WO2024085141A1 - 流体デバイス及び標的分子の検出方法 - Google Patents

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WO2024085141A1
WO2024085141A1 PCT/JP2023/037512 JP2023037512W WO2024085141A1 WO 2024085141 A1 WO2024085141 A1 WO 2024085141A1 JP 2023037512 W JP2023037512 W JP 2023037512W WO 2024085141 A1 WO2024085141 A1 WO 2024085141A1
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well
target molecule
fluidic device
detecting
target
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PCT/JP2023/037512
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陽介 堀内
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Ｔｏｐｐａｎホールディングス株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/02—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a plurality of sample containers moved by a conveyor system past one or more treatment or analysis stations
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N37/00—Details not covered by any other group of this subclass

Definitions

  • the present invention relates to a fluidic device and a method for detecting a target molecule.
  • Quantitative detection of target molecules in biological samples is used to detect diseases early and predict the effectiveness of medication.
  • the target molecule is a protein
  • quantification is performed using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or similar.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • nucleic acid quantification is performed using real-time PCR or similar.
  • Patent Document 1 Patent Document 1, Patent Document 2, and Non-Patent Document 1 describe a technique for performing an enzyme reaction in multiple microcompartments to detect single molecules. These methods are called digital measurement.
  • a sample solution is filled into a reaction vessel (fluid device) with an extremely large number of microcompartments, and the sample solution is divided into each of the microcompartments.
  • the signal from each microcompartment is then binarized, and the number of target molecules contained in the sample solution is measured by determining (i.e. detecting) only whether or not the target molecule is present in the microcompartment.
  • Digital measurement can significantly improve detection sensitivity and quantitation compared to conventional ELISA, real-time PCR, and other methods.
  • target molecules contained in a solution sample are distributed one molecule at a time to microcompartments, and the number of microcompartments into which the target molecules are distributed is measured.
  • the source of the target molecules i.e., the target substance
  • detect and quantify the amount of target molecules released from the target substance For example, while conventional digital measurement technology can detect cells (i.e., the target substance) contained in a solution sample with high accuracy, it is difficult to detect and quantify cytokines (i.e., the target molecules) secreted from each cell with high accuracy.
  • cytokines i.e., the target molecules
  • the present invention has been made in consideration of these circumstances, and aims to provide a fluidic device that enables highly sensitive detection of target molecules in a solution. It also aims to provide a method for detecting target molecules using such a fluidic device.
  • one aspect of the present invention includes the following aspects.
  • a fluidic device comprising a substrate, a wall material provided on the substrate, and a lid material facing the substrate and in contact with the wall material, the lid material having an inlet and an outlet penetrating in the thickness direction, a flow path through which a fluid flows formed between the top of the wall material and the lid material, a plurality of first wells surrounded by the substrate and the wall material, and a plurality of second wells provided on the upper surface of the substrate, each of which is provided at the bottom of the first well.
  • [1-3] A fluidic device according to [1-1] or [1-2], in which the major axis of the opening of the first well is 1 ⁇ m or more and 1 cm or less.
  • a fluidic device according to any one of [1-1] to [1-3], in which the aspect ratio of the first well is 0.002 or more and 3 or less.
  • [1-5] A fluidic device according to any one of [1-1] to [1-4], in which the major axis of the opening of the second well is 1 nm or more and 1 mm or less.
  • a fluidic device according to any one of [1-1] to [1-5], in which the aspect ratio of the second well is 0.05 or more and 3 or less.
  • a method for detecting a target molecule using a fluidic device comprising the steps of filling a sample solution containing a target substance into each of the first wells independently, releasing the target molecule from the target substance in one of the first wells in which the target substance is placed, distributing the target molecule independently to each of the second wells one molecule at a time, and causing a reaction between the target molecule and a detection reagent to occur and detecting the target molecule.
  • one embodiment of the present invention includes the following:
  • a method for detecting a target molecule using a fluidic device having a well comprising the steps of: placing in the well a reaction solution of a target molecule, alkaline phosphatase immobilized on a binder that binds to the target molecule, and a substrate that is visually changed when dephosphorylated by the alkaline phosphatase; and detecting the presence of a target molecule contained in the well by visualizing the presence of the target molecule contained in the well using a dephosphorylation reaction of the substrate by the alkaline phosphatase in the well.
  • a method for detecting a target molecule wherein at the start of the process of visualizing and detecting the presence of the target molecule, the concentration of the substrate in the reaction solution contained in the well is 80 ⁇ mol/L or more and 800 ⁇ mol/L or less.
  • the present invention provides a fluidic device that enables highly sensitive detection of target molecules in a solution. It also provides a method for detecting target molecules using such a fluidic device.
  • FIG. 1 is a schematic perspective view showing a fluidic device according to a first embodiment.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along line II-II in FIG.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram of the method for detecting a target molecule according to the first embodiment.
  • FIG. 4 is an explanatory diagram of the method for detecting a target molecule according to the first embodiment.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram of a method for detecting a target molecule according to the first embodiment.
  • FIG. 6 is an explanatory diagram of a method for detecting a target molecule according to the first embodiment.
  • FIG. 7 is an explanatory diagram of a method for detecting a target molecule according to the first embodiment.
  • FIG. 1 is a schematic perspective view showing a fluidic device according to a first embodiment.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along line II-II in FIG.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram of the method for detecting a
  • FIG. 8 is a schematic perspective view showing a fluidic device according to the second embodiment.
  • FIG. 9 is a cross-sectional view taken along line IX-IX in FIG.
  • FIG. 10 is an explanatory diagram of a method for detecting a target molecule according to the second embodiment.
  • FIG. 11 is an explanatory diagram of a method for detecting a target molecule according to the second embodiment.
  • FIG. 12 is a schematic cross-sectional view showing a state in which liquid is supplied to a fluidic device according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 13 is a schematic cross-sectional view showing a state in which a sealing liquid is supplied to the fluidic device shown in FIG. FIG.
  • FIG. 14 is a schematic cross-sectional view showing a state in which a sealing liquid is supplied to the fluidic device shown in FIG.
  • FIG. 15 is a schematic cross-sectional view of a fluidic device according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 16 is a bar graph showing the number of wells in which false positive reactions were observed for each substrate concentration.
  • FIG. 1 is a schematic perspective view showing a fluidic device according to the present embodiment
  • Fig. 2 is a cross-sectional view taken along line II-II in Fig. 1.
  • the fluidic device 100 has a well plate (also called a substrate) 11, a cover material 12, and a wall material 13.
  • the fluidic device 100 contains a sample in an internal space S, and is used as a reaction vessel for releasing target molecules from a target substance contained in the sample and for carrying out a detection reaction of the target molecules.
  • the fluidic device 100 has a plurality of first wells W1 surrounded by a well plate 11 and a wall material 13, and a plurality of second wells W2 each provided on the upper surface 11a of the well plate 11 at the bottom of the first wells W1. The following explains each in order.
  • the well plate 11 is a plate-like member having a rectangular shape in a plan view.
  • the "plan view” refers to a field of view from a normal direction of the upper surface 11a of the well plate 11.
  • the upper surface 11a of the well plate 11 is provided with a plurality of wells (also called second wells or microwells) W2.
  • the second well W2 is a recess provided on the upper surface 11a of the well plate 11 and opens to the upper surface 11a.
  • the second well W2 refers to the space surrounded by the recess and an imaginary plane that is parallel to and in contact with the upper surface 11a.
  • the second well W2 contains the sample contained in the internal space S and functions as a reaction site between the target molecules contained in the sample and the detection reagent.
  • the material of the well plate 11 may or may not be electromagnetically transparent.
  • electromagnetic waves that are the subject of the transmittance judgment include X-rays, ultraviolet rays, visible light, and infrared rays.
  • electromagnetic waves When the well plate 11 is electromagnetically transparent, it becomes possible to use electromagnetic waves to analyze the results of experiments performed in a fluidic device 100 having the well plate 11. For example, the fluorescence or phosphorescence that occurs as a result of irradiating electromagnetic waves can be measured from the well plate 11 side.
  • electroconductive wave transparency refers to the property of being able to transmit electromagnetic waves of various wavelengths, such as radio waves, light, X-rays, and gamma rays.
  • Examples of materials that are electromagnetically transparent include glass and resin.
  • resins include ABS resin, polycarbonate, COC (cycloolefin copolymer), COP (cycloolefin polymer), acrylic resin, polyvinyl chloride, polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyvinyl acetate, PET (polyethylene terephthalate), PEN (polyethylene naphthalate), PC (polycarbonate), silicone resin, fluororesin, and amorphous fluororesin.
  • These resins may contain various additives, and may be polymer alloys in which multiple resins are mixed.
  • the electromagnetic wave transparent material has substantially no autofluorescence. Having substantially no autofluorescence means that the material has no autofluorescence at the wavelength used for sample detection, or if it does have autofluorescence, it is so weak that it does not affect sample detection. For example, if the autofluorescence is less than 1/2 or 1/10 of the fluorescence to be detected, it can be said to be so weak that it does not affect sample detection. If the well plate 11 is formed using such a material, the detection sensitivity can be increased in sample detection using electromagnetic waves.
  • An example of a material that is electromagnetically transparent and does not emit autofluorescence is quartz glass.
  • Materials that emit weak autofluorescence and do not interfere with sample detection using electromagnetic waves include low-fluorescence glass, acrylic resin, COC (cycloolefin copolymer), and COP (cycloolefin polymer), etc.
  • the thickness of the well plate 11 can be determined appropriately. When observing the fluorescence from the well plate 11 side using a fluorescence microscope, the thickness of the well plate 11 may be, for example, 5 mm or less, 2 mm or less, or 1.6 mm or less.
  • the well plate 11 may be a single layer made of only the above material, or may be a laminate of multiple materials.
  • the layer having the second well W2 and the layer supporting that layer may be made of different materials.
  • a laminate in which a fluororesin is laminated on a substrate may be used as the material for the well plate 11, and the layer of fluororesin may be processed to form a well array.
  • CYTOP registered trademark
  • Asahi Glass or the like can be used as the fluororesin.
  • the shape of the second well W2 may be of various shapes. Examples of the shape of the second well W2 include cylindrical shapes such as a cylinder, an elliptical cylinder, and a polygonal cylinder; cone shapes such as a cone and a pyramid, and truncated pyramid shapes such as a truncated cone and a truncated pyramid. When the second well W2 is a cone or a truncated pyramid, it is preferable that the opening diameter gradually decreases in the depth direction of the well.
  • the bottom of the second well W2 may be flat or curved (convex or concave).
  • the volume of one second well W2 may be approximately 10 fL to 1000 pL.
  • multiple second wells W2 of the same shape and size form a well array WA.
  • “same shape and size” means that the wells have the same shape and capacity to the extent required for digital measurements using the fluidic device 100, and variations within the range of manufacturing errors are acceptable.
  • the long diameter of the opening of the second well W2 may be, for example, 1 nm or more and 1 mm or less. Note that the "long diameter of the second well W2" refers to the length of the long side of the smallest rectangle that circumscribes the opening of the second well W2 when viewed in a plan view.
  • the aspect ratio of the second well W2 is preferably 0.05 or more and 3 or less.
  • the “aspect ratio of the second well W2” refers to the ratio of the depth of the second well W2 to the major axis of the second well W2 ([depth of the second well W2]/[major axis of the second well W2]).
  • the “depth of the second well W2” refers to the distance from the above-mentioned “imaginary plane parallel to and in contact with the upper surface 11a" to the bottom of the second well W2.
  • the arrangement of the multiple second wells W2 is not particularly limited.
  • the multiple second wells W2 may be arranged, for example, in a triangular lattice pattern, a square lattice pattern, or may be arranged irregularly.
  • the well plate 11 described above can be manufactured using known injection molding, microimprinting technology, or nanoimprinting technology.
  • the well plate 11 can also be manufactured by forming the second well W2 by etching using known photolithography technology.
  • the wall material 13 is formed in a closed ring shape in a plan view, and is disposed on the upper surface 11a of the well plate 11.
  • the wall material 13 is sandwiched between the well plate 11 and the lid material 12, and together they form the fluidic device 100.
  • the space surrounded by the well plate 11, the lid material 12, and the wall material 13 is the internal space S in which a liquid sample is contained.
  • the wall material 13 functions as a wall surface of the internal space S, and also functions as a spacer between the well plate 11 and the lid material 12.
  • the internal space S is partitioned by wall material 13, and multiple first wells W1 are formed.
  • the first wells W1 refer to the space surrounded by the well plate 11, the wall material 13, and an imaginary plane that is parallel to and in contact with the top 13a of the wall material 13.
  • the fluidic device 100 has 10 to 10,000 first wells W1. There is no limit to the size of the bottom surface of the first well W1, but it is preferably large enough to accommodate 10 to 10,000 of the above-mentioned second wells W2.
  • the major axis of the opening of the first well W1 is preferably 1 ⁇ m or more and 1 cm or less. Note that the "major axis of the first well W1" refers to the length of the long side of the smallest rectangle that circumscribes the opening of the first well W1 when viewed in a plan view.
  • the aspect ratio of the first well W1 is preferably 0.002 or more and 3 or less.
  • the “aspect ratio of the first well W1” refers to the ratio of the depth of the first well W1 to the major axis of the first well W1 ([depth of the first well W1]/[major axis of the first well W1]).
  • the “depth of the first well W1” refers to the distance from the above-mentioned "imaginary plane parallel to and in contact with the top 13a of the wall material 13" to the “imaginary plane parallel to and in contact with the upper surface 11a.”
  • the volume of one first well W1 may be approximately 100 fL to 1 ⁇ L.
  • the material of the wall material 13 can be the same as that of the well plate 11 described above.
  • the wall material 13 made of such a material can be integrated with the well plate 11 and the lid material 12 by bonding with an adhesive or by welding using heat welding, ultrasonic welding, laser welding, or the like.
  • the wall material 13 may be formed integrally with the well plate 11 and may constitute a part of the well plate 11. Similarly, the wall material 13 may be formed integrally with the lid material 12 and may constitute a part of the lid material 12.
  • the lid material 12 has the same contour shape as the well plate 11 in a plan view.
  • the lid material 12 faces the well plate 11 and contacts the wall material 13.
  • the lid material 12 has two through holes that penetrate in the thickness direction.
  • the two through holes are provided at one end and the other end of the lid material 12.
  • One of the through holes is an inlet 121 used to inject liquid into the internal space S of the fluidic device 100, and the other through hole is an outlet 122 used to discharge liquid from the internal space S.
  • liquid includes not only liquid samples, but also detection reagents and sealing liquids.
  • the inlet 121, the internal space S, and the outlet 122 are connected in this order and together form a flow path FC.
  • a liquid is appropriately caused to flow through the flow path FC to carry out a detection reaction of the target substance.
  • a plurality of second wells W2 are arranged between the inlet 121 and the outlet 122.
  • a cylindrical injection port 125 is provided on the upper surface 12a of the lid 12, surrounding the injection port 121.
  • the injection port 125 is connected to the injection port 121.
  • the injection port 125 is used to connect a syringe, for example, when filling the internal space with a liquid using a syringe filled with the liquid.
  • a cylindrical discharge port 126 is provided on the upper surface 12a of the lid 12, surrounding the periphery of the discharge outlet 122.
  • the discharge port 126 is connected to the discharge outlet 122.
  • the discharge port 126 is used, for example, to connect a tube through which the liquid flows when the liquid is extracted from the internal space S.
  • a convex portion 129 is provided on the outer edge of the underside 12b of the lid material 12.
  • the lid material 12 is connected to the outer edge of the wall material 13 via the convex portion 129.
  • the material of the lid material 12 can be any of the materials exemplified as the material of the well plate 11 described above.
  • the material of the lid material 12 may be the same as the material of the well plate 11, or may be different.
  • the material of the lid material 12 may or may not be electromagnetically transparent.
  • the above-mentioned lid material 12 can be manufactured by known injection molding.
  • the fluid device 100 does not have to have a lid material 12.
  • the method for detecting a target molecule of this embodiment includes the following steps. (1) A step of adjusting the concentration of a liquid sample containing a target substance to obtain a sample solution; (2) A step of filling the sample solution into a plurality of first wells independently; (3) A step of releasing target molecules from the target substance; (4) A step of distributing the target molecules independently to each of the second wells, one molecule at a time; (5) A step of causing a reaction between the target molecules and a detection reagent and detecting the target molecules.
  • step (1) Step of adjusting the concentration of a liquid sample containing a target substance to obtain a sample solution
  • step (1) the concentration of a liquid sample containing a target substance is adjusted to obtain a sample solution L.
  • this step may be abbreviated as "step (1)".
  • Samples include, for example, biological samples or environmental samples.
  • Biological samples are not particularly limited, and examples include serum, plasma, urine, and cell culture fluid.
  • Environmental samples include, for example, river water and industrial wastewater.
  • Biological samples and environmental samples contain a target substance M1 that releases a target molecule to be detected.
  • target substances M1 include DNA, RNA, proteins, viruses, cells, and specific compounds.
  • RNA include miRNA and mRNA.
  • cells include bacteria, yeast, animal cells, plant cells, and insect cells.
  • the sample may contain a reaction reagent for detecting the target substance M1. That is, a biological sample or an environmental sample may be mixed with a reaction reagent for detecting the target molecule contained therein in a tube or the like, and the mixture may be placed in the first well W1 of the fluidic device 100 as a sample solution L. Alternatively, a sample solution L not containing a reaction reagent may be placed in the fluidic device, the target substance may be placed in the first well W1, and then a reaction reagent for detecting the target molecule may be placed in the first well W1 of the fluidic device 100. Examples of reaction reagents include buffer substances, enzymes, substrates, antibodies, and antibody fragments.
  • the enzyme is selected according to the content of the biochemical reaction in order to perform a biochemical reaction such as an enzyme reaction on a template nucleic acid related to the target substance M1.
  • the biochemical reaction on the template nucleic acid is, for example, a reaction in which signal amplification occurs under conditions in which the template nucleic acid is present.
  • an enzyme may be bound to an antibody and detected by an enzyme reaction.
  • the reaction reagent detection enzyme
  • the reaction reagent may be HRP, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, etc.
  • the reaction reagent is selected according to the detection reaction to be adopted.
  • Specific detection reactions include the Invasive Cleavage Assay (ICA) method, the Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) method (registered trademark), the 5' ⁇ 3' nuclease method (TaqMan (registered trademark) method), and the fluorescent probe method.
  • ICA Invasive Cleavage Assay
  • LAMP Loop-Mediated Isothermal Amplification
  • TaqMan registered trademark
  • fluorescent probe method the fluorescent probe method.
  • the sample may contain a surfactant.
  • a surfactant When the sample contains a surfactant, it becomes easier to form droplets in the second well.
  • the sample when the sample contains a surfactant, it becomes easier to replace the liquid in the fluidic device when sealing the first well and the second well using the method described below.
  • sodium dodecyl sulfate sodium dodecyl sulfate
  • Nonidet P-40 also known as octylphenoxypoly(ethyleneoxy)ethanol
  • Tween 20 also known as polyoxyethylene sorbitan monolaurate
  • the concentration of the surfactant is preferably 0.0011 g/L or more and 55.5 g/L or less (0.0001 to 5% by volume [v/v]) relative to the total volume of the sample, more preferably 0.0111 g/L or more and 22.2 g/L or less (0.001 to 2% by volume), and even more preferably 0.111 g/L or more and 11.1 g/L or less (0.01 to 1% by volume).
  • the surfactant concentration is 55.5 g/L or less relative to the total volume of the sample, there is little adverse effect on the reaction in the subsequent detection of the target substance M1.
  • the concentration of the sample is adjusted based on the volume of the fluidic device 100 used so that one target substance M1 is placed in each first well W1.
  • the concentration of the sample should be determined by conducting a preliminary experiment using the fluidic device 100.
  • step (2) Step of filling each of the first wells with the sample solution independently
  • the sample solution L having the adjusted concentration is filled independently into each of the first wells W1.
  • this step may be abbreviated as "step (2)”.
  • a sample solution L containing a detection reagent is injected into the internal space S from the injection port 121.
  • the sample solution L flows through the internal space S (also called the flow path FC)
  • the sample solution L fills the first well W1 that opens into the internal space S.
  • the sample solution L that has passed through the flow path FC is discharged from the outlet 122.
  • one target substance M1 is filled into one first well W1.
