CN118140141A - 靶物质的检测方法 - Google Patents

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CN118140141A CN202280071151.9A CN202280071151A CN118140141A CN 118140141 A CN118140141 A CN 118140141A CN 202280071151 A CN202280071151 A CN 202280071151A CN 118140141 A CN118140141 A CN 118140141A
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Abstract

本发明涉及一种检测方法，其为试样中的靶物质(110)的检测方法，其包含：将试样、由第一单链核酸片段(121)标记的针对靶物质(110)的第一特异性结合物质(120)、及由第二单链核酸片段(131)标记的针对靶物质(110)的第二特异性结合物质(130)导入孔中，其结果，在试样中存在靶物质(110)的情况下，形成包含靶物质(110)、第一特异性结合物质(120)及第二特异性结合物质(130)的复合物(100)，第一单链核酸片段(121)的至少一部分和第二单链核酸片段(131)的至少一部分杂交而形成双链核酸(140)的工序；以及检测双链核酸(140)的形成的工序；其中，检测到双链核酸(140)的形成表示靶物质(110)的存在。

Description

靶物质的检测方法
技术领域
本发明涉及靶物质的检测方法。更详细而言，本发明涉及靶物质的检测方法、复合物及靶物质的检测用试剂盒。
本申请主张2021年11月4日在日本申请的日本特愿2021-180020号的优先权，其内容援引至此。
背景技术
通过定量地检测生物试样中的靶物质，可进行疾病的早期发现、用药的效果预测。以往，蛋白的定量一直通过酶联免疫吸附试验(ELISA)等进行，核酸的定量一直通过实时PCR法等进行。
近年来，出于更早期地发现疾病等目的，更高精度地检测靶物质的需求提高。作为高精度地检测靶物质的方法，研究了在多个微小区室内进行酶反应的技术。这些方法被称为数字测量。数字测量中存在数字ELISA和数字PCR等。
在数字测量中，将试样溶液分割为极大量的微小溶液。然后，将来自各微小溶液的信号二值化，通过仅判别是否存在靶物质来测量靶物质的分子数。通过数字测量，与以往的ELISA、实时PCR法等相比，能够显著提高检测灵敏度和定量性。
例如，非专利文献1中记载了具有微小孔及用于供给试剂等的流路的微小孔阵列，并记载了使用该微小孔阵列进行数字ELISA。
另外，专利文献1、非专利文献2及3中报告了使用修饰有寡核苷酸的抗体来检测蛋白的方法，即邻位连接技术(proximity ligation assay，PLA)和邻位延伸技术(proximityextension assay，PEA)。这些方法在检测中利用PCR法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2012-160083号
非专利文献
非专利文献1：Kan C.W.,et al.,Isolation and detection of singlemolecules on paramagnetic beads using sequential fluid flows inmicrofabricated polymer array assemblies,Lab on a Chip,12(5),977-985,2012.
非专利文献2：Mohammed H.,et al.,Approaches for Assessing andDiscovering Protein Interactions in Cancer.,Mol Cancer Res,11(11),1295-1302,2013.
非专利文献3：Assarsson E.,et al.,Homogenous 96-Plex PEA ImmunoassayExhibiting High Sensitivity,Specificity,and Excellent Scalability,PLoS One,9(4),e95192,2014.
发明内容
发明所要解决的课题
ELISA中，需要在使靶物质与抗体反应后清洗未反应的抗体的工序。然而，在数字测量用的设备中，靶物质、抗体被封入在孔、液滴内，因此难以进行清洗工序。
因此，非专利文献1中记载了如下内容：首先，使作为检测对象的PSA与磁性珠粒结合，接着清洗珠粒，接着使珠粒与生物素标记抗体反应，接着清洗珠粒，接着使珠粒与含有链霉亲和素-β-半乳糖苷酶的溶液反应，接着清洗珠粒，接着将珠粒悬浮于含有底物的缓冲液中，然后将珠粒导入孔阵列中进行检测。这样，为了通过数字ELISA检测靶物质，有时需要繁杂的前处理。因此，本发明的目的在于提供一种不进行清洗工序地检测靶物质的技术。
用于解决课题的手段
本发明包含以下的方式。
[1]一种方法，其为试样中的靶物质的检测方法，其包含：将所述试样、由第一单链核酸片段标记的针对所述靶物质的第一特异性结合物质、及由第二单链核酸片段标记的针对所述靶物质的第二特异性结合物质导入孔中，其结果，在所述试样中存在所述靶物质的情况下，形成包含所述靶物质、所述第一特异性结合物质及所述第二特异性结合物质的复合物，所述第一单链核酸片段的至少一部分和所述第二单链核酸片段的至少一部分杂交而形成双链核酸的工序；以及检测所述双链核酸的形成的工序；其中，检测到所述双链核酸的形成表示所述靶物质的存在。
[2]根据[1]所述的方法，其中，所述孔的容积为10fL～100pL。
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，所述第一特异性结合物质识别所述靶物质的第一结合部位，所述第二特异性结合物质识别所述靶物质的第二结合部位，所述第一结合部位与所述第二结合部位不同。
[4]根据[3]所述的方法，其中，所述第一结合部位和所述第二结合部位之间的距离是所述第一单链核酸片段的至少一部分和所述第二单链核酸片段的至少一部分能够杂交的距离。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，所述第一单链核酸片段及所述第二单链核酸片段的碱基长度分别为10～200个碱基。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的方法，其进一步包含在将所述试样、所述第一特异性结合物质及所述第二特异性结合物质导入所述孔中之后，将所述孔的开口部密封的工序。
