WO2020235607A1 - 標的分子の検出方法 - Google Patents

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    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer

Definitions

  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • nucleic acid quantification is performed by real-time PCR method or the like.
  • Patent Document 1 a sample is flowed through a flow path in which a large number of wells having a depth of 3 ⁇ m and a diameter of 5 ⁇ m are formed, the sample is introduced into each well, and then the surplus reagent in the flow path is extruded with oil.
  • a method of introducing a sample into each well is disclosed.
  • At least one surface target molecule existing on the surface of the structure and at least one internal target molecule existing inside the structure are detected by the method of the present embodiment. Can be done.
  • the surface target molecule refers to a molecule that is exposed on the surface of a structure and is a detection target.
  • the internal target molecule is a molecule that is contained inside the structure and is not exposed on the surface, and is a molecule to be detected. In order to detect the internal target molecule, it is necessary to extract the contents from the structure and expose the internal target molecule.
  • a fluororesin may be laminated on the substrate 110 and the fluororesin may be processed by etching or the like to form a well array.
  • the fluororesin for example, CYTOP (registered trademark) (Asahi Glass) or the like can be used.
  • Well 142R is a well in which a signal was detected
  • well 142 is a well in which no signal was detected.
  • the reagent solution L110 is introduced into the fluid device 200.
  • the reagent solution L110 contains a target molecule.
  • the concentration of the target molecule contained in the reagent solution L110 is adjusted so that one or less target molecules per well can be contained in the well 141.
  • the reagent solution L110 is housed inside a plurality of wells 141.
  • the structure, the surface target molecule and the internal target molecule can be detected in association with each other. That is, surface target molecules and internal target molecules can be detected at the level of one structure.
  • the surface target molecule and the internal target molecule are detected by the method of the present embodiment, it can be said that the surface target molecule and the internal target molecule are present on the surface and inside of one structure.
  • the reagent solution L110 sent to the flow path 130 comes into contact with the well array 140. Then, the reagent solution L110 is housed inside the well 141. As a result, the structure will be introduced into the well 141.
  • the means for introducing the structure into the well is not particularly limited, and an appropriate means can be selected according to the selected structure.
  • an appropriate means can be selected according to the selected structure.
  • the structure is settled in the fluid device (in the flow path) by its own weight and distributed to the wells.
  • a substance that captures the structure may be used by a method described later, and the captured material may be bound to the structure that is difficult to settle due to its own weight to form a complex and the liquid may be sent.
  • the efficiency of introducing the structure into the well can be improved by immobilizing the trapped material in the well in advance and capturing the fed structure to form a complex.
  • the method for immobilizing the specific binding substance on the particle surface is not particularly limited, and is limited to a method by physical adsorption, a method by chemical bonding, a method using avidin-biotin binding, and binding of protein G or protein A to an antibody.
  • There is a method of using examples of the method by physical adsorption include a method of immobilizing a specific binding substance on the particle surface by hydrophobic interaction or electrostatic interaction.
  • Examples of the method using a chemical bond include a method using a cross-linking agent.
  • the carboxyl group of the specific binding substance is reacted with a cross-linking agent to form an active ester, and then the hydroxyl group is reacted with this ester group to form the specific binding substance. It can be immobilized on the surface. Further, it is preferable to provide a spacer between the specific binding substance and the particle surface so as not to hinder the recognition ability of the target molecule by the specific binding substance.
  • the sealing liquid is a liquid capable of forming droplets, that is, fine droplets by individually sealing the liquids introduced into a plurality of wells so as not to mix with each other, and is preferably an oil-based solution. More preferably, it is oil.
  • oil a fluorine-based oil, a silicone-based oil, a hydrocarbon-based oil, a mixture thereof, or the like can be used. More specifically, the trade name "FC-40" manufactured by Sigma Co., Ltd. can be used.
  • FC-40 (CAS No .: 86508-42-1) is a fluorinated aliphatic compound having a specific gravity of 1.85 g / mL at 25 ° C.
  • the extractant acts in the well, the structure collapses, and the internal target molecule is extracted.
  • FIG. 7B is a schematic view showing a state after the extraction step is performed on the structure in the state of FIG. 7A. As shown in FIG. 7B, the internal target molecule 720 is extracted from the structure 700'after the extraction step.
  • FIG. 8B is a schematic view showing a state after the extraction step is performed on the structure in the state of FIG. 8A. As shown in FIG. 8B, the internal target molecule 720 is extracted from the structure 700'after the extraction step.
  • the signal amplification reaction may be, for example, a biochemical reaction, more specifically, an enzymatic reaction.
  • a fluid device is placed in a well containing a reagent solution containing an enzyme for signal amplification under constant temperature conditions where the desired enzyme activity can be obtained, for example, 60 ° C. or higher 75.
  • An isothermal reaction maintained at a constant temperature of ° C. or lower, preferably about 66 ° C., for a predetermined time, for example, at least 10 minutes, preferably about 15 minutes.
  • the reagent solution L110 may contain an ICA reaction reagent such as an allele probe, an ICA oligo, a flap endonuclease-1 (FEN-1), and a fluorescent substrate.
  • an ICA reaction reagent such as an allele probe, an ICA oligo, a flap endonuclease-1 (FEN-1), and a fluorescent substrate.
  • the detection of the surface target molecule can also be performed by binding a specific binding substance to the surface target molecule to the target molecule and detecting the bound specific binding substance.
  • the internal target molecule is the same as the surface target molecule, and examples thereof include at least one molecule selected from the group consisting of nucleic acids, proteins, sugars, glycoproteins, lipids or complexes thereof.
  • the surface target molecule may contain a protein and the internal target molecule may contain a nucleic acid.
  • the steps of encapsulating the structure in the well, extracting the contents of the structure, detecting the surface target molecule, and detecting the internal target molecule may be performed in a different order, or any two steps may be performed at the same time.
  • the extraction step may be performed after the introduction of the structure into the wells and before the encapsulation step of the structure in the wells, and in that case, the introduction step and the extraction step may be performed at the same time.
  • a part of the surface target molecule detection step or the internal target molecule detection step may be performed before the extraction step.
  • the detection of the surface target molecule or the detection of the internal target molecule and the detection of the structure may be performed at the same time.
  • the reaction system is configured so that the detection signals do not interfere with each other, which is the same as the above-mentioned case.
  • the presence or absence of the surface target molecule and the internal target molecule is detected for each well.
  • structures, surface target molecules and internal target molecules can be detected in association with each other. That is, surface target molecules and internal target molecules can be detected at the level of one structure.
  • “Evaluating a structure” thus refers to detecting a structure, a surface target molecule, and an internal target molecule in association with each other. Further, the origin or state of the structure may be analyzed by evaluating the structure.
  • a capture was prepared to capture the f1 phage. Specifically, as a trap, magnetic beads on which an anti-f1 phage antibody was immobilized were prepared.
  • Example 1 Phage (10%) was sonicated for 1 minute using a probe-type ultrasonic generator.
  • -Sample 2 Bug Buster (manufactured by Merck Millipore) was added to phage (10%) in a volume ratio of 50%, and the mixture was stirred at 37 ° C. for 30 minutes.
  • Sample 3 Phage (10%) was heated at 70 ° C. for 30 minutes.
  • -Sample 4 BugBuster (manufactured by Merck Millipore) was added to phage (10%) in a volume ratio of 50%, and the mixture was stirred at 70 ° C. for 30 minutes.

Abstract

この構造体の表面標的分子及び内部標的分子を検出する方法は、複数のウェルを有するウェルアレイに、構造体が分散した液体を接触させ、前記ウェルに前記構造体を導入することと、前記ウェルアレイに封止液を接触させ、前記構造体を前記ウェル内に封入することと、前記ウェル内で前記構造体の内容物を抽出することと、前記ウェル内で前記構造体の表面に存在していた少なくとも１種の表面標的分子を検出することと、前記ウェル内で前記構造体の内部に存在していた少なくとも１種の内部標的分子を検出することと、を含む。

Description

標的分子の検出方法
　本発明は、標的分子の検出方法に関する。より具体的には、構造体の表面に存在する表面標的分子及び構造体の内部に存在する内部標的分子を検出する方法、構造体の評価方法及びキットに関する。
　本願は、２０１９年５月２１日に日本に出願された特願２０１９－０９５１８７号について優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　生体試料中の標的分子を定量的に検出することにより、疾患の早期発見や投薬の効果予測が行われている。従来から、タンパク質の定量は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等により行われ、核酸の定量はリアルタイムＰＣＲ法等により行われている。
　近年、疾患をより早期に発見する等の目的で、標的分子をより精度よく検出するニーズが高まっている。標的分子を精度よく検出する手法として、例えば、特許文献１、特許文献２及び非特許文献１等には、多数の微小区画内で酵素反応を行う技術が記載されている。これらの手法はデジタル計測と呼ばれている。
　デジタル計測では、試料溶液を極めて多数の微小溶液に分割する。そして、各微小溶液からの信号を２値化し、標的分子が存在するか否かのみを判別して、標的分子数を計測する。デジタル計測によれば、従来のＥＬＩＳＡやリアルタイムＰＣＲ法等と比較して、検出感度及び定量性を格段に向上させることができる。
　デジタルＰＣＲでは、１つの微小液滴に存在する鋳型となる核酸が０個ないし１個になるように、ＰＣＲ反応試薬と核酸との混合物は希釈されている。デジタルＰＣＲでは、核酸増幅の感度を高めるために、また多数の微小液滴に対して同時に核酸増幅を行うために、各微小液滴の体積は小さい方が好ましい。例えば、特許文献３には、各ウェルの容積が６ｎＬ（ナノリットル）となるように形成されたアレイ状の反応容器が開示されている。また、特許文献１には、深さ３μｍ、直径５μｍのウェルが多数形成された流路に試料を流して各ウェルに試料を導入した後、流路内の余剰試薬をオイルで押し出すことによって、各ウェル内に試料を導入する方法が開示されている。
特許第６１８３４７１号公報 特表２０１４－５０３８３１号公報 国際公開第２０１３／１５１１３５号
Kim S. H., et al., Large-scale femtoliter droplet array for digital counting of single biomolecules., Lab on a Chip, 12 (23), 4986-4991, 2012.