  • the concentration of the sample solution L is adjusted so that the number of target substances M1 injected into the internal space S is, for example, 1/10 or less of the total number of first wells W1.
  • one first well W1 is filled with one or less target substances M1, i.e., 0 or 1 target substance M1.
  • the means for introducing the target substance M1 into the first well W1 is not particularly limited, and an appropriate means can be selected according to the target substance M1 to be detected.
  • the target substance M1 can be allowed to settle in the fluidic device 100 (specifically, in the flow path FC) by its own weight, and then distributed to the first well W1.
  • a substance that captures the target substance M1 (also called a capture material) may be used, and the capture material may be bound to the target substance M1 that does not easily settle under its own weight and then delivered. Furthermore, the efficiency of introducing the target substance M1 into the second well W2 can be improved by fixing the capture material to the first well W1 in advance and allowing the capture material to capture the target substance M1 delivered together with the sample solution L.
  • the reaction of binding the capture product and the target substance M1 can be carried out at any time. For example, it may be carried out by contacting the target substance M1 with the capture product in a sample tube before preparing the sample solution.
  • the target substance M1 may be introduced into the first well W1, and the capture object and target substance M1 may be brought into contact in the first well W1.
  • the capture object is a substance capable of capturing the target substance M1.
  • the capture object may be, for example, a conjugate between a solid phase and a substance that specifically binds to the target substance M1.
  • the complement may also be a nucleic acid or a cell.
  • Antibody fragments include Fab, F(ab')2, Fab', single-chain antibodies (scFv), disulfide-stabilized antibodies (dsFv), dimeric V-domain fragments (diabodies), and peptides containing CDRs.
  • the antibodies may be monoclonal or polyclonal. They may also be commercially available antibodies.
  • the specific binding substance when the target substance M1 includes a glycan, the specific binding substance may be a lectin. In addition, when the target substance M1 includes a lipid membrane, the specific binding substance may be a substance that has binding properties to lipid membranes. Examples of substances that have binding properties to lipid membranes include hydrocarbons such as hexanediol and membrane proteins such as transmembrane proteins. Examples of membrane proteins include ⁇ -hemolysin.
  • the solid phase constituting the complement may be a particle, a membrane, a substrate, or the like.
  • the substance that specifically binds to the target substance M1 may be one type, or two or more types. For example, there may be three types, four types, or five or more types.
  • the particles are not particularly limited, and examples thereof include polymer particles, magnetic particles, and glass particles.
  • the particles are preferably surface-treated to avoid non-specific adsorption.
  • particles having functional groups such as carboxyl groups on the surface are preferable to immobilize specific binding substances. More specifically, products such as "Magnosphere LC300" manufactured by JSR Corporation can be used.
  • the method for immobilizing a specific binding substance on a solid phase is not particularly limited, and examples include physical adsorption, chemical binding, avidin-biotin binding, and binding between protein G or protein A and an antibody.
  • Physical adsorption methods include methods in which specific binding substances are fixed to the particle surface by hydrophobic or electrostatic interactions.
  • Chemical bonding methods include those that use crosslinking agents.
  • the specific binding substance can be immobilized on the particle surface by reacting the carboxyl groups of the specific binding substance with a crosslinking agent to form an active ester, and then reacting the hydroxyl groups with the ester groups.
  • the target is a nucleic acid
  • a nucleic acid that forms a complementary strand with the target may be used as the capture substance.
  • cells to which the virus can attach i.e., cells having a virus receptor
  • the capture substance may be used as the capture substance.
  • the lid material 12 is removed, and the sample solution L is scraped off at the height of the top 13a of the wall material 13, so that the sample solution L is filled independently into each of the first wells W1.
  • the target substance M1 distributed one by one to each of the first wells W1 becomes independent.
  • the target substance M1 filled in each first well W1 can be quantified. Specifically, if the target substance M1 is a nucleic acid, a detection reagent for detecting the target substance M1 can be added, and the concentration of the target substance M1 can be measured. Also, if the target substance M1 is a cell, the cell can be stained using a cell staining reagent, and the number of cells can be counted.
  • the cover material 12 is removed and the sample solution L is scraped off at the height of the top 13a of the wall material 13 to separate the target substance M1 for each of the first wells W1, but this is not limited to the above.
  • sealing liquid L2 may be sent from the inlet 121 to the flow path FC.
  • the sealing liquid L2 sent to the flow path FC flows over the first well W1 in the internal space S, and displaces the sample solution L that is not contained in the first well W1 among the sample solution L filled in the internal space S.
  • the sealing liquid L2 is preferably an oil-based solution, and more preferably an oil.
  • the oil may be a fluorine-based oil, a silicone-based oil, a hydrocarbon-based oil, or a mixture thereof.
  • FC-40 is a fluorinated aliphatic compound (fluorine-based oil) with a specific gravity of 1.85 g/mL at 25°C.
  • the sealing liquid L2 individually seals each of the multiple first wells W1, and the first wells W1 containing the sample solution L become independent reaction spaces.
  • the sample solution L replaced with the sealing liquid L2 and the excess sealing liquid L2 are discharged from the discharge port 122.
  • step (3) Step of Releasing Target Molecules from Target Substance
  • target molecules M2 are released from the target substance M1 distributed to each first well W1.
  • this step may be abbreviated as "step (3)".
  • the method for releasing the target molecule M2 from the target substance M1 is selected according to the type of target substance M1.
  • the target substance M1 is DNA or RNA
  • multiple fragments i.e., target molecules
  • the fluidic device may be heated to separate the individual nucleic acids through thermal denaturation.
  • the target substance M1 is a protein aggregate
  • the aggregate may be loosened by ultrasonic irradiation, an enzyme that breaks down proteins may be used, or a reagent that breaks down protein aggregates may be added.
  • the cell may be disrupted by ultrasonic waves, or the cell membrane may be disrupted by applying electrical stimulation.
  • Specific methods include the following: First, beads are placed in the first well W1.
  • the beads may be placed in the first well W1 in advance, or may be added to a solution containing cells and placed in the first well W1 together with the cells.
  • There are no limitations on the size of the beads as long as they do not impair the effects of the invention and are large enough to be placed in the first well W1.
  • the material of the beads may be silica or a magnetic material.
  • the size of the beads is preferably 50 nm to 500 ⁇ m, more preferably 100 nm to 100 ⁇ m, and even more preferably 500 nm to 10 ⁇ m.
  • the first well W1 is isolated in step (2) and the cells are cultured.
  • ultrasound is irradiated to the fluidic device 100. This causes the beads to vibrate within the first well W1, thereby breaking down the cell walls of the cells with the beads and releasing the contents of the cells into the first well W1.
  • the cell membrane may be dissolved using a reagent that dissolves the cell membrane.
  • a solution containing cells is mixed with a reagent (cell lysis solution) that dissolves cell membranes.
  • the solution containing cells and the cell lysis solution may be mixed before being injected into the fluidic device 100, or may be mixed within the fluidic device 100.
  • one method is to first inject the solution containing cells into the first well W1, and then inject the cell lysis solution into the first well W1.
  • Possible methods for adding the cell lysis solution to the first well W1 include adding it to the fluidic device 100 at a flow rate that does not cause the cells placed in the first well W1 to leave the first well W1, or fixing the cells in the first well W1.
  • the method of fixing the cells in the first well W1 may be a method of binding a cell capture substance to the first well W1, or a method of placing particles with a capture substance bound to them in the first well W1.
  • An example of a "capture substance” is an antibody that binds to cells.
  • surfactants or commercially available reagents can be used.
  • the first well W1 is isolated in step (2) and the cell membrane is dissolved by reacting for a certain period of time. This allows the contents of the cells to be released into the first well W1.
  • cells that are the target substance M1 may be cultured for a certain period of time in the first well W1, and secretions such as cytokines secreted from the cells may be detected as target molecules M2.
  • the released target molecules M2 are distributed to a portion of the multiple second wells W2 provided at the bottom of the first well W1. Usually, the amount of released target molecules M2 is very small compared to the volume of the first well W1. Therefore, in the second wells W2, each second well W2 is probabilistically filled with one or less target molecules M2, i.e., 0 or 1 target molecule M2.
  • step (4) Step of distributing target molecules to second wells one molecule at a time
  • the wall material 13 is removed, and the sample solution L is scraped off at the height of the upper surface 11a of the well plate 11, so that the sample solution L is filled into each of the second wells W2 in an independent manner.
  • the target molecules M2 distributed one by one to each second well W2 become independent.
  • this step may be abbreviated as "step (4)".
  • Methods for removing the wall material 13 include cutting the wall material 13, and forming the wall material 13 from a resin material and dissolving and removing the wall material 13. In these cases, it is preferable to form the wall material 13 from two parts: a ring-shaped first wall material provided at the outer edge of the well plate 11, and a second wall material provided on the inside of the well plate 11. When cutting the wall material 13, it is preferable to cut only the second wall material. Also, when dissolving the wall material 13, it is preferable to form the first wall material from a material different from the second wall material, and dissolve only the second wall material.
  • sample solution L may be filled into each second well W2 without removing the wall material 13.
  • the sample solution L may be evaporated to the height of the upper surface 11a of the well plate 11, so that the sample solution L is filled independently into each of the second wells W2.
  • the sample solution L1 may be removed by suction until the liquid level of the sample solution L1 reaches the height inside the first well W1. Then, sealing liquid L2 is sent from the injection port 121 to the flow path FC, so that the sample solution L can be filled into each of the second wells W2.
  • sealing liquid L2 may be sent from the inlet 121 to the flow path FC to replace the sample solution L in the first well W1 with the sealing liquid L2 and seal the second well W2 with the sealing liquid L2.
  • a computer simulation suggests that when the sealing liquid L2 is injected at a flow rate above a certain level, the sealing liquid L2 flows over the first well W1 in the internal space S as in FIG. 5, while when the flow rate is slowed down, the sealing liquid L2 sent from the inlet 121 passes through the inside of the first well W1 and can replace the sample solution L in the first well W1.
  • the flow rate is affected by the diameter of the first well W1, the type of sealing liquid L2, and the materials of the well plate 11 and wall material 13, so it is advisable to determine an appropriate flow rate through a preliminary experiment.
  • step (2) when the sealing liquid L2 is used to fill the sample solution L1 into each of the first wells W1 independently, a sealing liquid having a lower viscosity than the sealing liquid used in step (2) may be used in this step.
  • the sealing liquid used in performing step (2) flows over the first wells W1 in the internal space S, if a sealing liquid having a lower viscosity than the sealing liquid used in step (2) is sent into the flow path FC in this step, the sealing liquid will penetrate into the first wells W1, and the sample solution L in the first wells W1 can be replaced with the sealing liquid L2.
  • the sealing liquid is less likely to penetrate into the second well W2, making it easier to seal with the sealing liquid L2.
  • the well plate 11 when cutting and removing the wall material 13, by forming the well plate 11 from a material harder than the wall material 13, it is possible to accurately cut away only the wall material 13.
  • One possible combination of such materials is to form the well plate 11 from an inorganic material and the wall material 13 from a resin material, for example.
  • step (5) Step of detecting target molecules
  • the target molecules are reacted with the detection reagent to detect the target molecules.
  • this step may be abbreviated as "step (5)".
  • the detection reagent may be contained in the sample solution L in advance, or a liquid containing the detection reagent may be introduced into the fluidic device 100 from the outside at any stage.
  • One example of a detection method is to carry out a signal amplification reaction inside the sealed second well W2. Inside the second well W2, the signal derived from the detection reagent is amplified so that it can be detected.
  • Signals include fluorescence, color development, changes in potential, and changes in pH.
  • the signal amplification reaction may be, for example, a biochemical reaction, more specifically, an enzyme reaction.
  • the signal amplification reaction is an isothermal reaction in which a reagent solution containing an enzyme for signal amplification is contained in the second well W2, and the fluidic device 100 is maintained under constant temperature conditions at which the desired enzyme activity is obtained, for example, at least 60°C, preferably about 66°C, for a predetermined time, for example, at least 10 minutes, preferably about 15 minutes.
  • signal amplification reactions when the target molecule M2 is a nucleic acid, include ICA reactions such as the Invader (registered trademark) method, loop-mediated isothermal amplification (LAMP (registered trademark) method), 5' ⁇ 3' nuclease method (TaqMan (registered trademark) method), and fluorescent probe method. It is believed that these methods can cause a signal amplification reaction even if the solution contains the above-mentioned surfactant (which may be contained in the sample or cell lysate).
  • ICA reactions such as the Invader (registered trademark) method, loop-mediated isothermal amplification (LAMP (registered trademark) method), 5' ⁇ 3' nuclease method (TaqMan (registered trademark) method), and fluorescent probe method. It is believed that these methods can cause a signal amplification reaction even if the solution contains the above-mentioned surfactant (which may be contained in the sample or cell lysate).
  • the solution in the second well W2 may be replaced.
  • the target molecule M2 may be immobilized in the second well W2 and then a detection reagent may be added from the outside.
  • the target molecule may be fixed in the second well W2 by binding a substance that captures the target molecule M2 to the second well W2, or by adding magnetic particles bound to a compound that captures the target molecule M2 to the second well W2 and fixing the magnetic particles by magnetic force.
  • an ICA reaction As a signal amplification reaction, it is particularly preferable to use an ICA reaction.
  • signal amplification proceeds through a cycle of two reactions: (1) complementary binding between nucleic acids, and (2) recognition and cleavage of a triple-stranded structure by an enzyme.
  • the effect of reaction cycle inhibition by contaminants other than the target molecule M2 is small. Therefore, even if various components (e.g., contaminants) other than the target molecule M2 are present in the second well W2, the target molecule M2 can be detected with high accuracy by using an ICA reaction.
  • the sample solution L contains a reaction reagent and a template nucleic acid necessary for the ICA reaction.
  • the biochemical reaction in the reaction step is an ICA reaction
  • the fluorescent substance is released from the quenching substance, thereby emitting a predetermined fluorescent signal in response to the excitation light.
  • the target molecule M2 can also be detected by binding a substance that specifically binds to the target molecule M2 (also called a specific binding substance) to the target molecule M2 and detecting the bound specific binding substance.
  • a substance that specifically binds to the target molecule M2 also called a specific binding substance
  • the target molecule M2 is a protein
  • it can be detected using ELISA. More specifically, the detection may be performed by, for example, a sandwich ELISA using the principle of FRET.
  • a first specific binding substance e.g., an antibody
  • a second specific binding substance labeled with a second fluorescent substance also called an acceptor
  • the target molecule M2 e.g., an antigen
  • the target molecule M2 e.g., an antigen
  • the target molecule M2 is contacted with both the first specific binding substance and the second specific binding substance to form a complex.
  • the distance between the donor and acceptor decreases, and the fluorescence wavelength of the acceptor can be detected by irradiation with the excitation wavelength of the donor.
  • the specific binding substance can be labeled with a nucleic acid fragment, and the nucleic acid fragment can be detected by an ICA reaction.
  • the specific binding substance may be the same as the specific binding molecule for the structure described below, such as an antibody, an antibody fragment, or an aptamer.
  • the specific binding substance may be directly or indirectly labeled with an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP).
  • HRP horseradish peroxidase
  • a known appropriate method can be selected for observing the signal depending on the type of signal to be observed. For example, when performing bright-field observation, white light is irradiated perpendicularly onto the substrate on which the well array is provided. When observing fluorescent signals, excitation light corresponding to the fluorescent substance is irradiated into the well from the bottom side of the well, and the fluorescence emitted by the fluorescent substance is observed. An image of the observed well array, either in whole or in part, is photographed and saved, and the image is processed by a computer system.
  • the fluidic device 100 configured as described above makes it possible to detect target molecules released from a target substance in a solution with high sensitivity.
  • the above-described method for detecting a target molecule makes it possible to detect the target molecule with high accuracy.
  • step (1) is performed, but step (1) may be omitted. If step (1) is not performed, after filling the first wells with the sample solution, a first well W1 in which one target substance M1 is placed may be extracted from among the multiple first wells in step (3), and the subsequent steps (4) and (5) may be performed.
  • the target substance M1 is a cell
  • a possible method of visualization is to bring the cell into contact with a staining reagent in advance.
  • a possible method for visualization is to mix the target substance M1 with a known DNA staining reagent before injecting it into the fluidic device 100. After staining, only the nucleic acid may be recovered by a known method, and the recovered nucleic acid may be added to the sample solution L1 again, injected into the fluidic device 100, and placed in the first well W1.
  • a first well W1 in which one target substance M1 is placed may be extracted by performing an ICA reaction in the first well W1.
  • a fluorescent substance different from the fluorescent substance used in step (5) is added to a sample solution L1 containing nucleic acid, and the solution is then passed through a fluidic device.
  • a target substance M1 is placed in each first well W1, and an ICA reaction is then carried out in the first well W1.
  • the fluorescence intensity at any reaction time is measured to identify a first well W1 that contains one molecule of nucleic acid.
  • the number of illuminated wells is below a certain number (specifically, 1/10 of the total number of first wells), it can be assumed that most of the illuminated wells contain only one molecule of nucleic acid based on the Poisson distribution.
  • the nucleic acid After confirming that a single nucleic acid has been placed in the first well W1, the nucleic acid is fragmented by restriction enzyme treatment in the first well W1, and the fragmented DNA (i.e., the target molecule) is then detected in step (5).
  • the type of restriction enzyme so that a specific gene region is included one-to-one in the fragmented DNA, and detecting the "specific gene region" in step (5), copy number variation (CNV) can be analyzed.
  • a microscopic photograph of the first well W1 in which the target substance M1 is placed may be taken, and the captured image may be analyzed to extract the first well W1 in which one target substance M1 is placed.
  • FIGSecond embodiment 8 to 11 are explanatory diagrams of a fluidic device according to a second embodiment of the present invention.
  • components common to those in the first embodiment are given the same reference numerals, and detailed descriptions thereof will be omitted.
  • FIG. 8 is a schematic perspective view showing the fluidic device of this embodiment, and Fig. 9 is a cross-sectional view taken along line IX-IX in Fig. 8.
  • the fluidic device 200 has a well plate (also called a substrate) 21, a cover material 22, and a wall material 23.
  • the fluidic device 200 contains a sample in the internal space S, and is used as a reaction vessel for releasing target molecules from a target substance contained in the sample and for carrying out a detection reaction of the target molecules.
  • the fluidic device 200 has a plurality of first wells W1 surrounded by a well plate 21, a cover material 12 and a wall material 13, and a plurality of second wells W2 each provided on the upper surface 21a of the well plate 21 at the bottom of the first wells W1. The following explains each in order.
  • the well plate 21 is a plate-like member having a rectangular shape in a plan view.
  • the term "plan view” refers to a field of view from a vertical direction of the upper surface 21a of the well plate 21.
  • a plurality of wells (second wells) W2 are provided on the upper surface 21a of the well plate 21.
  • the material of the well plate 21 can be the same as that shown as the material of the well plate 11 in the first embodiment.
  • the wall material 23 is formed in a closed ring shape in a plan view, and is disposed on the upper surface 21 a of the well plate 21 .
  • the wall material 23 is sandwiched between the well plate 21 and the lid material 22, and is integrated to form the fluidic device 200.
  • the space surrounded by the well plate 21, the lid material 22, and the wall material 23 is the internal space S in which a liquid sample is contained.
  • the wall material 23 has a side wall 231 provided on the outer edge of the well plate 21 and an internal partition wall 232 provided on the inner periphery of the well plate 21. It functions as a wall surface of the internal space S, and also functions as a spacer between the well plate 21 and the lid material 22.
  • the space surrounded by the well plate 21, the wall material 23 (side wall 231 and internal partition 232), and the lid material 22 is the internal space S, which is the first well W1.
  • the first well W1 is a rectangular space in a plan view. All of the multiple first wells W1 extend in the same direction.
  • the material for the wall material 23 can be the same as that for the well plate 21 described above.
  • the lid member 22 has the same contour shape as the well plate 21 in a plan view.
  • the lid member 22 faces the well plate 21 and contacts the wall member 23.
  • the lid material 22 has multiple through holes that penetrate in the thickness direction.
  • the multiple through holes are provided at one end and the other end of each first well W1.
  • One of the through holes for the first well W1 is an inlet 221 used to inject liquid into the internal space S of the fluidic device 200, and the other through hole is an outlet 222 used to discharge liquid from the internal space S.
  • the inlet 221, the internal space S, and the outlet 222 are connected in this order, and together they form a flow path FC.