[7]根据[6]所述的方法，其中，密封了开口部的所述孔包含未与所述靶物质结合的所述第一特异性结合物质和/或未与所述靶物质结合的所述第二特异性结合物质。
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的方法，其中，所述靶物质为选自蛋白、糖链、核酸、脂质膜结构体、细菌、病毒和细胞中的1种或它们的复合物质。
[9]根据[1]～[8]中任一项所述的方法，其中，所述第一特异性结合物质及所述第二特异性结合物质分别为选自抗体、凝集素和对脂质膜具有结合性的物质中的1种。
[10]根据[1]～[9]中任一项所述的方法，其中，检测所述双链核酸的形成的工序通过侵入裂解分析(Invasive Cleavage Assay)来进行。
[11]一种复合物，其包含：靶物质、由第一单链核酸片段标记的针对所述靶物质的第一特异性结合物质、及由第二单链核酸片段标记的针对所述靶物质的第二特异性结合物质，其中，所述第一单链核酸片段的至少一部分和所述第二单链核酸片段的至少一部分杂交而形成了双链核酸。
[12]一种试剂盒，其为靶物质的检测用试剂盒，其包含：具有多个孔的孔阵列、由第一单链核酸片段标记的针对所述靶物质的第一特异性结合物质、及由第二单链核酸片段标记的针对所述靶物质的第二特异性结合物质。
[13]根据[12]所述的试剂盒，其进一步包含用于将所述孔的开口部密封的密封液。
[14]根据[12]或[13]所述的试剂盒，其进一步包含用于检测双链核酸的试剂，所述双链核酸是所述第一单链核酸片段的至少一部分和所述第二单链核酸片段的至少一部分杂交而形成的。
发明效果
根据本发明，能够提供不进行清洗工序地检测靶物质的技术。
附图说明
图1是说明靶物质的检测方法的示意图。
图2是表示流体设备的一例的示意剖视图。
图3是表示流体设备的一例的示意剖视图。
图4是表示流体设备的一例的示意剖视图。
图5是表示流体设备的一例的示意剖视图。
图6是表示流体设备的一例的示意剖视图。
图7是表示流体设备的一例的示意剖视图。
图8是说明侵入裂解分析(Invasive Cleavage Assay，ICA)法的一例的示意图。
图9是表示实验例1的结果的图表。
图10是表示实验例1的结果的图表。
图11是表示实验例1的结果的图表。
图12是表示实验例2的结果的显微镜图像。
图13是表示实验例2的结果的图表。
图14是表示实验例2中检测出各浓度的靶物质的情况下的孔的亮度的平均值±标准偏差的图表。
图15是表示实验例2中检测出各浓度的靶物质的情况下显示设定值以上的亮度的孔数的图表。
图16是表示实验例3中使用结合有DNA1及DNA2的寡核苷酸修饰抗体的免疫ICA反应的结果的图表。
图17是表示实验例3中使用结合有DNA2及DNA3的寡核苷酸修饰抗体的免疫ICA反应的结果的图表。
图18是表示实验例3中使用结合有DNA2及DNA4的寡核苷酸修饰抗体的免疫ICA反应的结果的图表。
图19是表示实验例3中使用结合有DNA2及DNA5的寡核苷酸修饰抗体的免疫ICA反应的结果的图表。
图20是表示实验例4中使用结合有DNA2及DNA5的寡核苷酸修饰抗体的免疫ICA反应的结果的图表。
具体实施方式
以下，根据情况参照附图对本发明的实施方式进行详细说明。需要说明的是，在附图中，对相同或相当的部分标注相同或对应的附图标记，并省略重复的说明。需要说明的是，各图中的尺寸比存在为了说明而夸张的部分，未必与实际的尺寸比一致。
[靶物质的检测方法]
在一个实施方式中，本发明提供一种方法，其为试样中的靶物质的检测方法，其包含：将所述试样、由第一单链核酸片段标记的针对所述靶物质的第一特异性结合物质、及由第二单链核酸片段标记的针对所述靶物质的第二特异性结合物质导入孔中，其结果，在所述试样中存在所述靶物质的情况下，形成包含所述靶物质、所述第一特异性结合物质及所述第二特异性结合物质的复合物，所述第一单链核酸片段的至少一部分和所述第二单链核酸片段的至少一部分杂交而形成双链核酸的工序；以及检测所述双链核酸的形成的工序；其中，检测到所述双链核酸的形成时表示所述靶物质的存在。
图1是说明本实施方式的方法的示意图。如图1所示，在本实施方式的方法中，首先，将试样、由第一单链核酸片段121标记的第一特异性结合物质120、及由第二单链核酸片段131标记的第二特异性结合物质130导入孔中。其结果，在试样中存在靶物质110的情况下，形成包含靶物质110、第一特异性结合物质120及第二特异性结合物质130的复合物100。第一单链核酸片段121的至少一部分和第二单链核酸片段131的至少一部分杂交而形成双链核酸(也称为双链核酸区域)140。
接着，检测双链核酸140的形成。在检测到双链核酸140的形成的情况下，可以说存在靶物质110。本实施方式的方法也可以应用于不含有靶物质110的试样，在该情况下，不会检测到双链核酸140的形成、即靶物质110的存在。关于双链核酸140的形成的检测将后述。
如图1所示，第一特异性结合物质120识别靶物质110的第一结合部位111。另外，第二特异性结合物质130识别靶物质110的第二结合部位112。这样，第一结合部位111和第二结合部位112可以是不同的结合部位。例如，当靶物质为蛋白时，第一结合部位111及第二结合部位112还可以分别为第一表位111及第二表位112。
作为试样，可举出生物试样和环境试样等。作为生物试样，没有特别限制，可举出血清、血浆、尿及细胞培养液等。另外，作为环境试样，例如可举出河川的水及工厂废水等。靶物质110可以是选自蛋白、糖链、核酸、脂质膜结构体、细菌、病毒及细胞中的1种或它们的复合物质。
蛋白可以是糖蛋白，也可以是膜蛋白。蛋白可以是复合物质。作为复合物质，例如可举出糖链与蛋白结合而成的糖蛋白、及使多个蛋白融合而成的融合蛋白等。作为脂质膜结构体，可举出由人工或天然的脂质构成的囊泡，例如可举出脂质体、外泌体及细胞内细胞器等。在脂质膜结构体、细菌、病毒及细胞的检测中，可以检测这些靶分子中存在的蛋白、糖链及核酸等。
在靶物质110中，第一结合部位111和第二结合部位112之间的距离优选为第一单链核酸片段121的至少一部分和第二单链核酸片段131的至少一部分能够杂交的距离。在此，能够杂交的距离优选为接近至第一单链核酸片段121与第二单链核酸片段131能够杂交的位置的距离。
