JPWO2014097991A1 - 希少細胞検出装置、希少細胞検出方法、希少細胞観察システム、および細胞展開用デバイス - Google Patents
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Abstract
Description
ここで、特許文献1では、スライド上にレチクルマークを形成することにより、他の装置への物理的な移動があったとしてもスライドの位置を補正できるようにしている。
複数のチャンバーが形成された細胞展開用デバイスにおける各チャンバーに収容された複数の細胞の中から、目的とする希少細胞を蛍光標識に基いて検出する希少細胞検出装置であって、
複数の細胞が収容された前記細胞展開用デバイスに励起光を照射する光源と、
前記光源から前記細胞展開用デバイスに照射された励起光により発光する、希少細胞を標識した蛍光体からの蛍光を光学的に検出する希少細胞検出部と、
前記光源から前記細胞展開用デバイスに照射された励起光に基く検出光を光学的に検出するチャンバー検出部と、
前記希少細胞検出部で得られた希少細胞の蛍光シグナルに基いて希少細胞の位置情報を得るとともに、前記チャンバー検出部で得られたチャンバーの検出光シグナルに基いてチャンバーの位置情報を得、これら希少細胞の位置情報とチャンバーの位置情報とに基いて希少細胞が前記細胞展開用デバイスのどのチャンバー内に収容されているかを特定する希少細胞位置特定取得部と、を備えている。
複数のチャンバーが形成された細胞展開用デバイスにおける各チャンバーに収容された複数の細胞の中から、目的とする希少細胞を蛍光標識に基いて検出する希少細胞検出方法であって、
前記細胞展開用デバイスの各チャンバーに、希少細胞を含む細胞懸濁液を展開する懸濁液展開工程と、
前記細胞懸濁液が展開された前記細胞展開用デバイスに対して励起光を相対的に走査することにより、希少細胞の存在を光学的に検出する希少細胞検出工程と、
前記細胞懸濁液が展開された前記細胞展開用デバイスに対して励起光を相対的に走査することにより、チャンバーを光学的に検出するチャンバー検出工程と、
前記希少細胞検出工程で得られた希少細胞の蛍光シグナルに基いて希少細胞の位置情報を得るとともに、前記チャンバー検出工程で得られたチャンバーの検出光シグナルとに基いてチャンバーの位置情報を得、これら希少細胞の位置情報とチャンバーの位置情報とに基いて希少細胞が前記細胞展開用デバイスのどのチャンバー内に収容されているかを特定する希少細胞位置特定取得工程とを備えている。
上記いずれかに記載の希少細胞検出装置と、前記細胞展開用デバイスが装着されて希少細胞を観察する観察装置とを備え、
前記希少細胞検出装置で検出された希少細胞を前記観察装置で観察するにあたり、前記希少細胞検出装置で検出された希少細胞がどのチャンバー内に収容されているのかの情報に基いて希少細胞が収容されているチャンバーを特定し、特定したチャンバー内の希少細胞を観察可能としている。
先ず、本発明の概要について説明する。
すなわち、複数のチャンバーを有する細胞展開用デバイスに希少細胞を含む細胞懸濁液を展開する懸濁液展開工程100と、希少細胞の存在を光学的に検出する希少細胞検出工程200Aと、細胞懸濁液が収容されたチャンバーそのものを光学的に検出するチャンバー検出工程200Bと、希少細胞がどのチャンバー内に収容されているかを特定する希少細胞位置特定取得工程300とを有するものである。なお、希少細胞検出工程200Aとチャンバー検出工程200Bとは、別々の走査により行うこともできるが同時の走査により行うことが好ましい。
このような希少細胞検出方法であれば、希少細胞がどのチャンバー内に収容されているかを特定することできる。
このような希少細胞検出方法であれば、希少細胞の検出と希少細胞の検出を同時に行うことから作業性が良好である。
