクロ
タイタープレートまたはマイクロウェルアレイで行われ
る。すなわち、各ウェル中の多くのまたは全ての細胞ま
たは多量の物質の全信号出力を平均することによって計
算がなされる。ＨＴＳにおいていくつかの規定された応
答を呈するウェル（「ヒット」）がシステムによって標
識される。次いで、同一マイクロタイタープレートまた
はマイクロウェルアレイ上で、ヒットとして同定された
各ウェルが前記したようにＨＣＳを介して測定される。
かくして、二重モードプロセスは以下のものを含む： １．マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルア
レイの多数のウェルの迅速な測定 ２．データを解釈してウェル間ベースで細胞中の蛍光標
識レポーター分子の全活性を決定し、「ヒット」（規定
された応答を呈するウェル）を同定 ３．各「ヒット」ウェル中で多数の細胞をイメージン
グ、及び、 ４．デジタルイメージデータを解釈して、個々の細胞中
の蛍光標識レポーター分子の分布、環境または活性（す
なわち、分子内測定）及び特定の生物学的機能について
テストするための細胞の分布を決定。
【００７６】二重モード処理の好ましい実施の態様にお
いて（図１１）、ラン３０１の開始時に、オペレータ
は、プレート及びその内容を記載する情報３０２をエン
ターし、フィルタ設定及び蛍光チャンネルを特定して、
使用すべき生物学的標識、求められる情報及びカメラ設
定を適合させ、試料の鮮度を適合させる。各自動ランに
ついての容易な検索のために、これらのパラメータをシ
ステムのデータベースに記憶する。ロボット負荷デバイ
スを制御することによって、手動または自動にて、マイ
クロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイを細
胞スクリーニンドシステム３０３に負荷する。該システ
ムによって光学環境チャンネル３０４を制御して、マイ
クロタイタープレートまたはマイクロウェルアレイ中の
生細胞を囲む空気における温度、湿度及びＣＯ２レベル
を維持する。光学流体デリバリデバイス３０５（図８参
照）をシステムによって制御して、スキャンの間に流体
をウェルに分注する。
【００７７】まず、プレート中の各ウェルからの信号を
獲得し解析することによって、マイクロタイタープレー
トまたはマイクロウェルアレイで高スループット処理３
０６を行う。高スループットモード３０７で行う処理は
図１２に示し、後記する。高スループットモードである
程度の選択された強度応答を呈するウェル（「ヒッ
ト」）がシステムによって同定される。システムは、ヒ
ットにつきテストする条件付操作３０８を行う。もしヒ
ットが見出されると、それらの特異的ヒットウェルは、
さらに、高内容（ミクロレベル）モード３０９で解析す
る。高内容モード３１２で行われる処理を図１３に示
す。次いで、システムはインフォーマティックスデータ
ベース３１１を更新し３１０、測定の結果はプレート上
にある。もし分析されるべきより多くのプレートがあれ
ば３１３、システムは次のプレートを負荷し３０３；さ
もなければ、プレートの解析は終了する３１４。
【００７８】以下の考察は図１２に示した高スループッ
トモードを記載する。システムの好ましい実施の態様で
ある単一プラットフォーム二重モードスクリーニングシ
ステムを記載する。当業者であれば、操作的に、二重プ
ラットフォームシステムは単にオプィクスを動かすより
むしろ２つの光学系の間のプレートを動かすことを認識
するであろう。一旦システムが設定され、プレートが負
荷されれば、システムはＨＴＳ獲得及び解析を開始する
４０１。ＨＴＳ光学モジュールは、二重モードシステム
でモーター化光学位置決定デバイス４０２を制御するこ
とによって選択される。１つの蛍光チャンネルにおい
て、プレート上の一次マーカーからのデータが獲得され
４０３、ウェルはマスキング手法を用いてプレートバッ
クグラウンドから分離される４０４。また、使用される
他の蛍光チャンネルにおいてイメージが獲得される４０
５。各ウェル４０６に対応する各イメージ中の領域が測
定される４０７。特定のウェルについての測定から計算
される特徴を、所定の閾値または強度応答と比較し４０
８、結果に基づいて、ウェルを「ヒット」として標識す
るか４０９、またはしない。ヒットとして標識されたウ
ェルの位置を、引き続いての高内容モード処理のために
記録する。もし処理すべき残存ウェルがあれば４１０、
プログラムは、全てのウェルが処理されるまで４１１、
ループバックされ４０６、システムは高スループットモ
ードから出る。
【００７９】ＨＴＳ解析に続き、図１３に規定した高内
容モード処理５０１を開始する。システムは、モーター
位置決定システムを制御することによってＨＣＳ光学モ
ジュール５０２を選択する。高スループットモードで同
定された各「ヒット」ウェルでは、ウェルのＸＹステー
ジ位置がメモリーまたはディスクから検索され、次い
で、ステージは選択されたステージ位置５０３まで移動
される。オートフォーカス手法５０４が、各ヒットウェ
ル中の第１視野で要求され、次いで、各ウェル内で５な
いし８視野毎に１回要求される。１つのチャンネルにお
いて、一次マーカー５０５（典型的には、ＤＡＰＩ、Ｈ
ｏｅｃｈｓｔまたはＰＩ蛍光色素で逆染色した細胞核）
でイメージが獲得される。次いで、適合閾値決定手法５
０６を用いてイメージが細分化される（核及び非核の領
域に分離される）。細分化手法の出力はバイナリーマス
クであり、ここに、対象は白色であって、バックグラウ
ンドは黒色である。当該分野でマスクとも呼ばれるこの
バイナリーイメージを用いて、視野が対象５０７を含む
かを決定する。マスクを小斑点標識アルゴリズムで標識
し、それにより、各対象（または小斑点）はそれに帰属
されたユニークな数を有する。もし対象が視野で見出さ
れれば、全ての他の活性チャンネル５０８につきイメー
ジが獲得され、さもなければ現行ウェルにおいてステー
ジを次の視野５１４に前進させる。各対象はさらなる分
析５０９のためにイメージ中に位置する。対象の面積及
び形状のような形態学的特徴を用いて、細胞核５１０で
ありそうな対象を選択し、人工物であると考えられるも
のは捨てる（それについてはさらなる処理は行わな
い）。各有効な核では、ＸＹＺステージ位置が記録さ
れ、細胞の小イメージが記憶され、アッセイ特異的特徴
が測定される５１１。次いで、システムは、いくつかの
分析方法を適用していくつかの波長の各々での特徴を測
定することによって細胞につき複数テストを行う。細胞
特徴を測定した後、システムは、現行視野５１２にいず
れかの未処理対象があるかをチェックする。もしいずれ
かの未処理対象があれば、それは次の対象５０９を突き
止め、有効な細胞核５１０についての基準に適合するか
を決定し、その特徴を測定する。現行視野中の全ての対
象を処理した後、システムは、現行ウェル５１３中でよ
り多くの細胞または視野が必要か否かを決定する。もし
現行ウェル中でより多くの細胞または視野を見出す必要
があれば、それはＸＹＺステージを現行ウェル５１５内
の次の視野に進行させる。さもなければ、システムは、
それが測定すべきいずれかの残存するヒットウェルを有
するか否かをチェックする５１５。 もし有すれば、そ
れは次のヒットウェル５０３まで進行させ、獲得及び解
析のもう１つのサイクルを通じて進み、さもなければ、
ＨＣＳモードは終了する５１６。
【００８０】本発明の別の実施の態様において、動的生
細胞スクリーニングの方法が提供される。本発明の既に
記載した実施の態様を用いて、時間の特定の時点、化学
的固定の時刻において細胞構成要素の空間的分布を特徴
付けする。それ自体、これらの実施の態様は、イメージ
獲得の逐次の性質、及びプレート上の全てのウェルを読
み取るのに要する時間の量のため、動的ベースのスクリ
ーニングを実行するのに限定された利用性しか有しな
い。例えば、プレートは全てのウェルを通じて読み取る
のに３０−６０分を要しかねないので、単に生細胞のプ
レートを調製し、次いで、一回を超えて全てのウェルを
通じて読み取ることによって非常に遅い動的プロセスし
か測定することができない。より速い動的プロセスは、
次のウェルに進行する前に各ウェルの複数読み取りを採
用することによって測定することができるが、最初及び
最後のウェルの間で経過した時間はあまりにも長く、速
い動的プロセスは最後のウェルに到達する前に完了する
であろう。
【００８１】本発明の動的生細胞拡張は、その空間的特
徴付けに代えて、あるいはそれに加えてその動態によっ
て生物学的プロセスが特徴付けされるスクリーニングの
設計及び使用を可能とする。多くの場合、試薬を特異的
ウェルに添加し、適当なタイミングにてそのウェルにつ
き複数測定を行うことによって生細胞における応答を測
定することができる。従って、本発明のこの動的生細胞
実施の態様は、ウェルを読み取る進行中の特定時間にお
いて試薬を各ウェルにデリバーするための、システムの
個々のウェルに流体をデリバーする装置を含む。それに
より、この実施の態様は、動的測定が、プレートの各ウ
ェルにつき数秒ないし数分の時間分解能で成されること
を可能とする。動的生細胞系の全効率を改良するには、
プレートの小区画からの反復データ収集を可能とするよ
うに獲得制御プログラムを修飾し、個々のウェルで要求
される時点間で他のウェルをシステムが読み取るのを可
能とする。
【００８２】図８は、本発明の生細胞実施の態様で使用
する流体配送デバイスの例を記載し、それは前記した。
この設定は、ピペットチップ７０５の１つの組または単
一のピペットチップでさえが、プレート上の全てのウェ
ルに試薬をデリバーするのを可能とする。シリンジポン
プ７０１のバンクを用いて、流体を１２個のウェルに同
時にデリバーし、あるいはチップ７０５のいくつかを除
去することによって、より少数のウェルにデリバーする
ことができる。従って、以下のようにチップの数及びス
キャンパターンを変更することによって、データ収集効
率を犠牲にすることなく、システムの時間的分解能を調
整することができる。典型的には、単一のウェルからの
データ収集及び解析は約５秒を要する。ウェルに移動
し、ウェル中で焦点合わせをするのは約５秒を要し、従
って、ウェルについての全サイクル時間は約１０秒であ
る。従って、単一のピペットチップを用いて流体を単一
のウェルにデリバーし、かつデータをそのウェルから反
復して収集するならば、約５秒の空間的分解能にて測定
を行うことができる。もし６個のピペットチップを用い
て流体を６個のウェルに同時にデリバーし、かつシステ
ムが全ての６つのウェルを反復して走査すれば、各スキ
ャンは６０秒を要し、それにより、時間的分解能を確立
する。８分毎にデータ収集を要するにすぎないより遅い
プロセスでは、流体デリバー相の間にプレートを移動さ
せ、次いで、プレートのその半分を反復的に走査するこ
とによって、流体をプレートの半分までデリバーするこ
とができる。従って、プレート上で走査すべき小区画の
サイズを調整することによって、獲得間に待機時間を挿
入する必要なくして時間的分解能を調整することができ
る。システムは継続的にデータを走査し獲得するので、
従って、プレートからの動的データ組を収集するための
全時間は、単に、プレートの単一スキャンを行う時間に
要する時点の数を掛け合わせたものである。典型的に
は、化合物の添加前の１つの時点及び添加に続いて２ま
たは３回の時点がスクリーニング目的で十分なはずであ
る。
【００８３】図１４は動的解析で使用される獲得手順を
示す。処理８０１の開始はシステムの機器構成であり、
その多くは標準的なＨＣＳ機器構成と同一である。加え
て、オペレータは、小区画サイズ、必要な時点の数及び
必要な時間増分のような、実行すべき動的解析に特異的
な情報８０２をエンターしなければならない。小区画
は、動的データを獲得するために反復して走査されるで
あろうウェルの群である。単一時間増分の間にシステム
が全小区画を１回スキャンでき、かくして待機回数を最
小化するように小区画のサイズを調整する。最適小区画
サイズは設定パラメータから計算し、要すればオペレー
タによって調整される。次いで、システムはプレートを
最初の小区画８０３まで、及びプレ刺激（時刻＝０）時
点を獲得するためにその小区画８０４中の最初のウェル
まで移動させる。各ウェルで行われる獲得手順は動的モ
ードで実行すべき特異的ＨＣＳに必要なものと正確に同
一である。図１５はその処理についてのフローチャート
の詳細を示す。スタート９０１及びリターン９０２の間
の工程の全ては図１３中の工程５０４−５１４として記
載されたものと同一である。
【００８４】小区画中の各ウェルを処理した後、システ
ムは、小区画中の全てのウェルが処理されたか８０６
（図１４）、及び全領域が処理されるまでの全てのウェ
ルを通じてのサイクルをチェックする。次いで、システ
ムはプレートを流体添加用の位置まで移動させ、流体の
全小区画８０７への流体システム配送を制御する。これ
は、プレート上のいくつかの列にわたる小区画で複数添
加を必要とし、システムはプレートを添加の間のＸ、Ｙ
ステージ上に移動させる。一旦流体が添加されれば、シ
ステムは小区画８０８中の第１ウェルまで移動させて、
時点の獲得を開始する。各ウェル８０９からデータが獲
得され、前記したように、システムは小区画８１０中の
全てのウェルを通って循環する。各々が小区画を通った
後、システムは、全ての時点が収集されたかをチェック
し８１１、もしそうでなければ、ようすれば８１２、休
止して８１３、必要な時間増分にて同調を保つ。さもな
ければ、システムは、プレート８１４上のさらなる小区
画につきチェックし、次の小区画８０３まで移動させる
か、あるいは終了する８１５。かくして、動的解析モー
ドは調べるべき動的応答に基づいて、スクリーニングす
るマイクロタイタープレートまたはマイクロウェルの小
区画のオペレータによる同定を含み、引き続いての小区
画でのデータ獲得に先立って小区画内でデータ獲得され
る。
【００８５】特異的スクリーニング 本発明のもう１つの態様において、細胞スクリーニング
システムが、特異的細胞構成要素の分布及び活性ならび
にプロセスを規定するための手順を実行するようにする
指令の組を含有するプログラムを含む機械読み取り可能
な記憶媒体が提供される。好ましい実施の態様におい
て、細胞スクリーニングシステムは、細胞を保持するの
に適したステージ及び該ステージを移動させるための手
段を備えた高倍率蛍光光学系、デジタルカメラ、該デジ
タルカメラからデジタルデータを受け取り処理するため
の光源、及び該デジタルカメラからのデジタルデータを
受け取り処理するためのコンピュータ手段を含む。本発
明のこの態様は、発光プローブ、光学イメージングシス
テム、及び本発明のパターン認識ソフトウェアを用い、
特異的細胞構成要素の分布及び活性ならびにプロセスを
規定するように細胞スクリーニングシステムに指令する
プログラムを含む。機械読み取り可能な記憶媒体の好ま
しい実施の態様は、細胞スクリーニングシステムが図
９、１１、１２、１３、１４、１５または２８に記載さ
れた手順を実行するようにさせる指令の組よりなるプロ
グラムを含む。もう１つの好ましい実施の態様は、細胞
スクリーニングシステムが特異的細胞構成要素の分布及
び活性ならびにプロセスを検出するための手順を実行さ
せるような指令の組よりなるプログラムを含む。最も好
ましい実施の態様において、細胞プロセスは、限定され
るものではないが、蛋白質の核移動、細胞肥大、アポト
ーシス、膜貫通受容体の内部化、及び蛋白質のプロテア
ーゼ−誘導移動を含む。
【００８６】以下の実施例は説明の目的のみを意図して
おり、添付の請求の範囲で定義される本発明の範囲を限
定するものと解釈されるべきものではない。
【００８７】以下の実施例で言及される種々の化学化合
物、試薬、色素及び抗体はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ），Ａｌｄｒｉｃｈ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋ
ｅｅ，ＷＩ），Ａｃｃｕｒａｔｅ ＣｈｅｍｉｃａｌＣ
ｏｍｐａｎｙ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ），Ｊａｃｋｓ
ｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌａｂｓ，ａｎｄ Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）のように入手源から商
業的に入手可能である。
【００８８】（実施例１） ＤＮＡ転写因子の核移動を誘導または阻害する化合物に
ついての自動スクリーニング いくつかの遺伝子の転写の調節は細胞質中の転写因子の
活性化を含み、その結果、その因子は核に輸送され、そ
こでそれは特定の遺伝子または複数遺伝子の転写を開始
することができる。転写因子分布のこの変化は、特定の
遺伝子または遺伝子の群の転写を阻害または誘導する化
合物を検出するための細胞ベースのスクリーニングシス
テム用のスクリーニングの基礎である。スクリーニング
の一般的記載に続いて具体的実施例をあげる。
【００８９】転写因子の分布は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３４
２３のようなＤＮＡ特異的フルオロフォアで核を標識
し、特異的蛍光抗体で転写因子を標識することによって
測定される。Ｈｏｅｃｈｓｔ標識核に対するオートフォ
ーカシングの後、２０×倍率で細胞ベーススクリーニン
グシステムにて核のイメージが獲得され、前記したよう
に、これを用いて、いくつかの任意の閾値決定方法のう
ちの１つによってマスクを作成する。該マスクによって
規定された領域の形態学的記述子を使用者が規定したパ
ラメータを比較し、有効な核マスクが同定され、転写因
子分布を抽出するための以下のアルゴリズムで用いる。
各有効な核マスクを侵食させてわずかにより小さな核領
域を規定する。次いで、元の核マスクを２工程で膨張さ
せて核のまわりのリング形状の領域を規定し、これは細
胞質領域を表す。これらの２つの領域の各々における平
均抗体蛍光を測定し、これらの平均間の差異をＮｕｃＣ
ｙｔ差異と定義する。核移動を測定する２つの例は後に
議論し、図１０Ａ−Ｊに示す。図１０Ａは青色フルオロ
フォアで標識されたその核２００及び緑色フルオロフォ
アで標識された細胞質２０１を持つ未刺激細胞を示す。
図１０Ｂは細胞ベースのスクリーニングシステムによっ
て誘導された核マスク２０２を示す。図１０Ｃは緑色波
長でイメージした未刺激細胞の細胞質２０３を示す。図
１０Ｄは、核マスク２０２が一旦侵食（還元）されて、
最小細胞質分布を持つ核サンプリング領域２０４を規定
することを示す。核境界２０２を数回膨張（拡大）して
２−３画素幅であるリングを形成させ、これを用いて同
一細胞につき細胞質サンプリング領域２０５を規定す
る。図１０Ｅは、さらに、核サンプリング領域２０４及
び細胞質サンプリング領域２０５を示す側面図を例示す
る。これらの２つのサンプリング領域を用い、細胞間ベ
ースに基づく細胞ベースのスクリーニングシステムによ
って核移動に関するデータを自動的に分析することがで
きる。図１０Ｆ−Ｊは刺激された細胞における核移動を
示す戦略を示す。図１０Ｆは青色フルオロフォアで標識
したその核２０６及び緑色フルオロフォアで標識した細
胞質２０７中の転写因子を持つ刺激細胞を示す。図１０
Ｇ中の核マスク２０８は細胞ベースのスクリーニングシ
ステムによって誘導される。図１０Ｈは緑色波長でイメ
ージされた刺激細胞の細胞質２０９を示す。図１０Ｉは
刺激細胞の核サンプリング領域２１１及び細胞質サンプ
リング領域２１２を示す。図１０Ｊは、さらに、核サン
プリング領域２１１及び細胞質サンプリング領域２１２
を示す側面図を例示する。
【００９０】この方法の特異的適用はスクリーニングと
してのこの方法を有効化するのに用いられた。ヒト細胞
系を９６ウェルマイクロタイタープレートで平板培養し
た。ウェルのいくつかの列をアゴニスト（特異的核転写
因子の公知のインデューサー）で力価測定した。次い
で、転写因子及びＨｏｅｃｈｓｔ３３４２３に対するフ
ルオレセイン標識抗体での標準的な方法によって細胞を
固定し染色した。細胞ベースのスクリーニングシステム
を用いてこのプレートからのイメージを獲得し分析し、
図１６に示すように、ＮｕｃＣｙｔ差異はウェルに添加
されたアゴニストの量と強く相関することが判明した。
第２の実験において、アゴニストについての受容体に対
するアンタゴニストをアゴニストの存在下で力価測定
し、転写因子のアゴニスト−誘導移動が徐々に阻害され
た。図１７に示すように、ＮｕｃＣｙｔ差異は移動のこ
の阻害と強く相関することが判明した。
【００９１】さらなる実験は、ＮｕｃＣｙｔ差異が広い
範囲の細胞密度及び試薬濃度にわたって一致した結果を
与え、従って、これは特異的核移動活性につき化合物ラ
イブラリをスクリーニングするのに日常的に使用できる