例如，在假设靶物质110为直径10nm的球的情况下，第一结合部位111与第二结合部位112的距离优选为3～10nm，更优选为3.5～9nm。作为一例，假设靶物质110为直径10nm的球，以靶物质110的中心为基准时的第一结合部位111与第二结合部位112的角度为30～120°的情况下，第一结合部位111与第二结合部位112的距离为4.14～8.66nm。在此，第一结合部位111与第二结合部位112的距离定义为沿着靶物质110的表面的第一结合部位111与第二结合部位112的最短距离。
具体而言，例如，第一单链核酸片段121的碱基长度可以为10～200个碱基。同样地，第二单链核酸片段131的碱基长度也可以为10～200个碱基。另外，第一单链核酸片段121的至少一部分和第二单链核酸片段131的至少一部分杂交而形成的双链核酸140的长度可以为7～30个碱基左右，也可以为7～20个碱基。第一单链核酸片段121和第二单链核酸片段131杂交的区域可以包含各单链核酸片段的末端。第一单链核酸片段121和第二单链核酸片段131杂交的区域也可以不包含单链核酸片段末端，例如可以从各单链核酸片段的末端起位于7～13个碱基。从提高检测灵敏度的观点出发，第一单链核酸片段121和第二单链核酸片段131杂交的区域优选包含各自的单链核酸片段的末端。
(孔)
本实施方式的方法适于基于数字测量的靶物质的检测。在通过数字测量进行本实施方式的方法的情况下，优选孔构成配置有多个孔的孔阵列。另外，优选孔阵列配置在流体设备的流路内。
(流体设备)
图2是表示流体设备的一例的示意剖视图。如图2所示，流体设备200具备基板210和与基板210对置配置的盖部件220。盖部件220具有凸部221，凸部221的前端与基板210接触。在流体设备200中，孔阵列240在基板210的一个面上与基板210一体成型。基板210的成型有孔阵列240的面与盖部件220对置。孔阵列240具有多个孔241。盖部件220也可以熔融粘合或粘接于基板210。
孔241在基板210的表面开口。孔241的形状、尺寸及配置没有特别限定，优选在1个孔241中导入1个靶物质。孔241优选为容积小的微小孔。例如，一个孔241的容积可以为10fL～100pL左右。在流体设备200中，相同形状相同大小的多个孔241构成孔阵列240。相同形状相同大小只要是进行数字测量所要求程度的相同的形状且相同的容量即可，制造上的误差程度的偏差可被容许。
孔241的直径例如可以为1～10μm左右。孔241的深度例如可以为1～10μm左右。另外，孔241的配置没有特别限制，例如可以排列成三角格子状，也可以排列成正方格子状，也可以无规配置。
在流体设备200中，由于凸部221的存在，在孔阵列240与盖部件220之间形成有空间。该空间构成流路230。流路230作为用于输送分散有靶物质、第一特异性结合物质、第二特异性结合物质等的液体以及后述的密封液的路径发挥功能。流路230的形状、结构以及容量等没有特别限定，流路230的高度(即基板210的与盖部件220对置且未形成有孔阵列的部分的表面与盖部件220的与基板210对置的面之间的距离)例如可以为500μm以下，例如可以为300μm以下，例如可以为200μm以下，例如也可以为100μm以下。
凸部221可以与盖部件220一体成型。盖部件220例如可以通过使用成型模具对热塑性树脂的流动体进行成型而成型为具有凸部221的板状。另外，也可以在盖部件220上形成试剂的导入口222和排出口223。
在盖部件220具有凸部221的情况下，按照凸部221与基板210的孔241开口的面接触的方式，盖部件220与基板210重叠。其结果，盖部件220与基板210之间的空间成为流路230。盖部件220与基板210可以通过激光熔融粘合等被熔融粘合。
(流体设备的变形例1)
本实施方式的方法中使用的流体设备不限于上述的流体设备200。图5是表示流体设备的一例的示意剖视图。如图5所示，流体设备500具备基板210和壁部件510。在流体设备500中，孔阵列240在基板210的一个面上与基板210一体成型。孔阵列240具有多个孔241。
流体设备500主要在不具有盖部件220这点上与上述的流体设备200不同。因此，流体设备500不具有流路。
(流体设备的变形例2)
在上述的流体设备200中，盖部件220与凸部221一体成型。但是，盖部件220与凸部221也可以分体成型。
另外，在上述的流体设备200及流体设备500中，孔阵列240在基板210的一个面上与基板210一体成型。然而，孔阵列也可以不与基板210一体成型。例如，也可以将与流体设备分体成型的孔阵列240配置于流体设备的基板210上。或者，也可以在基板210的表面上层叠树脂层，通过蚀刻等在树脂层上形成孔阵列。
(流体设备的材质)
基板210例如使用树脂形成。树脂的种类没有特别限定，优选为对试剂和密封液具有耐受性的树脂。另外，在所检测的信号为荧光的情况下，优选为自体荧光少的树脂。作为树脂，例如可举出环烯烃聚合物、环烯烃共聚物、有机硅、聚丙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚乙酸乙烯酯、氟树脂及非晶氟树脂等，但并不限定于这些。
可以在基板210的板厚方向的一个面上形成有多个孔241。作为使用了树脂的孔的形成方法，可举出注塑成型、热压印及光压印等。
或者，例如也可以在基板210上层叠氟树脂，通过蚀刻等对该氟树脂进行加工而形成孔阵列。作为氟树脂，例如可以使用CYTOP(注册商标)(旭硝子)等。
另外，在流体设备具有盖部件220的情况下，盖部件220的材质优选为自体荧光少的树脂，例如可以是环烯烃聚合物及环烯烃共聚物等热塑性树脂。
另外，盖部件220可以由不透射对信号进行荧光观察时所检测的波长附近的波长的光的材料形成，也可以由完全不透射光的材料形成。例如，盖部件220可以由添加有碳、金属粒子等的热塑性树脂形成。
(本实施方式的方法)
接着，根据情况参照图2～4，以使用流体设备200的情况为例，对本实施方式的方法进行说明。本实施方式的方法为试样中的靶物质的检测方法，其包含：将试样、由第一单链核酸片段121标记的针对靶物质110的第一特异性结合物质120、及由第二单链核酸片段131标记的针对靶物质110的第二特异性结合物质130导入孔241中，其结果，在试样中存在靶物质110的情况下，形成包含靶物质110、第一特异性结合物质120及第二特异性结合物质130的复合物100，第一单链核酸片段121的至少一部分和第二单链核酸片段131的至少一部分杂交而形成双链核酸140的工序；以及检测双链核酸140的形成的工序，其中，检测到双链核酸140的形成表示靶物质110的存在。通过本实施方式的方法，能够不进行清洗工序地检测靶物质。
