WO2017212782A1 - 細胞選択装置、細胞選択システム、細胞選択方法及び細胞培養容器 - Google Patents

細胞選択装置、細胞選択システム、細胞選択方法及び細胞培養容器 Download PDF

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WO2017212782A1
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cell
skeleton
substrate
photoresponsive
light
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邦彦 長嶺
俊一 諏訪
真寛 松本
大介 山口
義夫 後藤
匡平 吉満
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ソニー株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus

Definitions

  • the present invention relates to a cell selection device, a cell selection system, a cell selection method, and a cell culture container.
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 1
  • photoisomerization material a photodegradable linker
  • Patent Document 1 a biological material peeling method has been developed that combines plasticization of the substrate surface polymer material accompanying photoisomerization and liquid feeding control.
  • a cell-adhesive light control substrate formed by forming a cell-adhesive light control material in which a cell-adhesive material is bonded to a non-cell-adhesive material via a photolabile group on a transparent substrate has also been developed.
  • Patent Document 2 a cell-adhesive light control substrate formed by forming a cell-adhesive light control material in which a cell-adhesive material is bonded to a non-cell-adhesive material via a photolabile group on a transparent substrate has also been developed.
  • cell-adhesive light control substrate described in Patent Document 2 discloses a cell analysis / sorting apparatus using the cell-adhesion light control substrate, a specific example using a liquid crystal device or the like other than the substrate is disclosed. No cell sorting method / apparatus has been disclosed.
  • the present inventors have intensively studied to solve the above problems and have come up with the idea of linking a cell adhesive site to a photoisomer.
  • the photoisomer of the ligated product is only the trans isomer or a mixture of the cis isomer and the trans isomer
  • the cell is captured at the cell adhesion site, and the cell is released when the photoisomer is aligned with the cis isomer.
  • the inventors have come up with the idea of using an optical shutter for irradiating light to a photoisomer, and have developed this technology.
  • a cell-adhesive substrate comprising a cell-adhesive portion containing a substance capable of adhering to a cell, coupled to a photo-responsive skeleton that is photoisomerized, and the photo-responsive skeleton being immobilized on the substrate;
  • a cell selection device including an optical shutter is provided.
  • the cell selection device may further include a light irradiation device.
  • the light irradiation device can irradiate polarized light and / or parallel light.
  • this light irradiation apparatus can irradiate oblique light with respect to the said photoresponsive frame
  • the photoresponsive skeleton may be changed to a cis form or a trans form.
  • the photoresponsive skeleton includes at least one structure selected from the group consisting of azobenzene, stilbene, spiropyran, spirooxazine, fulgide, cinnamate, cinnamoyl, oryzanol, diarylethene, and derivatives thereof.
  • the photoresponsive skeleton may be modified with a hydrophilic compound.
  • the photoresponsive skeleton can be immobilized on the substrate via a cyclic alkyne.
  • an azide substrate in which the surface on which the photoresponsive skeleton is immobilized is modified with an azide group can be used.
  • the cell adhesion part contains at least one substance selected from the group consisting of an antibody, collagen, laminin, fibronectin, protein, peptide, sugar, oleyl group, aptamer and molecular recognition polymer. It is preferable that the photoresponsive skeleton portion connected to the cell adhesive portion is immobilized in an array on the substrate.
  • the optical shutter can be opened and closed for each desired element of the array.
  • the present technology provides a cell adhesive property in which a cell adhesive portion containing a substance capable of adhering to a cell is connected to a photoresponsive skeleton portion that is photoisomerized, and the photoresponsive skeleton portion is immobilized on a substrate.
  • a substrate There is provided a cell selection system including a cell selection device including an optical shutter, and an optical shutter control device for controlling opening and closing of the optical shutter.
  • the cell selection system may further include a solid-state imaging device.
  • this technology The following steps (a) to (b): (A) a cell-adhesive substrate comprising a cell-adhesive portion containing a substance capable of adhering to cells and linked to a photo-responsive skeleton portion that is photoisomerized, and the photo-responsive skeleton portion immobilized on the substrate; A step of applying a cell-containing sample to a cell selection device including an optical shutter and capturing the cell; and (b) opening the optical shutter to irradiate the light to release the captured cell. Provide a selection method.
  • a cell-adhesive substrate comprising a cell-adhesive portion containing a substance capable of adhering to a cell, coupled to a photo-responsive skeleton that is photoisomerized, and the photo-responsive skeleton being immobilized on the substrate;
  • An optical shutter A cell culture container is provided.
  • the present technology it is possible to provide a cell selection device that captures and releases cells by light irradiation at a high throughput. Moreover, according to this apparatus, cell capture, release, observation and analysis can be easily performed on the same apparatus. Therefore, cells can be selected and sorted with high purity, and efficient cell culture can be performed. Note that the effects described here are not necessarily limited, and may be any of the effects described in the present disclosure.
  • Cell selection device 1-1 Cell adhesion substrate 1-2.
  • Optical shutter 1-3 1. Light irradiation device 2.
  • Cell selection system Cell selection method 4.
  • the cell selection device includes at least a cell adhesive substrate 100 and an optical shutter 200. Further, the light irradiation device 400 may be included.
  • Cell Adhesive Substrate In the cell adhesive substrate 100, a cell adhesive portion containing a substance capable of adhering to a cell is connected to a photoresponsive skeleton that undergoes photoisomerization, and the photoresponsive skeleton is immobilized on the substrate. It is a thing.
  • the cell adhesion part 1 is not particularly limited as long as it is an antibody, collagen, laminin, fibronectin, protein, peptide, sugar, oleyl group, aptamer, molecular recognition polymer, and the like, and can adhere to cells. When the cells in the cell-containing sample come into contact with the cell adhesive part 1, the cells can be captured.
  • the cell adhesive part 1 can be determined according to the type of cell to be selected. For example, when it is desired to select human leukocytes, a desired anti-CD antibody may be used as the cell adhesion part 1. When it is desired to select a cancer cell, an antibody against a desired cancer antigen may be used as the cell adhesive part 1. Further, laminin can be used as the cell adhesive part 1 when epithelial cells and nerve cells are mainly selected, and fibronectin can be used when fibroblasts are mainly selected.
  • a photoisomerized compound is used for the photoresponsive skeleton 2.
  • the photoresponsive skeleton 2 is irradiated with light, it is preferably reversibly changed to a cis form or a trans form.
  • the cell-adhesive part 1 is bonded to one end of the light-responsive skeleton part 2, and when irradiated with light, the photo-responsive skeleton part 2 changes to a cis isomer or a trans isomer. 1 changes in direction three-dimensionally with respect to the substrate 10.
  • the photoresponsive skeleton part 2 is a mixture of cis and trans isomers, and the cell adhesive part 1 is in various three-dimensional directions.
  • the cells in the cell-containing sample come into contact with the cell adhesive part 1, the cells are captured by the cell adhesive part 1.
  • the light-responsive skeleton part 2 is irradiated with light having a specific wavelength
  • the cis-body and the trans-body are mixed in the cis-body direction, and the cells captured by the cell adhesive part 1 are released accordingly.
