CN117015710A - 生物粒子分析方法及用于生物粒子分析的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的提供了一种用于在反映包含在生物粒子群体中的粒子之间的相互作用的影响的状态下分析生物粒子的技术。本公开提供了一种生物粒子分析方法，该分析方法包括：准备生物粒子群体的准备步骤：该生物粒子群体包括用于分泌物质捕获的第一捕获物质已结合到的生物粒子；第一捕获步骤，使通过将生物粒子群体放置在规定条件下产生的分泌物质与第一捕获物质结合在一起；以及第二捕获步骤，使与第一捕获物质结合的分泌物质与用于分泌物质捕获的第二捕获物质结合在一起。此外，本公开还提供了用于该分析方法的用于生物粒子分析的试剂盒、以及用于实施该分析方法的生物粒子分析系统。
Description
技术领域
本公开涉及生物粒子分析方法和用于生物粒子分析的试剂盒。更具体地，本公开涉及用于对包括在生物粒子群体中的每个生物粒子进行单细胞分析的生物粒子分析方法，以及用于该分析方法的生物粒子分析的试剂盒。
背景技术
为了分析细胞的反应性，已经提出测量分泌的分子。例如，下面的专利文献1公开了用于鉴定包括具有细胞外效应的效应细胞的细胞群体的方法。作为包含在该方法中的步骤，专利文献1描述了一种在包含读出粒子群的微反应器中保留包含一个或多个效应细胞的细胞群体的步骤，该读出粒子群包含一个或多个读出粒子；以及在微反应器中培育细胞群体和一个或多个读出粒子的步骤(权利要求1)。专利文献1描述了细胞外效应是对效应细胞的细胞外的读出粒子的直接或间接效应。作为更具体的示例，专利文献1还描述了细胞外作用是效应细胞分泌的靶生物分子与读出粒子的结合，或是一种反应，例如读出细胞或辅助细胞的凋亡(第0183段)。
此外，下面的专利文献2公开了分析分泌蛋白质的方法。专利文献2描述了该方法包括：将细胞封装在含有预定组分的微滴中；将从细胞分泌的分子结合到捕获分子，从而将分泌的分子保留在微滴中；以及检测分泌的分子(权利要求1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：PCT申请号2016-515823的日译文
专利文献2：PCT申请号2004-528574的日译文
发明内容
本发明要解决的问题
本公开的目的是提供用于分析处于包括在生物粒子群体中的状态的生物粒子的技术，特别是针对处于包括在细胞群体中的状态的细胞的单细胞分析技术。
问题的解决方案
本发明提供了一种生物粒子分析方法，包括：
准备生物粒子群体的准备步骤，该生物粒子群体包括生物粒子，被配置为捕获分泌物质的第一捕获物质结合到该生物粒子；
第一捕获步骤，使通过将该生物粒子群体放置在预定条件下而产生的分泌物质结合到该第一捕获物质上；以及
第二捕获步骤：将结合到该第一捕获物质的该分泌物质结合到第二捕获物质，该第二捕获物质被配置为捕获该分泌物质。
第一捕获步骤可以包括将生物粒子群体放置在预定条件下的处理步骤，以及
可以在保持该生物粒子群体的群体状态的同时执行该处理步骤。
在保持第一捕获物质结合到生物粒子的状态的同时，可执行第一捕获步骤和第二捕获步骤。
被配置为标识该生物粒子的粒子标识物可以结合到包括在该准备步骤中准备的生物粒子群体中的生物粒子上。
被配置为标识第二捕获物质的捕获物质标识物可以结合到第二捕获物质。
第一捕获物质可以包括分泌物质结合部和生物粒子结合部。
该分泌物质结合部可以被配置为结合到这些分泌物质中的一种或两种或更多种。
生物粒子结合部可以包含与生物粒子表面上的抗原结合的抗原结合物质或与形成生物粒子的表面膜的分子结合的分子结合物质。
该分泌物质结合部可以通过交联部结合到该生物粒子结合部上。
第一捕获物质可以包含结合到相同或不同类型的两个或更多个细胞的表面的抗体。
根据本公开的生物粒子分析方法可以还包括分离步骤，该分离步骤在该第二捕获步骤之后将包括在该生物粒子群体中的生物粒子分离为单个粒子。
根据本公开内容的生物粒子分析方法可以还包括在分离步骤之后破坏生物粒子的破坏步骤。
该破坏步骤可以在一个生物粒子中包含的组分不与另一个生物粒子中包含的组分混合的环境下进行。
根据本公开内容的生物粒子分析方法可以还包括在破坏步骤之后分析每个生物粒子的分析步骤。
此外，本公开还提供了
用于生物粒子分析的试剂盒，该试剂盒包括：
第一分泌物质捕获物质，该第一分泌物质捕获物质包括：第一生物粒子结合部，该第一生物粒子结合部被配置为结合到生物粒子；以及第一分泌物质结合部，该第一分泌物质结合部被配置为结合到通过将包括该生物粒子的生物粒子群体放置在预定条件下而产生的分泌物质；以及
第二分泌物质捕获物质，包括：第二分泌物质结合部，被配置为结合所述分泌物质；以及捕获物质标识物，被配置为标识第二捕获物质。
第一分泌物质捕获物质可以还包括交联部，该交联部使生物粒子结合部和分泌物质结合部交联。
第一生物粒子结合部可以包含与生物粒子表面上的抗原结合的抗原结合物质或与形成生物粒子的表面膜的分子结合的分子结合物质。
抗原结合物质可以含有选自抗体、抗体片段、适配体和分子印迹聚合物的物质。
分子结合物质可以包括油烯基或胆固醇基。
该试剂盒可以还包括具有表面的基底材料，在该表面上粒子捕获物质包括：第二生物粒子结合部，该第二生物粒子结合部被配置为结合到该生物粒子；以及被配置为标识该生物粒子的粒子标识物被固定。
附图说明
图1A是本公开的生物粒子分析方法的流程图的示例。
图1B是生产步骤的流程图的示例。
图2A是用于示出生产步骤的示意图。
图2B是用于示出第一捕获步骤的示意图。
图2C是用于示出第二捕获步骤的示意图。
图2D是用于示出分离步骤、破坏步骤和分析步骤的示意图。
图3A是用于示出粒子捕获物质的示意图。
图3B是示出分子结合物质的示例的视图。
图4是用于示出第一捕获物质的示意图。
图5是用于示出第一捕获物质和粒子捕获物质结合到的生物粒子的示意图。
图6是用于示出第二捕获物质的示意图。
图7A是示出用于形成乳液粒子的微芯片的示例的视图。
图7B是用于示出分离乳液粒子中的生物粒子的示意图。
图8是微粒分选部分的示意性放大图。
图9是微粒分选部分的示意性放大图。
图10是形成乳液的方法的流程图的示例。
图11A是连接通道部分的示意性放大图。
图11B是连接通道部分的示意性放大图。
图12A是连接通道部分的示意性放大图。
图12B是连接通道部分的示意性放大图。
图13是示出容器连接至微芯片的状态的示意图。
图14是微芯片的另一个示例的示意图。
图15是用于执行粒子分离步骤的孔的示例的示意图。
图16是用于示出由设置在微流体芯片中的喷嘴生成包含生物粒子的液滴的示意图。
图17是示出第一捕获物质结合到生物粒子的状态的示例的示意图。
图18是示出第一捕获物质结合到生物粒子的状态的示例的示意图。
图19是示出第一捕获物质结合到生物粒子的状态的示例的示意图。
图20是示出通过一个第一捕获物质捕获两个细胞的状态的示意图。
图21是示出包含结合两个或更多个生物粒子的抗体的第一捕获物质的示例的示意图。
图22是用于示出两个或更多个生物粒子的交联的示例的示意图。
图23是用于示出两个或更多个生物粒子的交联的示例的示意图。
图24是示出表面分子结合物质结合到生物粒子的状态的示意图。
图25是用于示出与标识物质结合的表面分子结合物质的示意图。
具体实施方式
在下文中，将描述用于实施本公开的优选实施方式。要注意的是，下面描述的实施方式显示了本公开的代表性实施方式，并且本公开的范围不仅仅限于这些实施方式。应注意，将按照以下顺序描述本公开。
1.第一实施方式(生物粒子分析方法)
(1)问题的描述
(2)第一实施方式的描述
(3)第一实施方式的示例
(3-1)准备步骤
(3-1-1)表面准备步骤
(3-1-2)表面捕获步骤
(3-1-3)捕获物质结合步骤
(变形例1：分泌物质结合部包含多个分泌物质结合部的实施方式)
(变形例2：生物粒子结合部是多特异性抗体的实施方式)
(变形例3：包含结合到两个或更多个生物粒子的抗体的第一捕获物质)
(变形例4：两个或更多个生物粒子的交联)
(3-1-4)断裂步骤
(3-1-4-1)检测步骤
(3-1-4-2)连接部断裂步骤
(3-2)第一捕获步骤
(3-3)第二捕获步骤
(变形例5：与生物粒子的表面分子结合的物质的使用)
(3-4)分离步骤
(3-4-1)判别步骤
(3-4-2)粒子分离步骤
(3-4-2-1)乳液粒子中的空间的情况
(3-4-2-2)孔中的空间的情况
(3-5)破坏步骤
(3-6)分析步骤
2.第二实施方式(用于生物粒子分析的试剂盒)
3.第三实施方式(生物粒子分析系统)
1.第一实施方式(生物粒子分析方法)
(1)问题的描述
如上所述，已经提出通过测量分泌的分子来分析细胞的反应性的一些技术。然而，这些技术没有考虑由于包括多种类型的细胞的细胞群体(例如，免疫细胞群体)中的细胞之间的相互作用引起的效应。
此外，基因表达与分泌的分子量之间的相关性可能是低的。因此，仅测量细胞内分子可能不足以用于分析细胞。对于细胞的更详细的分析，认为需要同时测量细胞内的分子和细胞外的分泌的分子，并进一步同时测量除这些分子外的细胞表面分子。
对于包括多种类型的细胞的细胞群体，例如，免疫细胞群体，难以同时指定细胞群体中包括的细胞的细胞类型、分析细胞中包括的细胞内分子、以及分析与细胞相关的细胞外分子(具体地，分泌的分子)。
为了进行这些指定和/或分析，可想到使用荧光染料作为标记物。然而，由于荧光光谱的重叠，在使用荧光染料的情况下能够识别的分子类型的数量最多约为几十个。细胞类型可以通过流式细胞术指定，但仅使用荧光染料难以获得其他信息(例如，关于细胞内分子和/或细胞外分泌分子的信息)。
此外，为了分析从细胞分泌的细胞外的分子，可以使用被配置为捕获这些分子的珠(bead)。在这种情况下，可以想象以微空间分离细胞和珠，然后捕获分子。然而，在样品中包含多种类型的细胞的情况下，难以指定已经分泌分子的细胞和从某些细胞分泌的分子。
鉴于上述，本公开的主要目的是提供一种用于在被包括在生物粒子群体中的状态下分析生物粒子的技术。本公开的另一个目的是提供一种用于分析存在于该生物粒子外部的一种或多种物质(具体地，分泌物质)和/或存在于该生物粒子内部的一种或多种物质的技术。该分析可以例如在生物粒子群体中包括的每个生物粒子上执行。
(2)第一实施方式的描述
根据本公开的方法包括：准备生物粒子群体的准备步骤，该生物粒子群体包括生物粒子，被配置为捕获分泌物质的第一捕获物质结合到该生物粒子；第一捕获步骤，该第一捕获步骤使通过将该生物粒子群体放置在预定条件下而产生的分泌物质结合到该第一捕获物质上；以及将与第一捕获物质结合的分泌物质与配置为捕获分泌物质的第二捕获物质结合的第二捕获步骤。因此，可以形成这样的状态，在该状态中在生物粒子群体置于预定条件下的情况下产生的分泌物质被第一捕获物质和第二捕获物质捕获，并且这三种物质(分泌物质、第一捕获物质和第二捕获物质)与生物粒子结合。因此可以以反映生物粒子群体中的粒子间相互作用的状态分析生物粒子。即，在根据本公开的方法中，可以执行第一捕获步骤和第二捕获步骤，同时保持第一捕获物质结合到生物粒子的状态。
本公开适用于分析包括在具有多样性的细胞群体(如免疫细胞群体)中的细胞。例如，根据本公开，可以获得反映细胞群体中细胞间相互作用的影响的关于细胞的信息(细胞的类型或状态，例如，分化程度等)，以及关于细胞外分子(特别地，分泌物质)的信息。根据本公开，除了这些条信息之外，还可以获得关于细胞内分子的信息。例如，根据本公开，通过分析分泌物质(例如，指定分泌物质的类型或测量分泌物质的量)，可以直接或间接地观察包括在具有某种细胞构型的细胞群体中的细胞中的哪个细胞是反应的。因此，可阐明不同细胞群体的功能。
在根据本公开的方法中，可以通过结合到该生物粒子的表面的第一捕获物质捕获该分泌物质。此外，在根据本公开的方法中，生物粒子不必处于分离状态以引起产生分泌物质的反应，并且该反应可以在存在多种类型的生物粒子的环境中进行。
此外，在生物粒子表面上捕获的分泌物质与第二捕获物质(例如，结合捕获物质标识物(例如寡聚条形码(oligo barcode))的分泌物质结合抗体)反应。可以用例如结合到该生物粒子的表面上的粒子标识物(包括寡聚条形码或类似物)分析或测量该第二捕获物质。因此，也可以通过预先将分泌物质与第二捕获物质结合来分析或测量分泌物质。此外，除了分泌物质的分析或测量之外，可同时进行生物粒子的表面抗原的分析和/或生物粒子中基因表达的分析。此外，有可能确认通过将生物粒子群体置于促进分泌物质分泌的条件下而分泌的分泌物质来自哪个生物粒子，例如，其中粒子标识物结合到该生物粒子的表面。
在优选实施方式中，该第一捕获步骤包括将该生物粒子群体放置在预定条件下的处理步骤，并且在保持该生物粒子群体的群体状态的同时执行该处理步骤。因此，可以进行产生分泌物质的反应，同时保持细胞群体中的细胞间相互作用。然后，反应后，可以用单细胞分辨率分析细胞类型、细胞状态、细胞内基因表达、细胞外分泌的分子等。
根据本公开的方法可以还包括分离步骤，该分离步骤在该第二捕获步骤之后将包括在生物粒子群体中的生物粒子分离为单个粒子。根据本公开的方法可以还包括在分离步骤之后破坏该生物粒子的破坏步骤。可以在保持分离状态时执行破坏步骤。即，破坏步骤可以在一个生物粒子中包含的组分不与另一个生物粒子中包含的组分混合的环境下进行。根据本公开内容的方法可以还包括在破坏步骤之后分析每个生物粒子的分析步骤。
通过这些步骤，可以用单个细胞分辨率分析包括多种类型的细胞的细胞群体中包括的细胞的反应性。可以通过这种分析阐明特定细胞群体中的每个细胞的功能。同样在这个分析中，有可能指定在体外测定中对于治疗最佳的细胞或细胞群体。因此，本公开内容有助于改善用于治疗疾病如癌症的细胞群体(例如，细胞治疗剂)的响应速率。
(3)第一实施方式的示例
下面将参照图1A描述本发明的生物粒子分析方法。图1A是生物粒子分析方法的流程图的示例。
例如，如图1A所示，本公开的生物粒子分析方法包括准备步骤S101、第一捕获步骤S102、第二捕获步骤S103、分离步骤S104、破坏步骤S105和分析步骤S106。下面对各步骤进行说明。
(3-1)准备步骤
在准备步骤S101中，准备生物粒子群体，该生物粒子群体包括用于捕获分泌物质的第一捕获物质结合到的生物粒子。生物粒子群体可以例如是细胞群体。细胞群体例如是免疫细胞群体或血细胞群体。
该准备步骤包括该生物粒子群体的生产步骤。将参照图1B和图2A描述生产步骤的示例。图1B是生产步骤的流程图的示例。图2A是用于示出生产步骤的示意图。
如图1B所示，生产步骤可包括表面准备步骤S111、表面捕获步骤S112、捕获物质结合步骤S113以及断裂步骤S114。下面将描述这些步骤。
(3-1-1)表面准备步骤
在表面准备步骤S111中，准备固定有粒子捕获物质的表面。例如，如图2A所示，多个粒子捕获物质120固定在基板100的表面110上。
粒子捕获物质120经由连接部(linker)126固定至表面110，所述连接部作为物质的一部分被包括。
如图3A所示，除了连接部126外，粒子捕获物质120还包括粒子捕获部121、物质回收部122(例如，多聚T(poly T))、唯一分子标识物(UMI)部123、粒子标识物124(例如，细胞条码)和回收物质扩增部125(例如，用于核酸扩增的引物和/或用于核酸转录的启动子)。下面将描述这些。
粒子捕获部121被配置为捕获生物粒子，并且特别地被配置为捕获细胞。粒子捕获部121可以是生物粒子粘合物质。生物粒子结合物质可以是与生物粒子P的表面上的抗原结合的抗原结合物质，或者与形成生物粒子P的表面膜的分子结合的分子结合物质。
抗原结合物质可以含有选自抗体、抗体片段、适配体和分子印迹聚合物的物质。抗体或抗体片段例如可以是与存在于生物粒子如细胞表面上的组分(特别是表面抗原)结合的抗体或抗体片段。适配体可以是核酸适配体或肽适配体。适配体和分子印迹聚合物还可以结合例如存在于生物粒子如细胞表面上的组分(特别是表面抗原)。