  • a liquid is appropriately caused to flow through the flow path FC, and a detection reaction for the target substance is carried out.
  • a cylindrical injection port 225 is provided on the upper surface 22a of the lid 22, surrounding the injection port 221.
  • the injection port 225 is connected to the injection port 221.
  • the injection port 225 is used to connect a syringe, for example, when filling the internal space with a liquid using a syringe filled with the liquid.
  • a cylindrical discharge port 226 is provided on the upper surface 22a of the lid 22, surrounding the periphery of the discharge outlet 222.
  • the discharge port 226 is connected to the discharge outlet 222.
  • the discharge port 226 is used, for example, to connect a tube through which the liquid flows when the liquid is extracted from the internal space S.
  • the injection ports 225 of adjacent first wells W1 are adjacent to each other and are arranged in two rows and five columns along the arrangement of the first wells W1.
  • the material of the lid material 22 can be any of the materials exemplified as the material of the well plate 21 described above.
  • the material of the lid material 22 may be the same as the material of the well plate 21, or may be different.
  • the sample solution L that has passed through the flow path FC is discharged from the outlet 222.
  • target molecules (not shown) are released from the target substance in the first well W1.
  • Each second well W2 is filled with one or less of the released target molecules, i.e., 0 or 1.
  • sealing liquid L2 is sent from the injection port 221 to the flow path FC.
  • the sealing liquid L2 sent to the flow path FC flows in the planar direction of the upper surface 11a in the internal space S, and displaces the sample solution L sent to the flow path FC that is not contained in the second well W2.
  • the sealing liquid L2 individually seals each of the multiple second wells W2, and the second wells W2 containing the sample solution L become independent reaction spaces.
  • excess sealing liquid L2 is discharged from the discharge port 222.
  • a detection reaction for the target molecule is carried out in the second well W2.
  • the fluidic device 200 configured as described above makes it possible to detect target molecules released from a target substance in a solution with high sensitivity.
  • the above-described method for detecting a target molecule makes it possible to detect the target molecule with high accuracy.
  • the target molecule detection method in this embodiment is a method for detecting a target molecule using a fluidic device equipped with a well, and includes the steps of: containing in the well a reaction solution of a target molecule, alkaline phosphatase immobilized on a conjugate that binds to the target molecule, and a substrate that visually changes when dephosphorylated by the alkaline phosphatase; and visualizing and detecting the presence of the target molecule contained in the well using a dephosphorylation reaction of the substrate by the alkaline phosphatase in the well, and at the start of the step of visualizing and detecting the presence of the target molecule, the concentration of the substrate in the reaction solution contained in the well is 80 ⁇ mol/L or more and 800 ⁇ mol/L or less.
  • the present embodiment provides a method for detecting a target molecule using a fluidic device having a well, the method including the steps of: placing a target molecule in the well; placing alkaline phosphatase in the well; placing a substrate for the alkaline phosphatase in the well; and detecting the target molecule in the well using the alkaline phosphatase and the substrate in the well.
  • the concentration of the alkaline phosphatase substrate added to the well within an appropriate range, it is possible to suppress false positive reactions resulting from autolysis caused by the excitation light of the fluorescent microscope.
  • the steps of placing the target molecule in the well, placing the alkaline phosphatase in the well, and placing the alkaline phosphatase substrate in the well may be performed simultaneously or separately, and the target molecule, alkaline phosphatase, and substrate may be added to the well in a single solution.
  • the “single solution” corresponds to the "reaction liquid” in this embodiment.
  • the fluidic device used in the method of this embodiment may be the fluidic device disclosed in the first embodiment. Detection of target molecules will be described below using the fluidic device 100 shown in Figures 1 and 2 as an example.
  • the detection method in this embodiment involves placing a liquid containing alkaline phosphatase and its substrate, FDP (fluorescein diphosphate), in the second well W2 and observing the fluidic device 100 with a fluorescence microscope.
  • FDP fluorescein diphosphate
  • the sample solution L the concentration of which is adjusted in the same manner as in the first embodiment, is introduced into the internal space S (first well W1) from the inlet 121 of the fluidic device 100.
  • the sample solution L is as described in the first embodiment, so a description thereof will be omitted.
  • the sample solution L that has passed through the flow path FC is discharged from the outlet 122.
  • target molecules (not shown) are released from the target substance in the first well W1.
  • the number of target molecules introduced into one second well W2 is not particularly limited, but preferably one or less, i.e., 0 or 1 target molecule, is introduced into one second well W2. This allows detection of target molecules one by one, making digital measurement possible. It is not necessary to introduce target molecules into all of the second wells W2.
  • the reaction reagents in this embodiment include a buffer substance, alkaline phosphatase as an example of an enzyme, a substrate, an antibody, and an antibody fragment.
  • alkaline phosphatase is referred to as "ALP.”
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the antibody may be full-length, or may be partially deleted by enzyme treatment or the like.
  • ALP, DNA, etc. may be bound to the antibody.
  • ALP is an enzyme that hydrolyzes phosphate compounds such as phosphate monoesters, which serve as substrates, to release phosphate.
  • Types of substrates that can be used for ALP include, for example, FDP, pNPP (P-Nitrophenyl phosphate), and MFP (Monofluorophosphate).
  • FDP and MFP are non-fluorescent substances, but become fluorescent when dephosphorylated.
  • pNPP is a pale white substance, but has the property of turning yellow when dephosphorylated.
  • ALP dephosphorylated by ALP
  • visual changes or visualization are not limited to changes that can be seen with the naked eye, but may also be, for example, changes that can be seen when viewed under a microscope or when imaged using an image sensor.
  • the target molecules may be configured to settle in the fluidic device (specifically, in the flow path) due to their own weight and distributed to the second well W2. Also, a supplement may be used as described in the first embodiment.
  • the second well W2 may be washed prior to supplying ALP.
  • the ALP and FDP immobilized on a conjugate described in detail below may be supplied outside the fluidic device 100 into a container containing the particles and the target substance, respectively, or may be supplied into the fluidic device 100.
  • ALP is mixed with the target substance outside the fluidic device 100 or in the first well W1, it is necessary to wash away ALP that is not bound to the target molecule prior to supplying FDP. This makes it possible to prevent fluorescence emission in the second well W2 where no target molecule is present.
  • FDP is supplied after ALP that is not bound to target molecules has been removed.
  • the number of capture means for the target molecule may be one or more. For example, there may be three, four, or five or more types.
  • the surfactants listed in the first embodiment can be used.
  • the concentration of the surfactant is preferably 0.001% to 5% by volume, more preferably 0.01% to 1% by volume, and even more preferably 0.03% to 0.1% by volume, relative to the total volume of the reaction solution in the well at the start of the target molecule detection reaction. If the surfactant concentration is 1% by volume or less, it will have little effect on the subsequent reaction in the detection of the target molecule.
  • ALP Binding of ALP to target molecules
  • ALP is fixed to a conjugate that binds to the target molecule, and the ALP dephosphorylates (decomposes) FDP while bound to the target molecule via the conjugate, resulting in a fluorescent reaction. Therefore, the fact that a fluorescent reaction can be confirmed means that FDP and ALP have reacted, and can be considered indirect evidence of the presence of a target molecule bound to ALP.
  • Binding bodies that bind to target molecules include nucleic acids and antibodies.
  • the ALP may be immobilized on a nucleic acid that is complementary to the target nucleic acid and serves as a conjugate (i.e., for detection).
  • a protein can be bound to a nucleic acid complementary to the nucleic acid of a target molecule in advance, and then the nucleic acid complementary to the nucleic acid of the target molecule can be bound. Then, ALP can be bound to the target molecule by supplying ALP immobilized on an antibody (for detection) that binds to the protein.
  • ALP may be immobilized on an antibody that acts as a binder that binds to the target molecule.
  • the ALP added to the second well W2 can be reliably bound to the target molecule.
  • a covalent bond between an amino group and a carboxyl group may be used, or the ALP may be bound via biotin and streptavidin, or other reactions may be used to bind the ALP.
  • the timing for placing the conjugate with ALP immobilized thereon in the second well W2 may be after a sample solution L that may contain a target substance has been placed in the fluidic device 100 in advance to retain the target molecule in the second well W2, or it may be supplied to the second well W2 prior to the target substance. Alternatively, it may be mixed with the sample solution L that may contain the target substance outside the fluidic device 100 and then supplied to the fluidic device 100.
  • a washing solution for washing the second well W2 may be provided to the fluidic device 100.
  • the washing solution may contain, for example, a blocking component such as bovine serum albumin, a surfactant, a salt, a buffer solution, etc.
  • a blocking component such as bovine serum albumin, a surfactant, a salt, a buffer solution, etc.
  • the target molecule is distributed independently to each second well, one molecule at a time.
  • the fluorescence emitted from the degradation products of FDP is used to detect the target molecule.
  • FDP decomposes to produce degradation products without reacting with ALP a fluorescent reaction is observed similar to that described above. Since the confirmation of a fluorescent reaction is indirect evidence of the presence of the target molecule, in such cases the presence of the target molecule is mistakenly recognized, resulting in a "false positive.”
  • the inventors conducted extensive research on the idea that FDP may be photodecomposed by the excitation light used to confirm the fluorescent reaction, and that the resulting decomposition products may be the cause of false positives. As a result, they discovered that by appropriately controlling the concentration of FDP and setting it within a concentration range, it is possible to effectively suppress false positive reactions that are thought to be caused by the self-decomposition of FDP due to excitation light, and thus completed the invention.
  • the concentration of FDP is in the range of 80 ⁇ M ( ⁇ mol/L) to 800 ⁇ M, preferably in the range of 100 ⁇ M to 800 ⁇ M, and more preferably in the range of 200 ⁇ M to 600 ⁇ M.
  • a nucleic acid amplification reagent may be added to the reaction reagent, the nucleic acid may be amplified first, and then the nucleic acid may be detected using ALP and FDP.
  • the reaction may be carried out at room temperature or at 37°C with heating.
  • the reaction temperature is preferably 10°C to 50°C, more preferably 20°C to 40°C, and even more preferably 25°C to 37°C.
  • the reaction time is preferably 10 minutes to 2 hours, more preferably 20 minutes to 1 hour, and even more preferably 30 minutes to 50 minutes.
  • FDP is decomposed (dephosphorylated) by ALP in the second well W2 containing the target molecule.
  • excitation light of a specific wavelength is irradiated from a fluorescent microscope, fluorescence is detected in the well 141 in which FDP has been decomposed, and the target molecule is detected based on this characteristic.
  • One aspect of digital measurement using ALP makes it possible to easily detect target molecules when a sample contains multiple target molecules, for example when the target molecules are proteins.
  • One example is the following aspect.
  • a sample solution L containing a protein which is an example of a target molecule, is added to the fluidic device 100. At this time, it is preferable to capture the protein in the second well W2 using a capture substance.
  • a detection solution containing ALP immobilized on an antibody which is an example of a conjugate, is added to the fluidic device 100.
  • the solution is then left to stand for a certain period of time, allowing the detection antibody and ALP to bind to the target molecule.
  • a washing buffer is added to the fluidic device 100.
  • the number of washings may be one, five, or ten times. This makes it possible to remove excess conjugates that are not bound to the target molecule and the ALP bound to them, thereby suppressing false positive reactions.
  • reaction reagent containing FDP which is a substrate for ALP
  • each second well W2 is isolated.
  • ALP and FDP are contained and isolated in each second well W2, and then reacted at a certain temperature for a certain time to cause ALP to dephosphorylate FDP.
  • each second well W2 is observed under a fluorescent microscope and the number of second wells W2 that emit fluorescence is counted.
  • the number and concentration of the target protein molecules can be calculated from the counting results.
  • a protein which is an example of a target molecule
  • the following describes a case in which the process of capturing the protein and binding the ALP is performed outside the fluidic device 100.
  • particles with immobilized antibodies are added to a tube as capture substances, and then a solution containing proteins as target molecules is added.
  • a solution containing ALP fixed to the antibody for detection which is a conjugate, is added to the tube. This causes the target molecule to adhere to the capture on the particle, and the conjugate and ALP to adhere to the target molecule.
  • the particles to which the capture is fixed, the target molecule, the conjugate and ALP may be simultaneously put into the tube and mixed.
  • the solution is removed and an FDP reagent is added to the tube to suspend the particles. Thereafter, the solution and particles in the tube are supplied to the fluidic device 100. Instead of adding the FDP reagent to the tube, the particles may be added to the fluidic device 100 once, and then the FDP solution may be injected into the second well W2.
  • each second well W2 is separated. After that, it is left to stand at a constant temperature for a certain period of time to allow the ALP to react.
  • the number of wells that emit fluorescence is counted using excitation light under a fluorescence microscope. In this way, the number of target molecules can be digitally measured.
  • the above method can reduce false positives and improve the detection accuracy of target molecules.
  • the fluidic device used in the detection method of this embodiment may be any fluidic device other than the fluidic device disclosed in the first embodiment, as long as it has a well in which target molecules, etc. are contained, and its shape is not particularly limited.
  • a fluidic device 300 as an example includes a substrate 310 and a cover member 320 that covers the substrate 310.
  • the substrate 310 is formed using, for example, a resin.
  • the type of resin is not particularly limited, but it is preferable that the resin is resistant to the liquid L310 and the sealing liquid L2.
  • the signal to be detected is fluorescence, it is preferable that the resin has little autofluorescence.
  • the resin may be, but is not limited to, a cycloolefin polymer, a cycloolefin copolymer, silicone, polypropylene, polycarbonate, polystyrene, polyethylene, polyvinyl acetate, a fluororesin, an amorphous fluororesin, and the like.
  • the substrate 310 has a flat plate shape, and a well array 340 having a large number of wells 341 for containing samples, liquids, particles, etc. is formed on the upper surface 311 of the substrate 310.
  • Methods for forming wells using resin include injection molding, thermal imprinting, and optical imprinting.
  • the shape, dimensions, and arrangement of the wells 341 are not particularly limited, but it is preferable that one target molecule is introduced into one well 341. It is preferable that the wells 341 are microwells with a small volume. For example, the volume of one well 341 may be about 10 fL to 100 pL.
  • many wells 341 are configured to be of the same shape and size.
  • the same shape and size means that they have the same shape and capacity to the extent required for digital measurement, and variations within the range of manufacturing errors are acceptable.
  • the well shape can be the same as the second well W2 described in the first embodiment.
  • the diameter of the wells 341 may be, for example, about 1 to 100 ⁇ m.
  • the depth of the wells 341 may be, for example, about 1 to 100 ⁇ m.
  • the arrangement of the wells 341 is not particularly limited, and may be, for example, arranged in a triangular lattice pattern, a square lattice pattern, or randomly arranged.
  • the cover member 320 has a protrusion 321 that protrudes downward from its edge.
  • the protrusion 321 is provided in a ring shape that is the same as the contour shape of the substrate 310 in a plan view, and is in contact with the peripheral edge of the substrate 310. This forms a flow path 330 between the substrate 310 and the cover member 320.
  • the lower end of the protrusion 321 may be welded or glued to the substrate 310.
  • the flow path 330 functions as a path for delivering the sample solution L and sealing liquid L2 described below. That is, the sample solution L and sealing liquid L2 are introduced into the interior of the fluidic device 300 through the flow path 330.
  • the material of the cover member 320 is preferably a resin that emits little autofluorescence, and may be, for example, a thermoplastic resin such as a cycloolefin polymer or a cycloolefin copolymer.
  • the cover member 320 may be made of a material that does not transmit light of a wavelength detected during fluorescence observation of a signal and wavelengths in the vicinity of the wavelength, or may be made of a material that does not transmit light at all.
  • the cover member 320 may be made of a thermoplastic resin to which carbon, metal particles, or the like have been added.
  • the shape, structure, capacity, etc. of the flow path 330 are not particularly limited, but the height of the flow path 330 may be, for example, 100 ⁇ m or less.
  • the cover member 320 is formed with an inlet port 322 for supplying various liquids, particles, etc. to the flow path 330, and an outlet port 323 for discharging liquids, etc. from the flow path 330.
  • FIG. 15 is a schematic cross-sectional view of a fluid device 400 according to another preferred embodiment of the present invention.
  • the fluidic device 400 includes a substrate 310 and a wall member 410 extending upward from the edge of the upper surface 311 of the substrate 310.
  • the substrate 310 has a well array 340 formed thereon, which has a number of wells 341, similar to the fluidic device 300 shown in FIG. 12. In this way, even when using a fluidic device 400 in which the tops of the wells 341 are not covered, it is possible to detect target molecules.
  • a liquid containing ALP and its substrate FDP is placed in the well 341, and the opening of the well 341 is sealed with sealing liquid L2.
  • the fluidic device 300 or 400 is observed under a fluorescent microscope.
  • a sample solution L whose concentration has been adjusted in the same manner as in the first embodiment is introduced into the inlet port 322 of the fluidic device 300 and sent to the flow path 330.
  • the sample solution L that has passed through the flow path 330 is discharged from the discharge port 323.
  • the number of target molecules introduced into one well 341 is not particularly limited, but preferably one or less, i.e., 0 or 1 target molecule, is introduced into one well 341. This allows detection of target molecules one by one, making digital measurement possible. It is not necessary to introduce target molecules into all wells 341 of the well array 340.
  • the sample solution L is as described in this embodiment.
  • FIG. 13 is a schematic cross-sectional view showing the state in which sealing liquid L2 is supplied to the fluidic device 300 shown in FIG. 12, and FIG. 14 is a schematic cross-sectional view showing the state in which sealing liquid L2 has been supplied to the fluidic device shown in FIG. 12.
  • a sealing liquid L2 is supplied to the flow channel 330 through the introduction port 322. At this time, the sealing liquid L2 flows through the flow path 330 from the left side to the right side in the drawing as shown in FIG. 13, and when the flow path 330 is filled with the sealing liquid L2, it rises toward the discharge port 323.
  • the sealing liquid L2 is a liquid that can form droplets (also called microdroplets) by individually sealing the liquids introduced into the multiple wells 341 so that they do not mix with each other.
  • the sealing liquid L2 can be the one described in the first embodiment.
  • the sealing liquid L2 sent to the flow path 330 pushes away and replaces the sample solution L introduced into the flow path 330 that is not contained in the wells 341.
  • the sealing liquid L2 individually seals each of the multiple wells 341, and the wells 341 become independent reaction spaces (microcompartments 342).
  • Figure 14 shows a state in which all of the wells 341 of the well array 340 are sealed with sealing liquid L2, forming sealed wells (i.e., microcompartments) 342.
  • the sealing liquid L2 may contain a surfactant.
  • the surfactant include an ionic surfactant, a nonionic surfactant, and an amphoteric surfactant.
  • the inclusion of a surfactant in the sealing liquid is expected to have the effect of preventing the enzymes contained in the well 341 from coming into direct contact with the oil in the sealing liquid L2 and being inactivated. It is also expected to have the effect of preventing the target substance and reagent components necessary for the reaction from dissolving in the oil.
  • the well 341 is sealed with sealing liquid L2, and then a target substance bound to a particle such as a bead is added to the flow channel 330, it is expected that if the sealing liquid L2 contains a surfactant, it will be easier to introduce the particles into the well 341 even in the presence of oil.
  • Lipids that form lipid bilayers include, but are not limited to, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DOPG), and mixtures thereof.
  • DOPE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • DOPG 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol
  • the above method can reduce false positives and improve the detection accuracy of target molecules.
  • the depth of the first well W1 (the distance from the top surface of the well plate to the top of the wall material) was 30 ⁇ m.
  • the opening diameter (longer diameter) of the second well W2 was 10 ⁇ m, and the depth of the second well W2 was 15 ⁇ m.
  • the volume Vd of each second well W2 was 1100 fL.
  • the total volume of the second wells was approximately 20% of the total volume of the fluidic device.
  • Magnetic beads (hereinafter, magnetic beads) were used as a model of cells.
  • DNA was bound to the magnetic beads as a model of cytokines secreted from cells, and DNA that forms a complementary strand with the DNA was hybridized.
  • sample solution As sample solutions, solutions containing the following substances were prepared using water (AccuGENE Molecular Biology Grade Water (manufactured by LONZA)) as a solvent.
  • Detection oligo DNA 0.25 ⁇ mol/L Allele probe (Fasmac)
  • Detection oligo DNA 5 nmol/L Invader probe (Fasmac)
  • Fluorescent substrate 2 ⁇ mol/L 1-1Alexa488 (Japan Oligo Service Co., Ltd.)