  • the light irradiation and the like will be described later.
  • the photoresponsive skeleton 2 is not particularly limited as long as it contains a photoisomer.
  • azobenzene, stilbene, spiropyran, spirooxazine, fulgide, cinnamate, cinnamoyl, oryzanol, diarylethene, and derivatives thereof are photoisomerized. It can be used as a compound.
  • Azobenzene has a relatively high photoisomerization reaction rate and can be suitably used. Two or more of these photoisomers may be used in combination, or may be arranged in series. In this case, as a result of photoisomerization occurring in at least two or more locations by light irradiation, the cells captured by the cell adhesive portion 1 are easily released.
  • the photoresponsive skeleton 2 may be modified with a hydrophilic compound.
  • the modification location is not particularly limited, for example, since the cell adhesive portion 1 is bonded to one end of the photoresponsive skeleton portion 2, the hydrophilic portion 3 can be modified to the other end.
  • the modification of the hydrophilic part 3 makes it easier for the cell-containing sample to become familiar with the photoresponsive skeleton part 2, the cell adhesive part 1, and thus the cell adhesive substrate 100.
  • the hydrophilic part 3 for example, those having no cytotoxicity such as polyethylene glycol, (PEG), 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine polymer (MPC polymer) are preferably used.
  • the cell adhesive part 1 is fixed to the substrate via the alkyne.
  • the alkyne is not particularly limited, but is preferably a cyclic alkyne.
  • a Cu catalyst is required for bonding with an azide group.
  • a Cu catalyst is not required, and toxicity to cells can be reduced.
  • cyclic alkyne examples include, for example, a group selected from the group consisting of a benzocyclooctynyl group, a difluorocyclooctynyl group, a dibenzocyclooctynyl group, an azadibenzocyclooctynyl group, a biarylazacyclooctynyl group, and derivatives thereof.
  • a benzocyclooctynyl group a difluorocyclooctynyl group, a dibenzocyclooctynyl group, an azadibenzocyclooctynyl group, a biarylazacyclooctynyl group, and derivatives thereof.
  • the substrate 10 to be a solid phase is preferably a material having a flat surface and transmitting light. This is because the photoresponsive skeleton is immobilized on the substrate 10. Specifically, a material such as a glass plate, a quartz plate, or various plastic plates can be used. The surface of the substrate 10 may be coated with a hydrophilic compound having low cytotoxicity such as the polyethylene glycol in order to impart hydrophilicity.
  • substrate 10 is an azide board
  • an azide substrate for example, an azide group or an aromatic azide group may be modified on the surface of the substrate 10 with a binding member such as a silane coupling agent.
  • the immobilized product can be stably and inertly bound to the substrate 10.
  • the azide substrate can be used repeatedly. That is, after the cell-adhesive substrate is used once, the binding site between the azide group and the cyclic alkyne is cleaved, the surface of the azide substrate is washed, and the cell adhesion is newly fixed to the azide substrate.
  • a cell-adhesive substrate can be produced by applying an agent containing a compound comprising a sex part, a photoresponsive skeleton part, a hydrophilic part and an alkyne to the surface of the azide substrate.
  • the photoresponsive skeleton part and / or the cell adhesive part can be immobilized on the substrate in an array.
  • an agent containing a compound composed of the cell adhesive part, the photoresponsive skeleton part, the hydrophilic part, and the alkyne is applied to the surface of the azide substrate, perforation is performed so that the agent can be applied in an array. It may be fixed to the substrate in the form of an array using the formed paper pattern or the like.
  • the optical shutter 200 used in the present technology is disposed on the surface of the cell adhesive substrate 100 opposite to the surface on which the cell adhesive portion, the photoresponsive skeleton portion, and the like are fixed.
  • a liquid crystal shutter or a polymer dispersed liquid crystal (PDLC) element is used as the optical shutter.
  • the liquid crystal shutter is configured in such a way that the liquid crystal cell is sandwiched between intersecting linear polarizers, and a drive voltage is applied to reorient the birefringent liquid crystal molecules, changing the phase difference of light passing through the liquid crystal cell. As a result, the light transmittance is controlled to function as a shutter.
  • the shutter is divided, and the division pattern corresponds to each element of the array including the photoresponsive skeleton portion fixed on the substrate.
  • the dividing elements of the shutter are arranged like cells, and the shutter can be opened and closed for each dividing element by applying a voltage to each dividing element of the shutter.
  • the shutter corresponding to the array may be opened and irradiated with light.
  • the structure of the light-responsive skeleton becomes a cis body, and the cells are released.
  • light may be irradiated by opening a plurality of shutters corresponding to the plurality of arrays.
  • the cell selection device can include a light irradiation device 400 in addition to the cell adhesive substrate 100 and the optical shutter 200.
  • the irradiation wavelength of the light irradiation apparatus 400 is not specifically limited, For example, ultraviolet light and visible light can be irradiated. Since ultraviolet light can change a specific photoresponsive skeleton (for example, azobenzene) from a trans form to a cis form, when releasing cells captured by the cell adhesive part, ultraviolet light is emitted from the light irradiation device 400. Irradiation is sufficient. Visible light can change the specific photoresponsive skeleton from a cis body to a trans body, so that it is not visible when capturing captured cells, for example, when capturing cells or observing a cell adhesive substrate. Irradiate.
  • a specific photoresponsive skeleton for example, azobenzene
  • the light irradiation device 400 only needs to be able to emit a wavelength at which the photoresponsive skeleton used in the cell adhesive substrate 100 is photoisomerized, and the wavelength depends on the type of photoisomerized molecule used in the photoresponsive skeleton. It is selected according to.
  • light irradiation device optical shutter
  • light-responsive skeleton optical shutter
  • Each may be an energy ray or heat irradiation device, an energy ray or thermal shutter, and a skeleton that is mutated by energy rays or heat.
  • the light irradiation device 400 can irradiate polarized light and / or parallel light. In particular, by using parallel light, it is possible to irradiate only the region to be irradiated without spreading the light. Further, the light irradiation device 400 can irradiate the light-responsive skeleton with oblique light.
  • the angle of the oblique light is preferably 45 to 45 mm from the azide substrate when a compound comprising a cell adhesive part, a photoresponsive skeleton part, and a hydrophilic part is fixed perpendicularly to the azide substrate. °.
  • the compound comprising the cell adhesive part, the photoresponsive skeleton part, and the hydrophilic part can be regularly aligned and easily capture cells.
  • the oblique light is preferably polarized light and parallel light.
  • the photoisomerization site When the photoisomerization site is displaced by absorbing light energy of a specific wavelength, it is prevented from moving in various directions by absorbing light energy aligned in a specific vibration direction, and displaced in a specific direction. To effectively capture and release cells.
  • the light source of the light irradiation device 400 preferably includes at least an ultraviolet light irradiation light source and a visible light irradiation light source. More preferably, a light source including a low wavelength to a long wavelength is provided so that a desired wavelength can be appropriately selected. Further, when the cells are fluorescently labeled, in order to observe the cells, a laser light source, an LED light source, a xenon lamp, or the like that can excite the phosphor may be used.
