JP2022159046A - 分析用チップ、分析方法及び分析用チップの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】これまで攪拌用微粒子を備えた分析用チップでは、気泡の発生を抑えるための攪拌用微粒子の物性や製造方法が規定されていなかったため、十分に攪拌用微粒子の凝集を防ぐことができず、気泡が混入することを抑制することができなかった。【解決手段】本発明は、選択結合性物質がその表面に固定された基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納又は注入され、該微粒子の表面に界面活性剤がコーティングされ、該微粒子の静電電位が０．０１ｋＶ以上０．２ｋＶ以下であることを特徴とする分析用チップを提供するものである。【選択図】図１
Description
本発明は、選択結合性物質、すなわち被検物質と選択的に結合する物質を固定化した基板を備えた分析用チップ、当該分析用チップを用いた被検物質の分析方法及び当該分析用チップの製造方法に関する。
分析用チップは、遺伝子、タンパク質、脂質、糖などの選択結合性物質が固定化された基板を有し、この基板上の選択結合性物質と被検物質を通常溶液として反応させて、反応結果から被検物質の存在の有無、状態又は量などを分析するために用いられる。
分析用チップとして、分析用チップ内部に、被験物質を含む溶液を攪拌するための微粒子を備えた分析用チップが知られており、このような分析用チップとして、被検物質と固定化された選択結合性物質との選択的反応を阻害する気泡の発生を抑え、反応むらによる検出のばらつきや検出感度の低下を抑えるため、攪拌用微粒子の表面に界面活性剤をコーティングして微粒子の凝集を防ぎ、また、分析用チップ基板とそのカバーとの間の空隙への攪拌用微粒子の注入が容易な分析用チップが開示されている（特許文献１）。
本発明は、被検物質と固定化された選択結合性物質との選択的反応を阻害する気泡の発生を抑える分析用チップを提供するものである。これまで気泡の発生を抑えるための攪拌用微粒子の物性や製造方法が規定されていなかったため、十分に攪拌用微粒子の凝集を防ぐことができず、気泡が混入することを抑制することができないという課題があった。
発明者らは鋭意検討を重ねた結果、攪拌用の微粒子の表面に界面活性剤をコーティングし、該微粒子の静電電位を０．０１ｋＶ以上０．２ｋＶ以下にすることにより、上記課題を解決することができることを見出した。
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１）選択結合性物質が表面に固定化された基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納又は注入され、該微粒子表面に界面活性剤がコーティングされている分析用チップであって、該微粒子の静電電位が０．０１ｋＶ以上０．２ｋＶ以下である分析用チップ。
（２）微粒子の材質がセラミックまたはガラスを含む、（１）に記載の分析用チップ。
（３）微粒子の粒径が０．１μｍ以上３００μｍ以下である、（１）または（２）に記載の分析用チップ。
（４）微粒子の表面にコーティングされている界面活性剤が陰イオン性界面活性剤又は非イオン性界面活性剤である、（１）～（３）のいずれかに記載の分析用チップ。
（５）前記基板が、その表面に凹部及び凸部からなる凹凸部を有し、該凸部の上端面に選択結合性物質が固定化された基板である、（１）～（４）のいずれかに記載の分析用チップ。
（６）（１）～（５）のいずれか一項に記載の分析用チップに被検物質を含む溶液を接触させて前記基板表面に固定化された選択結合性物質に該被検物質を選択的に結合させ、分析用チップ上に該選択結合性物質を介して結合した該被検物質量を測定する、被検物質の分析方法。
（７）選択結合性物質が表面に固定化された基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納又は注入され、該微粒子表面に界面活性剤がコーティングされている分析用チップの製造方法であって、
微粒子を、界面活性剤を含む溶液に浸漬する工程Ａ、
工程Ａで浸漬された微粒子を、界面活性剤を含む溶液から回収する工程Ｂ、
工程Ｂで回収された、界面活性剤を含む溶液で表面が湿潤した微粒子を乾燥する工程Ｃ、及び、
工程Ｃで乾燥された微粒子を、前記基板とカバー部材との間の空隙に格納又は注入する工程Ｄ、を含み、
工程Ｃは、各微粒子が立体的に多点で接触する状態で行われる、製造方法。
（１）選択結合性物質が表面に固定化された基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納又は注入され、該微粒子表面に界面活性剤がコーティングされている分析用チップであって、該微粒子の静電電位が０．０１ｋＶ以上０．２ｋＶ以下である分析用チップ。
（２）微粒子の材質がセラミックまたはガラスを含む、（１）に記載の分析用チップ。
（３）微粒子の粒径が０．１μｍ以上３００μｍ以下である、（１）または（２）に記載の分析用チップ。
（４）微粒子の表面にコーティングされている界面活性剤が陰イオン性界面活性剤又は非イオン性界面活性剤である、（１）～（３）のいずれかに記載の分析用チップ。
（５）前記基板が、その表面に凹部及び凸部からなる凹凸部を有し、該凸部の上端面に選択結合性物質が固定化された基板である、（１）～（４）のいずれかに記載の分析用チップ。
（６）（１）～（５）のいずれか一項に記載の分析用チップに被検物質を含む溶液を接触させて前記基板表面に固定化された選択結合性物質に該被検物質を選択的に結合させ、分析用チップ上に該選択結合性物質を介して結合した該被検物質量を測定する、被検物質の分析方法。
（７）選択結合性物質が表面に固定化された基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納又は注入され、該微粒子表面に界面活性剤がコーティングされている分析用チップの製造方法であって、
微粒子を、界面活性剤を含む溶液に浸漬する工程Ａ、
工程Ａで浸漬された微粒子を、界面活性剤を含む溶液から回収する工程Ｂ、
工程Ｂで回収された、界面活性剤を含む溶液で表面が湿潤した微粒子を乾燥する工程Ｃ、及び、
工程Ｃで乾燥された微粒子を、前記基板とカバー部材との間の空隙に格納又は注入する工程Ｄ、を含み、
工程Ｃは、各微粒子が立体的に多点で接触する状態で行われる、製造方法。
本発明の分析用チップによれば、分析用チップ内部の反応液中での気泡の残留や発生が抑えられる分析用チップを提供することができる。この結果、気泡が選択結合性物質と被験物質との反応を阻害して反応むらによる検出のばらつきや検出感度の低下が顕著に抑制され、微量な発現遺伝子の微小な変動をとらえることが必要な測定に対して、被検物質を十分に高い感度、高い精度で検出することができる。
また、本発明の分析用チップにより、微粒子の凝集を防ぎ、また分析用チップ基板とカバー部材との間の空隙に容易かつスムーズに微粒子を注入することができる。
本発明の分析用チップは、選択結合性物質がその表面に固定された基板と、該基板と接着されたカバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納又は注入され、該微粒子の表面に界面活性剤がコーティングされ、該微粒子の静電電位が０．０１ｋＶ以上０．２ｋＶ以下であることを特徴とする。界面活性剤によるコーティングとは、微粒子の表面の一部又は全部に、界面活性剤を塗布、付着又は被覆することを意味し、このコーティングは、例えば後述する方法によって行うことができる。
本発明の微粒子を格納した分析用チップの一例を図１に示す。図１に示す例において、基板１の表面は、凹部１０及び凸部１１からなる凹凸部により構成されている。凹部１０に微粒子２が格納されており、凸部１１の上面には、選択結合性物質４５（例えば核酸）が固定化されている。
この基板１に固定化された選択結合性物質４５（例えば核酸）と反応させるために、分析用チップに被験物質を含む溶液を加えると、微粒子２の表面に付着した微小気泡が液体中に遊離し、図２に示すように気泡２６となって凸部を覆うため、覆われた凸部表面上の選択結合性物質は被験物質と反応できない。本発明の分析用チップにおいては、微粒子２の表面に界面活性剤がコーティングされていることにより、微粒子表面に気泡が付着しない又は付着しにくいので、気泡の発生を抑制することができる。これにより、基板１表面の全ての選択結合性物質４５が被験物質と反応することが可能となり、得られるデータの信頼性と再現性とを上昇させることができる。
微粒子の静電電位（静電気）が高いと一般的に微粒子どうしが凝集しやすくなり、上記のような分析用チップに被験物質を含む溶液を加える際に、微粒子への気泡が付着しやすくなり、気泡が発生しやすくなる。このため、本発明においては、分析用チップに用いる微粒子の静電電位が０．０１ｋＶ以上０．２ｋＶ以下であり、好ましくは０．０１ｋＶ以上０．１ｋＶ以下である。この範囲の静電電位であれば、上記のような分析用チップ内で微粒子が凝集せず、分析の際に微粒子への気泡の付着や分析用チップ内の気泡の発生を効果的に抑制することが可能となる。
