KR101431914B1

KR101431914B1 - 세포배양 미세 플레이트 및 이를 포함하는 세포배양용기

Info

Publication number: KR101431914B1
Application number: KR1020120149932A
Authority: KR
Inventors: 김규만; 최진호; 김영호; 진희경
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2012-12-20
Filing date: 2012-12-20
Publication date: 2014-08-22
Also published as: KR20140080899A

Abstract

본 발명은 상부표면이 세포부착층 코팅막을 포함하는, 기둥형의 세포배양 미세 플레이트, 지지판; 및 상기 지지판에 부착된 상기 세포배양 미세 플레이트를 포함하는 세포배양용기, 지지판에 광경화 고분자 용액을 주입하는 제1단계; 지지판 상부에 패턴으르 갖는 포토마스크를 배치하는 제2단계; 포토마스크 상부로부터 광을 조사하는 제3단계; 미반응 광경화 고분자 용액을 제거하는 제4단계; 및 세포부착층 코팅막을 형성하는 제5단계를 포함하는 세포배양 미세 플레이트의 제조방법 및 상기 세포배양용기에 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 배양세포시료 분석방법에 관한 것이다.

Description

세포배양 미세 플레이트 및 이를 포함하는 세포배양용기{Microplates for cell culture and cell culture container comprising the same}

본 발명은 상부표면이 세포부착층 코팅막을 포함하는, 기둥형의 세포배양 미세 플레이트 및 이의 제조방법, 지지판; 및 상기 지지판에 부착된 상기 세포배양 미세 플레이트를 포함하는 세포배양용기 및 상기 세포배양용기에 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 배양세포시료 분석방법에 관한 것이다.

현재 질병의 치료에 배양 세포들을 이용하는 세포 치료가 확대됨에 따라 세포 배양에 대한 관심이 높아지고 있다. 이러한 시험관 내 배양을 위해서는 체내와 유사한 배양 환경을 제공하기 위한 다양한 배양 기기 및 조건을 필요로 한다. 이에 있어서 중요한 요소 중의 하나가 세포배양용기이다. 이와 같이 인공적으로 배양하는 세포들은 부착(adhesion) 또는 부유(suspension) 상태로 생장한다. 동물세포의 경우 혈액계 세포 등을 제외한 대부분의 세포들은 부착 상태로 생장한다. 이러한 부착배양 세포들은 부착성을 증가시키기 위한 세포외 기질성분(extracellular matrix components)이 코팅된 조직 배양 접시와 같은 표면을 필요로 한다.

또한 이와 같이 체외에서 배양되는 세포들은 배양환경에 따라서 세포의 특성이 변화할 수 있으므로, 원하는 세포특성을 유지하는지 등을 확인할 필요가 있다. 특히, 줄기세포의 경우 배지 또는 이외의 배양 조건에 따라 줄기세포능을 유지하거나 또는 다양한 계통의 조직세포로 분화가 가능하므로, 줄기세포능 유지 여부 또는 원하는 계통으로 분화하고 있는지를 지속적으로 확인할 필요가 있다. 이러한 세포의 특성을 파악하는 방법은 현미경을 이용하여 세포형태를 관찰하는 방법 또는 형광표지된 각각의 세포에서 특이적으로 발현하는 마커를 이용하여 형광현미경으로 관찰하는 방법 등이 있으나, 이러한 세포 특성 확인을 위해서는 배양세포시료 채취과정이 필수적이다. 종래에는 이러한 부착배양세포로부터 시료 채취를 위하여 전체 배양세포를 분리하여 일부 세포를 취하는 방식을 이용하였다. 그러나, 이러한 세포 분리를 위해서는 효소를 처리해야 하는 번거로움이 있고, 새로운 배양접시로 옮겨주어야 하므로 새로운 배지 및 배양접시를 필요로 한다는 소모적인 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 세포 배양을 지속하면서 전체 세포를 분리해 내지 않고도 일부 세포를 채취하여 분석할 수 있는 방법을 찾기 위해 예의 연구 노력한 결과, 배양용기의 일부분에 동일한 배양환경을 갖는 세포배양 미세 플레이트 구조를 포함하는 세포배양용기를 제조하고 이에 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 상부표면이 세포부착층 코팅막을 포함하는, 기둥형의 세포배양 미세 플레이트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 지지판; 및 상기 지지판에 부착된 상기 세포배양 미세 플레이트를 포함하는 세포배양용기를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 지지판에 광경화 고분자 용액을 주입하는 제1단계; 지지판 상부에 패턴으르 갖는 포토마스크를 배치하는 제2단계; 포토마스크 상부로부터 광을 조사하는 제3단계; 미반응 광경화 고분자 용액을 제거하는 제4단계; 및 세포부착층 코팅막을 형성하는 제5단계를 포함하는 세포배양 미세 플레이트의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포배양용기에 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 배양세포시료 분석방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 상부표면이 세포부착층 코팅막을 포함하는, 기둥형의 세포배양 미세 플레이트를 제공한다. 본 발명의 세포배양 미세 플레이트는 상부표면에 세포부착 코팅막을 포함하므로 부착하여 배양되는 세포의 배양에 사용될 수 있으며, 기둥형을 가지므로 상부표면에 부착배양되는 세포를 포함한 채로 핀셋 등으로 기둥을 잡아 이동시킬 수 있다.