また、前記励起光の照射サイズは、前記チャンバーの上部開口の面積以下であることが好ましい。
このように励起光の照射サイズが設定されていれば、目的細胞の検出とチャンバーの検出に有効であり、精度良い情報を得ることができる。
このような希少細胞観察システムによれば、希少細胞の再度の検出作業を行う必要がなく、一旦、希少細胞の検出が行われたスライドを他の装置に移送してその希少細胞の観察を行った場合に、速やかにその作業を行うことができる。これにより、直ちに希少細胞の観察や確認作業などを効率的に行うことができる。
図1は、本発明の一実施例に係る細胞展開用デバイスの断面を示したものである。
この細胞展開用デバイス10は、後述する希少細胞検出装置に着脱自在に装着され、この細胞展開用デバイス10を介して希少細胞の検出が行われる。また、細胞展開用デバイス10は、希少細胞の検出作業が行われた後には、必要に応じて顕微鏡などの他の装置に移送されて、希少細胞の観察や確認などが行われる。
チャンバー6の深さは、チャンバー6の内径Bによって変動させることが好ましく、格納したい細胞数などに応じて、適宜決定することができる。具体的には、細胞を10〜15個程度格納できるようにチャンバーの深さを適宜決定することが好ましく、典型的には、チャンバー6の深さは、20μm〜500μmである。
また、流路5の高さ7は、50μm〜500μmであることが好ましい。
なお、本実施例では、細胞懸濁液中の目的とする希少細胞(図3Aにおける符号24)、例えば、特定の癌細胞は流路5を介してチャンバー6内に格納され、保持された後、特定の癌細胞のみを染色することが可能な蛍光体を含む染色液により標識される。これにより、染色された希少細胞24が、光学的手段により検出できるようにされている。
励起光25の照射サイズ(ここで、励起光の照射サイズとは、励起光の広がりを示す互いに直角な二方向の寸法、あるいは細胞展開デバイスに励起光が照射された際の照射面積をいう)は、チャンバー6内に収容された少なくとも1つの細胞の細胞サイズを包含できるように、細胞と同じ大きさ以上の照射サイズを有することが好ましい。これにより検出のための十分な光量を得ることができる。
また、励起光25の照射サイズ(面積)は、チャンバー6の上部開口の面積以下であることが好ましい。励起光25の具体的な面積としては、78μm2〜2.0×105μm2程度である。円形、楕円、長方形などからなる励起光25が、このような面積であれば、励起光25が複数のチャンバーに跨って同時に照射されることを容易に低減可能となる。また、このような面積に励起光の照射サイズが設定されていれば、目的細胞の検出とチャンバーの検出に有効であり、精度良い情報を得ることができる。
さらに、チャンバー6の上部開口の内径は、20μm〜500μmであることが好ましい。
チャンバー6の上部開口の内径がこのような範囲に設定されていれば、チャンバー内に好適に細胞を収容、保持することができる。
このような希少細胞検出装置32において、希少細胞24の検出には、希少細胞24を標識した蛍光体からの蛍光54を希少細胞検出部27で受光することによって行われる。
1)光源26から細胞展開用デバイス10に照射され、その細胞展開用デバイス10を透過した励起光25の透過光30(図4)、
2)光源26から細胞展開用デバイス10に照射され、その細胞展開用デバイス10で反射した励起光25の反射光61(図6A、図6B)、
3)光源74から細胞展開用デバイス10に照射され、その照射された励起光77に基いて細胞展開用デバイス10の素材が発光する、素材の自家蛍光63(図7)、
のいずれかを用いて検出することができる。
これらいずれかの検出光を用いることによりチャンバー6の位置を容易に検出することができる。