分子结合物质例如是具有油烯基或胆固醇基的化合物。这些基团可以非特异性地结合到形成生物粒子P的表面膜的分子(例如，细胞)。油烯基和胆固醇基可以结合到例如包括脂双层膜的生物粒子，如细胞。具有油烯基的化合物的示例包括图3B的左侧所示的油胺。含有胆固醇基的化合物的示例包括图3B右侧所示的胆固醇-TEG(具有15个原子的三乙二醇间隔物)。图3B的右上图示出胆固醇基-TEG结合到寡核苷酸的5'端的状态。图3B的右下图示出胆固醇基-TEG结合到寡核苷酸的3'端的状态。通过用包括油烯基或胆固醇基的分子结合物质修饰寡核苷酸，寡核苷酸可以捕获生物粒子。
物质回收部122被配置为捕获在后面描述的项目(3-3)第二捕获步骤中形成的第一捕获物质、分泌物质和第二捕获物质和/或生物粒子中包含的分子的组合物。
物质回收部122可包含例如核酸或蛋白质。
该核酸可以被配置为全面地捕获该生物粒子(特别是细胞)中所包含的组合物、以及mRNA，并且例如可以是多聚T序列。聚T序列可以结合到构成组合物的第二捕获物质中包含的多聚A序列。此外，多聚T(poly T)序列还可以结合到包含在生物粒子中的mRNA中的多聚A(poly A)序列。
可替代地，该核酸可以具有与包含在组合物中的靶序列或该生物粒子中的核酸的靶序列互补的序列。该核酸可以通过具有互补序列而结合到这些靶序列上。
在物质回收部是蛋白质的情况下，蛋白质例如可以是抗体。物质回收部可以是适配体或分子印迹聚合物。
物质回收部122可以包含用于捕获包含在生物粒子中的组合物或分子的两种以上类型的组成元件。物质回收部122可以包含蛋白质和核酸两者，并且可以包含例如抗体和多聚T序列两者。因此，可以同时检测蛋白质和mRNA。
唯一性分子鉴定物(UMI)部123可以含有核酸，具体地可以含有DNA或RNA，并且更具体地含有DNA。UMI部123可以具有例如5个碱基至30个碱基、具体地6个碱基至20个碱基、并且更具体地7个碱基至15个碱基的序列。
UMI部123可具有固定至表面110的粒子捕获物质当中的不同序列。例如，在UMI部分具有10个碱基的核酸序列的情况下，UMI序列的类型是410，即1百万或更多。
UMI部123可以用于对包含在该生物粒子中的分子进行定量。例如，在有待定量的分子是mRNA的情况下，可以将UMI序列添加至cDNA中，该cDNA是通过作为靶标物质的mRNA的逆转录获得的，例如，在稍后描述的分析步骤中。通过扩增从一个mRNA分子逆转录的cDNA而获得的多个cDNAs具有相同的UMI序列，但是通过扩增从与该一个mRNA的序列具有相同序列的另一个mRNA分子转录的cDNA而获得的多个cDNAs具有不同的UMI序列。因此，可以通过对具有相同cDNA序列的UMI序列的类型的数目进行计数来确定mRNA的拷贝数。因此，稍后描述的分析步骤可以包括，例如，确定mRNA的拷贝数，或者可以包括对具有相同cDNA序列的UMI序列的类型的数目进行计数。
例如，UMI部123可具有多个粒子捕获物质之间的不同序列，所述多个粒子捕获物质包含相同的粒子标识物并且被固定在图2A的a和b中示出的一个区域R(例如，稍后描述的点或珠)中。即，固定至区域R(例如，稍后描述的点或珠)的多个目标捕获分子可具有相同的粒子标识物，但是可具有不同的UMI部分(具体地，具有彼此不同的碱基序列的UMI部分)。
粒子标识物124用于标识或指定粒子标识物结合到的生物粒子(更具体地，包括粒子标识物的粒子捕获物质结合到的生物粒子)。粒子标识物124含有例如具有条形码序列的核酸。该核酸可以具体地是DNA或RNA，并且更具体地是DNA。该条形码序列可以用于，例如，指定捕获的生物粒子(具体地，细胞)，并且具体地，可以用作标识物，用于使在某一微空间中分离的生物粒子与在另一微空间中分离的生物粒子可区分。条形码序列也可以用作用于使包括某个条形码序列的粒子捕获物质与包括另一条形码序列的粒子捕获物质区分开的标识物。该条形码序列可以与生物粒子相关联，包括该条形码序列的粒子捕获物质被结合到该生物粒子上。此外，条形码序列可与关于包括条形码序列的粒子捕获物质固定在其上的表面110上的位置的信息相关联。此外，该条形码序列可以与微空间相关联，在该微空间中，包括该条形码序列的粒子捕获物质结合到其上的生物粒子被分离，并且进一步地，可以与关于该微空间位置的信息相关联。
关于位置的信息例如是关于XY坐标的信息，但不限于此。ID号可以分配给与位置信息相关联的条形码序列。ID号可用于断裂步骤之后的步骤中。ID号可以一对一地对应于条形码序列，并且可以在断裂步骤之后的步骤中用作对应于条形码序列的数据。
如上所述，用于标识生物粒子的粒子标识物可以结合到包括在准备步骤S101中准备的生物粒子群体中的生物粒子。
固定在表面110的特定区域中的多个粒子捕获物质可以具有相同的粒子标识物(具体地，相同的条形码序列)。因此，特定区域和粒子标识物彼此相关联。通过将特定区域的尺寸设置为小于生物粒子的尺寸，包括粒子标识物的粒子捕获物质可以与存在一个生物粒子的位置相关联。例如，如图2A的a和b所示，其上固定有包括相同粒子标识物的多个粒子捕获物质120的区域R可小于生物粒子P的尺寸。
如上所述，在本公开的生物粒子分析方法中使用的表面110可以具有多个区域，具有相同粒子标识物的多个粒子捕获物质固定在该多个区域上。然后，粒子标识物对于每个区域可以是不同的。每个区域的尺寸(例如，区域的最大尺寸、区域的直径、长直径、长边的长度等)可优选小于生物粒子的尺寸。每个区域的尺寸例如可以是50μm或更小，优选地，10μm或更小，并且更优选地，5μm或更小。
多个区域可以以间隔布置，使得例如被固定在一个区域中的粒子捕获物质捕获的生物粒子不被固定在另一个区域中的粒子捕获物质捕获。该间隔例如可以是等于或大于该生物粒子的尺寸的距离，并且可以优选地是大于该生物粒子的尺寸的距离。
多个区域的数量优选地大于在捕获步骤中施加到表面110上的生物粒子的数量。这种构造防止两个或更多个生物粒子被捕获在一个区域中。
在本公开的一个实施方式中，包括已知粒子标识物(具体地，序列已知的条形码序列)的粒子捕获物质可被固定在预定区域中。例如，表面110具有多个区域，并且固定至多个区域中的每个的多个粒子捕获物质可以包括相同的粒子标识物。该多个区域可以被设置成小于待捕获的生物粒子的尺寸。在表面110具有这种配置的情况下，多个区域中的每可以与包括在固定至每个区域的多个目标捕获分子中的粒子标识物关联。
在本说明书中，将如上所述固定包含相同粒子标识物的粒子捕获物质的区域也称为点。即，光斑的尺寸可以例如是50μm或更小，优选10μm或更小，并且更优选5μm或更小。
如上所述配置的表面110可将包括在特定粒子捕获物质中的粒子标识物与当粒子捕获物质固定在表面110上时特定粒子捕获物质存在的位置相关联。为了进行固定，例如，将生物素结合在粒子捕获物质的连接部1上，将链霉抗生物素蛋白结合在固定有粒子捕获物质的表面101上，然后，将生物素和链霉抗生物素蛋白结合，从而将粒子捕获物质固定在表面110上。
在本公开的另一个实施方式中，包括粒子标识物的粒子捕获物质可随机地布置在表面110上。
在这种情况下，在将包括粒子标识物的粒子捕获物质固定至表面110之后，指定包括在固定的粒子捕获物质中的粒子标识物(具体地，读取条形码序列)。由此，某个粒子捕获物质中所包括的粒子标识物与该某个粒子捕获物质存在的位置相关联。该读取可以通过例如一种技术进行，如通过合成的测序、通过连接的测序、或通过杂交的测序。
另外，某个粒子捕获物质中包含的粒子标识物和该某个粒子捕获物质存在的位置不必相互关联。在这种情况下，例如，在后述的分离步骤中，以微空间分离生物粒子和粒子捕获物质。由此，该生物粒子与该粒子捕获物质(具体地，包含在该粒子捕获物质中的条形码序列)是一对一地相关联的。
在本实施方式中，例如可以使用包括相同粒子标识物的多个粒子捕获物质所结合的珠(例如凝胶珠)。珠(例如，凝胶珠)可以被固定到例如表面110上。珠(例如，凝胶珠)的尺寸例如可以是50μm或更小，优选10μm或更小，并且更优选5μm或更小。为了将粒子捕获物质结合到珠(例如，凝胶珠)，例如，可以使用生物素和链霉亲和素的组合。例如，将生物素结合到粒子捕获物质的连接部126上，将链霉亲和素结合到这些珠粒上，并且然后将该生物素和链霉亲和素结合。由此，粒子捕获物质被固定在珠粒上。
表面110可以设置有多个凹槽。本实施方式中的一个点或一个珠可以布置在多个凹槽的每一个中。点或珠可通过多个凹槽更容易地布置在表面110上。凹槽的尺寸优选为例如放置一个珠部的尺寸。凹槽的形状可以是，但不限于，圆形、椭圆形、六边形或四边形。
此外，在表面110中，布置点或胎圈的表面部分的状态可以不同于另一表面部分。例如，其上布置点或珠的表面部分可以是亲水的，并且另一表面部分可以是疏水的，或者另一表面部分可以是疏水的并且具有突起。赋予表面亲水性的技术的示例包括在氧存在下的反应离子蚀刻、在臭氧存在下用深紫外光照射等。在这些技术中，可以使用具有对应于要赋予亲水性的部分的穿透部分的掩模。此外，赋予表面疏水性的技术的示例包括硅酮喷雾(spray-on-silicone)，例如，可以使用Techspray2101-12S等。甚至在赋予疏水性的情况下，例如，可以使用具有对应于赋予疏水性的部分的穿透部分的掩模。
也可以通过例如DNA微阵列生产技术等在基质上合成粒子捕获物质。例如，通过用于光刻的技术，诸如数字微镜器件(DMD)、液晶快门或空间光调制器，可在特定位置合成粒子捕获物质。用于合成的技术描述于，例如，临床微生物学微阵列的基本概念和潜在应用，临床微生物学，临床微生物学，2009年10月，第611至633页(Basic Concepts ofMicroarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology,CLINICALMICROBIOLOGY REVIEWS,Oct.2009,page.611to 633)。另外，在通过合成而在基板上合成粒子捕获物质的情况下，在合成粒子捕获物质时获取关于合成粒子捕获物质的位置的信息，并且粒子标识物和位置信息相互关联。此时，ID号可以分配给每个粒子标识物。
在本公开的一个实施方式中，固定在表面上的所有粒子捕获物质可以包括共同的寡核苷酸序列。通过使用具有与寡核苷酸序列互补的序列的荧光标记的核酸，可以确认其中粒子捕获物质被固定的位置(特别地，斑点的位置或珠的位置)，并且特别地，可以确认暗场中的位置。另外，在表面上没有上述凹凸的情况下，有时难以掌握粒子捕获物质的固定位置。在这种情况下，荧光标记使得容易掌握其中粒子捕获物质被固定的位置。
回收物质扩增部125可包含例如具有用于扩增核酸的引物序列的核酸和/或用于在稍后描述的分析步骤中转录核酸的启动子序列。该核酸可以是DNA或RNA，并且特别是DNA。回收物质扩增部125可具有引物序列和启动子序列两者。引物序列例如可以是PCR手柄。启动子序列例如可以是T7启动子序列(promoter sequence)。在本说明书中，回收物质扩增部125也被称为第一回收物质扩增部，以与稍后描述的第二回收物质扩增部172区分开。
连接部126可以是通过刺激可断裂的连接部，并且例如是通过光刺激或化学刺激可断裂的连接部。光刺激特别适合于在稍后描述的断裂步骤中选择性地刺激特定位置。
连接部126可含有例如选自芳基羰基甲基、硝基芳基、香豆素-4-基甲基、芳基甲基、含金属基团和其他基团中的任一种，作为可通过光刺激断裂的连接部。作为这些基团，例如描述于化学和生物学中的光可去除的保护基团：反应机制和功效，化学.Rev.2013,113,第119至191页(Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology:Reaction Mechanisms and Efficacy,Chem.Rev.2013,113,page 119to 191)。
芳基羰基甲基例如可以是苯甲酰甲基、邻烷基苯甲酰基或对羟基苯甲酰基。硝基芳基例如可以是邻硝基苄基、邻硝基-2-苯乙氧基羰基或邻硝基苯胺。芳基甲基例如可以是引入羟基的芳基，或不引入羟基的芳基。
在连接部126是通过光刺激可断裂的连接部的情况下，连接部可以通过具有优选地360nm或更大的波长的光断裂。连接部可以是优选以0.5μJ/μm2或更小的能量断裂的连接部。(用于定量生物学的光片荧光显微镜，自然方法(Nat Methods)，2015年1月；12(1)：23-6.doi：10.1038/nmeth.3219(Light-sheet fluorescence microscopy for quantitativebiology,Nat Methods.2015Jan；12(1):23-6.doi:10.1038/nmeth.3219))。通过采用由具有上述波长或上述能量的光断裂的连接部，可以减少当施加光刺激时可能发生的细胞损伤(具体地，DNA或RNA等的断裂)。
特别优选地，连接部可以是被短波长范围内的光、具体地360nm至410nm波长范围内的光断裂的连接部，或者可以是被近红外区域或红外区域中的光、具体地800nm以上波长范围内的光断裂的连接部。在连接部是被具有在可见光区域中的波长的光有效断裂的连接部的情况下，可能难以处理分析表面。因此，连接部优选是被短波长范围内的光、或近红外区域或红外区域中的光断裂的连接部。
连接部126可以含有例如二硫键或限制性内切核酸酶识别序列，作为通过化学刺激可断裂的连接部。对于二硫键的断裂，例如，使用还原剂如三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、或2-巯基乙醇。例如，在使用TCEP的情况下，例如使用50mM TCEP进行反应约15分钟。对于限制性核酸内切酶识别序列的解离，使用适当的限制性核酸内切酶(http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php？unitid＝U100003632)根据每个序列使用。1U的限制性内切核酸酶活性是在37℃下原则上在50μl的每种酶反应溶液中每小时完全降解1μgλDNA的酶的量。根据限制性内切核酸酶识别序列的量调节酶的量。
为了增加随后描述的断裂步骤中的效率，粒子捕获物质120可以包括多个可断裂连接部。优选地，该多个连接部可以串联连接。例如，在一个连接部的断裂概率是0.8的情况下，通过串联连接三个连接部将断裂概率提高至0.992(＝1-0.23)。
(3-1-2)表面捕获步骤
在表面捕获步骤S112中，例如，如图2A的b中所示，通过粒子捕获物质120捕获生物粒子P。特别是，由粒子捕获物质120的粒子捕获部121捕获生物粒子。在表面捕获步骤S112中，生物粒子和粒子捕获部121可以以特定或非特定的方式彼此结合。
例如，在生物粒子是细胞的情况下，细胞可以通过细胞表面抗原与包含在粒子捕获部121中的抗体、适配体或分子印迹聚合物的结合而被粒子捕获物质120捕获。抗体、适配体和分子印迹聚合物对表面抗原可以是特异性的或非特异性的。在这种情况下，也可以通过使细胞的脂双层膜与粒子捕获部121所包含的油烯基或胆甾醇基结合而由粒子捕获物质120捕获细胞。
表面捕获步骤S112可包括将生物粒子施加到表面110上的施加步骤。施用形式可以例如通过使包含生物粒子群体的样品(例如，包含生物粒子的液体)与表面110接触来进行。例如，可以将包含生物粒子群体的样品滴在表面110上。
在表面捕获步骤S112中，优选地，结合到一个生物粒子的多个粒子捕获物质可具有相同的粒子标识物。因此，一个粒子标识物(具体地，条形码序列(barcode sequence))可以与一个生物粒子相关联。另外，优选所述多个粒子捕获物质中包含的UMI部具有彼此不同的碱基序列。因此，例如，可以确定mRNA的拷贝数。
