JP6583602B2 - 細胞内の核酸の解析方法ならびにそのためのシステムおよびキット - Google Patents
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Description
[2]前記マイクロチャンバーの底面が細胞接着性である、項1に記載の準備方法。
[3]前記封止液がミネラルオイルである、項1または2に記載の準備方法。
[4]前記核酸増幅反応試薬が、蛍光強度によって核酸の増幅を定量することのできるリアルタイムPCR法のためのものである、項1〜3のいずれか一項に記載の準備方法。
[5]項1〜4のいずれか一項に記載の核酸増幅準備方法が行われた流路デバイスを使用して、(4)前記核酸増幅反応試薬に対応した核酸増幅反応を行う工程を含むことを特徴とする、細胞分析方法。
[6]さらに、前記核酸増幅準備方法における工程(2)の前に、(1’)前記マイクロチャンバーに収容された細胞を染色し、その結果を取得する工程を含む、項5に記載の細胞分析方法。
[7]さらに、前記工程(1')で取得された結果と、前記工程(4)で取得された結果を対比する工程を含む、項6に記載の細胞分析方法。
[8]前記工程(1’)において細胞を染色するための蛍光と、前記工程(4)において核酸増幅を検出するための蛍光が異なる種類のものである、項6または7に記載の細胞分析方法。
本発明の核酸増幅準備方法は、細胞を収容し保持することができるマイクロチャンバーが表面に形成されたマイクロチャンバーチップと、その上部に天井を有する流路を形成するための天井形成部材を備えた流路デバイスを用いて、前記マイクロチャンバー内で細胞に含まれる核酸を増幅するための準備方法であって、下記工程(1)〜(3)を含む:
(1)前記マイクロチャンバーに細胞を収容し保持するよう、前記流路に細胞懸濁液を送液する工程(細胞懸濁液送液工程);
(2)前記流路に核酸増幅反応試薬を送液し、すくなくとも前記マイクロチャンバーを核酸増幅反応試薬で満たす工程(核酸増幅反応試薬送液工程);および
(3)前記流路に封止液を送液することにより、前記流路に残存した核酸増幅反応試薬を押し流すことで、前記マイクロチャンバーを満たす核酸増幅反応試薬が連通しないよう、当該流路を封止液で満たす工程(封止液送液工程)。
本発明における核酸増幅または分析の対象とする細胞(集団)は特に限定されるものではない。本発明では、特定の遺伝子を発現している細胞や、核酸、タンパク質、脂質、糖等の生体物質の発現レベルが通常より高いまたは低い細胞を、細胞集団中から検出すべき対象とすることができる。このような検出対象細胞は、自然界に存在する(天然に発生した)細胞であってもよいし、人為的処理が施された細胞であってもよい。自然界に存在する細胞としては、たとえば病原細胞、病変細胞、病原菌又は病原生物に感染された細胞、突然変異した細胞、特定の性質を有する未知の細胞、さらには特定の疾患のマーカーとなる細胞などを挙げることができる。一方、人為的処理が施された細胞としては、たとえば遺伝子工学的処理(例:遺伝子組み換え処理)、化学的処理(例:薬剤処理)、物理的処理(例:電磁波照射)等が施された細胞などを挙げることができる。
本発明における核酸は、細胞に含まれるものであって、適切な手段により増幅することができるものであれば特に限定されるものではなく、ゲノムDNA(染色体)、ミトコンドリアDNA(mtDNA)などのDNAであってもよいし、mRNA、tRNA、rRNA、miRNA、siRNAなどのRNAであってもよい。
ヒトまたはその他の動物から採取された検体に含まれる細胞を用いる場合、その検体を細胞懸濁液として流路デバイスの流路に送液し、細胞に含まれる核酸の増幅や必要に応じて行われる細胞染色のために必要な前処理を、送液の前または後の適切な段階で行うようにする。
