WO2015093420A1 - 細胞検出方法および細胞検出装置 - Google Patents

細胞検出方法および細胞検出装置 Download PDF

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WO2015093420A1
WO2015093420A1 PCT/JP2014/083068 JP2014083068W WO2015093420A1 WO 2015093420 A1 WO2015093420 A1 WO 2015093420A1 JP 2014083068 W JP2014083068 W JP 2014083068W WO 2015093420 A1 WO2015093420 A1 WO 2015093420A1
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WO
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cell
detection
fluorescence
detection region
cells
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Application number
PCT/JP2014/083068
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English (en)
French (fr)
Inventor
久美子 星
祥一 田尾
Original Assignee
コニカミノルタ株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging

Definitions

  • the present invention relates to a cell detection method and a cell detection apparatus for performing this cell detection method.
  • Circulating tumor cells CTC
  • CEC Circulating tumor cells
  • CEP circulating vascular endothelial progenitor cells
  • target cells various stem cells
  • CTC Circulating tumor cells
  • CEC Circulating tumor cells
  • CEC circulating vascular endothelial cells
  • CEP circulating vascular endothelial progenitor cells
  • IR cells various stem cells
  • various cell separation techniques have been applied to detect rare cells, and various detection devices have been commercialized. For example, when examining whether or not a target rare cell is present in a specimen such as blood containing non-target cells, the cell suspension derived from the specimen is deployed on the device, and then all the expanded cells are analyzed. It has been proposed to do.
  • rare cells are detected using a microscope.
  • a cell suspension is developed in a flat shape, and then all cells are observed with a microscope to detect rare cells.
  • Non-Patent Document 1 a method using a microarray scanner is disclosed (see Non-Patent Document 1).
  • a cell suspension is developed on a chip having a plurality of microchambers, cells are accommodated in the microchambers, and rare cells are labeled with a fluorescent substance.
  • a microarray scanner scan the irradiation spot of the same size as the cells, irradiate all the cells with excitation light, and detect the fluorescence emitted from the fluorescent material labeled with the rare cells. Detect cells.
  • rare cells can be detected with high sensitivity, but the detection time becomes long because the field of view is narrow.
  • the field of view is widened and the detection time can be shortened, but the detection sensitivity is lowered, and some rare cells may not be detected.
  • Non-Patent Document 1 In the method for detecting a rare cell described in Non-Patent Document 1, since the whole cell is analyzed by scanning an irradiation spot having the same size as the cell, the cell can be detected with high sensitivity. It will be long. In the method for detecting rare cells described in Non-Patent Document 1, when detecting multicolor (various) fluorescent substances, it is necessary to detect all cells other than rare cells (other than target cells). Therefore, in the rare cell detection method described in Non-Patent Document 1, it is possible to determine whether the cell is a rare cell, but the measurement time becomes long.
  • the conventional rare cell detection method could not satisfy all of accurate detection, high detection sensitivity, and reduction of detection time.
  • a cell detection method is labeled with a first fluorescent material for labeling target cells and a second fluorescent material for labeling non-target cells.
  • a method for detecting the target cell from the group of cells detected, wherein the cell group is irradiated with excitation light for exciting the first fluorescent substance to detect fluorescence, and the position of the cell from which fluorescence is detected A first step of acquiring information, and detecting fluorescence by irradiating the cells in which the fluorescence is detected with excitation light for exciting the second fluorescent material, and acquiring positional information of the cells in which the fluorescence is detected And a third step of determining whether the cell detected in the first step is the target cell based on the detection results of the first step and the second step.
  • the detection area is moved to the cell where the fluorescence is detected.
  • a cell detection device includes a first fluorescent material for labeling target cells and a second fluorescent material for detecting non-target cells.
  • a holder for holding a chip in which a labeled cell group is accommodated in a cell accommodating portion, excitation light for exciting the first fluorescent substance on the chip, and excitation for exciting the second fluorescent substance A light irradiating unit for separately irradiating light, a light detecting unit for detecting fluorescence from the first fluorescent material and fluorescence from the second fluorescent material by excitation light emitted from the light irradiating unit, and the light detection
  • a position information acquisition unit that acquires position information of a cell that emits fluorescence from the first fluorescent substance detected by the unit and a cell that emits fluorescence from the second fluorescent substance, and between the light irradiation unit and the holder, Or
  • a first detection region defining portion that is disposed between a light detector and the light detection portion and defines a first detection region for detecting fluorescence from
  • the present invention it is possible to accurately detect a target cell from a cell group in a short time without omission without imaging.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a cell detection device according to the first embodiment.
  • 2A and 2B are schematic diagrams for explaining the relationship between an irradiation spot and a detection region.
  • 3A and 3B are diagrams for explaining scanning and movement of the first irradiation spot.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining scanning and movement of the second irradiation spot.
  • 5A and 5B are diagrams showing the configuration of a cell deployment device.
  • 6A to 6C are diagrams showing the configuration of a cell deployment device.
  • 7A and 7B are diagrams showing another form of the cell accommodating portion.
  • 8A to 8E are diagrams for explaining the cell detection method according to Embodiment 1.
  • FIG. 9A and 9B are diagrams for explaining the cell detection method according to the second embodiment.
  • 10A and 10B are diagrams for explaining the cell detection method according to the second embodiment.
  • the cell detection apparatus includes a target cell (rare cell) labeled with a first fluorescent substance and a non-target cell labeled with a second fluorescent substance, which are accommodated in a cell accommodating part of a cell deployment device.
  • This is an apparatus for detecting target cells contained in a cell group by irradiating the cell group with excitation light and detecting fluorescence emitted from a detection region in the excitation light irradiation spot.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of the cell detection device 100.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the relationship between the irradiation spots S1, S2 and the detection areas A1, A2.
  • FIG. 2A is a schematic diagram showing the relationship between the first irradiation spot S1 and the first detection region A1
  • FIG. 2B is a schematic diagram showing the relationship between the second irradiation spot S2 and the second detection region A2. is there.
  • the cell detection device 100 includes a holder 110, a light irradiation unit 120, a light detection unit 130, a first detection region definition unit 141, and a second detection region definition unit 142.
  • Unit 140, moving unit 150, and control unit (position information acquisition unit) (not shown).
  • a cell deployment device 160 including a chip 161 is attached to the cell detection apparatus 100.
  • the holder 110 holds the cell deployment device 160 in a predetermined position.
  • the holder 110 is moved in the horizontal direction by the moving unit 150 while holding the cell expansion device 160.
  • the light irradiation unit 120 and the light detection unit 130 are disposed above the holder 110.
  • the light irradiation unit 120 irradiates the cell deployment device 160 (chip 161) held by the holder 110 with excitation light.
  • the light detection unit 130 detects fluorescence emitted from the cell deployment device 160 (chip 161).
  • the light irradiation unit 120 includes a first light irradiation device 121 and a second light irradiation device 122.
  • the first light irradiation device 121 irradiates excitation light for generating fluorescence from the first fluorescent material.
  • the second light irradiation device 122 irradiates excitation light for generating fluorescence from the second fluorescent material.
  • a light source for irradiating excitation light included in the first light irradiation device 121 and the second light irradiation device 122 is provided.
  • the type of the light source is not particularly limited, and may be appropriately selected according to the type of fluorescent material to be used.
  • the light source is, for example, a laser diode.
  • the light irradiation part 120 may have a filter that transmits a predetermined wavelength.
  • the wavelength of the excitation light is preferably a long wavelength from the viewpoint of eliminating the influence of autofluorescence of the cell deployment device 160.
  • the wavelength of the excitation light emitted from the first light irradiation device 121 is, for example, in the range of 600 to 780 nm. Further, the wavelength of the excitation light irradiated from the second light irradiation device 122 is in the range of 470 to 580 nm, for example.
  • the type of the light detection unit 130 is not particularly limited as long as weak fluorescence can be detected.
  • Examples of the light detection unit 130 include a photomultiplier tube (PMT) and a photodiode.
  • the light detection unit 130 is a photomultiplier tube.
  • the first lens 131, the first detection region defining unit 141, the first dichroic mirror 132, the second lens 133, and the second dichroic mirror 134 and the objective lens 135 are sequentially arranged from the first light irradiation device 121 side.
  • the excitation light emitted from the first light irradiation device 121 passes through the first lens 131, the first detection region defining unit 141, the first dichroic mirror 132, and the second lens 133, and then is expanded by the second dichroic mirror 134. Reflected toward the device 160 for use.
  • the excitation light reflected by the second dichroic mirror 134 is collected by the objective lens 135 near the bottom surface of the cell accommodating portion 165 of the cell deployment device 160 (chip 161).
  • the fourth lens 139, the second detection region defining part 142, the first dichroic mirror 132, the second lens 133, the second lens The dichroic mirror 134 and the objective lens 135 are sequentially arranged from the second light irradiation device 122 side.
  • the excitation light emitted from the second light irradiation device 122 passes through the fourth lens 139, the second detection region defining part 142, the first dichroic mirror 132, and the second lens 133, and then is expanded by the second dichroic mirror 134. Reflected toward the device 160 for use.
  • the excitation light reflected by the second dichroic mirror 134 is collected by the objective lens 135 near the bottom surface of the cell accommodating portion 165 of the cell deployment device 160 (chip 161).
  • an objective lens 135, a second dichroic mirror 134, a filter 136, a third lens 138, and a pinhole 137 are arranged on the side of the cell deployment device 160 on the fluorescence optical path from the cell deployment device 160 to the light detection unit 130.
  • the fluorescence emitted from the cell deployment device 160 passes through the objective lens 135, the second dichroic mirror 134, and the filter 136, and then passes through the pinhole 137 by the third lens 138 and is coupled to the light receiving surface of the light detection unit 130.