  • Buffer substance 50 mmol/L Tris-HCl (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd., pH: 8.5) Salt: 20 mmol/L MgCl 2 (manufactured by SIGMA-ALDRICH)
  • Surfactant 0.05 mass% Tween 20 (manufactured by SIGMA-ALDRICH)
  • Detection enzyme 0.05 mg/ml Fen1 Simulation cell: Magnetic beads to which capture DNA is bound and complementary strand DNA (target
  • the model sample used as the simulated cell was made by binding DNA for DNA capture (Fasmac) to the above magnetic beads, the surface of which was modified with carboxyl groups, and hybridizing the target DNA (Fasmac).
  • sealing liquid oil (Fluorinert FC-40, manufactured by SIGMA-ALDRICH) was used.
  • reaction solution buffer: 0.1 mol/L MES buffer. pH 5.0. pH adjusted with NaOH solution. Then, 920 ⁇ L of reaction buffer was added.
  • the beads were washed with 1 ml of PBS-T using a magnetic stand (repeated three times).
  • PBS-T PBS solution containing 0.05% Tween 20
  • the fluidic device containing the above-mentioned mixed solution was heated at 50° C. for 30 seconds using a heater.
  • FC40 coupling liquid
  • the number of wells with a fluorescence intensity of 1000 or more was counted using a BZ analyzer (Keyence Corporation).
  • Example 2 Comparative Example (Blank Test) Except that the target DNA was not bound to the beads, the same procedure as in Example 1 was carried out. It was confirmed under a microscope that only one bead was present in the fluidic device for testing.
  • the number of second wells in which fluorescence was observed was 49 out of a total of 900,000 second wells.
  • the number of second wells in which fluorescence was observed was 24 out of a total of 900,000 second wells.
  • the number of wells in which DNA was detected was 25 (49-24).
  • the total volume of the second well is approximately 20% of the total volume of the input solution, so if we add in the DNA contained in the sample solution that was replaced with sealing liquid, we can estimate that 125 strands of DNA were bound to each bead.
  • a liquid containing FDP was placed inside a substrate 310 of a fluidic device 300 shown in FIG. 12 and numerous wells 341 formed on the upper surface of the substrate 310, which were then sealed with oil and allowed to stand for a certain period of time. The number of nonspecific reactions was counted by observing the wells with a fluorescent microscope.
  • a fluidic device having a structure as shown in FIG. 12 was manufactured.
  • a substrate 310 made of cycloolefin polymer having a well array 340 formed by injection molding and a cover member 320 made of cycloolefin polymer colored with carbon black were bonded by laser welding to manufacture a fluidic device.
  • the double-sided tape served as a convex portion 321, and the height of the flow channel 330 (the distance between the upper surface 311 of the substrate 310 and the surface of the cover member 320 facing the substrate 310) was 30 ⁇ m.
  • the cover member 320 had an inlet port 322 and an outlet port 323.
  • the diameter of the well 341 constituting the well array 340 was 10 ⁇ m, and the depth of the well 341 was 15 ⁇ m.
  • the volume Vd per well 341 was 1100 fL.
  • FDP solution was added to the fluidic device, filling the well array 340 with FDP reagent.
  • the composition of the FDP solution was pure water (AccuGENE Molecular Biology Grade Water (LONZA Corporation)), five types of FDP (model number: 11600 AAT (Bioquest Corporation)) at 50, 100, 200, 400, and 800 ⁇ M), 1 M DEA (pH 9.5) (model number: 099-03215 (WAKO Corporation)), 1 mM MgCl 2 (model number: M1028-100ML (Sigma Corporation)), and 0.05% [v/v] tween 20 (model number: P7949-100ML (Sigma Corporation)).
  • the system with an FDP concentration of 50 ⁇ M is a comparative example, and the systems with an FDP concentration of 100, 200, 400, and 800 ⁇ M are examples.
  • reaction The fluidic device 300 was allowed to stand at room temperature for 40 minutes. That is, in this example and the comparative example, the fluidic device 300 was allowed to stand in a state in which ALP, which is an enzyme that uses FDP as a substrate, was not added.
  • ALP which is an enzyme that uses FDP as a substrate
  • the above-mentioned suitable FDP concentration range refers to the suitable concentration range of FDP in the reaction solution in well 341 to which ALP, FDP, target substance, etc. have been added, when ALP is added to well 341 to carry out an enzyme reaction.
  • the above-mentioned concentration range suitable for suppressing false positives is not limited to FDP, but is also applicable when other substrates such as pNPP or MFP are used as the substrate for ALP in digital measurement.
  • pNPP substrates
  • MFP wells 341 in which a fluorescent reaction is observed can be counted as positive, just like ALP.
  • pNPP pNPP
  • wells 341 in which a yellow color is observed can be counted as positive.
  • the present invention provides a fluidic device that enables highly sensitive detection of target molecules released from a target substance in a solution. It also provides a method for detecting target molecules using such a fluidic device.

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Abstract

この流体デバイスは、基板と、基板上に設けられた壁材と、を備え、基板と壁材とで囲まれた複数の第１ウェルと、基板の上面であって、第１ウェルの底部にそれぞれ設けられた複数の第２ウェルと、を有する。

Description

流体デバイス及び標的分子の検出方法
　本発明は、流体デバイス及び標的分子の検出方法に関する。
　本願は、２０２２年１０月２０日に日本に出願された特願２０２２－１６８３４０及び２０２２年１１月１日に日本に出願された特願２０２２－１７５３８４号について優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　生体試料中の標的分子を定量的に検出することにより、疾患の早期発見や投薬の効果予測が行われている。例えば、標的分子がタンパク質である場合、定量は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等により行われている。また、標的分子が核酸である場合、定量はリアルタイムＰＣＲ法等により行われている。
　近年、疾患をより早期に発見する等の目的で、上述のような標的分子をより精度よく検出するニーズが高まっている。標的分子を精度よく検出する手法として、例えば、特許文献１、特許文献２及び非特許文献１には、多数の微小区画内で酵素反応を行い、単分子検出する技術が記載されている。これらの手法はデジタル計測と呼ばれている。
　デジタル計測では、試料溶液を極めて多数の微小区画を有する反応容器（流体デバイス）に充填し、各微少区画に試料溶液を分割する。そして、各微小区画からの信号を２値化し、試料溶液に含まれる標的分子が微少区画内に存在するか否かのみを判別（すなわち検出）して、標的分子の分子数を計測する。デジタル計測によれば、従来のＥＬＩＳＡやリアルタイムＰＣＲ法等と比較して、検出感度及び定量性を格段に向上させることができる。
特許第５５５１７９８号公報 特表２０１４－５０３８３１号公報
Kim S. H., et al., Large-scale femtoliter droplet array for digital counting of single biomolecules., Lab on a Chip, 12 (23), 4986-4991, 2012.
　デジタル計測技術では、溶液試料中に含まれる標的分子を微小区画に１分子ずつ分配し、標的分子が分配された微小区画の数を計測する。しかし、上述のように標的分子をより精度よく検出するニーズが高まっているなか、標的分子の発生源（つまり標的物質）に遡り、標的物質から放出される標的分子の量を検出し、定量することが求められている。例えば、従来のデジタル計測技術では、溶液試料に含まれる細胞（つまり標的物質）を高精度に検出することは可能であるが、さらに各細胞から分泌されるサイトカイン（つまり標的分子）を高精度に検出し定量することは困難である。また、疾患の診断及び創薬の分野等で用いられるデジタル計測において、標的物の検出にはより高い精度が求められている。
　本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであって、溶液中の標的分子を高感度で検出可能とする流体デバイスを提供することを目的とする。また、このような流体デバイスを用いた標的分子の検出方法を提供することを合わせて目的とする。
　上記の課題を解決するため、本発明の一態様は、以下の態様を包含する。
［１－１］基板と、前記基板上に設けられた壁材と、前記基板に対向し前記壁材に接する蓋材と、を備え、前記蓋材は、厚さ方向に貫通する注入口及び排出口を有し、前記壁材の頂部と前記蓋材との間には、流体が流れる流路が形成され、前記基板と前記壁材とで囲まれた複数の第１ウェルと、前記基板の上面であって、前記第１ウェルの底部にそれぞれ設けられた複数の第２ウェルと、を有する流体デバイス。
［１－２］前記蓋材は、前記壁材と着脱可能に設けられている［１－１］に記載の流体デバイス。
［１－３］前記第１ウェルの開口部の長径が１μｍ以上１ｃｍ以下である［１－１］又は［１－２］に記載の流体デバイス。
［１－４］前記第１ウェルのアスペクト比が０．００２以上３以下である［１－１］から［１－３］のいずれか１項に記載の流体デバイス。
［１－５］前記第２ウェルの開口部の長径が１ｎｍ以上１ｍｍ以下である［１－１］から［１－４］のいずれか１項に記載の流体デバイス。
［１－６］前記第２ウェルのアスペクト比が０．０５以上３以下である［１－１］から［１－５］のいずれか１項に記載の流体デバイス。
［１－７］［１－１］から［１－６］のいずれか１項に記載の流体デバイスを用いた標的分子の検出方法であって、標的物質を含む試料溶液を複数の前記第１ウェル毎に独立させて充填する工程と、複数の前記第１ウェルのうち、１つの前記標的物質が配置された第１ウェルにおいて前記標的物質から前記標的分子を放出させる工程と、前記標的分子を前記第２ウェル毎に独立させて１分子ずつ分配する工程と、前記標的分子と検出試薬との反応を生じさせ、前記標的分子を検出する工程と、を有する標的分子の検出方法。
［１－８］前記充填する工程では、前記流体デバイスに封止液を導入し、前記封止液によって前記試料溶液を前記第１ウェルに封止する［１－７］に記載の標的分子の検出方法。
［１－９］前記封止液はフッ素系オイルである［１－８］に記載の標的分子の検出方法。
［１－１０］前記試料溶液は界面活性剤を含む［１－７］から［１－９］のいずれか１項に記載の標的分子の検出方法。
［１－１１］前記充填する工程に先立ち、前記流体デバイスの容積に基づいて、前記第１ウェル毎に１つの前記標的物質が配置される濃度に調整された前記試料溶液を得る工程を有する［１－７］から［１－１０］のいずれか１項に記載の標的分子の検出方法。
　もう一つの側面として、本発明の一態様は、以下の態様を包含する。
［２－１］ウェルを備える流体デバイスを用いた標的分子の検出方法において、前記ウェル内に、標的分子と、前記標的分子に結合する結合体に固定された状態のアルカリホスファターゼと、前記アルカリホスファターゼにより脱リン酸化されることで視覚的に変化する基質との反応液を収容する工程と、
　前記ウェル内で前記アルカリホスファターゼによる前記基質の脱リン酸化反応を用いて、前記ウェル内に収容された標的分子の存在を視覚化して検出する工程とを備え、
　前記標的分子の存在を視覚化して検出する工程の開始時において、前記ウェルに収容された反応液における前記基質の濃度が８０μｍｏｌ／Ｌ以上８００μｍｏｌ／Ｌ以下である、標的分子の検出方法。
［２－２］前記反応液に界面活性剤が含まれている、［２－１］に記載の検出方法。
［２－３］前記反応液が収容された前記ウェルをオイルで封止する工程を含む、［２－１］又は［２－２］に記載の検出方法。
［２－４］前記結合体が抗体である、［２－１］から［２－３］のいずれか１項に記載の検出方法。
［２－５］前記標的分子を前記ウェル内に収容する工程において、前記標的分子を補足する捕捉手段が固定された粒子を用いて前記標的分子を前記ウェル内に保持する、［２－１］から［２－４］のいずれか１項に記載の検出方法。
［２－６］前記反応液に緩衝液が含まれる、［２－１］から［２－５］のいずれか１項に記載の検出方法。
　本発明によれば、溶液中の標的分子を高感度で検出可能とする流体デバイスを提供することができる。また、このような流体デバイスを用いた標的分子の検出方法を提供することができる。
図１は、第１実施形態の流体デバイスを示す概略斜視図である。 図２は、図１の線分ＩＩ－ＩＩにおける矢視断面図である。 図３は、第１実施形態の標的分子の検出方法の説明図である。 図４は、第１実施形態の標的分子の検出方法の説明図である。 図５は、第１実施形態の標的分子の検出方法の説明図である。 図６は、第１実施形態の標的分子の検出方法の説明図である。 図７は、第１実施形態の標的分子の検出方法の説明図である。 図８は、第２実施形態の流体デバイスを示す概略斜視図である。 図９は、図８の線分ＩＸ－ＩＸにおける矢視断面図である。 図１０は、第２実施形態の標的分子の検出方法の説明図である。 図１１は、第２実施形態の標的分子の検出方法の説明図である。 図１２は、本発明の他の実施形態にかかる流体デバイスに液体が供給される様子を示す模式断面図である。 図１３は、図１２に示された流体デバイスに封止液が供給される様子を示す模式断面図である。 図１４は、図１２に示された流体デバイスに封止液が供給された状態を示す模式断面図である。 図１５は、本発明のもう一つの実施形態にかかる流体デバイスの模式断面図である。 図１６は、基質濃度ごとの擬陽性反応が見られたウェル数を示す棒グラフである。
［第１実施形態］
　以下、場合により図面を参照しつつ、第１実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
［流体デバイス］
　図１は、本実施形態の流体デバイスを示す概略斜視図である。図２は、図１の線分ＩＩ－ＩＩにおける矢視断面図である。
　流体デバイス１００は、ウェルプレート（基板ともいう）１１、蓋材１２、壁材１３を有する。流体デバイス１００は、内部空間Ｓに試料を収容し、試料に含まれる標的物質から標的分子を放出させると共に、標的分子の検出反応を行う反応容器として用いられる。