　本発明は、構造体の外部及び内部に存在する標的分子を検出する技術を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］複数のウェルを有するウェルアレイに、構造体が分散した液体を接触させ、前記ウェルに前記構造体を導入することと、前記ウェルアレイに封止液を接触させ、前記構造体を前記ウェル内に封入することと、前記ウェル内で前記構造体の内容物を抽出することと、前記ウェル内で前記構造体の表面に存在している少なくとも１種の表面標的分子を検出することと、前記ウェル内で前記構造体の内部に存在している少なくとも１種の内部標的分子を検出することと、を含む、前記構造体の表面標的分子及び内部標的分子を検出する方法。
［２］前記構造体の内容物を抽出すること、前記表面標的分子を検出すること及び前記内部標的分子を検出することが、前記構造体を前記ウェル内に封入することの後に行われる、［１］に記載の方法。
［３］前記表面標的分子を検出すること及び前記内部標的分子を検出することが、前記構造体の内容物を抽出することの後に行われる、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記表面標的分子を検出すること及び前記内部標的分子を検出することが同時に行われる、［１］～［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］前記表面標的分子を検出すること及び前記内部標的分子を検出することが、同一条件下で行われる、［１］～［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］前記表面標的分子及び前記内部標的分子のそれぞれが、核酸、タンパク質、糖、脂質又はこれらの複合体からなる群より選択される少なくとも１種の分子である、［１］～［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］前記表面標的分子がタンパク質を含み、前記内部標的分子が核酸を含む、［１］～［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］前記内部標的分子を検出することが核酸検出手法により行われる、［１］～［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］前記核酸検出手法が、Ｉｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙである、［８］に記載の方法。
［１０］前記表面標的分子を検出することにおいて検出するシグナルと前記内部標的分子を検出することにおいて検出するシグナルが互いに識別可能である、［１］～［９］のいずれか一項に記載の方法。
［１１］前記構造体が、ウイルス、エクソソーム、細胞、小胞体からなる群より選択されるいずれか１つである、［１］～［１０］のいずれか一項に記載の方法。
［１２］前記構造体が捕捉物との複合体を形成しており、前記捕捉物は固相と前記構造体に対する特異的結合物質との結合体である、［１］～［１１］のいずれか一項に記載の方法。
［１３］前記特異的結合物質が抗体である、［１２］に記載の方法。
［１４］前記構造体の内容物を抽出することは、界面活性剤を含む液体中で構造体を加熱するである、［１］～［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［１５］前記ウェルに前記構造体を導入することにおいて、前記ウェル１つあたりに１つ以下の前記構造体が導入される、［１］～［１４］のいずれか一項に記載の方法。
［１６］［１５］に記載の方法により、前記ウェル毎に前記表面標的分子及び前記内部標的分子の有無を検出することと、前記表面標的分子の検出結果及び前記内部標的分子の検出結果に基づいて前記構造体を評価することと、を含む、構造体の評価方法。
［１７］複数のウェルを有するウェルアレイ、構造体から内容物を抽出する試薬、前記構造体の表面に存在する少なくとも１種の表面標的分子を検出する試薬、及び、前記構造体の内部に存在する少なくとも１種の内部標的分子を検出する試薬、を含む、前記構造体の前記表面標的分子及び前記内部標的分子を検出するためのキット。
　本発明によれば、構造体の外部及び内部に存在する標的分子を検出する技術を提供することができる。
流体デバイスの一例を示す模式断面図である。 流体デバイスの一例を示す模式断面図である。 流体デバイスの一例を示す模式断面図である。 流体デバイスの一例を示す模式断面図である。 流体デバイスの一例を示す模式断面図である。 流体デバイスの一例を示す模式断面図である。 構造体が、ウェルと封止液Ｌ１２０により形成された微小区画に収容されている様子を示す模式図である。 抽出工程後において、構造体から内部標的分子が抽出されている様子を示す模式図である。 構造体が、捕捉物を利用してウェルに導入及び封入され、ウェルと封止液により形成された微小区画に収容されている様子を示す模式図である。 抽出工程後において、構造体から内部標的分子が抽出されている様子を示す模式図である。 実施例２における蛍光観察の結果を示す写真である。 実施例３において、蛍光シグナルの経時変化を測定した結果を示すグラフである。 実施例４において、蛍光シグナルの経時変化を測定した結果を示すグラフである。
　以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
［構造体の表面標的分子及び内部標的分子を検出する方法］
　本発明の一実施形態において、複数のウェルを有するウェルアレイに、構造体が分散した液体を接触させ、前記ウェルに前記構造体を導入することと、前記ウェルアレイに封止液を接触させ、前記構造体を前記ウェル内に封入することと、前記ウェル内で前記構造体の内容物を抽出することと、前記ウェル内で前記構造体の表面に存在していた少なくとも１種の表面標的分子を検出することと、前記ウェル内で前記構造体の内部に存在していた少なくとも１種の内部標的分子を検出することと、を含む、前記構造体の表面標的分子及び内部標的分子を検出する方法を提供する。
　なお、前記構造体を導入することを導入工程と表現してもよい。同様に、前記構造体の内容物を抽出することを抽出工程と表現してもよい。前記表面標的分子を検出することを表面標的分子検出工程と表現してもよい。前記内部標的分子を検出することを内部標的分子検出工程と表現してもよい。
　実施例において後述するように、本実施形態の方法により、構造体の表面に存在する少なくとも１種の表面標的分子、及び、構造体の内部に存在する少なくとも１種の内部標的分子を検出することができる。
　本明細書において、表面標的分子とは、構造体の表面に露出して存在している分子であって、検出対象である分子をいう。また、内部標的分子とは、構造体の内部に内包されており、表面に露出していない分子であって、検出対象である分子をいう。内部標的分子を検出するためには、構造体から内容物を抽出し、内部標的分子を露出させる必要がある。
　本実施形態の方法によれば、１構造体レベルで表面標的分子及び内部標的分子を検出することも容易である。
（構造体）
　構造体としては、表面標的分子が露出した表面、及び、内部標的分子を含む内部構造を有するものであれば特に制限されず、任意の構造体を用いることができる。具体的な構造体としては、例えば、ウイルス、エクソソーム、細胞及び小胞体等が挙げられる。細胞としては、真核細胞、原核細胞等が挙げられる。真核細胞としては、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞及び真菌細胞等が挙げられる。原核細胞としては、細菌等が挙げられる。小胞体としては、細胞内小器官である小胞体及び脂質膜で構成された天然の又は人工の膜小胞等が挙げられる。構造体は、生体試料中に存在するものであってもよい。生体試料としては特に制限されず、血清、血漿及び尿等が挙げられる。
（ウェル）
　ウェルアレイは複数のウェルを有する。各ウェルは、上述した構造体、及び、後述する、前記構造体の内容物の抽出、表面標的分子の検出、内部標的分子の検出で使用する試薬を収容可能な寸法を有していれば、その形状及び配置は特に限定されない。
　また、ウェルは、無処理で使用してもよいし、目的に応じて、予めウェル内壁に構造体の内容物を抽出する抽出試薬、抗体及び構造体に対する特異的結合物質等を固定化していてもよい。
（流体デバイス）
　図１は、流体デバイスの一例を示す模式断面図である。図１に示すように、ウェルアレイ１４０は、流路１３０を備える流体デバイス１００の流路１３０と隣接して配置されていてもよい。図１に示すように、流体デバイス１００は、基板１１０と、基板１１０に対向して配置される蓋部材１２０（単に蓋１２０と記載してもよい）とを備えている。蓋部材１２０は、凸部１２１を有している。凸部１２１の先端は、基板１１０に接している。流体デバイス１００において、ウェルアレイ１４０は、基板１１０の一方面上に基板１１０と一体成型されており、蓋部材１２０と対向している。ウェルアレイ１４０は、複数のウェル１４１を有する。複数のウェルは、流路１３０と接続している。蓋部材１２０は、基板１１０に溶着又は接着されていてもよい。
　ウェル１４１は、基板１１０の表面に開口を有している。ウェル１４１の形状、寸法、及び配置は特に限定されないが、１つのウェル１４１に１個の構造体が導入されることが好ましい。ウェル１４１は、容積が小さい微小ウェルであることが好ましい。例えば、１つのウェル１４１の容積は、１０ｆＬ～１００ｐＬ程度であってもよい。流体デバイス１００では、同形同大の複数のウェル１４１がウェルアレイ１４０を構成している。同形同大とは、デジタル計測を行うために要求される程度に同一の形状で同一の容量であればよく、製造上の誤差程度のばらつきであれば許容される。