  • the wavelength cut filter 300 may be used between the light irradiation apparatus 400 and the optical shutter 200.
  • red, green, and blue color filters and bandpass filters may be used.
  • the wavelength cut filter 300 can be used, for example, to remove light having a low wavelength (340 nm) that may cause cell or DNA damage.
  • a shielding plate such as a metal plate may be provided. Normally, light is shielded by the shielding plate, but the shielding plate can be removed only when the captured cells are released.
  • the cell selection device 700 includes the cell adhesive substrate 100 and the optical shutter 200 as described above.
  • the optical shutter 200 is controlled by an optical shutter control device 210.
  • the optical shutter control device 210 can cause the optical shutter 200 to perform an operation of selecting and opening a shutter at a portion where the cell is desired to be captured or released.
  • By providing the optical shutter control device 210 it is possible to control to irradiate a specific wavelength with a specific wavelength at the time of cell capture, cell release, substrate observation, and the like.
  • the cell selection system 1000 of the present technology may include the solid-state imaging device 500.
  • a CCD or CMOS can be used for the solid-state imaging device 500.
  • the state, number, size, position, etc. of the cells captured or released by the cell adhesive substrate can be captured and analyzed with images.
  • a large area can be grasped collectively, it is useful for performing cell selection at high throughput.
  • the cell selection system 1000 of the present technology can also take the configuration of FIG.
  • a light irradiation device 400, a wavelength cut filter 300, an optical shutter 200, a cell adhesive substrate 100, and a solid-state imaging device 500 are installed in this order from the bottom.
  • the light irradiation device 400 is connected to the light irradiation control unit 450.
  • the light irradiation control unit 450 selects a specific wavelength from light of various wavelengths, and controls light intensity, irradiation time, light irradiation angle (angle of oblique light), and the like.
  • a wavelength cut filter control unit 350 is connected to the wavelength cut filter 300.
  • the wavelength cut filter control unit for example, selects the type of filter so that light of a specific wavelength can be selectively removed when light of a plurality of wavelengths is emitted from the light irradiation device 400, and wavelength cut by the filter Control timing, time, etc.
  • the optical shutter 200 is connected to the optical shutter controller 250.
  • the optical shutter control unit 250 is incorporated in the optical shutter control device 210 described above, and is capable of irradiating a specific wavelength with a specific wavelength at the time of cell capture, cell release, substrate observation, and the like. The voltage etc. with respect to 200 are controlled.
  • the cell adhesive substrate controller 150 is connected to the cell adhesive substrate 100.
  • the cell adhesive substrate controller 150 controls operations such as addition and removal of environmental conditions such as temperature and pH, cell-containing samples, buffers, and reagents. For example, since the temperature of the cell adhesive substrate 100 rises due to light irradiation and the captured cells may be damaged, the temperature is controlled so that the environment of the cell adhesive substrate 100 is maintained at 37 ° C. It is also possible to control the carbon dioxide concentration necessary for cell growth to 5-8%.
  • An imaging control unit 550 is connected to the solid-state imaging device 500.
  • the imaging control unit 550 controls an operation for changing the zoom magnification, a shooting of a moving image, an imaging operation for continuous shooting every unit time, and the like.
  • An image processing unit 560 is connected to the imaging control unit 550.
  • the image processing unit 560 performs processing for extracting information from an image obtained from the solid-state imaging device 500.
  • the information includes, for example, the cell type, size, number, position where the cell was captured, position where the cell was released, and the like.
  • the image processing unit may include a known image processing program.
  • An image display unit 570 is connected to the image processing unit 560.
  • the image display unit 570 is preferably a computer monitor. The cell image displayed on the monitor can be arbitrarily or automatically selected by a mouse operation or a keyboard operation using a computer.
  • the light irradiation control unit 450, the wavelength cut filter control unit 350, the optical shutter control unit 250, the cell adhesive substrate control unit 150, the imaging control unit 550, the image processing unit 560, and the image display unit 570 are controlled by the control calculation unit 950.
  • the control calculation unit 950 is a computer provided with a program for controlling the entire cell selection system 1000.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing how cells are selected using the cell selection device.
  • the cell adhesion apparatus is preferably in an environment in which the carbon dioxide concentration is adjusted to 5 to 8% and the temperature is adjusted to 37 ° C.
  • a cell-containing sample is introduced from the inlet 110 of the cell adhesion device and brought into contact with the cell adhesion substrate.
  • the cell-containing sample may be previously subjected to chemical treatment such as known physical treatment or enzyme treatment to disperse the cell mass into single cells.
  • chemical treatment such as known physical treatment or enzyme treatment to disperse the cell mass into single cells.
  • incubation or centrifugation may be performed in order to adhere the cell 5 to the cell adhesive substrate.
  • the operation process of the cell selection apparatus is shown in FIG. 6 and will be described below with reference to the operation process. It is preferable to use visible light as the light for capturing the cells 5 on the cell adhesive substrate.
  • Light irradiation of the cell adhesion device is started (S1).
  • the visible light beam emitted from the light source passes through the collimator lens and enters the optical shutter 200 as parallel light. It is desirable that the light beam that has passed through the optical shutter 200 is incident obliquely on the cell adhesive substrate, whereby the elements that capture the cells 5 can be regularly aligned and captured.
  • a wavelength cut filter is set to block light of a wavelength harmful to the cell (S2).
  • the cell may be fluorescently labeled. Fluorescent labeling facilitates microscopic observation and analysis of cells by excitation with a laser or LED light source. Microscope images can be taken with a camera equipped with a CCD or CMOS sensor (S3), and the images can be used for analysis, and the position information of individual cells can be acquired.
  • live cells and dead cells can be identified by microscopic observation and analysis (S4).
  • the coordinate position (position of the array element 6) of the cell determined to be a dead cell is specified by image analysis (S5).
  • processing such as measurement of the number of live cells and dead cells and differentiation of cell types is performed (S6).
  • a wavelength cut filter is set (S7).
  • the wavelength cut filter passes ultraviolet light but can block light of other wavelengths.
  • ultraviolet rays 7 are irradiated.
  • the optical shutter 200 disposed between the cell adhesive substrate and the light irradiation device is opened only at the element at the desired array element position so that only unnecessary cells are irradiated with ultraviolet light (S8).
  • Irradiation with ultraviolet rays (S9) displaces the photoresponsive skeleton 2 at the site where the cells are captured, thereby releasing unnecessary cells.
  • the ultraviolet light irradiation is terminated (S10).
  • Unnecessary cells are removed from the outlet 120 by washing or the like. Thereafter, the captured cells may be cultured as they are, or may be irradiated with ultraviolet rays again to release the captured live cells, removed from the outlet 120, collected in the container 8, and then cultured. May be.
  • the cells to be captured are cancer cells, etc.
  • the anticancer drug is administered to verify the effect of the drug, and the cell where the drug effect was not recognized is identified. Then, the area where the cells are captured can be taken out by irradiating with ultraviolet light, and the cause of the ineffective drug effect can be analyzed in detail.