　流体デバイス１００は、ウェルプレート１１と壁材１３とで囲まれた複数の第１ウェルＷ１と、ウェルプレート１１の上面１１ａであって、第１ウェルＷ１の底部にそれぞれ設けられた複数の第２ウェルＷ２と、を有する。
　以下、順に説明する。
（ウェルプレート）
　ウェルプレート１１は、平面視矩形を呈する板状部材である。「平面視」とは、ウェルプレートの上面１１ａの法線方向からの視野を指す。ウェルプレート１１の上面１１ａには、複数のウェル（第２ウェル、マイクロウェルともいう）Ｗ２が設けられている。
　第２ウェルＷ２は、ウェルプレート１１の上面１１ａに設けられた凹部であり、上面１１ａに開口している。第２ウェルＷ２とは、上記凹部と、上面１１ａと平行であって上面１１ａに接する仮想平面とに囲まれた空間を指す。
　第２ウェルＷ２は、内部空間Ｓに収容した試料を内部に収容し、試料に含まれる標的分子と、検出試薬との反応場として機能する。
　ウェルプレート１１の材料は、電磁波透過性を有するものであってもよく、有しないものであってもよい。ここで、透過性判断の対象である電磁波としては、Ｘ線、紫外線、可視光線及び赤外線等が挙げられる。ウェルプレート１１が電磁波透過性を有する場合、ウェルプレート１１を有する流体デバイス１００で行った実験結果を解析するために、電磁波を利用することが可能になる。例えば、電磁波を照射した結果生じる蛍光又は燐光等をウェルプレート１１側から計測することができる。なお、「電磁波透過性」とは、電波・光・Ｘ線・ガンマ線など、種々の波長の電磁波を透過可能である性質を意味する。
　電磁波透過性を有する材料としては、例えば、ガラス及び樹脂等が挙げられる。樹脂としては、例えば、ＡＢＳ樹脂、ポリカーボネート、ＣＯＣ（シクロオレフィンコポリマー）、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）、アクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＥＮ（ポリエチレンナフタレート）、ＰＣ（ポリカーボネート）、シリコーン樹脂、フッ素樹脂、及びアモルファスフッ素樹脂等が挙げられる。これらの樹脂は各種添加剤を含んでいてもよく、複数の樹脂が混合されたポリマーアロイであってもよい。
　電磁波透過性を有する材料は、自家蛍光を実質的に有しないことが好ましい。自家蛍光を実質的に有しないとは、材料が、試料検出に使用する波長の自家蛍光を全く有しないか、有していても試料検出に影響を与えないほど微弱であることを意味する。例えば、検出対象の蛍光に比べて１／２以下、１／１０以下程度の自家蛍光であれば、試料検出に影響を与えないほど微弱であるといえる。このような材料を用いてウェルプレート１１を形成すると、電磁波を利用した試料検出において、検出の感度を高めることができる。
　電磁波透過性を有し、かつ自家蛍光を発しない材料としては、例えば、石英ガラスが挙げられる。自家蛍光が微弱であり、電磁波を用いた試料検出に支障がない素材としては、低蛍光ガラス、アクリル樹脂、ＣＯＣ（シクロオレフィンコポリマー）及びＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）等が挙げられる。
　ウェルプレート１１の厚みは、適宜決定することが出来る。ウェルプレート１１側から蛍光顕微鏡を用いて蛍光を観察する場合には、ウェルプレート１１の厚みは、例えば５ｍｍ以下であってもよく、２ｍｍ以下であってもよく、１．６ｍｍ以下であってもよい。
　ウェルプレート１１は、上記材料のみを用いた単層の構成であってもよく、複数の材料の積層体であってもよい。積層体を加工してウェルプレート１１を形成する場合、第２ウェルＷ２を有する層と、当該層を支持する層とは別の材料であってもよい。例えば、基板の上にフッ素樹脂を積層した積層体をウェルプレート１１の材料とし、当該フッ素樹脂の層を加工してウェルアレイを形成してもよい。フッ素樹脂としては、例えばＣＹＴＯＰ（登録商標）（旭硝子）等を用いることができる。
（マイクロウェル）
　第２ウェルＷ２の形状は、種々の形状を採用することができる。第２ウェルＷ２の形状として、例えば円筒形、楕円筒形及び多角筒形等の筒形；及び円錐形、角錐形等の錘形、円錐台及び角錐台等の錘台形を例示できる。第２ウェルＷ２が錐形又は錘台形の場合、開口径がウェルの深さ方向に漸減する形状であるとよい。
　第２ウェルＷ２の底部は、平坦であってもよく、曲面（凸面や凹面）であってもよい。
　１つの第２ウェルＷ２の容積は、１０ｆＬ～１０００ｐＬ程度であってもよい。流体デバイス１００では、同形同大の複数の第２ウェルＷ２がウェルアレイＷＡを構成している。なお、「同形同大」とは、流体デバイス１００を用いてデジタル計測を行うために要求される程度に同一の形状で同一の容量であればよく、製造上の誤差程度のばらつきであれば許容される。
　第２ウェルＷ２の平面視形状が円形の場合、第２ウェルＷ２の開口部の長径は、例えば１ｎｍ以上１ｍｍ以下であってもよい。なお「第２ウェルＷ２の長径」とは、第２ウェルＷ２の開口部を平面視したときに、開口部に外接する最小の矩形が有する長辺の長さを指す。
　第２ウェルＷ２のアスペクト比は、０．０５以上３以下であることが好ましい。なお、「第２ウェルＷ２のアスペクト比」とは、第２ウェルＷ２の深さと、第２ウェルＷ２の長径との比（［第２ウェルＷ２の深さ］／［第２ウェルＷ２の長径］）を指す。
　「第２ウェルＷ２の深さ」とは、上述の「上面１１ａと平行であって上面１１ａに接する仮想平面」から第２ウェルＷ２の最下部までの距離を指す。
　複数の第２ウェルＷ２の配置は、特に制限されない。複数の第２ウェルＷ２は、例えば三角格子状に整列していてもよく、正方格子状も整列していてもよく、不規則に配置されていてもよい。
　上述のウェルプレート１１は、公知の射出成形、マイクロインプリンティング技術やナノインプリンティング技術を用いて製造することができる。また、ウェルプレート１１は、公知のフォトリソグラフィ技術を用い、エッチングで第２ウェルＷ２を形成することで製造することもできる。
（壁材）
　壁材１３は、平面視で閉環状に形成され、ウェルプレート１１の上面１１ａに配置されている。
　壁材１３は、ウェルプレート１１と蓋材１２とに挟持され、一体となることで流体デバイス１００を形成する。ウェルプレート１１と蓋材１２と壁材１３とで囲まれた空間は、液状の試料が収容される内部空間Ｓである。
　壁材１３は、内部空間Ｓの壁面として機能する上、ウェルプレート１１と蓋材１２との間のスペーサとして機能する。
　内部空間Ｓは、壁材１３によって区画され、複数の第１ウェルＷ１が形成されている。第１ウェルＷ１とは、ウェルプレート１１と、壁材１３と、壁材１３の頂部１３ａと平行であって頂部１３ａに接する仮想平面と、で囲まれた空間を指す。
　流体デバイス１００は、第１ウェルＷ１を１０～１００００個有する。また、第１ウェルＷ１の底面の大きさには限定はないが、上述した第２ウェルＷ２を１０～１００００個収容可能な大きさが望ましい。第１ウェルＷ１の開口部の長径は、１μｍ以上１ｃｍ以下が好ましい。なお「第１ウェルＷ１の長径」とは、第１ウェルＷ１の開口部を平面視したときに、開口部に外接する最小の矩形が有する長辺の長さを指す。
　第１ウェルＷ１のアスペクト比は、０．００２以上３以下であることが好ましい。なお、「第１ウェルＷ１のアスペクト比」とは、第１ウェルＷ１の深さと、第１ウェルＷ１の長径との比（［第１ウェルＷ１の深さ］／［第１ウェルＷ１の長径］）を指す。
　「第１ウェルＷ１の深さ」とは、上述の「壁材１３の頂部１３ａと平行であって頂部１３ａに接する仮想平面」から「上面１１ａと平行であって上面１１ａに接する仮想平面」までの距離を指す。
　１つの第１ウェルＷ１の容積は、１００ｆＬ～１μＬ程度であってもよい。
　壁材１３の材料は、上述したウェルプレート１１と同じ材料を採用することができる。このような材料で形成された壁材１３は、接着剤による接着；又は熱溶着、超音波溶着及びレーザー溶着等による溶着により、ウェルプレート１１及び蓋材１２と一体化することができる。
　なお、壁材１３は、ウェルプレート１１と一体的に形成され、ウェルプレート１１の一部を構成していてもよい。同様に、壁材１３は、蓋材１２と一体的に形成され、蓋材１２の一部を構成していてもよい。
（蓋材）
　蓋材１２は、平面視でウェルプレート１１と同じ輪郭形状を呈している。蓋材１２は、ウェルプレート１１と対向し、壁材１３に接する。
　蓋材１２には、厚さ方向に貫通する２つの貫通孔を有する。２つの貫通孔は、蓋材１２の一端側と他端側とにそれぞれ設けられている。一方の貫通孔は、流体デバイス１００の内部空間Ｓに液状物を注入する際に用いる注入口１２１であり、他方の貫通孔は、内部空間Ｓから液状物を排出させる際に用いる排出口１２２である。
　ここで、「液状物」には、液状の試料の他、検出試薬や封止液も該当する。
　注入口１２１、内部空間Ｓ及び排出口１２２は、この順に連通し、全体として流路ＦＣを形成している。流体デバイス１００では、流路ＦＣに液状物を適宜流動させて、標的物質の検出反応を行う。平面視において、注入口１２１と排出口１２２との間に、複数の第２ウェルＷ２が配置されている。
　蓋材１２の上面１２ａには、注入口１２１の周囲を囲む筒状の注入ポート１２５が設けられている。注入ポート１２５は、注入口１２１と連通している。注入ポート１２５は、例えば、液状物を充填したシリンジを用いて内部空間に液状物を充填する際、シリンジの接続に用いる。
　同様に、蓋材１２の上面１２ａには、排出口１２２の周囲を囲む筒状の排出ポート１２６が設けられている。排出ポート１２６は、排出口１２２と連通している。排出ポート１２６は、例えば、内部空間Ｓから液状物を抜き出す際に、液状物が流動するチューブの接続に用いる。
　蓋材１２の下面１２ｂの外縁部には、凸状部１２９が設けられている。蓋材１２は、凸状部１２９を介して壁材１３の外縁部と接続している。
　蓋材１２の材料は、上述したウェルプレート１１の材料として例示した材料を採用することができる。蓋材１２の材料は、ウェルプレート１１の材料と同じであってもよく、異なっていてもよい。
　蓋材１２の材料は、電磁波透過性を有していてもよく、電磁波透過性を有していなくてもよい。
　上述の蓋材１２は、公知の射出成形にて製造することができる。
　なお、流体デバイス１００は、蓋材１２を有していなくてもよい。
＜標的分子の検出方法＞
　図３～６は、本実施形態の標的分子の検出方法の説明図である。本実施形態の標的分子の検出方法は、以下の工程を含む。
（１）標的物質を含む液状の試料の濃度を調整し、試料溶液を得る工程
（２）試料溶液を複数の第１ウェル毎に独立させて充填する工程
（３）標的物質から標的分子を放出させる工程
（４）標的分子を第２ウェル毎に独立させて１分子ずつ分配する工程
（５）標的分子と検出試薬との反応を生じさせ、標的分子を検出する工程
（１）標的物質を含む液状の試料の濃度を調整し、試料溶液を得る工程
　まず、標的物質を含む液状の試料の濃度を調整し、試料溶液Ｌを得る。以下、本工程を「工程（１）」と略記することがある。
　試料は、例えば、生体試料又は環境試料を含む。生体試料としては、特に制限されず、血清、血漿、尿、及び細胞培養液等が挙げられる。また、環境試料としては、例えば、河川の水及び工場排水等が挙げられる。
　生体試料及び環境試料は、検出対象である標的分子を放出する標的物質Ｍ１を含む。標的物質Ｍ１としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ウイルス、細胞、及び特定化合物等が挙げられる。ＲＮＡとしては、ｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡ等が挙げられる。また、細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、植物細胞、及び昆虫細胞等が挙げられる。
　試料は、標的物質Ｍ１を検出する反応試薬を含んでいてもよい。すなわち、チューブなどで生体試料又は環境試料とその中に含まれる標的分子を検出する反応試薬を混ぜて、試料溶液Ｌとして流体デバイス１００の第１ウェルＷ１に収容してもよい。又は、反応試薬を含まない試料溶液Ｌを流体デバイスに入れて、第１ウェルＷ１内に標的物質を収容してから改めて、標的分子を検出する反応試薬を流体デバイス１００の第１ウェルＷ１内に収容してもよい。反応試薬としては、緩衝物質、酵素、基質、抗体、及び抗体断片等が挙げられる。酵素は、例えば標的物質Ｍ１が核酸である場合には、標的物質Ｍ１に関連する鋳型核酸に対する酵素反応等の生化学的反応を行うために、生化学的反応の内容に対応して選択される。鋳型核酸に対する生化学的反応は、例えば、鋳型核酸が存在する条件下でシグナル増幅が起こるような反応である。また、標的物質Ｍ１がタンパク質である場合、抗体に酵素を結合させ、酵素反応で検出してもよい。この場合、反応試薬（検出酵素）は、ＨＲＰやＡｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、βガラクトシダーゼなどを使用してもよい。
　反応試薬は、採用する検出反応に応じて選択される。具体的な検出反応としては、Ｉｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）法、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）法（商標登録）、５’→３’ヌクレアーゼ法（ＴａｑＭａｎ（登録商標）法）、及び蛍光プローブ法等が挙げられる。
　試料は、界面活性剤を含んでいてもよい。試料が界面活性剤を含むことにより、第２ウェル内での液滴形成がしやすくなる。また、試料に界面活性剤が含まれていると、後述する方法で第１ウェル及び第２ウェルを封止する際に、流体デバイス内の液を置換しやすくなる。
　界面活性剤としては、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（ポリエチレングリコールモノ－４－オクチルフェニルエーテル（ｎ＝約１０）ともいう）、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ－４０（オクチルフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノールともいう）及びＴｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラートともいう）等が挙げられる。
　界面活性剤の濃度は、試料の総体積に対し０．００１１ｇ／Ｌ以上５５．５ｇ／Ｌ以下（０．０００１～５体積比％［ｖ／ｖ］）であることが好ましく、０．０１１１ｇ／Ｌ以上２２．２ｇ／Ｌ以下（０．００１～２体積比％）であることがより好ましく、０．１１１ｇ／Ｌ以上１１．１ｇ／Ｌ以下（０．０１～１体積比％）であることがさらに好ましい。
　界面活性剤の濃度が試料の総体積に対し５５．５ｇ／Ｌ以下であると、後に行われる標的物質Ｍ１の検出における反応への悪影響が少ない。
　試料の濃度は、用いる流体デバイス１００の容積に基づいて、第１ウェルＷ１毎に１個の標的物質Ｍ１が配置される濃度に調整する。試料の濃度は、流体デバイス１００を用いて、予備実験を行い、決定するとよい。
（２）試料溶液を複数の第１ウェル毎に独立させて充填する工程
　次いで、濃度を調整した試料溶液Ｌを複数の第１ウェルＷ１毎に独立させて充填する。以下、本工程を「工程（２）」と略記することがある。
　まず、図３に示すように、注入口１２１から内部空間Ｓに、検出試薬を含む試料溶液Ｌを注入する。試料溶液Ｌが内部空間Ｓ（流路ＦＣともいう）を流動すると、内部空間Ｓに開口している第１ウェルＷ１に試料溶液Ｌが充填される。
　内部空間Ｓ及び全ての第１ウェルＷ１が試料溶液Ｌで充填された後、流路ＦＣを通過した試料溶液Ｌは、排出口１２２から排出される。
　このとき、試料溶液Ｌの濃度をあらかじめ調整しておくことにより、１つの第１ウェルＷ１に１つの標的物質Ｍ１が充填される。具体的には、内部空間Ｓの容積（内部空間Ｓに注入される試料溶液Ｌの体積）と、第１ウェルＷ１の総数とが既知の場合、内部空間Ｓに注入される標的物質Ｍ１の数が、例えば第１ウェルＷ１の総数の１／１０以下になるように試料溶液Ｌの濃度を調整する。この操作により、１つの第１ウェルＷ１に１つ以下、すなわち、０個又は１個の標的物質Ｍ１が充填される。
　標的物質Ｍ１を第１ウェルＷ１に導入する手段は、特に制限されず、検出対象である標的物質Ｍ１に応じた適切な手段を選択することができる。例えば、標的物質Ｍ１を自重により流体デバイス１００内（具体的には流路ＦＣ内）で沈降させ、第１ウェルＷ１に分配する方法が挙げられる。
　また、標的物質Ｍ１を捕捉する物質（捕捉物ともいう）を利用し、自重で沈降しにくい標的物質Ｍ１に捕捉物を結合させて送液してもよい。さらに、予め第１ウェルＷ１に捕捉物を固定しておき、試料溶液Ｌと共に送液された標的物質Ｍ１を捕捉物に捕捉させることで、標的物質Ｍ１の第２ウェルＷ２への導入効率を向上させることもできる。
　捕捉物と標的物質Ｍ１とを結合させる反応は、任意の時点で行うことができる。例えば、試料溶液を調整する前に、サンプルチューブ内で標的物質Ｍ１と捕捉物を接触させることにより行ってもよい。
　又は、捕捉物を第１ウェルＷ１に導入した後に、標的物質Ｍ１を第１ウェルＷ１に導入し、第１ウェルＷ１で捕捉物と標的物質Ｍ１とを接触させてもよい。
　捕捉物は、標的物質Ｍ１を捕捉することができる物質である。捕捉物は、例えば、固相と標的物質Ｍ１に対する特異的結合物質との結合体であってもよい。また、補足物は、核酸又は細胞であってもよい。
　特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、及びアプタマー等が挙げられる。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｓＦｖ）、２量化体Ｖ領域断片（Ｄｉａｂｏｄｙ）、及びＣＤＲを含むペプチド等が挙げられる。抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。また、市販の抗体であってもよい。
　また、標的物質Ｍ１が糖鎖を含む場合、特異的結合物質は、レクチンであってもよい。また、標的物質Ｍ１が脂質膜を含む場合、特異的結合物質は、脂質膜に結合性を有する物質であってもよい。脂質膜に結合性を有する物質としては、例えば、ヘキサンジオール等の炭化水素及び膜貫通タンパク質等の膜タンパク質が挙げられる。膜タンパク質としては、例えばα－ヘモリシン等が挙げられる。
　補足物を構成する固相としては、粒子、膜及び基板等が挙げられる。また、標的物質Ｍ１に対する特異的結合物質は１種類でもよいし、２種類以上であってもよい。例えば３種類であってもよいし、４種類であってもよいし、５種類以上であってもよい。
　粒子としては、特に制限されず、ポリマー粒子、磁気粒子及びガラス粒子等が挙げられる。粒子は、非特異的な吸着を避けるための表面処理が施された粒子が好ましい。また、特異的結合物質を固定するために、表面にカルボキシル基等の官能基を有する粒子が好ましい。より具体的には、ＪＳＲ社製の商品名「Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ　ＬＣ３００」等を用いることができる。
　特異的結合物質を固相に固定する方法としては、特に制限されず、物理吸着による方法、化学結合による方法、アビジン－ビオチンの結合を利用する方法、及びプロテインＧ又はプロテインＡと抗体との結合を利用する方法等が挙げられる。
　物理吸着による方法としては、疎水的相互作用又は静電的相互作用により、特異的結合物質を粒子表面に固定する方法が挙げられる。
　化学結合による方法としては、架橋剤を使用する方法が挙げられる。例えば、粒子の表面が水酸基を有する場合、特異的結合物質が有するカルボキシル基に架橋剤を反応させて活性エステル化した後、水酸基とこのエステル基とを反応させることにより、特異的結合物質を粒子表面に固定することができる。
　特異的結合物質による標的物質Ｍ１の認識能を阻害しないよう、特異的結合物質と粒子表面との間にスペーサを設けることが好ましい。
　標的物が核酸である場合、標的物と相補鎖を組む核酸を捕捉物として用いてもよい。
　また、例えば標的物質Ｍ１としてウイルスを用いる場合、ウイルスが付着することができる細胞（すなわち、ウイルス受容体を有する細胞）を、捕捉物として用いてもよい。
　次いで、図４に示すように、蓋材１２を取り外し、壁材１３の頂部１３ａの高さで試料溶液Ｌを掻き切ることで、試料溶液Ｌを複数の第１ウェルＷ１毎に独立させて充填する。これにより、第１ウェルＷ１毎に１つずつ分配した標的物質Ｍ１が、それぞれ独立する。
　このとき、各第１ウェルＷ１に充填された標的物質Ｍ１を定量することができる。具体的には、標的物質Ｍ１が核酸であれば、標的物質Ｍ１検出用の検出試薬を加え、標的物質Ｍ１の濃度も測定することができる。また、標的物質Ｍ１が細胞であれば、細胞染色試薬を用いて細胞を染色し、細胞の数を計測することができる。
　なお、図４では、蓋材１２を取り外し、壁材１３の頂部１３ａの高さで試料溶液Ｌを掻き切ることで、複数の第１ウェルＷ１毎に標的物質Ｍ１を独立させたが、これに限らない。