微粒子の静電電位の測定は、静電気が帯電すると電界を発生する原理を応用し、この静電気による電界をセンサーが検知して静電気の電圧に換算して表示することにより、静電気を非接触で測定する測定装置を使用して測定することができる。測定の際、微粒子は乾燥状態の微粒子を使用し、前処理などは実施しない。また、実際に分析用チップを使用する際と同じ実験環境にて測定を行う。微粒子の静電電位の測定において、まず複数の微粒子を非導電性素材の台上に配置する。測定時、測定距離を３０ｍｍに設定し、センサーから測定距離をあわせるための光が照射され、その焦点をあわせるが、測定箇所となる焦点があたった場所が微粒子で被覆された状態にして測定を行う。また、測定者はリストストラップ、帯電防止靴などによって人体接地を必ず実施し、測定者の帯電電位を確実に低く抑制して測定を行う。このような測定方法として、例えば、校正済みの静電電位測定器（AS-mini II Achilles社製）を使用し、測定器は接地体を使用してゼロ点調整を行い、測定対象の微粒子に対して３０ｍｍの位置で通常モードで静電電位を測定する。測定の際、微粒子は乾燥した状態とし、プラスチップなどの非導電性素材の板上に微粒子が縦・横が２ｃｍ×２ｃｍ以上の面積を被覆した状態に配置し、測定器からから照射された光の焦点をあわせて静電電位を測定する。
微粒子の静電電位を低下させるために、微粒子表面に界面活性剤をコーティングする。界面活性剤としては、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤が挙げられ、これらの中でも陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤が好ましく用いられる。
陰イオン界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ラウリルサルコシンナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、ラウロイルサルコシンナトリウムなどが挙げられる。
陽イオン界面活性剤としては、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、エチル硫酸ラノリン脂肪酸アミノプロピルエチルジメチルアンモニウム、塩化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ステアリルトリメチルアンモニウムなどが挙げられる。
両性界面活性剤としては、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－２－ヒドロキシプロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、ｎ－ドデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホナート（ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ ３－１２ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）などが挙げられる。
非イオン界面活性剤としては、ジメチルデシルホスフィンオキシド（ＡＰＯ－１０）、ドデシルジメチルホスフィンオキシド（ＡＰＯ－１２）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ＢＲＩＪ－３５）、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（ＢＲＩＪ－５８）、ポリオキシエチレン（８０）ソルビタンモノオレイン酸エステル（ポリソルベート８０、Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル（ポリソルベート２０、Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリエチレングリコールｐ－（１，１，３，３－テトラメチルブチル）フェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００）、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１１４、ｎ－デカノイル－Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン（ＭＥＧＡ－１０）、ｎ－ノナノイル－Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン（ＭＥＧＡ－９）、ｎ－オクタノイル－Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン（ＭＥＧＡ－８）、ノニルフェニル－ポリエチレングリコール（ＮＰ－４０）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、モノステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸ソルビタン、モノステアリン酸プロピレングリコール、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（プルロニック（登録商標）Ｆ６８）、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（プルロニック（登録商標）Ｆ１２７）などが挙げられる。
これらの中でも、陰イオン界面活性剤としては、界面活性効果が強力であることからドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デオキシコール酸ナトリウムが特に好ましく用いられ、非イオン界面活性剤としては、プルロニック（登録商標）Ｆ６８、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７が特に好ましく用いられる。
微粒子の形状は、被験物質溶液を攪拌することができれば特に限定されず、球状の形状以外に、多角形でも良く、円筒形、角柱形などのマイクロロッド状（微細な棒状）など任意の形状とすることができる。
微粒子のサイズとしては、微粒子の直径が、前記基板の選択結合性物質固定化面とカバー部材との間隔の最短距離未満であることが好ましい。例えば、球状の微粒子の場合、０．１μｍ～３００μｍの範囲とすることができる。微粒子が円筒形の微粒子の場合は、その底面直径を微粒子の直径と見なして、底面直径が前記基板の選択結合性物質固定化面とカバー部材との間隔の最短距離未満であることが好ましい。例えば、円筒形の微粒子の場合、長さ５０μｍ～５０００μｍ、底面直径１０μｍ～３００μｍの範囲とすることができる。
微粒子の材質としては、ガラス、セラミック（例えばイットリウム部分安定化ジルコニア）、金、白金、ステンレス、鉄、酸化アルミ（アルミナ）、酸化チタン（チタニア）等の金属若しくは金属酸化物、ナイロンやポリスチレン等のプラスチックを用いることができる。これらの中でも、分析用チップ内に加えられる被験物質を含む溶液を効率よく攪拌する観点から、比重が被験物質を含む溶液よりも高いことが好ましく、攪拌時に破壊されにくい剛性をもち、被験物質を含む溶液と反応しにくい性質を持つという観点から、微粒子の材質としてセラミックを含むことが特に好ましい。
また、界面活性剤がコーティングされる微粒子の表面は、適度な粗さを有していることが好ましい。即ち、微粒子の表面の中心線平均粗さ（Ｒａ値）が４０ｎｍ以上３００ｎｍ以下であることが好ましい。この範囲の表面粗さを有する微粒子を使用することで、ビーズの表面積がより大きいためにより多くの界面活性剤を微粒子表面にコーティングすることが可能となる。セラミックス製微粒子の場合、材質の強度を考慮すると、Ｒａ値が４０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることが好ましい。
本発明の分析用チップを構成する基板は、その表面に選択結合物質が結合されており、凹部及び選択結合性物質を固定化する凸部からなる凹凸部を有することが好ましい。このような構造をとることにより、検出の際、非特異的に吸着した被検物質を検出することがないので、ノイズが小さく、結果的によりＳ／Ｎが良好な結果を得ることができる。本発明の分析用チップは、該基板の表面を覆い該基板と接着されたカバー部材を備える。カバー部材を備えることにより、被検物質が含まれる溶液を簡便に密閉保持することができ、その結果、被検物質と、基板の領域に固定化された選択結合性物質との反応を、安定して行うことができる。また、本発明の分析用チップには予め微粒子を注入（格納）しておくことができ、被験物質溶液をアプライする作業を容易に行うことが可能である。