  • the cell selection device of the present technology can also be used as a cell culture container. That is, as described above, substances other than desired cells can be removed, and only the desired cells can be retained in the cell selection device, the medium can be filled into the container, and cell culture can be performed as it is. Since it is not necessary to move the cells to be cultured to another container or the like for culturing, the stress and damage to the cells can be reduced.
  • oxygen supply and carbon dioxide discharge may be performed by the inlet 110 and the outlet 120.
  • you may provide a thermostat so that the said whole cell selection apparatus may be 37 degreeC thermostat.
  • a medium suitable for the target cell can be selected.
  • Eagle medium, D-MEM medium, E-MEM medium, RPMI-1640 medium, Dulbecco PBS medium, or the like can be used. If the medium is colored with phenol red or the like, the pH optimum range (for example, pH 6.8 to 7.2) of the medium can be controlled during the culture.
  • this technique can also take the following structures.
  • a cell adhesive substrate wherein a cell adhesive portion containing a substance capable of adhering to a cell is connected to a photoresponsive skeleton portion to be photoisomerized, and the photoresponsive skeleton portion is immobilized on the substrate;
  • a cell selection device including an optical shutter.
  • the cell selection device according to [1] further including a light irradiation device.
  • the cell selection device according to [2] or [3], wherein the light irradiation device can irradiate the light-responsive skeleton with oblique light.
  • the cell selection device according to any one of [1] to [4], wherein the photoresponsive skeleton can be changed to a cis form or a trans form.
  • the photoresponsive skeleton includes at least one structure selected from the group consisting of azobenzene, stilbene, spiropyran, spirooxazine, fulgide, cinnamate, cinnamoyl, oryzanol, diarylethene, and derivatives thereof.
  • the cell selection device according to any one of [5] to [5].
  • the cell adhesion part contains at least one substance selected from the group consisting of an antibody, collagen, laminin, fibronectin, protein, peptide, sugar, oleyl group, aptamer, and molecular recognition polymer.
  • the cell selection device according to any one of [9] to [9].
  • the optical shutter can be opened and closed for each desired element of the array.
  • a cell adhesive substrate in which a cell adhesive portion containing a substance capable of adhering to cells is connected to a photoresponsive skeleton portion that is photoisomerized, and the photoresponsive skeleton portion is immobilized on the substrate;
  • a cell selection system including a cell selection device including an optical shutter, and an optical shutter control device for controlling opening and closing of the optical shutter.
  • a cell-adhesive substrate in which a cell-adhesive portion containing a substance capable of adhering to a cell is connected to a photoresponsive skeleton that undergoes photoisomerization, and the photoresponsive skeleton is immobilized on the substrate;
  • An optical shutter A cell culture vessel.

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Abstract

光照射を利用して、細胞の捕捉・解放をハイスループットで行う装置を提供する。　細胞と接着可能な物質を含む細胞接着性部が、光異性化する光応答性骨格部と連結され、該光応答性骨格部が基板に固定化された、細胞接着性基板と、　光学シャッターと を含む細胞選択装置である。　該細胞選択装置は、光照射装置を更に含むことができ、光照射装置は、前記光応答性骨格部に対して斜光を照射し得る。

Description

細胞選択装置、細胞選択システム、細胞選択方法及び細胞培養容器
　本発明は、細胞選択装置、細胞選択システム、細胞選択方法及び細胞培養容器に関する。