　ウェル１４１の直径は、例えば１～１０μｍ程度であってもよい。ウェル１４１の深さは、例えば１～１０μｍ程度であってもよい。また、ウェル１４１の配置は、特に制限されず、例えば三角格子状に整列していてもよいし、正方格子状に整列していてもよいし、ランダムに配置されていてもよい。
　流体デバイス１００では、凸部１２１の存在により、ウェルアレイ１４０と蓋部材１２０との間に空間が形成されている。当該空間は、流路１３０を構成している。流路１３０は、構造体が分散した液体及び封止液を送液するための経路として機能する。流路１３０の形状、構造及び容量等は特に限定されないが、流路１３０の高さ、つまり基板１１０の表面と、蓋部材１２０の基板１１０と対向する面との間の距離は、例えば５００μｍ以下であってもよいし、例えば３００μｍ以下であってもよいし、例えば２００μｍ以下であってもよいし、例えば１００μｍ以下であってもよい。
　凸部１２１は、蓋部材１２０と一体に成形されていてもよい。蓋部材１２０は、例えば、熱可塑性樹脂の流動体を、成形型を用いて成形することで、凸部１２１を有する板状に成形することができる。また、蓋部材１２０には試薬の導入ポート１２２及び排出ポート１２３が形成されていてもよい。
　蓋部材１２０が凸部１２１を有する場合、基板１１０のウェル１４１が開口する面に凸部１２１が接するように、蓋部材１２０と基板１１０とが重ねられる。この結果、蓋部材１２０と基板１１０との間の空間が流路となる。蓋部材１２０と基板１１０とは、レーザー溶着等により溶着されてもよい。
（流体デバイスの変形例１）
　本実施形態の方法に用いられる流体デバイスは、上述した流体デバイス１００に限られない。図４は、流体デバイスの一例を示す模式断面図である。図４に示すように、流体デバイス２００は、基板１１０と、壁部材２１０（単に壁部２１０と記載してもよい）とを備えている。流体デバイス２００においては、ウェルアレイ１４０は基板１１０の一方面上に基板１１０と一体成形されている。ウェルアレイ１４０は複数のウェル１４１を有する。
　流体デバイス２００は、蓋部材１２０を有していない点で上述した流体デバイス１００と主に異なっている。このため、流体デバイス２００は、流路を有していない。
（流体デバイスの変形例２）
　上述した流体デバイス１００においては、蓋部材１２０と凸部１２１は一体成形されている。しかしながら、蓋部材１２０と凸部１２１は、別体として成形されていてもよい。
　また、上述した流体デバイス１００及び流体デバイス２００においては、ウェルアレイ１４０は、基板１１０の一方面上に基板１１０と一体成形されている。しかしながら、ウェルアレイは、基板１１０と一体成形されていなくてもよい。例えば、流体デバイス１００とは別体として成形されたウェルアレイ１４０を、流体デバイスの基板１１０上に配置してもよい。あるいは、基板１１０の表面に樹脂層を積層し、エッチング等により、樹脂層にウェルアレイを形成してもよい。
（流体デバイスの変形例３）
　また、上述した流体デバイス１００においては、ウェルアレイは基板１１０に形成されている。しかしながら、ウェルアレイは蓋部材１２０に設けられていてもよい。別の側面として、流体デバイス１００とは別体として成型されたウェルアレイを流体デバイス１００の蓋部材１２０上に配置してもよい。あるいは、蓋部材１２０の表面に樹脂層を積層し、エッチング等により樹脂層にウェルアレイを形成してもよい。あるいは、蓋部材１２０の表面に直接ウェルアレイを形成してもよい。
（流体デバイスの材質）
　基板１１０は、例えば樹脂を用いて形成される。樹脂の種類は、特に限定されないが、試薬及び封止液に対して耐性のある樹脂であることが好ましい。また、検出するシグナルが蛍光
である場合には、自家蛍光が少ない樹脂であることが好ましい。例えば、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマー、シリコン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ酢酸ビニル、フッ素樹脂、及びアモルファスフッ素樹脂等が挙げられるがこれらに限定されない。
　基板１１０の板厚方向の一方面に複数のウェル１４１が形成されていてもよい。言い換えれば、基板１１０の一方の面に、板厚方向に深さを有する複数のウェル１４１が形成されていてもよい。樹脂を用いたウェルの形成方法としては、射出成形、熱インプリント、光インプリント等が挙げられる。
　あるいは、例えば、基板１１０の上にフッ素樹脂を積層し、当該フッ素樹脂をエッチング等により加工してウェルアレイを形成してもよい。フッ素樹脂としては、例えばＣＹＴＯＰ（登録商標）（旭硝子）等を用いることができる。
　また、流体デバイスが蓋部材１２０を有する場合、蓋部材１２０の材質は、自家蛍光の少ない樹脂であることが好ましく、例えば、シクロオレフィンポリマー及びシクロオレフィンコポリマー等の熱可塑性樹脂であってもよい。
　また、蓋部材１２０は、シグナルを蛍光観察する際に検出される波長の近傍の波長の光を透過しない材料から形成されていてもよく、完全に光を透過しない材料から形成されていてもよい。例えば、蓋部材１２０は、カーボン又は金属粒子等を添加した熱可塑性樹脂から形成されていてもよい。
（従来の標的分子の検出方法）
　図１～図３を参照しながら、流体デバイス１００を用いた場合を例に、デジタル計測により標的分子を検出する従来の方法について説明する。
　まず、図１に示すように、流体デバイス１００の導入ポート１２２から試薬液Ｌ１１０を導入し、流路１３０に送液する。試薬液Ｌ１１０は標的分子を含んでいる。試薬液Ｌ１１０に含まれる標的分子の濃度は、ウェル１４１に１ウェルあたり１分子以下の標的分子が入る濃度に調整されている。流路１３０に送液された試薬液Ｌ１１０は、複数のウェル１４１の内部に収容される。
　続いて、図２に示すように、蓋部材１２０の導入ポート１２２から、基板１１０と蓋部材１２０との間の流路１３０に、封止液Ｌ１２０を送液して複数のウェル１４１を個別に封止する。封止液としては、例えば油性のオイルを用いることができる。封止液Ｌ１２０は、流路１３０に送液された試薬液Ｌ１１０のうち、ウェル１４１に収容されていない試薬液Ｌ１１０を押し流して置換する。これにより、封止液Ｌ１２０が、標的分子を含む試薬液Ｌ１１０を収容した複数のウェル１４１をそれぞれ個別に封止し、ウェル１４１は独立した反応空間、つまり微小区画１４２となる。
　続いて、図３に示すように、ウェル１４１内で所定の反応を行い、発生したシグナルを観察する。ウェル１４２Ｒはシグナルが検出されたウェルであり、ウェル１４２はシグナルが検出されなかったウェルである。
　従来の検出方法では、細胞やウイルス等の構造体に含まれる核酸やタンパク質等の標的分子を検出する場合、予め構造体から標的分子を抽出し、試薬液Ｌ１１０に混合して送液する。このため、構造体から標的分子を抽出する段階及び送液工程で標的分子が失われ、減少する場合がある。また、標的分子がウェル１４１内に収容されず、流路１３０の内部に留まり、封止液Ｌ１２０に押し流され、反応工程においてシグナル増幅反応が観測されず、存在が検出されない場合がある。この結果、構造体に含まれる標的分子を正確に検出することができない場合がある。また、標的分子を検出することができた場合においても、構造体と検出された標的分子とを関連付けることができない。
　続いて、図４～図６を参照しながら、流体デバイス２００を用いた場合を例に、デジタル計測により標的分子を検出する従来の方法について説明する。この場合には、国際公開第２０１６／００６２０８号に開示される方法を用いて、検出することができる。
　まず、図４に示すように、流体デバイス２００の内部に試薬液Ｌ１１０を導入する。試薬液Ｌ１１０は、標的分子を含んでいる。試薬液Ｌ１１０に含まれる標的分子の濃度は、ウェル１４１に１ウェルあたり１分子以下の標的分子が入る濃度に調整されている。試薬液Ｌ１１０は、複数のウェル１４１の内部に収容される。
　続いて、図５に示すように、流体デバイス２００の内部に封止液Ｌ１２０を導入する。封止液Ｌ１２０の比重は、試薬液Ｌ１１０よりも大きい。このため、封止液Ｌ１２０は、試薬液Ｌ１１０のうち、ウェル１４１に収容されていない試薬液Ｌ１１０よりも下に沈み、ウェルアレイ１４０に接する。そして、封止液Ｌ１２０は、標的分子を含む試薬液Ｌ１１０を収容した複数のウェル１４１をそれぞれ個別に封止し、ウェル１４１は独立した反応空間、つまり微小区画１４２となる。
　続いて、図６に示すように、ウェル１４１内で所定の反応を行い、発生したシグナルを観察する。ウェル１４２Ｒはシグナルが検出されたウェルであり、ウェル１４２はシグナルが検出されなかったウェルである。
（本実施形態の検出方法）
　続いて、場合により図１～３を参照しながら、流体デバイス１００を用いた場合を例に、本実施形態の方法について説明する。本実施形態の方法は、構造体の表面標的分子及び内部標的分子を検出する方法であり、複数のウェルを有するウェルアレイに、構造体が分散した液体を接触させ、前記ウェルに前記構造体を導入することと、前記ウェルアレイに封止液を接触させ、前記構造体を前記ウェル内に封入することと、前記ウェル内で前記構造体の内容物を抽出することと、前記ウェル内で前記構造体の表面に存在していた少なくとも１種の表面標的分子を検出することと、前記ウェル内で前記構造体の内部に存在していた少なくとも１種の内部標的分子を検出することとを含む。
　本実施形態の方法によれば、構造体、表面標的分子及び内部標的分子を互いに関連付けて検出することができる。すなわち、１構造体レベルで表面標的分子及び内部標的分子を検出することができる。本実施形態の方法により、表面標的分子及び内部標的分子が検出された場合、当該表面標的分子及び内部標的分子は、１つの構造体の表面及び内部に存在していたということができる。