上記のような光学要素を備えた希少細胞検出装置32を用いて、図3Aに示した細胞展開用デバイス10に対し、レチクルマークR側の端部から矢印Zで示したように順番に走査していくことにより、希少細胞24の存在するチャンバー6’では、励起光25により希少細胞24を標識した蛍光体が発光し、その特定波長を有する蛍光54をダイクロックミラー29を通過させて希少細胞検出部27によって検出することで、蛍光シグナルを光学的に検出することができる。
そして、希少細胞24の位置情報とチャンバー6の位置情報とに基いて、希少細胞24がどのチャンバー内に収容されているかを、コンピューター56の希少細胞位置特定取得部56aにより特定することができる。そして、これらの情報はコンピューター56内の記録媒体56bに保存される。
図5のグラフから明らかなように、実線で示した蛍光シグナルのピークとなる位置が希少細胞24の検出を示しており、点線で示した検出光シグナルの低い所が、チャンバー6の検出を示している。
さらに、この希少細胞検出装置58では、図4に示した希少細胞検出装置32の場合と同様に、希少細胞24の位置情報とチャンバー6の位置情報とに基いて、希少細胞24がどのチャンバー6内に収容されているかを、コンピューター56の希少細胞位置特定部56aにより特定し、記録媒体56bに保存している。したがって、一旦希少細胞24の検出が行われた細胞展開用デバイス10を、他の装置に移送したとしても、その情報を記録媒体56bから呼び出すことができる。
この希少細胞検出装置59では、希少細胞検出部27に代わる一つの検出部270により、希少細胞24を標識した蛍光体の蛍光54を検出するとともにチャンバー6からの反射光61を検出することができる。
図7は、本発明のさらに他の実施例に係る希少細胞検出装置70を示したもので、この実施例では、チャンバー6を検出するための検出光として、第2の光源74からの励起光77に基いて細胞展開用デバイス10の素材が発光する、素材の自家蛍光63を採用している。
そして、細胞展開用デバイス10の素材が発光した自家蛍光63の波長は、希少細胞24を蛍光標識した蛍光体が発光する蛍光54の蛍光波長とは異なる波長となるようにする。
図8において、実線は反射光61による検出光シグナルを示し、点線は蛍光54による蛍光シグナルを示している。
1)透過光30、
2)反射光61、
3)自家蛍光63、
のいずれを用いた希少細胞検出装置32、58、59、70であっても、希少細胞24がどのチャンバー内に位置するかを検出することができる。
このように、細胞展開用デバイス10が希少細胞検出装置とは異なる他の観察装置に移送されたとしても、一旦、希少細胞検出装置で検出された希少細胞24を、速やかに観察することができる。
特に、希少細胞検出装置および観察装置に係わる光学要素は様々な態様をとることができる。
また、希少細胞24を標識した蛍光体の蛍光波長は、自家蛍光の影響を避けるために、励起光25の波長よりも、長波長側を採用することが好ましい。
がん患者から採血された末梢血を用いた細胞懸濁液を用意し、末梢血中の種々の細胞の検出、特には血液循環がん細胞(CTC)の検出を行った。
細胞懸濁液は、末梢血そのものでも良いし、末梢血を適切な緩衝液、例えばリン酸緩衝食塩水(PBS)等で希釈したものでも良いが、ここでは末梢血をリン酸緩衝食塩水(PBS)で希釈した細胞懸濁液を用いた。
上記予め蛍光標識された細胞懸濁液の調整方法は以下の通りである。
まず細胞懸濁液1mlに、パラホルムアルデヒド(和光純薬社製)を4%になるように加えて、緩やかに混和し、室温暗所にて15分間反応させた。ここに、リン酸緩衝食塩水(PBS)を充分量加えて混和し、遠心分離にて洗浄を行い、次に細胞膜透過処理用として0.1%Tweenを含むリン酸緩衝食塩水(PBS)を1ml、および血液循環がん細胞(CTC)標識用にAlexa Fluor647で標識した抗CK抗体(Micromet社製)溶液10μlおよび白血球標識用にAlexa Fluor488(インビトロジェン社製)で標識した抗CD45抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)溶液10μlを添加し、緩やかに混和しながら、室温暗所にて30分反応させ、最後の5分間、細胞核染色用にDAPI(同仁化学社製)溶液10μlを添加して反応させた。