本発明で使用する分析用チップの具体例を図１で例示する。
また、本発明において、選択結合性物質とは、被検物質と直接的又は間接的に、選択的に結合し得る各種の物質を意味する。基板の表面に結合しうる選択結合性物質の代表的な例としては、核酸、蛋白質、ペプチド、糖類、脂質を挙げることができる
本発明の分析用チップは、各種被検物質の分析に利用することができる。すなわち、本発明の分析用チップの選択結合性物質を固定化した基板に、被検物質を接触させて該選択結合性物質と選択的に結合させ、基板上に該選択結合性物質を介して結合した該被検物質の有無又は量を測定することにより、被検物質を分析することができる。
本発明の分析用チップは、各種被検物質の分析に利用することができる。すなわち、本発明の分析用チップの選択結合性物質を固定化した基板に、被検物質を接触させて該選択結合性物質と選択的に結合させ、基板上に該選択結合性物質を介して結合した該被検物質の有無又は量を測定することにより、被検物質を分析することができる。
本発明の分析用チップの製造方法は、選択結合性物質が表面に固定化された基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納又は注入され、該微粒子表面に界面活性剤がコーティングされている分析用チップの製造方法であって、後述の工程Ａ～Ｄを含むものであるが、該微粒子として静電電位が０．０１ｋＶ以上０．２ｋＶであるものを用いる。
本発明の製造方法において、工程Ａは、微粒子を界面活性剤を含む溶液に浸漬する工程である。微粒子に対して多くの界面活性剤をコーティングさせるためには、微粒子表面全体に対して界面活性剤を多く触れさせる必要があり、このための最適な方法として、界面活性剤を含む溶液に微粒子を浸漬させる。界面活性剤を含む溶液に微粒子を浸漬させる方法は、容器に入れた界面活性剤を含む溶液に微粒子を投入する方法や微粒子に界面活性剤を含む溶液を塗布、噴霧する方法などをとることができる。界面活性剤を含む溶液は、界面活性剤を溶融した状態でも良いし、界面活性剤を水や有機溶剤などの溶媒に溶解した状態でも良い、界面活性剤を含む溶液の濃度は、０．０１％～１０％が好ましく、０．０５％～２％の濃度がより好ましく用いられる。
本発明の製造方法では、工程Ａで界面活性剤を含む溶液に浸漬された微粒子を、界面活性剤を含む溶液から回収する工程Ｂを実施する。界面活性剤を含む溶液から回収せずに、次の工程である乾燥工程を実施すると、乾燥に時間がかかることにより、重力により界面活性剤が微粒子表面で除去されてしまい、多くの量の界面活性剤をコーティングすることができない。微粒子を、界面活性剤を含む溶液から回収する方法としては、界面活性剤を含む溶液から微粒子を単純に取り出す方法、金網や濾過膜、濾紙などを使用して、界面活性剤を含む溶液を濾過することにより、微粒子を回収する方法や界面活性剤を含む溶液をスポイトやピペットなどを使用して微粒子から取り除く方法などを取ることができる。
本発明の製造方法では、工程Ｂで回収された、界面活性剤を含む溶液で表面が湿潤した微粒子を乾燥する工程Ｃを実施する。工程Ｃでは、微粒子を、界面活性剤を含む溶液で表面が湿潤した状態から乾燥することにより、微粒子表面に対してより多くの界面活性剤をコーティングすることができる。微粒子表面に対して界面活性剤をより多くコーティングするためには、表面に界面活性剤の溶液を多く保持しながら乾燥させる必要があるが、従来の方法では、図３で例を示すように、微粒子を平面、単層状態で乾燥させた場合、重力の影響により界面活性剤の溶液が微粒子表面に保持されなくなり、多くの界面活性剤がコーティングされず、表面の一部にしか界面活性剤がコーティングされない場合がある。このため、本発明においては、図４で例を示すように、乾燥の際には各微粒子が立体的に多点で接触した状態で乾燥を行う。このように各微粒子を立体的に多点で接触した状態にする方法としては、使用する微粒子が単層にならないように、底面積が制限された容器に微粒子を入れることにより、多層に積みあがるようにして、各微粒子を立体的に多点で接触した状態とすることができる。また、容器を使用する際に、容器の中を仕切り板で仕切られた構造を作製し、これにより使用する微粒子が単層にならないように底面積を制限して微粒子が多層に積みあがるようにして、各微粒子を立体的に多点で接触した状態にすることも可能である。微粒子を立体的に多点で接触した状態にする際に使用する容器の形状は、直方体状、立方体状、柱状、球状、錐体形状、チューブ状などどのような形状の容器を使用してもよい。
工程Ｃにおける乾燥の際には微粒子どうしはできるだけ多くの点で接触していることが好ましく、各微粒子が立体的に多点で接触した状態にすることにより、表面張力の影響で、界面活性剤の溶液が微粒子の表面でより多く保持された状態となり、この状態で乾燥を行うことにより、微粒子表面により多くの界面活性剤がコーティングされることになる。
工程Ｃの乾燥は、室温で行っても加熱乾燥により行ってもよいし、真空乾燥により行ってもよい。
本発明の製造方法では、工程Ｃで乾燥された微粒子を、基板とカバー部材との間の空隙に格納又は注入する工程Ｄを行い、分析用チップを製造する。この際、微粒子表面に多くの界面活性剤がコーティングされているため、静電電位が低下し、微粒子どうしの凝集を定常的に防ぐことにより、基板とカバー部材との間の空隙に容易かつスムーズに微粒子を注入することができる。
本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。本発明は下記実施例に限定されない。
実施例１
（１）分析用チップの基板の作製
公知の方法であるＬＩＧＡ（Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｅ Ｇａｌｖａｎｏｆｏｒｍｕｎｇ Ａｂｆｏｒｍｕｎｇ）プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法により後述するような形状を有するポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）製の基板を得た。用いたＰＭＭＡの平均分子量は５万であり、ＰＭＭＡ中には１重量％の割合で、カーボンブラック（三菱化学製 ＃３０５０Ｂ）を含有させて、基板を黒色にした。
（１）分析用チップの基板の作製
公知の方法であるＬＩＧＡ（Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｅ Ｇａｌｖａｎｏｆｏｒｍｕｎｇ Ａｂｆｏｒｍｕｎｇ）プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法により後述するような形状を有するポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）製の基板を得た。用いたＰＭＭＡの平均分子量は５万であり、ＰＭＭＡ中には１重量％の割合で、カーボンブラック（三菱化学製 ＃３０５０Ｂ）を含有させて、基板を黒色にした。
基板としては、外形が縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、基板の中央部に、縦３９．４ｍｍ、横１９．０ｍｍ、深さ０．１５ｍｍの凹部を設け、この凹部の中に、直径０．１ｍｍ、高さ０．１５ｍｍの凸部を９２４８箇所設けた基板（以下「基板Ａ」とする）を用いた。この基板Ａにおいて、凸部上面と平坦部上面との高さの差（凸部は高さの平均値）は、３μｍ以下であった。また、凸部上面の高さのばらつき（最も高い凸部上面の高さと最も低い凸部上面との高さの差）は、３μｍ以下であった。また、凸部のピッチを０．５ｍｍとした。
上記基板Ａを１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃で１２時間浸漬した。これを、純水、０．１ＮのＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄し、基板表面にカルボキシル基を生成させた。
（２）選択結合性物質の固定化
基板Ａに対し、以下の条件で、それぞれ選択結合性物質（プローブＤＮＡ）としてオリゴヌクレオチドを固定化した。オリゴヌクレオチドとしては、オペロン社製ＤＮＡマイクロアレイ用オリゴヌクレオチドセット“Homo sapiens (human) AROS V4.0（各６０塩基）”を用いた。このオリゴヌクレオチドを、純水に０．３ｎｍｏｌ／μＬの濃度となるよう溶解させて、ストック溶液とした。このストック溶液を基板にスポット（点着）する際は、ＰＢＳ（８ｇのＮａＣｌ、２．９ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＫＣｌ、及び０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４を合わせて純水に溶かし、１Ｌにメスアップしたものに、塩酸を加えてｐＨ５．５に調整したもの）で１０倍希釈して、プローブＤＮＡの終濃度を０．０３ｎｍｏｌ／μＬとし、かつ、ＰＭＭＡ製基板表面に生成させたカルボキシル基とプローブＤＮＡの末端アミノ基とを縮合させるため、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍＬとした。この溶液をアレイヤー（スポッター）（日本レーザー電子製；Ｇｅｎｅ Ｓｔａｍｐ－ＩＩ）を用いて、基板Ａの全ての凸部上面にスポットした。次いで、スポットした基板を密閉したプラスチック容器に入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートした。最後に純水で基板を洗浄し、スピンドライヤーで遠心して乾燥した。