　近年、再生医療においては、目的の細胞を純度よく選択し、細胞培養することが求められている。
　細胞を選択する方法として、例えばフローサイトメトリーが挙げられる。フローサイトメトリーでは、培養基剤から細胞をいったん取り出して純化することが行われる。しかし、細胞にダメージを与える等のおそれがあり、またハイスループットで分取することができないことから、他の細胞選択方法が更に求められている。
　フローサイトメトリーに依らない細胞選択方法として、例えば、光分解性リンカー（非特許文献１）や光異性化材料をコーティングした基材表面に対して、光刺激により、細胞の接着と剥離を制御する方法が知られている。
　また、光異性化に伴う基板表面高分子材料の可塑化と送液制御を組み合わせた、生体物質の剥離方法も開発されている（特許文献１）。
　更に、細胞非接着性材料に光解離性基を介して細胞接着性材料を結合した細胞接着性光制御材料を透明基材に成膜してなる細胞接着性光制御基材も開発されている（特許文献２）。
特開２００５－０９１１２８号明細書 国際公開第２０１１／０５８７２１号パンフレット
M. Wirkner, Advanced Materials, 23, 3907-3910, 2011
　しかしながら、前記細胞の接着と剥離を制御する方法に用いられる基材は、細胞足場としての役割を果たすため、細胞接着能と細胞へのダメージ低減が求められていた。
　また、前記特許文献１に記載の生体物質の剥離方法では、抗体の固定化及び剥離については実際に確認されているが、細胞の固定化及び剥離については具体的に検討されていない。更に、細胞膜表面に存在する膜タンパク質（例えばインテグリン）や糖脂質（例えばガングリオシド）に応じて選択的に接着する要素（例えば抗体やペプチド）を基板表面に導入することについても検討されていない。従って、細胞膜表面の前記膜タンパク質や糖脂質による接着細胞の選択はできず、さらに細胞の接着効率も改善の余地があった。
　また更に、前記特許文献２に記載の細胞接着性光制御基材については、これを用いた細胞の解析分別装置が開示されているものの、該基材以外、例えば液晶デバイス等を用いた具体的な細胞分別方法・装置までは開示されていない。
　本発明者らは、前記課題解決のため鋭意研究し、光異性化体に細胞接着性部位を連結することに想到した。連結物の光異性化体がトランス体のみ又はシス体とトランス体とが混在しているときは細胞接着性部位に細胞が捕捉され、光異性化体がシス体に揃うと細胞が解放されることを見出した。また、光異性化体への光の照射に光学シャッターを利用することに想到し、本技術を開発するに至った。
　すなわち、本技術は、
　細胞と接着可能な物質を含む細胞接着性部が、光異性化する光応答性骨格部と連結され、該光応答性骨格部が基板に固定化された、細胞接着性基板と、
　光学シャッターと
を含む細胞選択装置を提供する。
　該細胞選択装置は、光照射装置を更に含むことができる。該光照射装置は、偏光光及び／又は平行光を照射し得る。
　また、該光照射装置は、前記光応答性骨格部に対して斜光を照射し得る。
　前記光応答性骨格部は、シス体又はトランス体に変化し得る。該光応答性骨格部は、具体的には、アゾベンゼン、スチルベン、スピロピラン、スピロオキサジン、フルギド、シンナメート、シンナモイル、オリザノール、ジアリールエテン及びこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１以上の構造を含む。
　また、前記光応答性骨格部は、親水性を有する化合物で修飾されてもよい。
　そして、前記光応答性骨格部は、環状アルキンを介して前記基板に固定化され得る。
　一方、前記基板は、前記光応答性骨格部が固定化される面がアジド基で修飾されたアジド化基板を用いることができる。
　ここで、前記細胞接着性部は、抗体、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、タンパク質、ペプチド、糖、オレイル基、アプタマー及び分子認識ポリマーからなる群から選択される少なくとも１種の物質を含んでいる。
　前記細胞接着性部と連結された光応答性骨格部は、前記基板上にアレイ状に固定化されていることが好ましい。
　また、前記光学シャッターは、所望の前記アレイの要素ごとに開閉可能である。
　また、本技術は、細胞と接着可能な物質を含む細胞接着性部が、光異性化する光応答性骨格部と連結され、該光応答性骨格部が基板に固定化された、細胞接着性基板と、
　光学シャッターと
を含む細胞選択装置、及び
　前記光学シャッターの開閉を制御する光学シャッター制御装置
を含む、細胞選択システムを提供する。
　該細胞選択システムは、固体撮像素子を更に含んでもよい。
　更に、本技術は、
　以下の工程（ａ）～（ｂ）：
　（ａ）細胞と接着可能な物質を含む細胞接着性部が、光異性化する光応答性骨格部と連結され、該光応答性骨格部が基板に固定化された、細胞接着性基板と、
　光学シャッターと
を含む細胞選択装置に、細胞含有試料を適用し、細胞を捕捉する工程、及び
　（ｂ）前記光学シャッターを開いて光照射し、前記捕捉された細胞を解放する工程
を含む、細胞選択方法を提供する。
　また更に、本技術は、
　細胞と接着可能な物質を含む細胞接着性部が、光異性化する光応答性骨格部と連結され、該光応答性骨格部が基板に固定化された、細胞接着性基板と、
　光学シャッターと、
を含む、細胞培養容器を提供する。
　本技術によれば、光照射により細胞を捕捉、解放をハイスループットで行う細胞選択装置を提供できる。また、該装置によれば、細胞の捕捉、解放、観察及び解析を同一装置上で簡便に行うことができる。故に、細胞を高純度に選択・分取し、効率のよい細胞培養を行うことができる。
　なお、ここに記載された効果は必ずしも限定されるものではなく、本開示中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
本技術に係る細胞選択装置の基本構成を示す概略図である。 本技術に係る細胞接着性基板の模式図である。 本技術に係る細胞選択システムの模式図である。 本技術に係る細胞選択システムの模式図である。 本技術に係る細胞選択装置を用いて細胞を選択する様子を示す概略図である。 本技術に係る細胞接着装置の操作工程を示すフローチャートである。
　以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。
１．細胞選択装置
　１－１．細胞接着性基板
　１－２．光学シャッター
　１－３．光照射装置
２．細胞選択システム
３．細胞選択方法
４．細胞培養容器
＜１．細胞選択装置＞
　本技術の細胞選択装置の基本構成を図１に示す。該細胞選択装置は、細胞接着性基板１００と光学シャッター２００とを少なくとも含む。更に、光照射装置４００を含めてもよい。
１－１．細胞接着性基板
　細胞接着性基板１００は、細胞と接着可能な物質を含む細胞接着性部が、光異性化する光応答性骨格部と連結され、該光応答性骨格部が基板に固定化されたものである。
　細胞接着性基板１００の一例を図２に示す。
　細胞接着性部１は、抗体、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、タンパク質、ペプチド、糖、オレイル基、アプタマー及び分子認識ポリマー等であって、細胞と接着可能なものであれば特に限定されない。細胞含有試料中の細胞と該細胞接着性部１とが接することにより、細胞を捕捉することができる。
　選択したい細胞の種類に応じて、細胞接着性部１を決定することができる。例えば、ヒト白血球を選択したいときには、所望の抗ＣＤ抗体を細胞接着性部１として用いればよい。がん細胞を選択したいときには、所望のがん抗原に対する抗体を細胞接着性部１として用いればよい。
　また、上皮細胞や神経細胞を主に選択したいときにはラミニン、線維芽細胞を主に選択したいときはフィブロネクチンを細胞接着性部１として用いることもできる。
　光応答性骨格部２は、光異性化化合物が用いられる。光応答性骨格部２に光を照射すると、シス体、トランス体に可逆的に変化することが好ましい。
　光応答性骨格部２の一端には、細胞接着性部１が結合しており、光照射すると光応答性骨格部２がシス体又はトランス体に変化し、この変化に伴い、細胞接着性部１は、基板１０に対して立体的に方向が変化する。