表面捕获步骤S112可包括用于结合生物粒子和粒子捕获物质的培育步骤。培育条件如培育时间和温度可以根据生物粒子和待使用的粒子捕获物质的类型来确定。
在执行表面捕获步骤S112之后，可执行去除诸如未与粒子捕获物质120结合的生物粒子等不必要物质的去除步骤。断裂步骤可包括用液体(例如，缓冲液)洗涤表面110。
(3-1-3)捕获物质结合步骤
如图2A的b中所示，将用于捕获分泌物质的第一捕获物质130结合到每个生物粒子。结合到一个生物粒子的第一捕获物质130的类型的数量可以是一个或多个。此外，要结合到一个生物粒子的第一捕获物质130的数量可以是一个或多个，但优选是多个。
将参考图4描述第一捕获物质130。图4是用于示出第一捕获物质130的结构的示例的示意图。如图中所示，第一捕获物质130包括分泌物质结合部131和生物粒子结合部133。第一捕获物质130还包括交联部132。分泌物质结合部131通过交联部132结合到生物粒子结合部133。
分泌物质结合部131可以被配置为结合一种或两种或更多种分泌物质。分泌物质结合部131可以由本领域技术人员根据待结合的分泌物质进行适当设计或生产。例如，分泌物质结合部131例如可以是从由抗体、抗体片段、适配体和分子印迹聚合物组成的组中选择的物质，并且特别是抗体或抗体片段。注意，在图4中，抗体被示为分泌物质结合部131。分泌物质结合部131的结合可以是特异性的或非特异性的，并且特别是特异性的。与一个生物粒子P结合的分泌物质结合部131的类型的数量可以是一个或多个。
与分泌物质结合部131结合的分泌物质是通过将包括生物粒子P的生物粒子群体置于预定条件下而产生的分泌物质。分泌物质可以是从生物粒子P分泌的物质、从包括在生物粒子群体中的其他生物粒子分泌的物质、或从构成预定条件的环境衍生的分泌物质。构成预定条件的环境可以由执行本公开的生物粒子分析方法的用户适当地选择，并且可以是包含针对其分析生物粒子群体的反应性的材料的环境。该环境例如可以是其中生物粒子群体被培育的环境，并且是，例如，在培养基或缓冲液中的环境。可以根据待分析的反应性来选择对其分析生物粒子群体的反应性的材料，并且该材料可以是生物材料或非生物材料。生物材料例如可以是病变组织、病变细胞、微生物(细菌、真菌、或病毒)、或异源组织。非生物材料例如可以是药物或毒性物质。病变组织例如可以是肿瘤组织，并且具体地，可以是癌组织或肉瘤组织。病变细胞例如可以是肿瘤细胞，并且具体地，可以是癌细胞、肉瘤细胞、或恶性淋巴瘤细胞。
例如，在生物粒子群体是免疫细胞群体并且分析免疫细胞群体与病变组织或病变细胞的反应性的情况下，构成预定条件的环境可以是包含病变组织或病变细胞的液体材料(具体地，介质或缓冲液)。
交联部132是使分泌物质结合部131和生物粒子结合部133交联的物质。注意，生物粒子结合部133可以直接结合到分泌物质结合部131，并且在这种情况下，第一捕获物质130不需要包括交联部。
交联部132例如可以是在国际公开号2017/177065中描述的化合物、或它们的立体异构体、盐、或互变异构体。下面将描述该化合物。
交联部132可以是具有以下结构(I)的化合物：
[化学式1]
或它们的立体异构体、盐或互变异构体。分泌物质结合部131可以结合到结构(I)中的R2和R3中的任何一个，并且生物粒子结合部133可以结合到另一个。
在结构(I)中：
M在每次出现时独立地是具有两个或更多个碳-碳双键和至少一个缀合度的部分；
L1在每次出现时独立地是i)可选的亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基、杂亚烯基、杂亚炔基或杂原子连接部；或ii)具有能够通过两个互补反应性基团的反应形成的官能团的连接部；
L2和L3在每次出现时独立地是任选的亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基、杂亚烯基、杂亚炔基、或杂原子连接部；
L4在每次出现时独立地是具有大于3个原子的长度的杂亚烷基、杂亚烷基或杂亚炔基连接部，其中该杂亚烷基、杂亚烷基和杂亚炔基连接部中的杂原子选自O、N和S；
R1在每次出现时独立地是H、烷基、或烷氧基；
R2和R3各自独立地是H、OH、SH、烷基、烷氧基、烷基醚、杂烷基、-OP(＝Ra)(Rb)Rc、Q、或其保护形式、或L'；
R4在每次出现时独立地是OH、SH、O-、S-、ORd、SRd、或Q；
R5在每次出现时独立地为氧代、硫代或不存在；
Ra是O或S；
Rb是OH、SH、O-、S-、ORd或SRd；
Rc是OH、SH、O-、S-、ORd、OL'、SRd、烷基、烷氧基、杂烷基、杂烷基烷氧基、烷基醚、烷氧基烷基醚、磷酸酯、硫代磷酸酯、磷烷基、硫代磷烷基、磷烷基醚、或硫代磷烷基醚；
Rd是抗衡离子；
Q在每次出现时独立地是具有能够与分析物分子形成共价键的反应性基团的部分、靶向部分、固体载体或互补反应性基团Q'或其保护形式；
L'在每次出现时独立地是与Q具有共价键的连接部、与靶向部分具有共价键的连接部、与分析物分子具有共价键的连接部、与固体载体具有共价键的连接部、与固体载体残基具有共价键的连接部、与核苷具有共价键的连接部或与结构(I)的另一种化合物具有共价键的连接部；
m在每次出现时独立地是0或更大的整数，其条件是m的至少一次出现是1以上的整数；以及
n是1以上的整数。
此外，分泌物质结合部131可以结合到结构(I)中的R4。例如，生物粒子结合部133可以结合到R2和R3中的任何一个，并且分泌物质结合部131可以结合到R2和R3中的另一个和选自R4的一个或两个或更多个中的每一个。结合多个分泌物质结合部131的结构的示例还被描述为用于稍后描述的变形例1中的参考。
为了将多个相同或不同的分泌物质结合部结合到R4，准备其中分泌物质结合部连接至结构(I)的R4部分的部分(在下文中称为R4-1)，并且类似地，准备R4-2、R4-3、…、以及R4-i(在此，i例如可以是2至500的整数，特别是2至300，更特别是2至100、2至50、2至20、或2至10，或甚至更特别是2至4的整数)。然后，R4-1至R4-i可以顺序地并入结构(I)中，例如，如在DNA合成中。
在R4-1至R4-i中，没有结合分泌物质结合部的R4(也称为R4-0)可以作为间隔基引入。例如，不具有分泌物质结合部的R4-0所结合的一个或多个P原子可存在于具有分泌物质结合部的R4所结合的一个P原子和具有分泌物质结合部的R4所结合的另一个P原子之间。
此外，R4可以包括间隔分子如PEG，即，原子P和分泌物质结合部可以通过间隔分子结合。
关于具有结构(I)的化合物，L4在每次出现时可以独立地是环氧烷连接部。
关于具有结构(I)的化合物，L4是聚环氧乙烷，并且该化合物具有以下结构(IA)：
[化学式2]
其中，z可以是2至100的整数，例如，3至6的整数。关于具有结构(I)的化合物，L1可以具有以下结构之一：[化学式3]。
该化合物可以具有以下结构(IB)：
[化学式4]
其中
x1、x2、x3和x4在每次出现时独立地是0至6的整数，以及
z可以是2至100的整数。
xl和x3在每次出现时可以各自是0，并且x2和x4在每次出现时可以各自是1。
xl、x2、x3和x4在每次出现时可以各自是1。
关于具有结构(I)的化合物，R4在每次出现时可以独立地是OH、O-或ORd，并且R5可以在每次出现时是氧代。
关于具有结构(I)的化合物，R1在每次出现时可以是H。
关于具有结构(I)的化合物，R2和R3可以各自独立地是-OP(＝Ra)(Rb)Rc。
Rc可以是OL'。
L'可以是至Q的杂亚烷基连接部、靶向部分、分析物分子、固体载体、固体载体残基、核苷或具有结构(I)的另一种化合物。
L'可以包括环氧烷或磷酸二酯部分、或它们的组合。
L'具有以下结构：
[化学式5]
其中
m"和n"独立地是1至10的整数；以及
Re是H、电子对、或抗衡离子；以及
L"可以是Re或直接键，或可以是至Q、靶向部分、分析物分子、固体载体、固体载体残基、核苷或具有结构(I)的另一种化合物的键。
靶向部分可以是抗体或细胞表面受体拮抗剂。
关于具有结构(I)的化合物，R2或R3可以具有以下结构之一：
[化学式6]
[化学式7]
关于具有结构(I)的化合物，Q可以包括巯基、二硫化物、活化酯、异硫氰酸酯、叠氮化物、炔、烯烃、二烯、亲二烯体、酰基卤、磺酰卤、膦、α-卤代酰胺、生物素、氨基、或马来酰亚胺官能团。
Q可以包括马来酰亚胺官能团。
关于具有结构(I)的化合物，Q可以包括选自以下表1(表1-1至1-3)的结构的部分。
[表1-1]
表1代表性Q部分
[表1-2]
[表1-3]
关于具有结构(I)的化合物，m在每次出现时可以独立地是1至10的整数，并且特别是1至5的整数。
关于具有结构(I)的化合物，n可以是1至10的整数。
关于具有结构(I)的化合物，M可以在每次出现时独立地是芘、二萘嵌苯、二萘嵌苯单酰亚胺、或6-FAM、或其衍生物。
关于具有结构(I)的化合物，M可以在每次出现时独立地具有以下结构之一：
[化学式8]
具有结构(I)的化合物例如可以是选自国际公开号2017/177065的表2中描述的化合物的任何化合物。
生物粒子结合部133可以是结合到生物粒子P的表面上的抗原的抗原结合物质，或结合到形成生物粒子P的表面膜的分子的分子结合物质。生物粒子结合部133的配置可以由本领域技术人员根据生物粒子P的类型适当地选择或设计。
抗原结合物质可以含有选自抗体、抗体片段、适配体和分子印迹聚合物的物质。抗体或抗体片段例如可以是与存在于生物粒子(如细胞)的表面上的组分(特别是表面抗原)结合的抗体或抗体片段。适配体可以是核酸适配体或肽适配体。适配体和分子印迹聚合物还可以结合例如存在于生物粒子如细胞表面上的组分(特别是表面抗原)。
分子结合物质是例如具有油烯基或胆固醇基的化合物。这些基团可以非特异性地结合到形成生物粒子P的表面膜的分子(例如，细胞)。油烯基和胆固醇基可以结合到例如包括脂双层膜的生物粒子(如细胞)。这些化合物的示例如以上参考图3B在项目(3-1-1)表面准备步骤中所。
捕获物质结合步骤S113可以包括用于结合生物粒子和第一捕获物质的培育步骤(incubation step)。可以根据生物粒子和待使用的第一捕获物质的类型来确定诸如培育时间和温度的培育条件。
在执行捕获物质结合步骤S113之后，可执行断裂步骤，该断裂步骤移除诸如未结合到粒子捕获物质120的第一捕获物质等不必要物质。断裂步骤可包括用液体(例如，缓冲液)洗涤表面110。
在图1B的流程图中，捕获物质结合步骤S113被描述为在表面捕获步骤S112之后和断裂步骤S114之前执行，但是执行捕获物质结合步骤S113的时刻不限于此。
可以在表面捕获步骤S112之前执行捕获物质结合步骤S114，或者可以在执行表面捕获步骤S112的同时执行捕获物质结合步骤S114。
例如，将含有生物粒子的样品与第一捕获物质混合，并且将第一捕获物质结合到包含在样品中的生物粒子上。然后，可以使用在表面捕获步骤S112中已经进行了结合的包含生物粒子的样品在表面110上捕获第一捕获物质已经预先结合到其上的生物粒子。
可替代地，将含有生物粒子的样品和第一捕获物质施加到表面110上，并且当包含在样品中的生物粒子被捕获在表面110上时，可以将第一捕获物质结合到每个生物粒子上。
可替代地，将含有生物粒子的样品施加到表面110上，并且将包含在样品中的生物粒子捕获在表面110上。然后，在完成捕获之后，将第一捕获物质施加到表面110，并且可以将第一物质结合到每个生物粒子。
(变形例1：分泌物质结合部包含多个分泌物质结合部的实施方式)
分泌物质结合部可以包含一种如参考图4所述的分泌物质结合物质，或者可以包含多种相同或不同的分泌物质结合物质。将参考图17描述在分泌物质结合部包含多个相同或不同的分泌物质结合物质的情况下的第一捕获物质。
图17是示出第一捕获物质结合到生物粒子(细胞)P的状态的示例的示意图。图17中示出的第一捕获物质330包括分泌物质结合部331、交联部332和生物粒子结合部333。
分泌物质结合部331包含四种分泌物质结合物质(抗体)331-1、331-2、331-3和331-4。这四种抗体可以彼此相同或不同。例如，这四种抗体可以被配置为捕获相同的分泌物质(例如细胞因子)，或可以被配置为捕获不同的分泌物质。如上所述，包含在分泌物质结合部中的多个分泌物质结合物质可以彼此相同或不同。例如，多个分泌物质结合物质可以是结合不同抗原的抗体。此外，多个分泌物质结合物质不一定是抗体，并且例如可以是抗体片段、适配体和分子印迹聚合物中的任一种。此外，包含在分泌物质结合部中的多个分泌物质结合物质可以具有相同的分泌物质结合特性或不同的分泌物质结合特性。
交联部332结合到多个分泌物质结合物质333-1至333-4，并且还结合到生物粒子结合部333。具有这样多个结合位点的交联部332可以是具有作为交联部132的示例的上述结构(I)的化合物，但不限于此。交联部132可以选自本领域中已知的具有多个结合位点的化合物，如具有结构(I)的化合物。
生物粒子结合部333在图17中作为抗体示出，但可以是抗原结合物质或抗体以外的分子结合物质，如对于生物粒子结合部133所描述的。
此外，多个分泌物质结合物质不一定结合到如图17所示的一种线性化合物，并且可以结合到结合到交联部332的物质。图18中示出该示例。在图18中所示的第一捕获物质335中，粒子状物质336结合到交联部332的一端，并且多个分泌物质结合物质331-1至331-4结合到粒子状物质336。
(变形例2：生物粒子结合部是多特异性抗体的实施方式)
生物粒子结合部可以是与生物粒子P的表面上的抗原结合的抗原结合物质。此外，抗原结合物质可以是多特异性抗体，特别是双特异性抗体或三特异性抗体。将参考图19描述该变形例。
图19是示出第一捕获物质结合到生物粒子(细胞)P的状态的示例的示意图。图19中示出的第一捕获物质430包括分泌物质结合部431、交联部432和生物粒子结合部433。
分泌物质结合部431包含一种分泌物质结合物质(抗体)。注意，分泌物质结合物质不一定是抗体，并且例如可以是抗体片段、适配体和分子印迹聚合物中的任一种。
交联部432可以是具有作为交联部132的示例的上述结构(I)的化合物，但不限于此。
如图19所示，生物粒子结合部433可以是双特异性抗体(bi-specific antibody)。双特异性抗体例如可以是结合(特异性地)至细胞P的表面抗原以及结合(特异性地)至除细胞P之外的细胞的抗体。
图20示出通过一个第一捕获物质430捕获两个细胞P1和P2的状态。第一捕获物质430的生物粒子结合部433是双特异性抗体，并且结合到细胞P1的表面抗原(黑色圆圈)和细胞P2的表面抗原(黑色正方形)。细胞P1的表面抗原不同于细胞P2的表面抗原，并且彼此不同的两种抗原被一个生物粒子结合部(抗体)433捕获。
(变形例3：包含结合到两个或更多个生物粒子的抗体的第一捕获物质)
在本公开的变形例中，该第一捕获物质可以包含结合到两个或更多个相同或不同类型的生物粒子(特别是细胞)的表面的一种抗体，并且更具体地可以包含结合到两个或更多个不同类型的生物粒子(特别是细胞)的表面的一种抗体。抗体可以是结合两种或更多种不同抗原的抗体。抗体例如可以是所谓的多特异性抗体，更具体地，双特异性抗体或三特异性抗体。在本变形例中，第一捕获物质可以包含与分泌物质结合部和生物粒子结合部分开的抗体。