  • the filter 136 is, for example, an excitation light cut filter or a neutral density filter. The excitation light cut filter blocks excitation light and external light, and improves the S / N ratio.
  • the neutral density filter adjusts the fluorescence intensity according to the light detection unit 130.
  • the pinhole 137 blocks light other than fluorescence emitted from the focal point of the excitation light (near the bottom surface of the cell accommodating portion 165), and improves the S / N ratio.
  • the shape of the pinhole 137 is not particularly limited, and is, for example, a circle or a rectangle.
  • the size of the pinhole 137 is appropriately set according to the shape of the excitation light irradiation spot and the optical element to be used.
  • the first detection region defining unit 141 and the second detection region defining unit 142 are provided between the light irradiation unit 120 (first light irradiation device 121 and second light irradiation device 122) and the cell deployment device 160 (holder 110). Or it arrange
  • the “detection region” means a region where fluorescence is detected by the light detection unit 130.
  • the fluorescence to be detected is not emitted from the excitation light irradiation spots (the first irradiation spot S1 and the second irradiation spot S2), so that the detection area (the first detection area A1 and the second detection area A2) is a chip.
  • 161 is set within an irradiation spot of excitation light on 161.
  • the detection region may coincide with the irradiation spot of the excitation light, or may be a part of the irradiation spot.
  • the first detection region defining unit 141 is disposed between the first light irradiation device 121 and the cell deployment device 160 (holder 110), and the first detection region of the excitation light emitted from the first light irradiation device 121 is the first detection. It may be a stop (slit, aperture, etc.) that allows only light irradiating the area A1 to pass therethrough.
  • the first detection region defining unit 141 is disposed between the cell deployment device 160 (holder 110) and the light detection unit 130, and among the fluorescence emitted from the first irradiation spot S1 of the excitation light, the first detection region defining unit 141 is the first detection region defining unit 141.
  • a diaphragm (such as a slit or an aperture) that allows only the fluorescence emitted from the detection region A1 to pass therethrough may be used.
  • the first detection region defining part 141 is disposed between the first light irradiation device 121 and the cell deployment device 160 (holder 110).
  • the size of the first irradiation spot S1 of excitation light is not particularly limited as long as it is equal to or larger than the size of the first detection region A1.
  • the shape of the first irradiation spot S1 of excitation light is not particularly limited. Normally, the shape of the first irradiation spot S1 is circular, but the first detection region defining portion 141 is provided between the first light irradiation device 121 and the cell deployment device 160 (holder 110) as in the present embodiment. When arranged, the shape of the first irradiation spot S1 (first detection region A1) can take various shapes.
  • the length of the first detection region A1 in the direction (second direction D2) orthogonal to the scanning direction (first direction D1) is longer than the length of two cells in the cell group.
  • the detection time becomes long.
  • the length of the first detection region A1 in the scanning direction (first direction D1) is not particularly limited, and is, for example, the length of about one cell in the cell group.
  • Examples of the shape of the first detection area A1 include a circle, an ellipse, and a rectangle.
  • the shape of the first detection region A1 is preferably elliptical or rectangular from the viewpoint of increasing detection sensitivity.
  • the shape of the first detection area A1 is a rectangle of scanning direction: 5 to 25 ⁇ m ⁇ direction orthogonal to the scanning direction: 10 to 200 ⁇ m.
  • the second detection region defining unit 142 is disposed between the second light irradiation device 122 and the cell deployment device 160 (holder 110), and the second detection region defining unit 142 is a second detection component of the excitation light emitted from the second light irradiation device 122. It may be a stop (such as a slit or an aperture) that allows only the light irradiated to the area A2 to pass therethrough.
  • the second detection region defining unit 142 is disposed between the cell deployment device 160 (holder 110) and the light detection unit 130, and among the fluorescence emitted from the second irradiation spot S2 of the excitation light, the second detection region defining unit 142 A diaphragm (such as a slit or an aperture) that allows only fluorescence emitted from the detection region A2 to pass therethrough may be used.
  • the first detection region defining unit 141 is disposed between the second light irradiation device 122 and the cell deployment device 160 (holder 110).
  • the size of the second irradiation spot S2 of excitation light is not particularly limited as long as it is equal to or larger than the size of the second detection region A2. Further, the shape of the second irradiation spot S2 of excitation light is not particularly limited. Normally, the shape of the second irradiation spot S2 is circular, but the first detection region defining portion 141 is provided between the first light irradiation device 121 and the cell deployment device 160 (holder 110) as in the present embodiment. When arranged, the shape of the first irradiation spot S1 (first detection region A1) can take various shapes.
  • the size of the second detection area A2 is limited to a predetermined size.
  • the length of the second detection region A2 in the scanning direction (first direction D1) and the direction orthogonal to the scanning direction (second direction D2) is equal to or shorter than one cell of the cell group.
  • the lengths of the first direction D1 and the second direction D2 of the second detection region A2 are more than one cell of the cell group, the length from the plurality of cells labeled with the second fluorescent substance There is a risk of detecting fluorescence.
  • Examples of the shape of the second detection region A2 include a circle, an ellipse, and a rectangle. In the present embodiment, the shape of the second detection area A2 is a rectangle of scanning direction: 5 to 25 ⁇ m ⁇ direction orthogonal to the scanning direction: 5 to 25 ⁇ m.
  • the moving unit 150 moves the device for cell deployment 160 held by the holder 110 in the horizontal direction (XY direction) by moving the holder 110 in the horizontal direction (XY direction). With the light irradiation unit 120 irradiating the cell deployment device 160 with the excitation light, the cell deployment device 160 is moved in the horizontal direction (XY direction), whereby the first irradiation spot S1 and the second irradiation spot of the excitation light. The chip 161 can be scanned with the irradiation spot S2.
  • the moving unit 150 includes an X-axis moving mechanism 151 that moves the holder 110 in the X-axis direction (for example, the first direction D1), and a holder 110 that moves in the Y-axis direction (for example, the second direction orthogonal to the first direction D1).
  • Y-axis moving mechanism 152 that moves in the direction D2).
  • the moving unit 150 drives the X-axis moving mechanism 151 and the Y-axis moving mechanism 152 to move the holder 110 in an arbitrary direction.
  • 3 and 4 are diagrams for explaining the scanning and movement of the irradiation spots S1, S2 (detection areas A1, A2).
  • 3A is a diagram for explaining scanning of the first irradiation spot S1 in the first direction D1
  • FIG. 3B is for explaining scanning of the first irradiation spot S1 in the second direction D2.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining the movement of the second irradiation spot S2.
  • the moving unit 150 is configured such that the first irradiation spot S1 (first detection region A1) is moved from one end (movement start position) to the other end of the first scanning region SA1 adjacent to each other.
  • the cell expansion device 160 is moved so as to move toward the first direction D1 (movement end position) (see solid line arrow in FIG. 3A).
  • the “first scanning region” refers to a region where the first light irradiation device 121 irradiates excitation light when the first irradiation spot S1 scans once in the first direction D1.
  • the first irradiation spot S1 (first detection area A1) is moved in the second direction D2. Specifically, as shown in FIG. 3A, the first irradiation spot S1 (first detection area A1) that has reached the movement end position of the first first scanning area SA1 is moved to the second first scanning. It moves to the movement start position of area
  • region SA1 (refer the dotted line arrow of FIG. 3A). At this time, the 1st light irradiation apparatus 121 may continue irradiating excitation light, and does not need to irradiate.
  • the first irradiation spot S1 (first detection area A1) is moved so that the first scanning area SA1 once scanned is not scanned again and there is no first scanning area SA1 that is not scanned. These steps are repeated until the last first scanning area SA1 has been scanned.
  • the moving unit 150 is configured such that the first irradiation spot S1 (first detection region A1) is moved from one end (movement start position) to the other end of the second scanning region SA2 adjacent to each other.
  • the cell deployment device 160 is moved so as to move in the second direction D2 until (movement end position).
  • the “second scanning region” refers to a region where the first light irradiation device 121 irradiates excitation light when the first irradiation spot S1 scans once in the second direction D2.
  • the first irradiation spot S1 (first detection area A1) is moved in the first direction D1. Specifically, as shown in FIG. 3B, the first irradiation spot S1 (first detection area A1) that has reached the movement end position of the first second scanning area SA2 is moved to the second second scanning. It moves to the movement start position of area
  • the moving unit 150 moves the second irradiation spot S2 (second detection area A2) toward the third scanning area SA3 based on the result of scanning the first irradiation spot S1.
  • the cell deployment device 160 is moved (see solid arrow in FIG. 4).
  • the “third scanning region” refers to a region where the second light irradiation device 122 irradiates excitation light.
  • the moving unit 150 moves the cell deployment device 160 so that the second irradiation spot S2 is continuously moved to the plurality of third scanning areas SA3. .
  • control unit position information acquisition unit
  • the control unit is connected to the light irradiation unit 120, the light detection unit 130, and the moving unit 150, and controls the cell detection device 100 in an integrated manner.
  • the cell detection device 100 may include an imaging device (not shown) for imaging the detected target cell.
  • the imaging apparatus is arranged so as to face the cell deployment device 160 from above.
  • FIG. 5A is a plan view of the cell deployment device 160
  • FIG. 5B is a cross-sectional view taken along the line AA shown in FIG. 5A.
  • the cell deployment device 160 includes a chip 161, a frame body 162, and a top plate 163.
  • 6A is a plan view of the chip 161
  • FIG. 6B is a plan view of the frame body 162
  • FIG. 6C is a plan view of the top plate 163.
  • the chip 161 has a cell accommodating portion 165 for expanding a plurality of cells on one surface.
  • the structure of the cell accommodating part 165 is not specifically limited. Examples of the structure of the cell accommodating portion 165 include a planar shape, a bottomed microchamber shape, a groove shape, and the like.
  • cell storage portion 165 has a planar shape.