ことを示した。さらに、同方法は生細胞及び固定細胞に
おいて他の転写因子またはＧＦＰ−転写因子キメラに対
する抗体で用いて、この及び他の遺伝子の転写の調節に
対する効果をスクリーニングすることができる。
【００９２】図１８は実施例１に従って得られたデータ
のＰＣスクリーンでの代表的表示である。グラフ１ １
８０は核サンプリング領域及び細胞質サンプリング領域
における平均抗体蛍光間の差異をプロットする（Ｎｕｃ
Ｃｙｔ差異−対−ウェル＃）。グラフ２ １８１は核サ
ンプリング領域における抗体の平均蛍光をプロットする
（ＮＰ１平均−対−ウェル＃）。グラフ３ １８２は細
胞質サンプリング領域における平均抗体蛍光をプロット
する（ＬＩＰ１平均−対−ウェル＃）。当該ソフトウェ
アは各細胞からのデータの表示を可能とする。例えば、
図１８は細胞＃２６についてのスクリーンディスプレイ
１８３、核イメージ１８４及び蛍光抗体イメージ１８５
を示す。
【００９３】図１８のグラフ１ １８０で言及したＮｕ
ｃＣｙｔ差異は平均細胞質プローブ（蛍光レポータ分
子）強度及び平均核プローブ（蛍光レポータ分子）強度
の間の差異である。図１８のグラフ２ １８１で言及し
たＮＰ１平均は核サンプリング領域内の細胞質プローブ
（蛍光レポータ分子）強度の平均である。図１８のグラ
フ３ １８２で言及したＬｉＰ１平均は細胞質サンプリ
ング領域内の平均プローブ（蛍光レポータ分子）強度で
ある。
【００９４】（実施例２） 心臓筋細胞における肥大を誘導または阻害する化合物に
ついての自動スクリーニング 心臓筋細胞における肥大は遺伝子発現における改変のカ
スケードに関連付けられ、細胞サイズの改変によって細
胞培養で特徴付けることができ、これはカバーグラス上
で増殖する接着性細胞で明瞭に目に見える。スクリーン
は以下の戦略を用いて実行される。９６ウェルプレート
で培養した筋細胞系ＱＭ７（ウズラ筋肉クローン７；Ａ
ＴＣＣ ＣＲＬ−１９６２）を種々の化合物で処理し、
次いで、固定し、細胞表面マーカーに対する蛍光抗体及
びＨｏｅｃｈｓｔのようなＤＮＡ標識で標識することが
できる。Ｈｏｅｃｈｓｔ標識核につき焦点合わせした
後、２つのイメージを獲得する（Ｈｏｅｃｈｓｔ標識核
の１つ及び蛍光抗体の１つ）。マスクを作成するために
閾値決定し、次いで、マスクの形態学的記述子を使用者
が規定した記述子値と比較することによって核を同定す
る。次いで、蛍光抗体イメージ中の同一領域についての
局所動的市来操作によって、それらの領域における細胞
の限界を規定する。侵食及び膨張の手順を用いて、わず
かに触れる細胞を分離し、形態学的記述子の第２の組み
を用いて、単一細胞を同定する。個々の細胞の領域を表
化して、正常及び肥大細胞からのサイズデータとの比較
のために細胞サイズの分布を規定する。加えて、主要筋
肉蛋白質アクチンまたはミオシンのような特定の細胞蛋
白質に対する第２の蛍光抗体を含ませることができる。
第２の抗体のイメージを獲得し、後のレビューのため
に、前記イメージに関して記憶して、肥大細胞における
これらの蛋白質の分布の類似性を同定するか、あるいは
アルゴリズムを開発して、これらのイメージにおける標
識蛋白質の分布を自動的に解析する。
【００９５】（実施例３） 受容体内部化を誘導または阻害する化合物についての自
動化したスクリーン Ｇ−蛋白質がカップリングした受容体 Ｇ−蛋白質がカップリングした受容体（ＧＰＣＲｓ）
は、ヘテロトリマーＧ−蛋白質とのその相互作用を介し
て細胞外環境からの信号を細胞質に伝達する７つの膜貫
通ドメイン細胞表面受容体の大きなクラスである。リガ
ンド結合によるこれらの受容体の活性化は関連Ｇ−蛋白
質についてのＧＴＰに代えてのＧＤＰの交換を促進し、
その結果、Ｇ−蛋白質が活性なＣα−ＧＴＰ及びＧβγ
サブユニットに解離する。これらのサブユニットとその
エフェクターとの相互作用は、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）
及びイノシトール三リン酸（ＩＰ３）の生産、ＣＡ＋＋
動員、及び種々のキナーゼの活性化のような細胞中の二
次信号のカスケードを刺激する。限定するものではない
が、匂い、味、光の認識、血圧の制御、神経伝達、内分
泌及び外分泌機能、走化性、エキソサイトーシス、胚形
成、発生、細胞増殖及び分化、及び癌形成を含めた広い
範囲の生物学的機能がＧＰＣＲｓと関連づけられる。従
って、ＧＰＣＲｓは種々の治療ユニットのための主要な
潜在的標的となった。
【００９６】ＧＰＣＲｓは原形質膜にわたり、未刺激細
胞において細胞表面からエンドソームへの比較的遅い速
度のエキソサイトーシスを受ける。メカニズム的にはあ
まりよく理解できないが、アゴニストの存在が受容体内
部化の速度を劇的に増加させることが知られている。エ
ンドソームに一旦内部化されれば、ＧＰＣＲｓは原形質
膜にリサイクルして戻されるか、あるいは分解のために
リソソームに標的化される。ＧＰＣＲｓの隔離の重要性
は未だ十分には理解されていない。受容体内部化は、継
続した刺激の存在下で二次メッセンジャーを生じる受容
体の能力の減少として示される脱感作（機能的応答の喪
失）で役割を演じるらしい。しかしながら、表面からの
受容体の喪失の速度は通常はあまりにも遅くて脱感作の
迅速な速度を説明できない（Ｔｏｂｉｎ，Ａ．Ｂ．ら，
（１９９２）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４２：１０
４２−１０４８）、及び２つのプロセスがカップリング
されていないことが示されている例がある（Ｂａｕｍｇ
ｏｌｄ，Ｊ．ら，（１９８９）Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａ
ｃｏｌｏｇｙ ２８：１２５３−１２６１；Ｋａｎｂ
ｅ，Ｓ．ら，（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ
ａｃｏｌ．４０：１００５−１０１４）。
【００９７】受容体のエンドサイトーシスは再感作（刺
激に応答して二次メッセンジャーを生じる細胞の能力の
再確立）に関与できるらしい。β２−アドレナリン作動
性受容体（β２−ＡＲ）につき、隔離欠損突然変異体な
らびに隔離をブロックする剤で処理した受容体は再感作
しないことが示されている（Ｙｕ，Ｓ．Ｓ．ら（１９９
３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１）：３３７−
３４１；Ｂａｒａｋ，Ｌ．Ｓ．ら（１９９４）Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（４）：２７９０−２７９
５）。β２ＡＲについては、アゴニスト刺激の結果、プ
ロテインキナーゼＡ及びβ２−アドレナリン作動性受容
体キナーゼ（β−ＡＲＫ）による受容体リン酸化がもた
らされる。従って、受容体に対するβ−アレスチンの漸
増及び結合の結果としてそのＧ−蛋白質からの受容体の
未カップリングがあり、クラスリン−コートしたピット
を介する受容体の内部化が開始される。酸性エンドソー
ムｐＨはホスファターゼの活性に好都合であり、かくし
て、受容体の脱リン酸化を増強し（Ｋｒｕｅｇｅｒ，
Ｋ．Ｍ．ら，（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
７２（１）：５−８）、及び原形質膜へリサイクルする
のに利用できる受容体をＧ−蛋白質と再会合させる。し
かしながら、Ｍ４ムスカリン作動性受容体のような他の
受容体の再感作はエンドサイトーシスによって支援され
ることが示されている（Ｂｏｇａｔｅｋｅｗｉｔｓｃ
ｈ，Ｇ．Ｓ．ら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏ
ｌ．５０：４２４−４２９）。受容体内部化の機能的重
要性が受容体クラスの間で変化し得るという事実にもか
かわらず、内部化が受容体の活性化及び機能の経路にお
いて重要な工程であることは依然として明らかである。
【００９８】ＧＰＣＲｓに関与する細胞プロセスの基本
的な重要性はそれらを薬物スクリーニングのための重要
な標的とする。ＧＰＣＲ−リガンド相互作用及び受容体
内部化をモニターする当該分野の技術水準は、単一事象
（例えば、受容体−リガンド相互作用または原形質膜か
らの受容体の喪失）の測定に限定される。現在の手法
は、全細胞または単離された膜画分への（通常は放射能
標識された）標識リガンドの結合（ＷＯ／９７／０４２
１４；ｖｏｎ Ｚａｓｔｒｏｗ及びＫｏｂｉｌｋａ，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１８４４８−１８４
５２（１９９４）；Ｋｏｃｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７３：１３６５２−１３６５７（１９９８）；Ｔ
ｉｂｅｒｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３７
７１−３７７８（１９９６））、遠心を介して解像され
た細胞下画分への種々のマーカと共に受容体の同時移動
（Ｓｅｉｂｏｌｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
３：７６３７−７６４２（１９９８）；Ｓｔｅｆａｎ
ら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．９：８８５−８９９
（１９９８））、固定細胞における受容体への蛍光標識
リガンドの結合の可視化（Ｔａｒａｓｏｖａら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１４８１７−１４８２４
（１９９７））、受容体を同定するための（直接的また
はエピトープタグへの）抗体標識（ｖｏｎ Ｚａｓｔｒ
ｏｗ及びＫｏｂｉｌｋａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６９：１８４４８−１８４５２（１９９４）；Ｓｅｇｒ
ｅｄｏら，（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６
８：２３９５−２４０４；Ｋｒｕｅｇｅｒら，（１９９
７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１）：５−８；
Ｔｉｂｅｒｉら，（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７１（７）：３７７１−３７７８））の測定を含
む。より最近では、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）−受容体
融合が用いられており、これは生細胞におけるＧＰＣＲ
受容体トラフィッキングの可視化を可能とする（Ｋａｌ
ｌａｌ，Ｌ．ら，（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７３（１）：３２２−３２８；Ｔａｒａｓｏｖ
ａ，Ｎ．Ｉ．ら，（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７２（２３）：１４８１７−１４８２４）。しか
しながら、これは、三次元情報を得て、受容体が内部化
されるか、あるいは原形質膜の面中に単に移動したかを
区別するのに共焦点イメージングを必要とする。ＧＰＣ
Ｒ、それらのリガンド、及びそれらの活性を変調する化
合物の同定用の方法も開示されている（ＷＯ９８／１３
３５３及びＷＯ９７／４８８２０）。しかしながら、こ
れらの方法は、受容体へのリガンドの結合及びレポータ
遺伝子の活性化によって間接的にＧ−蛋白質活性化を検
出する。いずれの方法も受容体を直接標識したり、ある
いは受容体活性化の表示として受容体の内部化を直接測
定しない。
【００９９】現在のアプローチは受容体機能の情報及び
その測定手段を提供してきたが、受容体活性化の尺度と
して高い空間的及び時間的分解能を持ってリガンド−誘
導受容体内部化を直接的に測定する方法に対する要求が
当該分野に依然としてある。
【０１００】従って、受容体内部化を測定することに対
する新規なアプローチを本明細書中で記載するが、これ
は適当な自動化及びスループットをもって単一工程での
受容体内部化の測定を可能とする。このアプローチは、
ＧＰＣＲの蛍光標識及び刺激細胞でのＧＰＣＲ内部化の
自動測定を含む。本明細書に記載する別の新規アプロー
チは、細胞内ドメインを特異的に標識するための受容体
のカルボキシル末端のＧＦＰまたはルシフェラーゼのよ
うな分子ベースのクロモフォアに加えて、その細胞外ド
メインを区別して標識するための受容体のアミノ末端に
特異的な標識を含む二重標識受容体を含む。かかるキメ
ラ蛋白質−発現ＤＮＡ構築体の構築のための方法は当該
分野においてよく知られている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ），Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編，１９９
１．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ，ＣＡ）；ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄ
ｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ （Ｉｎｎｉｓら１９９０ Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；Ｇｅｎ
ｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１０９−１２８，Ｅ．
Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編，Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓ
ｓ Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）。
【０１０１】２つの標識の蛍光強度の比率は未刺激及び
刺激細胞において作成される。受容体のアミノ末端は標
識するために利用できるに過ぎないが、他方受容体は原
形質膜に挿入されるので、未浸透化細胞における２つの
標識の比率を用いて受容体の内部化の程度を測定するこ
とができる。現在、膜受容体の外部及び内部ドメインの
相対的細胞外利用性を同時に測定する既知の技術はな
い。
【０１０２】ＧＰＣＲｓのモジュレータのためのスクリ
ーニングの好ましい実施の態様において、生細胞は正常
もしくは形質転換細胞の連続系から得られ、あるいは動
物から直接的に得られた初代正常もしくは形質転換細胞
から得られる。受容体が機能を保持するように、そのア
ミノもしくはカルボキシル末端においてまたは内部にお
いて分子ベースのクロモフォアに融合した注目ＧＰＣＲ
を発現するＤＮＡ構築体（プラスミドまたはウイルスベ
ースのいずれか）で適当な細胞を一過的または安定して
形質移入することができる。有用な分子ベースのクロモ
フォアの例は、限定されるものではないが、ＧＦＰ及び
その種々の突然変異体のいずれかを含む（Ｈｅｉｍ及び
Ｔｓｉｅｎ（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ ６：１７８−１８２；Ｚｈａｎｇら（１９９６）Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２
２７：７０７−７１１）。加えて、ルシフェラーゼ及び
その突然変異体のいずれも使用することができるであろ
う。これは新規な標識技術であろう。と言うのは、現在
までのこの分子ベースのクロモフォアの使用の例は遺伝
子活性の受容体Ｙａｎｇら，（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（１７）：１０７６３−１０７７
０；Ｐｅｎｇら，（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７３（２７）：１７２８６−１７２９５；Ｂａｌ
ｄａｒｉら，（１９９８）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ２
６（１）：１−５））及びバイオセンサの構築（Ｃａｍ
ｐｂｅｌｌ及びＰａｔｅｌ（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｊ．２１６：１８５−１９４；Ｓａｌａ−Ｎｅｗｂ
ｙ及びＣａｍｐｂｅｌｌ（１９９２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔ
ｔ．３０７：２４１−２４４；Ｊｅｎｋｉｎｓら，（１
９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．１８：
４６３−４６４としての使用を含むが、特定の蛋白質標
的をマークするためのキメラとしての使用は含まないか
らである。ＧＰＣＲ−発光蛋白質融合の発現は構成的
（限定されるものではながＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、
アクチン、ＥＦを含めた種々のプロモーターのうちのい
ずれかによって駆動）であるかまたは誘導性であり得る
（限定されるものではないが、テトラサイクリン、エク
ジソン、ステロイド−反応性を含めた多数の誘導性プロ
モータのいずれかによって駆動）。
【０１０３】別法として、細胞は、小ペプチドまたはエ
ピトープタグに融合した注目ＧＰＣＲを発現するＤＮＡ
構築体（プラスミドまたはウイルスベースのいずれか）
で一過的または安定して形質移入される。エピトープタ
グは、受容体が依然として機能的であるようにアミノも
しくはカルボキシル末端、または内部に融合させること
ができるか、あるいは別法として、ＧＰＣＲは２つの区
別されるエピトープタグで標識することができ、１つは
ＧＰＣＲの各端部に融合される。エピトープタグのいく
つかの例は、限定されるものではないが、ＦＬＡＧ（Ｓ
ｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍ
Ｏ）、ｍｙｃ（９Ｅ１０）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃ
ａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ），６−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ；Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、及
びＨＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む。ＧＰＣＲ融合の発現は
構成的または誘導的であり得る。
【０１０４】もう１つの実施の態様において、細胞は、
そのアミノ末端のエピトープタグ及びそのカルボキシル
末端の分子ベースクロモフォアに融合した注目ＧＰＣＲ
を発現するＤＮＡ構築体（プラスミドまたはウイルスベ
ースのいずれか）で一過的または安定して形質移入され
る。別法として、ＧＰＣＲはそのカルボキシル末端のエ
ピトープタグ及びそのアミノ末端の分子ベースのクロモ
フォアに融合させることができる。ＧＰＣＲ融合の発現
は構成的または誘導性であるあり得る。
【０１０５】次いで、適当な細胞を処理及び解析用のア
レイにパターン化する。これらのアレイは９６、３８
４、１５３６またはそれ以上の個々のウェルを含む複数
ウェルプレートであり得る。該細胞はＣｅｌｌＣｈｉｐ
ＴＭ Ｓｙｓｔｅｍ（米国特許出願番号第０８，８６
５，３４１号）を用いて「実質的ウェル」のマイクロア
レイに配置することもできる。これらのマイクロアレイ
は同一の細胞タイプであり得るが、区別される化合物の
組合せで処理されるか、別法として、該マイクロアレイ
は１以上の化合物で処理した細胞タイプの組合せであり
得る。
【０１０６】一旦選択された細胞がウェルまたはマイク
ロアレイにパターン化されると、それらを薬物またはリ
ガンドの溶液で処理して受容体内部化を阻害または刺激
する。流体配送システムが手動、ロボット、またはＣｅ
ｌｌＣｈｉｐ Ｓｙｓｔｅｍのマイクロ流体（米国特許
出願番号第０８，８６５，３４１号）であり得る。適当
なインキュベーション時間後に、化学架橋剤で固定し、
発光ベースの試薬で染色する。これらの試薬は、限定さ
れるものではないが、ＧＰＣＲと反応する蛍光標識一次
または二次抗体、エピトープタグ、またはＧＰＣＲの内
部化で補正するように決定された他の細胞抗原を含む。
発光染色、色素及び他の小分子を用いて薬物に対する細
胞の生理学的応答を測定することもできる。これらの試
薬を用いて、薬物によって誘導されたイオン、代謝産