在变形例中，例如，两个或更多个细胞，特别是彼此不同的两个或更多个细胞被抗体捕获。即，在第一捕获步骤S102中，第一捕获物质中包含的抗体捕获两个或更多个细胞，并且这些细胞被保持在彼此非常接近的位置。因此，可有意地引起两个或更多个细胞之间的细胞间相互作用。例如，细胞间相互作用例如可以是一种免疫细胞和一种肿瘤细胞之间的相互作用，一种免疫细胞和另一种免疫细胞之间的相互作用，或一种免疫细胞、另一种免疫细胞和一种肿瘤细胞之间的相互作用。即，该抗体可以是捕获两种或更多种相同或不同的免疫细胞的抗体，或捕获一种或多种免疫细胞和一种或多种肿瘤细胞的抗体。当第一捕获物质包含抗体时，可以更有效地分析细胞间相互作用。这在抗体药物或细胞治疗剂的研究和开发中是非常有用的。
将参考图21描述该变形例。如图21所示，第一捕获物质530包括分泌物质结合部531、交联部532和结合到细胞P1的生物粒子结合部533。第一捕获物质530还包括结合到细胞表面的抗体535-1和535-2。抗体535-1结合细胞P2的表面抗原(黑色星形)。抗体535-2结合细胞P3的表面抗原(黑色圆形)。当抗体535-1和535-2分别结合到细胞P2和P3时，细胞P2和P3保持彼此靠近。当细胞P2和P3保持彼此靠近时，在这些细胞之间发生交互。通过相互作用，例如，分泌物质(黑色方形标记)从这些细胞中释放。分泌物质由分泌物质结合部531捕获。以这种方式，可以分析细胞间相互作用。
在这个变形例中，第一捕获物质的分泌物质结合部可以被配置为结合到由细胞间相互作用产生的分泌物质。此外，在该变形例中，稍后描述的第二捕获物质的第二分泌物质结合部还可以被配置为在与分泌物质结合部已经结合的位点不同的位点处与分泌物质结合。
(变形例4：两个或更多个生物粒子的交联)
在本公开的又另一个变形例中，两个或更多个生物粒子可以在该第一捕获步骤中交联。通过交联，例如，保持两个或更多个细胞彼此靠近存在的状态，并且这可以引起细胞间相互作用。
在该变形例中，可以使用类似于第一捕获物质的交联物质以进行交联。将参照图22描述交联物质。图22中所示的交联物质670包括两个生物粒子结合部672和673以及交联部671。生物粒子结合部672和673可以类似于上述其他生物粒子结合部。交联部671可以类似于上述交联部。生物粒子结合部672和673分别结合到细胞P2和P3的表面抗原。因此，通过交联物质670保持细胞P1和P2彼此接近存在的状态。结果，细胞P1和P2之间发生交互。例如，根据本公开的第一捕获物质630-1和630-2捕获通过相互作用产生的分泌物质。
因为生物粒子结合部672和673是以特定的结合方式结合到生物粒子的物质，例如抗体，所以可以交联多个特定的生物粒子(细胞)。因此，可以分析特定细胞之间的相互作用。
交联物质可以以非特异性方式结合。例如，图23中所示的交联物质770包括两个生物粒子结合部772和773以及交联部771。生物粒子结合部772是以非特异性方式与各种细胞结合的物质，并且是例如具有上述油烯基或胆固醇基的化合物。生物粒子结合部773是以特定方式结合到细胞的抗体。交联部771可以类似于上述交联部。通过交联物质770，特定的细胞与各种细胞交联。这使得可以分析特定小区与各种小区之间的相互作用。
(3-1-4)断裂步骤
在断裂步骤S114中，断裂连接部126，并且从表面110释放在表面捕获步骤S112中捕获的生物粒子。优选地，在断裂步骤S114中，保持由粒子捕获部121捕获的生物粒子P的捕获状态。可保持所捕获的状态，直至生物粒子在稍后描述的环境转换步骤S104中的环境转换完成，或者可保持所捕获的状态，例如，直至生物粒子在稍后描述的破坏步骤S105中的中断完成。
断裂可以在表面110的整个区域上进行，或者可以在表面110的部分区域上进行。在后一种情况下，可基于例如下文描述的检测步骤的检测结果来选择部分区域。
此外，可以执行断裂以便将在表面110上捕获的整个生物粒子从表面110释放，或者可以执行该断裂以便将在表面110上捕获的生物粒子的一部分从表面110释放。在后一种情况下，可以基于例如下文描述的检测步骤的检测结果来选择生物粒子的零件。
例如，可以基于生物粒子P的标记、粒子捕获物质120的标记、或第一捕获物质130的标记来选择要从表面110释放的生物粒子。
生物粒子P的标记物例如可以是构成荧光染料标记的抗体的荧光染料，或存在于生物粒子内部的标记物(特别地，荧光染料)。
粒子捕获物质120的标记例如是荧光染料。粒子捕获物质120中包含的核酸的一部分可以是用荧光染料标记的核酸。可替代地，包含在粒子捕获物质120中的抗体可以用荧光染料标记。
例如，第一捕获物质130的标记也是荧光染料。包含在第一捕获物质130中的核酸的一部分可以是用荧光染料标记的核酸。可替换地，包含在第一捕获物质130中的抗体可以用荧光染料标记。
将参考图5描述在断裂步骤S114中获得的生物粒子群体中包括的生物粒子。图5是生物粒子的示意图。
如图5的左侧所示，用于捕获分泌物质的多个第一捕获物质130、130-2和130-3和多个粒子捕获物质120与生物粒子P结合。在生物粒子群体中包括的生物粒子中，可以对于每个粒子结合不同的粒子标识物。粒子标识物124结合在图5左侧所示的生物粒子上，但是不同于粒子标识物124的粒子标识物124-2结合在图5右侧所示的生物粒子上。例如，粒子标识物中的差异可以是构成粒子标识物的碱基序列中的差异。如上所述，在准备步骤中获得的生物粒子群体中包括的生物粒子可以具有不同的粒子标识物。此外，与一个生物粒子结合的多个粒子标识物可以是相同的。这种生物粒子群体适用于在后面描述的分析步骤中进行单细胞分析。
在本公开的一个实施方式中，断裂步骤S114可包括检测从生物粒子产生的光或来自结合到生物粒子的物质的光的检测步骤，以及基于检测步骤中的检测结果断裂连接部以从表面111释放生物粒子的连接部断裂步骤。因此，例如，可以根据检测结果来选择要从表面110释放的生物粒子。结果，可以在后面描述的分析步骤中从目标中排除不期望的生物粒子，并且可以提高分析效率。
在本公开的另一个实施方式中，在断裂步骤S114中，可以在不执行检测步骤的情况下执行连接部断裂步骤。通过省略检测步骤，可以减少本公开的分析方法中的步骤的数量。
在下文中，将描述检测步骤和连接部断裂步骤。
(3-1-4-1)检测步骤
断裂步骤S114可包括检测源自生物粒子的任何一种或两种或更多种光(例如，散射光和/或固有荧光)的检测步骤；源自靶捕获分子的光(例如，荧光)；源自与生物粒子结合的抗体的光(例如，荧光)；生物粒子的形态(例如，形态(特征为在明场、相衬或暗场中获取的图像并且特征为在明场、相衬或暗场中的图像处理的形态，具体地，通过形态处理获取的形态))或两个或更多个生物粒子(诸如细胞)彼此结合的状态)；以及从该生物粒子的形态信息(例如，细胞类型或细胞状态(活细胞或死细胞))预测的该生物粒子的特征。这些光、形态、特征等可通过例如包括物镜的观察装置(特别是显微镜装置)来检测。这些光、形态和特征可例如通过成像元件或光电探测器来检测。基于检测步骤中的光、形态、特征等的检测结果，可以选择将在后面描述的连接部断裂步骤中断裂的靶捕获分子，或者可以选择在断裂步骤S114中从表面110释放的生物粒子。例如，成像元件获取表面110的图像或在表面110上捕获的生物粒子的图像，并且可以基于所获取的图像选择要释放的生物粒子。
(3-1-4-2)连接部断裂步骤
断裂步骤S114包括断裂连接部126的连接部断裂步骤。通过连接部126的断裂，第一捕获物质和粒子捕获物质结合到其上的生物粒子从表面110释放。当粒子捕获物质120的连接部I断裂时，例如，如图2A的c所示，粒子捕获物质120从表面110释放，并且随着该释放，生物粒子也从表面110释放。
在断裂步骤S114中，可以通过例如刺激(如化学刺激或光刺激)断裂连接部。光刺激特别适合于选择性地刺激特定的窄范围。
断裂步骤S114中的刺激可以由刺激施用装置执行。刺激施加装置的驱动例如可以由通用计算机等信息处理装置来控制。例如，信息处理装置可以驱动刺激施加装置，以使刺激施加装置选择性地向要释放的生物粒子的位置施加刺激。以下，对可以采用的刺激施加装置的示例进行说明。
为了选择性地将光刺激施加到细胞的位置，可以使用光照射装置作为刺激施加装置。例如，光照射装置可以是数字微镜装置(DMD)或液晶显示装置。表面110上的选定位置可由构成DMD的微镜用光照射。例如，液晶显示装置可以是反射型液晶显示器，并且其具体示例包括SXRD(索尼公司)。通过控制液晶显示装置的液晶，可用光照射表面110的选定位置。
此外，液晶快门或空间光调制器可以用于选择性地将光刺激施加到该细胞的位置。这些装置还可向选定位置施加光刺激。
本领域技术人员可根据粒子捕获物质中包含的连接部的类型来适当地选择照射光的波长。
可以通过使断裂连接部126的试剂与表面110接触来施加化学刺激。如上所述，可根据连接部126的类型来确定试剂。
例如，在连接部126包含二硫键的情况下，试剂可以是能够断裂键的还原剂。试剂例如可以是三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、或2-巯基乙醇。例如，在使用TCEP的情况下，例如使用50mM的TCEP进行反应约15分钟。
例如，在连接部126是包含限制性内切核酸酶识别序列的核酸的情况下，试剂可以是对应于每个限制性内切核酸酶识别序列的限制性内切核酸酶。1U的限制性内切核酸酶活性是在37℃下原则上在50μl的每种酶反应溶液中每小时完全降解1μgλDNA的酶的量。酶的量可以根据限制性内切核酸酶识别序列的量进行调节。
通过断裂步骤S114中的断裂释放的至少一种生物粒子可以回收在例如液体(如缓冲液或介质)中。液体例如可以是亲水液体。通过回收获得的包含生物粒子的液体可用于后面描述的环境转换步骤S104中。为了回收释放的生物粒子，可以使用通过使液体如缓冲液流动而产生的流体力。可替代地，生物粒子可以通过振动漂浮在液体中，或生物粒子可以通过使用重力等漂浮在液体中。振动例如可以是通过基底100传递的振动或通过包含生物粒子的液体传递的振动。此外，可以移动基底110，使得表面110面向重力的方向，以便通过重力将生物粒子漂浮在液体中。
(3-2)第一捕获步骤
第一捕获步骤S102包括执行使在准备步骤S101中准备的生物粒子群体放置在预定条件下的处理的处理步骤。可以在保持该生物粒子群体的群体状态时进行该处理步骤。通过使该生物粒子群体置于预定条件下产生的分泌物质和结合到该生物粒子群体中包括的每个生物粒子上的第一捕获物质被结合。在保持第一捕获物质结合到生物粒子的状态的同时，可执行第一捕获步骤S102。
预定条件可以是在其中分析生物粒子群体的反应性的条件，并且可以由执行本公开的生物粒子分析方法的用户适当地选择。例如，预定条件可以是产生分泌物质的条件，或分析是否产生分泌物质的条件。产生的分泌物质被第一捕获物质捕获。
更具体地，预定条件是生物粒子群体(具体地，细胞群体)的培育环境，并且例如是培养基或缓冲液中的环境。在第一捕获步骤S102中，通过将生物粒子群体放置在环境下产生的分泌物质被第一捕获物质捕获。
培育环境可以包含例如生物材料或非生物材料。在本公开中，可以分析生物粒子群体在其中存在材料的环境下的反应性。该材料例如可以是病变组织、病变细胞、微生物(细菌、真菌、或病毒)、引起疾病或增加疾病风险的物质(例如，致癌物、淀粉样蛋白β、朊病毒等)、药物、毒性物质、或异源组织。非生物材料例如可以是药物或毒性物质。病变组织例如可以是肿瘤组织，并且具体地，可以是癌组织或肉瘤组织。病变细胞例如可以是肿瘤细胞，并且具体地，可以是癌细胞、肉瘤细胞、或恶性淋巴瘤细胞。
分泌物质可以是从包括在生物粒子群体中的生物粒子分泌的分泌物质，或者可以是从用于构成预定条件的材料分泌的分泌物质。分泌物质例如可以是由病变组织、病变细胞、微生物或异源组织分泌的分泌物质。
该生物粒子可以是如上所述的细胞，并且从该生物粒子分泌的分泌物质可以是从细胞分泌的分泌物质。例如，分泌物质可以是由免疫细胞分泌的物质，并且例如可以是选自细胞因子、激素、抗体和外来体的任何一种或多种，但不限于此。分泌物质可以是由神经细胞、肌肉细胞、皮肤细胞或腺细胞分泌的物质。分泌物质可以是外来体。
从该材料的观点来看，该分泌物质例如可以是一种蛋白质、一种肽、一种外来体、或其他生物分子。从细胞类型的观点，分泌物质例如可以是外泌体、细胞因子、激素或神经递质。
此外，通过将生物粒子群体置于预定条件下产生的分泌物质不限于从包括在生物粒子群体中的细胞分泌的物质。例如，分泌物质可以是从构成预定条件的材料分泌的分泌物质。该材料可以是包含在上述培育环境中的材料。该材料可以是生物组织、细胞(特别是病变细胞)、微生物、或异源组织，特别是病变组织，更特别是肿瘤组织或神经退行性组织。该细胞是例如病变细胞，特别是肿瘤细胞。
将参考图2B描述第一捕获步骤S102的具体示例。
为了执行第一捕获步骤S102，例如，准备培育环境作为预定条件。培育环境可以是如图2B的d中所示的容器140中的环境。容器140是例如皮氏培养皿(petri dish)、孔板(well plate)、管等，但不限于此。例如，容器140包含诸如培养基或缓冲液的培育培养基。容器140进一步含有病变细胞群体(肿瘤细胞)145作为构成培育环境的材料。病变细胞群体145可以包括一种类型或者两种或更多种类型的细胞。在图2B的d中，病变细胞群体145包括两种类型的细胞(细胞145a和145b)。
如图2B的d所示，将在准备步骤中准备的生物粒子群体置于容器140中。然后，将生物粒子群体在容器中培育。本领域技术人员可以适当地选择培育的时间和/或温度，从而产生分泌物质。
通过培育在容器140中产生分泌物质。如上所述，分泌物质可以是从包括在生物粒子群体中的生物粒子产生的物质，从构成培育环境的材料(图2B中的患病细胞群体)产生的物质，或这两种物质。
图2B的e显示已产生分泌物质160、161和162。如图中所示，这些产生的分泌物质被第一捕获物质130捕获。在图2B的e中，产生彼此不同的多种类型的分泌物质，但也可产生一种类型的分泌物质。
(3-3)第二捕获步骤
在第二捕获步骤S103中，与第一捕获物质结合的分泌物质与用于捕获分泌物质的第二捕获物质结合。因此，形成第一捕获物质、分泌物质和第二捕获物质的组合物。第二捕获物质优选地被配置为结合到与第一捕获物质结合的部位不同的部位。第二捕获步骤S103可以在保持第一捕获物质结合到生物粒子的状态的同时执行。
在本公开的优选实施方式中，在保持第一捕获物质结合到生物粒子的状态的同时，执行第一捕获步骤S102和第二捕获步骤S103两者。结果，在生物粒子上形成后面描述的夹心结构。形成这种结构可用于，例如，分析包括在生物粒子群体中的生物粒子之间的相互作用。
第二捕获步骤S103可以在已经执行了第一捕获步骤S102的孵化环境中执行，或者可以在不同于孵化环境的环境中执行。从复合物形成的效率的观点来看，优选地在第二捕获步骤S103的另一环境中执行第二捕获步骤S103。例如，在完成第一捕获步骤S102之后，从培育环境中回收包括具有已结合分泌物质的第一捕获物质的生物粒子的生物粒子群体。然后，将回收的生物粒子群体转移至用于执行第二捕获步骤S103的培育环境(在下文中，也称为“第二培育环境”)。第二培育环境可以是允许稍后描述的第二分泌物质结合部与分泌物质之间结合的环境，并且可以是容器中的环境。容器是例如皮氏培养皿、孔板、管等，但不限于此。容器可含有例如培育培养基(如培养基或缓冲液)。
将参考图6描述第二捕获物质的配置示例。如图6所示，第二捕获物质170包括第二分泌物质结合部171、第二回收物质扩增部172、捕获物质标识物173和多聚A序列174。如稍后描述的，第二捕获物质是例如核酸和蛋白质的复合物，并且可以由本领域技术人员适当地产生。
第二分泌物质结合部171可以由本领域技术人员根据要结合到第二分泌物质结合部171的分泌物质而适当地设计或产生。例如，第二分泌物质结合部171例如可以是选自由抗体、抗体片段、适配体和分子印迹聚合物组成的组的物质，并且特别是抗体或抗体片段。注意，在图6中，抗体被示出为第二分泌物质结合部171。第二分泌物质结合部171的结合可以是特异性的或非特异性的，并且特别是特异性的。