상기 기둥의 형태 및 크기는 수요자의 요구에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 세포배양 미세 플레이트에 세포를 배양하여 분석 등에 사용하고자 하는 것인 바, 최소한 분석에 요구되는 수의 세포를 포함할 수 있을 정도 이상이되 너무 커서 불필요하게 많은 세포를 낭비하지 않는 정도인 것이 적절하다. 바람직하게 상기 기둥은 단면의 직경 또는 대각선 길이가 0.01 내지 10 mm인 원형 또는 다각형일 수 있다. 보다 바람직하게는 0.05 내지 5 mm 또는 0.1 내지 3 mm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 기둥의 높이는 특별히 제한되지는 않으나, 너무 낮은 경우 핀셋 등으로 잡기가 곤란하여 이동성이 떨어지며, 상기 기둥의 상부에 세포가 부착되어 배양되는 것을 고려할 때, 배양배지가 상기 세포층을 충분히 덮을 수 있을 정도로 필요하므로 상기 기둥이 너무 높은 경우는 더 많은 양의 배지를 필요로 하게 되어 경제성이 떨어지는 단점이 있다. 따라서 바람직하게 상기 기둥은 높이가 0.01 내지 3 mm일 수 있다. 보다 바람직하게, 0.1 내지 2 mm 또는 0.5 내지 1 mm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 세포부착층 코팅막은 세포의 부착배양을 위해 사용되는 배양접시 코팅물질로서 당업계에 알려진 물질을 이용하여 형성할 수 있다. 바람직하게 상기 세포부착층 코팅막은 콜라겐(collagen), 알긴산염(alginate) 또는 한천(agar)일 수 있으나, 세포독성을 나타내지 않으면서 배양접시에 대한 세포부착능을 향상시킬 수 있는 물질이면 제한없이 사용할 수 있다.

본 발명의 세포배양 미세 플레이트는 세포배양을 목적으로 하는 구조물이므로, 바람직하게 세포독성을 나타내지 않는 생체적합성 고분자로 제조되는 것일 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 지지판; 및 상기 지지판에 부착된 상기 세포배양 미세 플레이트를 포함하는 세포배양용기를 제공한다.

바람직하게 상기 지지판은 세포가 고르게 분포될 수 있고, 세포배양 미세 플레이트의 부착이 용이하도록 편평한 바닥을 가지면서, 세포배양을 위한 배지 또는 세포배양 미세 플레이트의 제조를 위한 광경화 고분자 용액 등의 용액을 수용할 수 있도록 격벽을 갖는 고체일 수 있다. 전체 바닥면을 덮을 수 있는 정도의 용액을 수용할 수 있는 정도의 최소한의 높이의 격벽을 포함하는 것이면 그 형태는 제한되지 않는다.

바람직하게 상기 고체 즉, 지지판은 실리콘고분자, 아크릴기를 포함하는 고분자, 올레핀고분자, 실리카계 세라믹 또는 금속재질로 이루어진 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 세포독성을 나타내지 않는 재질로서 세포부착성 코팅막을 형성하여 세포를 부착배양할 수 있는 재질일 수 있으며, 보다 바람직하게는 세포배양 미세 플레이트와 동일한 재질일 수 있으나, 세포배양 미세 플레이트와 동일한 배양환경을 제공할 수 있는 것이면 제한없이 사용할 수 있다.