　本実施形態の方法によれば、表面標的分子及び内部標的分子を含む２種類以上の標的分子を検出することができる。また、複数種類の表面標的分子を検出することもできる。さらに、複数種類の内部標的分子を検出することもできる。
《構造体のウェルへの導入》
　本工程では、図１に示すように、流体デバイス１００の導入ポート１２２から試薬液Ｌ１１０を導入し、流路１３０に送液する。試薬液Ｌ１１０は、構造体が分散した液体である。試薬液Ｌ１１０は、表面標的分子及び内部標的分子を検出するための試薬も含む。試薬液Ｌ１１０を流路１３０に送液する時点において、表面標的分子を検出するための試薬は、表面標的分子に結合していてもよく、していなくてもよい。
　従来の方法においては、試薬液Ｌ１１０は、予め構造体から抽出された標的分子を含んでいる。一方で、本実施形態の方法においては、試薬液Ｌ１１０は、構造体そのものを含む点において従来技術と異なっている。つまり、試薬液Ｌ１１０は、構造体を含む。
　流路１３０に送液された試薬液Ｌ１１０は、ウェルアレイ１４０に接触する。そして、ウェル１４１の内部に試薬液Ｌ１１０が収容される。この結果、ウェル１４１に構造体が導入されることになる。
　導入工程において１つのウェルに導入される構造体の数は、特に制限されないが、好ましくは、１つのウェルに１つ以下、すなわち、０個又は１個の構造体が導入される。これにより、構造体の検出を１個単位で行うことができ、すなわちデジタル計測が可能となる。また、ウェルアレイの全てのウェルに構造体が導入される必要はない。
　構造体をウェルに導入する手段は、特に制限されず、選択した構造体に応じた適切な手段を選択することができる。例えば、構造体を自重により流体デバイス内（流路内）で沈降させ、ウェルに分配する方法が挙げられる。あるいは、後述する方法で構造体を捕捉する物質（捕捉物）を利用し、自重で沈降しにくい構造体に捕捉物を結合させて複合体を形成して送液してもよい。また、予めウェルに捕捉物を固定化させておき、送液された構造体を捕捉させて複合体を形成させることで、構造体のウェルへの導入効率を向上させることもできる。
　試薬液Ｌ１１０よりも比重が小さい捕捉物を構造体に結合させて試薬液Ｌ１１０を送液することで構造体をウェルに導入してもよい。この場合、基板１１０が上側、蓋部材１２０が下側となるよう流体デバイス１００を上下反転させた状態で試薬液Ｌ１１０を送液することで構造体をウェルに導入することができる。また、流体デバイスの変形例３で説明した流体デバイスを用いる場合、蓋部材１２０に形成されたウェルに構造体を導入することができる。なお、構造体が試薬液Ｌ１１０よりも比重が小さい場合には、同様の方法で構造体をウェルに導入することができる。
　捕捉物を構造体に結合させる工程は、本実施形態の方法の任意の時点で行うことができる。例えば、この工程は、ウェルに構造体を導入する前に、サンプルチューブ内で構造体と捕捉物を接触させることにより行ってもよい。構造体と捕捉物との接触は、構造体を含む試薬液Ｌ１１０に捕捉物を添加して行ってもよい。また、構造体と捕捉物とを接触させ、その後表面標的分子及び内部標的分子を検出するための試薬を含む溶液と混合してもよい。あるいは、捕捉物をウェルに導入した後に、構造体をウェルに導入し、ウェル内で捕捉物と構造体とを接触させることにより複合体を形成させてもよい。
　捕捉物は、構造体を捕捉することができる物質である。捕捉物は、例えば、固相と構造体に対する特異的結合物質との結合体であってもよい。また、特異的結合物質は抗体であってもよい。
　固相としては、粒子、膜及び基板等が挙げられる。また、構造体に対する特異的結合物質は、少なくとも１種類であってもよい。例えば３種類であってもよいし、４種類であってもよいし、５種類以上であってもよい。
　粒子としては、特に制限されず、ポリマー粒子、磁気粒子及びガラス粒子等が挙げられる。粒子は、非特異的な吸着を避けるための表面処理が施された粒子が好ましい。また、特異的結合物質を固定化するために、表面にカルボキシル基等の官能基を有する粒子が好ましい。より具体的には、ＪＳＲ社製の商品名「Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ　ＬＣ３００」等を用いることができる。
　あるいは、例えば構造体としてウイルスを用いる場合、ウイルスが付着することができる細胞（すなわち、ウイルス受容体を有する細胞）を、捕捉物として用いてもよい。
　特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、アプタマー及びレクチン等が挙げられる。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｓＦｖ）、２量化体Ｖ領域断片（Ｄｉａｂｏｄｙ）及びＣＤＲを含むペプチド等が挙げられる。抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。また、市販の抗体であってもよい。
　特異的結合物質を粒子表面に固定化する方法としては、特に制限されず、物理吸着による方法、化学結合による方法、アビジン－ビオチンの結合を利用する方法及びプロテインＧ又はプロテインＡと抗体との結合を利用する方法等が挙げられる。物理吸着による方法としては、疎水的相互作用又は静電的相互作用により、特異的結合物質を粒子表面に固定化する方法が挙げられる。化学結合による方法としては、架橋剤を使用する方法が挙げられる。例えば、粒子の表面が水酸基を有する場合、特異的結合物質が有するカルボキシル基に架橋剤を反応させて活性エステル化した後、水酸基とこのエステル基とを反応させることにより、特異的結合物質を粒子表面に固定化させることができる。また、特異的結合物質による標的分子の認識能を阻害しないよう、特異的結合物質と粒子表面との間にスペーサーを設けることが好ましい。
　上述したように、構造体のウェルへの導入を、捕捉物を用いて行ってもよい。例えば、捕捉物と構造体との複合体を流路に送液し、ウェルに導入してもよい。
　ここで、捕捉物１個に構造体が０個又は１個捕捉される条件で捕捉物と構造体との複合体を形成することが好ましい。さらに、１つのウェルには、捕捉物が０個又は１個導入されるように構成されることが好ましい。これによりデジタル計測が可能となる。すなわち、本実施形態において、構造体の検出は１個単位で行われてもよい。その場合は、１構造体レベルで、表面標的分子及び内部標的分子が検出される。
《構造体のウェルへの封入》
　本工程では、図２に示すように、蓋部材１２０の導入ポート１２２から、基板１１０と蓋部材１２０との間の流路１３０に、封止液Ｌ１２０を送液する。流路１３０に送液された封止液Ｌ１２０は、ウェルアレイ１４０に接触する。そして、封止液Ｌ１２０は、流路１３０に送液された試薬液Ｌ１１０のうち、ウェル１４１に収容されていない試薬液Ｌ１１０を押し流して置換する。これにより、封止液Ｌ１２０が、構造体を含む試薬液Ｌ１１０を収容した複数のウェル１４１をそれぞれ個別に封止し、ウェル１４１は独立した反応空間、つまり微小区画１４２となる。
　封止液は、複数のウェルに導入された液体同士を互いに混合しないように個別に封止して液滴、つまり微小液滴を形成することができる液であり、好ましくは油性溶液であり、より好ましくはオイルである。オイルとしては、フッ素系オイル、シリコーン系オイル、炭化水素系オイル又はこれらの混合物等を使用することができる。より具体的には、シグマ社製の商品名「ＦＣ－４０」等を用いることができる。ＦＣ－４０（ＣＡＳ番号：８６５０８－４２－１）はフッ素化脂肪族化合物であり、２５℃における比重が１．８５ｇ／ｍＬである。
《構造物の内容物の抽出》
　本工程では、ウェル１４１内で構造体の内容物を抽出する。本工程では、構造体から内部標的分子を含む内容物を抽出する。内容物の抽出においては、構造体から全ての標的分子が抽出されてもよいし、構造体に含まれる標的分子の一部のみが抽出されてもよい。
　構造体から標的分子を抽出する方法としては、特に制限されず、公知の手法を用いることができる。例えば、熱、超音波、光、磁力、又は電磁波等を用いた物理的手法界面活性剤、抗生物質、浸透圧誘導剤又はネクローシス・アポトーシス誘導剤等の抽出剤を用いた化学的手法及びこれら手法の組み合わせ等が挙げられる。
　界面活性剤としては、構造体を不安定化させるものが望ましい。具体的な界面活性剤として、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（ポリエチレングリコールモノ－４－オクチルフェニルエーテル（ｎ＝約１０）ともいう）、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ－４０（オクチルフェノキシポリ(エチレンオキシ)エタノールともいう）及びＴｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラートともいう）等が挙げられる。また、抽出剤として、界面活性剤を含む試薬を用いてもよい。界面活性剤を含む試薬としては、例えば、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（メルクミリポア社製）等が挙げられる。
　より具体的には、抽出方法として熱を用いる場合、構造体を不安定化させるのに十分な温度となるよう構造体を加熱すればよい。流体デバイスを好ましくは７０℃以上９０℃以下、より好ましくは７５℃以上８５℃以下、例えば約８０℃で、少なくとも５分間、好ましくは少なくとも１０分間、例えば約１５分間又は約３０分間加熱することにより、構造体から標的分子を抽出することができる。