第二分泌物质结合部171被配置用于与第一捕获物质130结合的分泌物质结合，并且特别被配置用于与第一捕获物质130结合的分泌物质中的第一捕获物质130结合的部分不同的部分结合。
在第二捕获步骤S103中，形成第二捕获物质170结合到与第一捕获物质130结合的分泌物质的状态。两种不同的抗体结合到一种物质的状态也被称为例如夹心结构。在第二捕获步骤S103中，可以形成这样的夹心结构。更具体地，可以形成其中包括在第一捕获物质130中的分泌物质结合部131(例如，抗体)和包括在第二捕获物质170中的第二分泌物质结合部171(例如，抗体)结合到一个分泌物质的结构。注意，一种类型的第二分泌物质结合部可以与一种分泌物质结合，或者两种或更多种类型的第二分泌物质可以与一种分泌物质结合。
第二回收物质扩增部172例如包含用于核酸扩增的引物和/或用于核酸转录的启动子。特别地，第二回收物质扩增部172可含有具有用于扩增核酸的引物序列的核酸，或用于在稍后描述的分析步骤中转录核酸的启动子序列。该核酸可以是DNA或RNA，并且特别是DNA。第二回收物质扩增部172可具有引物序列和启动子序列两者。引物序列例如可以是PCR手柄。启动子序列例如可以是T7启动子序列。
捕获物质标识物173用于标识或指定包括捕获物质标识物的第二捕获物质或第二分泌物质结合部。捕获物质标识物173包含例如具有条形码序列的核酸。该核酸可以具体地是DNA或RNA，并且更具体地是DNA。条形码序列可以用于例如指定结合到分泌物质的第二捕获物质或第二分泌物质结合部。对于指定，条形码序列可以与包括条形码序列的第二捕获物质或第二分泌物质结合部相关联。因此，条形码序列可以与第二捕获物质或第二分泌物质结合部相关联。例如，条形码序列的序列信息可以与第二捕获物质或第二分泌物质结合部的类型相关联。条形码序列可以与第二捕获物质或第二分泌物质结合部相关联，例如，在一对一的基础上。
如上所述，用于标识第二捕获物质的捕获物质标识物可结合到第二捕获物质173。因此，可以指定在后面描述的分析步骤中结合到生物粒子的捕获物质。
当在后面描述的分析步骤中读取条形码序列时，多聚A序列174可以稳定条形码序列的扩增产物。
将参考图2C描述第二捕获步骤S103的具体示例。
为了执行第二捕获步骤S103，准备由第一捕获步骤S102中的第一捕获物质130捕获的分泌物质和第二捕获物质170结合的培育环境。培育环境可以是如图2C的f所示的容器150中的环境。容器150例如是皮氏培养皿、孔板、管等，但不限于此。容器150包含例如培育介质，诸如介质或缓冲液。
如图2C的f所示，将包括在第一捕获步骤S102中对分泌物质执行捕获处理后的生物粒子P和第二捕获物质170的生物粒子群置于容器150中。然后，将生物粒子群体在容器中培育。本领域技术人员可以适当地选择培育的时间和/或温度，从而产生分泌物质。通过培育，分泌物质160被第二捕获物质170捕获。结果，形成分泌物质160被第一捕获物质130和第二捕获物质170捕获的状态。
(变形例5：与生物粒子的表面分子结合的物质的使用)
在本公开的变形例中，在第二捕获步骤中，除了由第二捕获物质捕获分泌物质之外，可以执行将表面分子结合物质结合到生物粒子的表面分子的结合步骤。表面分子结合物质例如可以是抗体、抗体片段、适配体或分子印迹聚合物。例如，荧光标记或鉴定物质可以结合到表面分子结合物质。在将表面分子结合物质添加至培育介质的状态下进行培育。因此，除了第二捕获物质与分泌物质的结合之外，表面分子结合物质与生物粒子的表面分子(特别是表面抗原)结合。
荧光标记可以用于例如确定在后面描述的分离步骤中是否以微步分离生物粒子。通过在后面描述的破坏步骤中破坏生物粒子，从生物粒子的表面释放标识物质，然后结合到例如物质回收部如多聚T序列以形成组合物。该组合物用于指定在随后描述的分析步骤中结合到生物粒子表面的表面分子结合物质。
将参考图24描述该变形例。除了第一捕获物质130、分泌物质160和第二捕获物质170之外，将用荧光标记181标记的结合物质180和结合有标识物质191的结合物质190结合到图24所示的生物粒子P。在使用表面分子结合物质的情况下，在第二捕获步骤中形成如本图所示的状态。
作为用荧光标记181标记的结合物质(例如，抗体)180，可以采用本领域已知的那些。以下将参考图25描述与标识物质191结合的结合物质(例如，抗体)190。
如图25所示，结合到结合物质190的标识物质191包括第三回收物质扩增部192、结合物质标识物193和多聚A序列194。
上述第二回收物质扩增部172的描述适用于第三回收物质扩增部192。
结合物质标识物193用于标识或指定结合物质190。结合物质标识物193包含例如具有条形码序列的核酸。该核酸可以具体地是DNA或RNA，并且更具体地是DNA。条形码序列可以例如用于指定结合物质190。为了指定结合物质190，条形码序列可以与结合物质190相关联。例如，条形码序列的序列信息可以与结合物质190的类型相关联。条形码序列可以与结合物质190例如在一对一的基础上相关联。
当在后面描述的分析步骤中读取条形码序列时，多聚A序列194可以使条形码序列的扩增产物稳定。
(3-4)分离步骤
在分离步骤S104中，将包括在生物粒子群体中的生物粒子分离成单个粒子。在本说明书中，术语“分离(isolate)”可以指，在执行随后描述的破坏步骤的情况下，包含在一个生物粒子中的组分和结合到一个生物粒子的物质(例如，第一捕获物质、第二捕获物质、粒子标识物等)不进入与包含在另一个生物粒子中的组分和结合到另一个生物粒子的物质混合的状态。例如，术语“分离(isolate)”可以意指如下文所述在微空间中分离。
根据本公开的一个实施方式，在分离步骤S104中，包括在生物粒子群体中的每个生物粒子以一个微空间被分离。微空间可以是乳液粒子中的空间或孔中的空间。如上所述，通过在微空间中执行稍后描述的破坏步骤，包含在一个生物粒子中的组分、以及结合到一个生物粒子的第一捕获物质、第二捕获物质和粒子标识物不与包含在另一生物粒子中的组分和结合到另一粒子的物质混合。
此外，通过执行分离步骤S104，可以一对一地关联一个生物粒子和结合到该一个生物粒子的物质(例如，第一捕获物质、第二捕获物质、粒子标识物等)。
在本公开的一个实施方式中，该分离步骤S104可以包括：一个判别步骤，该判别步骤确定该生物粒子是否在该微空间中被分离；以及一个粒子分离步骤，该粒子分离步骤在该微空间中分离在该判别步骤中被确定为分离的该生物粒子。这使得可以在微空间中仅分离目标生物粒子。因此，例如，可以在后面描述的分析步骤中从目标中排除非预期的生物粒子，并且可以提高分析效率。
例如，可以基于从生物粒子产生的光(例如，散射光和/或固有荧光)或从与生物粒子结合的物质产生的光、或形态图像进行辨别。结合到生物粒子的物质例如可以是靶捕获分子，或可以是结合到生物粒子的抗体(特别地，荧光染料标记的抗体)。从生物粒子产生的散射光例如可以是前向散射光和/或侧向散射光。可以基于通过散射光检测获取的信号的高度和/或面积值来执行双重检测。通过形态图像信息的单细胞确定也是可能的。生物粒子是否是死细胞可以根据散射光和/或形态图像、或用死细胞染色试剂染色后的荧光来确定，由此可以去除死细胞。在本公开中，该判别步骤可以在分离步骤之前立即进行，由此仅可以可靠地分离条码所附接的单细胞。
在本公开的另一个实施方式中，可在不执行判别步骤的情况下执行粒子分离步骤。通过省略判别步骤，可以减少本公开的分析方法中的步骤的数量。
在下文中，将描述判别步骤和粒子分离步骤。
(3-4-1)判别步骤
在判别步骤中，确定包括在生物粒子群体中的每个生物粒子是否以微步分离。如上所述，可基于从生物粒子产生的光或从结合到生物粒子的物质产生的光进行区分。
判别步骤可包括例如用光照射生物粒子的照射步骤和检测由照射产生的光的检测步骤。
照射步骤可通过例如用光照射生物粒子的光照射单元执行。光照射单元可包括例如发射光的光源。此外，光照射单元可包括将光会聚在生物粒子上的物镜。光源可以由本领域技术人员根据分析的目的适当地选择，并且例如可以是激光二极管、SHG激光器、固态激光器、气体激光器、高亮度LED或卤素灯，或者可以是它们中的两个或更多个的组合。除了光源和物镜之外，光照射单元可以根据需要包括其他光学元件。
检测步骤可以通过例如检测从生物粒子或结合到生物粒子的物质产生的光的检测单元来执行。在检测单元中，例如，通过光照射单元的光照射从生物粒子或结合到生物粒子的物质产生的光例如可以是散射光和/或荧光。检测单元可包括例如会聚从生物粒子产生的光的会聚透镜和检测器。作为检测器，可以使用PMT、光电二极管、CCD、CMOS等，但是检测器不限于此。除了聚光透镜和检测器之外，检测单元还可根据需要包括另一光学元件。检测单元可以还包括，例如，分光单元。形成分光单元的光学组件的示例可包括例如光栅、棱镜和滤光器。分光单元可检测例如具有应独立于具有另一波长的光检测的波长的光。检测单元可通过光电转换将检测到的光转换为模拟电信号。检测单元还可以进一步通过AD转换将模拟电信号转换为数字电信号。
该判别步骤可以由确定单元来执行，该确定单元基于在该检测步骤中检测到的光进行关于是否进行该生物粒子的判别的确定处理。确定单元的处理例如可以通过诸如通用计算机等信息处理装置来实现，具体地，通过包括在信息处理装置中的处理单元来实现。
(3-4-2)粒子分离步骤
该分离步骤包括以微空间分离该生物粒子的粒子分离步骤。在本发明中，微空间可以指具有能够容纳作为分析目标的一个生物粒子的尺寸的空间。该尺寸可以根据例如因素如生物粒子的尺寸适当地确定。该微空间还可以具有能够容纳两个或更多个生物粒子作为分析目标的尺寸。这种情况除了一个生物粒子被容纳在一个微空间中的情况之外，还可以包括两个或更多个生物粒子被容纳在其中的情况。容纳两个或更多个生物粒子的微空间中的生物粒子可以在后面描述的破坏步骤中从破坏目标中排除，或者可以在后面描述的分析步骤中从分析目标中排除。
附带地，在稍后描述的破坏步骤中，将在第二捕获步骤中形成的第一捕获物质、分泌物质和第二捕获物质的组合物从生物粒子中释放。此外，在稍后描述的破坏步骤中，例如，可以生成生物粒子中的物质与粒子标识物的复合物(具体地，通过结合生物粒子中的mRNA和粒子标识物的多聚T序列生成的复合物)。在本公开中，这些微空间中的每一个优选地彼此分离，这样使得在一个微空间中产生的组合物(以及任选地络合物)不迁移至另一个微空间中。如此分离的微空间的示例包括乳液粒子中的空间和孔中的空间。即，在本发明的优选实施方式中，所述微空间可以是乳液粒子中的空间或孔中的空间。在下文中，将描述在微空间是这些空间的情况下的粒子分离步骤的示例。
(3-4-2-1)乳液粒子中的空间的情况
可以使用例如微流体通道生产乳液粒子。该装置包括例如形成乳液分散体的第一液体流动通过的通道和形成分散介质的第二液体流动通过的通道。第一液体可以含有生物粒子。该装置还包括其中两种液体接触以形成乳液的区域。
下文中，将参考图7A和图7B描述用于有效形成包含各包括一个生物粒子的乳液粒子的乳液的装置的示例。通过乳液形成装置，一个生物粒子可以以极高的概率分离在一个乳液粒子中，并且可以减少空乳液粒子的数目。此外，通过乳液形成装置，在一个乳液粒子中分离一个生物粒子和一个条形码序列的概率也增加。
图7A是用于在装置中形成乳液粒子的微芯片的示例。在图7A中示出的微芯片250包括生物粒子流过的主通道255和回收通道259，通过回收通道259回收生物粒子当中的回收目标粒子。微芯片250设置有微粒分选部257。在图9中示出微粒分选部257的放大图。如图8的A所示，微粒分选部257包括连接主通道255和回收通道259的连接通道270。在连接通道270上连接有能够向连接通道270供应液体的液体供应通道261。如上所述，微芯片250具有包括主通道255、回收通道259、连接通道270以及液体供应通道261的通道结构。
图7B是示出在图7A中所示的微芯片250中形成乳液粒子和分离所形成的乳液粒子中的生物粒子的示意图。
此外，如图7A所示，微芯片250形成除了微芯片之外还包括光照射单元291、检测单元292和控制单元293的生物粒子分选装置200的一部分。如图9中所示，控制单元293可以包括信号处理单元294、确定单元295和分选控制单元296。生物粒子分选装置200用作上述乳液形成装置。
如图10所示，为了形成包含乳液粒子的乳液，每个乳液粒子包含一个目标生物粒子(与第一捕获物质、分泌物质和第二捕获物质结合的生物粒子P)，例如，在微芯片250中，可以执行以下步骤：流动步骤S201，使包含生物粒子群体的第一液体流动通过主通道255，该生物粒子群体包括目标生物粒子；判别步骤S202，确定流过主通道255的每个生物粒子是否是回收目标粒子；以及回收步骤S203，将回收目标粒子回收到回收通道259中。判别步骤S202对应于(3-4-1)项的判别步骤。回收步骤S203对应于项目(3-4-2)中描述的粒子分离步骤。
下面对各步骤进行说明。
(流动步骤)
在流动步骤S201中，含有生物粒子群体的第一液体流过主通道255。第一液体在主通道255中从连接部262朝向微粒分选部257流动。第一液体可以是包括含有生物粒子的样品液体和鞘液的层流。特别地，第一液体可以是其中样品液体被鞘液包围的层流。下面将描述用于形成层流的通道结构。
注意，鞘液可包含例如生物粒子破坏组分，例如细胞溶解组分。其结果是，将该组分结合到该乳液粒子中，并且可以在稍后描述的破坏步骤中在该乳液粒子中破坏该生物粒子。细胞溶解组分可以是细胞溶解酶，例如蛋白酶K。例如，在含有蛋白酶K的乳液粒子中捕获细胞后，通过将乳液粒子在预定温度(例如，37℃至56℃)下放置1小时或更短，特别是小于1小时来断裂细胞。注意，蛋白酶K甚至在37℃或更低温度下是活性的，但是在使用这种更低温度的情况下，考虑到蛋白酶K的细胞溶解特性劣化的事实，可以进行培育，例如，过夜。此外，鞘液还可以含有表面活性剂(例如，SDS、肌氨酰、吐温20(Tween 20)、曲通X-100(Triton X-100)等)。表面活性剂可增强蛋白酶K的活性。
此外，鞘液不一定含有生物粒子破坏组分。在这种情况下，该生物粒子可以被物理地破坏。作为物理破坏技术，例如，可采用光学处理(例如，光学断裂)或热处理(例如，热断裂)。例如，通过用激光束照射乳液粒子，在粒子中形成等离子体或空化气泡，可以进行光学处理。可通过加热乳液粒子进行热粒子破坏。
微芯片250设置有样本液入口251和鞘液入口253。从这些入口，将含有生物粒子群体的样品液体和不含有生物粒子的鞘液分别引入样品液体通道252和鞘液通道254。
微芯片250具有其中样本液体流经的样本通道252和鞘液流经的鞘液流道254在接合部262接合以变成主通道255的通道结构。样品液和鞘液在接合部262接合以形成例如层流，其中样品液被鞘液包围。图7B中示出形成层流的示意图。如图7B所示，形成层流，使得从样品通道252引入的样品液体由从鞘液通道254引入的鞘液包围。
优选地，在层流中，生物粒子基本上排列成一行。例如，如图7B所示，生物粒子P可在样品液体中基本上排列成一行。如上所述，在本公开中，通道结构形成包括基本上在一条线上流动的生物粒子的层流。
层流通过主通道255流向微粒分选部257。优选地，这些生物粒子在主通道255中以一条线流动。因此，在以下描述的检测区域256中的光照射中，变得容易区分当用光照射一个微粒时产生的光和当用光照射其他微粒时产生的光。
(判别步骤)
在判别步骤S202中，确定流过主通道255的生物粒子是否是回收目标粒子。该判别可以由确定单元295执行。确定单元295可基于通过光照射单元291用光照射生物粒子产生的光执行区分。下面更详细地描述判别步骤S202的示例。