マイクロチャンバー内で細胞に含まれる核酸を増幅させ、必要に応じて免疫染色した細胞を観察するためには、マイクロチャンバーに収容された細胞を逃さないよう、マイクロチャンバーの底面に細胞を「固相化する」ことが好ましい。細胞を固相化することにより、核酸の増幅および観察の対象とする細胞の位置を特定しやすくなり、稀少細胞等の目的細胞を効率的に検出することができ、さらに必要に応じて増幅された核酸を回収することも可能となる。
図1の(1)に示す細胞懸濁液送液工程では、流路1に細胞懸濁液を送液し、所定の時間静置してマイクロチャンバー5内に細胞を沈降させるようにして、マイクロチャンバー5に細胞を収容し保持する。細胞の回収効率を高めるために、送液の流量(流速)や向きに変化を付けてもよい。例えば、短時間送液した後、短時間静置するといったパターン(間欠送液)にしたり、流入口2から流出口3への順方向に送液した後、その逆方向送液するといったパターンにすることにより、マイクロチャンバーチップ1のマイクロチャンバー5以外の表面に残存したり、最後までマイクロチャンバー5内に回収されずに廃棄されたりする稀少細胞等の目的細胞を極力減らすことが可能になる。
図1の(2)に示す核酸増幅反応試薬送液工程では、流路1に核酸増幅反応試薬を送液し、マイクロチャンバー5を核酸増幅反応試薬で満たすようにする。核酸増幅反応試薬の送液量は、全てのマイクロチャンバー5の容積を考慮し、すくなくともそれを満たすのに十分な量となるよう適宜調節することができ、流路1を含めて核酸増幅反応試薬で満たすようにしてもよい。
図1の(3)に示す封止液送液工程では、流路1に封止液を送液することにより、流路1に残存した核酸増幅反応試薬を押し流すことで、マイクロチャンバー5を満たす核酸増幅反応試薬同士が連通しないよう、流路を封止液で満たすようにする。封止液の送液量は、全てのマイクロチャンバー5の上部の流路の容積を考慮し、それを満たすのに十分な量となるよう、特にマイクロチャンバー内の核酸増幅反応液同士を連通させないため、マイクロチャンバーチップのマイクロチャンバー以外の表面を封止液で被覆することができるよう、適宜調節することができる。
細胞懸濁液送液工程に先だって、マイクロチャンバーチップ11の表面(マイクロチャンバー5の内面を含む)の濡れ性を改善することなどを目的としたプレウェット液を送付する工程を設けてもよい。マイクロチャンバーチップ11がポリスチレンのような疎水性の材料から形成されている場合、流路1内に細胞懸濁液CLを導入しても、表面張力の関係で細胞懸濁液CLを全てのマイクロチャンバー5内に充填させることができず、複数のマイクロチャンバー5内に気泡が残存してしまう。そのような問題を抑制するため、細胞懸濁液CLをマイクロチャンバーチップ11の表面に展開する前に、予め表面張力の低い有機溶剤、例えばエタノールの水溶液をプレウェット液PLとして、流路1に導入しておくことにより、マイクロチャンバーチップ11の表面の濡れ性を向上させることができる。このようにプレウェット液PLで処理した後、PBS等の生理食塩水または純水を通液してプレウェット液PLを置換、洗浄してから、細胞懸濁液CLを通液するようにすれば、細胞懸濁液CLはほとんど全てのマイクロチャンバー5の内部に入り込み、細胞を効率的に回収することができるようになる。
本発明の細胞分析方法は、(1)細胞懸濁液送液工程、(2)核酸増幅反応試薬送液工程および(3)封止液送液工程を含む本発明の核酸増幅準備方法が行われた流路デバイスを使用して、(4)前記核酸増幅反応試薬に対応した核酸増幅反応を行う工程(核酸族副反応工程)を含む。また、核酸増幅反応としてTaqManプローブを用いて蛍光を測定するような定量的な核酸増幅反応を用いる場合は、その蛍光を測定する工程も含む。さらに、必要に応じて、(1’)前記マイクロチャンバーに収容された細胞を染色し、その結果を取得する工程(染色工程および観察工程)を含んでいてもよい。