  • the “cell accommodating part” means a part for accommodating and holding a cell group including a plurality of cells.
  • “holding cells” means that the cells stored in the cell storage unit 165 do not easily come out of the cell storage unit 165 when a liquid flows in a flow path 164 described later.
  • the surface of the chip 161 where the cell accommodating portion 165 is formed is the bottom surface of the flow path 164 of the cell deployment device 160.
  • the frame body 162 is a thin plate having a through-hole disposed between the chip 161 and the top plate 163 (see FIG. 5B). This through-hole becomes a flow path 164 for flowing a cell suspension derived from the specimen.
  • the shape of the flow path 164 (through hole) is not particularly limited as long as the cell suspension can flow over the cell storage portion 165, and can be appropriately selected depending on the application.
  • the thickness of the frame body 162 is not particularly limited, and is appropriately set according to the desired height (depth) of the flow path.
  • the thickness of the frame 162 is in the range of 50 to 500 ⁇ m, and the height of the flow path is in the range of 50 to 500 ⁇ m.
  • the material of the frame 162 is not particularly limited, and may be the same material as a known microplate.
  • Examples of the material of the frame body 162 include resins such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyamide, polycarbonate, polydimethylsiloxane, polymethyl methacrylate, and cyclic olefin copolymer.
  • the top plate 163 is a thin plate having two through holes arranged on the frame body 162 (see FIG. 6C). These through-holes are respectively an introduction port 166 for introducing a liquid (for example, a cell suspension, a washing solution, a staining solution, etc.) into the flow channel 164 and a discharge port for discharging the liquid from the flow channel 164. 167.
  • a liquid for example, a cell suspension, a washing solution, a staining solution, etc.
  • a discharge port for discharging the liquid from the flow channel 164.
  • the introduction port 166 communicates with one end of the flow channel 164
  • the discharge port 167 communicates with the other end of the flow channel 164.
  • the shapes of the inlet 166 and the outlet 167 are not particularly limited.
  • the thickness of the top plate 163 is not particularly limited as long as necessary strength can be secured.
  • the material of the top plate 163 is not particularly limited, from the viewpoint of transmitting the excitation light irradiated by the cell detection device 100, it is preferable that the material has a light transmission property.
  • the same resin as that of the frame body 162 can be used as the material of the top plate 163.
  • the chip 161, the frame body 162, and the top plate 163 are stacked in this order and are fixed to each other.
  • the method for fixing them is not particularly limited, but from the viewpoint of observation and maintenance, it is preferable to fix them so as to be removable from each other.
  • Examples of the fixing method include fixing by engagement, fixing using a screw, and fixing using an adhesive.
  • the flow path 164 formed in the cell deployment device 160 communicates with the outside through the introduction port 166 and the discharge port 167.
  • a liquid for example, a cell suspension
  • the flow path 164 can be filled with the liquid.
  • the liquid flows in the flow path 164 from the introduction port 166 toward the discharge port 167.
  • the flow path 164 is filled with the cell suspension, the cells settle on the chip 161 and adhere to the bottom surface of the cell storage unit 165. That is, the cells are accommodated in the cell accommodating portion 165. Thereafter, washing and staining are performed, and various analyzes can be performed by observing the cells accommodated in the cell accommodating portion 165 from the outside using the cell detection device 100 or the like.
  • a cell accommodating portion 165 is formed on one surface of the chip 161.
  • the material of the chip 161 is not particularly limited, but it is preferable that the material has light transmittance like the top plate 163.
  • the same resin as that of the frame body 162 and the top plate 163 can be used.
  • the thickness of the chip 161 is not particularly limited as long as necessary strength can be ensured.
  • the closed cell deployment device 160 having the flow channel 164 is used.
  • an open cell deployment device having no flow channel 164 may be used. That is, the chip 161 can also be used as a device for cell deployment.
  • FIG. 7 is a diagram showing the structure of another cell housing portion.
  • the cell storage unit 165 may have a plurality of microchambers 168.
  • Microchamber means a fine bottomed recess (microwell) for containing and holding one or more cells.
  • the shape of the opening of the microchamber 168 is not particularly limited, and includes a circle, an ellipse, and a polygon.
  • the size of the opening of the microchamber 168 is not particularly limited, and can be set as appropriate according to the type of cells to be accommodated, the number of cells to be accommodated in one microchamber 168, and the like. In general, the size of the opening is preferably such that about 10 to 15 cells can adhere to the bottom surface of the microchamber 168.
  • the cell storage unit 165 may have a plurality of grooves 169.
  • the cross-sectional shape in the width direction of the groove 169 is not particularly limited, and includes a V-groove, a U-groove, and the like.
  • the width of the groove 169 is not particularly limited, but is preferably a length that accommodates one cell.
  • the target cell is detected from the cell group labeled with the first fluorescent material for labeling the target cell and the second fluorescent material for labeling the non-target cell using the cell detection device 100. How to do will be described. Here, in order to simplify the description, a case where one target cell is included in the cell group will be described as an example.
  • FIG. 8 is a diagram for explaining the cell detection method according to the first embodiment.
  • FIG. 8A is a diagram for explaining the first step and the second step.
  • FIG. 8B shows that fluorescence from the first fluorescent material is detected when the first irradiation spot is scanned in the first direction D1.
  • 8C is a graph showing the signal when the fluorescence from the first fluorescent material is not detected when the first irradiation spot is scanned in the first direction D1.
  • FIG. 8D is a graph showing a signal when fluorescence from the first fluorescent material is detected when the second irradiation spot is scanned in the second direction, and
  • FIG. 8E shows the second irradiation spot at the second irradiation spot. It is a graph which shows a signal when the fluorescence from a 1st fluorescent substance is not detected when it scans in the direction of 2.
  • FIG. 8A is a diagram for explaining the first step and the second step.
  • FIG. 8B shows that fluorescence from the first
  • first step position information of a cell in which fluorescence from the first fluorescent substance is detected is acquired (first step).
  • second step positional information of the cell from which the fluorescence from the second fluorescent substance is detected is acquired (second step).
  • second step positional information of the cell from which the fluorescence from the second fluorescent substance is detected is acquired (second step).
  • second step it is determined whether it is a target cell (3rd process).
  • the determined target cell may be observed using an imaging device (fourth step).
  • a chip 161 (cell deployment device 160) in which a cell group is accommodated in the cell accommodation unit 165 is prepared.
  • a cell suspension for example, blood or a diluted solution thereof
  • the cell suspension is aspirated 20 times so that the cells in the cell suspension move slightly. Repeat (stop for 10 seconds after one suction), and the cells are accommodated in the cell accommodating portion 165.
  • tip 161 (device 160 for cell expansion
  • the kind of the target cell used as detection object is not specifically limited.
  • CTC blood circulating cancer cells
  • CEC circulating vascular endothelial cells
  • CEP circulating vascular endothelial progenitor cells
  • fetal cells antigen-specific T cells, various stem cells, and the like.
  • the cell group is irradiated with excitation light for exciting the first fluorescent substance to detect the fluorescence from the first fluorescent substance, and the fluorescence is detected.
  • the moving unit 150 moves the cell deployment device 160 via the holder 110 so that the first irradiation spot S1 of excitation light is positioned at the movement start position of the first scanning region SA1.
  • the moving unit 150 moves the cell deployment device 160 in the first direction so that the first irradiation spot S1 (first detection area A1) moves from the movement start position to the movement end position of the first scanning area SA1.
  • the first light irradiation device 121 continues to emit excitation light having a predetermined wavelength while the moving unit 150 moves the holder 110 in the direction opposite to the first direction D1 by 180 °. That is, the 1st light irradiation apparatus 121 irradiates excitation light continuously with respect to the cell (fluorescent substance) accommodated in the cell accommodating part 165 contained in a chamber row
  • the light detection unit 130 continuously detects the emitted fluorescence in this way, and acquires position information of the cells in which the fluorescence is detected in the first direction D1. As shown in FIG.
  • the position information acquisition unit acquires the position information of the fluorescence as the movement distance of the holder 110 (cell deployment device 160) with respect to the reference position.
  • the first fluorescent material is not present in the first scanning area SA1, no peak is observed as shown in FIG. 8C.
  • the moving unit 150 moves the cell deployment device 160 so that the first irradiation spot S1 (first detection area A1) of the excitation light moves to the movement start position of the first scanning area SA1 adjacent to each other. Move. While repeating the scanning and movement of the first irradiation spot S1, the fluorescence is detected while irradiating the chip 161 with the excitation light, and the position information in the first direction D1 of the cell from which the detected fluorescence is emitted is acquired. .
  • the moving unit 150 causes the cell deployment device 160 to pass through the holder 110 so that the first irradiation spot S1 of the excitation light scans the second scanning region SA2. To acquire position information of the detected fluorescence in the second direction D2.
  • the fluorescence from the second fluorescent material is detected by irradiating the cells in which the fluorescence is detected with excitation light for exciting the second fluorescent material.
  • the moving unit 150 moves the second irradiation spot S2 of excitation light to the third scanning area SA3 based on the positional information of the fluorescence detected in the first step in the first direction D1 and the second direction D2.
  • the light irradiation part 120 irradiates excitation light with respect to the cell (fluorescent substance) which emitted fluorescence at the 1st process.
  • the second fluorescent material emits fluorescence simultaneously with the excitation light irradiation.
  • the light detection unit 130 detects the fluorescence thus emitted.
  • the third step based on the results of the first step and the second step, it is determined whether or not the cell detected in the first step is a target cell. Specifically, it is examined whether or not fluorescence is detected in the second step at the position (cell) where fluorescence is detected in the first step. For example, when fluorescence is detected in the first step but no fluorescence is detected in the second step, the cells are appropriately labeled only with the first fluorescent substance. That is, it can be seen that the cells in which fluorescence was detected in the first step but no fluorescence was detected in the second step are target cells. On the other hand, when fluorescence is detected in the first step and the second step, the cells are non-specifically labeled with the first fluorescent substance. That is, it can be seen that the cells in which fluorescence is detected in the first step and the second step are non-target cells.