在判别步骤S202中，光照射单元291用光(例如，激发光)照射流过微芯片250中的主通道255(具体地，检测区域256)的生物粒子，并且检测单元292检测由光照射产生的光。根据由检测单元292检测的光的特征，包括在控制单元293中的确定单元295确定生物粒子是否是回收目标粒子。例如，判别单元295可基于散射光进行确定、基于荧光进行确定或基于图像(例如，暗场图像、亮场图像和相衬图像中的一个或多个)进行确定。在稍后描述的回收步骤S203中，控制单元293控制微芯片250中的流动以将回收目标粒子回收至回收通道259中。
光照射单元291用光(例如，激发光)照射在微芯片250中的通道中流动的生物粒子。光照射单元291可包括：光源，发射光；以及物镜，在流过检测区域的微粒上聚集激发光。光源可以由本领域技术人员根据分析的目的适当地选择，并且例如可以是激光二极管、SHG激光器、固态激光器、气体激光器、高亮度LED或卤素灯，或者可以是它们中的两个或更多个的组合。除了光源和物镜之外，光照射单元可以根据需要包括其他光学元件。
(基于荧光信号或/和散射光信号来区分分选目标)
在本公开的一个实施方式中，检测单元292通过光照射单元291的光照射来检测从微粒产生的散射光和/或荧光。检测单元292可包括聚集从生物粒子产生的荧光和/或散射光的聚光透镜，以及检测器。作为检测器，可以使用PMT、光电二极管、CCD、CMOS等，但是检测器不限于此。检测单元292可以根据需要包括除聚光透镜和检测器之外的其他光学元件。检测单元292可以还包括例如分光单元。形成分光单元的光学组件的示例可包括例如光栅、棱镜和滤光器。分光单元可检测例如具有应独立于具有另一波长的光检测的波长的光。检测单元292可以通过光电转换将检测到的光转换成模拟电信号。检测单元292可进一步通过AD转换将模拟电信号转换成数字电信号。
包括在控制单元293中的信号处理单元294可以处理由检测单元292获得的数字电信号的波形，以生成关于用于由确定单元295进行确定的光的特征的信息(数据)。作为关于光的特征的信息，信号处理单元294可以从数字电信号的波形获取例如波形的宽度、波形的高度和波形的面积中的一个、两个或三个。此外，关于光的特征的信息可以包括例如检测到光的时间。尤其在检测散射光和/或荧光的实施方式中，可执行上述信号处理单元294的处理。
包括在控制单元293中的确定单元295基于通过利用光照射在通道中流动的生物粒子而产生的光，确定生物粒子是否是回收目标粒子。
在检测散射光和/或荧光的实施方式中，由控制单元293处理由检测单元292获取的数字电信号的波形，然后，基于关于通过处理生成的光的特征的信息，确定单元295确定生物粒子是否是回收目标粒子。例如，在基于散射光的确定中，可以指定生物粒子的外部形状和/或内部结构的特征，并且可以基于该特征确定生物粒子是否是回收目标粒子。此外，例如，通过预先对生物粒子如细胞进行预处理，可以基于与流式细胞术中使用的特征相似的特征来确定生物粒子是否是回收目标粒子。此外，例如，通过用抗体或染料(尤其是，荧光染料)标记生物粒子如细胞，可以基于生物粒子的表面抗原的特征确定生物粒子是否是回收靶粒子。
(基于明视场像和/或相衬图像的分选目标的判别)
在本公开的另一个实施方式中，检测单元292可获取由光照射单元291的光照射生成的明视场图像和/或相衬图像。在本实施方式中，光照射单元291包括例如卤素灯，并且检测单元292可以包括CCD或CMOS。例如，该生物粒子被卤素灯用光照射，并且该CCD或CMOS可以获取被照射的生物粒子的明场图像和/或相衬图像。
在获取明视场像和/或相衬图像的实施方式中，包括在控制单元293中的确定单元295基于所获取的明视场像和/或相衬图像确定生物粒子是否是回收目标粒子。例如，可以基于该生物粒子(尤其是细胞)的形态、大小、以及颜色中的一种或者两种或更多种的组合来确定该生物粒子是否是该回收目标粒子。
(基于暗场图像的分选目标的判别)
在本公开的又一实施例中，检测单元292可获取通过光照射单元291的光照射生成的暗场图像。在该实施方式中，光照射单元291包括例如激光光源，并且检测单元292可包括CCD或CMOS。例如，通过激光用光照射生物粒子，并且CCD或CMOS可获取照射的微粒的暗场图像(例如，荧光图像)。
在获取暗场图像的实施方式中，包括在控制单元293中的确定单元295基于所获取的暗场图像确定生物粒子是否是回收目标粒子。例如，可以基于该生物粒子(尤其是细胞)的形态、大小、以及颜色中的一种或两种或更多种的组合来确定该生物粒子是否是该回收目标粒子。
在上述“基于荧光信号或/和散射光信号的分选目标的判别”、“基于明场图像的分选目标的判别”和“基于暗场图像的分选目标的判别”中的任一个中，检测单元292例如可以是其中集成CMOS传感器的基板和其中集成数字信号处理器(DSP)的基板层压的成像元件。通过允许成像元件的DSP作为机器学习单元操作，成像元件可作为所谓的AI传感器操作。包含成像元件的检测单元292可例如基于学习模型确定生物粒子是否是回收目标粒子。此外，可以在执行根据本公开的方法的同时实时更新学习模型。例如，DSP可在CMOS传感器中的像素阵列单元的重置、像素阵列单元的曝光、或来自像素阵列单元的每个单位像素的像素信号的读出期间执行机器学习处理。作为作为AI传感器进行动作的摄像元件的例子，例如可以举出国际公开号2018/051809所公开的摄像元件。在AI传感器被用作成像元件的情况下，从图像阵列获取的原始数据被原样学习，使得分选区分处理的速度快。
例如，可通过关于光的特征的信息是否满足预先指定的标准来执行区分。该标准可以是指示生物粒子是回收目标粒子的标准。该标准可以由本领域的技术人员适当地设置，并且可以是关于光的特征的标准，例如，在流式细胞术等的技术领域中使用的标准。
检测区域256中的一个位置可以用一个光照射，或者检测区域256中的多个位置中的每个位置可以用光照射。例如，微芯片250可形成为使得检测区域256中的两个不同位置中的每个被光照射(即，检测区域256中存在被光照射的两个位置)。在这种情况下，例如，可以基于通过用光照射生物粒子在一个位置产生的光(例如，荧光和/或散射光)确定生物粒子是否是回收目标粒子。此外，基于在一个位置处通过光照射产生的光的检测时间与在另一个位置处通过光照射产生的光的检测时间之间的差，还可以计算生物粒子在通道中的速度。为了计算，可以预先确定两个照射位置之间的距离，并且可以基于两个检测时间和距离之间的差来确定生物粒子的速度。此外，可以基于速度来精确地预测到达下面描述的微粒分选部257的到达时间。通过精确地预测到达时间，可以优化形成进入回收通道259的流的时序。此外，在某个生物粒子到达微粒分选部257的时间与在该某个生物粒子之前或之后的生物粒子到达微粒分选部257的时间之差等于或小于预定阈值的情况下，还可以确定不回收该某个生物粒子。在特定生物粒子与在之前或之后的生物粒子之间的距离窄的情况下，当抽吸特定生物粒子时，之前或之后的微粒一起回收的可能性高。在生物粒子在之前或之后一起回收的可能性高的情况下，通过确定不回收特定生物粒子，可以防止生物粒子在之前或之后的回收。结果，可以提高回收的生物粒子中的目标生物粒子的纯度。例如，日本专利申请公开号2014-202573中描述了其中检测区域256中的两个不同位置中的每个被光照射的微芯片和包括微芯片的装置的具体示例。
注意，控制单元293可以控制光照射单元291的光照射和/或检测单元292的光检测。此外，控制单元293可控制用于将流体供应至微芯片250中的泵的驱动。控制单元293可以包括例如硬盘、CPU和存储器，在硬盘中存储用于使设备执行分离步骤的程序和OS。例如，控制单元293的功能可以在通用计算机中实现。程序可以记录在记录介质中，例如，微型SD存储卡、SD存储卡或闪存。设置在生物粒子分选装置200中的驱动器(未示出)读取记录在记录介质中的程序。然后，控制单元293可以根据读取的程序使生物粒子分选装置200执行分离步骤。
(回收步骤)
在回收步骤S203中，将在判别步骤S202中被确定为回收目标粒子的生物粒子回收到回收通道259中。在回收步骤S203中，在回收通道中将处于包含于第一液体中的状态的回收目标粒子回收在与第一液体不混溶的第二液体中。因此，可以在回收通道259中形成含有作为分散介质的第二液体和作为分散体的第一液体的乳液，并且在乳液的每个乳液粒子中包含一种回收目标粒子。因此，靶生物粒子在乳液粒子的空间中被分离。
例如，如图7B所示，处于包含在以白色表示的第一液体中的状态的回收目标粒子P回收在以灰色表示的第二液体中。结果，形成乳液粒子290，并且一个回收目标粒子P被分离在一个乳液粒子290的空间中。
在下文中，将更详细地描述回收步骤。
在微芯片250中的微粒分选部257中执行回收步骤S203。在粒子分选部257中，流过主通道255的层流分别流到两个废料通道258。图7A中示出的微粒分选部257具有两个废料通道258，但是分支通道的数量不限于两个。微粒分选部257可设置有例如一个或多个(例如，两个、三个或四个)分支通道。分支通道可以被配置为在如图7A中的一个平面上以Y形状分支，或者可以被配置为三维地分支。
在微粒分选部257中，仅在回收目标微粒流动的情况下，形成从主通道255通过连接通道270进入回收通道259的流动，并且回收目标微粒被回收到回收通道159中。图8示出微粒分选部257的放大图。如图8的A所示，主通道255和回收通道259经由与主通道255同轴的连接通道270彼此通信。如图8的B所示，回收目标粒子通过连接通道270流入回收通道259。如图8的C所示，不是回收目标粒子的微粒流入废料通道258中。
图11A和图11B是连接通道270附近的放大图。图11A是连接通道270附近的示意性透视图。图11B是在穿过液体供应通道261的中心线和连接通道270的中心线的平面上的示意性截面图。连接通道270包括检测区域256侧的通道270a(以下也称为上游侧连接通道270a)、回收通道159侧的通道270b(以下也称为下游侧连接通道270b)、以及连接通道270与液体供应通道261之间的连接270c。液体供应通道261设置成与连接通道270的通道的轴线大致垂直。在图11A和图11B中，两个液体供应通道261被设置成在连接通道270的大致中心位置处彼此面对，但是可仅设置一个液体供应通道。
上游侧连接通道270a的截面的形状和尺寸可以与下游侧连接通道270b的形状和尺寸相同。例如，如图11A和图11B所示，上游侧连接通道220a的截面和下游侧连接通道220b的截面均可为具有相同尺寸的大致圆形。可替代地，两个截面可以是具有相同尺寸的矩形(例如，正方形或矩形)。
如图11B中的箭头所示，第二液体从两个液体供应通道261供应至连接通道270。该第二液体从连接件270c流动到上游侧连接通道270a和下游侧连接通道270b两者。
在不执行回收工序的情况下，第二液体如下流动。
流到上游侧连接通道270a的第二液体从连接表面流出到连接通道270的主通道255，然后分别流到两个废料通道258。因为第二液体以这种方式从连接面排出，所以可以防止不需要被回收到回收通道259中的第一液体和微粒通过连接通道270进入回收通道259。
流至下游侧连接通道270b的第二液体流入回收通道259。因此，回收通道259填充有第二液体，并且第二液体用作例如用于形成乳液的分散介质。
另外，在进行回收步骤的情况下，也可以从两个液体供应通道261向连接通道270供应第二液体。然而，由于回收通道259中的压力波动，特别地，通过在回收通道259中产生负压，形成从主通道255通过连接通道270到回收通道259的流动。即，形成从主通道255依次通过上游侧连接通道270a、连接270c、以及下游侧连接通道270b至回收通道259的流动。因此，在回收通道259中，处于封装在第一液体中的状态的回收目标粒子回收在第二液体中。通过执行回收步骤，例如，可以在回收通道259中或在连接至回收通道端部263(例如经由通道)的容器中形成乳液。
上游侧连接通道220a的截面的形状和/或尺寸可不同于下游侧连接通道220b的形状和/或尺寸。图12A和图12B中示出两个通道的尺寸彼此不同的示例。如图12A和图12B所示，连接通道280包括检测区域256侧上的通道280a(在下文中，也称为上游侧连接通道280a)、回收通道259侧上的通道280b(在下文中，也称为下游侧连接通道280b)以及连接通道280和液体供应通道261之间的连接280c。上游侧连接通道280a的截面和下游侧连接通道280b的截面都具有基本上圆形的形状，但是后者的截面的直径大于前者的截面的直径。通过使后者的截面的直径大于前者的截面的直径，与两者的直径相同的情况相比，可以更有效地防止在通过上述负压的微粒分选操作之后立即通过连接通道280将已分选到回收通道259中的回收目标粒子排放到主通道255。
例如，在上游侧连接通道280a的截面和下游侧连接通道280b的截面都是矩形的情况下，通过使后者的截面的面积大于前者的截面的面积，可以更有效地防止已经回收的微粒通过连接通道280排出至主通道255，如上所述。
在回收步骤S203中，由于回收通道259中的压力波动，通过连接通道将回收目标粒子回收到回收通道中。例如，可以通过如上所述在回收通道259中产生负压来执行回收。例如，当限定回收通道259的壁由附接至微芯片250的外部的致动器297(尤其是压电致动器)变形时，可产生负压。负压可形成进入回收通道259的流。为了产生负压，致动器297可附接至微芯片250的外部，例如，使得回收通道259的壁可以变形。由于壁的变形，回收通道259的内部空间改变，并且可产生负压。致动器297例如可以是压电致动器。当回收目标粒子被吸入回收通道259中时，形成层流的样品液体或形成层流的样品液体和鞘液也可流到回收通道259。以这种方式，回收目标微粒在微粒分选部257中被分选并且被回收到回收通道259中。
在回收通道259中，将处于封装在第一液体中的状态的回收目标粒子回收在与第一液体不混溶的第二液体中。因此，如上所述，在回收通道259中形成含有作为分散介质的第二液体和作为分散体的第一液体的乳液。
连接通道270设置有液体供应通道261，以便防止不是回收目标粒子的生物粒子通过连接通道270进入回收通道259。与流过主通道255的液体(样品液体和鞘液)不混溶的第二液体从液体供应通道261引入连接通道270。
因为从连接通道270朝向主通道255的流由被引入到连接通道270中的第二液体的一部分形成，所以可以防止除了回收目标粒子之外的生物粒子进入回收通道259。由于流过主通道255的第一液体流动至废料通道258，由从连接通道270朝向主通道255的流动形成的第二液体与第一液体类似地流过废料通道258而不流过主通道255。
应注意，引入连接通道270的第二液体的剩余部分流入回收通道259。因此，回收通道259可填充有第二液体。
回收通道259可填充有与第一液体不混溶的第二液体。为了用第二液体填充回收通道259，可将第二液体从液体供应通道261供应至连接通道270。通过该供应，第二液体从连接通道270流到回收通道259，使得回收通道259可填充有第二液体。
已流入废料通道258的层流可在废料通道端部260处排出至微芯片的外部。此外，被回收到回收通道259中的回收目标微粒可在回收通道端部261被排放到微芯片的外部。
如图13所示，例如，容器271可经由诸如管272的通道连接至回收通道端部263。如图所示，在容器271内，在容器271内回收含有第一液体和第二液体的乳液，该第一液体含有作为分散体的回收目标粒子，该第二液体作为分散介质。以这种方式，获得包含乳状液粒子的乳状液，其中生物粒子P已经结合到第一捕获物质、分泌物质和第二捕获物质上。图2D的g示出在乳液粒子E中分离生物粒子P的状态。可以对所获得的乳液执行随后描述的破坏步骤和分析步骤。
如上所述，根据本公开的一个实施方式，该生物粒子分选装置200可以包括一个通道，该通道用于将包含该回收目标粒子的乳液回收到该容器中。