物、マクロ分子及びオルガネラの時間的及び空間的変化
を測定する。細胞生理学のマクロ分子ベースのインジケ
ータをアッセイで用いることもできる。
【０１０７】もう１つの実施の態様において、ウェルま
たはマイクロアレイ中の細胞を薬物で処理し、生理学的
応答を、適当なインキュベーション期間後に、単一の生
細胞の集団内で時間的及び空間的に測定する。発光染
色、色素及び他の小分子を用いて、薬物に対する生細胞
の生理学的応答を測定することができる。（ＧＦＰ及び
その突然変異体のような）細胞それ自体によって発現さ
れた分子ベースのクロモフォアが生細胞測定に対して特
に適する。これらの試薬を用いて薬物によって誘導され
たイオン、代謝産物、マクロ分子及びオルガネラの時間
的及び空間的分子内変化を測定することができる。ま
た、細胞生理学のマクロ分子ベースのインジケータをア
ッセイで用いることもできる。これらの発光アナログ及
びバイオセンサを用いて、薬物処理に応答しての、蛋白
質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質及び炭水化物のようなマクロ
分子の分布及び活性の時間的及び空間的変化を測定する
ことができる。
【０１０８】もう１つの実施の態様において、蛍光標識
リガンドを用いて受容体隔離を誘導し、リガンドの運命
は高内容スクリーニングのパラメータとして以下のよう
である。
【０１０９】もう１つの実施の態様において、それらの
データを収集するために異なる蛍光チャンネルを用いる
ことによって異なるＧＰＣＲを同一細胞中で分析できる
ように、細胞は１を超える区別されて標識された受容体
を含有することができる。同様に、ウェルまたはマイク
ロアレイは細胞の混合集団を含有することができ、各集
団はスペクトル的に区別されるフルオロフォアで標識さ
れた異なる受容体を含有する。これらの実施例において
異なる受容体の蛍光のチャンネルを区別することができ
る、本発明の細胞スクリーニングシステムのような細胞
スクリーニングシステムを利用することによって単一ラ
ンで異なる受容体に対する薬物の効果を測定するのが可
能である。このようにして、複数受容体タイプに影響す
る化合物につき、あるいは逆に１の受容体タイプには影
響するが他のタイプには影響しない化合物につきスクリ
ーニングすることができる。
【０１１０】アゴニスト刺激に応答して内部化を受ける
いずれの細胞表面受容体にも本発明を適用できるのは当
該分野においては明白であろう。ＧＰＣＲｓのいくつか
の公知の例はアドレナリン作動性受容体；ムスカリンア
セチルコリン受容体；オピオイド受容体；ケモカイン受
容体；神経ペプチド受容体；プロスタグランジン受容
体；上皮小体ホルモン受容体；コレシストキニン受容
体；セレクチン受容体；ロドプシン；ドーパミン受容
体；セロトニン受容体；オドラント受容体；ヒスタミン
受容体；アンジオテンシン受容体；ガストリン受容体；
小胞刺激ホルモン受容体；黄体ホルモン受容体；メタボ
トロピックグルタメート受容体；グルカゴン受容体であ
る（公知のＧＰＣＲｓ及びそのリガンドのより完全なリ
ストはＢｅｃｋ−Ｓｉｃｋｉｎｇｅｒ，Ａ．Ｇ（１９９
６）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ １
（１２）：５０２−５１３）に見出すことができる。本
発明はＧＰＣＲｓに限定されず；本発明を適用し得る他
の受容体の例はＰＤＧＦ（Ｈｅｌｄｉｎら，（１９８
２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７（８）：４２１６
−４２２１；Ｋａｐｅｌｌｅｒら，（１９９３）Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３（１０）：６０５２−６
０６３）及びＥＧＦ（Ｚｉｄｏｖｅｔｚｋｉら，（１９
８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８
（１１）：６９８１−６９８５；Ｂｅｇｕｉｎｏｔら，
（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
８１（８）：２３８４−２３８８；Ｅｍｌｅｔら，（１
９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（７）：４０
７９−４０８６）のような成長因子受容体、トランスフ
ェリン受容体（Ｋｌａｕｓｎｅｒら，（１９８３）Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８（８）：４７１５−４７２
４；Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒら，（１９８３）Ｊ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３（１−４）：１０７−１３
０）、及びインスリン受容体（Ｂａｌｄｗｉｎら，（１
９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７
（１０）：５９７５−５９７８；Ｄｉ Ｇｕｇｌｉｅｌ
ｍｏら，（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１８２（１−２）：５９−６３）を含む。本発明は
特異的リガンド及び／またはエフェクターがそれにつき
知られていないみなし児受容体に適用することができ
る。
【０１１１】以下の実施例は、原形質膜から近位核位置
へのＧＰＣＲの移動によって検出されるＧ−蛋白質がカ
ップリングした受容体（ＧＰＣＲ）の活性化についての
スクリーニングである。この実施例は、細胞ベースのス
クリーニングについての二重モードシステムで高スルー
プットスクリーニングがいかにして高内容スクリーニン
グとカップリングできるかを説明する。
【０１１２】図１９はＧＰＣＲの活性化のための二重モ
ードスクリーニングを示す。青色蛍光蛋白質（ＢＦＰ）
とのＧＰＣＲの安定なキメラを運ぶ細胞にＦｌｕｏ−３
のアセトキシメチルエステル形、該エステルの加水分解
により生細胞に捕獲される細胞浸透性カルシウムインジ
ケータ（緑色蛍光）を負荷した。次いで、それらをマイ
クロタイタープレート６０１のウェルに沈積させる。次
いで、流体デリバリシステム、及びそのマイクロタイタ
ープレートがカルシウム応答を呈するウェルにつき獲得
及び分析されるＦｌｕｏ−３イメージの短い配列を用い
てウェルをテスト化合物のアレイで処理する（すなわ
ち、高スループットモード）。イメージは図１９のマイ
クロタイタープレート６０１の説明と似ている。該説明
におけるウェルＣ４及びＥ９のような少数のウェルは、
受容体の刺激に際して放出されるＣａ＋＋のため、より
鮮明に蛍光を発するであろう。応答６０２を誘導した化
合物を含有したウェルの位置を、ＨＣＳプログラムまで
移動させ、核周辺領域へのＧＰＣＲ移動の証拠のための
青色蛍光の細胞分析によって詳細な細胞につき光学系を
スイッチする。図１９の底は高分解能細胞データの分析
の２つの可能な結果を示す。カメラはウェル領域６０３
の小区画６０４をイメージし、蛍光細胞６０５のイメー
ジを生じさせる。ウェルＣ４において、細胞中での蛍光
の均一な分布は、受容体が内部化されなかったことを示
し、これは観察されたＣａ＋＋応答が細胞中のいくつか
の他のシグナリング系の刺激の結果であったことを意味
する。他方、ウェルＥ９ ６０６中の細胞は、核周辺領
域における受容体の濃縮を明瞭に示し、これは受容体の
十分な活性化を明瞭に示す。少数のヒットウェルを高分
解能で分析しなければならなかったに過ぎないので、二
重モードシステムの全スループットはかなり高く、高ス
ループットシステム単独と匹敵し得る。
【０１１３】（実施例４） リガンド−誘導上皮小体ホルモン受容体の内部化の高内
容スクリーニング プラスミド構築体。ヒト化ＧＦＰ突然変異体（ｐＥＧＥ
Ｐ−Ｎ２，ＣＬＯＮＴＥＣＨ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃ
Ａ）についてのコーディング配列を含有する真核生物発
現プラスミドを用いてＧＦＰ−ヒト上皮小体ホルモン受
容体（ＰＴＨＲ，ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｌ０４３０８）キメ
ラを得た。
【０１１４】細胞調製。プラスミド構築体を用いてヒト
胚腎臓細胞系（ＨＥＫ２９３）（ＡＴＣＣ ＮＯ．ＣＲ
Ｌ−１５７３）を形質移入した。ＧＦＰ−ＰＴＨＲキメ
ラを安定に発現するクローン系は、ネオマイシンアナロ
グＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（ゲネチシン）（０．５ｍｇ／ｍ
ｌ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈ
ｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）での抗生物質選択によって確立
された。細胞を調製し、２５ｍＭ緩衝液（炭酸水素ナト
リウム無し）、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ペニシ
リン．ストレプトアビジン（ＰＳ）、及び２ｍＭ Ｌ−
グルタミンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で平板培養する。ウェ
ル当たり２００ｕｌの容量にて９６−ウェルマイクロタ
イタープレート中、ウェル当たり４×１０４の密度にて
細胞を平板培養する。室温にて細胞をほぼ３０分間沈積
させ、次いで、プレートを３７℃の湿潤化空気インキュ
ベーター中に入れる。
【０１１５】ＧＦＰ−ＰＴＨＲ内部化の上皮小体ホルモ
ン誘導。酸性化水（ｐＨ４−４．５）を用い、ウシ上皮
小体ホルモン（ＰＴＨ）、アミノ酸１−３４（Ｂａｃｈ
ｅｍ，Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）の１０
０μＭストックを調製する。ＧＦＰ−ＰＴＨＲキメラの
内部化を誘導するために、５００ｎＭ ＰＴＨの５０ｕ
ｌの各ウェルへの添加によって細胞を刺激する（ＤＭＥ
Ｍ／Ｆ１２、１０％ＦＣＳ、ＰＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタ
メートに希釈）。この容量をウェル中に既にある２００
ｕｌに添加し、１００ｎＭ ＰＴＨの最終濃度を得る。
光からフルオロフォアを保護するためにアルミニウムホ
イルで被覆しつつ、プレートを室温で２時間インキュベ
ートする。２時間のＰＴＨ刺激に続き、培地をプレート
からデカントし、細胞を固定し、３．７％ホルマリン
（Ｓｉｇｍａ）及び１ｕｇ／ｍｌＨｏｅｃｈｓｔ ３３
３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅ
ｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）を含有する２００ｕｌのハンクス
の平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）の添加によって核を染色す
る。室温での１０分間のインキュベーション後、溶液を
プレートからデカントし、２００ｕｌ／ウェルのＨＢＳ
Ｓの添加によって細胞を洗浄し、プレートを新鮮なＨＢ
ＳＳ（２００ｕｌ／ウェル）で分析し／記憶する。
【０１１６】イメージ獲得及び分析（総括については図
２６参照）。Ｈｏｅｃｈｓｔ−標識核についての応答フ
ォーカシング１０１（図２７）後に、核１０２のイメー
ジを２０×倍率で獲得する。使用者によって選択される
か、あるいは使用者がそれから選択される２つの他の方
法のうちの１つによって得られた（イソデータアルゴリ
ズムまたはピーク内挿）閾値を用い、核イメージを閾値
決定１０３によって細分化する。次いで、イメージ中の
全ての核の画素における全面積を単一合計１０４として
計算する。次いで、ＧＦＰ蛍光のイメージを２０×倍率
で獲得する１０５（図２６）。このようにしてイメージ
したプレートの面積は視野と呼ばれる。
【０１１７】大きな人工物を以下のようにＧＦＰイメー
ジから除去する１０６（図２６）。該イメージは、有効
な対象を後に検出するのに使用される閾値よりも高いユ
ーザ選択強度値における閾値とする。得られたイメージ
で検出された全ての対象を標識し、そのサイズ（画素の
数）を測定する。ユーザ特殊化サイズよりも大きいいず
れの物体も人工物として処理する。全てのかかる物体を
コピーし、新しいブランクのイメージ、人工物イメージ
に移す。人工物イメージをわずかに膨張させて、人工物
が完全に欠失することを確実とする。次いで、人工物イ
メージを元のＧＦＰイメージから差し引いて、中間イメ
ージを得る。
【０１１８】バックグラウンド蛍光における変動を除去
するために、中間イメージを頂部ハットトランスフォー
ム１０７に付す（図２６）。このトランスフォームは、
（ａ）灰色スケール侵食（その隣における最小値による
各画素値の置き換え）、（ｂ）バックグラウンドイメー
ジを生じる、（ａ）と同一サイズ近隣にての灰色スケー
ル膨張（その隣における最大値による各画素値の置き換
え）、及び（ｃ）小さな鮮やかなスポットを含む対象イ
メージを生じさせるための、元のインプットイメージか
らの得られたバックグラウンドイメージの差し引きより
なる。前記工程（ａ）及び（ｂ）で使用される近隣のサ
イズを、イメージ中の全ての注目対象よりもわずかに大
きくなるように選択される。その結果、侵食（ａ）及び
膨張（ｂ）後に全てのかかる対照はバックグラウンドイ
メージから存在しない。しかしながら、元のイメージの
バックグラウンドにおける少しずつの変動はバックグラ
ウンドイメージに保持される。従って、差し引き工程
（ｃ）はバックグラウンドにおけるこれらの変動を対象
イメージから除去する。
【０１１９】対象イメージを処理して、いずれの鮮やか
なスポットが刺激細胞中の内部化受容体を表すかを決定
する。このプロセスは、使用者によって設定された輝度
閾値及び最小サイズを使用する。対象イメージは輝度閾
値で閾値決定して、バイナリ対象マスク１０８を得る
（図２６）。バイナリ対象マスクにおける対象を標識
し、それらのサイズを画素中である。最小サイズに適合
するまたはそれを超える対照は有効なスポット１０９で
あり；（図２８）残りは無視する。
【０１２０】次いで、各有効なスポットにつき以下の測
定を行う（図２８）。視野中のスポットのカウントを増
大させる１１０。画素の数は先にカウントした。各有効
なスポットについては、その標識を持つ領域をバイナリ
対象マスクから抽出して、単一−スポットのバイナリマ
スクを得る。単一−スポットのバイナリマスクを元の対
象イメージに適用して、各スポットの灰色スケールスポ
ットイメージを得る。灰色スケールスポットイメージ中
の画素の強度を合計して、スポット１１１の総強度を得
る。いったん全てのスポットが処理されれば、有効なス
ポットの面積の全てを合計して、視野１１２につき総ス
ポット面積を得る。スポットの総強度を合わせて、視野
の総スポット強度を得る。視野（またはウェル）に対す
る最終スコアから選択するいくつかの統計量がある：
（ａ）有効スポットの数；（ｂ）有効スポットの総面
積；（ｃ）有効スポットの総強度；（ｄ）有効スポット
の総強度を核の全面積で割ったもの。１を超える視野を
各ウェル内で分析する場合、ウェルの全ての視野につい
ての値をいっしょに平均して、ウェル１１３についての
総統計量（図２６）を得る。
【０１２１】前記技術を用いる受容体内部化を測定する
以下の実施例は処理及び未処理細胞間で見出された差異
を説明する。未刺激細胞の核をＤＮＡ−特異的Ｈｏｅｃ
ｈｓｔ染料で標識し、近−ＵＶ蛍光フィルタセットでイ
メージする。同細胞を青色蛍光フィルタセットでイメー
ジし、これはＧＦＰ蛍光の分布を示す。核−標識イメー
ジに閾値を適用することによって核マスクを誘導し、Ｇ
ＦＰイメージの灰色スケール侵食及び膨張によってバッ
クグラウンドイメージを誘導し、これはバックグラウン
ド強度の変動を示す。次いで、ＧＦＰイメージからバッ
クグラウンドイメージを差し引くことによって対象イメ
ージを誘導し、かすかなスポットが得られる。次いで、
対象イメージに閾値を適用することによって対象マスク
が誘導される。閾値決定によっていくつかのかすかなス
ポットが排除される。いくつかの他のものは有効スポッ
トに対する要件よりも閾値上でより少数の画素を有す
る。その結果、未刺激細胞のイメージにおいては非常に
少数の有効スポットしか見出されない。スポットカウン
ト、総スポット面積、及び総スポット輝度は全て低い値
を有する。
【０１２２】第２の実施例において、刺激細胞の核をＤ
ＮＡ−特異的Ｈｏｅｃｈｓｔ染料で標識し、これまでの
実施例におけるようにイメージする。自動閾値決定法に
よって核マスクが誘導され、ＧＦＰイメージの灰色スケ
ール侵食及び膨張によってバックグラウンドイメージが
誘導され、これはバックグラウンド強度の変動を示す。
ＧＦＰイメージからバックグラウンドイメージを差し引
くことによって対象イメージが誘導され、その結果鮮や
かなスポットが得られる。対象イメージに閾値を適用す
ることによって対象マスクが誘導される。対象マスクで
多くのスポットが観察され、スポットの多くは有効スポ
ットに対する要件に適合する閾値を超える十分な画素を
有する。スポットカウント、総スポット面積、及び総ス
ポット輝度は全て高い値を有する。これらの実施例と同
様の実験からの結果が図２５で先に示された。
【０１２３】図２９は前記実施例で記載された方法によ
って得られたデータを示すＰＣスクリーンの代表的なデ
ィスプレイを示す。各データ点は、ウェルの視野のスポ
ットカウントを一緒に合計することによって計算され
た、プレートの単一ウェルのスポットカウントを表す。
グラフ３００は個々の曲線を示し、各々は９６ウェルプ
レートの単一列を表す。各曲線の最も左の６つの点は未
処理細胞のスポットカウントを表し、他方、最も右の６
つの点は処理細胞を表す。スポットカウント特徴（図中
「ｏｂｊカウント」）はリスト３０２を用いて選択する
ことができる。全ての列に対する数値をスプレッドシー
トフォーマット３０３に示す。グラフ３００及びスプレ
ッドシート３０３は印刷することができ、スプレッドシ
ートはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌＴＭ のような
スプレッドシートプログラムへの入力のためにコンマ−
分離フォーマットで送り出すことができる。
【０１２４】別法として、データを視野ベースによって
視野に表示することができる（図３０）。頂部３０４、
３０５及び３０６における各グラフを計算した統計量の
うちのいずれか１つ（ウェルの視野にわたる平均）対ウ
ェル数をプロットするように設定することができる。ス
プレッドシート３０７は視野間ベースで計算された数値
データを示す。スプレッドシートからのラインの選択
は、対応するＨｏｅｃｈｓｔ３０８及びＧＦＰ３０９イ
メージの表示が成されるようにする。スプレッドシート
３０５はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌＴＭのような
スプレッドシートプログラムへの入力のためにＡＳＣＩ
Ｉファイルフォーマットで印刷するかまたは送り出すこ
とができる。
【０１２５】グラフ３０４は、スポットカウント−対−
ウェル数を示す。スポットカウントは入力ＧＦＰイメー
ジで検出された有効スポットの数である。本発明は、カ
メラからのデジタル信号をこのパラメータに変換するた
めに、及びパラメータ対−ウェル数をプロットするため
のコンピュータ手段を提供する。
【０１２６】グラフ３０５は総スポット面積（説明では
「全スポット領域」）対ウェル数を示す。総スポット面
積は入力ＧＦＰイメージで検出された全ての有効スポッ
トの合計面積である。本発明は、カメラからのデジタル
信号をこのパラメータに変換するために、及びこのパラ
メータ対ウェル数をプロットするためのコンピュータ手
段を提供する。
【０１２７】グラフ３０６は正規化スポット強度比率
（説明中「スポット強度比率×１００」）を示す。正規
化スポット強度比率は入力ＧＦＰイメージで検出された
有効スポットにおける全ての画素の合計強度を、対応す
るＨｏｅｃｈｓｔイメージにおける核マスク中の画素の
合計数で割ったものである。本発明は、カメラからのデ
ジタル信号をこのパラメータに変換するための、及びパ
ラメータ対−ウェル数をプロットするためのコンピュー
タ手段を提供する。
【０１２８】図２５はＰＴＨＲ内部化スクリーニングの
確認実行からのデータのグラフ表示である。該図面は、
最小（「最小応答」＝未刺激）及び最大（「最大応答」
＝刺激）についてのデータが異なるプレート間で一致す
ることを示し（差は統計的に有意ではない）、一致し許
容される範囲内のｃ．ｏ．ｖ．（分散計数）を与える。
【０１２９】高内容スクリーニングの具体的例におい