図1の(4)に示す核酸増幅反応工程では、核酸増幅準備方法により、細胞を収容し、核酸増幅反応試薬で満たされ、封止液で封止されたマイクロチャンバー内で、その核酸増幅反応試薬に対応した核酸増幅反応を行い、細胞に含まれる核酸を増幅する。
図1の(1’)に示す染色工程では、蛍光標識抗体や核染色剤が溶解した水溶液である染色液を流路に送液し、所定の時間流路1を満たして、マイクロチャンバーに収容された細胞と染色液を接触させることにより、その細胞が有する抗原にその蛍光標識抗体を結合させるようにする。このような染色工程は、その染色の結果を取得するための観察工程(詳細は後述)とともに、核酸増幅反応工程の前に行うことが好ましい。
図1の(4)に示す、核酸増幅反応工程と同時またはその後に行われる測定工程は、核酸増幅反応工程において蛍光強度を核酸の増幅量の指標として用いる定量的な核酸増幅反応を用いた場合に行われる工程であって、その蛍光に対応した所定の励起光を照射しながら、各マイクロチャンバーから発せられる蛍光の強度を測定する。たとえば、光学系機構(PMT、PD等)をマイクロチャンバーの配置に沿って走査させながら位置(移動距離)ごとに、フィルターを通過した蛍光の強度を測定することが好ましい。測定対象とする蛍光に応じて、励起光の光源または励起フィルターと蛍光フィルターとを切り替えればよい。所定の塩基配列を有する核酸を含む細胞を収容しており、その核酸が増幅されたマイクロチャンバーの位置では、測定される蛍光強度が高くなる。また、測定工程では必要に応じて、マイクロチャンバーの位置を取得するための反射光、透過光、自家蛍光等を測定してもよい。
図1の(1’)に示す染色工程を行った場合で、細胞分析装置が蛍光顕微鏡に準じた光学系機構を備えている場合は、染色工程の後、核酸増幅反応液送液工程の前にさらに、蛍光顕微鏡で染色された細胞を観察したり、その染色画像を撮影したりする観察工程を行ってもよい。このような観察工程を通じて得られる染色画像からのデータと、定量的な核酸増幅反応を通じて得られる蛍光量のデータを対比することにより、ある特徴を有する細胞の中に特定の遺伝子を有する細胞が含まれているかどうかなど、細胞に関する目的に応じた分析が行うことが可能となる。
洗浄工程は、細胞懸濁液、核酸増幅反応試薬、封止液、および必要に応じて用いられる染色液などを送液する工程の後、次の送液を行う前に設けられる工程である。洗浄液を送液して、流路1内に残存する前の工程で送液された液体を洗い流すことにより、後の工程に対する悪影響を排除することができる。洗浄液は、細胞懸濁液等の溶媒として用いられているものと同じPBS等だけであってもよいし、そのPBS等の溶媒に必要に応じて界面活性剤を添加したものであってもよい。洗浄液は、必要に応じて複数回、送液および回収を繰り返してもよい。
免疫染色の対象とする抗原は特に限定されるものではないが、CTC等の稀少細胞やその他の特徴的な細胞を検出する場合には、そのような細胞と他の細胞と区別するために利用されているマーカー分子を免疫染色の対象に含めることが好適である。マーカー分子には、細胞表面に発現するタンパク質と、細胞内部(細胞質)に発現するタンパク質があるが、本発明ではどちらを対象としてもよい。細胞表面に発現するタンパク質としては、例えば、白血球で陽性となりMCF−7(乳癌細胞)等のCTCで陰性となるCD45、白血球で陽性となりMCF−7等の上皮細胞としての性質を有するCTCで陽性となるEpCAM(Epithelial cell adhesion molecule:上皮細胞接着分子)などが挙げられる。細胞内部に発現するタンパク質としては、例えば、MCF−7等のCTCで陽性となり白血球では陰性となるサイトケラチンが挙げられる。これらの例示した抗原を対象として免疫染色を行った場合に、CD45が陰性で、サイトケラチンが陽性の細胞が検出されれば、その細胞はMCF−7であると判定することができる。