바람직하게 상기 세포배양 미세 플레이트는 물리적인 힘을 가하여 지지판으로부터 분리시킬 수 있는 것이 특징이다.

또한, 바람직하게 상기 지지판과 세포배양 미세 플레이트의 상부 평면은 동일한 세포부착층 코팅막을 포함하는 것일 수 있다. 이때, 세포부착층 코팅막을 형성하기 위하여 세포부착층 코팅막이 형성된 지지판 상에 세포부착층 코팅막을 포함하는 세포배양 미세 플레이트를 제조하거나, 지지판 상에 세포배양 미세 플레이트를 제조하고 미세 플레이트를 포함하는 지지판 전체를 세포부착층 코팅막으로 처리하여 제조할 수 있다.

따라서, 본 발명의 세포배양용기는 시료채취를 위해 배양을 중단하지 않고 원하는 시점에서 배양세포를 샘플링하여 분석할 수 있는 장점을 갖는다. 구체적으로, 본 발명의 세포배양 미세 플레이트를 필요로 하는 수만큼 세포배양용기의 일부분에 배열되도록 제조하고, 세포배양 미세 플레이트를 포함하지 않는 세포배양용기의 바닥을 세포배양 미세 플레이트에 형성된 세포부착성 코팅막과 동일한 물질로 코팅하여 세포배양 미세 플레이트를 충분히 덮을 수 있는 양의 배지를 이용하여 세포배양용기 전체에 분석하고자 하는 세포를 고루 분주한 후 배양하면, 세포배양 미세 플레이트 상에 또한 이를 제외한 세포배양용기 바닥면에 동일한 세포농도로 세포가 부착배양될 수 있으며, 동일한 배지를 이용하여 동일한 배양조건 하에서 배양되도록 할 수 있다. 이러한 상태로 배양을 지속하면서 분석이 필요한 시점에 분리가능한 본 발명의 세포배양 미세 플레이트를 하나씩 분리시켜 분석에 이용하고 이외의 세포는 지속적으로 배양을 진행할 수 있다. 즉, 분석이 필요한 시점에서 기존의 배양세포 시료 채취방법인 전체 배양용기 내의 세포를 회수하여 일부 시료를 채취하고 재분주하여 배양을 계속하는 불필요한 과정을 생략할 수 있다.

이와 같이 세포배양용기 내에 세포배양 미세 플레이트를 제조하는 방법은 아래에 상세히 기술할 것이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 지지판에 광경화 고분자 용액을 주입하는 제1단계; 지지판 상부에 패턴으르 갖는 포토마스크를 배치하는 제2단계; 포토마스크 상부로부터 광을 조사하는 제3단계; 미반응 광경화 고분자 용액을 제거하는 제4단계; 및 세포부착층 코팅막을 형성하는 제5단계를 포함하는 세포배양 미세 플레이트의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "광경화 고분자"는 광조사에 의해 유도되는 중합반응에 의해 형성되는 고분자를 의미하는 것이다. 바람직하게 광조사에 의해 중합반응을 일으켜 고분자를 형성할 수 있는 단량체는 아크릴레이트기(acrylate group) 또는 메타크릴레이트기(methacrylate group)를 포함하는 분자일 수 있다.

바람직하게 상기 단량체는 폴리에틸렌글리콜 메틸 에테르 아크릴레이트(poly(ethylene glycol) methyl ether acrylate), 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(poly(ethylene glycol) diacrylate) 또는 히드록시에틸 메타크릴레이트(hydroxyethyl methacrylate)일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 광조사에 의해 중합반응을 일으킬 수 있는 분자이면 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "광경화 고분자 용액"은 광조사에 의해 광경화 고분자를 형성할 수 있는 조성물들을 포함하는 용액을 의미하는 것으로, 광조사에 의해 중합반응을 일으켜 고분자를 형성할 수 있는 단량체를 포함한다.