《导入工序》
首先，如图2所示，从流体设备200的导入口222导入试剂液L210，向流路230送液。试剂液L210是分散有试样、第一特异性结合物质120及第二特异性结合物质130的液体，还含有用于检测双链核酸140的形成的试剂。试剂液L210在试样中含有靶物质110的情况下，含有第一特异性结合物质120、第二特异性结合物质130、靶物质110及用于检测双链核酸140的形成的试剂。
输送到流路230的试剂液L210与孔阵列240接触。然后，在孔241的内部收纳试剂液L210。其结果，在孔241中导入第一特异性结合物质120、第二特异性结合物质130、及存在的情况下的靶物质110、以及用于检测双链核酸140的形成的试剂。
试剂液L210可以通过以下的第一方法制备。将试样、第一特异性结合物质120及第二特异性结合物质130混合，进行试样中可能含有的靶物质110与第一特异性结合物质120及第二特异性结合物质130的抗原抗体反应。抗原抗体反应例如在25～37℃下进行30～180分钟。然后，添加用于检测双链核酸140的形成的试剂，进行ICA反应。ICA反应例如在60～70℃下进行10～60分钟。可以将ICA反应完成后的混合液用作试剂液L210。
试剂液L210可以通过以下的第二方法制备。将试样、第一特异性结合物质120及第二特异性结合物质130混合，制备抗原抗体反应溶液。在抗原抗体反应溶液中添加用于检测双链核酸140的形成的试剂，制备混合液。将该混合液例如在25～37℃下保持30～180分钟后，在60～70℃下保持10～60分钟，完成ICA反应。可以将ICA反应完成后的混合液用作试剂液L210。
导入1个孔241的靶物质110的数量没有特别限制，优选在1个孔241中导入1个以下、即0个或1个靶物质110。由此，能够以一个单位进行靶物质110的检测，即能够进行数字测量。另外，无需在孔阵列的所有孔中导入靶物质110。
将靶物质110导入孔的手段没有特别限制，可以选择与所选择的靶物质110相应的适当手段。例如，可举出利用自重使靶物质110在流体设备内(可以在流路内)沉降，分配到孔中的方法。或者，也可以利用用于捕获靶物质110的物质(也称为捕获物)，使捕获物与难以通过自重沉降的靶物质110结合而进行送液，也可以预先在孔中固定捕获物，捕获被输送的靶物质110，从而提高靶物质110向孔中的导入效率。
使捕获物与靶物质110结合的工序可以在本实施方式的方法的任意时间点进行。例如，该工序可以在向孔241中导入靶物质110的工序之前，通过在样品管内使靶物质110与捕获物接触来进行。或者，也可以在将捕获物导入孔241中之后，将靶物质110导入孔中，在孔内使捕获物与靶物质110接触。
捕获物是能够捕获靶物质110的物质。捕获物例如可以是固相与针对靶物质110的特异性结合物质的结合体。
作为固相，可举出粒子、膜及基板等。另外，针对靶物质110的特异性结合物质可以为1种，也可以为2种以上。例如可以为3种，也可以为4种，还可以为5种以上。
作为粒子，没有特别限制，可举出聚合物粒子、磁粒子及玻璃粒子等。粒子优选实施了用于避免非特异性吸附的表面处理的粒子。另外，为了固定特异性结合物质，优选在表面具有羧基等官能团的粒子。更具体而言，可以使用JSR公司制的商品名“MagnosphereLC300”等。
或者，例如在使用病毒作为靶物质110的情况下，也可以将病毒能够附着的细胞(即具有病毒受体的细胞)用作捕获物。
作为第一特异性结合物质120、第二特异性结合物质130及捕获物中的特异性结合物质，可举出抗体、抗体片段和配体(aptamer)等。作为抗体片段，可举出Fab、F(ab’)2、Fab’、单链抗体(scFv)、二硫化物稳定化抗体(dsFv)、包含二聚体V区域片段(Diabody)和CDR的肽等。抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。另外，也可以是市售的抗体。
另外，在靶物质110包含糖链的情况下，特异性结合物质也可以是凝集素。另外，在靶物质110包含脂质膜的情况下，特异性结合物质可以是与脂质膜具有结合性的物质。作为与脂质膜具有结合性的物质，例如可举出己二醇等烃及膜贯通蛋白等膜蛋白。作为膜蛋白，例如可举出α-溶血素(α-hemolysin)等。
作为用单链核酸片段标记特异性结合物质的方法，可举出使用交联剂的方法。单链核酸片段可以通过作为连接分子的分子标记到特异性结合物质上。作为连接分子，没有特别限定，例如可举出聚乙烯链、烃链及肽等。单链核酸片段可以是DNA，也可以是RNA。另外，也可以包括BNA及LNA等人工核酸。
作为将特异性结合物质固定于粒子表面的方法，没有特别限制，可举出基于物理吸附的方法、基于化学键合的方法、利用亲和素-生物素的结合的方法以及利用蛋白G或蛋白A与抗体的结合的方法等。作为基于物理吸附的方法，可举出通过疏水相互作用或静电相互作用将特异性结合物质固定于粒子表面的方法。作为基于化学键合的方法，可举出使用交联剂的方法。例如，在粒子的表面具有羟基的情况下，使交联剂与特异性结合物质所具有的羧基反应而活性酯化后，使羟基与该酯基反应，由此能够使特异性结合物质固定于粒子表面。另外，为了不阻碍特异性结合物质对靶分子的识别能力，优选在特异性结合物质与粒子表面之间设置间隔物。
如上所述，在使用捕获物将靶物质110导入孔241中的情况下，优选在1个捕获物捕获0个或1个靶物质110的条件下形成捕获物与靶物质110的结合体。进而，优选构成为在1个孔241中导入0个或1个捕获物。由此，能够进行数字测量。
当使靶物质110、第一特异性结合物质120及第二特异性结合物质130接触时，形成包含它们的复合物100，第一单链核酸片段121的至少一部分和第二单链核酸片段131的至少一部分杂交而形成双链核酸140。复合物100的形成可以在试样、第一特异性结合物质120及第二特异性结合物质130被导入孔中之前在样品管内进行，也可以在孔241内进行。
靶物质可以由2个分子构成，也可以使用各个分子特异性的经核酸标记的特异性结合物质进行检测。在该情况下，能够测定上述2个分子是否为结合状态。另外，在上述2个分子形成均二聚体的情况下，经核酸标记的第一特异性结合物质和经核酸标记的第二特异性结合物质可以识别同一表位。
《封入工序》
可以在将试样、第一特异性结合物质120及第二特异性结合物质130导入孔241中之后，实施将孔241的开口部密封的工序。