此外，当关闭回收通道端部263并执行回收操作时，可在回收通道259中保留多个乳液粒子。在完成回收操作之后，例如，可以在回收通道259中连续地执行测定(如单细胞分析)。例如，可以在回收通道259中执行稍后描述的破坏步骤。然后，靶捕获分子和目标物质之间的结合可以与破坏步骤一起进行。
如上所述，在本公开中使用的微芯片中，主通道可分支为连接通道和至少一个废料通道。该至少一个废料通道是除回收目标粒子之外的生物粒子流过的通道。
此外，如图7A和图7B以及图8所示，在本公开中使用的微芯片中，主通道、连接通道和回收通道可线性布置。例如，与这三个通道相对于主通道成角度地布置的连接通道和回收通道的情况相比，在线性布置(尤其是同轴布置)这三个通道的情况下，可以更有效地执行回收步骤。例如，可以进一步减少用于将回收目标粒子引导至连接通道所需的吸入量。
此外，如图7A和图7B所示，在本公开中使用的微芯片中，生物粒子在主通道中基本布置成一行并且朝向连接通道流动。因此，能够减少回收工序的抽吸量。
需注意，本公开中使用的微芯片的通道配置并不局限于图7A中所示。例如，在本公开中使用的微芯片中，例如，在其中引入液体的入口和从其排出液体的出口之中的两个或更多个入口和/或出口，优选地，所有入口和/或出口可形成在一个表面上。图14示出包括以这种方式形成的入口和出口的微芯片。在图14所示的微芯片350中，回收通道端部263和两个分支通道端部260均形成在样本液入口251和鞘液入口253形成在其上的表面上。此外，在该表面上还形成有用于将液体引入引入通道261的引入通道入口264。以这种方式，在生物粒子分选微芯片350中，所有引入液体的入口和排出液体的出口形成在一个表面上。这有助于将芯片附接到生物粒子分选装置200上。例如，与入口和/或出口形成在两个或更多个表面上的情况相比，设置在生物粒子分选装置200上的通道和生物粒子分选微芯片350的通道之间的连接变得容易。
应注意，在图14中，鞘液通道254的一部分由虚线表示。由虚线表示的部分位于比由实线表示的样品液通道252的位置低的位置(在由箭头表示的光轴方向上位移的位置)，并且在由虚线表示的通道与由实线表示的通道相交的位置中通道彼此不连通。该描述还适用于在回收通道259和与该部分相交的分支通道258中由虚线表示的部分。
此外，在本公开中，液体供应通道将液体(具体地，第二液体)供应至连接通道。因此，在连接通道中形成从液体供应通道和连接通道之间的连接位置朝向主通道的流，并且可以防止流过主通道的液体进入连接通道并且防止除了回收目标粒子之外的微粒通过连接通道流到回收通道。当执行回收步骤时，如上所述，例如，由于在回收通道中产生的负压，所以包含一种回收目标粒子的第一液体通过连接通道回收到回收通道中的第二液体中。结果，在第二液体中形成包含一种回收目标粒子的乳液粒子。
此外，在本发明中，例如，通过在适当的时刻(例如，在生物粒子到达微粒分选部257的时间)驱动压电致动器，将包含在确定步骤中被确定为回收目标微粒的生物粒子的亲水溶液回收到回收通道259中以形成乳液微粒。在确定步骤中，还可以通过使用例如峰信号和面积信号确定生物粒子是否是回收目标粒子来确定生物粒子是一个微粒(单峰)、两个生物粒子的组合物(双峰)还是三个生物粒子的组合物(三重峰)。因此可以避免乳液粒子的形成，其中一种乳液粒子包含两种或更多种生物粒子。因此，可以以高概率和高效率形成包含一个生物粒子的乳液粒子。此外，由于可以避免形成含有如上所述的两种或更多种生物粒子的组合物的乳液粒子，因此可以省略在形成乳液的操作之前通过例如细胞分选仪等去除两种或更多种生物粒子的组合物产物的操作。
在本公开中，在分离步骤中，可以如上所述形成乳液粒子。在乳液粒子中分离与第一捕获物质、分泌物质和第二捕获物质结合的生物粒子P。
(3-4-2-2)井中的空间的情况
图15示出用于执行粒子分离步骤的孔的示例的示意图。如图15所示，例如，每个都具有能够容纳一个生物粒子的尺寸的多个孔40可形成在基板41的表面中。例如，从任选的喷嘴42将含有已经经历了在项目(3-3)中描述的第二捕获步骤的生物粒子群体的液体施加到基底41的表面上。因此，生物粒子43被分离在孔40中的空间中，如图15所示。以此方式，该生物粒子可以通过将一个生物粒子放置在一个孔的空间中而在微空间中被分离。
在如图15所示的示例中将含有多个生物粒子的液体涂覆到其上形成孔的基底的情况下，可以在不进行项(3-4-2-1)中描述的判别步骤的情况下执行粒子分离步骤。
此外，在进行项目(3-4-2-1)中描述的判别步骤的情况下，例如，可以使用诸如将一个生物粒子放置在一个孔中的细胞分选仪或单细胞分配器的装置。对于该装置，在其上形成多个孔的基底(例如，板等)可以用于分离该生物粒子。作为装置，可以使用市售的装置。该装置可以包括例如用光照射生物粒子的光照射单元、检测来自生物粒子的光的光检测单元、基于所检测的光确定生物粒子是否被放入孔中的辨别单元、以及将被确定为放入孔中的生物粒子分配到孔中的分配单元。
光照射单元和检测单元执行检测步骤，然后判别单元执行判别步骤。分配单元包括例如微流体芯片，该微流体芯片具有形成包含生物粒子的液滴的喷嘴。
该装置在根据该判别单元的确定结果操作该微流体芯片的位置的同时将一个包含生物粒子的液滴放置到一个预定孔中。可替代地，该装置根据该判别单元的确定结果，使用施加到该液滴上的电荷来控制从该喷嘴排出的含有生物粒子的液滴的移动方向。将含有生物粒子的液滴通过对照置于预定的孔中。以这种方式，一个生物粒子分布在一个孔中。
例如，如图16所示，从设置在装置的微流体芯片中的喷嘴52排放包含生物粒子的液滴。通过光照射单元54，用光(例如，激光束L)照射包含在液滴中的生物粒子。然后，由检测单元55执行检测步骤，并且检测光(荧光F)。然后，判别部(未示出)根据检测出的光执行判定步骤。然后，分配单元根据确定结果使用施加至液滴的电荷控制液滴的移动方向。通过对照，在预定的孔中回收包含目标生物粒子的液滴。因此，一个生物粒子分布在一个孔中。
通过执行判别步骤，例如，可以根据检测信号指定生物粒子所属的细胞群体、分配条形码的生物粒子、或包含单线态生物粒子的液滴。因此，仅可以回收包含目标生物粒子的液滴。结果，不必排除后面描述的分析步骤中的数据，并且提高了分析效率。
在一个基底(板)中提供的孔的数目例如可以是1至1,000，具体地10至800，以及更具体地30至500，但是本领域技术人员可以适当地选择孔的数目。
如上所述，在本公开中，可以在孔中分离与第一捕获物质、分泌物质和第二捕获物质结合的生物粒子P。
(3-5)破坏步骤
在破坏步骤S105中，该生物粒子在微空间中被中断。该破坏步骤可以在其中一个生物粒子中包含的组分不与另一个生物粒子中包含的组分混合的环境下进行。
随着破坏，将在第二捕获步骤S103中形成的第一捕获物质、分泌物质和第二捕获物质的组合物从生物粒子中分离。此外，随着破坏，粒子捕获物质120也从生物粒子分离。
在此，组合物中的第二捕获物质包括多聚A序列，并且粒子捕获物质120包括物质回收部122(例如，多聚T)。因此，多聚A和物质回收部122被结合。第二捕获物质包括如上所述的捕获物质标识物，并且粒子捕获物质包括如上所述的粒子标识物。因此，捕获物质标识物和粒子标识物经由多聚A和物质回收部之间的结合而彼此结合。因此，例如，在后面描述的分析步骤中，可在捕获物质标识物与粒子标识物彼此相关联的状态下进行分析。更具体地，由第二捕获物质捕获的分泌物质可以由捕获物质标识物指定，并且包括粒子标识物的粒子捕获物质已经结合到其上的生物粒子可以由粒子标识物指定。分泌物质和生物粒子可以相应地彼此相关联。因此，可以将关于由生物粒子补充的分泌物质的信息(关于类型和/或量的信息)与生物粒子相关联，并且可以在单细胞水平分析分泌物质。
此外，在破坏步骤S105中，构成生物粒子的目标物质或结合到生物粒子的目标物质可被包括在粒子捕获物质120中的物质回收部122捕获。结果，形成粒子捕获物质120和目标物质的复合物，并且在稍后描述的分析步骤中，目标物质可以与包括在粒子捕获物质120中的粒子标识物124相关联。这样形成的复合物在后述的分析步骤中进行分析。因此，关于目标物质的信息(关于类型和/或量的信息)可以与生物粒子相关联，并且可以在单细胞水平分析目标物质。
破坏步骤S105优选地在保持微空间中的生物粒子的分离状态时执行。因此，有效地进行了组合物和/或复合物的形成。此外，可以防止组合物和/或复合物的组成分子结合到微空间外部的分子上。
在微空间是指乳液粒子中的空间的情况下，保持分离状态可以是指保持乳液粒子，并且具体地，可以指乳液粒子不被破坏。
在微空间意指孔中的空间的情况下，保持分离状态可以意指孔中的组分(具体地，生物粒子、组合物、复合物、以及孔中的组合物和/或复合物的组成分子)保留在孔中，并且可以进一步意指另孔中的组分不进入孔。
破坏步骤S105可以通过化学地或物理地破坏生物粒子来执行。
对于生物粒子的化学破坏，可以使生物粒子破坏物质和生物粒子在微空间中彼此接触。生物粒子破坏物质可以由本领域技术人员根据生物粒子的类型适当地选择。在生物粒子是细胞的情况下，例如，脂双层膜破坏成分可以用作生物粒子破坏物质，并且具体地，可以使用表面活性剂、碱成分、酶等。作为表面活性剂，可以使用阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、两性表面活性剂或阳离子表面活性剂。阴离子表面活性剂的示例包括十二烷基硫酸钠(SDS)和月桂酰肌氨酸钠。非离子表面活性剂的示例包括Triton X-100、TritonX-114、Tween 20、Tween 80、NP-40、Brij-35、Brij-58、辛基葡糖苷、辛基硫代葡糖苷和辛基苯氧基聚乙氧基乙醇。两性表面活性剂的示例包括CHAPS和CHAPSO。阳离子表面活性剂的示例包括十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。而且，碱性组分的示例包括OH-离子。此外，酶的示例包括蛋白酶K、链球菌溶血素、溶菌酶、溶葡萄球菌素、酶解酶、纤维素酶、聚糖酶和蛋白酶。酶的类型可以根据例如细胞的类型(动物细胞、植物细胞、细菌、酵母等)适当地选择。
在微空间是孔中的空间的情况下，破坏步骤可以例如通过在每个孔中放置生物粒子破坏物质来进行。因为每个孔彼此分离，所以即使当执行破坏时，孔中的组件也保持在孔中。
在微空间是乳液粒子中的空间的情况下，例如，可以在形成乳液粒子的同时将生物粒子破坏物质引入乳液粒子中。然后，在形成该乳液粒子之后，可以进行由该生物粒子破坏物质对该生物粒子的破坏步骤。
对于生物粒子的物理破坏，可以对生物粒子施加破坏生物粒子的物理刺激。作为向生物粒子施加物理刺激的处理，例如，可以采用光学处理、热处理、电处理、声学处理、冻融处理或机械处理。通过这些处理，细胞或外来体可以被破坏。光学处理的示例包括通过用激光束照射形成等离子体或形成空泡。热处理的示例包括热处理。声学处理的示例包括使用超声波的超声处理。机械处理的示例包括使用均质器或珠磨机的处理。通过这些处理生物粒子的物理破坏可应用于微空间是孔中的空间的情况和微空间是乳液粒子中的空间的情况。在微粒是乳液粒子中的空间的情况下，在这些处理中，光学处理、热处理、电处理和冻融处理是特别适合的。注意，为了在通过声学处理防止乳液粒子破坏的同时破坏生物粒子，例如，可以将表面活性剂添加到乳液粒子中，并且此外，可以调节表面活性剂的浓度。
在破坏步骤S105中，通过使用包括在粒子捕获物质120中的物质回收部122，可以分析分泌物质并且可以分析细胞中的目标物质，并且此外，这些分析的结果可以与生物粒子相关联。因此，可同时进行分泌物质和细胞内物质的单细胞分析。
破坏步骤S105包括利用物质回收部122回收组合物和/或粒子捕获物质120(具体地，结合到粒子捕获物质120的目标物质)的步骤。组合物可通过物质回收部122回收，此外，粒子捕获物质120，特别地，与粒子捕获物质120结合的目标物质也可回收。
例如，如图2D的g所示，在乳液粒子E中分离与第一捕获物质、分泌物质和第二捕获物质结合的生物粒子P。通过对生物粒子P进行破坏处理，从生物粒子P释放第一捕获物质、分泌物质和第二捕获物质。
然后，例如，如图2D的h所示，第二捕获物质170结合到粒子捕获物质120。这种结合可以基于第二捕获物质170的多聚A序列173与粒子捕获物质120的物质回收部122(在这种情况下为多聚T序列)之间的结合。注意，尽管在图2D的h中未示出第一捕获物质和分泌物质，但是在结合之后，分泌物质和第一捕获物质可以连续地结合到第二捕获物质170，或者分泌物质和第一捕获物质不一定结合到第二捕获物质170。例如，当生物粒子P被破坏时，分泌物质可以从第二捕获物质170释放或被破坏。与此一起，第一捕获物质还可从第二捕获物质170释放。
此外，通过破坏该生物粒子P将该生物粒子P内部的mRNA释放到该乳液粒子中。然后，mRNA结合到粒子捕获物质120的物质回收部(多聚T序列)122。
如上所述，在破坏步骤中，在乳液粒子中形成粒子捕获物质120和第二捕获物质170的组合物。同样在破坏步骤中，还可以在乳液粒子中形成粒子捕获物质120和包含在生物粒子中的物质(上述目标物质，具体地，mRNA)的复合物。在后面描述的分析步骤中，组合物和/或复合物结合产物是分析靶。
(3-6)分析步骤
在分析步骤S106中，分析每个生物粒子。例如，可以对通过在破坏步骤S105中破坏生物粒子而释放的组合物和/或复合物进行分析。例如，如图2D的i所示，可以对粒子捕获物质120和第二捕获物质170的组合物执行分析。此外，可以对包含在生物粒子中的粒子捕获物质120和物质(上述目标物质，具体地，mRNA)的复合物进行分析。
组合物和复合物均包括回收物质扩增部和第二回收物质扩增部。因此，在分析步骤S106中的分析可以包括使用回收物质扩增部和/或第二回收物质扩增部来扩增包含在组合物和/或复合物中的核酸的核酸扩增步骤。在核酸扩增步骤中，包含在组合物中的捕获物质标识物(具体地，核酸，更具体地，mRNA)被扩增，和/或包含在复合物中的目标物质(具体地，核酸，更具体地，mRNA)被扩增。然后，通过对扩增的核酸执行测序处理获得核酸序列信息。
在此，包含在组合物中的捕获物质标识物(特别地，包括在标识物中的序列信息)与分泌物质相关。因此，分泌物质可以从核酸序列信息中指定。此外，复合物中包含的目标物质是生物粒子中包含的物质或与生物粒子结合的物质，并且该物质被放大。因此，可以从核酸序列信息指定目标物质。分泌物质和目标物质可以相应地通过测序处理来指定。
此外，如上所述，包含在组合物中的捕获物质标识物经由多聚A和物质回收部之间的结合结合到粒子标识物。包含在复合物中的粒子捕获物质也与粒子标识物结合。因此，扩增后的核酸中还包括粒子标识的序列，即通过测序处理获得的核酸序列信息中还包括粒子标识的相关信息。因此，在多种类型的核酸序列信息中，包括相同粒子标识物的序列的核酸序列信息可以指定为源自结合到相同生物粒子的组合物(分泌物质)或包含在相同生物粒子中的目标物质。
如上所述，在分析步骤S106中，关于指定的分泌物质和/或目标物质的信息可以基于粒子标识物的序列与一个生物粒子相关联。
因为在破坏步骤中组合物和/或复合物包括粒子标识物，即使在分析步骤S106中对分别存在于多个微空间中的不同生物粒子衍生的组合物和/或复合物进行总体分析的情况下，基于粒子标识物，组合物和/或复合物的分析结果可以与衍生组合物和/或复合物的生物粒子相关联。
例如，在微空间是孔中的空间的情况下，可以单独分析每个孔中的生物粒子破坏产物，或者可以收集多个孔的生物粒子破坏产物作为一个样品，并且可以共同分析一个样品。在前一种情况下，易于将生物粒子与分析结果相关联。同样在后者的情况下，因为包含在每个生物粒子破坏产品中的分泌物质或目标物质作为包含粒子标识物的组合物或复合物的组成元素存在，所以组合物或复合物的分析结果可以与衍生组合物或复合物的生物粒子相关。