　抽出方法として熱を用いる場合、界面活性剤を含む液体中で構造体を加熱することにより、構造体の内容物を抽出してもよい。
　抽出剤を使用する場合、構造体及び抽出剤は、本実施形態の方法の任意の時点で接触させることができる。例えば、構造体及び抽出剤を、導入工程の前に混合し、続いて混合した液体を送液してウェルに導入してもよい。その後、封入工程を行う。
　この場合、例えば構造体と抽出剤との混合比を調整する等の方法により、ウェルが封止された後にウェル内で構造体から標的分子が抽出されるように、抽出条件を設計してもよい。あるいは、抽出剤をウェルに導入してから、構造体が分散した液体を送液し、ウェル内で接触させてもよい。その後、封入工程を行う。
　ウェルを封止した後に、ウェル内にて抽出剤が作用し、構造体が崩壊し、内部標的分子が抽出される。
　抽出工程は、ウェルが封止された後、ウェル内で行われる。これにより、標的分子の損失を抑制することができる。その結果、標的分子を構造体から抽出した後に流路を用いてマイクロアレイの各ウェルに分配する従来の方法と比較して、標的分子を精度よく検出することができる。
　図７Ａは、表面標的分子７１０及び内部標的分子７２０を含む構造体７００が、ウェル１４１と封止液Ｌ１２０により形成された微小区画１４２に収容されている様子を示す模式図である。
　図７Ｂは、図７Ａの状態の構造体に抽出工程を実施した後の様子を示す模式図である。図７Ｂに示すように、抽出工程後において、構造体７００’から内部標的分子７２０が抽出されている。
　図８Ａは、表面標的分子７１０及び内部標的分子７２０を含む構造体７００が、捕捉物８００を利用してウェルに導入及び封入され、ウェル１４１と封止液Ｌ１２０により形成された微小区画１４２に収容されている様子を示す模式図である。捕捉物８００には、構造体７００に対する特異的結合物質８１０が結合している。
　図８Ｂは、図８Ａの状態の構造体に抽出工程を実施した後の様子を示す模式図である。図８Ｂに示すように、抽出工程後において、構造体７００’から内部標的分子７２０が抽出されている。
《表面標的分子検出工程》
　本工程では、ウェル１４１内で構造体の表面に存在していた少なくとも１種の表面標的分子を検出する。
　表面標的分子としては、核酸、タンパク質、糖、糖タンパク質、脂質又はこれらの複合体からなる群より選択される少なくとも１種の分子が挙げられる。核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡ等が挙げられる。タンパク質としては、構造タンパク質、膜タンパク質及び酵素等が挙げられる。
　構造体は、標的分子を含む。本願明細書において、構造体が標的分子を「含む」とは、構造体が標的分子を内包することか、又は、標的分子の一部若しくは全部が構造体の表面に存在することを指し得る。
　表面標的分子を検出する方法は、検出したい標的分子の特性に合わせて、公知の任意の検出方法を使用することができる。例えば、まず必要に応じて標的分子由来のシグナルを検出可能なレベルまで増幅させる反応（シグナル増幅反応）を行い、次いで増幅されたシグナルを適切な手段を用いて検出する。本実施形態において、表面標的分子を検出する工程は、核酸検出手法により行われてもよい。
　本実施形態に係る検出方法において使用することができるシグナルの例としては、蛍光、化学発光、発色、電位変化及びｐＨ変化等が挙げられる。
　シグナル増幅反応は、例えば生化学反応、より具体的には酵素反応であってもよい。一例として、シグナル増幅反応は、シグナル増幅のための酵素を含んだ試薬液がウェル内に収容された状態で、流体デバイスを、所望の酵素活性が得られる一定温度条件下、例えば６０℃以上７５℃以下の一定温度、好ましくは約６６℃で、所定時間、例えば少なくとも１０分間、好ましくは約１５分間、維持する等温反応である。
　シグナル増幅反応の例としては、具体的には、核酸検出手法を使用する場合には、Ｉｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）法、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）法（商標登録）、５’→３’ヌクレアーゼ法（ＴａｑＭａｎ（登録商標）法）、蛍光プローブ法等が挙げられる。ＩＣＡ反応を用いることが特に好ましい。
　ＩＣＡ反応は、（１）核酸同士の相補的結合と、（２）酵素による三重鎖構造の認識及び切断との２つの反応のサイクルによってシグナル増幅が進行するという原理に関連する。
　ＩＣＡ反応においては、標的分子以外の夾雑物による反応サイクル阻害の影響が小さい。したがって、構造体からの内容物の抽出において構造体内に存在する標的分子以外の様々な成分が微小区画内に放出される場合でも、ＩＣＡ反応を用いることにより、標的分子を精度よく検出することができる。例えば、シグナル増幅反応にＩＣＡ反応を用いる場合、試薬液Ｌ１１０（構造体を分散させる液体）は、ＩＣＡ反応に必要な反応試薬及び鋳型核酸を含む。
　ＩＣＡ反応を用いる場合、具体的には、試薬液Ｌ１１０中に、アレルプローブ、ＩＣＡオリゴ、フラップエンドヌクレアーゼ－１（ＦＥＮ－１）、蛍光基質等のＩＣＡ反応試薬が含まれていてもよい。
　試薬液Ｌ１１０としては、流体デバイスを用いて行われる生化学分析において使用される一般的な液体を用いることができ、好ましくは水性溶液である。また、試薬液Ｌ１１０に界面活性剤等を含ませることにより、ウェル内に液体を封入しやすくしてもよい。また、試薬液Ｌ１１０は、構造体の内容物の抽出で使用する抽出剤を含んでいてもよい。しかしながら、抽出剤は、生化学反応を行う酵素を失活させる場合があるため、試薬液Ｌ１１０に抽出剤を含有させることは容易ではない。
　表面標的分子の検出における生化学反応がＩＣＡ反応である場合、ウェルに標的分子が存在すると、等温反応による酵素反応によって、蛍光物質が消光物質から遊離し、励起光に対応して所定の蛍光シグナルを発する。
　あるいは、表面標的分子の検出は、表面標的分子に対する特異的結合物質を標的分子に結合させ、結合した特異的結合物質を検出することによっても行うことができる。
　例えば、表面標的分子がタンパク質である場合、ＥＬＩＳＡ法を用いて検出することができる。より具体的には、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の原理を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより行ってもよい。
　ＦＲＥＴの原理を用いたサンドイッチ法を行う場合、まず、第１の蛍光物質（ドナー）で標識した第１の特異的結合物質（例えば抗体）と、第１の蛍光物質の蛍光波長と重複する吸光波長を有する第２の蛍光物質（アクセプター）で標識した第２の特異的結合物質を準備する。続いて、表面標的分子（例えば抗原）を、第１の特異的結合物質と第２の特異的結合物質の両方と接触させ、複合体を形成させる。複合体が形成されると、ドナーとアクセプターの距離が近づき、ドナーの励起波長の照射によりアクセプターの蛍光波長を検出することができるようになる。
　あるいは、特異的結合物質を核酸断片で標識しておき、核酸断片をＩＣＡ反応により検出してもよい。特異的結合物質としては、例えば抗体、抗体断片、又はアプタマー等を使用することができる。標的分子に結合した特異的結合物質を検出するために、特異的結合物質を、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素により、直接的又は間接的に標識してもよい。２以上の特異的結合物質を使用する場合は、各々の特異的結合分子を、互いに識別可能に標識することができる。
　シグナルの観察方法は、観察するシグナルの種類に応じて公知の適切な方法を選択することができる。例えば、明視野観察を行う場合は、ウェルアレイが設けられた基板に対して垂直方向に白色光を照射する。蛍光シグナルを観察する場合は、蛍光物質に対応する励起光をウェル内へ照射し、蛍光物質が発する蛍光を観察する。
《内部標的分子の検出》
　本工程では、ウェル１４１内で構造体の内部に存在していた少なくとも１種の内部標的分子を検出する。
　内部標的分子としては、表面標的分子と同様であり、核酸、タンパク質、糖、糖タンパク質、脂質又はこれらの複合体からなる群より選択される少なくとも１種の分子が挙げられる。例えば、表面標的分子がタンパク質を含み、内部標的分子が核酸を含んでいてもよい。
　内部標的分子の検出は、上述した表面標的分子と同様にして行うことができる。なかでも、内部標的分子の検出が核酸検出手法により行われることが好ましい。核酸検出手法としては、ＩＣＡ法が好ましい。
　例えば、表面標的分子を核酸標識抗体を用いて検出し、核酸標識抗体に標識された核酸をＩＣＡ法で検出することができる。また、内部標的分子が核酸である場合、当該核酸をＩＣＡ法で検出することができる。
　このように、表面標的分子と内部標的分子とが異なる分子であったとしても、標識することによって、同じ原理により検出することができる。上記の場合、表面標的分子及び内部標的分子をいずれもＩＣＡ法で検出することが可能となる。このため、表面標的分子及び内部標的分子を同じ条件で同時に検出することができる。
　本実施形態の方法において、構造体の内容物の抽出、表面標的分子の検出及び内部標的分子の検出は、構造体のウェルへの封入の後に行われることが好ましい。これにより、１つの構造体に由来する表面標的分子及び内部標的分子を検出することができる。そして、構造体、表面標的分子及び内部標的分子を互いに関連付けて検出することができる。