将孔241的开口部密封的方法只要能够实现被收纳于某孔241的内部的液体与被收纳于其他的孔241的内部的液体相互不混合的状态，则并无特别限定，例如可以通过用密封液覆盖孔241的开口部而进行密封。或者，也可以通过在孔241的开口部上层叠玻璃板等板状部件来进行密封。
例如如图3所示，从盖部件220的导入口222向基板210与盖部件220之间的流路230输送密封液L220。输送到流路230的密封液L220与孔阵列240接触。然后，密封液L220将输送到流路230的试剂液L210中的未收纳于孔241的试药液L210冲走并替换。由此，密封液L220分别单独地将收纳有包含靶物质110的试剂液L210的多个孔241密封，孔241成为独立的反应空间(微小区室242)。当流路230被密封液L220填满时，多余的密封液L220会从排出口223排出。图4表示孔阵列240的全部孔241被密封液L220密封、形成了被密封的孔(即微小区室)242的状态。
另外，也可以在试剂液L210中预先溶解脂质，将密封液L220送液至流路230后，再次输送包含脂质的液体，由此在孔241的开口部形成脂质双层膜，利用该脂质双层膜分别单独地将多个孔241密封，形成经密封的孔242。作为形成脂双层膜的脂质，例如可举出1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰甘油(DOPG)以及它们的混合物等，但并不限定于这些。
通过上述任一种密封方法密封的孔242可以包含未与靶物质110结合的第一特异性结合物质120和/或未与靶物质110结合的第二特异性结合物质130。
密封液是能够将导入到多个孔241的液体彼此以不相互混合的方式单独地密封而形成液滴(也称为微小液滴)的液体。密封液优选为油性溶液，更优选为油。作为油，可以使用氟系油、有机硅系油、烃系油或它们的混合物等。更具体而言，可以使用Sigma公司制的商品名“FC-40”等。FC-40(CAS号：86508-42-1)为氟化脂肪族化合物，25℃下的比重为1.85g/mL。
《检测工序》
接着，检测双链核酸140的形成。双链核酸140的形成的检测优选使用信号扩增反应进行。作为信号扩增反应，例如可举出侵入裂解分析(Invasive Cleavage Assay，ICA)。
ICA反应与通过(1)核酸彼此的互补结合和(2)基于酶的三重链结构的识别和切断这两个反应的循环进行信号放大的原理相关。
ICA反应中，夹杂物造成的反应循环阻碍的影响小。因此，通过使用ICA反应，能够高精度地检测靶物质110。在信号扩增反应使用ICA反应的情况下，试剂液L210(包含靶物质110、第一特异性结合物质120及第二特异性结合物质130的液体)包含ICA反应所需的反应试剂。
作为ICA反应所需的反应试剂，可举出flap探针、flap内切酶(FEN)和荧光基质等ICA反应试剂。flap探针是按照与第一单链核酸片段121或第二单链核酸片段131杂交而形成双链核酸140和flap结构的方式设计的核酸片段。
图8是说明ICA法的一例的示意图。在图8的例子中，通过ICA法，检测第一单链核酸片段121的至少一部分和第二单链核酸片段131的至少一部分杂交而形成的双链核酸140。
首先，使flap探针与第一单链核酸片段121或第二单链核酸片段131杂交。在图8的例子中，flap探针810与第一单链核酸片段121杂交。其结果，形成第一flap部位811。
接着，当使FEN与第一flap部位811反应时，第一flap部位811被切断，生成核酸片段811。接着，核酸片段811与荧光基质(核酸片段820)杂交而形成第二flap部位821。
在图8的例子中，在核酸片段820的5’末端结合有荧光物质F，在距核酸片段820的5’末端数个碱基的3’侧结合有淬灭物质Q。接着，当使FEN与第二flap部位821反应时，第二flap部位821被切断，生成核酸片段821。其结果，荧光物质F从淬灭物质Q脱离，产生荧光信号。通过检测该荧光信号，能够检测双链核酸140的形成。
作为试剂液L210，可以使用在使用流体设备进行的生化学分析中使用的通常的液体，优选为水性溶液。另外，通过使试剂液L210中含有表面活性剂等，可以容易地在孔内封入液体。
在双链核酸140的形成的检测中使用ICA反应的情况下，在存在双链核酸140的情况下，通过基于等温反应的酶反应，荧光物质F从淬灭物质Q游离，与激发光对应地发出规定的荧光信号。
双链核酸140的形成的检测可以根据所检测的信号的种类选择公知的适当的方法。例如，在观察荧光信号的情况下，向微小区室242照射与荧光物质对应的激发光，观察荧光物质发出的荧光。例如如图4所示，在微小区室242内进行规定的反应，观察所产生的信号。微小区室242R是检测到信号的孔，微小区室242是未检测到信号的孔。
接着，参照图5～图7，以使用流体设备500的情况为例，对本实施方式的方法进行说明。
首先，如图5所示，向流体设备500的内部导入试剂液L210。试剂液L210是分散有靶物质110、第一特异性结合物质120及第二特异性结合物质130的液体，还包含用于检测双链核酸140的形成的试剂。在试剂液L210中，靶物质110的浓度优选调整为每1孔有1个分子以下的靶物质进入孔241的浓度。
接着，如图6所示，向流体设备500的内部导入密封液L220。密封液L220的比重大于试剂液L210。因此，密封液L220比试剂液L210中的未收纳于孔241的试剂液L210更向下方沉降，与孔阵列240接触。然后，密封液L220分别单独地将收纳有包含靶物质的试剂液L210的多个孔241密封，成为独立的反应空间(即微小区室242)。
接着，如图7所示，在微小区室242内进行规定的反应，观察所产生的信号。微小区室242R是检测到信号的孔，微小区室242是未检测到信号的孔。
[复合物]
在一个实施方式中，本发明提供一种复合物100，其包含靶物质110、由第一单链核酸片段121标记的针对靶物质110的第一特异性结合物质120、及由第二单链核酸片段131标记的针对靶物质110的第二特异性结合物质130，其中，第一单链核酸片段121的至少一部分和第二单链核酸片段131的至少一部分杂交而形成了双链核酸140。
在复合物100中，可以在第一单链核酸片段121或第二单链核酸片段131上进一步杂交有flap探针。
如上所述，通过利用本实施方式的复合物，能够不进行清洗工序地检测靶物质。
[试剂盒]