此外，在微粒是乳液粒子中的空间的情况下，可以集中分析多个乳液粒子，并且例如，可以集中分析所获得的整个乳液。因为包含在每个生物粒子破坏产品中的分泌物质或目标物质作为包含粒子标识物的组合物或复合物的组成元素存在，所以组合物或复合物的分析结果可以与衍生组合物或复合物的生物粒子相关。因此，可以提高分析效率。
如图2D的i所示，可以使用分析器1000执行分析步骤S106。分析器1000例如可以是对组合物和/或复合物进行测序处理的装置。通过测序处理，获得核酸(特别是DNA或RNA，更特别是mRNA)的序列信息。测序处理可以通过测序仪进行，或者可以通过下一代测序仪或使用桑格法的测序仪进行。为了以更高的速度全面地进行多个生物粒子(具体地，细胞群体)的分析，可以通过下一代测序仪进行测序处理。
为了在分析步骤S106中进行测序处理，分析步骤可还包括准备待进行测序处理的核酸(例如，cDNA)的准备步骤以及纯化核酸的纯化步骤。通过准备步骤和纯化步骤，例如，可以准备用于进行下一代测序处理的文库。
准备步骤例如可以包括从mRNA合成cDNA的cDNA合成步骤。此外，准备步骤还可以包括扩增合成的cDNA的扩增步骤。在准备步骤之后，可以进行纯化在准备步骤中获得的核酸的纯化步骤。纯化步骤可以包括，例如，使用酶(如蛋白酶K)破坏处理除核酸之外的组分。在纯化步骤中，也可以进行核酸回收处理。在核酸回收处理中，例如，可以使用可商购的核酸纯化试剂，并且其示例包括磁珠如AMPure XP。注意，在纯化步骤中，还可以回收细胞内dsDNA，但是可以防止dsDNA在测序处理中被测序。例如，通过在待扩增的序列中(例如，在第二捕获物质和粒子捕获物质中)并入用于测序处理(特别是用于下一代测序处理)的连接部序列，可以仅对包括连接部序列的核酸进行测序。
在分析步骤S106中，可以基于测序处理的结果针对每个生物粒子分析分泌物质和/或目标物质。
例如，在分析步骤S106中，可确定第二捕获物质的类型(具体地，捕获物质标识物的序列)和/或第二捕获物质的数量。该确定可以基于通过测序处理所确定的序列中的捕获物质标识物的序列来进行。由此，确定由第二捕获物质捕获的分泌物质的类型和/或数量。
此外，在分析步骤S106中，可以确定目标物质的序列(例如包含在细胞中的mRNA)和/或每个目标物质的拷贝数。
对每个生物粒子的分泌物质和/或目标物质的这种分析可以基于通过序列处理所确定的序列中的粒子鉴定物来进行。例如，从通过序列处理确定的大量基序列中选择包括相同粒子标识物的序列的碱基序列。包括相同粒子鉴定物的序列的碱基序列基于已经捕获结合到一个细胞的分泌物质和/或结合到包含在细胞中的组分的粒子捕获物质的第二捕获物质。因此，通过收集每个粒子鉴定物的分泌物质和/或目标物质的分析结果，可以对每个生物粒子分析这些物质。
2.第二实施方式(用于生物粒子分析的试剂盒)
本公开提供了一种用于生物粒子分析的试剂盒，该试剂盒包括：第一分泌物质捕获物质，该第一分泌物质捕获物质包括：第一生物粒子结合部，被配置为结合到生物粒子；以及第一分泌物质结合部，被配置为结合到通过将包括该生物粒子的生物粒子群体放置在预定条件下而产生的分泌物质；以及第二分泌物质捕获物质，包括：第二分泌物质结合部，被配置为结合所述分泌物质；以及捕获物质标识物，被配置为标识第二捕获物质。
第一分泌物质捕获物质是在以上部分1中描述的第一捕获物质130。关于第一捕获物质130的描述也适用于本实施方式中的第一分泌物质捕获物质。第一生物粒子结合部和第一分泌物质捕获物质分别是在以上部分1中描述的生物粒子结合部133和分泌物质结合部131。关于生物粒子结合部133和分泌物质结合部131的描述也适用于本实施方式中的第一生物粒子结合部和第一分泌物质捕获物质。第一分泌物质捕获物质可以还包括交联部，该交联部使第一生物粒子结合部和第一分泌物质结合部交联。
例如，第一生物粒子结合部可以包含与生物粒子表面上的抗原结合的抗原结合物质，或与形成生物粒子表面膜的分子结合的分子结合物质。抗原结合物质可以含有选自抗体、抗体片段、适配体和分子印迹聚合物的物质。分子结合物质可以包括油烯基或胆固醇基。
第二分泌物质捕获物质是在以上部分1中描述的第二捕获物质170。对于第二捕获物质170的描述也适用于本实施方式中的第二分泌物质捕获物质。第二分泌物质结合部和捕获物质标识物是在以上部分1中描述的第二分泌物质结合部171和捕获物质标识物173。关于第二分泌物质结合部171和捕获物质标识物173的描述也适用于本实施方式中的第二分泌物质结合部和捕获物质标识物。
该试剂盒可以还包括基底材料，该基底材料具有固定有粒子捕获物质的表面，该粒子捕获物质包括：第二生物粒子结合部，被配置为结合到该生物粒子；以及粒子标识物，被配置为标识该生物粒子。表面和基底材料是在以上部分1中描述的表面110和基底材料100。粒子捕获物质是上述部分1中描述的粒子捕获物质120。因此，关于表面110、基底材料100和粒子捕获物质120的描述也适用于本实施方式中的表面、基底材料和粒子捕获物质。
根据本公开的用于生物粒子分析的试剂盒可以用于根据本公开的生物粒子分析方法中。如上述第1部分所描述，在试剂盒中包含的材料中，第一分泌物质捕获物质和第二分泌物质捕获物质的组合用于捕获分泌物质。特别地，该组合用于捕获处于与生物粒子结合的状态的分泌物质。
第一分泌物质捕获物质可以还包括交联部，该交联部使生物粒子结合部和分泌物质结合部交联。交联部是在以上部分1中描述的交联部132。关于交联部132的描述也适用于本实施方式中的交联部。
该试剂盒可以还包括具有表面的基底材料，在该表面上粒子捕获物质包括：第二生物粒子结合部，该第二生物粒子结合部被配置为结合到该生物粒子；以及被配置为标识该生物粒子的粒子标识物被固定。表面和基底材料是在以上部分1中描述的表面110和基底材料100。粒子捕获物质是上述部分1中描述的粒子捕获物质120。因此，关于表面110、基底材料100和粒子捕获物质120的描述也适用于本实施方式中的表面、基底材料和粒子捕获物质。
3.第三实施方式(生物粒子分析系统)
本发明还提供了一种生物粒子分析系统。该系统可以包括：第一容器，其中，通过放置生物粒子群体诱导分泌物质的分泌，该生物粒子群体包括生物粒子，被配置为捕获分泌物质的第一捕获物质在预定条件下结合到该生物粒子；第二容器，结合在该第一捕获物质上的分泌物质和被配置为捕获分泌物质的第二捕获物质结合在该第二容器中；以及生物粒子处理装置，所述生物粒子处理装置将与第一捕获物质、分泌物质和第二捕获物质结合的生物粒子分离为单个粒子。
第一容器对应于在上面部分1中描述的第一捕获步骤S102的容器140。执行。第二容器对应于在上面部分1中描述的第二捕获步骤S103的容器150。执行。
该生物粒子处理装置可以被配置为执行在以上部分1中描述的分离步骤S104。该生物粒子处理装置例如可以是在以上部分1中描述的生物粒子分选设备200。
本公开的生物粒子分析系统可以还包括被配置为执行在以上部分1中描述的断裂步骤S114(具体地，检测步骤和/或连接部断裂步骤)的装置。该装置可以是在以上部分1中描述的刺激施加装置。
此外，根据一个实施方式，本公开的生物粒子分析系统可以包括一个生物粒子处理装置，该生物粒子处理装置将与该第一捕获物质、该分泌物质、和该第二捕获物质结合的生物粒子分离为单个粒子。除了该生物粒子加工装置以外，该生物粒子分析系统还可以包括根据本公开的用于生物粒子分析的试剂盒(或包含在该试剂盒中的任何一种或多种材料)。
本公开的生物粒子分析系统可以包括执行在以上部分1中描述的分析步骤的分析器。分析器例如可以是测序仪。
应注意，本公开的技术可具有以下配置。
[1]
一种生物粒子分析方法，包括：
准备生物粒子群体的准备步骤，所述生物粒子群体包括第一捕获物质结合到的生物粒子，所述第一捕获物质被配置为捕获分泌物质；
第一捕获步骤，使通过将所述生物粒子群体放置在预定条件下而产生的分泌物质结合到所述第一捕获物质上；以及
第二捕获步骤：使结合到所述第一捕获物质的所述分泌物质结合到第二捕获物质，所述第二捕获物质被配置为捕获所述分泌物质。
[2]
根据[1]所述的生物粒子分析方法，其中
所述第一捕获步骤包括将所述生物粒子群体放置在预定条件下的处理步骤，并且
在保持该生物粒子群体的群体状态的同时执行该处理步骤。
[3]
根据[1]或[2]所述的生物粒子分析方法，其中，在保持所述第一捕获物质结合到所述生物粒子的状态的同时，执行所述第一捕获步骤和所述第二捕获步骤。
[4]
根据[1]至[3]中任一项所述的生物粒子分析方法，其中，被配置为标识该生物粒子的粒子标识物结合在该准备步骤中准备的该生物粒子群体中包括的该生物粒子。
[5]
根据[1]至[4]中任一项所述的生物粒子分析方法，其中，被配置为标识第二捕获物质的捕获物质标识物结合到第二捕获物质。
[6]
根据[1]至[4]中任一项所述的生物粒子分析方法，其中，所述第一捕获物质包括分泌物质结合部和生物粒子结合部。
[7]
根据[6]所述的生物粒子分析方法，其中，该分泌物质结合部被配置为结合到这些分泌物质中的一种或两种或更多种。
[8]
根据[6]或[7]所述的生物粒子分析方法，其中，所述生物粒子结合部包含与所述生物粒子的表面上的抗原结合的抗原结合物质或者与形成所述生物粒子的表面膜的分子结合的分子结合物质。
[9]
根据[6]至[8]中任一项所述的生物粒子分析方法，其中，分泌物质结合部通过交联部结合到生物粒子结合部。
[10]
根据[1]至[9]中任一项所述的生物粒子分析方法，其中，所述第一捕获物质包含与相同类型的两个或更多个或者不同类型的两个或更多个细胞的表面结合的抗体。
[11]
根据[1]至[10]中任一项所述的生物粒子分析方法，还包括在该第二捕获步骤之后将该生物粒子群体中包括的生物粒子分离为单个粒子的分离步骤。
[12]
根据[11]所述的生物粒子分析方法，还包括在该分离步骤之后破坏该生物粒子的破坏步骤。
[13]
根据[12]所述的生物粒子分析方法，其中在一个生物粒子中包含的组分不与另一个生物粒子中包含的组分混合的环境下执行所述破坏步骤。
[14]
根据[13]所述的生物粒子分析方法，还包括在破坏步骤之后分析每个生物粒子的分析步骤。
[15]
一种用于生物粒子分析的试剂盒，该试剂盒包括：
第一分泌物质捕获物质，包括：第一生物粒子结合部，被配置为结合到生物粒子上；以及第一分泌物质结合部，该第一分泌物质结合部被配置为结合到通过将包括该生物粒子的生物粒子群体放置在预定条件下而产生的分泌物质；以及
第二分泌物质捕获物质，包括：第二分泌物质结合部，被配置为结合到分泌物质；以及捕获物质标识物，被配置为标识第二捕获物质。
[16]
根据[15]所述的用于生物粒子分析的试剂盒，其中，该第一分泌物质捕获物质还包括使该生物粒子结合部和该分泌物质结合部交联的交联部。
[17]
根据[15]或[16]所述的用于生物粒子分析的试剂盒，其中，该第一生物粒子结合部包含与该生物粒子的表面上的抗原结合的抗原结合物质或与形成该生物粒子的表面膜的分子结合的分子结合物质。
[18]
根据[17]所述的用于生物粒子分析的试剂盒，其中，该抗原结合物质包含选自下组的物质，该组由以下各项组成：抗体、抗体片段、适配体、以及分子印迹聚合物。
[19]
根据[17]所述的用于生物粒子分析的试剂盒，其中，该分子结合物质包括油烯基或胆固醇基。
[20]
根据[15]至[19]中任一项所述的用于生物粒子分析的试剂盒，还包括基底材料，该基底材料具有固定有粒子捕获物质的表面，该粒子捕获物质包括：第二生物粒子结合部，被配置为结合到所述生物粒子；以及粒子标识物，被配置为标识该生物粒子的粒子标识物。
参考符号列表
100 基底
110 表面
120 粒子捕获物质
130 第一捕获物质
160 分泌物质
170 第二捕获物质。
Claims (20)
1.一种生物粒子分析方法，包括：
准备生物粒子群体的准备步骤，所述生物粒子群体包括第一捕获物质结合到的生物粒子，所述第一捕获物质被配置为捕获分泌物质；
第一捕获步骤，使通过将所述生物粒子群体放置在预定条件下而产生的分泌物质结合到所述第一捕获物质上；以及
第二捕获步骤，使结合到所述第一捕获物质的所述分泌物质结合到第二捕获物质，所述第二捕获物质被配置为捕获所述分泌物质。
2.根据权利要求1所述的生物粒子分析方法，其中，
所述第一捕获步骤包括将所述生物粒子群体放置在预定条件下的处理步骤，并且
在保持所述生物粒子群体的群体状态的同时执行所述处理步骤。
3.根据权利要求1所述的生物粒子分析方法，其中，在保持所述第一捕获物质结合到所述生物粒子的状态的同时，执行所述第一捕获步骤和所述第二捕获步骤。
4.根据权利要求1所述的生物粒子分析方法，其中，被配置为标识所述生物粒子的粒子标识物结合到在所述准备步骤中准备的所述生物粒子群体中包括的所述生物粒子。
5.根据权利要求1所述的生物粒子分析方法，其中，被配置为标识所述第二捕获物质的捕获物质标识物结合到所述第二捕获物质。
6.根据权利要求1所述的生物粒子分析方法，其中，所述第一捕获物质包括分泌物质结合部和生物粒子结合部。
7.根据权利要求6所述的生物粒子分析方法，其中，所述分泌物质结合部被配置为结合一种或两种或更多种分泌物质。
8.根据权利要求6所述的生物粒子分析方法，其中，所述生物粒子结合部包含与所述生物粒子的表面上的抗原结合的抗原结合物质或者与形成所述生物粒子的表面膜的分子结合的分子结合物质。
9.根据权利要求6所述的生物粒子分析方法，其中，所述分泌物质结合部经由交联部结合到所述生物粒子结合部。
10.根据权利要求1所述的生物粒子分析方法，其中，所述第一捕获物质包含与相同类型或者不同类型的两个或更多个细胞的表面结合的抗体。
11.根据权利要求1所述的生物粒子分析方法，还包括在所述第二捕获步骤之后将所述生物粒子群体中包括的所述生物粒子分离为单个粒子的分离步骤。
12.根据权利要求11所述的生物粒子分析方法，还包括在所述分离步骤之后破坏所述生物粒子的破坏步骤。
13.根据权利要求12所述的生物粒子分析方法，其中，在包含在一个生物粒子中的组分不与包含在另一个生物粒子中的组分混合的环境下执行所述破坏步骤。
14.根据权利要求13所述的生物粒子分析方法，还包括在所述破坏步骤之后分析每个生物粒子的分析步骤。
15.一种用于生物粒子分析的试剂盒，所述试剂盒包括：
第一分泌物质捕获物质，包括：第一生物粒子结合部，被配置为结合到生物粒子上；以及第一分泌物质结合部，被配置为结合到通过将包括所述生物粒子的生物粒子群体放置在预定条件下而产生的分泌物质；以及
第二分泌物质捕获物质，包括：第二分泌物质结合部，被配置为结合到所述分泌物质；以及捕获物质标识物，被配置为标识第二捕获物质。
16.根据权利要求15所述的用于生物粒子分析的试剂盒，其中，所述第一分泌物质捕获物质还包括交联部，所述交联部使所述第一生物粒子结合部和所述第一分泌物质结合部交联。
17.根据权利要求15所述的用于生物粒子分析的试剂盒，其中，所述第一生物粒子结合部包含与所述生物粒子的表面上的抗原结合的抗原结合物质或者与形成所述生物粒子的表面膜的分子结合的分子结合物质。
18.根据权利要求17所述的用于生物粒子分析的试剂盒，其中，所述抗原结合物质包含从由抗体、抗体片段、适配体和分子印迹聚合物组成的组中选择的物质。
19.根据权利要求17所述的用于生物粒子分析的试剂盒，其中，所述分子结合物质包括油烯基或胆固醇基。
20.根据权利要求15所述的用于生物粒子分析的试剂盒，还包括基底材料，所述基底材料具有固定有粒子捕获物质的表面，所述粒子捕获物质包括：第二生物粒子结合部，被配置为结合到所述生物粒子；
以及粒子标识物，被配置为标识所述生物粒子。
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