この後、遠心分離により細胞に結合していない抗体試薬を除去し、新たにリン酸緩衝食塩水(PBS)を添加して再懸濁させ、これを本実施例で用いる細胞懸濁液とした。
細胞展開用デバイス10(チャンバー深さ50μm, チャンバー径100μφ)に流路5(幅5mm)と流路形成部材(流路高さ500μm)2を具備させ、ブロッキング液(3%BSA含有PBS)を高流速(16mLmin)で送液した。その後、PBSにてブロッキング剤を流路5内から除去し、細胞懸濁液を同流速にて流路5内へ導入後、間欠的な送液(10μL送液後10秒停止)を繰り返すことで、チャンバー6内に細胞を回収した。
細胞を収容した細胞展開用デバイス10に、血液循環がん細胞(CTC)標識用に標識したAlexa647を励起するHe-Neレーザー(波長633nm)を照射し、Alexa647の蛍光シグナルを希少細胞検出部27(PMT)にて測定し、同光源26にて照射されたチャンバーの反射光61をチャンバー検出部28(PD)にて測定をしたところ、位置情報は自動ステージのパルス信号から取得し、血液循環がん細胞(CTC)のシグナルと併せてチャンバーの検出光シグナル(反射光)が検出された。
細胞を収容した細胞展開用デバイス10に、血液循環がん細胞(CTC)標識用に標識したAlexa647を励起するHe-Neレーザー(波長633nm)を光源26から照射し、Alexa647の蛍光シグナルを希少細胞検出部27としてのPMT(光電子倍増管)にて測定した。さらに、照射光を405 nmで細胞展開用デバイスの自家蛍光をチャンバー検出部28としてのPD(フォトダイオード)にて測定をしたところ、血液循環がん細胞(CTC)のシグナルと併せてチャンバー6の検出光シグナル(自家蛍光)が検出された。
2 流路形成枠体
3 入口部
4 出口部
5 流路
6、6’ チャンバー
7 高さ
10 細胞展開用デバイス
24 希少細胞
25 励起光
26 光源(第1の光源)
27 希少細胞検出部
28 チャンバー検出部
30 透過光
32 希少細胞検出装置
54 蛍光
56 コンピューター
56a 希少細胞位置特定取得部
56b 記録媒体
58 希少細胞検出装置
59 希少細胞検出装置
61 反射光
63 自家蛍光
70 希少細胞検出装置
74 光源(第2の光源)
76 観察部
77 励起光
80 希少細胞検出装置
100 懸濁液展開工程
200A 希少細胞検出工程
200B チャンバー検出工程
300 希少細胞位置特定取得工程
270 検出部
480 フィルタ切り替え部
R レチクルマーク
Claims (11)
- 複数のチャンバーが形成された細胞展開用デバイスにおける各チャンバーに収容された複数の細胞の中から、目的とする希少細胞を蛍光標識に基いて検出する希少細胞検出装置であって、
複数の細胞が収容された前記細胞展開用デバイスに励起光を照射する光源と、
前記光源から前記細胞展開用デバイスに照射された励起光により発光する、希少細胞を標識した蛍光体からの蛍光を光学的に検出する希少細胞検出部と、
前記光源から前記細胞展開用デバイスに照射された励起光に基く検出光を光学的に検出するチャンバー検出部と、
前記希少細胞検出部で得られた希少細胞の蛍光シグナルに基いて希少細胞の位置情報を得るとともに、前記チャンバー検出部で得られたチャンバーの検出光シグナルに基いてチャンバーの位置情報を得、これら希少細胞の位置情報とチャンバーの位置情報とに基いて希少細胞が前記細胞展開用デバイスのどのチャンバー内に収容されているかを特定する希少細胞位置特定取得部と、を備えた、希少細胞検出装置。 - 前記チャンバー検出部では、下記1)〜3)のいずれかの検出光により、チャンバーの位置が検出される、請求項1に記載の希少細胞検出装置;