　特定の波長の光を照射しないときには、光応答性骨格部２はシス体及びトランス体が混在し、細胞接着性部１が様々な立体的方向にある。ここで、細胞含有試料中の細胞と細胞接着性部１とが接触すると、細胞が細胞接着性部１に捕捉される。
　次に、特定の波長の光を光応答性骨格部２に照射すると、シス体及びトランス体の混在からシス体方向に揃い、それに伴い、細胞接着性部１に捕捉されていた細胞が解放される。光照射等については後述する。
　光応答性骨格部２は、光異性化体が含まれれば、特に限定されないが、例えば、アゾベンゼン、スチルベン、スピロピラン、スピロオキサジン、フルギド、シンナメート、シンナモイル、オリザノール、ジアリールエテン及びこれらの誘導体等を光異性化体として用いることができる。アゾベンゼンは、光異性化の反応速度が比較的早く、好適に用いることができる。また、これらの光異性化体を２以上組み合わせて用いてもよく、直列に連なるように配置してもよい。この場合、光照射により、光異性化が少なくとも２以上の箇所で生じる結果、細胞接着性部１に捕捉されていた細胞が解放されやすくなる。
　なお、光応答性骨格部２は親水性を有する化合物で修飾されていてもよい。修飾箇所は特に限定されないが、例えば、光応答性骨格部２の一端に細胞接着性部１が結合されているので、他端に親水性部３を修飾することができる。親水性部３の修飾により、光応答性骨格部２や細胞接着性部１、ひいては細胞接着性基板１００に細胞含有試料がなじみやすくなる。
　親水性部３には、例えば、ポリエチレングリコール、（PEG）、2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholineポリマー（MPCポリマー）等の細胞毒性のないものが好適に用いられる。
　更に、親水性部３の他端には、アルキンを含む化合物が結合される。このアルキンを介して、細胞接着性部１が基板に固定化される。アルキンは特に限定されないが、環状アルキンであることが好ましい。単なるアルキンの場合、アジド基と結合させるにはＣｕ触媒が必要となるが、環状アルキンであればＣｕ触媒がいらず、細胞への毒性を低減することができる。
　環状アルキンとしては、例えば、ベンゾシクロオクチニル基、ジフルオロシクロオクチニル基、ジベンゾシクロオクチニル基、アザジベンゾシクロオクチニル基、ビアリールアザシクロオクチノニル基及びそれらの誘導体からなる群から選択される基を有するものを挙げることができる。
　固相となる基板１０は、平坦な表面を有し、かつ光を透過する材料が好ましい。基板１０に光応答性骨格部が固定化されるからである。具体的には、ガラス板、石英板又は各種プラスチック板等の材料を用いることができる。
　なお、基板１０の表面は、親水性を付与するため、前記ポリエチレングリコール等の細胞毒性の低い親水性化合物をコーティングしてもよい。
　また、基板１０は、前記光応答性骨格部が固定化される面がアジド基で修飾されたアジド化基板であることが好ましい。
　アジド化基板にするには、例えば、シランカップリング剤等の結合部材により、基板１０の表面にアジド基又は芳香族アジド基を修飾すればよい。
　アジド基はアルキンとクリック反応することから、所望の基板への固定化物に、末端官能基としてアルキンを付加しておけば、該固定化物を基板１０に安定かつ不活性に結合させることができる。
　なお、前記アジド化基板は繰り返し用いることができる。すなわち、前記細胞接着性基板を一度使用した後、アジド基と環状アルキンとの結合部位を切断し、アジド化基板の表面を洗浄し、新たに前記アジド化基板に固定するための、前記細胞接着性部と光応答性骨格部と親水性部とアルキンとを含んで構成される化合物を含む剤を、アジド化基板の表面に塗布して、細胞接着性基板を作製することができる。
　また、基板表面のアジド化は、アレイ状に配列するように行えば、光応答性骨格部及び／又は細胞接着性部をアレイ状に基板に固定化することができる。あるいは、前記細胞接着性部と光応答性骨格部と親水性部とアルキンとを含んで構成される化合物を含む剤をアジド化基板表面に塗布する際、アレイ状に剤を塗布できるように穿孔された型紙等を用いて、アレイ状に基板に固定化してもよい。
１－２．光学シャッター
　本技術に用いられる光学シャッター２００は、前記細胞接着性基板１００の細胞接着性部や光応答性骨格部等が固定化された面の反対側の面に配置される。
　光学シャッターは、例えば、液晶シャッター、高分子分散型液晶（ＰＤＬＣ）素子が用いられる。液晶シャッターは、交差した直線偏光子の間に液晶セルが挟まれる形で構成されており、駆動電圧を印加して複屈折液晶分子を再配向し、液晶セルを通過する光の位相差を変化させ、この結果、光の透過率を制御し、シャッターとして機能する。
　シャッターは分割されており、該分割パターンは、前記基板上に固定化された光応答性骨格部を含むアレイの要素ごとに対応していることが好ましい。例えば、シャッターの分割要素がマス目のように並んでおり、シャッターの分割要素ごとに電圧を印加して分割要素ごとのシャッターを開閉できる。
　例えば、あるアレイに細胞が捕捉され、その捕捉を解除したいときは、該アレイに対応する部分のシャッターを開けて光を照射すればよい。該光の照射により、光応答性骨格部の構造がシス体になり、細胞が解放される。
　また、複数のアレイにまたがって細胞が捕捉され、その捕捉を解除したいときは、該複数のアレイに対応する部分の複数のシャッターを開けて光を照射すればよい。
１－３．光照射装置
　本技術の細胞選択装置は、細胞接着性基板１００と光学シャッター２００の他に、光照射装置４００を含めることができる。
　光照射装置４００の照射波長は特に限定されないが、例えば、紫外光及び可視光を照射することができる。紫外光は、特定の光応答性骨格部（例えばアゾベンゼン）をトランス体からシス体にすることができるので、細胞接着性部に捕捉された細胞を解放するときには、光照射装置４００から紫外光を照射すればよい。また、可視光は、前記特定の光応答性骨格部をシス体からトランス体にすることができるので、捕捉された細胞を解放するとき以外、例えば細胞捕捉時や細胞接着性基板観察時に可視光を照射する。
　光照射装置４００は、細胞接着性基板１００に用いられている光応答性骨格部が光異性化する波長を放射できればよく、その波長は、光応答性骨格部に用いられる光異性化分子の種類に応じて選択される。
　なお、本技術においては、「光照射装置」、「光学シャッター」、「光応答性骨格部」と表現しているが、これら光照射装置、光学シャッター、光応答性骨格部に限定されず、それぞれ、エネルギー線又は熱照射装置、エネルギー線又は熱シャッター、エネルギー線又は熱によって変異する骨格を用いてもよい。
　光照射装置４００は、偏光光及び／又は平行光を照射することができる。特に、平行光を用いることにより、光の広がりを持たせず、照射したい領域のみに光を照射することができる。
　また、光照射装置４００は、前記光応答性骨格部に対して斜光を照射することができる。該斜光の角度は、細胞接着性部、光応答性骨格部及び親水性部を含んで構成される化合物がアジド化基板に垂直に固定化されているとした場合、好ましくはアジド化基板から４５°である。斜光であることにより、前記細胞接着性部、光応答性骨格部及び親水性部を含んで構成される化合物が、規則正しく整列して細胞を捕捉しやすくなる。
　前記斜光は、偏光光かつ平行光であることが好ましい。光異性化部位が特定の波長の光エネルギーを吸収して変位する際、特定の振動方向に揃った光エネルギーを吸収することによって、様々な方向に変位することを抑制し、特定の方向に変位することが考えられ、これによって効果的に細胞を捕捉、及びリリースできるようになる。
　光照射装置４００の光源は、少なくとも紫外光照射光源及び可視光照射光源とを有することが好ましい。より好ましくは、適宜所望の波長を選択できるよう、低波長から長波長を含む光源を備える。また、細胞を蛍光標識したときに、該細胞を観察するため、蛍光体を励起できるレーザー光源、LED光源、キセノンランプ等を用いてもよい。