  • the detected cell may be imaged and the detailed form of the cell may be observed (step 4).
  • the target cell is imaged by moving the imaging unit by the moving unit 150 based on the positional information of the cells detected in the first and second steps.
  • target rare cells can be detected from a large number of cells accurately, with high sensitivity and in a short time.
  • the irradiation spots S1, S2 are scanned once for each detection area A1, A2.
  • the irradiation spots S1, S2 are scanned twice for each detection area A1, A2. May be. By doing in this way, a rare cell (target cell) can be detected more reliably.
  • the movement start position and the movement end position may be set at positions opposite to each other in the first scanning area SA1 (or the second scanning area SA2) adjacent to each other.
  • the moving unit 150 is configured such that the first irradiation spot S1 (second irradiation spot S2) is changed from one end (movement start position) to the other end (first scan area SA1).
  • the cell expansion device 160 is moved so as to move in the first direction D1 (second direction D2) to the movement end position).
  • the first irradiation spot S1 (second irradiation spot S2) that has reached the movement end position of the other end of the first scanning area SA1 (second scanning area SA2) is changed to the next first scanning area SA1 (second It is moved to the movement start position of the scanning area SA2).
  • the movement start position of the next first scanning area SA1 (second scanning area SA2) is an end located adjacent to the movement end position of the first scanning area SA1 (second scanning area SA2).
  • the first irradiation spot S1 (second irradiation spot S2) that has reached the movement start position of the next first scanning area SA1 (second scanning area SA2) is changed to the first scanning area SA1 (second scanning area SA2).
  • the movement end position of the next first scanning area SA1 (second scanning area SA2) is an end located adjacent to the movement start position of the first scanning area SA1 (second scanning area SA2).
  • the moving unit 150 may move the light irradiation unit 120, the first detection region defining unit 141, the second detection region defining unit 142, and the light detecting unit 130. Specifically, the first detection region defining unit 141, the second detection region defining unit 142, and the light detecting unit 130 are moved in the horizontal direction (XY direction) in a state where the holder 110 is fixed.
  • the chip 161 may be scanned with the first irradiation spot S1 and the second irradiation spot S2.
  • the cell detection device according to the second embodiment is different from the cell detection device according to the first embodiment in the scanning method of the first irradiation spot S1. Therefore, the difference from the scanning method of the first irradiation spot S1 in the first embodiment will be mainly described.
  • the description is abbreviate
  • the first irradiation spot S1 scans only the first scanning area SA1. Specifically, the first irradiation spot S1 (first detection area A1) is moved from the movement start position of the first first scanning area SA1 to the movement end position to move the first first scanning area SA1. The first irradiation spot S1 (first detection area A1) that has reached the end position is moved to the movement start position of the second first scanning area SA1. This process is repeated until the last first scanning area SA1 has been scanned. That is, in the second embodiment, the second scanning area SA2 of the first irradiation spot S1 is not scanned.
  • FIG. 9 is a diagram for explaining scanning of the second irradiation spot S2 in the second embodiment.
  • FIG. 10A is a graph showing a signal when fluorescence from the second fluorescent material is detected
  • FIG. 10B is a graph showing a signal when fluorescence from the second fluorescent material is detected.
  • the third scanning region SA3 may extend in the second direction D2.
  • the position of the third scanning region SA3 in the first direction D1 is determined based on the cell position information obtained during the scanning of the first irradiation spot S1.
  • the second irradiation spot S2 is linearly scanned in the second direction D2 from the movement start position to the movement end position of the third scanning region SA3.
  • fluorescence is detected in most of the third scanning region SA3. In the position corresponding to the target cell, one negative peak is observed.
  • the first fluorescent material is not present in the second scanning region SA2, no negative peak is observed as shown in FIG. 10B.
  • a plurality of third scanning areas SA3 may be arranged in the second direction.
  • the movement start position of the third scanning region SA3 is the front side in the scanning direction from the position where the fluorescence from the first fluorescent substance is detected in the first direction D1, and the movement end position is the first direction D1.
  • the depth is in the scanning direction from the position where the fluorescence from the first fluorescent material is detected.
  • the length of the third scanning region SA3 in the first direction D1 is not particularly limited, and may be, for example, about the length of one cell. Then, similarly to the first embodiment, scanning is performed from the first third scanning area SA3 to the last third scanning area SA3.
  • Cell detection method In the first step of the method for detecting a cell according to the second embodiment, the first detection region A1 is scanned in the first direction D1, and the position information in the first direction D1 of the cell in which fluorescence is detected is acquired. To do.
  • the second detection region A2 is scanned in the first direction D1 or the second direction D2 and irradiated with excitation light, Fluorescence from the second fluorescent material is detected.
  • the length of the second irradiation spot S2 in the first direction D1 and the second direction D2 is one cell or less, the fluorescence from the second fluorescent substance can be appropriately detected.
  • the cell detection device 100 according to the second embodiment has the same effect as the cell detection device 100 according to the first embodiment.
  • Example 1 Preparation of Cell Suspension Peripheral blood collected from cancer patients was diluted with phosphate buffered saline (PBS) to obtain a diluted blood solution. Subsequently, paraformaldehyde (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to 1 mL of a diluted blood solution so as to have a concentration of 4% by mass, and then gently mixed and allowed to react for 15 minutes at room temperature in a dark place. Further, after adding a sufficient amount of PBS and mixing, the suspension was centrifuged with a centrifuge.
  • PBS phosphate buffered saline
  • blood circulating cancer cells 100, whole cells excluding blood circulating cancer cells (leukocytes): 1.0 ⁇ 10 6 , among the leukocytes, 200 non-specifically labeled leukocytes: 200 there were.
  • a cell suspension is dropped onto a chip 161 having a cell accommodating portion 165 (FIG. 6) having a length of 25 mm and a width of 5 mm, and then a frame body 162 and a top plate 163 are arranged to arrange the cell deployment device 160.
  • a cell accommodating portion 165 FIG. 6
  • a frame body 162 and a top plate 163 are arranged to arrange the cell deployment device 160.
  • Detection of cells Blood circulating cancer cells (CTC) were detected using the cell detection apparatus 100 (FIG. 1).
  • the excitation light He-Ne laser light (wavelength 635 nm) for exciting Alexa Fluor 647 labeled with CTC and semiconductor laser (wavelength 488 nm) for exciting Alexa Fluor 488 labeled CD45 were used.
  • the shape of the first irradiation spot S1 was a circle of 100 ⁇ m ⁇ . In the present embodiment, the first irradiation spot S1 and the first detection area A1 coincide.
  • the first irradiation spot S1 is scanned in the first direction (X-axis direction) D1, irradiated with excitation light having a wavelength of 635 nm, fluorescence from Alexa Fluor 647 is detected, and the X coordinate of the cell from which fluorescence is detected (Location information) was acquired.
  • the first irradiation spot S1 is scanned in a second direction D2 (Y-axis direction) orthogonal to the first direction D1 to irradiate excitation light having a wavelength of 635 nm and detect fluorescence from Alexa Fluor 647.
  • the Y coordinate (position information) of the detected cell was acquired (first step).
  • the first irradiation spot S1 is scanned in the first direction D1 and the second direction D2 of the first irradiation spot S1 (irradiation of excitation light, detection of fluorescence and acquisition of position information) and the first irradiation spot S1 between the first scanning areas SA1.
  • the total time required to move was about 3 minutes.
  • the second irradiation spot S2 is moved onto the coordinates (positional information) obtained in the first step, irradiated with excitation light having a wavelength of 488 nm, and fluorescence from Alexa Fluor 488 was detected (second step). ). At this time, the total time required for movement (irradiation of excitation light and detection of fluorescence) of the second irradiation spot S2 was about 5 minutes.
  • the detected cells were target cells (blood circulating cancer cells) or non-target cells (leukocytes).
  • Example 2 Pretreatment of chamber and cell accommodation Depth: 50 ⁇ m, diameter: 100 ⁇ m Microchip (FIG. 7A) A frame 162 and a top plate 163 are arranged on a chip 161 having 20000 microchambers, and a flow path 164 is provided. A cell deployment device 160 was produced. A blocking solution (PBS containing 3% by mass BSA) was fed into the flow path 164 at 16 mL / min. Thereafter, PBS was fed into the channel 164 to remove excess blocking solution from the channel 164. 10 ⁇ L of the above cell suspension was fed into the flow channel 164 from which the blocking solution had been removed at a flow rate of 16 mL / min, and rested for 10 seconds. All the cells were accommodated in the cell accommodating part 165 by repeating the liquid feeding and stationary of the cell suspension.
  • PBS containing 3% by mass BSA was fed into the flow path 164 at 16 mL / min.
  • 10 ⁇ L of the above cell suspension was fed into the flow channel 164 from
  • Example 2 blood circulation cancer cells (CTC) were detected using the cell detection device 100 (FIG. 1) according to Embodiment 1.
  • the detection region defining unit 140 is also disposed on the light irradiation unit 120 side in this embodiment. A rectangular slit was used as the detection area defining unit 140.
  • the first irradiation spot S1 is a rectangle having a short side: 20 ⁇ m and a long side of 100 ⁇ m.
  • the second irradiation spot S2 was a circle of 10 ⁇ m ⁇ . The scanning of the first irradiation spot S1 and the second irradiation spot S2 was performed in the same manner as in Example 1.
  • the first irradiation spot S1 is scanned in the X-axis direction and the Y-axis direction (excitation light irradiation, fluorescence detection and position information acquisition) and the first irradiation spot S1 is moved between the first scanning areas SA1.
  • the total time required was about 2 minutes.