基板Ａに対し、以下の条件で、それぞれ選択結合性物質（プローブＤＮＡ）としてオリゴヌクレオチドを固定化した。オリゴヌクレオチドとしては、オペロン社製ＤＮＡマイクロアレイ用オリゴヌクレオチドセット“Homo sapiens (human) AROS V4.0（各６０塩基）”を用いた。このオリゴヌクレオチドを、純水に０．３ｎｍｏｌ／μＬの濃度となるよう溶解させて、ストック溶液とした。このストック溶液を基板にスポット（点着）する際は、ＰＢＳ（８ｇのＮａＣｌ、２．９ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＫＣｌ、及び０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４を合わせて純水に溶かし、１Ｌにメスアップしたものに、塩酸を加えてｐＨ５．５に調整したもの）で１０倍希釈して、プローブＤＮＡの終濃度を０．０３ｎｍｏｌ／μＬとし、かつ、ＰＭＭＡ製基板表面に生成させたカルボキシル基とプローブＤＮＡの末端アミノ基とを縮合させるため、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍＬとした。この溶液をアレイヤー（スポッター）（日本レーザー電子製；Ｇｅｎｅ Ｓｔａｍｐ－ＩＩ）を用いて、基板Ａの全ての凸部上面にスポットした。次いで、スポットした基板を密閉したプラスチック容器に入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートした。最後に純水で基板を洗浄し、スピンドライヤーで遠心して乾燥した。
（３）分析用チップ基板へのカバー部材の貼付
選択結合性物質を固定化した上記基板Ａに対し、次のようにカバー部材を貼付した。
選択結合性物質を固定化した上記基板Ａに対し、次のようにカバー部材を貼付した。
カバー部材としては、縦４１．４ｍｍ、横２１ｍｍ、厚さ１ｍｍのＰＭＭＡ平板を切削加工により作製してカバー部材とした。作製した該カバー部材には、貫通孔および液面駐止用チャンバーを設けた。そして、接着部材として縦４１．４ｍｍ、横２１ｍｍを幅１ｍｍの両面テープを用い、この両面テープをカバー部材を縁取るように、かつ厚さ５０μｍで積層させて貼り付けたのち、該カバー部材を基板Ａに貼付した。
（４）攪拌用微粒子表面の界面活性剤コーティング
直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１０ｇを、１０ｍＬサンプル瓶（マルエム製、口内径×胴径×全長：φ１４．８×φ２１×４５ｍｍ）に入れ、微粒子どうしを立体的に多点で接触した状態とし、これに界面活性剤として０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液５０ｍｌを加えた。これを１０分間超音波処理したのち、上清（ＳＤＳ成分）をスポイトで除去し、オーブンを用いて微粒子を７０℃にて、１２時間乾燥させた。乾燥後の微粒子は微粒子どうしが凝集しにくく、さらさらの状態であった。同様のコーティング操作を５回行った。乾燥後の微粒子をポリプロピレンの板上で縦・横が２ｃｍ×２ｃｍ以上の面積を被覆する状態に配置し、校正済みの静電電位測定器（AS-mini II Achilles社製）を使用して、接地体を使用してゼロ点調整を行い、微粒子に対して３０ｍｍの位置で通常モードを使用して静電電位を測定した。測定の結果、静電電位は０．０５ｋＶ、０．０３ｋＶ、０．０７ｋＶ、０．０６ｋＶ、０．０７ｋＶであり、全ての微粒子で、静電電位は０．０１ｋＶ以上０．２ｋＶ以下の値を示した。
直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１０ｇを、１０ｍＬサンプル瓶（マルエム製、口内径×胴径×全長：φ１４．８×φ２１×４５ｍｍ）に入れ、微粒子どうしを立体的に多点で接触した状態とし、これに界面活性剤として０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液５０ｍｌを加えた。これを１０分間超音波処理したのち、上清（ＳＤＳ成分）をスポイトで除去し、オーブンを用いて微粒子を７０℃にて、１２時間乾燥させた。乾燥後の微粒子は微粒子どうしが凝集しにくく、さらさらの状態であった。同様のコーティング操作を５回行った。乾燥後の微粒子をポリプロピレンの板上で縦・横が２ｃｍ×２ｃｍ以上の面積を被覆する状態に配置し、校正済みの静電電位測定器（AS-mini II Achilles社製）を使用して、接地体を使用してゼロ点調整を行い、微粒子に対して３０ｍｍの位置で通常モードを使用して静電電位を測定した。測定の結果、静電電位は０．０５ｋＶ、０．０３ｋＶ、０．０７ｋＶ、０．０６ｋＶ、０．０７ｋＶであり、全ての微粒子で、静電電位は０．０１ｋＶ以上０．２ｋＶ以下の値を示した。
（５）分析用チップへの微粒子の注入（格納）と注入（格納）操作性の評価
上記（３）でカバー部材を貼りつけた基板Ａに、上記（４）で界面活性剤をコーティングしたジルコニア製微粒子１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空隙（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に注入（格納）した。微粒子の注入は、カバー部材の貫通孔から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ１」とした。
上記（３）でカバー部材を貼りつけた基板Ａに、上記（４）で界面活性剤をコーティングしたジルコニア製微粒子１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空隙（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に注入（格納）した。微粒子の注入は、カバー部材の貫通孔から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ１」とした。
（６）被験物質ＤＮＡの調製
被験物質としては、マイクロアレイの被験物質として一般的な、ａＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ）を用いた。市販のヒト培養細胞由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ）５μｇから、Ａｍｂｉｏｎ社製ａＲＮＡ調製キットを使用して、５μｇのＣｙ３標識ａＲＮＡを得た。
被験物質としては、マイクロアレイの被験物質として一般的な、ａＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ）を用いた。市販のヒト培養細胞由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ）５μｇから、Ａｍｂｉｏｎ社製ａＲＮＡ調製キットを使用して、５μｇのＣｙ３標識ａＲＮＡを得た。
本実施例、及び以下の実施例、比較例において、ハイブリダイゼーションの際の被験物質溶液は、特に断りのない限り、上記で調製した標識ａＲＮＡを、１重量％ＢＳＡ、５×ＳＳＣ、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡ、０．１重量％ＳＤＳの溶液（各濃度はいずれも終濃度）で希釈したものを用いた。
（７）ハイブリダイゼーション反応と気泡発生数の評価
マイクロピペットを用いて、分析用チップ１の基板Ａとカバー部材との空隙（反応槽）に、Ｃｙ３標識ａＲＮＡ２００ｎｇを含むハイブリダイゼーション被験物質溶液１６５μＬを貫通孔より注入した。このとき、容易に溶液を注入でき、気泡が混入することはなかった。封止材としてカプトンテープ（アズワン）を用い、４つの貫通孔を塞いだ。ハイブリダイゼーションチャンバー（Ｔａｋａｒａ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｃｈａｍｂｅｒ（タカラバイオ（株）製）を、シート振盪台（東京理化器械（株）製 ＭＭＳ ＦＩＴ－Ｓ）に密着させて固定し、分析用チップ１をハイブリダイゼーションチャンバー内にセットした。このとき、分析用チップ１をセットする位置の両端の凹みに、１５μＬずつ超純水を滴下した。ハイブリダイゼーションチャンバー蓋を閉めた後、６本の固定ネジを締めて固定し、４２℃に設定した恒温チャンバー（東京理化器械（株）製 ＦＭＳ－１０００）内に据え付けた振盪機（東京理化器械（株）製 ＭＭＳ－３１０）の上に載せて固定した。恒温チャンバーの前面をアルミホイルで遮光して、２５０回転／分で旋回振盪しながら、４２℃で１６時間インキュベートした。インキュベート後、ハイブリダイゼーションチャンバーから分析用チップ１を取り出した。