て、４つの視野が各ウェルで獲得された。ウェルの視野
を横切ってスポットカウントを合計し、同様に処理され
たウェル間で平均した。プレートの未処理の半分はプレ
ートの未処理半分の６９．３±１７．７（平均±標準偏
差）倍のスポットカウントを有し、２６％の分散計数
（ＣＯＶ、標準偏差を平均で割ったもの）を与えた。プ
レートの処理半分の視野からの値は４０４．２±４１．
２のスポットカウントを有し、（１０％）のＣＯＶを与
えた。処理半分の平均スポットカウントは未処理半分の
平均スポットカウントの５．８３倍であった。
【０１３０】（実施例５） 動的高内容スクリーニング 内部化されたかまたはそうではない終点を単に検出する
ことで、受容体アゴニストまたはアンタゴニストとして
の化合物の能力を定義するには十分ではないであろう。
もう１つの実施の態様において、細胞を薬物で処理し、
薬物処理に続いて種々の時点でデータを収集して、受容
体内部化の動態を定量する。これらの動的アッセイは前
記したように生細胞で行うことができるか、あるいは薬
物処理に続いて細胞の異なるウェルを種々の注目時点の
各々において固定することができる。いずれの場合にお
いても、前記した試薬及び方法を用いて細胞を標識する
ことができる。かかる動的測定は測定の間の能力につい
ての情報を提供するのみならず、かなり長い時間に対す
るデータの外挿を可能とするであろう。
【０１３１】好ましい実施の態様において、受容体内部
化と関連した細胞応答についての高スループットまたは
超高スループットモードで蛍光の１つのチャンネルで成
される。この応答は内部化プロセスそれ自体よりも受容
体特異的ではなく、それは限定されるものではないがＣ
ａ２＋、ｃＡＭＰ、またはＩＰ３濃度の変化、または種
々のキナーゼのうちのいずれかの活性化を含むことがで
きる。次いで、このパラメータからの所望の出力を呈す
るウェルを、細胞間ベースでかなり詳細な時間的及び空
間的情報につきＨＣＳモードで分析する。
【０１３２】本発明の細胞スキャニングシステムのよう
な細胞スキャニングシステムを用い、生細胞または固定
細胞の発光信号を分析する。
【０１３３】（実施例６） 二重−標識受容体を取り込む高内容スクリーニングのた
めの挿入された配列及びそれらのリガンド もう１つの実施の態様において、各端部に融合した特異
的ペプチド配列を含有するように膜受容体を修飾して、
細胞外及び細胞内ドメインを区別可能に標識する。２つ
の標識の蛍光強度の比率は未処理及び処理細胞において
得られる；というのは、受容体のアミノ末端は標識のた
めに利用できるに過ぎず、他方受容体は原形質膜に挿入
され、未浸透細胞における２つの標識を用いて受容体の
内部化の程度を測定することができるからである。現
在、膜受容体の外部及び内部ドメインの相対的細胞外利
用性を同時に測定するための知られた技術はない。
【０１３４】適当な細胞は、そのアミノ末端のエピトー
プタグ及びそのカルボキシル末端の分子ベースのクロモ
フォアに融合した注目ＧＰＣＲを発現するＤＮＡ構築体
（プラスミドまたはウイルスベースいずれか）で一過的
にまたは安定に形質移入される。別法として、ＧＰＣＲ
はそのカルボキシル末端のエピトープ及びそのアミノ末
端の分子ベースクロモフォアに融合させることができ
る。ＧＰＣＲ融合の発現は構成的であるかまたは誘導的
である。
【０１３５】エピトープタグのいくつかの例は、限定さ
れるものではないが、ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ，Ｓｔ．，Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ｍｙｃ（９Ｅ
１０）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃ
Ａ）、６−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｎｏｖａｇ
ｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、及びＨＡ（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ）を含む。ＧＰＣＲ融合の発現は構成的であるかま
たは誘導的であり得る。
【０１３６】有用な分子ベースのクロモフォアの実施例
は、限定されるものではないが、ＧＦＰ及びその種々の
突然変異体のいずれかを含む（Ｈｅｉｍ及びＴｓｉｅｎ
（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６：１
７８−１８２；Ｚｈａｎｇら，（１９９６），Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２２７：
７０７７１１）。加えて、ルシフェラーゼ及びそれらの
突然変異体のいずれかを用いることもできる。キメラ標
的蛋白質の一部としてのルシフェラーゼの使用は新規標
識技術を含む。というのは、現在まで、この分子−ベー
スのクロモフォアの使用の例は遺伝子活性のレポーター
（Ｙａｎｇら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
７３（１７）；１０７６３−１０７７０；Ｐｅｎｇら，
（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（２
７）；１７２８６−１７２９５；Ｂａｌｄａｒｉら，
（１９９８）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ２６（１）：１
−５）及びバイオセンサの構築８Ｃａｍｐｂｅｌｌ及び
Ｐａｔｅｌ（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２１６：
１８５−１９４；Ｓａｌａ−Ｎｅｗｂｙ及びＣａｍｐｂ
ｅｌｌ（１９９２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０７：２４
１−２４４；Ｊｅｎｋｉｎｓら，（１９９０）Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．１８：４０４）としての
使用を含むが、特定の蛋白質標的を作成するためのキメ
ラとして使用含まないからである。膜蛋白質−発光蛋白
質融合の発現は構成的（限定されるものではないが、Ｃ
ＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、アクチン、ＥＦを含めた種々
のプロモーターのいずれかにより駆動）または誘導的
（限定されるものではないが、テトラサイクリン、エク
ジソン、ステロイド−応答性を含めた多数の誘導性プロ
モーターのうちのいずれかにより駆動）であり得る。
【０１３７】別法として、細胞は、２つの区別されるエ
ピトープタグ（１つは膜蛋白質の各端部に融合してい
る）に融合した注目膜蛋白質を発現するＤＮＡ構築体
（プラスミドまたはウイルスベースのいずれか）で一過
的にまたは安定に形質移入される。
【０１３８】挿入された配列の外部利用可能性は、受容
体の内部化状態に依存する。すなわち、挿入された配列
の外部利用可能性の比率は、受容体内部化の大きさの直
接的な尺度を提供する。これは二重−標識受容体を取り
込む高内容スクリーニングである。挿入された配列の外
部利用可能性は、単一アプローチまたはいくつかのアプ
ローチの組合せを用いて測定することができる。
【０１３９】１．挿入された配列の１以上は特異的抗体
に対するエピトープであり得る。エピトープに対する抗
体の結合は、組織化学、放射性、または蛍光方法を用い
て測定することができる。可能なエピトープは限定され
るものではないが、表Ｉに示されたものを含む。
【０１４０】表１として ペプチドエピトープ及びそれ
らの対応する抗体
【表１】
【０１４１】２．挿入された配列は蛍光蛋白質をコード
することができる。多くの蛋白質に存在するｔｒｐ．ｔ
ｙｒ及びｐｈｅの天然フルオロフォアに加えて、他の蛍
光蛋白質配列を挿入することができる。ＧＦＰ配列また
はその突然変異体のうちの１つを、受容体をコードする
配列に挿入することができる。ルシフェラーゼをコード
する配列及びその突然変異体も挿入することができる。
フルオロフォアをコードするまたはそれと相互作用する
いずれのペプチド配列もこの方法で用いることができ
る。挿入された配列は、各々からの蛍光信号が独立して
測定できるように、異なる蛍光特性を持って蛍光蛋白質
を発現するように構築することができる。
【０１４２】３．挿入された配列は、高親和性（Ｋｄ＜
１０−９）及び特異性をもって小さな（＜１０００ Ｍ
ｒ）リガンドに結合するペプチドをコードすることがで
きる。従って、これらの小さな分子は発光または放射能
標識することができる他の分子またはマクロ分子に対し
て密接な架橋を形成する。挿入された配列は、各々から
の信号が独立して測定できるように、区別して標識され
た分子またはマクロ分子に結合する異なる架橋分子に結
合するように構築することができる。例えば、ペプチド
配列−ＨＨＨＨＨＨ−は、多座酢酸部位（例えば、ニト
リロ酢酸）とで密接な架橋を形成するであろう金属イオ
ン（例えば、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋等）に結合するであろ
う。該酸部位は、発光、放射能、または光吸収性である
分子に共有結合することができる。これらの分子は、発
光または放射性標識を含有する蛋白質のような発光染料
またはマクロ分子であり得る。挿入されたペプチド配列
の他の例は、それらが、発光または放射能標識すること
ができる他の分子またはマクロ分子に対して密な架橋を
形成するステロイドホルモン、ビタミン及び炭水化物を
含む他の小さな分子に対して高い親和性を有するもので
ある。
【０１４３】（実施例７） 一般化された二重−標識受容体内部化高内容スクリーニ
ング 修飾されたＧ−蛋白質がカップリングした受容体（公知
の機能またはみなし児のＧＴＣＲ）は、その局所化が原
形質膜からの内部化の尺度を提供するヒト上皮腎臓細胞
（ＨＥＫ ２９３）に形質移入される。修飾されたＧＰ
ＣＲはＮ−末端（細胞外）及びＣ−末端（細胞内）のＧ
ＦＰ−分子を含有する。リガンド処理後にＧＰＣＲ内部
化を測定するために、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２
（ＤＮＡ−結合蛍光色素）及びエピトープタグに対する
区別される発光標識抗体で固定し標識する。比率イメー
ジを用いる、本発明の細胞のスクリーニングシステムの
ような細胞スクリーニングシステムを用いて、原形質膜
の外側からのＧＰＣＲ−エピトープの喪失及び細胞内の
ＧＦＰ−唯一−標識受容体の増加によりＧＰＣＲの内部
化を計算する。リガンド−誘導受容体内部化を測定する
このアプローチは内部化メカニズムとは独立しており、
従って、それは公知及び未知の機能の広い範囲の受容体
に適用することができる。
【０１４４】（実施例８） ヒト・グルココルチコイド受容体移動の高内容スクリー
ニング ＨＣＳの１つのクラスは細胞内構成要素の薬物−誘導動
的再分布を含む。ヒト・グルココルチコイド受容体（ｈ
ＧＲ）、細胞の複雑な環境応答機械中の単一「センサ
ー」は、細胞中に拡散するステロイド分子に結合する。
リガンド−受容体複合体は核に移動し、そこで転写の活
性化が起こる（Ｈｔｕｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．９３：４８４５，１９９６）。
【０１４５】一般に、ホルモン受容体は、その活性が鍵
となる細胞内シグナリング経路の先端に存在するので優
れた薬物標識である。従ってｈＧＲ移動の高内容スクリ
ーニングはインビトロでのリガンド−受容体結合アッセ
イよりも優れた区別される利点を有する。本発明の細胞
スクリーニング系における蛍光の２以上までのチャンネ
ルの利用性は、該スクリーニングが、他の受容体、他の
区別される標識または他の細胞プロセスのような、２つ
のさらなるパラメータを平行して含むことを可能とす
る。
【０１４６】プラスミド構築体。緑色蛍光蛋白質−ヒト
・グルココルチコイド受容体（ＧＦＰ−ｈＧＲ）キメラ
についてのコーディング配列を含有する真核生物発現プ
ラスミドはＧＦＰ突然変異体を用いて調製した（Ｐａｌ
ｍら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．４：３６１
（１９９７））。該構築体を用いてヒト頸カルシノーマ
細胞系（ＨｅＬａ）を形質移入した。
【０１４７】細胞の調製及びトランスフェクション。Ｈ
ｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）をトリプシン処理
し、トランスフェクションに１２−２４時間先立って、
５％木炭／ブキストラン−処理ウシ胎児血清（ＦＢＳ）
（ＨｙＣｌｏｎｅ）及び１％ペニシリン−ストレプトマ
イシン（Ｃ−ＤＭＥＭ）を含有するＤＭＥＭを用いて平
板培養し、３７℃及び５％ＣＯ２でインキューベートし
た。トランスフエクションはリン酸カルシウム共沈殿
（Ｇｒａｈａｍ及びＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ ５２：４５６，１９７３；Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら，（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２
版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ，１９８９）またはリポフェクタミン（Ｌｉ
ｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ
ｕｒｇ，ＭＤ）によって行った。リン酸カルシウム共沈
殿では、トランスフェクションに先立って、５％木炭／
デキストラン−処理ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで培地を
置き換えた。３７℃及び５％ＣＯ２で４−５時間、細胞
をリン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿と共にインキュベート
し、ＤＭＥＭで３−４回洗浄して沈殿を除去し、続い
て、Ｃ−ＤＭＥＭを添加した。
【０１４８】リポフェクタミントランスフェクション
は、製造業者の指示（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に従って抗体
なくして無血清ＤＭＥＭ中で行った。ＤＮＡ−リポソー
ム複合体との２−３時間のインキュベーションに続き、
培地を取り出し、Ｃ−ＤＭＥＭで置き換えた。９６−ウ
ェルマイクロタイタープレート中の全ての形質移入細胞
を、薬物処理に先立って、３３℃及び５％ＣＯ２にて２
４−４８時間インキュベートした。実験は、ＨｅＬａ細
胞において一過的に発現させた受容体で行った。
【０１４９】ＧＦＰ−ｈＧＲ移動のデキサメタゾン誘
導。受容体−リガンド動的データを得るために、形質移
入した細胞の核を、まず、３３℃及び５％ＣＯ２におい
てＣ−ＤＭＥＭ中で２０分間、５μｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃ
ｈｓｔ ３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ
ｓ）で標識した。細胞をハンクスの平衡塩溶液（ＨＢＳ
Ｓ）で１回洗浄し、続いて、１％木炭／デキストラン−
処理ＦＢＳを含むＨＢＳＳ中の１００ｎＭデキサメタゾ
ンを添加した。固定時点デキサメタゾン力価測定データ
を得るために、形質移入したＨｅＬａ細胞を、まず、Ｄ
ＭＥＭで洗浄し、次いで、１％木炭／デキストラン−処
理ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中の０−１０００ ｎＭデ
キサメタゾンの存在下で３３℃及び５％ＣＯ２にて１時
間インキュベートした。細胞を生きたまま分析するか、
またはそれらをＨＢＳＳですすぎ、ＨＢＳＳ中の３．７
％ホルムアルデヒドで１５分間固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ
３３３４２で染色し、分析前に洗浄した。細胞内ＧＦＰ
−ｈＧＲ蛍光信号はこの固定手法によって消失しなかっ
た。
【０１５０】イメージの獲得及び解析。デキサメタゾン
の添加前に、１分間間隔で３０分間、生細胞の視野から
蛍光イメージ対（ＧＦＰ−ｈＧＲ及びＨｏｅｃｈｓｔ３
３３４２−標識核）を獲得することによって動的データ
を収集した。同様に、デキサメタゾンの添加１時間後
に、固定時点スクリーニングプレートの各ウェルからイ
メージを得た。両方の場合、各時点において得られたイ
メージ対を用いて、各ウェル中で核及び細胞質領域を規
定した。ＧＦＰ−ｈＧＲの移動は、核におけるＧＦＰ−
ｈＧＲの積分した蛍光強度を、細胞質中の該キメラの積
分した蛍光強度で割ることによって、あるいはＧＦＰ蛍
光の核−細胞質差異として計算した。固定した時点のス
クリーニングにおいて、この移動比率は、テストしたデ
キサメタゾンの各濃度において少なくとも２００細胞か
ら得られたデータから計算した。従って、細胞質から核
へのＧＦＰ−ｈＧＲの薬物−誘導移動は移動比率の増加
と相関した。
【０１５１】結果。図２０はヒト・グルココルチコイド
受容体の薬物−誘導の細胞質２５３から核２５２への移
動を模式的に示す。該模式図の上方対は、デキサメタゾ
ンでの２５０（Ａ）刺激前及びの２５１（Ｂ）刺激後に
おける細胞内でのＧＦＰ−ｈＧＲの局所化を示す。これ
らの実験条件下で、当該薬物は核中へ移動する細胞質Ｇ
ＦＰ−ｈＧＲの大きな割合を誘導する。この再分布は、
処理２５５及び未処理２５４細胞における細胞質及び核
蛍光の積分強度比率を測定することによって定量する。
蛍光顕微鏡写真の下方の対は、処理前２５４及び後２５
５における、単一細胞中でのＧＦＰ−ｈＧＲの動的再分
布を示す。該ＨＣＳは数百ないし数千の形質移入された
細胞を含有するウェルで行い、該移動は、ＧＦＰ蛍光を
呈する視野中での各細胞につき定量する。安定に形質移
入された細胞系の使用は最も首尾一貫して標識細胞を生
じるであろうが、一過性トランスフェクションによって
誘導されたＧＦＰ−ｈＧＲ発現の不均一レベルは、本発
明の細胞スクリーニングシステムによる分析に干渉しな
かった。
【０１５２】スクリーニングを実行するために、細胞ス
クリーニングシステムはプレートの各ウェルを走査し、
各々における細胞の集団をイメージし、個々に細胞を分
析する。ここに、２つのチャンネルの蛍光を用いて、各
細胞内でのＧＦＰ−ｈＧＲの細胞質及び核分布を規定す
る。ＧＦＰ−ｈＧＲスクリーンの端部近くの細胞スクリ
ーニングシステムのグラフ表示ユーザインターフェイス
を図２１に示す。ユーザインターフェイスは、当該シス
テムの平行したデータ収集及び分析能力を示す。ウイン
ドウ標識「Ｎｕｃｌｅｕｓ」２６１及び「ＧＦＰ−ｈＧ
Ｒ」２６２ 、単一視野で得られ解析した蛍光イメージ
の対を示す。ウインドウ標識「Ｃｏｌｏｒ Ｏｖｅｒｌ
ａｙ」２６０は、前記イメージを偽着色、それらを合体
させることによって形成され、そこで、使用者は細胞変
化をただちに同定することができる。「記録された対象
領域」ウインドウ２６５内で、各分析された細胞及びそ
の隣接物を含有するイメージは記録されているのでそれ
が提示される。さらに、ＨＣＳデータが収集されている
時に、それは分析され、ＧＦＰ−ｈＧＲ移動の本ケース
では、直後の「ヒット」応答に翻訳される。スクリーン
２６７の下部ウインドウに示された９６ウェルプレート
は、使用者が規定したスクリーン基準の組にいずれのウ
ェルが適合したかを示す。例えば、白色ウェル２６９
は、薬物−誘導移動が５０％の所定の閾値を超えたこと
を示す。他方、黒色ウェル２７０は、テストされる薬物
が１０％未満の移動を誘導したことを示す。灰色ウェル
２６８は、移動値が１０％及び５０％の間となる「ヒッ
ト」を示す。分析されるべき９６ウェルプレート２６６
上の列「Ｅ」は、ＧＦＰ−ｈＧＲ移動を達成することが
知られている薬物であるデキサメタゾンでの力価測定を
示す。この例のスクリーニングは２つの蛍光チャンネル
のみを用いた。２つのさらなるチャンネル（チャンネル
３ ２６３及び４ ２６４）は、複数パラメータスクリ
ーニングを生じさせるために、他の特異的標的、細胞プ
ロセスまたは細胞毒性の平行した分析で利用できる。
【０１５３】新しいスクリーニングの有効化プロセスの
間に強力なツールとなる、イメージデータベース及び上
方データベースの間のリンクがある。スクリーニングの
完了の時点で、使用者はイメージ及び計算されたデータ
全てにアクセスできる（図２２）。細胞スクリーニング
システムの包括的なデータ解析パッケージは、使用者が
複数レベルでＨＣＳデータを調査するのを可能とする。