免疫染色のための蛍光物質は特に限定されるものではないが、例えば公知の様々な蛍光色素(分子)を用いることが好適である。免疫染色のための蛍光物質同士の励起光波長および蛍光波長ならびに次に述べる核染色の蛍光波長の関係性を考慮し、適切な複数枚のカットフィルターを用いることでそれぞれの蛍光をうまく測定できるよう、適切な励起光波長および蛍光波長を有する蛍光物質を選択して用いればよい。
図2[A]および[B]に、本発明の細胞分析システムの実施形態の例を表す模式図を示す。
細胞分析装置100は、流路デバイス10の流路1に各種の液体を送液するための送液系機構110、流路デバイス10のマイクロチャンバー5内に回収され蛍光染色された細胞や、その細胞に含まれる核酸を増幅させた反応生成物を観察するための光学系機構120、流路デバイス10を保持する流路デバイスホルダー160、試薬収容器を保持する試薬収容器ホルダー170、ならびに細胞分析装置100が備える各種の機器類を制御するための制御手段190を備える。送液系機構110および光学系機構120は、任意の位置で液の吸引・吐出および細胞観察を可能にするための、空間的な移動手段を備えることが望ましい。
細胞分析装置100を用いて核酸増幅準備方法を実施した流路デバイス10を使用し、その流路デバイス10を流路デバイスホルダー160にセットしたまま、引き続き核酸増幅反応工程を行う場合、流路デバイスホルダー160は、核酸増幅反応を進行させるために、細胞が収容された各マイクロチャンバーチップの温度を調節するための手段を備えることが好ましい。そのようなマイクロチャンバー温度調節手段は、例えば、ペルチェ素子のような加温と冷却を行う温度調節素子(図示せず)および温度検出素子(図示せず)とを備え、これらは流路デバイスホルダーのマイクロチャンバーチップと接触する部位に設けることができる。そして制御手段190が、温度検出素子が測定したマイクロチャンバーチップの温度を参照しながら、温度調節素子による加温又は冷却によって、マイクロチャンバーチップが所定のタイミングで所定の温度となるように温度制御を実行する。
送液系機構110は、制御手段190の制御により、試薬収容器20に収容されている細胞懸濁液CL、核酸増幅反応試薬RL、封止液SL、必要に応じて用いられる染色液DL、洗浄液WL、プレウェット液PL、その他の試薬類の吸引および吐出を行い、それらの液を流路1に送液するための機構である。
光学系機構120は、例えば、光源としてのレーザーダイオード(LD)、集光レンズ、ピンホール部材、ダイクロックミラー、蛍光フィルター、光電子増倍管(PMT)などによって構築することができる。LDは、観察の対象とする蛍光物質の励起波長に対応したものとし、必要であれば複数用意してダイクロックミラーで適切なものが照射されるようにしてもよい。蛍光フィルターは、蛍光標識抗体に用いられている蛍光物質の蛍光波長に対応したものとし、必要であれば複数枚用意してフィルター切り替え器で交換しながら用いるようにしてもよい。
制御手段190としては、細胞分析装置100の各種の機器類に接続され、それらの機器類の制御プログラムを実行可能なパーソナルコンピュータを用いることができる。制御プログラムは、パーソナルコンピュータが内蔵する記憶媒体に記憶されていてもよいし、ネットワークまたは取り外し可能な記憶媒体を介してパーソナルコンピュータが利用できる状態に置かれていてもよい。
流路デバイス10は、マイクロチャンバーチップ11および流路形成部材12によって構築されており、これらによって閉鎖されている空間が、細胞懸濁液等の液体を送液して満たすことのできる流路1となっている。マイクロチャンバーチップ11と流路形成部材12とは、観察やメンテナンスのしやすさの観点から、係合、ねじ固定、粘着等の手段で取り付け・取り外しが可能なようになっていてもよい。