　例えば、図５に示すように、内部空間Ｓに試料溶液Ｌを充填した後、注入口１２１から流路ＦＣに封止液Ｌ２を送液してもよい。これにより、流路ＦＣに送液された封止液Ｌ２は、内部空間Ｓにおいて第１ウェルＷ１の上を流動し、内部空間Ｓに充填された試料溶液Ｌのうち、第１ウェルＷ１に収容されていない試料溶液Ｌを押し流して置換する。
　封止液Ｌ２としては、好ましくは油性溶液であり、より好ましくはオイルである。オイルとしては、フッ素系オイル、シリコーン系オイル、炭化水素系オイル又はこれらの混合物等を使用することができる。
　より具体的には、シグマ社製の商品名「ＦＣ－４０」（ＣＡＳ番号：８６５０８－４２－１）等を用いることができる。ＦＣ－４０はフッ素化脂肪族化合物（フッ素系オイル）であり、２５℃における比重が１．８５ｇ／ｍＬである。
　これにより、封止液Ｌ２は、複数の第１ウェルＷ１をそれぞれ個別に封止し、試料溶液Ｌを収容した第１ウェルＷ１は独立した反応空間となる。封止液Ｌ２で置換された試料溶液Ｌ及び余剰の封止液Ｌ２は、排出口１２２から排出される。
（３）標的物質から標的分子を放出させる工程
　次いで、図６に示すように、第１ウェルＷ１毎に分配した標的物質Ｍ１から、標的分子Ｍ２を放出させる。以下、本工程を「工程（３）」と略記することがある。
　標的物質Ｍ１から標的分子Ｍ２を放出させる方法は、対象となる標的物質Ｍ１の種類に応じて選択される。例えば、標的物質Ｍ１がＤＮＡやＲＮＡである場合は、超音波破砕や酵素分解により、１つのフラグメントから複数のフラグメント（つまり標的分子）を得てもよい。
　標的物質Ｍ１が、核酸同士のハイブリダイゼーションによる会合体である場合は、流体デバイスを加熱し、熱変性により各核酸を分離させてもよい。
　標的物質Ｍ１がタンパク質の凝集体である場合は、超音波照射により凝集体をほぐしてもよく、タンパク質を分解する酵素を用いてもよく、タンパク質凝集を解除する試薬を添加してもよい。
　標的物質Ｍ１が細胞であれば、細胞を超音波で破砕してもよく、電気刺激を与えて細胞膜を破砕してもよい。
　具体的な方法としては、以下のような方法が挙げられる。
　まず、第１ウェルＷ１にビーズを配置する。ビーズは、第１ウェルＷ１に予め配置していてよく、細胞を含む溶液に加え細胞と第１ウェルＷ１に配置してもよい。ビーズは、発明の効果を阻害せず、また第１ウェルＷ１に配置可能な大きさであれば制限はない。ビーズの材料は、シリカでもよく、磁性を帯びた材料であってもよい。
　ビーズの大きさは、５０ｎｍ～５００μｍであると好ましく、１００ｎｍ～１００μｍであるとより好ましく、５００ｎｍ～１０μｍであるとさらに好ましい。
　第１ウェルＷ１には、少なくとも１０個以上のビーズが配置されると好ましい。
　次に、標的物質である細胞とビーズとの両方が第１ウェルＷ１に入っている状態で、工程（２）により第１ウェルＷ１を独立させ、細胞を培養する。一定時間細胞を培養した後、流体デバイス１００に超音波を照射する。これにより、ビーズを第１ウェルＷ１内で振動させることで細胞の細胞壁をビーズにより破砕し、細胞の内容物を第１ウェルＷ１内に放出させることができる。
　また、標的物質Ｍ１が細胞であれば、細胞膜を溶解する試薬を用い、細胞膜を溶解させてもよい。
　具体的な方法としては、以下のような方法が挙げられる。
　まず、細胞を含む溶液と細胞膜を溶解する試薬（細胞溶解液）とを混ぜる。細胞を含む溶液と細胞溶解液とは、流体デバイス１００に注入する前に混合してもよく、流体デバイス１００内で混合してもよい。
　細胞を含む溶液と細胞溶解液とを流体デバイス１００内で混合する場合、まず、細胞を含む溶液を第１ウェルＷ１に注入した後、細胞溶解液を第１ウェルＷ１に注入する方法が挙げられる。第１ウェルＷ１に細胞溶解液を加える方法としては、第１ウェルＷ１に配置した細胞が第１ウェルＷ１から出ない流速で流体デバイス１００に加える、又は細胞を第１ウェルＷ１内に固定しておく等の方法が考えられる。
　細胞を第１ウェルＷ１内に固定する方法としては、第１ウェルＷ１に細胞の捕捉物を結合させる方法であってよいし、補足物が結合した粒子を第１ウェルＷ１内に配置する方法であってもよい。「捕捉物」としては、細胞と結合する抗体が挙げられる。補足物が結合した粒子を用いる場合、粒子として磁性ビーズを用い、第１ウェルＷ１に細胞溶解液を加える際に、磁力により粒子を第１ウェルＷ１内に留めておくとよい。
　細胞溶解液としては、界面活性剤や市販の試薬などを用いることができる。
　第１ウェルＷ１内に細胞と細胞溶解液を加えた後、工程（２）により第１ウェルＷ１を独立させ、一定時間反応させることで細胞膜を溶解させる。これにより、細胞の内容物を第１ウェルＷ１内に放出させることができる。
　また、第１ウェルＷ１において標的物質Ｍ１である細胞を一定時間培養し、細胞から分泌されるサイトカインなどの分泌物を標的分子Ｍ２として検出することとしてもよい。
　放出された標的分子Ｍ２は、一部が第１ウェルＷ１の底部に設けられた複数の第２ウェルＷ２の一部に分配される。通常、放出される標的分子Ｍ２の量は、第１ウェルＷ１の容積に対して微量である。そのため、第２ウェルＷ２においては、確率的に１つの第２ウェルＷ２に対して１つ以下、すなわち、０個又は１個の標的分子Ｍ２が充填される。
（４）標的分子を第２ウェル毎に独立させて１分子ずつ分配する工程
　次いで、図７に示すように、壁材１３を取り除き、ウェルプレート１１の上面１１ａの高さで試料溶液Ｌを掻き切ることで、複数の第２ウェルＷ２毎に独立させて試料溶液Ｌを充填する。これにより、第２ウェルＷ２毎に１つずつ分配した標的分子Ｍ２が、それぞれ独立する。以下、本工程を「工程（４）」と略記することがある。
　第２ウェルＷ２毎に試料溶液Ｌを充填する方法としては、種々の方法が考えられる。
　壁材１３を取り除く方法としては、壁材１３を切削する方法や、壁材１３を樹脂材料で構成しておき壁材１３を溶解させて除去する方法が挙げられる。これらの場合、壁材１３を、ウェルプレート１１の外縁部の位置に設けられた環状の第１壁材と、ウェルプレート１１の内側に設けられた第２壁材との２つで構成しておくとよい。壁材１３を切削する場合には、第２壁材のみを切削するとよい。また、壁材１３を溶解させる場合、第１壁材を第２壁材とは異なる材料で形成し、第２壁材のみを溶解させるとよい。
　また、壁材１３を取り除くこと無く第２ウェルＷ２毎に試料溶液Ｌを充填してもよい。
　例えば、ウェルプレート１１の上面１１ａの高さまで試料溶液Ｌを蒸発させることで、複数の第２ウェルＷ２毎に独立させて試料溶液Ｌを充填してもよい。また、試料溶液Ｌ１の液面が、第１ウェルＷ１内の高さとなるまで試料溶液Ｌ１を吸引して除去してもよい。その後、注入口１２１から流路ＦＣに封止液Ｌ２を送液することで、第２ウェルＷ２毎に試料溶液Ｌを充填することができる。
　また、試料溶液Ｌが第１ウェルＷ１で満たされた状態で、注入口１２１から流路ＦＣに封止液Ｌ２を送液することで、第１ウェルＷ１内の試料溶液Ｌを封止液Ｌ２で置換すると共に、第２ウェルＷ２を封止液Ｌ２で封止してもよい。コンピュータシミュレーションにより、一定以上の流速で封止液Ｌ２を注入すると、封止液Ｌ２は図５と同様に内部空間Ｓにおいて第１ウェルＷ１の上を流動する一方、流速を遅くすると、注入口１２１から送液する封止液Ｌ２は第１ウェルＷ１の内部を通過し、第１ウェルＷ１内の試料溶液Ｌを置換可能であることが示唆されている。流速は、第１ウェルＷ１の直径、封止液Ｌ２の種類、ウェルプレート１１や壁材１３の材料により影響を受けるため、予備実験により適切な流速を定めておくとよい。
　また、上述した工程（２）において、封止液Ｌ２を用いて試料溶液Ｌ１を複数の第１ウェルＷ１毎に独立させて充填する場合、本工程では、工程（２）で用いる封止液よりも低粘度の封止液を用いることとしてもよい。工程（２）を行う際に用いた封止液が内部空間Ｓにおいて第１ウェルＷ１の上を流動する場合、本工程において工程（２）で用いた封止液よりも低粘度の封止液を流路ＦＣ内に送液すると、封止液は、第１ウェルＷ１の中に浸入し、第１ウェルＷ１内の試料溶液Ｌを封止液Ｌ２で置換することができる。
　上述したような第１ウェルＷ１内の試料溶液Ｌを封止液Ｌ２で置換する操作の場合、第１ウェルＷ１の底面に対して開口部を広くし壁を傾斜させることで、注入した封止液が第１ウェルＷ１の底面に流動しやすくなる。
　これらの操作を容易にするため、ウェルプレート１１と壁材１３とは異なる材料とするとよい。
　例えば、ウェルプレート１１を親水性の材料で形成することで、封止液が第２ウェルＷ２の内部に浸入しにくく、封止液Ｌ２による封止を容易に行うことができる。
　また、壁材１３を切削して除去する場合、ウェルプレート１１を壁材１３よりも固い材料で形成することで、壁材１３のみを正確に削り取ることができる。このような材料の組み合わせとして、例えばウェルプレート１１を無機材料、壁材１３を樹脂材料で形成することが考えられる。
（５）標的分子を検出する工程
　次いで、標的分子と検出試薬との反応を生じさせ、標的分子を検出する。以下、本工程を「工程（５）」と略記することがある。検出試薬は、予め試料溶液Ｌに含まれていてもよく、任意の段階で外部から流体デバイス１００に検出試薬を含む液体を導入してもよい。
　検出方法としては、例えば、封止された第２ウェルＷ２の内部でシグナル増幅反応を行う方法が挙げられる。第２ウェルＷ２の内部において、検出試薬由来のシグナルが検出されるようにシグナルを増幅させる。
　シグナルとしては、蛍光、発色、電位変化、及びｐＨ変化等が挙げられる。
　シグナル増幅反応は、例えば生化学反応、より具体的には酵素反応であってもよい。一例として、シグナル増幅反応は、シグナル増幅のための酵素を含んだ試薬液が第２ウェルＷ２内に収容された状態で、流体デバイス１００を、所望の酵素活性が得られる一定温度条件下、例えば６０℃以上、好ましくは約６６℃で、所定時間、例えば少なくとも１０分間、好ましくは約１５分間、維持する等温反応である。
　シグナル増幅反応の例としては、具体的には、標的分子Ｍ２が核酸である場合は、インベーダー（登録商標）法等のＩＣＡ反応、ループ介在等温増幅法（ＬＡＭＰ法（商標登録））、５’→３’ヌクレアーゼ法（ＴａｑＭａｎ（登録商標）法）、及び蛍光プローブ法等が挙げられる。これらの方法であれば、溶液中に上述した界面活性剤（試料又は細胞溶解液に含まれ得る）が含まれていても、シグナル増幅反応を生じさせることができると考えられる。
　また、シグナル増幅反応の際、細胞溶解液が反応を阻害する場合には、第２ウェルＷ２内の溶液を置換してもよい。その場合、標的分子Ｍ２を第２ウェルＷ２内に固定した上で外部から検出試薬を加えてもよい。
　標的分子を第２ウェルＷ２内に固定する方法としては、第２ウェルＷ２内に標的分子Ｍ２を捕捉する物質を結合させてもよく、標的分子Ｍ２を捕捉する化合物が結合した磁性粒子を第２ウェルＷ２に加えておき、磁力で磁性粒子を固定することしてもよい。
　シグナル増幅反応としては、ＩＣＡ反応を用いることが特に好ましい。ＩＣＡ反応は、（１）核酸同士の相補的結合と、（２）酵素による三重鎖構造の認識及び切断との２つの反応のサイクルによってシグナル増幅が進行する。このようなシグナル増幅反応においては、標的分子Ｍ２以外の夾雑物による反応サイクル阻害の影響が小さい。したがって、第２ウェルＷ２内に標的分子Ｍ２以外の様々な成分（例えば夾雑物）が存在する場合でも、ＩＣＡ反応を用いることにより、標的分子Ｍ２を精度よく検出することができる。
　例えば、シグナル増幅反応にＩＣＡ反応を用いる場合、試料溶液Ｌは、ＩＣＡ反応に必要な反応試薬及び鋳型核酸を含む。反応工程における生化学反応がＩＣＡ反応である場合、標的分子Ｍ２が存在する第２ウェルＷ２では、蛍光物質が消光物質から遊離することによって、励起光に対応して所定の蛍光シグナルを発する。
　また、標的分子Ｍ２の検出は、標的分子Ｍ２に特異的に結合する物質（特異的結合物質ともいう）を標的分子Ｍ２に結合させ、結合した特異的結合物質を検出することによっても、行うことができる。例えば、標的分子Ｍ２がタンパク質である場合、ＥＬＩＳＡを用いて検出することができる。より具体的には、検出は、例えばＦＲＥＴの原理を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、行ってもよい。
　ＦＲＥＴの原理を用いたサンドイッチ法を行う場合は、まず、第１の蛍光物質（ドナーともいう）で標識した第１の特異的結合物質（例えば抗体）と、第１の蛍光物質の蛍光波長と重複する吸光波長を有する第２の蛍光物質（アクセプターともいう）で標識した第２の特異的結合物質を準備する。
　続いて、標的分子Ｍ２（例えば抗原）を、第１の特異的結合物質と第２の特異的結合物質の両方と接触させ、複合体を形成させる。複合体が形成されると、ドナーとアクセプターの距離が近づき、ドナーの励起波長の照射によりアクセプターの蛍光波長を検出することができるようになる。あるいは、特異的結合物質を核酸断片で標識しておき、核酸断片をＩＣＡ反応により検出してもよい。
　特異的結合物質としては、後述する構造体に対する特異的結合分子と同様のもの、例えば抗体、抗体断片、アプタマー等を使用することができる。標的分子Ｍ２に結合した特異的結合物質を検出するために、特異的結合物質を、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素により、直接的又は間接的に標識してもよい。２以上の特異的結合物質を使用する場合は、各々の特異的結合分子を、互いに識別可能に標識することができる。
　シグナルの観察方法は、観察するシグナルの種類に応じて公知の適切な方法を選択することができる。例えば、明視野観察を行う場合は、ウェルアレイが設けられた基板に対して垂直方向に白色光を照射する。蛍光シグナルを観察する場合は、蛍光物質に対応する励起光をウェルの底側からウェル内へ照射し、蛍光物質が発する蛍光を観察する。観察されたウェルアレイの全体又は一部の画像を撮影して保存し、コンピューターシステムによる画像処理を行う。
　以上のような構成の流体デバイス１００によれば、溶液中の標的物質から放出される標的分子を高感度で検出可能となる。
　また、以上のような標的分子の検出方法によれば、標的分子の検出を高精度で実施可能となる。
　なお、本実施形態においては、工程（１）を行うこととしたが、工程（１）はなくてもよい。工程（１）を行わない場合、試料溶液を第１ウェルに充填した後、工程（３）において複数の第１ウェルのうち、１つの標的物質Ｍ１が配置された第１ウェルＷ１を抽出し、以降の工程（４）及び（５）を行うとよい。
　その際、標的物質Ｍ１を可視化することで、１つの標的物質Ｍ１が配置された第１ウェルの抽出が容易となる。標的物質Ｍ１が細胞である場合、可視化の方法としては、予め細胞を染色試薬に接触させておくことが考えられる。
　また、標的物質Ｍ１が核酸である場合、可視化の方法としては、流体デバイス１００に注入する前に、標的物質Ｍ１と公知のＤＮＡ染色試薬とを混合することが考えられる。染色後、核酸のみを公知の方法で回収し、回収した核酸を改めて試料溶液Ｌ１に加えて流体デバイス１００に注入して第１ウェルＷ１に配置してもよい。
　また、標的物質Ｍ１が核酸（例えば、ゲノムＤＮＡや染色体）である場合、第１ウェルＷ１においてＩＣＡ反応をさせることで、１つの標的物質Ｍ１が配置された第１ウェルＷ１を抽出してもよい。
　具体的には、工程（５）で用いる蛍光物質とは異なる蛍光物質を、核酸を含む試料溶液Ｌ１に含ませておき、流体デバイスに流す。次いで、工程（２）において各第１ウェルＷ１に標的物質Ｍ１を配置した後、第１ウェルＷ１でＩＣＡ反応を行い、任意の反応時間での蛍光強度を測定することで、１分子の核酸が含まれる第１ウェルＷ１を特定する。
　このとき、光っているウェル数が一定数以下（具体的には第１ウェル数の総数の１／１０）であれば、ポアソン分布に基づいて大部分の光っているウェルで１分子しか核酸が無いとみなしてよい。
　１つの核酸が配置された第１ウェルＷ１を確認した後、第１ウェルＷ１内で制限酵素処理し断片化した後、断片化したＤＮＡ（つまり標的分子）を工程（５）により検出する。断片化したＤＮＡにおいて特定の遺伝子領域が一対一で含まれるよう制限酵素の種類を選択し、工程（５）により上記「特定の遺伝子領域」を検出することで、コピー数多型（ＣＮＶ）の解析が可能となる。
　また、上記の方法で可視化させた後、標的物質Ｍ１を配置した第１ウェルＷ１の顕微鏡写真を撮像し、撮像した画像を解析することで１つの標的物質Ｍ１が配置された第１ウェルＷ１を抽出してもよい。
［第２実施形態］
　図８～１１は、本発明の第２実施形態に係る流体デバイスの説明図である。本実施形態において第１実施形態と共通する構成要素については同じ符号を付し、詳細な説明は省略する。
［流体デバイス］
　図８は、本実施形態の流体デバイスを示す概略斜視図である。図９は、図８の線分ＩＸ－ＩＸにおける矢視断面図である。
　流体デバイス２００は、ウェルプレート（基板ともいう）２１、蓋材２２、壁材２３を有する。流体デバイス２００は、内部空間Ｓに試料を収容し、試料に含まれる標的物質から標的分子を放出させると共に、標的分子の検出反応を行う反応容器として用いられる。
　流体デバイス２００は、ウェルプレート２１と蓋材１２と壁材１３とで囲まれた複数の第１ウェルＷ１と、ウェルプレート２１の上面２１ａであって、第１ウェルＷ１の底部にそれぞれ設けられた複数の第２ウェルＷ２と、を有する。
　以下、順に説明する。
（ウェルプレート）
　ウェルプレート２１は、平面視矩形を呈する板状部材である。「平面視」とは、ウェルプレートの上面２１ａの鉛直方向からの視野を指す。ウェルプレート２１の上面２１ａには、複数のウェル（第２ウェル）Ｗ２が設けられている。
　ウェルプレート２１の材料は、第１実施形態のウェルプレート１１の材料として示した材料を採用することができる。
（壁材）
　壁材２３は、平面視で閉環状に形成され、ウェルプレート２１の上面２１ａに配置されている。
　壁材２３は、ウェルプレート２１と蓋材２２とに挟持され、一体となることで流体デバイス２００を形成する。ウェルプレート２１と蓋材２２と壁材２３とで囲まれた空間は、液状の試料が収容される内部空間Ｓである。
　壁材２３は、ウェルプレート２１の外縁部に設けられた側壁２３１と、ウェルプレート２１の内周側に設けられた内部隔壁２３２とを有する。内部空間Ｓの壁面として機能する上、ウェルプレート２１と蓋材２２との間のスペーサとして機能する。
　ウェルプレート２１と、壁材２３（側壁２３１及び内部隔壁２３２）と、蓋材２２とで囲まれた空間は、内部空間Ｓであり、第１ウェルＷ１である。流体デバイス２００は、第１ウェルＷ１を複数（図８では２×５＝１０個）有している。第１ウェルＷ１は、平面視矩形の空間である。複数の第１ウェルＷ１は、いずれも同方向に延在している。
　壁材２３の材料は、上述したウェルプレート２１と同じ材料を採用することができる。
（蓋材）
　蓋材２２は、平面視でウェルプレート２１と同じ輪郭形状を呈している。蓋材２２は、ウェルプレート２１と対向し、壁材２３に接する。
　蓋材２２には、厚さ方向に貫通する複数の貫通孔を有する。複数の貫通孔は、各第１ウェルＷ１の一端側と他端側とにそれぞれ設けられている。第１ウェルＷ１に対して一方の貫通孔は、流体デバイス２００の内部空間Ｓに液状物を注入する際に用いる注入口２２１であり、他方の貫通孔は、内部空間Ｓから液状物を排出させる際に用いる排出口２２２である。
　注入口２２１、内部空間Ｓ及び排出口２２２はこの順に連通し、全体として流路ＦＣを形成している。流体デバイス２００では、流路ＦＣに液状物を適宜流動させて、標的物質の検出反応を行う。
　蓋材２２の上面２２ａには、注入口２２１の周囲を囲む筒状の注入ポート２２５が設けられている。注入ポート２２５は注入口２２１と連通している。注入ポート２２５は、例えば、液状物を充填したシリンジを用いて内部空間に液状物を充填する際、シリンジの接続に用いる。
　同様に、蓋材２２の上面２２ａには、排出口２２２の周囲を囲む筒状の排出ポート２２６が設けられている。排出ポート２２６は排出口２２２と連通している。排出ポート２２６は、例えば、内部空間Ｓから液状物を抜き出す際に、液状物が流動するチューブの接続に用いる。
　隣り合う第１ウェルＷ１が有する注入ポート２２５は、互いに隣り合い、第１ウェルＷ１の配列に沿って２行、５列で配列している。
　蓋材２２の材料は、上述したウェルプレート２１の材料として例示した材料を採用することができる。蓋材２２の材料は、ウェルプレート２１の材料と同じであってもよく、異なっていてもよい。
＜標的分子の検出方法＞
　図１０及び１１は、本実施形態の標的分子の検出方法の説明図である。
　まず、図１０に示すように、注入口２２１から内部空間Ｓ（第１ウェルＷ１）に、第１実施形態と同様に濃度調整した試料溶液Ｌを注入する。予め濃度を調整しておくことにより、各第１ウェルＷ１において、１個の標的物質（不図示）が分配される。
　内部空間Ｓが試料溶液Ｌで充填された後、流路ＦＣを通過した試料溶液Ｌは排出口２２２から排出される。
　次いで、第１実施形態と同様に、第１ウェルＷ１において、標的物質から標的分子（不図示）を放出させる。放出された標的分子は、各第２ウェルＷ２に１つ以下、すなわち、０個又は１個充填される。