  • the total time required for the movement of the second irradiation spot S2 was about 25 minutes.
  • the number of detected CTCs completely coincided with the number of CTCs introduced into the cell deployment device 160 (100%).
  • Example 3 Pretreatment of chamber and accommodation of cells A cell suspension is dropped onto a chip 161 having a cell accommodating portion 165 (FIG. 7B) in which grooves having a groove width of 10 ⁇ m and a groove depth of 20 ⁇ m are formed on the entire surface, thereby accommodating cells. All cells were contained in part 165.
  • Example 3 blood circulation cancer cells (CTC) were detected using the cell detection device 100 (FIG. 1) according to the first embodiment.
  • the detection region defining unit 140 is also disposed on the light irradiation unit 120 side in this embodiment.
  • a rectangular slit was used as the detection area defining unit 140.
  • the first irradiation spot S1 is a rectangle having a short side of 10 ⁇ m and a long side of 200 ⁇ m.
  • the second irradiation spot S2 was a circle of 10 ⁇ m ⁇ .
  • the first irradiation spot S1 was scanned in the first direction D1 from the first first scanning area SA1 to the last first scanning area SA1. That is, in the first step, the first irradiation spot S1 does not scan the second scanning area SA2.
  • the second step was performed by linearly scanning the second irradiation spot S2 in the second direction D2.
  • [Comparative example] Detection of cells
  • CTC blood circulation cancer cells
  • a cell suspension was developed on a flat substrate.
  • the shape of the irradiation spot is a circle having a diameter of 5 ⁇ m.
  • the time required for detecting fluorescence on the entire surface of the substrate was about 40 minutes.
  • CTC could be detected in the same manner as in Examples 1 to 3. Further, the number of detected CTCs almost coincided with the number of CTCs introduced into the cell deployment device 160 (98%). However, because of the detection using a microarray scanner whose irradiation spot is 5 ⁇ m in diameter, the detection time has become very long, about 40 minutes.
  • the cell detection device according to the present invention and the cell detection method using this cell detection device have sensitivity equal to or higher than that of cell detection using a microarray scanner with an irradiation spot of about 5 ⁇ m in diameter, and in a short time. It can be seen that rare cells can be detected.
  • the cell detection method and cell detection apparatus of the present invention can detect rare cells accurately, with high sensitivity and in a short time, and are useful for, for example, examination of diseases.
  • DESCRIPTION OF SYMBOLS 100 Cell detection apparatus 110 Holder 120 Light irradiation part 121 1st light irradiation apparatus 122 2nd light irradiation apparatus 130 Light detection part 131 1st lens 132 1st dichroic mirror 133 2nd lens 134 2nd dichroic mirror 135 Objective lens 136 Filter 137 Pinhole 138 Third lens 139 Fourth lens 140 Detection region defining unit 141 First detection region defining unit 142 Second detection region defining unit 150 Moving unit 151 X-axis moving mechanism 152 Y-axis moving mechanism 160 Cell deployment device 161 Chip 162 Frame 163 Top plate 164 Flow path 165 Cell accommodating part 166 Inlet 167 Discharge outlet 168 Microchamber 169 Groove A1 First detection area A2 Second detection area S1 First irradiation spot S2 Second irradiation spot SA1 First scanning area S 2 second scanning region SA3 third scanning region

Landscapes

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Abstract

　細胞群に、第１蛍光物質を励起するための励起光を照射して蛍光を検出し、蛍光が検出された細胞の位置情報を取得する（第１工程）。このとき、走査方向に直交する方向の長さが細胞群の細胞２個分以上の第１検出領域を走査させる。次いで、蛍光が検出された細胞に、第２蛍光物質を励起するための励起光を照射して蛍光を検出し、蛍光が検出された細胞の位置情報を取得する（第２工程）。このとき、走査方向および走査方向に直交する方向の長さが細胞群の細胞１個分以下の第２検出領域を、蛍光が検出された細胞に移動させる。次いで、第１工程および第２工程の検出結果に基づいて、第１工程で検出された細胞が目的細胞であるかどうかを判定する（第３工程）。

Description

細胞検出方法および細胞検出装置
　本発明は、細胞検出方法およびこの細胞検出方法を行うための細胞検出装置に関する。
　循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）や循環血管内皮細胞（ＣＥＣ）、循環血管内皮前駆細胞（ＣＥＰ）、各種幹細胞など（以下「希少細胞」または「目的細胞」ともいう）は、病態に応じて血液中に極めて稀に存在する。このような希少細胞は、臨床的に有用であることは明らかであるが、検出が極めて難しい。近年、様々な細胞分離手法を応用して希少細胞の検出が試みられており、様々な検出装置が製品化されている。たとえば、非目的細胞を含む血液などの検体中に対象の希少細胞が存在するかどうかを検査する場合に、検体に由来する細胞懸濁液をデバイスに展開した後、展開された全細胞を解析することが提案されている。
　一般的に、希少細胞の検出は、顕微鏡を用いて行われている。この方法では、細胞懸濁液を平面状に展開した後、顕微鏡により全細胞を観察して、希少細胞を検出する。
　また、希少細胞の他の検出方法として、マイクロアレイスキャナーを用いた方法が開示されている（非特許文献１参照）。この方法では、複数のマイクロチャンバーを有するチップに細胞懸濁液を展開してマイクロチャンバー内に細胞を収容し、希少細胞を蛍光物質で標識する。そして、マイクロアレイスキャナーを用いて、細胞と同じ程度の大きさの照射スポットを走査して励起光を全細胞に照射し、希少細胞を標識した蛍光物質から放出された蛍光を検出することで、希少細胞を検出する。
S. Yatsushiro et al., "Rapid and Highly Sensitive Detection of Malaria-Infected Erythrocytes Using a Cell Microarray Chip", PLoS ONE, Vol. 5, Issue 10, e13179.