試薬収容器20には、細胞懸濁液、核酸増幅反応試薬、封止液、また必要に応じて用いられる染色液(蛍光標識抗体溶液、核染色剤溶液等)、洗浄液など、核酸の増幅や細胞の分析を行う上で流路1に送液する必要のある各種の液体が収容されている。例えば、封止液、洗浄液など比較的保存性の高い液体は、密封された状態であらかじめ試薬収容器20の所定の部位に収容しておくことが可能であり、細胞懸濁液、核酸反応増幅試薬、染色液など核酸の増幅や細胞の分析を行う直前に調製する必要のある液体は、調製後に試薬収容器20の所定の部位に添加して収容させることができるようにする。洗浄液などのように複数回使用される溶液は、各工程に対応した容量の溶液を別個の部位に収容しておいてもよいし、各工程で同一の組成の溶液を繰り返し使用する場合はそれらの合計の用量の液体を1つの部位に収容しておいてもよい。また、試薬収容器20には必要に応じて、送液後に吸引して流路1から排出させた廃液を貯留する部位を設けておくようにする。
細胞懸濁液は、例えば、稀少細胞またはその他の目的細胞を含んでいる可能性がある、血液、尿、リンパ液、組織液、体腔液等の検体、あるいはそれらの検体から得られた細胞画分や精製物などの前処理物を、PBS等の適切な溶媒で希釈することにより調製することができる。また、細胞懸濁液は、試験、研究等のために培養した、稀少細胞またはその他の目的細胞の細胞株、あるいは目的細胞を含む細胞集団を、PBS等に分散させて調製したものであってもよい。患者の血中細胞モデルとして、健常者から採取された血中細胞の懸濁液にCTC等の稀少細胞の細胞株を添加したものを、細胞懸濁液として用いてもよい。
(流路デバイスの作製)
直径100μm、深さ50μmのマイクロチャンバーを20000個を形成したマイクロチャンバーチップ(基板)を作製し、出入口を有する高さ0.1mm、幅15mmの流路を形成できる流路形成部材を組み合わせて流路デバイスとした。一方の出入口をシリンジポンプに連結し、もう一方に試薬を添加するためのリザーバーを形成した。
プレウェット液として30%エタノール水溶液を調製し、シリンジポンプによる吸引で、リザーバー側から1000μL、0.1mL/minの流量で、流路内に導入した。続いて、PBSにて105個/mLのMB231細胞懸濁液を調製し、シリンジポンプによる吸引で、リザーバー側から100μL、0.1mL/minの流量で流路内に導入して、マイクロチャンバー内に細胞を収容した。その後、マイクロチャンバーが形成されている領域全体を顕微鏡で撮影し、各マイクロチャンバー内の細胞の有無を観測した。
核酸増幅反応試薬として、ヒトGAPDH遺伝子を増幅対象とするリアルタイムPCR用の反応試薬(TaqMan、Life technologies社)を200μL調製した(ANTICANCER RESEARCH 28: 921-926 (2008)参照)。プライマー(forward およびreverse)、プローブの塩基配列は下記の通りである。
forwardプライマー: 5' CCCCACACACATGCACTTACG 3'
reverseプライマー: 5' CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT 3'
プローブ: 5' (MGB) (minor groove GTG AAC GTG GAT GAA GTTGG (VIC) 3'
上記反応試薬200μLを、シリンジポンプによる吸引で、リザーバー側から0.1mL/minの流量で流路内に導入した。
ミネラルオイル(MP Biomedicals, Inc. 194836)200μLを、シリンジポンプによる吸引で、リザーバー側から0.1mL/minの流量で流路内に導入した。
マイクロチャンバー内に細胞および核酸増幅反応試薬が格納され、ミネラルオイルで封止された流路デバイスに対して、95℃で15秒、60℃で1分間の熱反応サイクルを40サイクル行った。その後、全てのマイクロチャンバーに対してVICの蛍光強度を測定した。その結果、細胞が存在していたマイクロチャンバーのうち90%以上でVICによる蛍光を認めた。また、細胞が存在しないマイクロチャンバーではVICによる蛍光は認められなかった。