マイクロピペットを用いて、分析用チップ１の基板Ａとカバー部材との空隙（反応槽）に、Ｃｙ３標識ａＲＮＡ２００ｎｇを含むハイブリダイゼーション被験物質溶液１６５μＬを貫通孔より注入した。このとき、容易に溶液を注入でき、気泡が混入することはなかった。封止材としてカプトンテープ（アズワン）を用い、４つの貫通孔を塞いだ。ハイブリダイゼーションチャンバー（Ｔａｋａｒａ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｃｈａｍｂｅｒ（タカラバイオ（株）製）を、シート振盪台（東京理化器械（株）製 ＭＭＳ ＦＩＴ－Ｓ）に密着させて固定し、分析用チップ１をハイブリダイゼーションチャンバー内にセットした。このとき、分析用チップ１をセットする位置の両端の凹みに、１５μＬずつ超純水を滴下した。ハイブリダイゼーションチャンバー蓋を閉めた後、６本の固定ネジを締めて固定し、４２℃に設定した恒温チャンバー（東京理化器械（株）製 ＦＭＳ－１０００）内に据え付けた振盪機（東京理化器械（株）製 ＭＭＳ－３１０）の上に載せて固定した。恒温チャンバーの前面をアルミホイルで遮光して、２５０回転／分で旋回振盪しながら、４２℃で１６時間インキュベートした。インキュベート後、ハイブリダイゼーションチャンバーから分析用チップ１を取り出した。
カバー部材を通して、分析用チップ１の基板Ａ上に観察された被験物質溶液中の気泡数を計数した。分析用チップ１を用いたハイブリダイゼーション反応を１０回実施した結果、被験物質溶液中に発生した気泡数は、１回当たりの平均で０．４個であった（表１）。
（８）蛍光シグナル値の測定と検出ばらつきの評価
分析用チップ１の基板Ａに接着したカバー部材と両面テープを脱離した後、基板Ａを洗浄、乾燥した。ＤＮＡチップ用のスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製 ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）に上記処理後の基板Ａをセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態において、ハイブリダイゼーション反応した被験物質の標識体シグナル値（蛍光強度）、バックグラウンドノイズを測定した。全９２４８個のスポットのうち、３２個をバックグラウンド蛍光値測定用のネガティブコントロールスポットとし、個々のシグナル値からバックグラウンドシグナル値を差し引いて各スポットの真のシグナル値を算出した。
分析用チップ１の基板Ａに接着したカバー部材と両面テープを脱離した後、基板Ａを洗浄、乾燥した。ＤＮＡチップ用のスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製 ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）に上記処理後の基板Ａをセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態において、ハイブリダイゼーション反応した被験物質の標識体シグナル値（蛍光強度）、バックグラウンドノイズを測定した。全９２４８個のスポットのうち、３２個をバックグラウンド蛍光値測定用のネガティブコントロールスポットとし、個々のシグナル値からバックグラウンドシグナル値を差し引いて各スポットの真のシグナル値を算出した。
ハイブリダイゼーション反応の反応むらによる検出のばらつきの評価として、分析用チップ１を用いたハイブリダイゼーション反応を１０回実施し、各回におけるバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値＝全回のバックグラウンドシグナル値の標準偏差／全回のバックグラウンドシグナル値の平均値（％））を計算した。その結果、１０回の評価におけるバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）の平均値は３．０％であった（表１）。
実施例２
実施例１（６）で調製した被験物質溶液を次のように脱気処理を行ったこと以外は、実施例１と同様に分析用チップ１を用いた評価を実施した。
実施例１（６）で調製した被験物質溶液を次のように脱気処理を行ったこと以外は、実施例１と同様に分析用チップ１を用いた評価を実施した。
被験物質溶液１７５μｌを０．２ｍｌＰＣＲチューブ（アシスト社製７２．７３７．００２）にいれ、フタを開けたまま脱気装置（ＵＬＶＡＣ社製アスピレーターＮＤＡ－０１５型）にセットして脱気を行った。脱気時の到達圧力は、装置の表示で５０ｈＰａ、脱気時間は２５分間とした。
実施例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の基板上に観察された被験物質溶液中の気泡数を計数したところ、気泡数は、１０回実施した結果の１回当たりの平均値が０．２個であった（表１）。
また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、１．５％であった（表１）。
比較例１
実施例１の（４）において、１０ｍＬサンプル瓶の代わりに、ステンレス製バット（１０ｃｍ×１０ｃｍ×５ｃｍ）を用いて、界面活性剤のコーティングを行った。すなわち、ステンレス製バット（１０ｃｍ×１０ｃｍ×５ｃｍ）に直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１０ｇを入れ、これに界面活性剤として０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液５０ｍｌを加えた。これを１０分間超音波処理したのち、上清（ＳＤＳ成分）をスポイトで除去したところ、微粒子どうしは平面、単層状態となり、この状態でオーブンを用いて微粒子を７０℃にて、１２時間乾燥させた。乾燥後に得られた微粒子は、微粒子どうしが凝集しやすく、微粒子塊を形成しやすい状態であった。実施例１と同様に静電電位を測定した結果、静電電位は０．４５ｋＶ、０．４１ｋＶ、０．３８ｋＶ、０．２７ｋＶ、０．５１ｋＶであり、全ての微粒子で静電電位は０．２ｋＶを超える値を示した。
実施例１の（４）において、１０ｍＬサンプル瓶の代わりに、ステンレス製バット（１０ｃｍ×１０ｃｍ×５ｃｍ）を用いて、界面活性剤のコーティングを行った。すなわち、ステンレス製バット（１０ｃｍ×１０ｃｍ×５ｃｍ）に直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１０ｇを入れ、これに界面活性剤として０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液５０ｍｌを加えた。これを１０分間超音波処理したのち、上清（ＳＤＳ成分）をスポイトで除去したところ、微粒子どうしは平面、単層状態となり、この状態でオーブンを用いて微粒子を７０℃にて、１２時間乾燥させた。乾燥後に得られた微粒子は、微粒子どうしが凝集しやすく、微粒子塊を形成しやすい状態であった。実施例１と同様に静電電位を測定した結果、静電電位は０．４５ｋＶ、０．４１ｋＶ、０．３８ｋＶ、０．２７ｋＶ、０．５１ｋＶであり、全ての微粒子で静電電位は０．２ｋＶを超える値を示した。
本ジルコニア製微粒子を使用して、実施例１と同様にして「分析用チップ２」を作成した。この分析用チップ２を用いて、実施例１と同様に評価を実施した。
実施例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の基板上に観察された被験物質溶液中の気泡数を計数したところ、気泡数は、１０回の評価の平均値が４．５個であった（表１）。
また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、８．４％であった（表１）。
比較例２
実施例２において、分析用チップ１の代わりに、比較例１で作成した分析用チップ２を用いた以外は実施例２と同様にして、被験物質溶液を脱気処理して評価を実施した。
実施例２において、分析用チップ１の代わりに、比較例１で作成した分析用チップ２を用いた以外は実施例２と同様にして、被験物質溶液を脱気処理して評価を実施した。
実施例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、気泡数は、６回の評価の平均が０．４個であった（表１）。