　顕微鏡を用いた希少細胞の検出方法では、例えば高い倍率で全細胞を観察すると、高感度で希少細胞を検出することができるが、視野が狭いため検出時間が長くなってしまう。一方、低い倍率で全細胞を観察すると、視野が広くなるため検出時間を短縮することができるが、検出感度が下がってしまい、一部の希少細胞を検出できないおそれがある。
　非特許文献１に記載の希少細胞の検出方法では、細胞と同じ程度の大きさの照射スポットを走査して全細胞を解析するため、高感度で細胞を検出することができるが、検出時間が長くなってしまう。非特許文献１に記載の希少細胞の検出方法において、多色（多種）の蛍光物質を検出する場合には、希少細胞以外（目的細胞以外）の全ての細胞を検出する必要がある。よって、非特許文献１に記載の希少細胞の検出方法では、希少細胞かどうかを判定することはできるが、測定時間が長くなってしまう。
　このように、従来の希少細胞の検出方法では、正確な検出、高い検出感度および検出時間の短縮の全てを満たすことができなかった。
　本発明の目的は、多数の細胞から目的細胞を正確に、高感度かつ短時間で検出することができる細胞検出方法を提供することである。また、本発明の別の目的は、この細胞検出方法を行うための細胞検出装置を提供することである。
　上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る細胞検出方法は、目的細胞を標識するための第１蛍光物質と、非目的細胞を標識するための第２蛍光物質と、により標識された細胞群から前記目的細胞を検出する方法であって、前記細胞群に、前記第１蛍光物質を励起するための励起光を照射して蛍光を検出し、蛍光が検出された細胞の位置情報を取得する第１工程と、前記蛍光が検出された細胞に、前記第２蛍光物質を励起するための励起光を照射して蛍光を検出し、蛍光が検出された細胞の位置情報を取得する第２工程と、前記第１工程および前記第２工程の検出結果に基づいて、前記第１工程で検出された細胞が前記目的細胞であるかどうかを判定する第３工程と、を有し、前記第１工程では、走査方向に直交する方向の長さが前記細胞群の細胞２個分以上の第１検出領域を走査させ、前記第２工程では、前記走査方向および前記走査方向に直交する方向の長さが前記細胞群の細胞１個分以下の第２検出領域を、前記蛍光が検出された細胞に移動させる。
　また、上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る細胞検出装置は、目的細胞を標識するための第１蛍光物質と、非目的細胞を検出するための第２蛍光物質とにより標識された細胞群が細胞収容部に収容されているチップを保持するためのホルダーと、前記チップに前記第１蛍光物質を励起するための励起光および前記第２蛍光物質を励起するための励起光を別個に照射する光照射部と、前記光照射部から照射された励起光により前記第１蛍光物質からの蛍光および前記第２蛍光物質からの蛍光を検出する光検出部と、前記光検出部により検出した前記第１蛍光物質から蛍光を発した細胞および前記第２蛍光物質から蛍光を発した細胞の位置情報を取得する位置情報取得部と、前記光照射部と前記ホルダーとの間、または前記ホルダーと前記光検出部との間に配置され、前記第１蛍光物質からの蛍光を検出するための第１検出領域を規定する第１検出領域規定部と、前記光照射部と前記ホルダーとの間、または前記ホルダーと前記光検出部との間に配置され、前記第２蛍光物質からの蛍光を検出するための第２検出領域を規定する第２検出領域規定部と、前記チップにおける前記第１検出領域および前記第２検出領域を、第１の方向および前記第１の方向に直交する第２の方向に走査させるために、前記ホルダーと、前記光照射部、前記第１検出領域規定部、前記第２検出領域規定部および前記光検出部とを相対的に移動させる移動部と、を有し、走査方向に直交する方向における前記第１検出領域の長さは、前記細胞群の細胞２個分以上であり、前記走査方向および前記走査方向に直交する方向における前記第２検出領域の長さは、前記細胞群の細胞１個分以下である。
　本発明によれば、撮像しなくても、細胞群中から目的細胞を正確に短時間で漏れなく検出することができる。
図１は、実施の形態１に係る細胞検出装置の模式図である。 図２Ａ，Ｂは、照射スポットと、検出領域との関係を説明するための模式図である。 図３Ａ，Ｂは、第１照射スポットの走査および移動を説明するための図である。 図４は、第２照射スポットの走査および移動を説明するための図である。 図５Ａ，Ｂは、細胞展開用デバイスの構成を示す図である。 図６Ａ～Ｃは、細胞展開用デバイスの構成を示す図である。 図７Ａ，Ｂは、細胞収容部の他の形態を示す図である。 図８Ａ～Ｅは、実施の形態１に係る細胞検出方法を説明するための図である。 図９Ａ，Ｂは、実施の形態２に係る細胞検出方法を説明するための図である。 図１０Ａ，Ｂは、実施の形態２に係る細胞検出方法を説明するための図である。
　以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
　［実施の形態１］
　（細胞検出装置の構成）
　本発明に係る細胞検出装置は、細胞展開用デバイスの細胞収容部内に収容された、第１蛍光物質で標識された目的細胞（希少細胞）および第２蛍光物質で標識された非目的細胞を含む細胞群に励起光を照射し、励起光の照射スポット内の検出領域から放出された蛍光を検出することで、細胞群中に含まれる目的細胞を検出するための装置である。
　図１は、細胞検出装置１００の模式図である。図２は、照射スポットＳ１，Ｓ２と、検出領域Ａ１，Ａ２との関係を示す模式図である。図２Ａは、第１照射スポットＳ１と、第１検出領域Ａ１との関係を示す模式図であり、図２Ｂは、第２照射スポットＳ２と、第２検出領域Ａ２との関係を示す模式図である。
　図１に示されるように、細胞検出装置１００は、ホルダー１１０と、光照射部１２０と、光検出部１３０と、第１検出領域規定部１４１および第２検出領域規定部１４２を有する検出領域規定部１４０と、移動部１５０と、図示しない制御部（位置情報取得部）とを有する。細胞検出装置１００には、チップ１６１を含む細胞展開用デバイス１６０が装着される。
　ホルダー１１０は、細胞展開用デバイス１６０を所定の位置に保持する。ホルダー１１０は、細胞展開用デバイス１６０を保持した状態で、移動部１５０により水平方向に移動させられる。
　光照射部１２０および光検出部１３０は、ホルダー１１０の上方に配置されている。光照射部１２０は、ホルダー１１０に保持された細胞展開用デバイス１６０（チップ１６１）に励起光を照射する。一方、光検出部１３０は、細胞展開用デバイス１６０（チップ１６１）から放出された蛍光を検出する。
　光照射部１２０は、第１光照射装置１２１および第２光照射装置１２２を有する。第１光照射装置１２１は、第１蛍光物質から蛍光を発生させるための励起光を照射する。また、第２光照射装置１２２は、第２蛍光物質から蛍光を発生させるための励起光を照射する。第１光照射装置１２１および第２光照射装置１２２に含まれる励起光を照射するための光源を有する。光源の種類は、特に限定されず、使用する蛍光物質の種類などに応じて適宜選択すればよい。光源は、例えばレーザーダイオードである。また、光照射部１２０は、所定の波長を透過させるフィルターを有していてもよい。励起光の波長は、細胞展開用デバイス１６０の自家蛍光の影響を排除する観点からは、長波長であることが好ましい。第１光照射装置１２１から出射される励起光の波長は、例えば６００～７８０ｎｍの範囲内である。また、第２光照射装置１２２から照射される励起光の波長は、例えば４７０～５８０ｎｍの範囲内である。
　光検出部１３０の種類は、微弱な蛍光を検出することが可能であれば特に限定されない。光検出部１３０の例には、光電子増倍管（ＰＭＴ：photo-multiplier tube）やフォトダイオードなどが含まれる。本実施の形態では、光検出部１３０は、光電子増倍管である。
　第１光照射装置１２１から細胞展開用デバイス１６０までの励起光の光路上には、第１レンズ１３１、第１検出領域規定部１４１、第１ダイクロイックミラー１３２、第２レンズ１３３、第２ダイクロイックミラー１３４および対物レンズ１３５が、第１光照射装置１２１側から順番に配置されている。第１光照射装置１２１から出射された励起光は、第１レンズ１３１、第１検出領域規定部１４１、第１ダイクロイックミラー１３２および第２レンズ１３３を通過した後、第２ダイクロイックミラー１３４で細胞展開用デバイス１６０に向けて反射される。第２ダイクロイックミラー１３４で反射した励起光は、対物レンズ１３５により細胞展開用デバイス１６０（チップ１６１）の細胞収容部１６５の底面近傍に集光される。
　また、第２光照射装置１２２から細胞展開用デバイス１６０までの励起光の光路上には、第４レンズ１３９、第２検出領域規定部１４２、第１ダイクロイックミラー１３２、第２レンズ１３３、第２ダイクロイックミラー１３４および対物レンズ１３５が、第２光照射装置１２２側から順番に配置されている。第２光照射装置１２２から出射された励起光は、第４レンズ１３９、第２検出領域規定部１４２、第１ダイクロイックミラー１３２および第２レンズ１３３を通過した後、第２ダイクロイックミラー１３４で細胞展開用デバイス１６０に向けて反射される。第２ダイクロイックミラー１３４で反射した励起光は、対物レンズ１３５により細胞展開用デバイス１６０（チップ１６１）の細胞収容部１６５の底面近傍に集光される。
　一方、細胞展開用デバイス１６０から光検出部１３０までの蛍光の光路上には、対物レンズ１３５、第２ダイクロイックミラー１３４、フィルター１３６、第３レンズ１３８およびピンホール１３７が、細胞展開用デバイス１６０側から順番に配置されている。細胞展開用デバイス１６０から放出された蛍光は、対物レンズ１３５、第２ダイクロイックミラー１３４およびフィルター１３６を通過した後、第３レンズ１３８によりピンホール１３７を通過して光検出部１３０の受光面に結像させられる。フィルター１３６は、例えば励起光カットフィルターや減光フィルターなどである。励起光カットフィルターは、励起光や外光などを遮断し、Ｓ／Ｎ比を向上させる。減光フィルターは、蛍光強度を光検出部１３０に合わせて調整する。ピンホール１３７は、励起光の焦点（細胞収容部１６５の底面近傍）から放出された蛍光以外の光を遮断し、Ｓ／Ｎ比を向上させる。ピンホール１３７の形状は、特に限定されず、例えば円形や矩形などである。ピンホール１３７の大きさは、励起光の照射スポットの形状や使用する光学素子に応じて適宜設定される。
　第１検出領域規定部１４１および第２検出領域規定部１４２は、光照射部１２０（第１光照射装置１２１および第２光照射装置１２２）と細胞展開用デバイス１６０（ホルダー１１０）との間、または細胞展開用デバイス１６０（ホルダー１１０）と光検出部１３０との間にそれぞれ配置され、チップ１６１上の第１検出領域Ａ１および第２検出領域Ａ２をそれぞれ規定する。ここで「検出領域」とは、光検出部１３０により蛍光が検出される領域を意味する。通常、励起光の照射スポット（第１照射スポットＳ１および第２照射スポットＳ２）外からは検出すべき蛍光は放出されないため、検出領域（第１検出領域Ａ１および第２検出領域Ａ２）は、チップ１６１上の励起光の照射スポット内に設定される。検出領域は、励起光の照射スポットと一致していてもよいし、照射スポットの一部であってもよい。