上記実施例1における核酸増幅反応試薬送液工程の前に、下記の染色工程および観察工程を追加して行った。
PE標識抗サイトケラチン抗体(日本BD社)100μLおよびAPC標識抗CD45抗体(ベックマンコールター社)20μLを、1%のTween20を含有するPBS100μLと混合し、その混合液全200μLを、シリンジポンプによる吸引で、リザーバー側から流路内に導入した。
30分間静置後、PBSを200μL、シリンジポンプによる吸引で、リザーバー側から流路内に導入した。その後、マイクロチャンバーが形成されている領域全体を顕微鏡で撮影し、各マイクロチャンバーのPEおよびAPCによる蛍光強度を測定した。
MB231癌細胞はEGFRのT790M変異を有さず、H1975癌細胞はEGFR遺伝子のT790M変異を有することが知られている。
2 流入口
3 流出口
4 リザーバー
5 マイクロチャンバー
5a 細胞接着性の底面
10 流路デバイス
11 マイクロチャンバーチップ
12 流路形成部材
12a 枠部材
12b 天板部材
20 試薬収容器
50 細胞
50a 検出対象細胞
50’ 溶解した細胞
CL 細胞懸濁液
DL 染色液
RL 核酸増幅反応試薬
RL’ 蛍光発色した核酸増幅反応試薬(核酸増幅産物溶液)
SL 封止液
100 細胞分析装置
110 送液系機構
110a チップ
111 供給手段
112 送液手段
112a チップ
120 光学系機構
160 流路デバイスホルダー
170 試薬収容器ホルダー
190 制御手段
200 細胞分析システム
配列番号2:ヒトGAPDH遺伝子のリアルタイムPCRのためのリバースプライマー(実施例1参照)
配列番号3:ヒトGAPDH遺伝子のリアルタイムPCRのためのプローブ(実施例1参照)
Claims (3)
- 細胞を収容し保持することができるマイクロチャンバーが表面に形成されたマイクロチャンバーチップと、その上部に天井を有する流路を形成するための天井形成部材を備えた流路デバイスを用いて、
(1)前記マイクロチャンバーに細胞を収容するよう、前記流路に細胞懸濁液を送液する工程、
(1’)前記マイクロチャンバーに収容された細胞中の目的細胞を、該目的細胞が有する抗原と結合する蛍光標識抗体で染色し、その蛍光強度を取得する工程、
(2)前記流路に核酸増幅反応試薬を送液し、すくなくとも前記マイクロチャンバーを核酸増幅反応試薬で満たす工程、
(3)前記流路に封止液を送液することにより、前記流路に残存した核酸増幅反応試薬を押し流すことで、前記マイクロチャンバーを満たす核酸増幅反応試薬同士が連通しないよう、当該流路を封止液で満たす工程、
(4)前記核酸増幅反応試薬に対応した核酸増幅反応を行い、該核酸の蛍光強度を取得する工程、および
(5)前記工程(1’)で取得された蛍光強度と、前記工程(4)で取得された蛍光強度を対比し、前記細胞の遺伝子変異情報を取得する工程を含み、
前記封止液の比重が前記核酸増幅反応試薬の比重よりも小さく、
前記マイクロチャンバーが逆円錐台形であり、該逆円錐台形の底面の直径が20μm〜500μmであり、深さが20〜500μmであり、
前記マイクロチャンバーの底面が細胞接着性を有し、
前記マイクロチャンバーチップと前記天井形成部材の間隔が50μm〜500μmであり、
前記工程(1’)において目的細胞を染色するための蛍光と、前記工程(4)において核酸増幅を検出するための蛍光が異なる種類のものであること、
を特徴とする細胞分析方法。 - 前記封止液がミネラルオイルである、請求項1に記載の細胞分析方法。
- 前記核酸増幅反応試薬が、蛍光強度によって核酸の増幅を定量することのできるリアルタイムPCR法のためのものである、請求項1または2に記載の細胞分析方法。
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