また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．７％であった（表１）。
以上の実施例１、２、比較例１、２の結果から、微粒子どうしが立体的に多点で接触した状態で界面活性剤をコーティングして微粒子表面の静電電位を０．０１ｋＶ以上０．２ｋＶ以下にすることによって、気泡の発生が顕著に抑制され、データのばらつき（バックグラウンドシグナルのＣＶ値）を顕著に低減できることがわかった。
実施例３
実施例１の（４）において、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液５０ｍｌの代わりに、０．０５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液５０ｍｌを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、ジルコニア製微粒子表面の界面活性剤コーティングを行った。乾燥後に得られた微粒子は、微粒子どうしが凝集しにくく、さらさらの状態であった。同様のコーティング操作を５回行った。実施例１と同様に静電電位を測定した結果、静電電位は０．１２ｋＶ、０．１０ｋＶ、０．１５ｋＶ、０．１４ｋＶ、０．１１ｋＶであり、全ての微粒子で静電電位は０．０１ｋＶ以上０．２ｋＶ以下の値を示した。
実施例１の（４）において、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液５０ｍｌの代わりに、０．０５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液５０ｍｌを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、ジルコニア製微粒子表面の界面活性剤コーティングを行った。乾燥後に得られた微粒子は、微粒子どうしが凝集しにくく、さらさらの状態であった。同様のコーティング操作を５回行った。実施例１と同様に静電電位を測定した結果、静電電位は０．１２ｋＶ、０．１０ｋＶ、０．１５ｋＶ、０．１４ｋＶ、０．１１ｋＶであり、全ての微粒子で静電電位は０．０１ｋＶ以上０．２ｋＶ以下の値を示した。
本ジルコニア製微粒子を使用して、実施例１と同様にして「分析用チップ３」を作成した。この分析用チップ３を用いて、実施例１と同様に評価を実施した。
実施例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の基板上に観察された被験物質溶液中の気泡数を計数したところ、気泡数は、１０回の評価の平均値が０．６個であった（表１）。
また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、３．０％であった（表１）。
実施例４
実施例１の（４）において、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液５０ｍｌの代わりに、０．０１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液５０ｍｌを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、ジルコニア製微粒子表面の界面活性剤コーティングを行った。乾燥後に得られた微粒子は、微粒子どうしが凝集しにくく、さらさらの状態であった。同様のコーティング操作を５回行った。実施例１と同様に静電電位を測定した結果、静電電位は０．１９ｋＶ、０．１５ｋＶ、０．１７ｋＶ、０．１７ｋＶ、０．１６ｋＶであり、全ての微粒子で静電電位は０．０１ｋＶ以上０．２ｋＶ以下の値を示した。
実施例１の（４）において、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液５０ｍｌの代わりに、０．０１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液５０ｍｌを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、ジルコニア製微粒子表面の界面活性剤コーティングを行った。乾燥後に得られた微粒子は、微粒子どうしが凝集しにくく、さらさらの状態であった。同様のコーティング操作を５回行った。実施例１と同様に静電電位を測定した結果、静電電位は０．１９ｋＶ、０．１５ｋＶ、０．１７ｋＶ、０．１７ｋＶ、０．１６ｋＶであり、全ての微粒子で静電電位は０．０１ｋＶ以上０．２ｋＶ以下の値を示した。
本ジルコニア製微粒子を使用して、実施例１と同様にして「分析用チップ４」を作成した。この分析用チップ４を用いて、実施例１と同様に評価を実施した。
実施例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の基板上に観察された被験物質溶液中の気泡数を計数したところ、気泡数は、１０回の評価の平均値が０．９個であった（表１）。
また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、３．４％であった（表１）。
以上の実施例３，４の結果から、微粒子表面の静電電位を０．０１ｋＶ以上０．２ｋＶ以下に制御することによって、気泡の発生が抑制され、データのばらつき（バックグラウンドシグナルのＣＶ値）を低減できることがわかった。
実施例５
実施例１の（４）において、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液５０ｍｌの代わりに、界面活性剤として０．１％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル（Ｔｗｅｅｎ２０）水溶液５０ｍｌを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、ジルコニア製微粒子表面の界面活性剤コーティングを行った。乾燥後に得られた微粒子は、微粒子どうしが凝集しにくく、さらさらの状態であった。同様のコーティング操作を５回行った。実施例１と同様に静電電位を測定した結果、静電電位は０．１３ｋＶ、０．１４ｋＶ、０．０８ｋＶ、０．１０ｋＶ、０．０６ｋＶであり、全ての微粒子で静電電位は０．０１ｋＶ以上０．２ｋＶ以下の値を示した。
実施例１の（４）において、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液５０ｍｌの代わりに、界面活性剤として０．１％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル（Ｔｗｅｅｎ２０）水溶液５０ｍｌを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、ジルコニア製微粒子表面の界面活性剤コーティングを行った。乾燥後に得られた微粒子は、微粒子どうしが凝集しにくく、さらさらの状態であった。同様のコーティング操作を５回行った。実施例１と同様に静電電位を測定した結果、静電電位は０．１３ｋＶ、０．１４ｋＶ、０．０８ｋＶ、０．１０ｋＶ、０．０６ｋＶであり、全ての微粒子で静電電位は０．０１ｋＶ以上０．２ｋＶ以下の値を示した。
本ジルコニア製微粒子を使用して、実施例１と同様にして「分析用チップ５」を作成した。この分析用チップ５を用いて、実施例１と同様に評価を実施した。
実施例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の基板上に観察された被験物質溶液中の気泡数を計数したところ、気泡数は、１０回の評価の平均値が０．６個であった（表１）。
また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、３．１％であった（表１）。
比較例３
実施例５において、比較例１と同様に、１０ｍＬサンプル瓶の代わりに、ステンレス製バット（１０ｃｍ×１０ｃｍ×５ｃｍ）を用いて、微粒子どうしが平面、単層状態となるようにして界面活性剤のコーティングを行ったこと以外は、実施例５と同様にして、ジルコニア製微粒子の界面活性剤（０．１％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル（Ｔｗｅｅｎ２０））のコーティングを行った。乾燥後に得られた微粒子は、微粒子どうしが凝集しやすく、微粒子塊を形成しやすい状態であった。実施例１と同様に静電電位を測定した結果、静電電位は０．４５ｋＶ、０．３０ｋＶ、０．５１ｋＶ、０．３８ｋＶ、０．６２ｋＶであり、全ての微粒子で静電電位は０．２ｋＶを超える値を示した。
実施例５において、比較例１と同様に、１０ｍＬサンプル瓶の代わりに、ステンレス製バット（１０ｃｍ×１０ｃｍ×５ｃｍ）を用いて、微粒子どうしが平面、単層状態となるようにして界面活性剤のコーティングを行ったこと以外は、実施例５と同様にして、ジルコニア製微粒子の界面活性剤（０．１％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル（Ｔｗｅｅｎ２０））のコーティングを行った。乾燥後に得られた微粒子は、微粒子どうしが凝集しやすく、微粒子塊を形成しやすい状態であった。実施例１と同様に静電電位を測定した結果、静電電位は０．４５ｋＶ、０．３０ｋＶ、０．５１ｋＶ、０．３８ｋＶ、０．６２ｋＶであり、全ての微粒子で静電電位は０．２ｋＶを超える値を示した。