　なお、光照射装置４００と光学シャッター２００との間に波長カットフィルター３００を配置してもよい。具体的には、赤色、緑色、青色等のカラーフィルター、バンドパス型フィルターを用いればよい。波長カットフィルター３００は、例えば、細胞やDNAの損傷を起こし得る低波長（340nm）の光を除去するのに用いることができる。
　また、光照射装置４００からの光による液晶フィルター又はPDLC素子のダメージを抑制するため、金属板などの遮蔽板を備えてもよい。通常時は遮蔽板で光が遮蔽されているが、捕捉された細胞を解放するときのみ遮蔽板を除去することができる。
＜２．細胞選択システム＞
　本技術の細胞選択システムの一例を図３に示す。
　細胞選択装置７００には、前述のように、細胞接着性基板１００と光学シャッター２００とを備える。
　光学シャッター２００は、光学シャッター制御装置２１０により制御される。光学シャッター制御装置２１０は、細胞を捕捉したい部分あるいは細胞を解放したい部分のシャッターを選択して開閉する動作を光学シャッター２００に行わせることができる。光学シャッター制御装置２１０を備えることにより、細胞捕捉時、細胞解放時、基板観察時等に、それぞれ特定の場所に特定の波長を光照射するよう、制御できる。
　また、本技術の細胞選択システム１０００は、固体撮像素子５００を含めてもよい。固体撮像素子５００は、例えばCCD、CMOSを用いることができる。固体撮像素子５００を用いると、細胞接着性基板に捕捉又は解放された細胞の様子、数、大きさ、位置等を画像でとらえ、分析することができる。また、広い面積を一括で把握できるので、細胞選択をハイスループットで行うのに有用である。
　更に、本技術の細胞選択システム１０００は、図４の構成をとることもできる。
　顕微鏡８００には、下から順に、光照射装置４００、波長カットフィルター３００、光学シャッター２００、細胞接着性基板１００、固体撮像素子５００が設置されている。
　光照射装置４００には、光照射制御部４５０が連結されている。光照射制御部４５０は、種々の波長の光のなかから特定の波長を選択し、光強度、照射時間、光の照射角度（斜光の角度）等を制御する。
　波長カットフィルター３００には、波長カットフィルター制御部３５０が連結されている。波長カットフィルター制御部は、例えば複数の波長の光が光照射装置４００から照射されるときに、選択的に特定の波長の光を除去できるよう、フィルターの種類を選択し、フィルターによる波長カットのタイミング、時間等を制御する。
　光学シャッター２００には、光学シャッター制御部２５０が連結されている。光学シャッター制御部２５０は、前述の光学シャッター制御装置２１０に組み込まれており、細胞捕捉時、細胞解放時、基板観察時等に、それぞれ特定の場所に特定の波長を光照射できるよう、光学シャッター２００に対する電圧等を制御する。
　細胞接着性基板１００には、細胞接着性基板制御部１５０が連結されている。細胞接着性基板制御部１５０は、温度やpH等の環境条件、細胞含有試料やバッファー、試薬の添加、除去等の操作を制御する。例えば、光照射により、細胞接着性基板１００の温度が上昇し、捕捉された細胞がダメージを受けることもあるため、細胞接着性基板１００の環境を37℃に保つように温度制御する。また、細胞が増殖するのに必要な二酸化炭素濃度を、5～8％に管理するようにもできる。
　固体撮像素子５００には、撮像制御部５５０が連結されている。撮像制御部５５０は、ズーム倍率を変える動作、動画の撮影や単位時間ごとに連写する撮像動作等を制御する。
　撮像制御部５５０には、画像処理部５６０が連結されている。画像処理部５６０は、例えば、固体撮像素子５００から得られた画像から情報を取り出す処理を行う。情報は、例えば、細胞の種類、大きさ、数、細胞が捕捉された位置、細胞が解放された位置等である。画像処理部には、公知の画像処理用プログラムを備えてもよい。
　画像処理部５６０には、画像表示部５７０が連結されている。画像表示部５７０は、コンピューターのモニターが好適に用いられる。モニターに表示された細胞の画像を、コンピューターによるマウス操作、キーボード操作等により、任意あるいは自動的に選択できるようにすることもできる。
　光照射制御部４５０、波長カットフィルター制御部３５０、光学シャッター制御部２５０、細胞接着性基板制御部１５０、撮像制御部５５０、画像処理部５６０及び画像表示部５７０は、制御演算部９５０により制御される。制御演算部９５０は、細胞選択システム１０００全体を制御するプログラムが備えられているコンピューターである。
３．細胞選択方法
　本技術の細胞選択方法は、前記細胞選択装置を用いて行う。該細胞選択装置を用いて細胞を選択する様子を示す概略図を図５に示す。該細胞接着装置は二酸化炭素濃度が5～8％、温度が37℃に調節された環境下にすることが好ましい。
　まず、細胞含有試料を細胞接着装置の流入口１１０から投入し、細胞接着性基板上に接触させる。細胞含有試料は、予め、公知の物理的処理や酵素処理等の化学的処理を行い、細胞塊を単細胞に分散させておいてもよい。細胞５と細胞接着性部１との接着性の強さにもよるが、細胞５を細胞接着性基板によりよく接着させるため、インキュベーションや遠心分離処理を行ってもよい。
　前記細胞選択装置の操作工程を図６に示し、該操作工程を参照しつつ以下説明する。
　細胞５を細胞接着性基板に捕捉するときの光は、可視光光線を用いることが好ましい。
　細胞接着装置の光照射を開始する（S1）。光源から出射した可視光光線はコリメーターレンズを透過し、平行光として光学シャッター２００に入射する。光学シャッター２００を透過した光線は細胞接着性基板に斜めに入射することが望ましく、それによって細胞５を捕捉する素子が規則正しく整列して細胞を捕捉できる。
　このとき、細胞に有害な波長の光を遮断するため、波長カットフィルターをセットする（S2）。
　細胞は蛍光標識されていてもよい。蛍光標識により、レーザーやLED光源によって励起させて細胞の顕微鏡観察や解析を行いやすくなる。
　CCD又はCMOSセンサーを搭載したカメラによって顕微鏡画像を撮影し（S3）、その画像を解析に利用するとともに、個々の細胞の位置情報をも取得することができる。
　顕微鏡観察及び解析により、例えば、生細胞と死細胞を特定することができる（S4）。画像解析により、死細胞と判断された細胞の座標位置（アレイ要素６の位置）を特定する（S5）。そして、生細胞と死細胞の数の計測や細胞の種類の区別等の処理を行う（S6）。
　次に、波長カットフィルターをセットする（S7）。該波長カットフィルターは、紫外光線は通過するが、他の波長の光は遮断することができる。
　前記アレイ要素の位置の情報に基づき所定の箇所のみを選択して、死細胞等の不要な細胞を解放するため、紫外光線７を照射する。細胞接着性基板と光照射装置との間に配置された光学シャッター２００を、所望のアレイ要素位置の素子のみ開き、不要な細胞にのみ紫外光線が照射されるようにする（S8）。紫外光線の照射（S9）により、細胞を捕捉している部位の光応答性骨格部２が変位して、不要な細胞が解放される。細胞解放後、紫外光線照射を終了する（S10）。流出口１２０から不要な細胞を洗浄等で除去する。
　その後、捕捉された細胞を必要に応じてそのまま培養してもよいし、再度紫外光線照射を行い、捕捉された生細胞を解放し、流出口１２０から取り出して、容器８に回収後、培養してもよい。
　なお、本技術によれば、捕捉される細胞が、がん細胞等の場合、細胞を捕捉した後、抗癌剤を投与して薬の効果を検証し、薬の効果が認められなかった細胞を特定して、その細胞が捕捉されている領域に紫外光を照射して取り出して、薬の効果が得られなかった原因等を詳しく解析することもできる。
＜４．細胞培養容器＞
　本技術の前記細胞選択装置は、細胞培養容器としても使用することができる。
　すなわち、前述のように所望の細胞以外の物質を除去し、所望の細胞のみを前記細胞選択装置に保持させたまま、培地を前記容器に満たして、そのまま細胞培養を行うことができる。
　培養したい細胞を、培養のために他の容器等に移動させる必要がないため、細胞に対するストレスやダメージを低減できる。
　細胞培養においては、酸素の供給、二酸化炭素の排出を行うため、細胞培養に適した環境（最適CO2濃度、最適温度等）にすることが好ましい。例えば、流入口１１０、流出口１２０により、酸素供給、二酸化炭素排出を行ってもよい。