바람직하게 상기 광경화 고분자 용액은 광조사에 의해 활성화되어 고분자 중합반응을 유발할 수 있도록 자가 광개시 작용기를 가지는 단량체를 포함하거나 광개시제를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 광개시제는 광경화 고분자 용액의 0.1 내지 5 중량%로 포함될 수 있다.

본 발명의 용어 "광개시제"는 광조사에 의해 활성화되어 자유라디칼을 생성함으로써 고분자 중합반응을 유발하는 물질을 의미하는 것으로, 광경화 고분자 용액에 별도로 추가할 수 있다. 또는 광경화 고분자를 형성하는 단량체 분자 내에 광개시 작용기 즉, 광조사시 빛을 흡수하여 자유라디칼을 생성할 수 있는 작용기를 포함하는 분자일 경우에는 광개시제를 별도로 추가할 필요없이 상기 광개시 작용기가 그 역할을 대신할 수 있다.

바람직하게 상기 광개시제는 2-히드록시-2-메틸 프로피오페논(2-hydroxy-2-methyl propiophenone), 모노아실 포스핀 옥사이드(monoacyl phosphine oxides; MAPO) 또는 비스아실 포스핀 옥사이드(bisacyl phosphine oxides; BAPO)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 광조사에 이용되는 광은 상기 단량체들의 중합반응을 유발할 수 있을 만큼의 에너지를 갖는 것이면 제한없이 사용할 수 있다. 바람직하게 상기 광은 UV(ultra-violet) 즉, 자외선일 수 있다.

바람직하게 상기 지지판은 세포배양 미세 플레이트의 고른 배열을 위해 미세 플레이트 기둥과의 접착력을 향상시키기 위하여 플라즈마로 표면을 처리한 것일 수 있다. 상기 플라즈마 처리는 진공상태에서 산소, 아르곤, 질소 가스 등을 주입하여 플라즈마를 형성하여 수행되는 것으로 플라스틱 등의 접착력을 향상시키기 위해 수행되는 것으로 당업자에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

또한 상기 광경화 고분자 용액 상에 포토마스크를 배치하는 제2단계에 앞서 투명평판을 배치하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게 상기 투명평판의 재질은 플라즈마 표면처리 하지 않은 지지판과 동일한 재질의 평면판을 이용할 수 있으나, 형성되는 미세 플레이트 기둥에 대하여 지지판 보다 높은 접착력을 갖는 것이 아니면 제한없이 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 생체적합성 고분자(PDMS)를 플라즈마 표면처리하여 접착력을 향상시킨 지지판과 플라즈마 처리하지 않은 PDMS 재질의 투명평판을 사용함으로써, 광경화 반응 후 투명평판 제거 시 지지판과 투명평판 사이에 형성된 미세 플레이트 기둥이 투명평판에 부착되어 이와 함께 제거되지 않고 지지판 상에 부착되는 경향을 나타냄으로써 고르게 분포된 일련의 미세 플레이트 기둥을 획득할 수 있었다. 즉, 상기 투명평판으로 지지판과 동일한 재질(PDMS)의 플라즈마를 처리하지 않은 물질을 사용하면, 광경화에 의해 투명평판과 지지판 사이에 형성된 미세 플레이트 기둥은 지지판에 대해 더 높은 부착력을 가지므로 투명평판을 제거할 때, 투명평판에 부착되어 제거되지 않고 지지판 상에 부착된 채로 유지될 수 있다.

상기 제5단계의 세포부착층 코팅막을 형성하는 단계는 미세 플레이트를 포함하는 지지판 전체를 코팅용액으로 처리하거나, 하부에 세포부착층 코팅막의 코팅막을 포함하는 면을 미세 플레이트 기둥의 상부에 접촉시켜 미세 플레이트 상에만 세포부착층 코팅막이 형성되도록 하는 것일 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 세포배양용기에 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 배양세포시료 분석방법을 제공한다.

바람직하게 상기 세포를 배양하는 단계는 세포배양 미세 플레이트의 상부 표면까지 충분히 덮을 수 있는 양의 배지를 사용하고, 세포배양용기에 세포를 고르게 분주하여 배양하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 분석방법은 배양 중 분석하고자 하는 시점에서 세포배양 미세 플레이트를 세포배양용기로부터 분리하여 분석하는 것이 특징인 분석방법이다.