1)前記光源から前記細胞展開用デバイスに照射され、その細胞展開用デバイスを透過した前記励起光の透過光、
2)前記光源から前記細胞展開用デバイスに照射され、その細胞展開用デバイスで反射した前記励起光の反射光、
3)前記光源から前記細胞展開用デバイスに照射され、その照射された前記励起光に基いて前記細胞展開用デバイスの素材が発光する、素材の自家蛍光。 - 前記励起光は、前記細胞と同じ大きさ以上の照射サイズを有し、前記細胞展開用デバイスに対して相対的に走査されるものであって、前記照射サイズの走査方向における長さは前記走査方向に隣接するチャンバー間の中心間の距離以下、かつ、前記照射サイズの前記走査方向に垂直な方向における長さは前記垂直な方向に隣接するチャンバー間の中心間の距離以下である、請求項1または請求項2に記載の希少細胞検出装置。
- 前記励起光の照射サイズは、チャンバーの上部開口の面積以下である、請求項1ないし請求項3のいずれかに記載の希少細胞検出装置。
- 前記チャンバーの上部開口の内径は、20μm〜500μmである、請求項1ないし請求項4のいずれかに記載の希少細胞検出装置。
- 複数のチャンバーが形成された細胞展開用デバイスにおける各チャンバーに収容された複数の細胞の中から、目的とする希少細胞を蛍光標識に基いて検出する希少細胞検出方法であって、
前記細胞展開用デバイスの各チャンバーに、希少細胞を含む細胞懸濁液を展開する懸濁液展開工程と、
前記細胞懸濁液が展開された前記細胞展開用デバイスに対して励起光を相対的に走査することにより、希少細胞の存在を光学的に検出する希少細胞検出工程と、
前記細胞懸濁液が展開された前記細胞展開用デバイスに対して励起光を相対的に走査することにより、チャンバーを光学的に検出するチャンバー検出工程と、
前記希少細胞検出工程で得られた希少細胞の蛍光シグナルに基いて希少細胞の位置情報を得るとともに、前記チャンバー検出工程で得られたチャンバーの検出光シグナルに基いてチャンバーの位置情報を得、これら希少細胞の位置情報とチャンバーの位置情報とに基いて希少細胞が前記細胞展開用デバイスのどのチャンバー内に収容されているかを特定する希少細胞位置特定取得工程とを備えた、希少細胞検出方法。 - 前記希少細胞検出工程と、前記チャンバー検出工程とが同時の走査により実施される、請求項6に記載の希少細胞検出方法。
- 前記励起光は、前記細胞と同じ大きさ以上の照射サイズであって、前記照射サイズの走査方向における長さは前記走査方向に隣接するチャンバー間の中心間の距離以下、かつ、前記照射サイズの前記走査方向に垂直な方向における長さは前記垂直な方向に隣接するチャンバー間の中心間の距離以下である、請求項6または請求項7に記載の希少細胞検出方法。
- 前記励起光の照射サイズは、チャンバーの上部開口の面積以下である、請求項6ないし請求項8のいずれかに記載の希少細胞検出方法。
- 請求項1〜請求項5のいずれかに記載の希少細胞検出装置と、前記細胞展開用デバイスが装着されて希少細胞を観察する観察装置とを備え、
前記希少細胞検出装置で検出された希少細胞を前記観察装置で観察するにあたり、前記希少細胞検出装置で検出された希少細胞がどのチャンバー内に収容されているのかの情報に基いて希少細胞が収容されたチャンバーを特定し、特定したチャンバー内の希少細胞を観察可能とした、希少細胞観察システム。 - デバイス本体に複数のチャンバーが形成されているとともに、前記デバイス本体の一部にレチクルマークが形成されている、細胞展開用デバイス。
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