　更に、前記細胞選択装置全体を、37℃の恒温条件になるよう、恒温装置を備えてもよい。
　培地は、培養目的細胞に適したものを選択でき、例えば、イーグル培地、D-MEM培地、E-MEM培地、RPMI-1640培地、ダルベッコPBS培地等を用いることができる。
　また、培地をフェノールレッド等で着色しておけば、培養中に培地のpH至適範囲（例えばpH6.8～7.2）を管理することができる。
　なお、本技術は、以下のような構成も採ることができる。
〔１〕細胞と接着可能な物質を含む細胞接着性部が、光異性化する光応答性骨格部と連結され、該光応答性骨格部が基板に固定化された、細胞接着性基板と、
光学シャッターと
を含む細胞選択装置。
〔２〕光照射装置を更に含む、〔１〕に記載の細胞選択装置。
〔３〕前記光照射装置は、偏光光及び／又は平行光を照射し得る、〔２〕に記載の細胞選択装置。
〔４〕前記光照射装置は、前記光応答性骨格部に対して斜光を照射し得る、〔２〕又は〔３〕に記載の細胞選択装置。
〔５〕前記光応答性骨格部は、シス体又はトランス体に変化し得る、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の細胞選択装置。
〔６〕前記光応答性骨格部は、アゾベンゼン、スチルベン、スピロピラン、スピロオキサジン、フルギド、シンナメート、シンナモイル、オリザノール、ジアリールエテン及びこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１以上の構造を含む、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の細胞選択装置。
〔７〕前記光応答性骨格部は、親水性を有する化合物で修飾される、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の細胞選択装置。
〔８〕前記光応答性骨格部は、環状アルキンを介して前記基板に固定化される、〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の細胞選択装置。
〔９〕前記基板は、前記光応答性骨格部が固定化される面がアジド基で修飾されたアジド化基板である、〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の細胞選択装置。
〔１０〕前記細胞接着性部は、抗体、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、タンパク質、ペプチド、糖、オレイル基、アプタマー、及び分子認識ポリマーからなる群から選択される少なくとも１種の物質を含む、〔１〕～〔９〕のいずれかに記載の細胞選択装置。
〔１１〕前記細胞接着性部と連結された光応答性骨格部は、前記基板上にアレイ状に固定化されている、〔１〕～〔１０〕のいずれかに記載の細胞選択装置。
〔１２〕前記光学シャッターは、所望の前記アレイの要素ごとに開閉可能である、〔１１〕に記載の細胞選択装置。
〔１３〕細胞と接着可能な物質を含む細胞接着性部が、光異性化する光応答性骨格部と連結され、該光応答性骨格部が基板に固定化された、細胞接着性基板と、
光学シャッターと
を含む細胞選択装置、及び
前記光学シャッターの開閉を制御する光学シャッター制御装置
を含む、細胞選択システム。
〔１４〕固体撮像素子を更に含む、〔１３〕に記載の細胞選択システム。
〔１５〕以下の工程（ａ）～（ｂ）：
　（ａ）細胞と接着可能な物質を含む細胞接着性部が、光異性化する光応答性骨格部と連結され、該光応答性骨格部が基板に固定化された、細胞接着性基板と、
光学シャッターと
を含む細胞選択装置に、細胞含有試料を適用し、細胞を捕捉する工程、及び
（ｂ）前記光学シャッターを開いて光照射し、前記捕捉された細胞を解放する工程
を含む、細胞選択方法。
〔１６〕細胞と接着可能な物質を含む細胞接着性部が、光異性化する光応答性骨格部と連結され、該光応答性骨格部が基板に固定化された、細胞接着性基板と、
光学シャッターと、
を含む、細胞培養容器。
１　　　　細胞接着性部
２　　　　光応答性骨格部
３　　　　親水性部
５　　　　細胞
６　　　　アレイ要素
７　　　　紫外光
８　　　　容器
１０　　　基板
１００　　細胞接着性基板
１１０　　流入口
１２０　　流出口
１５０　　細胞接着性基板制御部
２００　　光学シャッター
２５０　　光学シャッター制御部
２１０　　光学シャッター制御装置
３００　　波長カットフィルター
３５０　　波長カットフィルター制御部
４００　　光照射装置
４５０　　光照射制御部
５００　　固体撮像素子
５５０　　撮像制御部
５６０　　画像処理部
５７０　　画像表示部
７００　　細胞選択装置
８００　　顕微鏡
９５０　　制御演算部
１０００　細胞選択システム

Claims (16)

  1. 　細胞と接着可能な物質を含む細胞接着性部が、光異性化する光応答性骨格部と連結され、該光応答性骨格部が基板に固定化された、細胞接着性基板と、
    　光学シャッターと
    を含む細胞選択装置。
  2. 　光照射装置を更に含む、請求項１に記載の細胞選択装置。
  3. 　前記光照射装置は、偏光光及び／又は平行光を照射し得る、請求項２に記載の細胞選択装置。
  4. 　前記光照射装置は、前記光応答性骨格部に対して斜光を照射し得る、請求項２に記載の細胞選択装置。
  5. 　前記光応答性骨格部は、シス体又はトランス体に変化し得る、請求項１に記載の細胞選択装置。
  6. 　前記光応答性骨格部は、アゾベンゼン、スチルベン、スピロピラン、スピロオキサジン、フルギド、シンナメート、シンナモイル、オリザノール、ジアリールエテン及びこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１以上の構造を含む、請求項１に記載の細胞選択装置。
  7. 　前記光応答性骨格部は、親水性を有する化合物で修飾される、請求項１に記載の細胞選択装置。
  8. 　前記光応答性骨格部は、環状アルキンを介して前記基板に固定化される、請求項１に記載の細胞選択装置。
  9. 　前記基板は、前記光応答性骨格部が固定化される面がアジド基で修飾されたアジド化基板である、請求項１に記載の細胞選択装置。
  10. 　前記細胞接着性部は、抗体、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、タンパク質、ペプチド、糖、オレイル基、アプタマー及び分子認識ポリマーからなる群から選択される少なくとも１種の物質を含む、請求項１に記載の細胞選択装置。
  11. 　前記細胞接着性部と連結された光応答性骨格部は、前記基板上にアレイ状に固定化されている、請求項１に記載の細胞選択装置。
  12. 　前記光学シャッターは、所望の前記アレイの要素ごとに開閉可能である、請求項１１に記載の細胞選択装置。
  13. 　細胞と接着可能な物質を含む細胞接着性部が、光異性化する光応答性骨格部と連結され、該光応答性骨格部が基板に固定化された、細胞接着性基板と、
    　光学シャッターと
    を含む細胞選択装置、及び
    　前記光学シャッターの開閉を制御する光学シャッター制御装置
    を含む、細胞選択システム。
  14. 　固体撮像素子を更に含む、請求項１３に記載の細胞選択システム。
  15. 　以下の工程（ａ）～（ｂ）：
    　（ａ）細胞と接着可能な物質を含む細胞接着性部が、光異性化する光応答性骨格部と連結され、該光応答性骨格部が基板に固定化された、細胞接着性基板と、
    　光学シャッターと
    を含む細胞選択装置に、細胞含有試料を適用し、細胞を捕捉する工程、及び
    　（ｂ）前記光学シャッターを開いて光照射し、前記捕捉された細胞を解放する工程
    を含む、細胞選択方法。
  16. 　細胞と接着可能な物質を含む細胞接着性部が、光異性化する光応答性骨格部と連結され、該光応答性骨格部が基板に固定化された、細胞接着性基板と、
    　光学シャッターと、
    を含む、細胞培養容器。
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