個々の細胞についてのスプレッドシート２７９における
イメージ２７６及び詳細なデータは別々にレビューする
ことができるか、あるいは要約データをプロットするこ
とができる。例えば、９６ウェルプレート中の各細胞に
ついての単一パラメータの計算結果はパネル標識グラフ
１ ２７５に示す。該グラフ中で単一点を選択すること
によって、使用者は、現存データベースから要求される
特定の細胞についての全データ組を表示することができ
る。ここでは、単一細胞（細胞＃１１８、灰色の線２７
７）からのイメージ対２７６ならびに詳細な蛍光及び形
態学的データを示す。大きなグラフインサート２７８
は、ＧＦＰ−ｈＧＲの移動に対するデキサメタゾン濃度
の結果を示す。各点は少なくとも２００細胞からのデー
タの平均である。このアッセイにおけるデキサメタゾン
についての計算されたＥＣ５０は２ｎＭである。
【０１５４】細胞スクリーニングシステムでのＨＣＳの
強力な態様は、生細胞での多色蛍光及び形態的パラメー
タを用いる動的測定の能力である。時間的及び空間的測
定は視野中の細胞集団内の単一細胞に対して行うことが
できる。図２３は単一視野内のいくつかの細胞における
ＧＦＰ−ｈＧＲのデキサメタゾン−誘導移動についての
動的データを示す。ＧＦＰ−ｈＧＲで形質移入したヒト
ＨｅＬａ細胞を１００ｎＭデキサメタゾンで処理し、単
一細胞の集団で経時的にＧＦＰ−ｈＧＲの移動を測定し
た。当該グラフは形質移入された細胞２８５、２８６、
２８７及び２８８ならびに非形質移入細胞２８９の応答
を示す。また、これらのデータは異なる発現レベルで細
胞を分析する能力を示す。
【０１５５】（実施例９） 薬物−誘導アポトーシスの高内容スクリーニング アポトーシスは、膨大な細胞事象及び経路に関連する複
雑な細胞プログラムである。このプロセスに対する薬物
作用のメカニズムを理解するためには、時間的及び空間
的分解能にて出来る限り多くの細胞内でのこれらの事象
を測定するのが必須である。生きた試料調製物をほとん
ど必要としないが、いくつかのアポトーシス−関連パラ
メータの自動読みだしを供するアポトーシススクリーニ
ングが理想的であろう。細胞スクリーニングシステムに
つき設計された細胞ベースのアッセイを用いて、パクリ
タキセル−誘導アポトーシスの形態学的、オルガネラ及
びマクロ分子のホールマークのいくつかが同時に定量さ
れている。
【０１５６】細胞調製。この実験で選択された細胞はマ
ウス結合組織繊維芽細胞（Ｌ−９２９；ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ−１）及び高度に侵入的な神経膠腫細胞系（ＳＮＢ−
１９；ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２１９）であった（Ｗｅｌ
ｃｈら，Ｉｎ ＢｉｔｒｏＣｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏ
ｌ．３１：６１０，１９９５）。アポトーシス誘導薬物
での処理の前日に、３５００細胞を９６−ウェルプレー
トの各ウェルに入れ、湿潤化された５％ＣＯ２雰囲気
中、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、培養培地
を各ウェルから取り出し、ＤＭＳＯ中で作成した２０ｍ
Ｍストックからのパクリタキセル（０−５０μＭ）の種
々の濃度のものを含有する新鮮な培地で置き換えた。こ
れらの実験で用いたＤＭＳＯの最大濃度は０．２５％で
あった。次いで、細胞を前記したように２６時間インキ
ュベートした。パクリタキセル処理時間の最後に、各ウ
ェルに、７５０ｎＭ Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅ
ｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ；Ｅｕｇｅｎ
ｅ，ＯＲ）及び３μｇ／ｍｌＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２
ＤＮＡ−結合染料（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ
ｓ）を含有する新鮮な培地を摂取させ、前記したように
２０分間インキュベートした。次いで、プレート上の各
ウェルをＨＢＳＳで洗浄し、室温にて、１５分間、ＨＢ
ＳＳ中の３．７％ホルムアルデヒドで固定した。該ホル
ムアルデヒドをＨＢＳＳで洗浄し、０．５％（ｖ／ｖ）
トリトン−Ｘ−１００を細胞に９０秒間あらかじめ浸透
させ、ＨＢＳＳで洗浄し、２ Ｕ ｍｌ−１ Ｂｏｄｉ
ｐｙ ＦＬファラチジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏ
ｂｅｓ）とともに３０分間インキュベートし、ＨＢＳＳ
で洗浄した。次いで、プレート上のウェルに２００μｌ
のＨＢＳＳを満たし、シールし、要すればプレートを４
℃で保存した。このように保存したプレートからの蛍光
信号は調製後少なくとも２週間安定であった。核移動ア
ッセイにおけるように、蛍光試薬は、このアッセイを生
細胞高内容スクリーニングに変換するように設計するこ
とができる。
【０１５７】アレイスキャンシステムについてのイメー
ジ獲得及び分析。細胞内ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅ
ｄ，Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、及びＢｏｄｉｐｙ Ｆ
Ｌファラチジンの蛍光強度を前記したように細胞スクリ
ーニングシステムで測定した。また、各ウェルから得ら
れたイメージの各対からの形態データを得て、イメージ
視野中の各対象（例えば、細胞及び核）を検出し、その
サイズ、形状及び積分強度を計算した。
【０１５８】計算及び出力。合計５０−２５０細胞をイ
メージ視野当たりで測定した。細胞の各視野では、以下
の計算を行った：（１）視野中の全核面積を検出された
核の数で割ることによって平均各面積（μｍ２）を計算
した。（２）視野中の全ての核の周囲の合計をその視野
中で検出された核の数で割ることによって平均各周囲
（μｍ）を計算した。かなり複雑なアポトーシス核は最
大核周囲値を有した。（３）核の全視野の積分強度をそ
の視野中の核の数で割ることによって平均核輝度を計算
した。核輝度の増加は増大したＤＮＡ含有量と相関し
た。（４）ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ染料で染色した細胞
の全視野の積分強度をその視野中の核の数で割ることに
よって平均細胞輝度を計算した。ミトコンドリア内に蓄
積するＭｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ染料の量はミトコンド
リアポテンシャルに比例するので、平均細胞輝度の増加
はミトコンドリアポテンシャルの増加に一致する。
（５）Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬファラチジン染料で染色した
細胞の全視野の積分強度をその視野中の核の数で割るこ
とによって平均細胞輝度を計算した。ファロトキシンは
アクチンの重合形態に高い親和性を持って結合するの
で、細胞内に蓄積するＢｏｄｉｐｙ ＦＬファラチジン
染料の量はアクチン重合状態に比例する。平均細胞輝度
の増加はアクチン重合の増加と一致する。
【０１５９】結果。図２４（頂部パネル）はＬ−９２９
細胞の核形態で誘導されたパクリタキセルの変化を示
す。パクリタキセルの量を増加させると、核は拡大し細
分化する２９３（アポトーシスのホールマーク）。細胞
スクリーニングシステムによって得られたこれら及び他
のイメージの定量的分析を同図に呈する。各測定したパ
ラメータは、Ｌ−９２９細胞２９６がＳＮＢ−１９細胞
２９７よりも低濃度のパクリタキセルに対して感受性が
低いことを示した。より高濃度では、Ｌ−９２９細胞は
測定された各パラメータについての応答を示した。この
アッセイのマルチパラメータプローチは、薬物の作用の
メカニズムを解明するのに有用である。例えば、核２９
８の面積、輝度及び細分化ならびにアクチン重合値２９
４は、ＳＮＢ−１９細胞を１０ｎＭパクリタキセルで処
理した場合に最大値に達した（図面２４；頂部及び底部
グラフ）。しかしながら、ミトコンドリアのポテンシャ
ル２９５は同一モードのパクリタキセルで最小であった
（図２４；中央のグラフ）。測定した全てのパラメータ
が増大するパクリタキセル濃度（＞１０ｎＭ）において
対照レベルに近づいたという事実は、ＳＮＢ−１９細胞
が、十分に高レベルの薬物で補償的である低親和性薬物
代謝またはクリアランス経路を有することを示唆する。
ＳＮＢ−１９細胞２９７の薬物感受性を対照すると、Ｌ
−９２９はパクリタキセル２９６に対して異なる応答を
示した。これらの繊維芽細胞は、５μＭパクリタキセル
（ＳＮＢ−１９細胞よりも５００倍高い用量）において
多くのパラメータで最大応答を示した。さらに、Ｌ−９
２９細胞は、テストしたパクリタキセル濃度のいずれに
おいてもミトコンドリアポテンシャル２９５の鋭敏な減
少を示さなかった。この結果は、正常及び癌細胞系の間
のユニークなアポトーシス経路の存在と合致する。従っ
て、これらの結果は、比較的単純な蛍光標識プロトコル
を本発明の細胞スクリーニングシステムとカップリング
させて、プログラムされた細胞の死滅に関与する鍵とな
る事象の高内容スクリーニングを生じることを示す。
【０１６０】（実施例１０） 細胞質から核への病気−関連配列を含有するシグナリン
グ酵素のプロテアーゼ誘導移動 プラスミド構築体。緑色蛍光蛋白質−カスターゼ（Ｃｏ
ｈｅｎ（１９９７），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ．３
２６：１−１６；Ｌｉａｎｇら，（１９９７），Ｊ．ｏ
ｆ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７４：２９１−３０２）
キメラについてのコーディング配列を含有する真核生物
発現プラスミドはＧＦＰ突然変異体を用いて調製され
る。該構築体を用いて真核生物細胞を形質移入する。
【０１６１】細胞の調製及びトランスフェクション。細
胞をトリプシン処理し、トランスフェクションの２４時
間前に平板培養し、３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベ
ートする。トランスフェクションは、限定されるもので
はないがリン酸カルシウム共沈殿またはリポフェクショ
ンを含めた方法によって行われる。３７℃及び５％ＣＯ
２において４−５時間、細胞をリン酸カルシウム−ＤＮ
Ａ沈殿と共にインキュベートし、ＤＭＥＭで３−４回洗
浄して沈殿を除去し、続いてＣ−ＤＭＥＭを添加した。
リポフェクタミントランスフェクションは製造業者の指
示に従って抗生物質なくして無血清ＤＭＥＭ中で行う。
ＤＮＡ−リポソーム複合体との２−３時間インキュベー
ション後に、培地を取り出し、Ｇ−ＤＭＥＭで置き換え
る。
【０１６２】ガスパーゼ−ＧＦＰ移動のアポトーシス誘
導。ガスパーゼ−−ＧＦＰ移動の動的データを得るため
に、形質移入された細胞の核を、まず、３７℃及び５％
ＣＯ２にて、２０分間、Ｃ−ＤＭＥＭ中の５μｇ／ｍｌ
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐ
ｒｏｂｅｓ）で標識する。細胞をハンクスの平衡塩溶液
（ＨＢＳＳ）中で１回洗浄し、続いてアポトーシスを誘
導する化合物を添加する。これらの化合物は、限定され
るものではないが、パクリタキセル、スタウロスポリ
ン、セラミド及び腫瘍壊死因子を含む。固定された時点
の力価測定データを得るために、形質移入された細胞を
まずＤＭＥＭで洗浄し、次いで、ＤＭＥＭ中の０−１０
００ｎＭ化合物の存在中、３７℃及び５％ＣＯ２で１時
間インキュベートする。細胞を生きたまま分析するか、
あるいはそれらをＨＢＳＳですすぎ、ＨＢＳＳ中の３．
７％ホルムアルデヒドで１５分間固定し、Ｈｏｅｃｈｓ
ｔ３３３４２で染色し、分析前に洗浄する。
【０１６３】イメージの獲得及び分析。動的データは、
化合物の添加後１分間隔で３０分間、生細胞の視野から
蛍光イメージ対（カスパーゼ−ＧＦＰ及びＨｏｅｃｈｓ
ｔ３３３４２−標識核）を獲得することによって収集す
る。同様に、イメージ対は、化合物の添加から１時間後
に、固定された時点のスクリーニングプレートの各ウェ
ルから得られる。両方の場合、各時点で得られたイメー
ジ対を用いて各細胞中の核及び細胞質領域を規定する。
核中のカスパーゼ−ＧＦＰの積分蛍光強度を細胞質中の
キメラの積分蛍光強度で割ることによって、あるいはＧ
ＦＰ蛍光の核−細胞質差異として、ガスパーゼ−ＧＦＰ
の移動を計算する。固定時点スクリーニングにおいて、
この移動比率は、テストした化合物の各濃度において少
なくとも２００の細胞から得られたデータから計算され
る。従って、ガスパーゼ−ＧＦＰの細胞質から核への薬
物−誘導移動は移動比率の増加に相関する。限定される
ものではないがアポトーシス−活性化酵素の推定アクチ
ベータまたはインヒビターを含むものを含めた分子相互
作用ライブラリを用いて、インジケータ細胞系をスクリ
ーニングし、ＤＡＳについての特異的リガンド及び化合
物活性によって活性化された経路を同定する。
【０１６４】（実施例１１） ＤＡＳからの新規なステロイド受容体の同定 本実施の態様を使用するには２つの源の物質及び／また
は情報が必要であり、これは特徴付けされていない遺伝
子の機能の評価を可能とする。まず、哺乳動物細胞への
トランスフェクションに適したｃＤＮＡ配列を含有する
病気関連配列バンク（類）を用いることができる。各Ｒ
ＡＤＥまたは示差発現実験は数百までの配列を生じるの
で、ＤＡＳの豊富な供給を生じさせることができる。第
２に、一次配列データベースサーチからの情報を用い
て、限定されるものではないが、シグナル配列、７つの
膜貫通モチーフ、保存されたプロテアーゼ活性部位ドメ
イン、または他の同定可能なモチーフを含有するものを
含めた広いカテゴリーにＤＡＳをおくことができる。こ
れらの源から獲得された情報に基づいて、アルゴリズム
タイプ及び形質移入すべきインジケータ細胞系を選択す
る。非常に多数のモチーフが既によく特徴付けされてお
り、現存のゲノムデータベースにおける非常に多数の遺
伝子内に含まれる線状配列にコードされている。
【０１６５】１つの実施の態様において、以下の工程が
採られる： １）（データベースサーチを含めた）ＤＡＳ同定実験か
らの情報を、関連生物学的プロセスを選択するための基
礎として用いる（例えば、細胞周期変調、アポトーシ
ス、転移性プロテアーゼ等についての腫瘍系からのＤＡ
Ｓを見られたし）。
【０１６６】２）同定可能なモチーフ（すなわち、シグ
ナル配列、７−膜貫通ドメイン、保存されたプロテアー
ゼ活性ドメイン等）によるＤＮＡ配列またはＤＡＳの分
類。この最初のグループ分けは、前記したように、蛍光
タギング戦略、宿主細胞系、インジケータ細胞系、及び
スクリーニングすべき生物活性分子のバンクを決定する
であろう。
【０１６７】３）十分に確立された分子生物学方法を用
いると、この目的でデザインされた発現ベクターにＤＡ
Ｓが連結される。一般化された発現ベクターは、一過性
発現のために細胞に標的配列をデリバーするためのプロ
モーター、エンハンサー及びターミネーターを含有す
る。また、かかるベクターは、宿主によって発現された
場合に検出を容易にするために、抗体タギング配列、直
接会合配列、クロモフォア融合配列様ＧＦＰを含有する
ことができる。
【０１６８】４）リン酸カルシウム共沈殿リポソーム媒
介、ＤＥＡＥデキストラン媒介、ポリカチオン媒介、ウ
イルス媒介またはエレクトロポレーションを含めた標準
的なトランスフェクションプロトコルを用いてＤＡＳ含
有ベクターで細胞を一過的に形質移入し、マイクロタイ
タープレートまたはマイクロウェルアレイに平板培養す
る。別法として、トランスフェクションはマイクロタイ
タープレートそれ自体中で直接行うことができる。
【０１６９】５）前記したように細胞スクリーニング方
法を行う。
【０１７０】本実施の態様においては、転写活性化ポテ
ンシャルを示すモチーフ（例えば、ＤＮＡ結合ドメイ
ン、アミノ末端変調ドメイン、ヒンジ領域またはカルボ
キシル末端リガンド結合ドメイン）を保有することが示
されているＤＡＳを利用して新規ステロイド受容体を同
定する。
【０１７１】この実験についての蛍光タグの定義は、Ｇ
ＦＰをコードする遺伝子に近位で融合した発現ベクター
へのＤＡＳの挿入を介してＧＦＰキメラを創製すること
による、ＤＡＳを染色しタギングすることを介する核の
同定を含む。別法として、発現されたＤＡＳのいくつか
の部分に対して高親和性を持つ一本鎖抗体断片は、当該
分野で利用できる技術（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉ
ｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて構築で
き、フルオロフォア（ＦＩＴＣ）に連結して、細胞中の
推定転写アクチベータ／受容体にタグすることができる
であろう。この別法は、ＤＮＡトランスフェクションを
要しない外部タグを提供し、従って、もし分布データが
ＤＡＳを生じさせるのに用いる元の初代培養から集める
べきであれば有用であろう。
【０１７２】プラスミド構築体。緑色蛍光蛋白質−ＤＡ
Ｓキメラについてのコーディング配列を含有する真核生
物発現プラスミドはＧＦＰ突然変異体を用いて調製され
る。該構築体を用いてＨｅＬａ細胞を形質移入する該プ
ラスミドは、宿主細胞に形質移入されると、ＧＦＰ−Ｄ
ＡＳｐｐと命名されたＤＡＳ蛋白質産物に融合したＧＦ
Ｐを生じる。
【０１７３】細胞の調製及びトランスフェクション。Ｈ
ｅＬａ細胞をトリプシン処理し、５％木炭／デキストラ
ン−処理ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）及
び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｃ−ＤＭＥ
Ｍ）を含有するＤＭＥＭを用いて、トランスフェクショ
ンに１２−２４時間先立って平板培養し、３７℃及び５
％ＣＯ２でインキュベートする。トランスフェクション
はリン酸カルシウム共沈殿によってまたはディポフェク
タミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で行
う。リン酸カルシウムトランスフェクションでは、５％
木炭／デキストラン−処理ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ
で、トランスフェクションに先立って、培地を置き換え
る。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２にて４−５時間、リン
酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿と共にインキュベートし、Ｄ
ＭＥＭで３−４回洗浄して沈殿を除去し、続いてＣ−Ｄ
ＭＥＭを添加する。リポフェクタミントランスフェクシ
ョンは製造業者の指示に従って抗生物質なくして無血清
ＤＭＥＭ中で行う。ＤＮＡ−リポソーム複合体との２−
３時間インキュベーションに続き、培地を取り出し、Ｃ
−ＤＭＥＭで置き換える。９６−ウェルのマイクロタイ
タープレート中の全ての形質移入された細胞を、薬物処
理に先立って２４−４８時間、３３℃及び５％ＣＯ２で
インキュベートする。実験はＨｅＬａ細胞中で一過的に
発現される受容体で行う。
【０１７４】発現された細胞内部のＧＦＰ−ＤＡＳｂｐ
の位置決定。細胞分布データを得るために、形質移入さ
れた細胞の核を、まず、３３℃及び５％ＣＯ２で２０分
間、Ｃ−ＤＭＥＭ中の５μｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔ３
３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で標識
する。細胞をハンクスの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で洗
浄する。細胞は生きたまま分析するか、あるいはそれら
はＨＢＳＳですすぎ、ＨＢＳＳ中の３．７％ホルムアル
デヒドで１５分間固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で
染色し、分析前に洗浄する。
【０１７５】好ましい実施の態様において、イメージの
獲得及び分析は、本発明の細胞スクリーニングシステム
を用いて行われる。細胞内ＧＦＰ−ＤＡＳｐｐ蛍光信号
は、視野細胞からの蛍光イメージ対（ＧＦＰ−ＤＡＳｐ
ｐ及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２−標識核）を獲得する