　第１検出領域規定部１４１は、第１光照射装置１２１と細胞展開用デバイス１６０（ホルダー１１０）との間に配置され、第１光照射装置１２１から出射された励起光のうち、第１検出領域Ａ１に照射する光のみを通過させる絞り（スリットやアパーチャーなど）であってもよい。また、第１検出領域規定部１４１は、細胞展開用デバイス１６０（ホルダー１１０）と光検出部１３０との間に配置され、励起光の第１照射スポットＳ１から放出された蛍光のうち、第１検出領域Ａ１から放出された蛍光のみを通過させる絞り（スリットやアパーチャーなど）であってもよい。図１に示されるように、本実施の形態では、第１検出領域規定部１４１は、第１光照射装置１２１と細胞展開用デバイス１６０（ホルダー１１０）との間に配置されている。
　励起光の第１照射スポットＳ１の大きさは、第１検出領域Ａ１の大きさ以上であれば特に限定されない。また、励起光の第１照射スポットＳ１の形状も、特に限定されない。通常、第１照射スポットＳ１の形状は円形であるが、本実施の形態のように第１光照射装置１２１と細胞展開用デバイス１６０（ホルダー１１０）との間に第１検出領域規定部１４１が配置されている場合は、第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）の形状は、様々な形状を採りうる。
　図２Ａに示されるように、第１検出領域Ａ１の走査方向（第１の方向Ｄ１）に直交する方向（第２の方向Ｄ２）における長さは、細胞群の細胞２個分の長さより長い。第２の方向Ｄ２における第１検出領域Ａ１の長さが、細胞群の細胞２個分の長さ未満の場合、検出時間が長くなってしまう。また、第１検出領域Ａ１の走査方向（第１の方向Ｄ１）における長さは、特に限定されず、例えば細胞群の細胞１個分程度の長さである。
　第１検出領域Ａ１の形状の例には、円形、楕円形および矩形が含まれる。第１検出領域Ａ１の形状は、検出感度を高める観点からは、楕円形または矩形であることが好ましい。本実施の形態では、第１検出領域Ａ１の形状は、走査方向：５～２５μｍ×走査方向に直交する方向：１０～２００μｍの矩形である。
　第２検出領域規定部１４２は、第２光照射装置１２２と細胞展開用デバイス１６０（ホルダー１１０）との間に配置され、第２光照射装置１２２から出射された励起光のうち、第２検出領域Ａ２に照射する光のみを通過させる絞り（スリットやアパーチャーなど）であってもよい。また、第２検出領域規定部１４２は、細胞展開用デバイス１６０（ホルダー１１０）と光検出部１３０との間に配置され、励起光の第２照射スポットＳ２から放出された蛍光のうち、第２検出領域Ａ２から放出された蛍光のみを通過させる絞り（スリットやアパーチャーなど）であってもよい。図１に示されるように、本実施の形態では、第１検出領域規定部１４１は、第２光照射装置１２２と細胞展開用デバイス１６０（ホルダー１１０）との間に配置されている。
　励起光の第２照射スポットＳ２の大きさは、第２検出領域Ａ２の大きさ以上であれば特に限定されない。また、励起光の第２照射スポットＳ２の形状も、特に限定されない。通常、第２照射スポットＳ２の形状は円形であるが、本実施の形態のように第１光照射装置１２１と細胞展開用デバイス１６０（ホルダー１１０）との間に第１検出領域規定部１４１が配置されている場合は、第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）の形状は、様々な形状を採りうる。
　第２検出領域Ａ２の大きさは、所定の大きさに制限される。第２検出領域Ａ２の走査方向（第１の方向Ｄ１）および走査方向に直交する方向（第２の方向Ｄ２）における長さは、細胞群の細胞１個分以下の長さである。第２検出領域Ａ２の第１の方向Ｄ１および第２の方向Ｄ２の長さが、細胞群の細胞１個分超の長さである場合、第２蛍光物質で標識された複数の細胞からの蛍光を検出してしまうおそれがある。第２検出領域Ａ２の形状の例には、円形、楕円形および矩形が含まれる。本実施の形態では、第２検出領域Ａ２の形状は、走査方向：５～２５μｍ×走査方向に直交する方向：５～２５μｍの矩形である。
　移動部１５０は、ホルダー１１０を水平方向（ＸＹ方向）に移動させることで、ホルダー１１０に保持された細胞展開用デバイス１６０を水平方向（ＸＹ方向）に移動させる。光照射部１２０が励起光を細胞展開用デバイス１６０に照射している状態で、細胞展開用デバイス１６０を水平方向（ＸＹ方向）に移動させることで、励起光の第１照射スポットＳ１および第２照射スポットＳ２でチップ１６１を走査することができる。たとえば、移動部１５０は、ホルダー１１０をＸ軸方向（例えば第１の方向Ｄ１）に移動するＸ軸移動機構１５１と、ホルダー１１０をＹ軸方向（例えば第１の方向Ｄ１に直交する第２の方向Ｄ２）に移動するＹ軸移動機構１５２とを有する。移動部１５０は、Ｘ軸移動機構１５１およびＹ軸移動機構１５２を駆動させてホルダー１１０を任意の方向に移動させる。
　図３および図４は、照射スポットＳ１，Ｓ２（検出領域Ａ１，Ａ２）の走査および移動を説明するための図である。図３Ａは、第１照射スポットＳ１の第１の方向Ｄ１への走査を説明するための図であり、図３Ｂは、第１照射スポットＳ１の第２の方向Ｄ２への走査を説明するための図である。図４は、第２照射スポットＳ２の移動を説明するための図である。
　まず、第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）を第１の方向Ｄ１に走査させる場合について説明する。図３Ａに示されるように、移動部１５０は、第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）が、互いに隣接する第１走査領域ＳＡ１の一方の端部（移動開始位置）から他方の端部（移動終了位置）まで第１の方向Ｄ１に向かって移動するように、細胞展開用デバイス１６０を移動させる（図３Ａの実線矢印参照）。ここで、「第１走査領域」とは、第１照射スポットＳ１が第１の方向Ｄ１に１回走査するときに、第１光照射装置１２１が励起光を照射する領域をいう。
　そして、第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）を第２の方向Ｄ２に移動させる。具体的には、図３Ａに示されるように、１個目の第１走査領域ＳＡ１の移動終了位置に到達した第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）を、２個目の第１走査領域ＳＡ１の移動開始位置に移動させる（図３Ａの点線矢印参照）。このとき、第１光照射装置１２１は、励起光を照射し続けていてもよいし、照射していなくてもよい。このように、一度走査した第１走査領域ＳＡ１をもう一度走査しないように、かつ走査しない第１走査領域ＳＡ１が無いように、第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）を移動させる。これらの工程を、最後の第１走査領域ＳＡ１を走査し終わるまで繰り返す。
　次に、第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）を第２の方向Ｄ２に走査させる場合について説明する。第１照射スポットＳ１を第２の方向Ｄ２に走査させる場合、ガルバノミラーなどにより第１の方向Ｄ１の長さと第２の方向Ｄ２の長さ入れ替える。すなわち、走査方向に直交する方向の長さを長くする。図３Ｂに示されるように、移動部１５０は、第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）が、互いに隣接する第２走査領域ＳＡ２の一方の端部（移動開始位置）から他方の端部（移動終了位置）まで第２の方向Ｄ２に向かって移動するように、細胞展開用デバイス１６０を移動させる。ここで、「第２走査領域」とは、第１照射スポットＳ１が第２の方向Ｄ２に１回走査するときに、第１光照射装置１２１が励起光を照射する領域をいう。
　そして、第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）を第１の方向Ｄ１に移動させる。具体的には、図３Ｂに示されるように、１個目の第２走査領域ＳＡ２の移動終了位置に到達した第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）を、２個目の第２走査領域ＳＡ２の移動開始位置に移動させる（図３Ｂの点線矢印参照）。このとき、第１光照射装置１２１は、励起光を照射し続けていてもよいし、照射していなくてもよい。このように、一度走査した走査領域をもう一度走査しないように、かつ走査しない走査領域が無いように、第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）を移動させる。これらの工程を、最後の第２走査領域ＳＡ２を走査し終わるまで繰り返す。
　次いで、第２照射スポットＳ２（第２検出領域Ａ２）を移動させる場合について説明する。図４に示されるように、移動部１５０は、第２照射スポットＳ２（第２検出領域Ａ２）を、第１照射スポットＳ１の走査による結果に基づいて、第３走査領域ＳＡ３に向かって移動するように、細胞展開用デバイス１６０を移動させる（図４の実線矢印参照）。ここで、「第３走査領域」とは、第２光照射装置１２２が励起光を照射する領域をいう。また、複数の第３走査領域ＳＡ３がある場合には、移動部１５０は、第２照射スポットＳ２を複数の第３走査領域ＳＡ３に連続して移動するように、細胞展開用デバイス１６０を移動させる。
　特に図示しないが、制御部（位置情報取得部）は、光照射部１２０、光検出部１３０および移動部１５０と接続されており、細胞検出装置１００を統括的に制御する。
　また、細胞検出装置１００は、検出された目的細胞を撮像するための撮像装置（図示省略）を有していてもよい。このとき、撮像装置は、細胞展開用デバイス１６０を上側から臨むように配置される。
　（細胞展開用デバイスの構成）
　図５および図６は、細胞展開用デバイス１６０の構成を示す図である。図５Ａは、細胞展開用デバイス１６０の平面図であり、図５Ｂは、図５Ａに示されるＡ－Ａ線の断面図である。
　図５Ａに示されるように、細胞展開用デバイス１６０は、チップ１６１、枠体１６２および天板１６３を有する。図６Ａは、チップ１６１の平面図であり、図６Ｂは、枠体１６２の平面図であり、図６Ｃは、天板１６３の平面図である。
　図５および図６に示されるように、チップ１６１は、一方の面に複数の細胞を展開するための細胞収容部１６５を有する。細胞収容部１６５の構造は、特に限定されない。細胞収容部１６５の構造の例には、平面状、有底のマイクロチャンバー状、溝状などが含まれる。本実施の形態では、細胞収容部１６５は、平面形状である。ここで、「細胞収容部」とは、複数の細胞を含む細胞群を収容し、保持するための部位を意味する。また、「細胞を保持する」とは、細胞収容部１６５に収容された細胞が、後述する流路１６４内に液体を流したときに細胞収容部１６５外に出難くすることを意味する。チップ１６１の細胞収容部１６５が形成されている面は、細胞展開用デバイス１６０の流路１６４の底面となる。