상기한 바와 같이 충분한 배양액을 가하여 배양된 세포는 상기 세포배양용기에서 설명한 바와 같이 세포배양 미세 플레이트 상부표면과 이를 제외한 세포배양용기 바닥면에 분석하고자 하는 세포가 동일한 세포농도로 분주되고 동일한 배지조성 및 동일한 배양조건 하에서 배양되므로 배양 중간에 분석이 요구되는 경우 번거로운 시료채취과정을 수행할 필요없이 간단히 개별 세포배양 미세 플레이트를 핀셋 등으로 분리해 내어 분석을 수행할 수 있다.

본 발명의 세포배양 미세 플레이트를 포함하는 세포배양용기를 이용하면 세포를 배양하면서 분석이 필요한 경우 함께 배양되는 다른 세포를 손상시키지 않으면서 동일한 조건 하에서 배양된 세포시료의 채취가 가능하며 여분의 세포는 지속적으로 배양가능하므로, 복수 개의 세포배양 미세 플레이트를 포함하는 세포배양용기를 이용하면 일부 세포는 지속적으로 배양하면서 분석을 요하는 시점에서 차례로 개별 세포배양 미세 플레이트를 분리하여 분석할 수 있다는 장점이 있다.

도 1은 본 발명에 따른 세포배양 미세 플레이트의 형태와 구성을 나타낸 개략도이다. (가)는 세포배양 미세 플레이트, (나)는 세포가 부착된 상태의 세포배양 미세 플레이트, (다)는 지지판 상부에 배열된 복수의 세포배양 미세 플레이트를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 세포배양 미세 플레이트의 제조과정을 단계적으로 나타낸 개략도이다.
도 3은 본 발명에 따른 제조과정에 따라 제조된 세포배양 미세 플레이트의 광학현미경 이미지를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 제조과정에 따라 제조된 세포배양 미세 플레이트의 주사전자현미경 이미지를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 형광염료를 포함하는 세포부착층 코팅막(콜라겐)을 사용하여 제조한 세포배양 미세 플레이트의 형광현미경 이미지를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명에 따른 제조과정에 따라 제조된 세포배양 미세 플레이트의 이동성을 나타낸 도이다. 광학현미경으로 관찰한 본 발명의 방법으로 제조된 지지판 상부에 배열된 복수의 세포배양 미세 플레이트 (가), 핀셋을 이용한 지지판으로부터 개별 세포배양 미세 플레이트의 분리 (나) 및 분리된 단일 세포배양 미세 플레이트 (다)이다.
도 7은 본 발명에 따른 제조과정에 따라 제조된 세포배양 미세 플레이트 및 상기 플레이트 상에서 부착배양되는 세포를 나타낸 도이다. (가)는 실리콘고분자(PDMS) 평판 상부를, (나)는 PEGDA로 제조한 미세 플레이트 기둥을, (다)는 상부에 세포부착층 코팅막을 포함하는 세포배양 미세 플레이트 상에 NIH/3T3 세포를 7일간 부착 배양시킨 후 촬영한 광학현미경 이미지이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 세포배양 미세 플레이트의 제조

첨부된 도 1 및 2를 참조하여 본 발명에 따른 세포배양 미세 플레이트의 제조과정을 설명한다.

먼저, 도 1은 본 발명에 따라 제조된 세포배양 미세 플레이트의 구성을 개략적으로 나타낸다. (가)는 세포가 부착되지 않은 상부표면에 세포부착층 코팅막(12)을 포함하는 기둥형(10)의 개별 세포배양 미세 플레이트(100)를 나타낸다. (나)는 상기 세포배양 미세 플레이트 상에 세포(20)가 부착된 상태를 나타낸다. (다)는 지지판(30) 상에 배열된 복수의 세포배양 미세 플레이트를 나타낸다.