在一个实施方式中，本发明提供一种试剂盒，其为靶物质110的检测用试剂盒，其包含：具有多个孔241的孔阵列240、由第一单链核酸片段121标记的针对靶物质110的第一特异性结合物质120、及由第二单链核酸片段131标记的针对靶物质110的第二特异性结合物质130。
通过本实施方式的试剂盒，能够适当地进行上述的靶物质的检测方法。因此，本实施方式的试剂盒还可以说是用于下述方法的试剂盒，所述方法包含：将靶物质110、由第一单链核酸片段121标记的针对靶物质110的第一特异性结合物质120、及由第二单链核酸片段131标记的针对靶物质110的第二特异性结合物质130导入孔241中，其结果，形成包含靶物质110、第一特异性结合物质120及第二特异性结合物质130的复合物100，第一单链核酸片段121的至少一部分和第二单链核酸片段131的至少一部分杂交而形成双链核酸140的工序，以及检测双链核酸140的形成的工序；其中，检测到双链核酸140的形成表示靶物质110的存在。
孔阵列可以配置于上述流体设备的内部。另外，在本实施方式的试剂盒中，靶物质、第一单链核酸片段、第一特异性结合物质、第二单链核酸片段及第二特异性结合物质与上文所述的相同。
本实施方式的试剂盒还可以包含用于将孔241的开口部密封的密封液L220。密封液L220与上文所述的相同。
本实施方式的试剂盒可以进一步包含用于检测双链核酸140的试剂，所述双链核酸140是第一单链核酸片段121的至少一部分和第二单链核酸片段131的至少一部分杂交而形成的。
作为这样的试剂，可举出上述的ICA反应用的试剂，具体而言，可举出flap探针、flap内切酶(FEN)及荧光基质等。
实施例
[材料和方法]
(前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)的检测)
《对抗体的寡核苷酸修饰1》
使用抗体-寡核苷酸缀合工具，使两种抗人PSA小鼠单克隆抗体(克隆5A6及1H12，HyTest公司)上分别结合有不同的寡核苷酸(FASMAC公司)。使其分别结合有在5’末端进行了氨基修饰的寡核苷酸DNA1(5’-TTTGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTTTCCTTTCTGTGAGCAATTTCACCCA A-3’，序列号1)及DNA2(5’-GCATGGTTCCAATTTGGGTGAT-3’，序列号2)。DNA1与DNA2杂交而形成的双链核酸的长度为9个碱基。
《抗原抗体反应1》
将靶物质(PSA抗原)、上述2种寡核苷酸修饰抗体及封闭缓冲液混合，制备混合液。各混合液的用量分别为10μL。靶物质以终浓度分别达到0nM、0.294nM、2.94nM、14.7nM、29.4nM的方式制备。另外，2种寡核苷酸修饰抗体以终浓度分别达到8.56nM的方式制备。另外，作为封闭缓冲液，使用含有1％牛血清白蛋白(BSA)的Tris缓冲生理盐水(TBS)。接着，使各混合液在37℃下反应30分钟。
《侵入裂解分析(Invasive Cleavage Assay，ICA)反应试剂的制备1》
为了使用修饰在上述抗体上的寡核苷酸进行ICA反应，制备检测用ICA反应试剂。本实验例中的ICA反应试剂包含0.25μM等位基因探针(5’-CGCGCCGAGGAATTGCTCACAGAAAGGA-3’)(FASMAC公司，序列号3)、2μM FRET盒1(荧光基质，Alexa488-BHQ：X-TTCT-Y-AGCCGGTTTTCCGGCTGAGACCTCGGCGCG；X：Alexa488+Amino C6，Y：黑洞猝灭剂(BHQ)1-dT)(日本Bio Services公司，序列号4)、0.81μM flap核酸内切酶(FEN)-1、50mM Tris-HCl(pH为8.5)、20mM MgCl2及0.05％Tween20。需要说明的是，这些ICA反应试剂中的各成分的浓度是实验例中的终浓度。
[实验例1]
(试管内的靶物质(PSA)的检测)
将上述抗原抗体反应后的混合液10μL与上述ICA反应试剂10μL混合，使用Rotor-Gene Q(QIAGEN公司)使其在66℃下反应1小时，检测Alexa488的荧光。以下，有时将该反应称为“免疫ICA反应”。
图9～11是表示实验例1的结果的图表。图9是使用0nM、0.294nM、2.94nM、14.7nM、29.4nM的PSA抗原作为靶物质进行免疫ICA反应的结果。图9中，纵轴表示Alexa488的荧光强度(相对值)，横轴表示ICA反应开始后的时间(秒)。其结果可知，在PSA抗原为2.94nM以上的条件下，能够检测有无抗原。
图10是表示在图9的结果中，将抗原浓度为0nM时的荧光强度记为N(噪声)，将其他各浓度下的荧光强度记为S(信号)，算出信/噪比(S/N比)的结果的图表。图10中，纵轴表示S/N比，横轴表示ICA反应开始后的时间(秒)。其结果，抗原浓度为14.7nM的条件下的S/N比在从反应开始起1080秒时为10.0。另外，抗原浓度为29.4nM的条件下的S/N比在从反应开始起1080秒时为5.6。另外，抗原浓度为2.94nM的条件下的S/N比在从反应开始起1380秒时为4.6。
图11是表示抗原浓度(nM)与从反应开始起18分钟后的S/N比的关系的图表。图11中，纵轴表示S/N比，横轴表示抗原浓度(nM)。其结果，抗原浓度为14.7nM时，S/N比最高，为约10。
[实验例2]
(使用流体设备的靶物质(PSA)的检测)
将上述抗原抗体反应后的混合液10μL与上述ICA反应试剂10μL混合，将其中的10μL送液至流体设备。接着，输送FC-40(Sigma公司)作为密封液，将各孔密封。接着，将流体设备设置在热板上，在66℃下使其反应20分钟。
接着，用荧光显微镜BZ-710(KEYENCE公司)使用10倍的物镜拍摄流体设备中的各孔的荧光图像。曝光时间分别使用GFP的荧光滤光片并设为2秒。另外，在孔密封后，也用显微镜BZ-710使用10倍物镜拍摄明场图像。
图12左上是抗原浓度为0pM时的明场图像。图12右上是抗原浓度为0pM时的荧光图像。图12左下是抗原浓度为14.7nM时的明场图像。图12右下是抗原浓度为14.7nM时的荧光图像。其结果，在存在抗原的孔中，观察到了来自靶物质(PSA)的荧光信号。
图13是表示在检测到各浓度的靶物质的情况下观察到荧光的孔数及亮度的图表。图13中，纵轴表示观察到荧光的孔数，横轴表示亮度(相对值)。其结果可知，观察到荧光的孔数和亮度依赖于抗原浓度的增加地增加。