本ジルコニア製微粒子を使用して、実施例１と同様にして「分析用チップ６」を作成した。この分析用チップ６を用いて、実施例１と同様に評価を実施した。
実施例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の基板上に観察された被験物質溶液中の気泡数を計数したところ、気泡数は、１０回の評価の平均値が２．０個であった（表１）。
また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．９％であった（表１）。
以上の実施例５、比較例３の結果から、実施例１～４と異なる界面活性剤を用いた場合であっても、微粒子どうしが立体的に多点で接触した状態で界面活性剤をコーティングして微粒子表面の静電電位を０．０１ｋＶ以上０．２ｋＶ以下にすることによって、気泡の発生が顕著に抑制され、データのばらつき（バックグラウンドシグナルのＣＶ値）を顕著に低減できることがわかった。
実施例６
実施例１の（４）において、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液５０ｍｌの代わりに、界面活性剤として０．５％ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（プルロニック（登録商標）Ｆ６８）水溶液５０ｍｌを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、ジルコニア製微粒子表面の界面活性剤コーティングを行った。乾燥後に得られた微粒子は、微粒子どうしが凝集しにくく、さらさらの状態であった。同様のコーティング操作を５回行った。実施例１と同様に静電電位を測定した結果、静電電位は０．１２ｋＶ、０．１７ｋＶ、０．０６ｋＶ、０．０２ｋＶ、０．１３ｋＶであり、全ての微粒子で静電電位は０．０１ｋＶ以上０．２ｋＶ以下の値を示した。
実施例１の（４）において、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液５０ｍｌの代わりに、界面活性剤として０．５％ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（プルロニック（登録商標）Ｆ６８）水溶液５０ｍｌを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、ジルコニア製微粒子表面の界面活性剤コーティングを行った。乾燥後に得られた微粒子は、微粒子どうしが凝集しにくく、さらさらの状態であった。同様のコーティング操作を５回行った。実施例１と同様に静電電位を測定した結果、静電電位は０．１２ｋＶ、０．１７ｋＶ、０．０６ｋＶ、０．０２ｋＶ、０．１３ｋＶであり、全ての微粒子で静電電位は０．０１ｋＶ以上０．２ｋＶ以下の値を示した。
本ジルコニア製微粒子を使用して、実施例１と同様にして「分析用チップ７」を作成した。この分析用チップ７を用いて、実施例１と同様に評価を実施した。
実施例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の基板上に観察された被験物質溶液中の気泡数を計数したところ、気泡数は、１０回の評価の平均値が０．８個であった（表１）。
また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、３．３％であった（表１）。
以上の実施例６の結果から、実施例１～５と異なる界面活性剤を用いた場合であっても、微粒子どうしが立体的に多点で接触した状態で界面活性剤をコーティングして微粒子表面の静電電位を０．０１ｋＶ以上０．２ｋＶ以下にすることによって、気泡の発生が顕著に抑制され、データのばらつき（バックグラウンドシグナルのＣＶ値）を顕著に低減できることがわかった。
比較例４
実施例１の（４）において、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液５０ｍｌの代わりに水を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、ジルコニア製微粒子を処理した。すなわち、界面活性剤のコーティングを行っていないジルコニア製微粒子を用いて以下の評価を行った。乾燥後に得られた微粒子は、微粒子どうしが凝集しやすく、微粒子塊を形成しやすい状態であった。同様の操作を５回行った。実施例１と同様に静電電位を測定した結果、静電電位は０．６２ｋＶ、０．５５ｋＶ、０．６５ｋＶ、０．７２ｋＶ、０．５９ｋＶであり、全ての微粒子で静電電位は０．２ｋＶを超える値を示した。
実施例１の（４）において、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液５０ｍｌの代わりに水を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、ジルコニア製微粒子を処理した。すなわち、界面活性剤のコーティングを行っていないジルコニア製微粒子を用いて以下の評価を行った。乾燥後に得られた微粒子は、微粒子どうしが凝集しやすく、微粒子塊を形成しやすい状態であった。同様の操作を５回行った。実施例１と同様に静電電位を測定した結果、静電電位は０．６２ｋＶ、０．５５ｋＶ、０．６５ｋＶ、０．７２ｋＶ、０．５９ｋＶであり、全ての微粒子で静電電位は０．２ｋＶを超える値を示した。
本ジルコニア製微粒子を使用して、実施例１と同様にして「分析用チップ８」を作成した。この分析用チップ８を用いて、実施例１と同様に評価を実施した。
実施例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の基板上に観察された被験物質溶液中の気泡数を計数したところ、気泡数は、１０回の評価の平均値が１２．５個であった（表１）。
また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、１２．２％であった（表１）。
実施例７
実施例１の（４）において、ジルコニア製微粒子の代わりに直径１８０μｍのガラス製微粒子（不二製作所製）１０ｇを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、ガラス製微粒子表面に界面活性剤（０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液５０ｍｌ）のコーティングを行った。乾燥後に得られた微粒子は、微粒子どうしが凝集しにくく、さらさらの状態であった。同様のコーティング操作を５回行った。実施例１と同様に静電電位を測定した結果、静電電位は０．０９ｋＶ、０．０５ｋＶ、０．１２ｋＶ、０．１８ｋＶ、０．１０ｋＶであり、全ての微粒子で静電電位は０．０１ｋＶ以上０．２ｋＶ以下の値を示した。
実施例１の（４）において、ジルコニア製微粒子の代わりに直径１８０μｍのガラス製微粒子（不二製作所製）１０ｇを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、ガラス製微粒子表面に界面活性剤（０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液５０ｍｌ）のコーティングを行った。乾燥後に得られた微粒子は、微粒子どうしが凝集しにくく、さらさらの状態であった。同様のコーティング操作を５回行った。実施例１と同様に静電電位を測定した結果、静電電位は０．０９ｋＶ、０．０５ｋＶ、０．１２ｋＶ、０．１８ｋＶ、０．１０ｋＶであり、全ての微粒子で静電電位は０．０１ｋＶ以上０．２ｋＶ以下の値を示した。
本ガラス製微粒子を使用して、実施例１と同様にして「分析用チップ９」を作成した。この分析用チップ９を用いて、実施例１と同様に評価を実施した。
実施例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の基板上に観察された被験物質溶液中の気泡数を計数したところ、気泡数は、１０回の評価の平均値が１．６個であった（表１）。
また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、４．７％であった（表１）。
比較例５
実施例７において、比較例１と同様に、１０ｍＬサンプル瓶の代わりに、ステンレス製バット（１０ｃｍ×１０ｃｍ×５ｃｍ）を用いて、微粒子どうしが平面、単層状態となるようにして界面活性剤のコーティングを行ったこと以外は、実施例７と同様にして、ガラス製微粒子に界面活性剤（０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のコーティングを行った。乾燥後に得られた微粒子は、微粒子どうしが凝集しやすく、微粒子塊を形成しやすい状態であった。実施例１と同様に静電電位を測定した結果、静電電位は０．４０ｋＶ、０．４４ｋＶ、０．２５ｋＶ、０．３０ｋＶ、０．３１ｋＶであり、全ての微粒子で静電電位は０．２ｋＶを超える値を示した。