도 2는 본 발명에 따른 세포배양 미세 플레이트(100)의 구체적인 제조과정을 나타낸 도이다. 지지판(30)은 생체적합성 고분자(polydimethylsiloxane; PDMS) 재질의 편평한 바닥과 격벽을 가지며 상부가 개방된 용기를 사용하였다. 상기 지지판은 플라즈마 표면처리를 통하여 상기 지지판 상에 제조되는 세포배양 미세 플레이트와의 접착력을 향상시켰다. 상기 지지판 상에 광경화 고분자 용액(50)을 채우고(나), 그 위로 플라즈마 처리를 하지 않은 지지판과 동일한 재질(PDMS)의 투명평판(60)과 미세패턴은 투명하고 주변은 검게 인쇄된, 투명창 영역(66)을 포함하는 포토마스크 필름(65)을 차례로 적층하였다(다 및 라). 이후 상기 포토마스크 필름의 상부로부터 광(70)을 조사하여(마), 광경화 고분자의 중합반응을 유도하여 미세 플레이트 기둥을 형성하였다(바). 미세 플레이트 기둥이 형성되면, 포토마스크와 투명평판을 제거하고 반응하지 않은 폴리머 용액을 제거하여 지지판 상부에 형성된 미세 플레이트 기둥을 얻었다(사). 상기 형성된 미세 플레이트 기둥의 상부에 세포부착층 코팅막(12)을 도입하기 위하여, 일면에 세포부착층 코팅막을 포함하는 평면판을 상기 코팅막이 미세 플레이트를 향하도록 하여(아) 미세플레이트 기둥의 상부에 접촉시킨 후(자) 수직으로 분리시켜 제거하였다(차). 그 결과, 지지판 상에 고정된 상부표면에 세포부착층 코팅막을 포함하는 세포배양 미세 플레이트를 제조하였다(카).

상기 과정을 통하여 제조된 세포배양 미세 플레이트의 광학현미경 이미지를 도 3에, 전자현미경 이미지를 도 4에 나타내었다. 도 3의 (가)는 지지판 상에 배열된 복수의 미세 플레이트를 수직으로 내려다 본 이미지이며, (나)와 (다)는 각각 상기 미세 플레이트를 확대하여 상부에서 또는 측면에서 바라본 이미지이다. 도 4는 약 340 μm 직경의 미세 플레이트의 각각 다른 각도 및 배율에서의 전자현미경 이미지이다. 도 4에 나타난 바와 같이, 제조된 미세 플레이트의 상부표면은 편평하고 매끈한 것을 확인할 수 있었다.

형광염료를 포함하는 세포부착층 코팅막을 입힌 평면판을 미세 플레이트 기둥 상에 찍어 세포부착층 코팅막을 입힌 세포배양 미세 플레이트를 제조하고 그 형광이미지를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 제조방법으로 제조된 세포배양 미세 플레이트는 상부표면 전체에 세포부착층 코팅막에 고르게 형성된 것을 확인할 수 있었다.

이와 같이 제조한 본 발명의 개별 세포배양 미세 플레이트의 이동성을 확인하였다. 도 6에는 본 발명의 방법으로 제조한 세포배양 미세 플레이트를 핀셋으로 지지판으로부터 분리하여 이동시키는 과정을 광학현미경 이미지를 통해 나타내었다. 본 발명의 세포배양 미세 플레이트는 상부표면에 세포가 부착된 상태로 핀셋 등을 이용하여 약간의 물리적인 힘을 가함으로써 지지판으로부터 분리하여 이동시킬 수 있으므로, 분석을 위해 전체 배양접시의 세포를 회수하여 일부를 취할 필요없이 개별 세포배양 미세 플레이트를 배양용기로부터 분리하여 분석에 이용할 수 있음을 의미한다. 도 7은 개별 세포배양 미세 플레이트 상에 부착 배양되는 세포의 광학현미경 이미지를 나타낸 것으로, NIH/3T3 세포를 세포부착층 코팅막으로서 콜라겐이 도포된 세포배양 미세 플레이트 상부에 부착시켜 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 7일간 배양한 후 관찰한 것이다. 도 7에 나타난 바와 같이, 세포배양 미세 플레이트 상에서 배양되는 세포는 단지 작은 규모를 가질 뿐 일반 세포배양 접시에서 배양되는 세포와 동일한 형태를 나타내며 미세 플레이트 전면에 고루 부착되어 배양되는 것을 확인하였다.