ことによって収集される。各時点で得られたイメージ対
を用いて、各細胞における核及び細胞質領域を規定す
る。細胞質において分散した信号を示すデータは、ＤＮ
Ａ転写アクチベーターである公知のステロイド受容体と
一致するであろう。
【０１７６】インジケータ細胞系としてのＧＦＰ−ＤＡ
Ｓｐｐの適当な発現につき確認された、ＧＦＰ−ＤＡＳ
ｐｐ移動の同定のためのスクリーニング。前記構築体を
用い、種々のリガンドのスクリーニングは、限定される
ものではないが、エストロゲン、プロゲステロン、成長
因子、アンドロゲン、及び多くの他のステロイド及びス
テロイドベースの分子を含めた一連のステロイドタイプ
のリガンドを用いて行われる。イメージの獲得及び分析
は、本発明の細胞スクリーニングシステムを用いて行わ
れる。細胞内ＧＦＰ−ＤＡＳｐｐ蛍光信号は、視野細胞
からの蛍光イメージ対（ＧＦＰ−ＤＡＳｐｐ及びＨｏｅ
ｃｈｓｔ３３３４２−標識核）を獲得することによって
収集される。各時間で得られたイメージ対を用いて、各
細胞における核及び細胞質領域を規定する。ＧＦＰ−Ｄ
ＡＳｐｐの移動は、核中のＧＦＰ−ＤＡＳｐｐの積分蛍
光強度を細胞質中の該キメラの積分蛍光強度で割ること
によって、あるいはＧＦＰ蛍光の核−細胞質差異として
計算される。核へり細胞質からの移動は、ＤＡＳｐｐの
リガンド結合活性化を示し、かくして、潜在的受容体の
クラス及び作用を同定する。ステロイド受容体の公知の
インヒビター及びモディファイアーを用いて同様にして
得られた他のデータとこのデータとを組み合わせると、
標的としてのＤＡＳｐｐを有効化し、あるいはより多く
のデータが種々の源から生じるであろう。
【０１７７】（実施例１２） さらなるスクリーン 原形質膜及び細胞質の間の移動 プロフィリン複合体の解離及びプロフィンの原形質膜へ
の結合。１つの実施の態様において、プロフィン膜結合
の蛍光蛋白質バイオセンサは、精製されたプロフィリン
（Ｆｅｄｅｒｏｖら，（１９９４），Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．
Ｂｉｏｌ．２４１：４８０−４８２；Ｌａｎｂｒｅｃｈ
ｔｓら（１９９５），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２
３０：２８１−２８６）を、２−３００ナノ秒の範囲の
蛍光寿命を保有するプローブで標識することによって調
製される。標識されたプロフィリンを、バルクローディ
ング方法及びインジケータ細胞を用いて生細胞インジケ
ータ細胞に導入し、テスト化合物で処理する。蛍光異方
性イメージング顕微鏡（Ｇｏｕｇｈ及びＴａｙｌｏｒ
（１９９３），Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２１：１０
９５−１１０７）を用いて、０．１秒ないし１０時間の
範囲の処理後における時間の間の細胞質及び膜の間のプ
ロフィンの蛍光誘導体のテスト−化合物依存性移動を測
定する。
【０１７８】Ｒｈｏ−ＲｈｏＧＤＩ複合体の膜への移
動。もう１つの実施の態様において、インジケータ細胞
をテスト化合物で処理し、次いで、固定し、洗浄し、浸
透させる。インジケータ細胞の原形質膜、細胞質及び核
を全て区別した色の付いたマーカーで標識し、続いて、
第４の色で標識した抗体でＲｈｏ蛋白質で免疫位置決定
する（Ｓｅｌｆら，（１９９５），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２５６：３−１０；Ｔａｎ
ａｋａら，（１９９５），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ ２５６：４１−４９）。４つの標識の
各々を細胞スクリーニングシステムを用いて別々にイメ
ージし、イメージを用いて、テスト化合物によって行わ
れた移動の阻害または活性化の量を計算する。この計算
を行うために、原形質膜及び細胞質をマークするのに使
用したプローブのイメージを用いて、細胞内Ｒｈｏ蛋白
質の位置をマークする免疫学的プローブのイメージをマ
スクする。各マスク下の単位面積当たりの積分輝度を用
いて、原形質積分膜輝度／面積を細胞質積分輝度／面積
によって割ることによって移動商を形成する。対照及び
実験ウェルからの移動商値を組み合わせることによっ
て、パーセント移動を各潜在的リード化合物につき計算
する。
【０１７９】Ｇ−蛋白質活性化に対しての原形質膜に対
するβ−アレスチン移動 細胞質から膜への移動の高内容スクリーニングのもう１
つの実施の態様において、細胞質から原形質膜へのβ−
アレスチン蛋白質の移動は細胞処理に応答して測定され
る。移動を測定するには、発光ドメインマーカーを含有
するインジケータ生細胞をテスト化合物で処理し、β−
アレスチンマーカーの移動を、本発明の細胞スクリーニ
ングシステムを用いて時間及び空間内で測定する。好ま
しい実施の態様において、インジケータ細胞は、一過的
または安定な細胞トランスフェクションの使用を通じて
インジケータ細胞によって発現される緑色蛍光蛋白質β
−アレスチン（ＧＦＰ−β−アレスチン）蛋白質キメラ
（Ｂａｒａｋら，（１９９７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２７２：２７４９７−２７５００；Ｄａａｋａ
ら，（１９９８），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７
３：６８５−６８８）よりなるマーカー及び細胞質及び
膜ドメインをマークするのに使用される他のレポーター
を含有する。インジケータ細胞が休止状態にある場合、
ドメインマーカー分子は原形質膜または細胞質に支配的
に分配される。高内容スクリーニングにおいて、これら
のマーカーを用いて、蛍光の区別されるチャンネルにお
ける細胞質及び原形質膜を示す。インジケータ細胞をテ
スト化合物で処理すると、ＧＦＰ−β−アレスチンの動
的再分布が、０．１秒ないし１０時間の範囲のタイムス
ケールにわたって一連のイメージとして記録される。好
ましい実施の態様において、タイムスケールは１時間で
ある。各イメージは、原形質膜及び細胞質の間のＧＦＰ
−β−アレスチン蛋白質キメラの移動を定量する方法に
よって分析される。この計算を行うために、プローブの
イメージを用いて原形質膜をマークし、細胞質を用い
て、細胞内ＧＦＰ−β−アレスチン蛋白質の位置をマー
クするＧＦＰ−β−アレスチンプローブのイメージをマ
スクする。各マスク下で面積当たりの積分輝度を用い、
原形質膜積分輝度／面積を細胞質積分輝度／面積で割る
ことによって、移動商を形成する。対照及び実験ウェル
からの移動商を比較することによって、パーセント移動
を各潜在的リード化合物につき計算する。高内容スクリ
ーニングの出力は、注目するテスト化合物で処理されて
いる非常に多数の個々の細胞内の移動の大きさを記載す
る定量的データに関する。
【０１８０】小胞体及びゴルジ体の間の移動 小胞体からゴルジ体への移動高内容スクリーニングの１
つの実施の態様において、水泡性口内炎ウイルスのｔｓ
０４５突然変異体からのＶＳＶＧ蛋白質（Ｅｌｌｅｎｂ
ｅｒｇら，（１９９７），Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１
３８：１１９３−１２０６；Ｐｒｅｓｌｅｙら，（１９
９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９：８１−８５）の小胞体か
らゴルジ体ドメインへの移動は細胞処理に応答して測定
される。移動を測定するには、発光レポーターを含有す
るインジケータ細胞テスト化合物で処理し、レポーター
の移動は、本発明の細胞スリーニングシステムを用いて
交換及び時間にて測定される。インジケータ細胞は、一
過的または安定な細胞トランスフェクションの使用を通
じてインジケータ細胞によって発現されるＧＦＰ−ＶＳ
ＶＧ蛋白質キメラ及び小胞体及びゴルジ体ドメインの位
置を測定するのに使用される他のドメインマーカーより
なる発光レポーターを含有する。インジケータ細胞が４
０℃のその休止状態にあると、ＧＦＰ−ＶＳＶＧ蛋白質
キメラ分子は小胞体に支配的に分配される。この高内容
スクリーニングにおいて、区別される色のドメインマー
カーを用いて、蛍光の区別されるチャンネル中の小胞体
及びゴルジ体ドメインを示す。インジケータ細胞をテス
ト化合物で処理し、かつ温度を同時に３２℃まで低下さ
せると、ＧＦＰ−ＶＳＶＧ蛋白質キメラの動的再分布
は、０．１秒ないし１０時間の範囲のタイムスケールに
わたって一連のイメージとして記録される。各イメージ
は、小胞体及びゴルジ体ドメインの間のＧＦＰ−ＶＳＶ
Ｇ蛋白質キメラの移動を定量する方法によって分析され
る。この計算を行うには、小胞体及びゴルジ体ドメイン
をマークするのに使用されるプローブのイメージを用い
て、ＧＦＰ−ＶＳＶＧプローブをマスクし、細胞内ＧＦ
Ｐ−ＶＳＶＧ蛋白質の位置をマークする。各マスク下の
単位面積当たりの積分輝度を用い、小胞体積分輝度／面
積をゴルジ体積分輝度／面積で割ることによって移動商
を形成する。対照及び実験ウェルからの移動商値を比較
することによって、各潜在的リード化合物につきパーセ
ント移動を計算する。高内容スクリーニングの出力は、
１分ないし１０時間の範囲の間、１０−１２Ｍないし１
０−３Ｍの範囲の最終濃度において注目するテスト化合
物で処理されている非常に多数の個々の細胞内の移動の
大きさを記載する定量的データに関する。
【０１８１】オルガネラ機能の誘導及び阻害 細胞内微小管の安定性。オルガネラ機能の高内容スクリ
ーニングの１つの実施の態様において、細胞内微小管の
アセンブリ状態は細胞処理に応答して測定される。微小
管アセンブリ状態を測定するには、発光レポーターを含
有するインジケータ細胞をテスト化合物で処理し、レポ
ーターの分布を、本発明の細胞スクリーニングシステム
を用いて空間及び時間において測定する。
【０１８２】好ましい実施の態様において、細胞内微小
管アセンブリはＭＡＰ ４（Ｂｕｌｉｎｓｋｉら，（１
９９７），Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１０：３
０５５−３０６４）、間期及び有糸分裂細胞において微
小管と相互作用することが知られている普遍微小管関連
蛋白質である。インジケータ細胞は、一過的または安定
な細胞トランスフェクションの使用を通じてインジケー
タ細胞によって発現されるＧＦＰ−ＭＡＰ ４キメラ及
び細胞質及び膜構成要素の位置を測定するのに使用され
る他のレポーターよりなる発光レポーターを含有する。
ＧＦＰ−ＭＡＰ４は以下のように調製される：制限酵素
部位を導入するためのプライマーを用いる天然または突
然変異体ＧＦＰ分子のＰＣＲ増幅が好ましい。ＰＣＲ産
物を真核生物発現ベクター内のＭＡＰ ４ ｃＤＮＡに
連結する。次いで、インジケータ細胞を発現ベクターで
形質移入して、一過的にまたは安定に形質移入されたイ
ンジケータ細胞を得る。
【０１８３】インジケータ細胞を、１分ないし１０時間
の範囲の間、１０−１２Ｍないし１０−３Ｍの範囲の最
終濃度のテスト化合物で処理する。核及び細胞質をマー
クするための標識試薬を含有する増殖培地を添加する。
インキュベーションの後、細胞をハンクスの平衡塩溶液
（ＨＢＳＳ）で洗浄し、室温にて３．７％ホルムアルデ
ヒドで１０分間固定し、洗浄し、ＨＢＳＳ中で保存す
る。
【０１８４】イメージデータは固定細胞及び生細胞双方
から得られる。得られた各イメージから形態データを抽
出するために、以下の分析方法を用いる： １．核または細胞境界の外側の各画素につき値＝０を有
するマスクを生じさせるための各核及び細胞質イメージ
に閾値を付与する。
【０１８５】２．マスクを元のイメージに重ね、視野中
の各対象（すなわち、核または細胞）を検出し、そのサ
イズ及び積分強度を計算する。
【０１８６】３．前記で得られた全細胞マスクを対応す
るＧＦＰ−ＭＡＰ ４イメージに重ね、エッジ強度ルー
チンの自動測定（Ｋｏｌｅｇａら，（１９９３）Ｂｉｏ
Ｉｍａｇｉｎｇ １：１３６−１５０）を用いて、各細
胞内の全エッジ強度を計算する。細胞サイズを正規化す
るために、全エッジ強度を細胞面積で割って「強靭性」
を得る。大きな強靭性は強いエッジ強度値に関連し、従
って、区別される微小管構造を含有する細胞において最
大である。同様に、小さな強靭値は弱いエッジ強度に関
連し、脱重合微小管を持つ細胞において最小である。強
靭性値の生理学的範囲は、微小管安定化薬物パクリタキ
セル（１０μＭ）または微小管脱重合薬物ノコダゾール
（１０μｇ／ｍｌ）いずれかで細胞を処理することによ
って設定される。
【０１８７】マクロ分子の機能的位置に関連する高内容
スクリーニング 高内容スクリーニングのこのクラス内では、外部刺激に
応答してのマクロ分子の機能的位置は生細胞内である。
【０１８８】解糖酵素活性の調節。細胞酵素活性高内容
スクリーニングの好ましい実施の態様において、鍵とな
る解糖調節酵素の活性を処理細胞で測定する。酵素活性
を測定するには、発光標識試薬を含有するインジケータ
細胞をテスト化合物で処理し、レポーターの活性を、本
発明の細胞スクリーニングシステムを用いて空間及び時
間において測定する。
【０１８９】１つの実施の態様において、細胞内酵素活
性のレポーターはアラクトース−６−リン酸、２−キナ
ーゼ／フラクトース−２，６−ビスホスファターゼ（Ｐ
ＦＫ−２）、そのリン酸化状態が細胞内炭水化物の同化
及び異化を示す調節酵素である（Ｄｅｐｒｅｚら，（１
９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１７２６９
−１７２７５；Ｋｅａｌｅｒら，（１９９６）ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔｅｒｓ ３９５：２２５−２２７；Ｌｅｅ
ら，（１９９６），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３５：６
０１０−６０１９）。インジケータ細胞はＰＦＫ−２リ
ン酸化の蛍光蛋白質バイオセンサよりなる発光レポータ
ーを含有する。蛍光蛋白質バイオセンサは、環境的に感
受性の蛍光染料を当該酵素の既知のリン酸化部位近くに
導入することによって構築される（Ｄｅｐｒｅｚら，
（１９９７），前掲；Ｇｉｕｌｌｉａｎｏら，（１９９
５），前掲）。該染料はケトシアニンのクラスのもので
あり得るか（Ｋｅｓｓｌｅｒ及びＷｏｌｆｂｅｉｓ（１
９９１），Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ
４７Ａ：１８７−１９２）、あるいは蛋白質反応性部位
及びその励起または発光スペクトルが溶液の極性に感受
性であるフルオロクロムを含有するいずれかのクラスの
ものであり得る。蛍光蛋白質バイオセンサはバルクロー
ディング方法を用いてインジケータ細胞に導入される。
【０１９０】インジケータ生細胞を、０．１秒ないし１
０時間の範囲の間、１０−１２Ｍないし１０−３Ｍの範
囲の最終濃度でテスト化合物で処理する。好ましい実施
の態様において、比率イメージデータは、各時点におい
て蛍光イメージのスペクトル部分を収集することによっ
て処理したイメージデータ細胞から得られる。各自点か
ら形態データを抽出するために、各自点における２つの
スペクトルイメージを画素間で数字的に分割することに
よって、比率をイメージの各対の間で出す。次いで、各
画素値を用いて、ＰＦＫ−２のリン酸化分率を計算す
る。リン酸化の小さな分率値では、ＰＦＫ−２は炭水化
物代謝を刺激する。リン酸化の高い分率値では、ＰＦＫ
−２は炭水化物異化を刺激する。
【０１９１】プロテインキナーゼＡ活性及びサブユニッ
トの位置。高内容スクリーニングのもう１つの実施の態
様において、インジケータ内のプロテインキナーゼＡ
（ＰＫＡ）のドメイン位置及び活性双方をテスト化合物
での処理に応答して測定する。
【０１９２】インジケータ細胞はＰＫＡ活性化の蛍光蛋
白質バイオセンサを含む蛍光レポーターを含有する。蛍
光蛋白質バイオセンサは、ＰＫＡの調節サブユニッと相
互作用することが知られている部位近くのＰＫＡの触媒
サブユニッに環境感受性蛍光染料を導入することによっ
て構築される（Ｈａｒｏｏｔｕｎｉａｎら，（１９９
３），Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ
４：９９３−１００２；Ｊｏｈｎｓｏｎら，（１９９
６），Ｃｅｌｌ ８５：１４９−１５８；Ｇｉｕｌｉａ
ｎｏら，（１９９５），前掲）。該染料はケトシアニン
クラスのものであり得るか（Ｋｅｓｓｌｅｒ及びＷｏｌ
ｆｂｅｉｓ（１９９１），Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃ
ａ Ａｃｔａ ４７Ａ：１８７−１９２）、あるいは蛋
白質反応性部位及びその励起または発光スペクトルが溶
液の極性に感受性であるフルオロクロムを含有するいず
れかのクラスのものであり得る。ＰＫＡ活性化の蛍光蛋
白質バイオセンサはバルクローディング方法を用いてイ
ンジケータ細胞に導入される。
【０１９３】１つの実施の態様において、インジケータ
生細胞を、０．１秒ないし１０時間の範囲の間、１０
−１２Ｍないし１０−３Ｍの範囲の最終濃度でテスト化
合物で処理する。好ましい実施の態様において、比率イ
メージデータは、処理されたインジケータ生細胞から得
られる。各時点からバイオセンサデータを抽出するに
は、イメージの各対の間で比率を求め、次いで、各画素
値を用いてＰＫＡの活性化分率を計算する（例えば、ｃ
ＡＭＰ結合後における触媒及び調節サブユニットの分
離）。活性の高分率値では、ＰＦＫ−２は生細胞内で生
化学的カスケードを刺激する。
【０１９４】ＰＫＡの触媒サブユニットの移動を測定す
るために、発光レポーターを含有するインジケータ細胞
をテスト化合物で処理し、レポーターの移動を、細胞ス
クリーニングシステムを用いて空間及び時間において測
定する。インジケータ細胞は、細胞質及び核ドメインの
位置を測定するのに使用されるドメインマーカーよりな
る発光レポーターを含有する。インジケータ細胞をテス
ト化合物で処理すると、ＰＫＡ蛍光蛋白質バイオセンサ
の動的再分布が、０．１秒ないし１０時間のタイムスケ
ールにわたって一連のイメージとして細胞内で記録され
る。細胞質及び核ドメインの間のＰＫＡの移動を定量す
る方法によって各イメージを分析する。この計算をなす
には、細胞質及び核ドメインをマークするのに使用され
るプローブのイメージを用いて、ＰＫＡ蛍光蛋白質バイ
オセンサのイメージをマスクする。各マスク下の単位面
積当たりの積分輝度を用い、細胞質積分輝度／面積を核
積分輝度／面積で割ることによって移動商を求める。対
照及び実験ウェルからの移動商値を比較することによっ
て、各潜在的リード化合物につきパーセント移動を計算
する。高内容スクリーニングの出力は、１０−１２Ｍな
いし１０−３Ｍの濃度範囲のテスト化合物で処理してあ
る非常に多数の個々の細胞内の移動の大きさを記載する
定量的データに関する。
【０１９５】遺伝子発現の誘導または阻害に関連する高
内容スクリーニング ＲＮＡベースの蛍光バイオセンサ 細胞骨格蛋白質の転写及びメッセージ位置。細胞−基材
接着、細胞間接着、信号変換、細胞間事象、仲介及びシ
グナリング分子代謝、細胞移行、細胞間通信及び細胞死
滅を含めた細胞生理学応答の一般的クラスの調節は遺伝
子発現の改変に関連し得る。また、高内容スクリーニン
グはこのクラスの生理学的応答を測定するように設計す
ることができる。
【０１９６】１つの実施の態様において、細胞内遺伝子
発現のレポーターは、標的ｍＲＮＡとハイブリダイズす
ることができ、その蛍光シグナルを改変することができ
るオリゴヌクレオチドである。好ましい実施の態様にお
いて、オリゴヌクレオチドは分子ビーコン（Ｔｙａｇｉ
及びＫｒａｍｅｒ（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ．１４：３０３−３０８）、その蛍光信号が分子
間及び分子内相互津要に依存している発光ベースの試薬
である。蛍光バイオセンサは、試薬の各端部（５’及び
３’）に１つがあるように、蛍光染料の蛍光エネルギー
移行対を導入することによって構築される。該染料は、
蛋白質反応性部位及び、その励起及び発光スペクトルが
十分に重複して、限定されるものではないが、フルオレ
セイン及びローダミンを含めた、休止状態における染料
間の蛍光エネルギー移行を供するフルオロクロムを含有
する（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎ
ｃ．）。好ましい実施の態様において、β−アクチンを
コードするメッセージの一部（Ｋｉｓｋａｕｓｋｉｓ
ら，（１９９４），Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２７：