　次いで、図１１に示すように、注入口２２１から流路ＦＣに封止液Ｌ２を送液する。流路ＦＣに送液された封止液Ｌ２は、内部空間Ｓにおいて上面１１ａの面方向に流動し、流路ＦＣに送液された試料溶液Ｌのうち、第２ウェルＷ２に収容されていない試料溶液Ｌを押し流して置換する。
　これにより、封止液Ｌ２は、複数の第２ウェルＷ２をそれぞれ個別に封止し、試料溶液Ｌを収容した第２ウェルＷ２は、独立した反応空間となる。流路ＦＣが封止液Ｌ２で満たされると、余分な封止液Ｌ２は、排出口２２２から排出される。
　その後、第１実施形態と同様に、第２ウェルＷ２において標的分子の検出反応を行う。
　以上のような構成の流体デバイス２００によれば、溶液中の標的物質から放出される標的分子を高感度で検出可能となる。
　また、以上のような標的分子の検出方法によれば、標的分子の検出を高精度で実施可能となる。
［第３実施形態］
　第１実施形態に開示される流体デバイスを用いた、別の側面における標的分子の検出方法について説明する。
　本実施形態における標的分子の検出方法は、ウェルを備える流体デバイスを用いた標的分子の検出方法において、前記ウェル内に、標的分子と、前記標的分子に結合する結合体に固定された状態のアルカリホスファターゼと、前記アルカリホスファターゼにより脱リン酸化されることで視覚的に変化する基質との反応液を収容する工程と、前記ウェル内で前記アルカリホスファターゼによる前記基質の脱リン酸化反応を用いて、前記ウェル内に収容された標的分子の存在を視覚化して検出する工程とを備え、前記標的分子の存在を視覚化して検出する工程の開始時において、前記ウェルに収容された反応液における前記基質の濃度が８０μｍｏｌ／Ｌ以上８００μｍｏｌ／Ｌ以下である。
　もう一つの側面として、本実施形態は、ウェルを備える流体デバイスを用いた標的分子検出方法であって、標的分子をウェル内に収容する工程と、アルカリホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）をウェル内に収容する工程と、アルカリホスファターゼの基質をウェル内に収容する工程と、ウェル内でアルカリホスファターゼ及び基質を用いてウェル内の標的分子を検出する工程とを備えた方法を提供する。
　この方法においては、ウェルに加えるアルカリホスファターゼの基質濃度を適切な範囲に設定することで、蛍光顕微鏡の励起光による自己分解から生じる擬陽性反応を抑制することが可能になる。なお、標的分子をウェル内に収容する工程と、アルカリホスファターゼをウェル内に収容する工程と、アルカリホスファターゼの基質をウェル内に収容する工程は同時に行われても別々に行われてもよく、標的分子、アルカリホスファターゼ及び基質が単一の溶液に混ざった状態でウェル内に加えられてもよい。「単一の溶液」は、本実施形態における「反応液」に該当する。
（流体デバイス）
　本実施形態の方法に用いられる流体デバイスは、第１実施形態に開示される流体デバイスを用いることができる。図１～図２に示された流体デバイス１００を用いた場合を例に、標的分子の検出について説明を進める。
　なお、本実施形態における検出方法は、第２ウェルＷ２内に、アルカリホスファターゼとその基質であるＦＤＰ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｄｉ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含む液体を収容し、流体デバイス１００を蛍光顕微鏡で観察する方法である。
　まず、流体デバイス１００の注入口１２１から内部空間Ｓ（第１ウェルＷ１）に、第１実施形態と同様に濃度調整した試料溶液Ｌを導入する試料溶液Ｌは、第１実施形態で説明した通りであるので説明を省略する。
　内部空間Ｓが試料溶液Ｌで充填された後、流路ＦＣを通過した試料溶液Ｌは排出口１２２から排出される。
　次いで、第１実施形態と同様に、第１ウェルＷ１において、標的物質から標的分子（不図示）を放出させる。１つの第２ウェルＷ２に導入される標的分子の数は、特に制限されないが、好ましくは、１つの第２ウェルＷ２に１つ以下、すなわち、０個又は１個の標的分子が導入される。これにより、標的分子の検出を１個単位で行うことができ、デジタル計測が可能となる。なお、全ての第２ウェルＷ２に標的分子が導入される必要はない。
　本実施形態における反応試薬としては、緩衝物質、酵素の一例としてのアルカリホスファターゼ、基質、抗体、及び抗体断片等が挙げられる。以下において、アルカリホスファターゼを「ＡＬＰ」という。抗体はポリクローナル抗体でもよいし、モノクローナル抗体でもよい。抗体は全長の物を使用してもよいし、酵素処理などにより、一部が欠損したものを使用してもよい。さらに抗体にＡＬＰやＤＮＡなどが結合していてもよい。
　ＡＬＰは、基質であるリン酸モノエステル等のリン酸化合物を加水分解してリン酸を遊離させる酵素である。
　ＡＬＰの基質の種類としては、例えばＦＤＰやｐＮＰＰ（ＰーＮｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＭＦＰ（Ｍｏｎｏｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）等を用いることができる。
　ＦＤＰ及びＭＦＰは、無蛍光の物質であるが、脱リン酸化されることで蛍光を発するようになる。
　ｐＮＰＰは、淡い白色系の物質であるが、脱リン酸化されることで黄色になる性質を有している。
　ＦＤＰ、ＭＦＰ及びｐＮＰＰ等のように、ＡＬＰにより脱リン酸化されることで視覚的に変化する基質を用いることで、標的分子の存在を視覚化（＝ラベル化）することができる。なお、この場合の視覚的な変化や視覚化とは、肉眼で確認できる変化に限られず、例えば顕微鏡で見たときに分かる変化や、イメージセンサを用いて画像化したときに分かる変化であってもよい。
　本実施形態においては、アルカリホスファターゼの基質としてＦＤＰを用いた場合について説明を進める。
《第２ウェルへの標的分子の保持》
　試料溶液Ｌに反応試薬が含まれず、先に流体デバイス１００に試料溶液Ｌを入れた後、外部から標的分子を検出する酵素等の反応試薬を加える場合、標的分子は第２ウェルＷ２内に保持される必要がある。
　標的分子は、自重により流体デバイス内（具体的には流路内）で沈降し、第２ウェルＷ２に分配する構成としてもよい。また、第１実施形態に記載の通り補足物を利用してもよい。
　なお、捕捉物を用いた第２ウェルＷ２内への標的物質の捕捉後、ＡＬＰの供給に先立って、第２ウェルＷ２内を洗浄してもよい。
　流体デバイス１００の外部で粒子上の捕捉物により標的物質を捕捉する場合、後に詳述する結合体に固定されたＡＬＰ、及びＦＤＰは、それぞれ、流体デバイス１００の外部で、粒子及び標的物質が収容された容器内に供給されてもよく、流体デバイス１００内に供給されてもよい。
　ＡＬＰが、流体デバイス１００の外部、又は第１ウェルＷ１のいずれの場所で標的物質と混ぜられた場合でも、ＦＤＰの供給に先立って、標的分子に結合していないＡＬＰを洗浄して取り除くことが必要である。これにより、標的分子が存在しない第２ウェルＷ２での蛍光発光を防止できる。
　ＦＤＰは、標的分子に結合していないＡＬＰが取り除かれた後に供給される。
　なお、標的分子に対する捕捉手段は１種類でもよいし、複数種類であってもよい。例えば３種類であってもよいし、４種類であってもよいし、５種類以上であってもよい。
　試料溶液Ｌや、標的分子を検出する反応時（＝検出の工程時）の各第２ウェルＷ２内に含まれる溶液（＝反応液）、すなわち、標的分子とＡＬＰとＦＤＰとを含む溶液には、界面活性剤や緩衝液を含んでいてもよい。界面活性剤は、第１実施形態で列挙したものを使用できる。
　界面活性剤の濃度は、標的分子検出反応を開始時のウェル内の反応液の総体積に対し０．００１体積％以上５体積％以下であることが好ましく、０．０１体積％以上１体積％以下であることがより好ましく、０．０３体積％以上０．１体積％以下であることがさらに好ましい。界面活性剤の濃度が１体積％以下であると、後に行われる標的分子の検出における反応への影響が少ない。
《標的分子へのＡＬＰの結合》
　標的分子の検出には、標的分子に結合する結合体にＡＬＰを固定しておき、当該ＡＬＰが、結合体を介して標的分子に結合した状態で、ＦＤＰを脱リン酸（つまり分解）することで可能となる蛍光反応を利用する。そのため、蛍光反応が確認できるということは、ＦＤＰとＡＬＰとが反応したことを意味し、ＡＬＰと結合している標的分子が存在していることの間接証拠と考えることができる。
　標的分子に結合する結合体には、核酸及び抗体等が挙げられる。
　たとえば、標的分子が核酸の場合、標的の核酸と相補的な、結合体としての（つまり検出用の）核酸に、ＡＬＰが固定されていてもよい。
　また、標的分子の核酸と相補的な核酸に予めタンパク質を結合させておき、標的分子の核酸に相補的な核酸を結合させる。そして、上記タンパク質に結合する（＝検出用の）抗体に固定されたＡＬＰを供給することで、標的分子にＡＬＰを結合させることも可能である。
　標的分子がタンパク質の場合、標的分子に結合する結合体としての抗体に、ＡＬＰが固定されていてもよい。
　以上のように、標的分子に結合する結合体を用いることで、第２ウェルＷ２に加えられたＡＬＰを確実に標的分子に結合させることができる。
　結合体としての核酸や抗体にＡＬＰを固定させるときには、アミノ基とカルボキシル基による共有結合を利用してもよいし、ビオチンとストレプトアビジンを介して結合させてもよいし、その他の反応を使用して結合させてもよい。
　ＡＬＰが固定された結合体を第２ウェルＷ２に収容するタイミングとしては、予め標的物質を含み得る試料溶液Ｌを流体デバイス１００に入れて標的分子を第２ウェルＷ２内に保持した後でもよいが、標的物質に先立って第２ウェルＷ２内に供給されてもよい。また、流体デバイス１００外で、標的物質を含み得る試料溶液Ｌと混ぜられた後に流体デバイス１００に供給されてもよい。
《ウェルの洗浄》
　ＡＬＰが固定された結合体を流体デバイス１００に供給した後、第２ウェルＷ２を洗浄するための洗浄溶液を流体デバイス１００に供給してもよい。
　第２ウェルＷ２を洗浄しておくことで、標的分子のない第２ウェルＷ２でＡＬＰによるＦＤＰの分解反応が起こってしまう事態を防止できる。なお、第２ウェルＷ２の洗浄を行う場合には、第２ウェルＷ２へのＦＤＰの供給は洗浄後に行う。
　洗浄溶液には例えば、ウシ血清アルブミンなどのブロッキング成分が含まれていてもよいし、界面活性剤が含まれていてもよいし、塩や緩衝液などが含まれていてもよい。
《標的分子の第２ウェル毎への分配》
　第１実施形態と同じ方法で、標的分子を第２ウェル毎に独立させて１分子ずつ分配する。
《標的分子の検出》
　各第２ウェルＷ２を独立させた後、第２ウェルＷ２内の試料溶液Ｌに含まれる反応試薬を反応させて、標的分子を検出する。
　上述のように、標的分子の検出にはＦＤＰの分解物から発せられる蛍光を利用する。一方、ＦＤＰがＡＬＰと反応すること無く分解し分解物を生じた場合であっても、上記と同様に蛍光反応が観察される。蛍光反応の確認は、標的分子の存在の間接証拠であることから、このような場合、標的分子の存在を誤認し「擬陽性」となる。
　発明者は、蛍光反応の確認のために照射する励起光により、ＦＤＰが光分解することがあり、結果として生じる分解物が擬陽性の原因となり得ると考え、鋭意検討した。その結果、ＦＤＰの濃度を適切に制御し濃度範囲に設定することで、ＦＤＰの励起光による自己分解が原因と考えらえる擬陽性反応を効果的に抑制できることを見いだし発明を完成させた。
　ウェル１４１に収容されたＡＬＰ，ＦＤＰ、及び標的分子が含まれうる反応液中において、ＦＤＰの濃度は、８０μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）から８００μＭの範囲内であり、好ましくは１００μＭ～８００μＭの範囲内であり、より好ましくは２００μＭ～６００μＭの範囲内である。
　これらのＦＤＰの濃度は、標的分子を含み得る液体Ｌ１１０、ＡＬＰ及びＦＤＰが、いずれもウェル１４１内に加えられて、ＡＬＰ及びＦＤＰを用いた検出反応（＝酵素反応）が開始された時点でのＦＤＰの濃度を指す。
　標的分子が核酸の場合、反応試薬に核酸増幅の試薬を加えておき、まず核酸を増幅させて、その後、その核酸をＡＬＰとＦＤＰで検出してもよい。
　ＡＬＰがＦＤＰを分解するためには一定時間反応させる必要がある。反応時は室温であってもよいし、３７℃で加温してもよい。反応温度は、１０℃～５０℃が好ましく、２０℃～４０℃がさらに好ましく、２５℃～３７℃がさらに好ましい。反応時間は、１０分間～２時間が良く、２０分間～１時間がさらに好ましく、３０分間～５０分間がさらに好ましい。
《蛍光の観察》
　反応時間の経過後には、標的分子が入った第２ウェルＷ２において、ＡＬＰによりＦＤＰが分解（＝脱リン酸化）されている。蛍光顕微鏡から特定の波長の励起光を照射すると、ＦＤＰが分解されたウェル１４１では蛍光が検出されるため、この特性をもって標的分子を検出する。
　ＡＬＰを用いたデジタル計測の一態様によれば、試料に複数の標的分子が含まれる場合、例えば標的分子がタンパク質である場合に、標的分子の検出を簡便にすることができる。一つの例として、以下の態様が挙げられる。
　まず、流体デバイス１００に、標的分子の一例であるタンパク質を含む試料溶液Ｌを加える。このとき、捕捉物を用いてタンパク質を第２ウェルＷ２内で捕捉することが好ましい。
　次いで、流体デバイス１００に、結合体の一例である抗体に固定されたＡＬＰを含む検出溶液を加える。その後、一定時間静置することで、標的分子に検出用の抗体とＡＬＰを結合させる。
　結合体を標的分子に結合させた後、流体デバイス１００に洗浄バッファーを加える。洗浄回数は１回でも良く、５回でもよいし、１０回でもよい。これにより、標的分子に結合していない余分な結合体及びそれらに結合したＡＬＰを取り除くことができ、擬陽性反応を抑制できる。
　その後、流体デバイス１００に、ＡＬＰの基質であるＦＤＰを含む反応試薬を加える。
　次いで、各第２ウェルＷ２を独立させる。
　こうして、各第２ウェルＷ２内にＡＬＰ及びＦＤＰを収容して独立させると、ＡＬＰにＦＤＰを脱リン酸化させるため、一定時間、一定温度で反応させる。
　ＡＬＰによる脱リン酸化反応の後、標的分子が入っている第２ウェルＷ２の数を確認するために、蛍光顕微鏡で各第２ウェルＷ２を観察し、蛍光を発する第２ウェルＷ２の数をカウントする。
　カウント結果から標的分子であるタンパク質の数や濃度を算出することが出来る。
　また、標的分子の一例であるタンパク質を検出する他の例として、以下にタンパク質の捕捉とＡＬＰの結合の工程を、流体デバイス１００の外部で実施する場合について説明を加える。
　まず、チューブに、捕捉物としての抗体が固定された粒子を加えておき、さらに、標的分子であるタンパク質を含む溶液を加える。
　次いで、上記のチューブに、結合体である検出用の抗体に固定されたＡＬＰを含む溶液を加える。これにより、粒子上の捕捉物に標的分子が、標的分子に結合体及びＡＬＰが、各々、付着する。なお、捕捉物が固定された粒子と、標的分子と、結合体及びＡＬＰを同時にチューブに入れて混ぜてもよい。
　こうして、ＡＬＰを、結合体を介して標的分子に結合させると、溶液を除去し、チューブ内にＦＤＰ試薬を加えて粒子を懸濁させる。
　その後、チューブ内の溶液及び粒子を流体デバイス１００に供給する。なお、ＦＤＰ試薬をチューブに加えるのに代えて、一度粒子を流体デバイス１００に加えてから、ＦＤＰ溶液を第２ウェルＷ２へ注入してもよい。
　次いで、各第２ウェルＷ２を独立させる。その後、一定時間、一定温度で静置し、ＡＬＰを反応させる。
　反応後、蛍光顕微鏡で励起光を用いて、蛍光を発するウェル数をカウントする。以上のようにして、標的分子数をデジタル計測することができる。
　以上のような方法によれば、擬陽性を抑制し、標的分子の検出精度を向上させることができる。
（流体デバイスの変形例）
　本実施形態の検出方法に用いられる流体デバイスは、第１実施形態に開示される流体デバイス以外であっても、標的分子等が収容されるウェルを有している流体デバイスであればよく、その形態は特に限定されるものではない。
　図１２は、本実施形態の変形例にかかる流体デバイスを示す模式断面図である。図１２に示すように、一例としての流体デバイス３００は、基板３１０と、基板３１０を覆うカバー部材３２０とを備えている。
　基板３１０は、例えば樹脂を用いて形成される。樹脂の種類は特に限定されないが、液体Ｌ３１０及び封止液Ｌ２に対して耐性のある樹脂であることが好ましい。また、検出するシグナルが蛍光である場合には、自家蛍光が少ない樹脂であることが好ましい。例えば、樹脂としては、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマー、シリコーン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ酢酸ビニル、フッ素樹脂、及びアモルファスフッ素樹脂等が挙げられるがこれらに限定されない。
　基板３１０は、平板状の形状をなしており、基板３１０の上面３１１には、試料や液体、粒子等が収容される多数のウェル３４１を備えたウェルアレイ３４０が形成されている。樹脂を用いたウェルの形成方法としては、射出成形、熱インプリント、及び光インプリント等が挙げられる。
　ウェル３４１の形状、寸法、及び配置は、特に限定されないが、１つのウェル３４１に１個の標的分子が導入されることが好ましい。ウェル３４１は、容積が小さい微小ウェルであることが好ましい。例えば、１つのウェル３４１の容積は、１０ｆＬ～１００ｐＬ程度であってもよい。
　本実施形態においては多数のウェル３４１が同形同大に構成されている。同形同大とは、デジタル計測を行うために要求される程度に同一の形状で同一の容量であればよく、製造上の誤差程度のばらつきであれば許容される。
　ウェルの形状は、第１実施形態に記載の第２ウェルＷ２と同じ形状を採用することができる。
　ウェル３４１の直径は、例えば１～１００μｍ程度であってもよい。ウェル３４１の深さは、例えば１～１００μｍ程度であってもよい。また、ウェル３４１の配置は、特に制限されず、例えば三角格子状に整列していてもよいし、正方格子状も整列していてもよいし、ランダムに配置されていてもよい。
　カバー部材３２０は、その縁部に、下方へ突出する凸部３２１を備えている。凸部３２１は、平面視で基板３１０の輪郭形状と同型状の環状に設けられ、基板３１０の周縁部に接している。これにより、基板３１０とカバー部材３２０との間に流路３３０が形成されている。凸部３２１の下端部は、基板３１０に溶着又は接着されていてもよい。
　流路３３０は、後述する試料溶液Ｌ、封止液Ｌ２を送液するための経路として機能する。すなわち、試料溶液Ｌ及び封止液Ｌ２は、流路３３０を通じて流体デバイス３００の内部に導入される。
　カバー部材３２０の材質は、自家蛍光の少ない樹脂であることが好ましく、例えば、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマー等の熱可塑性樹脂であってもよい。
　また、カバー部材３２０は、シグナルを蛍光観察する際に検出される波長及びその近傍の波長の光を透過しない材料から形成されていてもよく、完全に光を透過しない材料から形成されていてもよい。したがって例えば、カバー部材３２０は、カーボンや金属粒子等を添加した熱可塑性樹脂から形成されていてもよい。
　流路３３０の形状、構造、及び容量等は特に限定されないが、流路３３０の高さは、例えば１００μｍ以下であってもよい。
　カバー部材３２０には、種々の液体や粒子等を流路３３０に供給するための導入ポート３２２と、流路３３０から液体等を排出するための排出ポート３２３が形成されている。
　図１５は、本発明の他の好ましい実施形態にかかる流体デバイス４００の模式断面図である。
　図１５に示すように、流体デバイス４００は、基板３１０と、基板３１０の上面３１１の縁部から上方へ延びる壁部材４１０を備えている。
　基板３１０には、図１２に示された流体デバイス３００と同様に、多数のウェル３４１を有するウェルアレイ３４０が形成されている。このように、ウェル３４１の上方が覆われない構成の流体デバイス４００を用いた場合でも、標的分子を検出することが可能である。
　なお、本変形例における検出方法では、ウェル３４１に、ＡＬＰとその基質であるＦＤＰを含む液体を収容し、当該ウェル３４１の開口部を封止液Ｌ２によって封止した流体デバイス３００又は流体デバイス４００を蛍光顕微鏡で観察する。
　以上、流体デバイス３００及び４００の構成例について説明を加えたが、以下に、図１２～図１４に示された流体デバイス３００を用いた場合の、標的分子の検出について説明する。
　まず、図１に示すように、流体デバイス３００の導入ポート３２２から第１実施形態と同様に濃度調整した試料溶液Ｌを導入し、流路３３０に送液する。
　流路３３０が試料溶液Ｌで充填された後、流路３３０を通過した試料溶液Ｌは排出ポート３２３から排出される。
　１つのウェル３４１に導入される標的分子の数は、特に制限されないが、好ましくは、１つのウェル３４１に１つ以下、すなわち、０個又は１個の標的分子が導入される。これにより、標的分子の検出を１個単位で行うことができ、デジタル計測が可能となる。なお、ウェルアレイ３４０の全てのウェル３４１に標的分子が導入される必要はない。試料溶液Ｌについては、本実施形態に記載の通りである。