　表面標的分子及び内部標的分子は、いずれの順序で検出してもよい。また、表面標的分子が複数種類存在する場合、それぞれの表面標的分子は、いずれの順序で検出してもよい。また、内部標的分子が複数種類存在する場合、それぞれの内部標的分子は、いずれの順序で検出してもよい。また、表面標的分子の検出及び内部標的分子の検出は同時に行われてもよいし、独立して別々に行われてもよい。
　また、表面標的分子の検出及び内部標的分子の検出は同一条件下で行われてもよい。表面標的分子の検出及び内部標的分子の検出を同一条件下で同時に行うことにより、本実施形態の方法を簡便に実施することができる。
　表面標的分子の検出及び内部標的分子の検出において、２種類以上の標的分子を同時に検出する場合や、同時ではなくても各標的分子が検出可能な状態で共存している状況で順次検出する場合等には、各標的分子それぞれの存在を示すシグナルが混同しないように反応系を設計する必要がある。このような場合、表面標的分子の検出で検出するシグナルと内部標的分子の検出で検出するシグナルが互いに識別可能であることが好ましい。
　さらに、表面標的分子が複数種類存在する場合、それぞれの表面標的分子の存在を示すシグナルも互いに識別可能であることが好ましい。同様に、内部標的分子が複数種類存在する場合、それぞれの内部標的分子の存在を示すシグナルも互いに識別可能であることが好ましい。
　例えば、蛍光シグナルによって検出を行う場合には、励起光や蛍光の波長を異なる帯域とすることで、シグナルを互いに識別可能にすることができる。あるいは、例えば、蛍光シグナルと磁気シグナル等の、異なるシグナルを用いることにより、シグナルを互いに識別可能にすることもできる。
　本実施形態の方法は、構造体のウェルへの封入、表面標的分子の検出、構造体の内容物の抽出、内部標的分子の検出の順に実施してもよい。すなわち、構造体をウェルに封入した後、構造体の表面に存在する表面標的分子を検出する。その後、構造体の内容物を抽出する。これにより、内部標的分子がウェルの内部に露出する。その後、内部標的分子の検出を実施してもよい。この場合、表面標的分子の検出のためのシグナルと内部標的分子の検出のためのシグナルとが同一である場合でも、検出のタイミングによって表面標的分子と内部標的分子とを識別可能である。
　表面標的分子の検出を構造物の内容物の抽出の前に行う場合、表面標的分子の検出は、内部標的分子の抽出が生じない条件で行われる。例えば、構造物の内容物の抽出時の温度よりも低い温度、より具体的には室温から約６０℃の範囲の温度で表面標的分子の検出を行ってもよい。
　あるいは、表面標的分子の検出及び内部標的分子の検出を、構造物の内容物の抽出の後に行ってもよい。
　あるいは、構造体のウェルへの封入、構造体の内容物の抽出、表面標的分子の検出、内部標的分子の検出の各工程を順序を入れ替えて行ったり、いずれか２つの工程を同時に行ってもよい。例えば、構造体のウェルへの導入の後、構造体のウェルへの封入工程を行う前に抽出工程を行ってもよく、その場合、導入工程と抽出工程とを同時に行ってもよい。また、上述したように、表面標的分子検出工程又は内部標的分子検出工程の一部を、抽出工程を行う前に行ってもよい。
（構造体の検出）
　本実施形態の方法は、構造体を検出する工程を更に備えていてもよい。構造体の検出は、上記実施形態の方法の任意の時点で行うことができ、例えば、構造体のウェルへの導入の後、構造体の内容物の抽出の前に行ってもよい。あるいは、構造体の内容物の抽出の後に、構造体を検出してもよい。
　あるいは、表面標的分子の検出又は内部標的分子の検出と、構造体の検出とを同時に行ってもよい。表面標的分子の検出、内部標的分子の検出、構造体の検出を同時に行う場合、検出シグナルが相互に干渉しないように反応系を構成する点については、上述した場合と同様である。
　構造体は、明視野観察する等の方法により直接検出してもよい。あるいは、構造体に含まれる分子を、表面標的分子又は内部標的分子と同様の操作により検出する等の方法により、間接的に構造体を検出してもよい。後者の例としては、細胞膜を染色する蛍光色素や、ウイルスコートタンパク質を認識する抗体等を用いて構造体を検出することが挙げられる。
［構造体の評価方法］
　本発明の一実施形態は、複数のウェルを有するウェルアレイに、構造体が分散した液体を接触させ、前記ウェルに１ウェルあたり１つ以下の前記構造体を導入することと、前記ウェルアレイに封止液を接触させ、前記構造体を前記ウェル内に封入することと、前記ウェル内で前記構造体の内容物を抽出することと、前記ウェル内で前記構造体の表面に存在していた少なくとも１種の表面標的分子を検出する表面標的分子を検出することと、前記ウェル内で前記構造体の内部に存在していた少なくとも１種の内部標的分子を検出することと、前記表面標的分子の検出結果及び前記内部標的分子の検出結果に基づいて前記構造体を評価することと、を含む、構造体の評価方法を提供する。
　本実施形態の方法では、ウェル毎に前記表面標的分子及び前記内部標的分子の有無を検出する。その結果、構造体、表面標的分子及び内部標的分子をそ互いに関連付けて検出することができる。すなわち、１構造体レベルで表面標的分子及び内部標的分子を検出することができる。「構造体を評価する」とは、このように、構造体、表面標的分子及び内部標的分子を互いに関連付けて検出することを指す。また、構造体を評価することによって、構造体の由来又は状態等を解析してもよい。
［キット］
　本発明の一実施形態は、複数のウェルを有するウェルアレイ、前記構造体から内容物を抽出する試薬、前記構造体の表面に存在する少なくとも１種の表面標的分子を検出する試薬、及び、前記構造体の内部に存在する少なくとも１種の内部標的分子を検出する試薬、を含む、前記構造体の前記表面標的分子及び前記内部標的分子を検出するためのキットを提供する。
　ウェルアレイは、上述した流体デバイスを構成していてもよい。構造体から内容物を抽出する試薬（つまり、抽出剤）、表面標的分子を検出する試薬及び内部標的分子を検出する試薬については、上述したものと同様である。
　本実施形態のキットにより、構造体の表面標的分子及び内部標的分子の検出を好適に実施することができる。
　以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。本発明は、これらの実施例に何ら限定されない。
［実施例１］
（ウイルス表面タンパク質及びウイルス内核酸の検出）
　構造体の表面標的分子及び内部標的分子を検出した。構造体として、ウイルスの一種であるｆ１ファージ（試薬名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｐｈａｇｅ　ｆ１、独立行政法人　製品評価技術基盤機構、型番：ＮＢＲＣ２００１０）を用いた。また、表面標的分子として、ｆ１ファージ（内包ＤＮＡとして、5’-ACGTTAAACAAAAAATCGTTTCTTATTTGGATTGGGATAAATAATATGGCTGTTTATTTTGTAACTGGCAAATTAGGCTCTGGAAAGACGCTCGTTAGCGTTGGTAAGATTCAGGATAAAATTGTAGCTGGGTGCAAAAT-3’（配列番号１）の塩基配列を有する。）の表面タンパク質であるコートタンパク質を検出した。また、内部標的分子として、ｆ１ファージのゲノムＤＮＡ上の塩基配列（5'-GTAACTGGCAAATTAGGCTCTGGAAAGACGCTCGTTAGC-3'、配列番号２）を検出した。また、構造体のウェルへの導入には、特異的結合物質として抗体を有する磁性ビーズを捕捉物として用いた。
《核酸検出試薬の調製》
　下記表１に組成を示すＩＣＡ反応液を調製した。この反応液はＩＣＡ反応で核酸を検出するためのものである。表１中、Ａｌｅｘａ４８８及びＲｅｄｍｏｎｄ　ＲＥＤ（表１ではＲＥＤと表記）は蛍光色素であり、ＢＨＱ－１（表１ではＢＨＱと表記）及びＥｃｌｉｐｓｅは消光物質である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　続いて、ＩＣＡ反応液とタンパク質抽出試薬であるＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（メルクミリポア社製）を容量比で１：１となるように混合した溶液（溶液Ａ）を調製した。
《捕捉物の調製》
　ｆ１ファージを捕捉する捕捉物を調製した。具体的には、捕捉物として、抗ｆ１ファージ抗体を固定化した磁性ビーズを調製した。
　まず、カルボキシル基修飾磁性ビーズ（Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ、ＬＣ３００、ＪＳＲ社）溶液に、抗ｆ１ファージ抗体（型式「Ａｎｔｉ－Ｍ－１３　Ｐｈａｇｅ　Ｃｏａｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ」、フナコシ社）を添加し、ローテーターで３０分反応させた。続いて、縮合剤であるＥＤＣ（１－Ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）を加えて３時間反応させ、抗ｆ１ファージ抗体をカルボキシル基修飾磁性ビーズに固定化した。
　続いて、未反応の抗体と試薬を取り除くため、マグネットスタンドを用いて抗体固定化磁性ビーズを磁気捕集した。続いて、ＰＢＳ－Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ））による洗浄を３回繰り返し、抗体固定化磁性ビーズを調製した。これにより、ｆ１ファージを捕捉する捕捉物が調製された。
《核酸標識抗ｆ１ファージ抗体の作製》