４４１−４５１；ＭｃＣａｎｎら，（１９９６），Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：５６７９−
５６８４；Ｓｕｔｏｈ（１９８２），Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ２１：３６５４−３６６１）を、分子内交雑
のため一緒に連結された端部を持つヘアピン−形状のオ
リゴヌクレオチドのループ領域に挿入される。バイオセ
ンサの各端部において、蛍光デナー（フルオレセイン）
及び蛍光アクセプター（ローダミン）が共有結合する。
連結状態において、蛍光エネルギー移動は最大であり、
従って、未ハイブリダイズド分子の指標となる。β−ア
クチンをコードするｍＲＮＡとハイブリダイズすると、
連結は破壊され、エネルギー移動は喪失する。完全な蛍
光バイオセンサは、バルクローディング方法を用いてイ
ンジケータ細胞に導入される。
【０１９７】１つの実施の態様において、インジケータ
生細胞を、０．１秒ないし１０時間の範囲の間、１０
−１２Ｍないし１０−３Ｍの範囲の最終濃度のテスト化
合物で処理する。好ましい実施の態様において、処理さ
れたインジケータ生細胞から比率イメージデータが得ら
れる。各自点からの形態データを抽出するために、イメ
ージの各対の間で比率を求め、次いで、各画素値を用い
て標識ヌクレオチドの交雑分率を計算する。小さな分率
値の交雑において、β−アクチンの発現はほとんど示さ
れない。高い分率値の交雑において、β−アクチンの最
大発現が示される。さらに、インジケータ細胞の細胞質
内のハイブリダイズした分子の分布もまたインジケータ
細胞の生理学的応答の尺度である。
【０１９８】リガンドの細胞表面結合 生細胞におけるその細胞表面受容体への標識インスリン
の結合。この原形質膜ドメインが特定の色の標識試薬で
標識されている細胞を、適当な条件下で適当な時間、異
なる色の発光プローブで標識されたインスリン分子（Ｌ
ｅｅら，（１９９７），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３
６：２７０１−２７０８；Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｚａｇｕ
ｉｌａｎら，（１９９６），Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．２７０：Ｃ１４３８−Ｃ１４４６）を含有する溶液
と共にインキュベートする。インキュベーションの後
に、未結合インスリン分子を洗浄除去し、細胞を固定
し、原形質膜上のインスリンの分布及び濃度を測定す
る。これを行うために、細胞膜イメージをインスリンイ
メージ用のマスクとして使用する。マスクしたインスリ
ンイメージからの積分強度を、標識インスリンの既知量
を含有するイメージの組と比較する。細胞に結合したイ
ンスリンの量は標準から決定され、該細胞と共にインキ
ュベートした全濃度のインスリンと組み合わせて用い
て、解離定数またはその細胞表面受容体に対するインス
リンを計算する。
【０１９９】細胞区画の標識 全細胞標識 全細胞標識は、細胞形状のダイナミックス及び細胞の移
動度が細胞の蛍光イメージを分析することによって経時
的に測定することができるように、細胞構成要素を標識
することによって達成される。
【０２００】１つの実施の態様において、小さな反応性
蛍光分子は生細胞に導入する。これらの膜−浸透性分子
は原形質膜中の蛋白質構成要素を通じて拡散すると共に
それと反応する。染料分子は細胞内分子と反応して、各
分子から発せられた蛍光信号を増加させると共に、生細
胞内に蛍光染料を捕獲する。これらの分子はアミノクマ
リンの反応性クロロメチル誘導体、ヒドロキシクマリ
ン、エオシン二酢酸塩、フルオレセイン二酢酸塩、いく
つかのＢｏｄｉｐｙ染料誘導体及びテトラメチルローダ
ミンを含む。マクロ分子に向けてのこれらの染料の反応
性は遊離一次アミノ基及び遊離スルフヒドリル基を含
む。
【０２０１】もう１つの実施の態様において、細胞表面
上の分子と特異的に反応する蛍光標識抗体またはレクチ
ン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と細胞とを相互作用させるこ
とによって細胞表面を標識する。緑色蛍光蛋白質または
その突然変異体を含有する注目細胞によって発現された
細胞表面蛋白質キメラを用いて全細胞表面を蛍光標識す
ることもできる。いったん全細胞が標識されれば、全細
胞または細胞アレイは、細胞の形状、移動度、サイズ、
ならびに増殖及び分裂の測定に関連する、高内容スクリ
ーニングでのパラメータとなり得る。
【０２０２】原形質膜標識 １つの実施の態様において、全原形質膜の標識は、全細
胞を標識するための前記と同一の方法のうちのいくつか
を使用する。全細胞表面を標識する発光分子は原形質膜
を描くように作用する。
【０２０３】原形質膜の第２の実施の態様のサブドメイ
ンにおいて、細胞外表面、脂質二層及び細胞内表面を別
々に標識し、高内容スクリーニングの構成要素として用
いる。第１の実施の態様において、スクシンイミジルエ
ステルのような反応性蛍光分子またはフルオレセイン、
ローダミン、シアニン及びＢｏｄｉｐｙのような蛍光染
料のヨードアセトアミド誘導体での簡単な処理を用いて
細胞外表面を標識する。
【０２０４】第３の実施の態様において、細胞表面分子
に対する高い親和性を持って蛍光標識マクロ分子を用い
て細胞外表面を標識する。これらはフルオレセイン、ロ
ーダミンのような蛍光標識レクチン、及びタチナタマメ
（Ｃｏｎ Ａ）、インゲンマメ（エリスロアグルチニン
ＰＨＡ−Ｅ）、小麦胚芽に由来するレクチンのシアニ
ン誘導体を含む。
【０２０５】第４の実施の態様において、細胞表面構成
要素に対する高親和性を持つ蛍光標識抗体を用いて、原
形質膜の細胞外領域を標識する。細胞表面受容体及びイ
オンチャンネルの細胞外領域は抗体で標識することがで
きる蛋白質の例である。
【０２０６】第５の実施の態様において、原形質膜の脂
質二層を蛍光分子で標識する。これらの分子は、原形質
膜脂質二層の中心にある疎水性領域と強く相互作用する
長鎖疎水性分子に付着した蛍光染料を含む。これらの染
料の例は染料のＰＫＨシリーズ（米国特許第４，７８
３，４０１号、第４，７６２，７０１号及び第４，８５
９，５８４号；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍ
ｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．）、ニトロベンズ
オキサジアゾールグリセロホスフォエタノールアミン及
びフルオレセイン−誘導体化ジヘキサデカノイルグリセ
ロホスフォエタノールアミンのような蛍光リン脂質、５
−ブチル−４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ
−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ノナン酸及び１−ピレ
ンデカン酸のような蛍光脂肪酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）、４，４−ジフルオロー５，
７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−イ
ンダセン−３−ドデカン酸コレステリル及び１−ピレン
ヘキサン酸コレステリルを含めて蛍光ステロール、アネ
キシンＶのフルオレセイン誘導体のような脂質二層構成
要素と特異的に相互作用する蛍光標識蛋白質（Ｃａｌｔ
ａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍ
ｅ，ＣＡ）を含む。
【０２０７】もう１つの実施の態様において、原形質膜
の細胞内構成要素を蛍光分子で標識する。これらの分子
の例はトリマＧ−蛋白質受容体、アデニリルシクラーゼ
及びイオン輸送蛋白質の細胞内構成要素である。これら
の分子は、蛍光標識特異的抗体への密接な結合の結果と
して、あるいは膜−会合蛋白質及び緑色蛍光蛋白質から
構成される蛍光蛋白質キメラ、及びその突然変異体の取
り込みによって標識することができる。
【０２０８】エンドソーム蛍光標識 １つの実施の態様において、受容体−媒介エンドサイト
ーシスによって細胞に輸送されたリガンドを用いてエン
ドソームオルガネラのダイナミッスを追跡する。標識リ
ガンドの例はＢｏｄｉｐｙ ＦＬ−標識低密度リポ蛋白
質複合体、テトラメチルローダミントランスフェリンア
ナログ、及び蛍光標識表皮細胞成長因子（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）を含む。
【０２０９】第２の実施の態様において、エンドソーム
リガンドを特異的に標識する蛍光標識一次または二次抗
体（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．Ｓｔ．Ｌｏ
ｕｉｓ，ＭＯ．；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，
Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；Ｃａｌｔａｇ Ａｎｔ
ｉｂｏｄｙ Ｃｏ．）を用いて細胞中のエンドソーム区
画をマークする。
【０２１０】第３の実施の態様において、その内部化が
エンドソームを標識する受容体と、緑色蛍光蛋白質また
はその突然変異体とを融合させることによって形成され
た蛋白質キメラを発現する細胞中でエンドソームを蛍光
標識する。ＥＧＦ、トランスフェリン及び低密度リポ蛋
白質受容体のキメラがこれらの分子の例である。
【０２１１】リソソーム標識 １つの実施の態様において、膜浸透性リソソーム−特異
的発光試薬を用いて、生細胞及び固定細胞のリソソーム
区画を標識する。これらの試薬は発光分子のニュートラ
ルレッド、Ｎ−（３−（（２，４−ジニトロフェニル）
アミノ）プロピル）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−メ
チルアミン、及びリソソーム内ｐＨならびにリソソーム
の動的分布を報告するＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒプローブ
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．）を含
む。
【０２１２】第２の実施の態様において、リソソーム抗
原に対する抗体（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．；
Ｃａｌｔａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏ．）を用いて、
特別のリソソームドメインに位置するリソソーム区画を
標識する。これらの構成要素の例はコレステロールエス
テルの加水分解に関与する分解酵素、膜蛋白質プロテア
ーゼ、及びヌクレアーゼならびにＡＴＰ−駆動リソソー
ムプロトンポンプである。
【０２１３】第３の実施の態様において、緑色蛍光蛋白
質またはその突然変異体のような固有発光蛋白質に遺伝
的に融合したリソソーム蛋白質よりなる蛋白質キメラを
用いてリソソームドメインを標識する。これらの構成要
素の例はコレステロールエステルの加水分解に関与する
分解酵素、膜蛋白質プロテアーゼ、及びヌクレアーゼな
らびにＡＴＰ−駆動リソソームプロトンポンプである。
【０２１４】細胞質蛍光標識 １つの実施の態様において、反応性基を持つ細胞浸透性
蛍光染料（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎ
ｃ．）を生細胞と反応させる。モノブロモビマン、５−
クロロメチルフルオレセイン二酢酸塩、カルボキシフル
オレセイン二酢酸塩スクシンイイジルエステル、及びク
ロロメチルテトラメチルローダミンを含めた反応性染料
は、細胞の細胞質の長期間標識で使用される細胞浸透性
蛍光染料の例である。
【０２１５】第２の実施の態様において、ルシファーイ
エロー及びカスケード青色ベースの蛍光染料（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．）のような極性ト
レーサー分子をバルクローディング方法を用いて細胞に
導入し、これはまた細胞質標識に使用される。
【０２１６】第３の実施の態様において、細胞質区画に
対する抗体（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．；
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．；Ｃａｌ
ｔａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏ．）を用いて細胞質を
蛍光標識する。細胞質抗原の実施例は媒介代謝に関与す
る酵素の多くである。エノラーゼ、ホスフォフルクトキ
ナーゼ、及びアセチル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは均一
に分布した細胞質抗原の例である。
【０２１７】第４の実施の態様において、緑色蛍光蛋白
質またはその突然変異体のような固有発光蛋白質に遺伝
的に融合した細胞質蛋白質よりなる蛋白質キメラを用い
て細胞質を標識する。均一に分布した蛋白質の蛍光キメ
ラを用いて全細胞質ドメインを標識する。これらの蛋白
質の例は媒介代謝に関与する蛋白質の多くであり、エノ
ラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ及びヘキソキナーゼを含
む。
【０２１８】第５の実施の態様において、細胞質抗原に
対する抗体 （Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．；
Ｃａｌｔａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏ．）を用いて、
特別の細胞質サブドメインに位置する細胞質構成要素を
標識する。これらの構成要素の例は細胞骨格蛋白質アク
チン、チュービュリン及びサイトケラチンである。細胞
内のこれらの蛋白質の集団は離散的構造に組み立てら
れ、この場合には繊維状である。従って、抗体ベースの
試薬でのこれらの蛋白質の蛍光標識は細胞質の特別のサ
ブドメインを標識する。
【０２１９】第６の実施の態様において、細胞質蛋白質
と強く相互作用する非抗体ベースの蛍光標識分子を用い
て特別の細胞質構成要素を標識する。１つの例は酵素Ｄ
ＮＡｓｅＩの蛍光アナログである（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．）。この酵素の蛍光アナログ
は細胞質アクチンに密にかつ特異的に結合し、かくし
て、細胞質のサブドメインを標識する。もう１つの実施
の態様において、キノコ毒のファロイジンまたは薬物パ
クリタキセルの蛍光アナログ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐ
ｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて、各々、アクチン−及
び微小管−細胞骨格の構成要素を標識する。
【０２２０】第７の実施の態様において、緑色蛍光蛋白
質またはその突然変異体のような固有発光蛋白質に遺伝
的に融合した細胞質蛋白質よりなる蛋白質キメラを用い
て細胞質の特別のドメインを標識する。高度に局所化さ
れた蛋白質の蛍光キメラを用いて細胞質サブドメインを
標識する。これらの蛋白質の例は細胞骨格の調節に関与
する蛋白質の多くである。それらは構造蛋白質のアクチ
ン、チュービュリン及びサイトケラチンならびに調節蛋
白質の微小管関連蛋白質４及びα−アクチニンを含む。
【０２２１】核ヌクレア標識 １の実施の態様において、膜浸透性核酸特異的発光試薬
（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．）を用い
て生細胞及び固定細胞の核を標識する。これらの試薬は
シアニンベースの染料（例えば、ＴＯＴＯ、ＹＯＹＯ、
ＢＯＢＯＴＭ、フェナンチジン及びアクリジン（例え
ば、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム及びアクリジ
ンオレンジ）、インドール及びイミダゾール（例えば、
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２
及び４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドー
ル）、及び他の同様の試薬（例えば、７−アミノアクチ
ノマイシンＤ、ヒドロキシスチルバミジン及びプソラレ
ン）を含む。
【０２２２】第２の実施の態様において、核抗原に対す
る抗体（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．；Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．；Ｃａｌｔａ
ｇＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏ．）を用いて、特別の核ドメ
インに位置する核構成要素を標識する。これらの構成要
素の例はＤＮＡの構造及び機能の維持に関与するマクロ
分子である。ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヒストン、ＤＮＡポリメ
ラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ラミン、及びアクチンの
ような細胞質蛋白質の核変異体は核抗原の実施例であ
る。
【０２２３】第３の実施の態様において、緑色蛍光蛋白
質またはその突然変異体のような固有発光蛋白質に遺伝
的に融合した核蛋白質よりなる蛋白質キメラを用いて核
ドメインを標識する。これらの蛋白質の例はＤＮＡの構
造及び機能の維持に関与する蛋白質の多くである。ヒス
トン、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ラミ
ン、及びアクチンのような細胞質蛋白質の核変異体は核
蛋白質の例である。
【０２２４】ミトコンドリア標識 １つの実施の態様において、膜浸透性ミトコンドリア−
特異的発光試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ
Ｉｎｃ．）を用いて生細胞及び固定細胞のミトコンドリ
アを標識する。これらの試薬はローダミン１２３、テト
ラメチルロサミン、ＪＣ−１、Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅ
ｒ反応性染料を含む。
【０２２５】第２の実施の態様において、ミトコンドリ
ア抗原に対する抗体（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．；
Ｃａｌｔａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏ．）を用いて、
特別のミトコンドリアドメインに位置するミトコンドリ
ア構成要素を標識する。これらの構成要素の実施例はミ
トコンドリアＤＮＡの構造及び機能の維持に関与するマ
クロ分子である。ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヒストン、ＤＮＡポ
リメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ミトコンドリアｔＲ
ＮＡ及びｒＲＮＡのような細胞質マクロ分子のミトコン
ドリア変異体はミトコンドリア抗原の例である。ミトコ
ンドリア抗原の他の例はミトコンドリアに見出される酸
化的リン酸化系の構成要素である（例えば、チトクロー
ムｃ、チトクロームｃオキシダーゼ、及びコハク酸デヒ
ドロゲナーゼ）。
【０２２６】第３の実施の態様において、緑色蛍光蛋白
質のような固有発光蛋白質またはその変異体に遺伝的に
融合したミトコンドリア蛋白質よりなる蛋白質キメラを
用いてミトコンドリアドメインを標識する。これらの構
成要素の実施例はミトコンドリアＤＮＡの構造及び機能
に関与するマクロ分子である。その実施例はヒストン、
ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、及びミトコ
ンドリアで見出される酸化的リン酸化系の構成要素であ
る（例えば、チトクロームｃ、チトクロームｃオキシダ
ーゼ、及びコハク酸デヒドロゲナーゼ）。
【０２２７】小胞体標識 １つの実施の態様において、膜浸透性小胞体−特異的発
光試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎ
ｃ．）を用いて生細胞及び固定細胞の小胞体を標識す
る。これらの試薬は短鎖カルボシアニン染料（例えば、
ＤｉＯＣ６及びＤｉＯＣ３）、長鎖カルボシアニン染料
（例えば、ＤｉＩＣ１６及びＤｉＩＣ１８）、及びコン
カナバリンＡのような発光標識レクチンを含む。
【０２２８】第２の実施の態様において、小胞体抗原に
対する抗体（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．；
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．；Ｃａｌ
ｔａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏ．）を用いて、特異的
小胞体ドメインに存在する小胞体構成要素を標識する。
これらの構成要素の実施例は脂肪酸伸長システム、グル
コース−６−ホスファターゼ、及びＨＭＧ ＣｏＡ−レ
ダクターゼに関与するマクロ分子である。
【０２２９】第３の実施の態様において、緑色蛍光蛋白
質またはその突然変異体のような固有発光蛋白質に遺伝
的に融合した小胞体蛋白質よりなる蛋白質キメラを用い
て小胞体ドメインを標識する。これらの構成要素の実施
例は脂肪酸伸長システム、グルコース−６−ホスファタ
ーゼ、及びＨＭＧ ＣｏＡ−レダクターゼに関与するマ
クロ分子である。
【０２３０】ゴルジ体標識 １つの実施の態様において、膜浸透性ゴルジ体−特異的
発光試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎ
ｃ．）を用いて生細胞及び固定細胞のゴルジ体を標識す
る。これらの試薬は小麦胚芽アグルチミン及びブレフェ
ルジンＡのような発光標識マクロ分子ならびに発光標識
セラミドを含む。
【０２３１】第２の実施の態様において、ゴルジ体抗原
に対する抗体（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．；
Ｃａｌｔａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏ．）を用いて、
特別のゴルジ体ドメインに存在するゴルジ体構成要素を
標識する。これらの構成要素の例はＮ−アセチルグルコ
サミンホスフォトランスフェラーゼ、ゴルジ体−特異的
ホスフォジエステラーゼ、及びマンノース−６−リン酸
受容体蛋白質である。
【０２３２】第３の実施の態様において、緑色蛍光蛋白
質またはその変異体のような固有発光蛋白質に遺伝的に
融合したゴルジ体蛋白質よりなる蛋白質キメラを用いて
ゴルジ体ドメインを標識する。これらの構成要素の例は
Ｎ−アセチルグルコサミンホスフォトランスフェラー
ゼ、ゴルジ体−特異的ホスフォジエルテラーゼ、及びマ
ンノース−６−リン酸受容体蛋白質である。
【０２３３】示した実施例の多くは単一細胞プロセスの
測定を含むが、これは再度説明の目的を意図するに過ぎ
ない。いくつかの単一パラメータスクリーニングをマル
チパラメータ高内容スクリーニングに組み合わせること
によって、あるいは細胞パラメータをいずれかの既存高
内容スクリーニングに付加することによって、複数パラ
メータ高内容スクリーニングを生じさせることができ
る。さらに、各実施例は生細胞または固定細胞いずれか
を基礎とするが、各高内容スクリーニングを生細胞及び
固定細胞双方で使用されるように設計することができ
る。
【０２３４】当業者であれば、本明細書で提供した開示
に基づいて開発することができる非常に多様な区別され
るスクリーニングを認識するであろう。細胞内の特別の
構成要素の移動または再組織化に関係する細胞中の既知
の生化学及び分子プロセスの大きくかつ増えつつあるリ
ストがある。細胞内の標的部位への細胞表面からのシグ
ナリング経路は原形質膜−会合蛋白質の細胞質への移動
を含む。例えば、蛋白質チロシンキナーゼのｓｒｃファ
ミリーのうちの１つ、ｐｐ６０ｃ−ｓｒｃ（Ｗａｌｋｅ
ｒら，（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
８：１９５５２−１９５５８）は、繊維芽細胞の血小板
由来成長因子（ＰＤＧＦ）での刺激に際して原形質膜か
ら細胞質に移動することが知られている。加えて、スク
リーニングのための標的それ自体は、リガンド−結合及
び移動後修飾を含めた分子変化を報告する蛍光ベースの
試薬に変換することができる。 ［図面の簡単な説明］
【図１】図１は細胞ベースのスキャニングシステムの構
成要素のダイアグラムを示す。
【図２】図２は顕微鏡部分組立品の模式図を示す。
【図３】図３はカメラ部分組立品を示す。
【図４】図４は細胞スキャニングシステムのプロセスを
例示する。
【図５】図５は使用者への案内のための主要な機能を示
すユーザインターフェイスを例示する。
【図６】図６は細胞ベースのスクリーニング用の二重モ
ードシステムの２つのプラットフォーム構築のブロック
ダイアグラムであり、１のプラットフォームは望遠鏡レ
ンズを用いてマイクロタイタープレートの全てのウェル
を読み取り、第２のプラットフォームはより高い倍率の
レンズを用いてウェル中の個々の細胞を読み取る。
【図７】図７は、マイクロタイタープレートの全てのウ
ェルを読み取るための移動可能な「望遠鏡」レンズ及び
ウェル中の個々の細胞を読み取るための移動可能なより
高い倍率のレンズを用いる細胞ベーススクリーニング用
の二重モードシステムの単一プラットフォーム構築のた
めの光学系の詳細図である。
【図８】図８は細胞ベースのスクリーニングシステムで
の動的データを獲得するための流体配送システムの説明
図である。
【図９】図９は細胞ベースのスキャニングシステムのた
めの処理工程のフローチャートである。
【図１０】図１０Ａ−Ｊは核移動アッセイの戦略を示
す。
【図１１】図１１はマイクロタイタープレートの高スル
ープット及び高内容スクリーニングを組み合わせる細胞
ベースのスクリーニング用の二重モードシステムにおけ
る処理過程段階を規定するフローチャートである。
【図１２】図１２は細胞ベースのスクリーニング用のシ
ステムの高スループットモードにおける処理過程段階を
規定するフローチャートである。
【図１３】図１３は細胞ベースのスクリーニング用のシ
ステムの高内容モードにおける処理過程段階を規定する
フローチャートである。
【図１４】図１４は細胞ベースのスクリーニング用のシ
ステムの高内容モードで動的データを獲得するのに必要
な処理過程段階を規定するフローチャートである。
【図１５】図１５は動的データの獲得の間にウェル内で
行われる処理過程段階を規定するフローチャートであ
る。
【図１６】図１６は転位の公知の阻害剤からのデータの
例である。
【図１７】図１７は転位の公知の刺激剤からのデータの
例である。
【図１８】図１８はグラフィックディスプレイでのデー
タ提示を説明する。
【図１９】図１９は細胞ベースのスクリーニング用の高
スループットモードからのデータ、高内容モードへと通
過したデータの例、高内容モードで獲得されたデータ、
及びそのデータの解析の結果の説明図である。
【図２０】図２０は薬物に誘導された細胞質から核への
転位の測定を示す。
【図２１】図２１は図２０で示した測定のグラフによる
ユーザインターフェイスを説明する。
【図２２】図２２は図２０で示した測定のグラフによる
ユーザインターフェイスを説明する。
【図２３】図２３は図２０で示した測定から得られた動
的データを表すグラフである。
【図２４】図２４は薬物誘導アポトーシスの高内容スク
リーニングの詳細を示す。
【図２５】図２５はＰＴＨＲ内部化スクリーニングの確
認実行のグラフ表示である。
【図２６】図２６は信号処理のためのフローチャートで
ある。
【図２７】図２７は信号処理で使用されるオートフォー
カシング手法のためのフローチャートである。
【図２８】図２８は信号処理で信号される対象処理手法
のためのフローチャートである。
【図２９】図２９は個々のウェルのスポットカウントを
表示する受容体内部化データを示すＰＣスクリーンの代
表的なディスプレイを示す。
【図３０】図３０は視野間ベースで表示された受容体内
部化データを示すＰＣスクリーンの代表的ディスプレイ
を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｇ０１Ｎ 33/58 (72)発明者 ジュリアーノ、 ケン エイ. アメリカ合衆国 15238 ペンシルヴェ ニア州 ピッツバーグ ウィリアム ピ ット ウェイ 635 (72)発明者 ゴー、 アルバート アメリカ合衆国 15238 ペンシルヴェ ニア州 ピッツバーグ ウィリアム ピ ット ウェイ 635 (72)発明者 ダンレイ、 テリー アメリカ合衆国 15238 ペンシルヴェ ニア州 ピッツバーグ ウィリアム ピ ット ウェイ 635 (72)発明者 コンウェイ、 ブルース アメリカ合衆国 18901 ペンシルヴェ ニア州 ドイルズタウン エフロス サ ークル 3302 (56)参考文献 特開 平９−119842（ＪＰ，Ａ) 国際公開97／045730（ＷＯ，Ａ１) ＴＲＥＮＤ ＩＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮ ＯＬＯＧＹ Ｖｏｌ．16，Ｎｏ．３（Ｍ ａｒｃｈ，1998） ｐ．135−140 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 273，Ｎｏ．１（Ｊａｎｕａｒｙ 1998) ｐ．322−328 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏ．. 272，Ｎｏ．23（1997） ｐ．14817− 14824 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98

Claims (18)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 細胞表面受容体蛋白質の内部化を誘導す
    る化合物を同定するための自動化方法であって、 テスト化合物で処理すべき複数細胞を含有する位置のア
    レイを備え、ここに、該細胞は注目する細胞表面受容体
    蛋白質を保有し、ここに、該細胞表面受容体蛋白質は発
    光標識蛋白質として発現されるか、あるいは注目する細
    胞表面受容体に結合する発光標識分子と該細胞とを接触
    させることによって発光標識され、ここに、該接触は該
    テスト化合物での処理の前または後のいずれかで行うこ
    とができ； 該細胞をテスト化合物で処理し； 複数細胞を含有する位置の各々において複数細胞を走査
    して、発光標識細胞表面受容体蛋白質からの発光信号を
    得； 発光信号をデジタルデータに変換し；及び、 該デジタルデータを利用して、以下の測定値： （ａ）核周辺の位置の、有効な内部化細胞表面受容体を
    表すと決定された対象の数； （ｂ）核周辺の位置の、有効な内部化細胞表面受容体を
    表すと決定された対象の総面積； （ｃ）核周辺の位置の、有効な内部化細胞表面受容体を
    表すと決定された対象の総強度；または （ｄ）核周辺の位置の、有効な内部化細胞表面受容体を
    表すと決定された対象の正規化総強度； ここで１またはそれ以上の測定値が、発光標識された細
    胞表面受容体蛋白質の内部化を該テスト化合物が誘導し
    たか否かを示す、これら測定値のうち１またはそれ以上
    を自動的に作成することを包含する方法。
  2. 【請求項２】 さらに、発光標識細胞表面受容体蛋白質
    を内部化した多数の細胞を測定することを含む請求項１
    に記載の方法。
  3. 【請求項３】 さらに、全細胞数を測定することを含む
    請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 全細胞数の測定が、 ａ．細胞核のイメージを獲得し； ｂ．細胞核のイメージを細分化し；及び、 ｃ．細胞核のイメージ中の全ての核の全面積を計算する
    工程を含む請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 発光標識細胞表面受容体蛋白質を内部化
    した多数の細胞の測定が、 ａ．細胞中または細胞上の発光標識細胞表面受容体蛋白
    質の対象イメージを獲得し； ｂ．対象イメージを細分化し；及び、 ｃ．細分化対象イメージ中の対象が有効な内部化発光標
    識細胞表面受容体蛋白質を表すか否かを測定する工程を
    含む請求項２に記載の方法。
  6. 【請求項６】 さらに、以下の ａ．対象イメージからの人工物を除去するか；または ｂ．バックグラウンド発光を補正する； のうちの少なくとも１つを含む請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 複数細胞を含有する位置のアレイの小区
    画が、該細胞への細胞表面受容体蛋白質内部化の動的測
    定を供する間隔で複数回サンプリングされる請求項１に
    記載の方法。
  8. 【請求項８】 細胞表面受容体蛋白質の内部化を誘導す
    る化合物を同定する方法であって、 テスト化合物で処理されるべき複数細胞を含有する位置
    のアレイを備え、ここに、該細胞は注目する細胞表面受
    容体蛋白質を保有し、該細胞受容体蛋白質は発光標識蛋
    白質として発現されるか、あるいは注目する細胞表面受
    容体に結合する発光標識分子と該細胞とを接触させるこ
    とによって発光標識され、該接触は該テスト化合物での
    処理の前または後で行うことができ； 該細胞をテスト化合物で処理し； テスト化合物の不存在下で細胞表面受容体蛋白質が内部
    化されるようにするリガンドで該細胞を処理し； 細胞を含有する位置の各々において複数細胞を走査し
    て、発光標識受容体蛋白質から発光信号を得； 発光信号をデジタルデータに変換し；及び、 該デジタルデータを利用して利用して、以下の測定値： （ａ）核周辺の位置の、有効な内部化細胞表面受容体を
    表すと決定された対象の数； （ｂ）核周辺の位置の、有効な内部化細胞表面受容体を
    表すと決定された対象の総面積； （ｃ）核周辺の位置の、有効な内部化細胞表面受容体を
    表すと決定された対象の総強度；または （ｄ）核周辺の位置の、有効な内部化細胞表面受容体を
    表すと決定された対象の正規化総強度； ここで１またはそれ以上の測定値が、発光標識された細
    胞表面受容体蛋白質の該細胞へのリガンド−誘導内部化
    を該テスト化合物が阻害したか否かを示す、これら測定
    値のうち１またはそれ以上を作成することを包含する方
    法。
  9. 【請求項９】 さらに、発光標識細胞表面受容体蛋白質
    を内部化した多数の細胞を測定することを含む請求項８
    に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 さらに、全細胞数を測定することを含
    む請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 細胞数の測定が、 ａ．細胞核のイメージを獲得し； ｂ．細胞核のイメージを細分化し；及び、 ｃ．細胞核のイメージ中の全ての核の全面積を計算す
    る； 工程を含む請求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 発光標識受容体蛋白質を内部化した多
    数の細胞の測定が、 ａ．該細胞中または細胞上の発光標識細胞表面受容体蛋
    白質の対象イメージを獲得し； ｂ．対象イメージを細分化し；及び、 ｃ．細分化対象イメージ中の対象が有効な内部化発光標
    識細胞表面受容体蛋白質を表すか否かを決定する； 工程を含む請求項９に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 さらに、以下の ａ．対象イメージから人工物を除去し；または ｂ．バックグラウンド発光につき補正する； のうちの少なくとも１つを含む請求項１２に記載の方
    法。
  14. 【請求項１４】 複数細胞を含有する位置のアレイの小
    区画が、該細胞への細胞表面受容体蛋白質内部化の阻害
    の動的測定を供する間隔で複数回サンプリングされる請
    求項８に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 下記を含有する、位置のアレイ内で複
    数細胞を走査する請求項１の方法。 ｉ）内部化された細胞表面受容体蛋白質を含む位置のア
    レイ内の位置を同定するための、低分解能画像の獲得；
    および ｉｉ）内部化された細胞表面受容体蛋白質を含むそれら
    位置だけの、高分解能画像の獲得。
  16. 【請求項１６】 下記を含有する、位置のアレイ内で複
    数細胞を走査する請求項８の方法。 ｉ）内部化された細胞表面受容体蛋白質を含む位置のア
    レイ内の位置を同定するための、低分解能画像の獲得；
    および ｉｉ）内部化された細胞表面受容体蛋白質を含むそれら
    位置だけの、高分解能画像の獲得。
  17. 【請求項１７】 細胞表面受容体蛋白質の内部化を誘導
    する化合物を同定するための処理を、細胞スクリーニン
    グシステムが実行するようにする、指令の組を含有する
    プログラムを包むコンピュータ読み取り可能な記憶媒体
    であって、該処理は、 複数細胞を含有する位置のアレイ内で複数細胞を走査し
    て、細胞上、または細胞内の発光標識細胞表面受容体蛋
    白質からの発光信号を得る、ここで該細胞は注目する細
    胞表面受容体蛋白質を保有し、およびここで該細胞表面
    受容体蛋白質は発光標識蛋白質として発現されるか、あ
    るいは注目する細胞表面受容体に結合する発光標識分子
    と該細胞とを接触させることによって発光標識され、こ
    こで該接触は該テスト化合物での処理の前または後のい
    ずれかで行うことができ； 発光信号をデジタルデータに変換し；及び、 該デジタルデータを利用して、以下の測定値： （ａ）核周辺の位置の、有効な内部化細胞表面受容体を
    表すと決定された対象の数； （ｂ）核周辺の位置の、有効な内部化細胞表面受容体を
    表すと決定された対象の総面積； （ｃ）核周辺の位置の、有効な内部化細胞表面受容体を
    表すと決定された対象の総強度；または （ｄ）核周辺の位置の、有効な内部化細胞表面受容体を
    表すと決定された対象の正規化総強度； ここで１またはそれ以上の測定値が、発光標識された細
    胞表面受容体蛋白質の内部化を該テスト化合物が誘導し
    たか否かを示し、これら測定値のうち１またはそれ以上
    を自動的に作成することを包含する。
  18. 【請求項１８】 細胞表面受容体蛋白質の内部化を誘導
    する化合物を同定するための処理を、細胞スクリーニン
    グシステムが実行するようにする、指令の組を含有する
    プログラムを包むコンピュータ読み取り可能な記憶媒体
    であって、該処理は、 複数細胞を含有する位置のアレイ内で複数細胞を走査し
    て、細胞上、または細胞内の発光標識細胞表面受容体蛋
    白質からの発光信号を得る、ここで該細胞は注目する細
    胞表面受容体蛋白質を保有し、およびここで該細胞表面
    受容体蛋白質は発光標識蛋白質として発現されるか、あ
    るいは注目する細胞表面受容体に結合する発光標識分子
    と該細胞とを接触させることによって発光標識され、こ
    こで該接触は該テスト化合物での処理の前または後のい
    ずれかで行うことができ、ここで該細胞はテスト化合物
    によって、およびテスト化合物不在化で細胞表面受容体
    蛋白質が内部化されるようにするリガンドによって処理
    され； 細胞を含有するそれぞれの位置で複数細胞を走査し、発
    光標識受容体蛋白質からの発光信号を得て； 発光信号をデジタルデータに変換し；及び、 該デジタルデータを利用して、以下の測定値： （ａ）核周辺の位置の、有効な内部化細胞表面受容体を
    表すと決定された対象の数； （ｂ）核周辺の位置の、有効な内部化細胞表面受容体を
    表すと決定された対象の総面積； （ｃ）核周辺の位置の、有効な内部化細胞表面受容体を
    表すと決定された対象の総強度；または （ｄ）核周辺の位置の、有効な内部化細胞表面受容体を
    表すと決定された対象の正規化総強度； ここで１またはそれ以上の測定値が、発光標識された細
    胞表面受容体蛋白質の該細胞へのリガンド−誘導内部化
    を該テスト化合物が阻害したか否かを示し、これら測定
    値のうち１またはそれ以上を作成することを包含する。
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