10: 미세 플레이트 기둥
12: 세포부착층 코팅막
20: 세포
30: 플라즈마 표면처리 생체적합성 고분자(PDMS) 지지판
50: 자외선 경화형 고분자 용액
60: 생체적합성 고분자(PDMS) 투명평판
65: 포토마스크
66: 포토마스크의 투명창 영역
70: 자외선
80: 평면판
100: 세포배양 미세 플레이트

Claims

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지지판; 및 상기 지지판 상에 물리적 힘으로 탈착 가능하게 부착된 2개 이상의 기둥형 세포배양 미세 플레이트를 포함하는 세포배양용기로서,
하나의 세포배양용기 내의 2개 이상의 세포배양 미세 플레이트에 동일한 배양조건을 제공할 수 있는 것인 세포배양용기.
제6항에 있어서,
상기 지지판은 편평한 바닥과 용액을 수용할 수 있도록 격벽을 갖는 고체인 세포배양용기.
제7항에 있어서.
상기 고체는 실리콘고분자, 아크릴기를 포함하는 고분자, 올레핀고분자, 실리카계 세라믹 및 금속으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 세포배양용기.
삭제
제6항에 있어서,
상기 지지판과 세포배양 미세 플레이트의 상부 평면은 동일한 세포부착층 코팅막을 포함하는 것이 특징인 세포배양용기.
제10항에 있어서,
세포부착층 코팅막이 형성된 지지판 상에 세포부착층 코팅막을 포함하는 세포배양 미세 플레이트를 제조하거나, 지지판 상에 세포배양 미세 플레이트를 제조하고 미세 플레이트를 포함하는 지지판 전체를 세포부착층 코팅막으로 처리하여 제조되는 것이 특징인 세포배양용기.
지지판에 광경화 고분자 용액을 주입하는 제1단계;
지지판 상부에 패턴으르 갖는 포토마스크를 배치하는 제2단계;
포토마스크 상부로부터 광을 조사하는 제3단계;
미반응 광경화 고분자 용액을 제거하는 제4단계; 및
세포부착층 코팅막을 형성하는 제5단계
를 포함하는 세포배양 미세 플레이트의 제조방법.
제12항에 있어서,
상기 광경화 고분자 용액 상에 포토마스크를 배치하기 전에 투명평판을 배치하는 단계를 추가로 포함하는 것인 제조방법.
제12항에 있어서,
상기 광경화 고분자는 아크릴레이트기(acrylate group) 또는 메타크릴레이트기(methacrylate group)를 포함하는 단량체로부터 형성되는 고분자인 것인 제조방법.
제14항에 있어서,
상기 단량체는 폴리에틸렌글리콜 메틸 에테르 아크릴레이트(poly(ethylene glycol) methyl ether acrylate), 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(poly(ethylene glycol) diacrylate) 및 히드록시에틸 메타크릴레이트(hydroxyethyl methacrylate)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제조방법.
제12항에 있어서,
상기 광경화 고분자 용액은 자가 광개시 작용기를 가지는 단량체를 포함하거나 광개시제를 추가로 포함하는 것인 제조방법.
제16항에 있어서,
상기 광개시제는 2-히드록시-2-메틸 프로피오페논(2-hydroxy-2-methyl propiophenone), 모노아실 포스핀 옥사이드(monoacyl phosphine oxides; MAPO) 및 비스아실 포스핀 옥사이드(bisacyl phosphine oxides; BAPO)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제조방법.
제12항에 있어서,
상기 제5단계의 세포부착층 코팅막을 형성하는 단계는 미세 플레이트를 포함하는 지지판 전체를 코팅용액으로 처리하거나, 일면에 세포부착층 코팅막을 포함하는 평면판의 코팅막을 포함하는 면을 미세 플레이트 기둥의 상부에 접촉시켜 미세 플레이트 상에만 세포부착층 코팅막이 형성되도록 하는 것인 제조방법.
상기 제6항에 기재된 세포배양용기에 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 배양세포시료 분석방법.
제19항에 있어서,
상기 세포를 배양하는 단계는 세포배양 미세 플레이트의 상부 표면까지 충분히 덮을 수 있는 양의 배지를 사용하고, 세포배양용기에 세포를 고르게 분주하여 배양하는 것이 특징인 분석방법.
제19항에 있어서,
배양 중 분석하고자 하는 시점에서 세포배양 미세 플레이트를 세포배양용기로부터 분리하여 분석하는 것이 특징인 분석방법.