　抗ｆ１ファージ抗体（型式「Ａｎｔｉ－Ｍ－１３　Ｐｈａｇｅ　Ｃｏａｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ」、フナコシ社）に、ＤＮＡ断片（5’-TTTGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTTTCCTTTCTGTGAGCAATCTCACCCAAATTGGAACCATGCTGTATACAGTT-3’、配列番号９）を結合させ、核酸標識抗ｆ１ファージ抗体を作製した。ＤＮＡ断片の結合には、市販のキット（商品名「Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｏｌｉｇｏ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ」、ソルリンク社）を用いた。
《ｆ１ファージ及び抗体固定化ビーズの反応》
　ｆ１ファージの濃度は、販売されているｆ１ファージの懸濁液の濃度を１００％とした場合における希釈率として表す。ｆ１ファージ（終濃度０％又は終濃度１％）、１００μｇ／ｍＬの上述した抗体固定化磁性ビーズ、１０ｎｇ／ｍＬの上述した核酸修飾抗ｆ１ファージ抗体を、全量が１００μＬとなるように混合し、ローテーター上で室温１時間反応させた。ここで、ｆ１ファージが存在する場合、抗ｆ１ファージ抗体が、ｆ１ファージ表面のコートタンパク質を認識し結合することにより抗体固定化磁性ビーズとの複合体が形成された。
　続いて、マグネットスタンドを用いて磁性ビーズを磁気捕集し、上清の除去及びＰＢＳ－Ｔを加える操作を３回繰り返して洗浄し、最後に上清を除去した。
《導入工程》
　続いて、図１に示す構造の流体デバイスに、上述した溶液Ａ（ＩＣＡ反応液とＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（メルクミリポア社製）の混合液）に懸濁した抗体固定化磁性ビーズ２０μＬを送液し、ウェルアレイに接触させた。この結果、抗体固定化磁性ビーズがウェルに導入された。
　本実施例で用いた流体デバイスのウェルの直径は５μｍであり、ウェルの深さは３μｍであった。また、流路の高さは１００μｍであった。
《封入工程》
　続いて、封止液としてＦＣ－４０（Ｓｉｇｍａ社）を１５０μＬ送液し、ウェルアレイに接触させた。この結果、各ウェルが個別に封止され、抗体固定化磁性ビーズが封入された。以上の操作により、抗体固定化磁性ビーズがｆ１ファージとの複合体を形成していた場合、１ウェルあたり１個以下のｆ１ファージがウェル内に封止された。
《抽出工程》
　続いて、上記流体デバイスをホットプレート上にセットし、６６℃で１５分間反応させた。これにより、封止されたウェル内で、ｆ１ファージのカプシド構造が壊れ、ｆ１ファージの内容物であるゲノムＤＮＡが抽出された。
《表面標的分子検出工程及び内部標的分子検出工程》
　続いて、抽出工程後の上記流体デバイスをホットプレート上にセットし、６６℃で１５分間反応させた。これにより、表面標的分子及び内部標的分子が同時に検出された。
　より詳細には、アレルプローブ１及びＩＣＡオリゴ１がゲノムＤＮＡ上の塩基配列（配列番号２）にそれぞれハイブリダイズし、フラップ構造を形成した。続いて、ＦＥＮ－１がフラップ構造を認識してアレルプローブ１を切断した。
　続いて、放出されたアレルプローブ１の断片がＲＥＤ－Ｅｃｌｉｐｓｅにハイブリダイズし、フラップ構造を形成した。続いて、ＦＥＮ－１がフラップ構造を認識してＲＥＤ－Ｅｃｌｉｐｓｅを切断し、その結果、蛍光物質と消光物質が離れ、Ｒｅｄｍｏｎｄ　ＲＥＤの蛍光シグナルが発生した。
　同様に、アレルプローブ２及びＩＣＡオリゴ２が、核酸標識抗ｆ１ファージ抗体に修飾されたＤＮＡ断片にそれぞれハイブリダイズし、フラップ構造を形成した。続いて、ＦＥＮ－１がフラップ構造を認識してアレルプローブ２を切断した。
　続いて、放出されたアレルプローブ２の断片がＡｌｅｘａ４８８－ＢＨＱにハイブリダイズし、フラップ構造を形成した。続いて、ＦＥＮ－１がフラップ構造を認識してＡｌｅｘａ４８８－ＢＨＱを切断し、その結果、蛍光物質と消光物質が離れ、Ａｌｅｘａ４８８の蛍光シグナルが発生した。
《ウェルの蛍光観察》
　表面標的分子検出工程及び内部標的分子検出工程の後、蛍光顕微鏡ＢＺ－７１０（ＫＥＹＥＮＣＥ社）を用いて流体デバイスの各ウェルの蛍光シグナルを撮影した。１０倍の対物レンズを用いた。
　露光時間は、Ａｌｅｘａ４８８の蛍光観察の際にはＧＦＰの蛍光フィルターを用いて３０００ｍｓｅｃとし、Ｒｅｄｍｏｎｄ　ＲＥＤの蛍光観察の際にはＴｅｘａｓ　Ｒｅｄの蛍光フィルターを用いて２０００ｍｓｅｃとした。
　図９は、蛍光観察の結果を示す写真である。図９中、「ファージなし」はウイルス濃度０％のｆ１ファージの結果であることを示し、「ファージあり」はウイルス濃度１％のｆ１ファージの結果であることを示す。
　また、「Ａｌｅｘａ４８８」はＡｌｅｘａ４８８の蛍光を検出した結果であることを示し、「ＲＥＤ」はＲｅｄｍｏｎｄ　ＲＥＤの蛍光を検出した結果であることを示し、「Ｏｖｅｒｌａｙ」はＡｌｅｘａ４８８の蛍光の検出結果とＲｅｄｍｏｎｄ　ＲＥＤの蛍光の検出結果を重ね合わせた結果であることを示す。下記表２に蛍光が検出されたウェルの数を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　その結果、ファージのコートタンパク質が出された３２ウェルのうち２３ウェルで配列番号２の核酸断片が検出されたことが明らかとなった。すなわち、ファージのコートタンパク質が出されたウェルのうちの約７２％のウェルでファージのゲノムＤＮＡを検出することができた。この結果は、構造体の表面標的分子と内部標的分子を高精度で関連付けて検出することができることを示す。
［実施例２］
（抽出試薬の濃度の検討）
　抽出工程において、構造体から内容物を抽出する試薬（抽出試薬）の濃度を検討した。構造体として、ウイルスの一種であるｆ１ファージ（試薬名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｐｈａｇｅ　ｆ１、独立行政法人　製品評価技術基盤機構、型番：ＮＢＲＣ２００１０）を用いた。また、内部標的分子として、ｆ１ファージのゲノムＤＮＡ上の塩基配列（配列番号２）を検出した。
《核酸検出試薬の調製》
　下記表３に組成を示すＩＣＡ反応液を調製した。表３中、Ａｌｅｘａ４８８は蛍光色素であり、ＢＨＱ－１（表３中、ＢＨＱと表記）は消光物質である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　続いて、ＩＣＡ反応液とタンパク質抽出試薬であるＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（メルクミリポア社製）を容量比でＩＣＡ反応液：ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ＝９：１、１：１、１：９となるように混合した溶液をそれぞれ調製した。また、ネガティブコントロールとして、ｆ１ファージを含まない試料も用意した。
　続いて、各試料をリアルタイムＰＣＲ装置（型式「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０」、ロシュ社）にセットし、６５℃で６０分間反応させ、Ａｌｅｘａ４８８の蛍光シグナルを経時的に測定した。
　図１０は、蛍光シグナルの経時変化を測定した結果を示すグラフである。図１０中、「９：１ＮＣ」は、ｆ１ファージを含まないＩＣＡ反応液とＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（メルクミリポア社製）を容量比でＩＣＡ反応液：ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ＝９：１で混合した試料の結果であることを示し、「９：１ｐｈａｇｅ」は、ＩＣＡ反応液（ｆ１ファージを含む。）とＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（メルクミリポア社製）を容量比でＩＣＡ反応液：ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ＝９：１で混合した試料の結果であることを示し、「１：１ＮＣ」は、ｆ１ファージを含まないＩＣＡ反応液とＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（メルクミリポア社製）を容量比でＩＣＡ反応液：ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ＝１：１で混合した試料の結果であることを示し、「１：１ｐｈａｇｅ」は、ＩＣＡ反応液（ｆ１ファージを含む。）とＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（メルクミリポア社製）を容量比でＩＣＡ反応液：ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ＝１：１で混合した試料の結果であることを示し、「１：９ＮＣ」は、ｆ１ファージを含まないＩＣＡ反応液とＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（メルクミリポア社製）を容量比でＩＣＡ反応液：ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ＝１：９で混合した試料の結果であることを示し、「１：９ｐｈａｇｅ」は、ＩＣＡ反応液（ｆ１ファージを含む。）とＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（メルクミリポア社製）を容量比でＩＣＡ反応液：ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ＝１：９で混合した試料の結果であることを示す。