　次いで、上述の《第１ウェルへの標的分子の保持》、《標的分子へのＡＬＰの結合》及び《ウェルの洗浄》を行う。
《封止液の導入》
　図１３は、図１２に示された流体デバイス３００に封止液Ｌ２が供給される様子を示す模式断面図であり、図１４は、図１２に示された流体デバイスに封止液Ｌ２が供給された状態を示す模式断面図である。
　標的分子を含みうる試料溶液Ｌ、ＡＬＰ、及びＦＤＰがウェル３４１内に収容されると、導入ポート３２２を通じて、封止液Ｌ２が流路３３０に供給される。
　このとき、封止液Ｌ２は、図１３に示すように、流路３３０内を、図面左側から右側へ向かって流れていき、流路３３０が封止液Ｌ２により満たされると、排出ポート３２３の方へ上昇する。
　封止液Ｌ２は、複数のウェル３４１に導入された液体同士を互いに混合しないように個別に封止して液滴（微小液滴ともいう）を形成することができる液である。封止液Ｌ２は、第１実施形態に記載のものを用いることができる。
　流路３３０に送液された封止液Ｌ２は、流路３３０に導入された試料溶液Ｌのうち、ウェル３４１に収容されていない試料溶液Ｌを押し流して置換する。これにより、封止液Ｌ２が複数のウェル３４１をそれぞれ個別に封止し、ウェル３４１は、独立した反応空間（微小区画３４２）となる。
　流路３３０が封止液Ｌ２で満たされると、余分な封止液Ｌ２は、排出ポート３２３から排出される。図１４は、ウェルアレイ３４０のウェル３４１の全てが封止液Ｌ２で封止され、封止されたウェル（つまり微小区画）３４２が形成された状態を示す。
　封止液Ｌ２には界面活性剤を含有させておいてもよい。界面活性剤は例えば、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性の界面活性剤などが挙げられる。
　封止液に界面活性剤が含まれていることで、ウェル３４１内に含まれる酵素が封止液Ｌ２のオイルに直接触れ、失活することを防ぐ効果が期待できる。また、標的物や反応に必要な試薬成分がオイルに溶け込んでしまうことを防ぐ効果も期待できる。
　また、予めＡＬＰやＦＤＰ等の反応試薬をウェル３４１内に加えて起き、封止液Ｌ２でウェル３４１を封止してから、ビーズなどの粒子に結合した標的物を流路３３０内に加えた場合に、封止液Ｌ２に界面活性剤が含まれているとオイルがある状態でも粒子をウェル３４１内に入れやすくなることも期待できる。
　さらに、試料溶液Ｌに脂質を溶解させておき、封止液Ｌ２を流路３３０に送液した後、再び脂質を含む液体を送液することが好ましい。
　これにより、ウェル３４１の開口部に脂質二重膜を形成でき、当該脂質二重膜によって複数のウェル３４１をそれぞれ個別に封止し、封止されたウェル３４２を形成することができる。
　脂質二重膜を形成する脂質としては、例えば、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＯＰＧ）、及びこれらの混合物等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　次いで、上述の《標的分子の検出》及び《蛍光の観察》を行う。
　以上のような方法によれば、擬陽性を抑制し、標的分子の検出精度を向上させることができる。
　次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
〈実験例１〉
（流体デバイスの製造）
　まず、図９に示す流体デバイスにおける第１ウェルＷ１一つ分に相当する試験用の流体デバイスを射出成形で作製した。ウェルプレートの形成材料はシクロオレフィンポリマーを用いた。また、カーボンブラックを添加して着色したシクロオレフィンポリマー製の蓋材１２を射出成形で作製し、レーザー溶着で接着して流体デバイスを製造した。
　第１ウェルＷ１の深さ（ウェルプレートの上面から壁材の頂部までの距離）は３０μｍであった。
　第２ウェルＷ２の開口径（長径）は１０μｍであり、第２ウェルＷ２の深さは、１５μｍであった。第２ウェルＷ２の１つあたりの体積Ｖｄは、１１００ｆＬであった。第２ウェルの全容積は、流体デバイスの容積全体の約２０％であった。
（モデルサンプル）
　本実施例では、細胞のモデルとして、磁性を有するビーズ（以下、磁性ビーズ）を用いた。また、細胞から分泌されるサイトカインを模擬したモデルとして、磁性ビーズにＤＮＡを結合させ、ＤＮＡに相補鎖を組むＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。
（試料溶液）
　試料溶液として、水（ＡｃｃｕＧＥＮＥ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｇｒａｄｅ　Ｗａｔｅｒ（ＬＯＮＺＡ社製））を溶媒とし、以下の各物質を含む溶液を調整した。
　検出用オリゴＤＮＡ：０．２５μｍｏｌ／Ｌ　Ａｌｌｅｌｅ　ｐｒｏｂｅ（ファスマック社）
　検出用オリゴＤＮＡ：５ｎｍｏｌ／Ｌ　Ｉｎｖａｄｅｒ　ｐｒｏｂｅ（ファスマック社）
　蛍光基質：２μｍｏｌ／Ｌ　１－１Ａｌｅｘａ４８８（日本オリゴサービス社）
　緩衝物質：５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ニッポンジーン社製、ｐＨ：８．５）
　塩　：２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製）
　界面活性剤：０．０５ｍａｓｓ％　Ｔｗｅｅｎ　２０（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製）
　検出酵素：０．０５ｍｇ／ｍｌ　Ｆｅｎ１
　模擬細胞：捕捉ＤＮＡが結合し、相補鎖ＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）がハイブリダイゼーションしている磁性ビーズ
　磁性ビーズ：Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ　ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ（ＪＳＲ株式会社製）、直径３μｍ
　模擬細胞としては、カルボキシル基が表面に修飾されている上記磁性ビーズにＤＮＡ捕捉用ＤＮＡ（ファスマック社）を結合させ、そこにターゲットＤＮＡ（ファスマック社）をハイブリダイゼーションさせたモデルサンプルを用いた。
（封止液）
　封止液として、オイル（Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ　ＦＣ－４０、ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を用いた。
（顕微鏡観察）
　使用した装置は、以下の通りであった。
　顕微鏡：ＢＺ－８００（キーエンス社製）
　対物レンズ：ＣＦＩ　プランアポクロマート　Ｌａｍｂｄａ　１０Ｘ（ニコン社製）
　フィルタ１：ＢＺ－Ｘフィルタ　ＴｅｘａｓＲｅｄ（キーエンス社製）
　フィルタ２：ＢＺ－Ｘフィルタ　ＧＦＰ（キーエンス社製））
［実施例］
　ＭＳ３００／ＣａｒｂｏｘｙｌをＶｏｒｔｅｘミキサーで良く攪拌した後、１０μＬ採取して１．５ｍｌチューブに加えた。
　磁気スタンドを使用し、２００μＬの反応液（ｂｕｆｆｅｒ：０．１ｍｏｌ／Ｌ　ＭＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ。ｐＨ５．０。ＮａＯＨ溶液でｐＨ調製）でビーズを１回洗浄した。その後、９２０μＬの反応ｂｕｆｆｅｒを加えた。
　純水で希釈した１００μｍｏｌ／ＬのターゲットＤＮＡ捕捉ＤＮＡ溶液８０μＬを加えた後、３０分間攪拌した。
　次いで、反応ｂｕｆｆｅｒで１０ｍｇ／ｍＬに希釈したＥＤＣを加え、３時間ローテーターで攪拌した。
　磁気スタンドを使用し、１ｍｌのＰＢＳ－Ｔでビーズを洗浄した（３回繰り返した）。
　ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ溶液）を２００μＬ加えて４℃で保存した後、０．１ｎｇ／μＬのキャリアＤＮＡ溶液でターゲットＤＮＡを１ｎｍｏｌ／Ｌに希釈した。
　ＰＢＳ－Ｔを４６μＬ、１ｎｍｏｌ／ＬターゲットＤＮＡ溶液を２μＬ、捕捉ＤＮＡ結合ビーズ溶液を２μＬ（６×１０４個）それぞれ秤量し、１．５ｍｌチューブに入れた。混合液を１５分間ｖｏｒｔｅｘミキサーで攪拌した後、ＰＢＳ－Ｔ１００μＬで３回洗浄した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液を２００μＬ加えた。
（擬似細胞の導入）
　ビーズを１個含むように０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で希釈したビーズ溶液とＩＣＡ試薬を混ぜた。試験用の流体デバイスに、ビーズ溶液とＩＣＡ試薬との混合液を８μＬ加えた。ビーズが試験用の流体デバイス内に１つだけあることを顕微鏡で確認した。
（疑似サイトカイン放出）
　上記混合液を含む流体デバイスを、ヒーターを用いて５０℃で３０秒間を加熱した。
（疑似サイトカイン検出）
　プラスチックニードルが付いたシリンジで、流体デバイスにＦＣ４０（封止液）を５００μＬ注入した。その後、流体デバイスをヒーターで６６℃７分加熱した。
　ＢＺアナライザー（キーエンス社）にて蛍光強度が１０００以上のウェル数をカウントした。
［比較例（ブランク試験）］
　ビーズにターゲットＤＮＡを結合させていないこと以外は、実施例１と同様にして行った。ビーズが試験用の流体デバイス内に１つだけあることを顕微鏡で確認した。
　評価の結果、実施例では、第２ウェル総数９０００００に対し、蛍光が観察された第２ウェルの数は、４９であった。対して、比較例では、第２ウェル総数９０００００に対し、蛍光が観察された第２ウェルの数は、２４であった。実施例では、ＤＮＡが検出されたウェル数は２５（４９－２４）であった。
　第２ウェルの全容積は、投入溶液全体の約２０％であるため、封止液で置換された試料溶液に含まれていたＤＮＡを合わせると、概算で１ビーズに１２５本のＤＮＡが結合していたと求めることができる。
　以上の結果から、本発明が有用であることが確かめられた。
〈実験例２〉
　本実施例及び比較例は、図１２に示す流体デバイス３００の基板３１０と、当該基板３１０の上面に形成された多数のウェル３４１の内部にＦＤＰを含む液体を収容し、オイルにより封止した後、一定時間静置し、蛍光顕微鏡により観察することで非特異的反応数の数をカウントした。
（流体デバイスの製造）
　まず、図１２に示すような構造を有する流体デバイスを製造した。射出成型で形成され、ウェルアレイ３４０を有するシクロオレフィンポリマー製の基板３１０と、カーボンブラックを添加して着色したシクロオレフィンポリマー製のカバー部材３２０を、レーザー溶着で接着して流体デバイスを製造した。両面テープは凸部３２１として機能するものであり、流路３３０の高さ（基板３１０の上面３１１と、カバー部材３２０の基板３１０と対向する面との間の距離）は３０μｍであった。また、カバー部材３２０は、導入ポート３２２及び排出ポート３２３を有していた。また、ウェルアレイ３４０を構成するウェル３４１の直径は、１０μｍであり、ウェル３４１の深さは、１５μｍであった。ウェル３４１の１つあたりの体積Ｖｄは、１１００ｆＬであった。
（純水の導入）
　流体デバイスに純水を２００μＬ加え、ウェルアレイ３４０を純水で満たした。純水は、ＡｃｃｕＧＥＮＥ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｇｒａｄｅ　Ｗａｔｅｒ（ＬＯＮＺＡ社製）を使用した。
　続いて、２０μＬのＦＤＰ溶液を流体デバイスに加え、ウェルアレイ３４０をＦＤＰ試薬で満たした。ＦＤＰ溶液の組成は、純水（ＡｃｃｕＧＥＮＥ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｇｒａｄｅ　Ｗａｔｅｒ（ＬＯＮＺＡ社製）、５０、１００、２００、４００、８００μＭの計５つの系のＦＤＰ（型番：１１６００　ＡＡＴ　Ｂｉｏｑｕｅｓｔ社製）、１Ｍ　ＤＥＡ（ｐＨ９．５）（型番：０９９－０３２１５　ＷＡＫＯ社）、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２（型番：Ｍ１０２８－１００ＭＬ　ＳＩＧＭＡ社）、０．０５％［ｖ／ｖ］　ｔｗｅｅｎ２０（型番：Ｐ７９４９－１００ＭＬ　ＳＩＧＭＡ社）であった。ＦＤＰ濃度が５０μＭの系が比較例であり、１００、２００、４００、及び８００μＭの系が実施例である。
（ウェルの封止）
　次いで、流体デバイス３００にオイルを５００μＬ加えて、各ウェル３４１を封止した。封止液として、オイル（Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ　ＦＣ－４０、ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を用いた。
（反応）
　室温で、４０分間静置した。すなわち、本実施例及び比較例においては、ＦＤＰを基質とする酵素であるＡＬＰは加えられていない状態で流体デバイス３００を静置した。
（顕微鏡観察）
　上記の反応時間が経過した後、各系について蛍光顕微鏡で観察し、蛍光画像を取得した。使用した装置は、以下の通りであった。
　顕微鏡：ＢＺ－８００（キーエンス社製）
　対物レンズ：ＣＦＩ　プランアポクロマート　Ｌａｍｂｄａ　１０X（ニコン社製）
　フィルタ：BＺ－Xフィルタ　ＧＦＰ（キーエンス社製））
励起光：100％
露光時間：ＦＤＰ（５０μＭ）：１ｓ
　　　　　ＦＤＰ（１００μＭ）：１/１．５ｓ
　　　　　ＦＤＰ（２００μＭ）：１/３ｓ
　　　　　ＦＤＰ（４００μＭ）：１/３．５ｓ
　　　　　ＦＤＰ（８００μＭ）：１/５ｓ
　次いで、基質濃度ごとに蛍光観察した画像を基に、各濃度のＦＤＰにおける８０００ウェルの蛍光強度の平均＋３σより蛍光強度が高いウェルを陽性ウェル（＝擬陽性ウェル）としてカウントした。基質濃度ごとの擬陽性反応が見られたウェル数のデータを以下の表１に示し、さらにそれをグラフ化したものを図１６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１及び図１６に示すように、上記カウントの結果、ＦＤＰの基質濃度が５０μＭの場合、８０００ウェル中で平均３５５．３３の擬陽性ウェルが発生していた（ｎ＝３）。一方で、１００μＭ～８００μＭでは、平均して０～２．３３の擬陽性反応しか確認されなかった。これらの擬陽性反応は、蛍光顕微鏡の励起光によるＦＤＰの自己分解により生じているものと解される。
　上記の結果から、ウェル１４１に収容された反応液中のＦＤＰ濃度が１００μＭ、２００μＭ、４００μＭ、又は８００μＭの４つの系では、擬陽性の反応を効果的に抑制できることが明らかとなった。
　加えて、反応液中のＦＤＰ濃度が４００μＭの系が最も擬陽性の反応を抑えられることが判明した。
　このように、ＦＤＰ濃度を上記の範囲内に設定することで、擬陽性の発生を効果的に抑制でき、これにより、アルカリホスファターゼによるＦＤＰの分解反応に基づく標的物の計測精度を大幅に向上させることができることが分かった。
　なお、上記の好適なＦＤＰの濃度の範囲は、ウェル３４１内にＡＬＰを加えて酵素反応を行う場合、ＡＬＰやＦＤＰ、標的物等が加えられたウェル３４１内の反応液中におけるＦＤＰの好適な濃度範囲を指す。このＦＤＰの濃度は、標的物、ＡＬＰ及びＦＤＰがウェル内に加えられて、ＡＬＰ及びＦＤＰを用いて検出反応（＝酵素反応）が開始された時点でのＦＤＰの濃度を指す。
　また、擬陽性を抑制するのに好適な上記の濃度範囲は、ＦＤＰに限定されるものではなく、デジタル計測におけるＡＬＰの基質として、ｐＮＰＰやＭＦＰ等の他の基質を用いた場合にも適用可能な濃度範囲である。なお、ＭＦＰを用いた場合にはＡＬＰと同様に蛍光反応が見られたウェル３４１を陽性としてカウントすることができる。一方で、ｐＮＰＰを用いた場合には黄色の発色が見られたウェル３４１を陽性としてカウントすることができる。
（実験結果の考察）
　ＦＤＰ濃度が１００μＭより低い場合、励起光を当てる露光時間を長くしなければならず、基質がこの励起光により自己分解しやすくなる。更に、ＦＤＰの濃度が低いため、少しの分解でも蛍光強度の上昇割合が高くなり、結果として擬陽性になりやすいことが考えられる。一方、１００μＭ以上のＦＤＰであれば、基質が十分量あるため、露光時間を抑えることができ、更に、多少分解されても、溶液に占めるＦＤＰ濃度に対して、分解されたＦＤＰの割合が低くなることから、擬陽性反応が検出されにくくなることが考えられる。
　これに対して８００μＭを超える濃度のＦＤＰを加えて酵素反応を進める場合、擬陽性反応が増加すると考えられることに加え、溶液調整やコストの面で使用しづらいことが考えられる。
　本発明によれば、溶液中の標的物質から放出される標的分子を高感度で検出可能とする流体デバイスを提供することができる。また、このような流体デバイスを用いた標的分子の検出方法を提供することができる。
　１１，２１…ウェルプレート（基板）、１１ａ，１２ａ，２１ａ，２２ａ…上面、１２，２２…蓋材、１３，２３…壁材、１３ａ…頂部、１００，２００，３００，４００…流体デバイス、１２１，２２１…注入口、１２２，２２２…排出口、ＦＣ，３３０…流路、Ｌ…試料溶液、Ｌ１…検出試薬、Ｌ２…封止液、Ｍ１…標的物質、Ｍ２…標的分子、Ｗ１…第１ウェル、Ｗ２…第２ウェル

Claims (17)

  1. 　基板と、
    　前記基板上に設けられた壁材と、
    　前記基板に対向し前記壁材に接する蓋材と、を備え、
    　前記蓋材は、厚さ方向に貫通する注入口及び排出口を有し、
    　前記壁材の頂部と前記蓋材との間には、流体が流れる流路が形成され、
    　前記基板と前記壁材とで囲まれた複数の第１ウェルと、
    　前記基板の上面であって、前記第１ウェルの底部にそれぞれ設けられた複数の第２ウェルと、を有する流体デバイス。
  2. 　前記蓋材は、前記壁材と着脱可能に設けられている請求項１に記載の流体デバイス。
  3. 　前記第１ウェルの開口部の長径が１μｍ以上１ｃｍ以下である請求項１又は２に記載の流体デバイス。
  4. 　前記第１ウェルのアスペクト比が０．００２以上３以下である請求項１に記載の流体デバイス。
  5. 　前記第２ウェルの開口部の長径が１ｎｍ以上１ｍｍ以下である請求項１に記載の流体デバイス。
  6. 　前記第２ウェルのアスペクト比が０．０５以上３以下である請求項１に記載の流体デバイス。
  7. 　請求項１に記載の流体デバイスを用いた標的分子の検出方法であって、
    　標的物質を含む試料溶液を複数の前記第１ウェル毎に独立させて充填する工程と、
    　複数の前記第１ウェルのうち、１つの前記標的物質が配置された第１ウェルにおいて前記標的物質から前記標的分子を放出させる工程と、
    　前記標的分子を前記第２ウェル毎に独立させて１分子ずつ分配する工程と、
    　前記標的分子と検出試薬との反応を生じさせ、前記標的分子を検出する工程と、を有する標的分子の検出方法。
  8. 　前記充填する工程では、前記流体デバイスに封止液を導入し、前記封止液によって前記試料溶液を前記第１ウェルに封止する請求項７に記載の標的分子の検出方法。
  9. 　前記封止液はフッ素系オイルである請求項８に記載の標的分子の検出方法。
  10. 　前記試料溶液は界面活性剤を含む請求項７に記載の標的分子の検出方法。
  11. 　前記充填する工程に先立ち、前記流体デバイスの容積に基づいて、前記第１ウェル毎に１つの前記標的物質が配置される濃度に調整された前記試料溶液を得る工程を有する請求項７に記載の標的分子の検出方法。
  12. 　ウェルを備える流体デバイスを用いた標的分子の検出方法において、
    　前記ウェル内に、標的分子と、前記標的分子に結合する結合体に固定された状態のアルカリホスファターゼと、前記アルカリホスファターゼにより脱リン酸化されることで視覚的に変化する基質との反応液を収容する工程と、
    　前記ウェル内で前記アルカリホスファターゼによる前記基質の脱リン酸化反応を用いて、前記ウェル内に収容された標的分子の存在を視覚化して検出する工程とを備え、
    　前記標的分子の存在を視覚化して検出する工程の開始時において、前記ウェルに収容された反応液における前記基質の濃度が８０μｍｏｌ／Ｌ以上８００μｍｏｌ／Ｌ以下である、標的分子の検出方法。
  13. 　前記反応液に界面活性剤が含まれている、請求項１２に記載の標的分子の検出方法。
  14. 　前記反応液が収容された前記ウェルをオイルで封止する工程を含む、請求項１２又は１３に記載の標的分子の検出方法。
  15. 　前記結合体が抗体である、請求項１２又は１３に記載の標的分子の検出方法。
  16. 　前記標的分子を前記ウェル内に収容する工程において、前記標的分子を補足する捕捉手段が固定された粒子を用いて前記標的分子を前記ウェル内に保持する、請求項１２又は１３に記載の標的分子の検出方法。
  17. 　前記反応液に緩衝液が含まれる、請求項１２又は１３に記載の標的分子の検出方法。
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