图14是表示检测到各浓度的靶物质的情况下的亮度的平均值±标准偏差的图表。图14中，纵轴表示亮度(相对值)，横轴表示抗原浓度。图15是表示在检测到各浓度的靶物质的情况下，临时设定亮度的阈值(本实验例中设定为6000)，显示该亮度以上的亮度的孔数的图表。其结果可知，在抗原浓度为2.94nM以上时，与没有抗原的情况相比，约3.7倍的数量的孔显示出阈值以上的亮度。
《对抗体的寡核苷酸修饰2》
使用抗体-寡核苷酸缀合工具，使两种抗人PSA小鼠单克隆抗体(克隆5A6及1H 12，HyTest公司)上分别结合有不同的寡核苷酸(FASMAC公司)。使其分别结合有在5’末端进行了氨基修饰的寡核苷酸DNA3(5’-TTTGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTTTCCTTTCTGTGAGCAATT TC-3’，序列号5)、DNA4(5’-TTTGTCACTGTTCCTCCTTTTGTT TTCCTTTCTGTGAGCAATTTCACCCAAATT-3’，序列号6)及DNA5(5’-TTTGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTTTCCTTTCTGTGAGCAATTTCACCCAAATTGGA-3’，序列号7)。DNA2与DNA3杂交而形成的双链核酸的长度为3个碱基。DNA2与DNA4杂交而形成的双链核酸的长度为12个碱基。DNA2与DNA5杂交而形成的双链核酸的长度为15个碱基。
《抗原抗体反应2》
将靶物质(PSA抗原)、分别结合有DNA1及DNA2的寡核苷酸修饰抗体、以及封闭缓冲液混合，制备混合液。各混合液的用量分别为10μL。靶物质以终浓度达到0nM或2.94nM的方式制备。另外，2种寡核苷酸修饰抗体以终浓度分别达到8.56nM的方式制备。另外，作为封闭缓冲液，使用含有1％BSA的TBS。接着，使各混合液在37℃下反应30分钟。作为2种寡核苷酸修饰抗体，使用分别结合有DNA2及DNA3的寡核苷酸修饰抗体的组合、分别结合有DNA2及DNA4的寡核苷酸修饰抗体的组合、以及分别结合有DNA2及DNA5的寡核苷酸修饰抗体的组合来代替上述的组合，除此以外，用相同的方法制备混合液，在相同的条件下进行反应。
《ICA反应试剂的制备2》
为了使用修饰在上述抗体上的寡核苷酸进行ICA反应，制备检测用ICA反应试剂。本实验例中的ICA反应试剂包含0.25μM等位基因探针(5’-CGCGCCGAGGAATTGCTCACAGAAAGGA-3’)(FASMAC公司，序列号3)、4μM FRET盒1(荧光基质，Alexa488-BHQ，X-TTCT-Y-AGCCGGTTTTCCGGCTGAGACCTCGGCGCG，X：Alexa488+Amin oC6，Y：黑洞猝灭剂(BHQ)1-dT)(日本Bio Services公司，序列号4)、0.81μM flap核酸内切酶(FEN)-1、50mM Tris-HCl(pH为8.5)、20mM MgCl2及0.05％Tween20。需要说明的是，这些ICA反应试剂中的各成分的浓度是实验例中的终浓度。
[实验例3]
(杂交而形成的双链核酸长度的影响)
将上述的抗原抗体反应后的混合液10μL与通过《ICA反应试剂的制备2》中记载的方法制备的ICA反应试剂10μL混合，使用Rotor-Gene Q(QIAGEN公司)在66℃下使其反应1小时，检测Alexa488的荧光。将使用分别结合有DNA1及DNA2的寡核苷酸修饰抗体的免疫ICA反应的结果示于图16。将使用分别结合有DNA2及DNA3的寡核苷酸修饰抗体的免疫ICA反应的结果示于图17。将使用分别结合有DNA2及DNA4的寡核苷酸修饰抗体的免疫ICA反应的结果示于图18。将使用分别结合有DNA2及DNA5的寡核苷酸修饰抗体的免疫ICA反应的结果示于图19。
由图16～19的结果可知，杂交而形成的双链核酸越长，反应性越高。另一方面，杂交而形成的双链核酸越长，背景反应的信号也越大。其中，杂交而形成的双链核酸为9bp时(图16)，从反应开始起3600秒时S/N比为7.4，杂交而形成的双链核酸为12bp时(图18)，从反应开始起1440秒时S/N比为5.7，杂交而形成的双链核酸为15bp时(图19)，从反应开始起288秒时S/N比为7.5。因此可知，杂交而形成的双链核酸为12～15bp，即使在背景反应的信号比较高的情况下，也能够以充分的灵敏度进行靶物质的检测。
[实验例4]
(抗原抗体反应液和ICA反应溶液混合的影响)
将混合溶液中的靶物质(PSA抗原)的终浓度设为0nM或2.94nM，将分别结合有DNA2及DNA5的寡核苷酸修饰抗体的终浓度设为8.56nM，除此以外，以与实验例3相同的顺序将抗原抗体反应后的混合液10μL与ICA反应试剂10μL混合，进行免疫ICA反应(以下称为反应型I)。
将靶物质(PSA抗原)、分别结合有DNA2及DNA5的寡核苷酸修饰抗体、以及封闭缓冲液混合，制备混合液。混合液的用量为10μL。混合液中的靶物质以终浓度达到0nM或2.94nM的方式制备。另外，2种寡核苷酸修饰抗体以终浓度分别达到8.56nM的方式制备。将该混合液10μL与通过《ICA反应试剂的制备2》中记载的方法制备的ICA反应试剂10μL混合。得到的混合液中的靶物质的终浓度为0nM或1.47nM，2种寡核苷酸修饰抗体的终浓度分别为4.28nM。将该混合液在37℃下保持30分钟进行抗原抗体反应，然后在66℃下保持1小时进行免疫ICA反应，使用Rotor-Gene Q(QIAGEN公司)检测Alexa488的荧光(以下称为反应型II)。
将反应型I和反应型II的结果示于图20。与如反应型I那样在抗原抗体反应后混合ICA反应溶液的方法相比，反应型II的免疫ICA反应强度及背景反应强度也没有大的差异。由该结果可知，在抗原抗体反应时，ICA反应试剂会使抗原抗体反应减弱，或者在ICA反应时抗原抗体反应试剂不会使ICA反应减弱。将抗原抗体反应溶液与ICA反应试剂混合后，能够继续进行抗原抗体反应和免疫ICA反应，在这点上，尽管工序简便，但能够高灵敏度地检测免疫ICA反应，这属于无法预测的效果。
工业上的可用性
通过本发明，能够提供不进行清洗工序地检测靶物质的技术。
附图标记说明
100 复合物
110 靶物质
111 第一结合部位
112 第二结合部位
120 第一特异性结合物质
121 第一单链核酸片段
130 第二特异性结合物质
131 第二单链核酸片段
140 双链核酸
200、500 流体设备
210 基板
220 盖部件
221 凸部
222 导入口
2323 排出口
230 流路
240 孔阵列