実施例７において、比較例１と同様に、１０ｍＬサンプル瓶の代わりに、ステンレス製バット（１０ｃｍ×１０ｃｍ×５ｃｍ）を用いて、微粒子どうしが平面、単層状態となるようにして界面活性剤のコーティングを行ったこと以外は、実施例７と同様にして、ガラス製微粒子に界面活性剤（０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のコーティングを行った。乾燥後に得られた微粒子は、微粒子どうしが凝集しやすく、微粒子塊を形成しやすい状態であった。実施例１と同様に静電電位を測定した結果、静電電位は０．４０ｋＶ、０．４４ｋＶ、０．２５ｋＶ、０．３０ｋＶ、０．３１ｋＶであり、全ての微粒子で静電電位は０．２ｋＶを超える値を示した。
本ガラス製微粒子を使用して、実施例１と同様にして「分析用チップ１０」を作成した。この分析用チップ１０を用いて、実施例１と同様に評価を実施した。
実施例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の基板上に観察された被験物質溶液中の気泡数を計数したところ、気泡数は、１０回の評価の平均値が３．５個であった（表１）。
また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、７．２％であった（表１）。
以上の実施例７、比較例５の結果から、実施例１～６と異なる材質の微粒子を用いた場合であっても、微粒子どうしが立体的に多点で接触した状態で界面活性剤をコーティングして微粒子表面の静電電位を０．０１ｋＶ以上０．２ｋＶ以下にすることによって、気泡の発生が顕著に抑制され、データのばらつき（バックグラウンドシグナルのＣＶ値）を顕著に低減できることがわかった。
比較例６
実施例７において、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液５０ｍｌの代わりに水を用いたこと以外は、実施例７と同様にして、ガラス製微粒子を処理した。すなわち、界面活性剤のコーティングを行っていないガラス製微粒子を用いて以下の評価を行った。乾燥後に得られた微粒子は、微粒子どうしが凝集しやすく、微粒子塊を形成しやすい状態であった。同様の操作を５回行った。実施例１と同様に静電電位を測定した。測定の結果、静電電位は０．６０ｋＶ、０．６７ｋＶ、０．４２ｋＶ、０．４５ｋＶ、０．５８ｋＶであり、全ての微粒子で静電電位は０．２ｋＶを超える値を示した。
実施例７において、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液５０ｍｌの代わりに水を用いたこと以外は、実施例７と同様にして、ガラス製微粒子を処理した。すなわち、界面活性剤のコーティングを行っていないガラス製微粒子を用いて以下の評価を行った。乾燥後に得られた微粒子は、微粒子どうしが凝集しやすく、微粒子塊を形成しやすい状態であった。同様の操作を５回行った。実施例１と同様に静電電位を測定した。測定の結果、静電電位は０．６０ｋＶ、０．６７ｋＶ、０．４２ｋＶ、０．４５ｋＶ、０．５８ｋＶであり、全ての微粒子で静電電位は０．２ｋＶを超える値を示した。
本ガラス製微粒子を使用して、実施例１と同様にして「分析用チップ１１」を作成した。この分析用チップ１１を用いて、実施例１と同様に評価を実施した。
実施例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の基板上に観察された被験物質溶液中の気泡数を計数したところ、気泡数は、１０回の評価の平均値が１３．２個であった（表１）。
また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、１３．４％であった（表１）。
本発明は、被検物質と選択的に結合する選択結合性物質を固定化した基板を備え、微粒子によって被験物質溶液を攪拌することのできる分析用チップにおいて、反応むらを防ぐことにより、微量な発現遺伝子の微小な変動をとらえることが必要な測定に対して、十分に検出感度や検出精度が高い分析用チップを提供する。本発明は、特に医薬・医療分野における様々な生体関連物質の検出等のための分析用チップとして有用であり、その他、食品、環境分野における微量物質の検出のための分析用チップとしても有用である。
１ 基板
２ 微粒子
３ カバー部材
１０ 凹部
１１ 凸部
２６ 発生した気泡の例
３０ 接着部材
３０Ａ 仕切り構造の接着部材
３２ 貫通孔
３３ 液面駐止用チャンバー
４５ 基板に固定化された選択結合性物質
５０ 微粒子の乾燥に使用する容器
２ 微粒子
３ カバー部材
１０ 凹部
１１ 凸部
２６ 発生した気泡の例
３０ 接着部材
３０Ａ 仕切り構造の接着部材
３２ 貫通孔
３３ 液面駐止用チャンバー
４５ 基板に固定化された選択結合性物質
５０ 微粒子の乾燥に使用する容器
Claims (7)
- 選択結合性物質が表面に固定化された基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納又は注入され、該微粒子表面に界面活性剤がコーティングされている分析用チップであって、該微粒子の静電電位が０．０１ｋＶ以上０．２ｋＶ以下である分析用チップ。
- 微粒子の材質がセラミックまたはガラスを含む、請求項１に記載の分析用チップ。
- 微粒子の粒径が０．１μｍ以上３００μｍ以下である、請求項１または２に記載の分析用チップ。
- 微粒子の表面にコーティングされている界面活性剤が陰イオン性界面活性剤又は非イオン性界面活性剤である、請求項１～３のいずれかに記載の分析用チップ。
- 前記基板が、その表面に凹部及び凸部からなる凹凸部を有し、該凸部の上端面に選択結合性物質が固定化された基板である、請求項１～４のいずれかに記載の分析用チップ。
- 請求項１～５のいずれか一項に記載の分析用チップに被検物質を含む溶液を接触させて前記基板表面に固定化された選択結合性物質に該被検物質を選択的に結合させ、分析用チップ上に該選択結合性物質を介して結合した該被検物質量を測定する、被検物質の分析方法。
- 選択結合性物質が表面に固定化された基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納又は注入され、該微粒子表面に界面活性剤がコーティングされている分析用チップの製造方法であって、
微粒子を、界面活性剤を含む溶液に浸漬する工程Ａ、
工程Ａで浸漬された微粒子を、界面活性剤を含む溶液から回収する工程Ｂ、
工程Ｂで回収された、界面活性剤を含む溶液で表面が湿潤した微粒子を乾燥する工程Ｃ、及び、
工程Ｃで乾燥された微粒子を、前記基板とカバー部材との間の空隙に格納又は注入する工程Ｄ、を含み、
工程Ｃは、各微粒子が立体的に多点で接触する状態で行われる、製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2021059766 | 2021-03-31 | ||
| JP2021059766 | 2021-03-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2022159046A true JP2022159046A (ja) | 2022-10-17 |
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ID=83638588
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022046352A Pending JP2022159046A (ja) | 2021-03-31 | 2022-03-23 | 分析用チップ、分析方法及び分析用チップの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2022159046A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024085226A1 (ja) * | 2022-10-20 | 2024-04-25 | Ｔｏｐｐａｎホールディングス株式会社 | 検出キット及び標的分子の検出方法 |
| WO2024085141A1 (ja) * | 2022-10-20 | 2024-04-25 | Ｔｏｐｐａｎホールディングス株式会社 | 流体デバイス及び標的分子の検出方法 |
-
2022
- 2022-03-23 JP JP2022046352A patent/JP2022159046A/ja active Pending
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