　その結果、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒの容量比が高すぎると、ＩＣＡ反応が阻害されることが明らかとなった。
［実施例３］
（抽出工程の検討）
　本実施例では、構造体から内容物を抽出する条件の検討を行った。構造体として、ウイルスの一種であるｆ１ファージ（試薬名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｐｈａｇｅ　ｆ１、独立行政法人製品評価技術基盤機構、型番：ＮＢＲＣ２００１０）を用いた。また、ｆ１ファージのゲノムＤＮＡ上の塩基配列（配列番号２）を内部標的分子として検出した。
《核酸検出試薬の調製》
　下記表４に組成を示すＩＣＡ反応液を調製した。この反応液はＩＣＡ反応で核酸を検出するためのものである。表４中、Ａｌｅｘａ４８８は蛍光色素であり、ＢＨＱ－１（表４中、ＢＨＱと表記）は消光物質である。表４中、「ＭＯＰＳ」は３－モルホリノプロパンスルホン酸を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　続いて、種々の条件でファージの内容物の抽出を試み、以下の試料１～４を調製した。
　・試料１：ファージ（１０％）に、プローブ型超音波発生装置を用いて超音波処理を１分間行った。
　・試料２：ファージ（１０％）に、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（メルクミリポア社製）を容量比で５０％加え、３７℃で３０分間撹拌した。
　・試料３：ファージ（１０％）を７０℃で３０分間加熱した。
　・試料４：ファージ（１０％）に、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（メルクミリポア社製）を容量比で５０％加え、７０℃で３０分間撹拌した。
　続いて、サンプルチューブに、上述したＩＣＡ反応液と試料１～４とをそれぞれ混合して、ファージ濃度が終濃度１％、容量１０μＬとなる溶液を調製した。
　また、ネガティブコントロールとして、ＩＣＡ反応液のみ（試料５）、及び、ＩＣＡ反応液及びファージの混合溶液（試料６）を調製した。また、ポジティブコントロールとして、ＩＣＡ反応液に、ｆ１ファージのゲノムＤＮＡ上に存在する塩基配列（配列番号２）を有する核酸断片を終濃度３０ｐＭとなるように加えた溶液（試料７）を調製した。
　続いて、これらの試料をリアルタイムＰＣＲ装置（型式「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０」、ロシュ社）にセットし、６６℃で６０分間反応させ、Ａｌｅｘａ４８８の蛍光シグナルを経時的に測定した。
　図１１は、蛍光シグナルの経時変化を測定した結果を示すグラフである。図１１中、横軸は反応時間（秒）を示し、縦軸は蛍光強度（相対値）を示す。図１１中、「ＩＣＡ」はＩＣＡ溶液を示し、「ｐｈａｇｅ」はファージを示し、「ｂｕｇ」はＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（メルクミリポア社製）を示す。
　その結果、ファージを超音波処理した試料１、ファージにＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（メルクミリポア社製）を加えた試料２、ファージに７０℃の熱処理を加えた試料３、ファージにＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（メルクミリポア社製）を加え、かつ、７０℃で３０分間熱処理した試料４、及びポジティブコントロールの試料７において、いずれも蛍光強度の増加が検出された。
　また、ファージを超音波処理した試料１、及び、ファージにＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（メルクミリポア社製）を加え、かつ、７０℃で３０分間熱処理した試料４で、は蛍光強度の増加が顕著であった。一方、ネガティブコントロールのＩＣＡ反応液のみ（試料５）では、蛍光強度の増加はほとんど観察されなかった。また、ＩＣＡ反応液及びファージの混合溶液（試料６）においても、時間の経過とともに、蛍光強度の増加が観察されたが、試料１～４と比較すると増加の程度は緩やかであった。
　本発明によれば、構造体の外部及び内部に存在する標的分子を検出する技術を提供することができる。
　１００，２００…流体デバイス、１１０…基板、１２０…蓋部材、１２１…凸部、１２２…導入ポート、１２３…排出ポート、１３０…流路、１４０…ウェルアレイ、１４１…ウェル、１４２…微小区画、Ｌ１１０…試薬液、Ｌ１２０…封止液、１４２Ｒ…シグナルが検出されたウェル、２１０…壁部材、７００，７００’…構造体、７１０…表面標的分子、７２０…内部標的分子、８００…捕捉物、８１０…特異的結合物質。

Claims (17)

  1. 　複数のウェルを有するウェルアレイに、構造体が分散した液体を接触させ、前記ウェルに前記構造体を導入することと、
    　前記ウェルアレイに封止液を接触させ、前記構造体を前記ウェル内に封入することと、
    　前記ウェル内で前記構造体の内容物を抽出することと、
    　前記ウェル内で前記構造体の表面に存在していた少なくとも１種の表面標的分子を検出することと、
    　前記ウェル内で前記構造体の内部に存在していた少なくとも１種の内部標的分子を検出することと、
    　を含む、前記構造体の表面標的分子及び内部標的分子を検出する方法。
  2. 　前記構造体の内容物を抽出すること、前記表面標的分子を検出すること及び前記内部標的分子を検出することが、前記構造体を前記ウェル内に封入することの後に行われる、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記表面標的分子を検出すること及び前記内部標的分子を検出することが、前記構造体の内容物を抽出することの後に行われる、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記表面標的分子を検出すること及び前記内部標的分子を検出することが同時に行われる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記表面標的分子を検出すること及び前記内部標的分子を検出することが、同一条件下で行われる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記表面標的分子及び前記内部標的分子のそれぞれが、核酸、タンパク質、糖、糖タンパク質、脂質又はこれらの複合体からなる群より選択される少なくとも１種の分子である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記表面標的分子がタンパク質を含み、前記内部標的分子が核酸を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　前記内部標的分子を検出することが核酸検出手法により行われる、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　前記核酸検出手法が、Ｉｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙである、請求項８に記載の方法。
  10. 　前記表面標的分子を検出することにおいて検出するシグナルと前記内部標的分子を検出することにおいて検出するシグナルが互いに識別可能である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　前記構造体が、ウイルス、エクソソーム、細胞、小胞体からなる群より選択されるいずれか１つである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　前記構造体が捕捉物との複合体を形成しており、前記捕捉物は固相と前記構造体に対する特異的結合物質との結合体である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　前記特異的結合物質が抗体である、請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記構造体の内容物を抽出することは、界面活性剤を含む液体中で構造体を加熱することである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 　前記導入工程において、前記ウェル１つあたりに１つ以下の前記構造体が導入される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 　請求項１５に記載の方法により、前記ウェル毎に前記表面標的分子及び前記内部標的分子の有無を検出する工程と、
    　前記表面標的分子の検出結果及び前記内部標的分子の検出結果に基づいて前記構造体を評価する工程と、を含む、構造体の評価方法。
  17. 　複数のウェルを有するウェルアレイ、
    　構造体から内容物を抽出する試薬、
    　前記構造体の表面に存在する少なくとも１種の表面標的分子を検出する試薬、及び
    　前記構造体の内部に存在する少なくとも１種の内部標的分子を検出する試薬、
    　を含む、前記構造体の前記表面標的分子及び前記内部標的分子を検出するためのキット。
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