241 孔
242 封闭的孔(微小区室)
L210 试剂液
L220 密封液
242R 检测到信号的孔
510 壁部件
810 flap探头
811 第一flap部位(核酸片段)
821 第二flap部位(核酸片段)
820、820’ 核酸片段
F 荧光物质
Q 淬灭物质

Claims (14)

1.一种方法，其为试样中的靶物质的检测方法，其包含：
将所述试样、由第一单链核酸片段标记的针对所述靶物质的第一特异性结合物质、及由第二单链核酸片段标记的针对所述靶物质的第二特异性结合物质导入孔中，其结果，在所述试样中存在所述靶物质的情况下，形成包含所述靶物质、所述第一特异性结合物质及所述第二特异性结合物质的复合物，所述第一单链核酸片段的至少一部分和所述第二单链核酸片段的至少一部分杂交而形成双链核酸的工序；以及
检测所述双链核酸的形成的工序；
其中，检测到所述双链核酸的形成表示所述靶物质的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述孔的容积为10fL～100pL。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述第一特异性结合物质识别所述靶物质的第一结合部位，所述第二特异性结合物质识别所述靶物质的第二结合部位，所述第一结合部位与所述第二结合部位不同。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述第一结合部位和所述第二结合部位之间的距离是所述第一单链核酸片段的至少一部分和所述第二单链核酸片段的至少一部分能够杂交的距离。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述第一单链核酸片段及所述第二单链核酸片段的碱基长度分别为10～200个碱基。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包含在将所述试样、所述第一特异性结合物质及所述第二特异性结合物质导入所述孔中之后，将所述孔的开口部密封的工序。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，密封了开口部的所述孔包含未与所述靶物质结合的所述第一特异性结合物质和/或未与所述靶物质结合的所述第二特异性结合物质。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述靶物质为选自蛋白、糖链、核酸、脂质膜结构体、细菌、病毒及细胞中的1种或它们的复合物质。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述第一特异性结合物质及所述第二特异性结合物质分别为选自抗体、凝集素及对脂质膜具有结合性的物质中的1种。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中，检测所述双链核酸的形成的工序通过侵入裂解分析来进行。
11.一种复合物，其包含：靶物质、由第一单链核酸片段标记的针对所述靶物质的第一特异性结合物质、及由第二单链核酸片段标记的针对所述靶物质的第二特异性结合物质，其中，所述第一单链核酸片段的至少一部分和所述第二单链核酸片段的至少一部分杂交而形成了双链核酸。
12.一种试剂盒，其为靶物质的检测用试剂盒，其包含：
具有多个孔的孔阵列、
由第一单链核酸片段标记的针对所述靶物质的第一特异性结合物质、及
由第二单链核酸片段标记的针对所述靶物质的第二特异性结合物质。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其进一步包含用于将所述孔的开口部密封的密封液。
14.根据权利要求12或13所述的试剂盒，其进一步包含用于检测双链核酸的试剂，所述双链核酸是所述第一单链核酸片段的至少一部分和所述第二单链核酸片段的至少一部分杂交而形成的。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7122319B2 (en) * 2002-12-18 2006-10-17 Monogram Biosciences, Inc Multiplexed immunohistochemical assays using molecular tags
US20040248103A1 (en) * 2003-06-04 2004-12-09 Feaver William John Proximity-mediated rolling circle amplification
US7494776B2 (en) * 2005-07-07 2009-02-24 Beckman Coulter, Inc. Labeled complementary oligonucleotides to detect oligonucleotide-linked ligands
EP2350657A4 (en) * 2008-11-21 2013-06-12 Univ Saint Louis BIOSENSOR FOR DETECTING MULTIPLE EPITOPES ON ONE TARGET
ES2884100T3 (es) * 2011-11-11 2021-12-10 Eli N Glezer Procedimientos de ensayo asistidos por coagente de unión
EP3584306A1 (en) * 2014-01-31 2019-12-25 Toppan Printing Co., Ltd. Biomolecule analysis kit and biomolecule analysis method
EP3526667A4 (en) 2016-10-11 2020-07-01 Green Hills Software, Inc. SYSTEMS AND METHODS FOR SUMMARY AND VISUALIZATION OF TRACE DATA
JP2021519431A (ja) * 2018-04-03 2021-08-10 ザ ロイヤル インスティテューション フォー ザ アドバンスメント オブ ラーニング／マクギル ユニバーシティ 連結による共局在化サンドイッチアッセイ

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