　枠体１６２は、チップ１６１と天板１６３との間に配置された、貫通孔を有する薄板である（図５Ｂ参照）。この貫通孔は、検体に由来する細胞懸濁液を流すための流路１６４となる。流路１６４（貫通孔）の形状は、細胞収容部１６５上に細胞懸濁液を流すことが可能であれば、特に限定されず、用途に応じて適宜選択されうる。また、枠体１６２の厚みは、特に限定されず、所望の流路の高さ（深さ）に応じて適宜設定される。たとえば、枠体１６２の厚みは、５０～５００μｍの範囲内であり、流路の高さは、５０～５００μｍの範囲内である。枠体１６２の素材は、特に限定されず、公知のマイクロプレートなどと同じ素材であってもよい。枠体１６２の素材の例には、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン、ポリメチルメタクリレート、環状オレフィンコポリマーなどの樹脂が含まれる。
　天板１６３は、枠体１６２の上に配置された、２つの貫通孔を有する薄板である（図６Ｃ参照）。これらの貫通孔は、それぞれ、流路１６４内に液体（例えば細胞懸濁液や洗浄液、染色液など）を導入するための導入口１６６と、流路１６４内から液体を排出するための排出口１６７となる。通常、導入口１６６は、流路１６４の一端に連通し、排出口１６７は、流路１６４の他端に連通する。導入口１６６および排出口１６７の形状は、特に限定されない。また、天板１６３の厚みも、必要な強度を確保できれば特に限定されない。天板１６３の素材は、特に限定されないが、細胞検出装置１００により照射される励起光を透過する観点からは、光透過性を有する素材であることが好ましい。天板１６３の素材としては、枠体１６２と同じ樹脂を使用することができる。
　チップ１６１、枠体１６２および天板１６３は、この順番で積層され、互いに固定されている。これらを固定する方法は特に限定されないが、観察やメンテナンスの観点からは、互いに取り外し可能に固定されることが好ましい。固定方法の例には、係合による固定、螺子を用いた固定、粘着剤を用いた固定が含まれる。
　図５Ｂに示されるように、細胞展開用デバイス１６０内に形成された流路１６４は、導入口１６６および排出口１６７を介して外部に連通している。導入口１６６から液体（例えば細胞懸濁液）を導入することで、流路１６４内に液体を満たすことができる。このとき、液体は、導入口１６６から排出口１６７に向かって流路１６４内を流れる。細胞懸濁液で流路１６４内を満たした場合、細胞はチップ１６１上に沈降し、細胞収容部１６５の底面に付着する。すなわち、細胞は、細胞収容部１６５内に収容される。この後、洗浄や染色などを行い、外部から細胞収容部１６５内に収容されている細胞を、細胞検出装置１００などを用いて観察することで、各種分析を行うことができる。
　（チップの構成）
　図５Ｂに示されるように、チップ１６１の一方の面には、細胞収容部１６５が形成されている。チップ１６１の素材は、特に限定されないが、天板１６３と同様に光透過性を有する素材であることが好ましい。チップ１６１の素材は、枠体１６２および天板１６３と同じ樹脂を使用することができる。チップ１６１の厚みは、必要な強度を確保できれば特に限定されない。
　なお、本実施の形態では、流路１６４を有する閉鎖系の細胞展開用デバイス１６０を使用したが、流路１６４を有さない開放系の細胞展開用デバイスを使用してもよい。すなわち、チップ１６１を細胞展開用デバイスとしても使用することもできる。
　また、本実施の形態では、平面形状の細胞収容部１６５について説明したが、細胞収容部１６５の構造は、平面形状に限定されない。図７は、他の細胞収容部の構造を示す図である。図７Ａに示されるように、細胞収容部１６５は、複数のマイクロチャンバー１６８を有していてもよい。「マイクロチャンバー」とは、１個または２個以上の細胞を収容し、保持するための微細な有底の凹部（マイクロウェル）を意味する。マイクロチャンバー１６８の開口部の形状は、特に限定されず、円形、楕円形および多角形が含まれる。また、マイクロチャンバー１６８の開口部の大きさは、特に限定されず、収容する細胞の種類や１個のマイクロチャンバー１６８に収容する細胞の数などに応じて適宜設定されうる。通常は、開口部の大きさは、マイクロチャンバー１６８の底面に１０～１５個程度の細胞が付着できる大きさであることが好ましい。また、図７Ｂに示されるように、細胞収容部１６５は、複数の溝１６９を有していてもよい。溝１６９の幅方向の断面面形状は、特に限定されず、Ｖ溝、Ｕ溝などが含まれる。溝１６９の幅は、特に限定されないが、細胞１個が収容される長さであることが好ましい。
　（細胞検出方法）
　次に、細胞検出装置１００を用いて、目的細胞を標識するための第１蛍光物質と、非目的細胞を標識するための第２蛍光物質と、により標識された細胞群中から目的細胞を検出する方法について説明する。ここでは、説明を簡略にするため、細胞群中に１個の目的細胞が含まれている場合を例に挙げて説明する。
　図８は、実施の形態１に係る細胞検出方法を説明するための図である。図８Ａは、第１工程および第２工程を説明するための図であり、図８Ｂは、第１照射スポットを第１の方向Ｄ１に走査したときに、第１蛍光物質からの蛍光が検出された場合のシグナルを示すグラフであり、図８Ｃは、第１照射スポットを第１の方向Ｄ１に走査したときに、第１蛍光物質からの蛍光が検出されなかった場合のシグナルを示すグラフであり、図８Ｄは、第２照射スポットを第２の方向に走査したときに、第１蛍光物質からの蛍光が検出された場合のシグナルを示すグラフであり、図８Ｅは、第２照射スポットを第２の方向に走査したときに、第１蛍光物質からの蛍光が検出されなかった場合のシグナルを示すグラフである。
　上述した細胞検出装置１００を用いて、細胞群から目的細胞を検出するには、まず、第１蛍光物質からの蛍光が検出された細胞の位置情報を取得する（第１工程）。次いで、第２蛍光物質からの蛍光が検出された細胞の位置情報を取得する（第２工程）。そして、第１工程および第２工程の検出結果に基づいて、目的細胞か否かを判定する（第３工程）。また、目的細胞の検出方法は、第３工程の後、撮像装置を用いて、判定した目的細胞を観察してもよい（第４工程）。
　まず、細胞収容部１６５に細胞群が収容されたチップ１６１（細胞展開用デバイス１６０）を準備する。たとえば、流路１６４内を細胞懸濁液（例えば、血液またはその希釈液）で満たした後、細胞懸濁液中の細胞がわずかに移動するように細胞懸濁液を吸引することを２０回繰り返して（１回の吸引後に１０秒間停止）、細胞収容部１６５内に細胞を収容する。そして、細胞収容部１６５の開口部が上側を向くように、細胞が収容されたチップ１６１（細胞展開用デバイス１６０）をホルダー１１０に保持させる。なお、検出対象となる目的細胞の種類は、特に限定されない。検出対象の細胞の例には、血液循環癌細胞（ＣＴＣ）や循環血管内皮細胞（ＣＥＣ）、循環血管内皮前駆細胞（ＣＥＰ）、循環胎児細胞、抗原特異的Ｔ細胞、各種幹細胞などが含まれる。
　図８Ａ～Ｃに示されるように、第１工程では、細胞群に、第１蛍光物質を励起するための励起光を照射して、第１蛍光物質からの蛍光を検出し、蛍光が検出された細胞の位置情報を取得する。まず、移動部１５０は、励起光の第１照射スポットＳ１が第１走査領域ＳＡ１の移動開始位置に位置するように、ホルダー１１０を介して細胞展開用デバイス１６０を移動させる。そして、移動部１５０は、第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）が、第１走査領域ＳＡ１の移動開始位置から移動終了位置まで移動するように、細胞展開用デバイス１６０を第１の方向Ｄ１と１８０°逆方向に移動させる。
　このとき、第１光照射装置１２１は、移動部１５０がホルダー１１０を第１の方向Ｄ１と１８０°逆方向に移動させている間、所定の波長の励起光を出射し続ける。すなわち、第１光照射装置１２１は、チャンバー列に含まれる細胞収容部１６５に収容された細胞（蛍光物質）に対して連続して励起光を照射する。蛍光物質は、励起光が照射されると同時に蛍光を発する。光検出部１３０は、このように放出される蛍光を連続して検出すると共に、蛍光が検出された細胞の第１の方向Ｄ１における位置情報を取得する。図８Ｂに示されるように、第１蛍光物質で標識された細胞が１個の場合、第１照射スポットＳ１の走査により、１つのピークが観察される。位置情報取得部は、蛍光の位置情報を基準位置に対するホルダー１１０（細胞展開用デバイス１６０）の移動距離として取得する。一方、第１走査領域ＳＡ１に第１蛍光物質がなかった場合には、図８Ｃに示されるように、ピークが観察されない。
　次いで、移動部１５０は、励起光の第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）が、次に互いに隣接する第１走査領域ＳＡ１の移動開始位置に移動するように、細胞展開用デバイス１６０を移動させる。以上の第１照射スポットＳ１の走査および移動を繰り返しながら、チップ１６１に励起光を照射しながら蛍光を検出するとともに、検出された蛍光が発した細胞の第１の方向Ｄ１における位置情報を取得する。
　図８Ａ，Ｄ，Ｅに示されるように、同様に、移動部１５０は、励起光の第１照射スポットＳ１が第２走査領域ＳＡ２を走査するように、ホルダー１１０を介して細胞展開用デバイス１６０を移動させて、検出された蛍光の第２の方向Ｄ２における位置情報を取得する。
　第２工程では、蛍光が検出された細胞に、第２蛍光物質を励起するための励起光を照射して、第２蛍光物質からの蛍光を検出する。移動部１５０は、第１工程で検出された蛍光の第１の方向Ｄ１および第２の方向Ｄ２における位置情報に基づいて、励起光の第２照射スポットＳ２を第３走査領域ＳＡ３に移動する。このとき、光照射部１２０は、第１工程で蛍光を発した細胞（蛍光物質）に対して励起光を照射する。第２蛍光物質は、励起光が照射されると同時に蛍光を発する。光検出部１３０は、このように放出される蛍光を検出する。
　第３工程では、第１工程および第２工程の結果に基づいて、第１工程で検出された細胞が目的細胞であるかどうかを判定する。具体的には、第１工程で蛍光が検出された位置（細胞）において、第２工程で蛍光が検出されるか否かを調べる。たとえば、第１工程で蛍光が検出されたが、第２工程で蛍光が検出されなかった場合、細胞は、第１蛍光物質のみによって、適切に標識されたものとなる。すなわち、第１工程で蛍光が検出されたが、第２工程で蛍光が検出されなかった細胞は、目的細胞であるということがわかる。一方、第１工程および第２工程で蛍光が検出された場合、細胞は、第１蛍光物質によって非特異的に標識されたものとなる。すなわち、第１工程および第２工程で蛍光が検出された細胞は、非目的細胞であるということがわかる。
　また、細胞を検出する方法は、目的細胞か否かを判定した後、検出された細胞を撮像して、細胞の詳細な形態などを観察してもよい（第４工程）。第４工程では、第１工程および第２工程で検出された細胞の位置情報に基づいて、移動部１５０により撮像部を移動させて目的細胞を撮像する。
　以上の手順により、多数の細胞から目的の希少細胞を正確に、高感度、かつ短時間で検出することができる。
　なお、本実施の形態では、各検出領域Ａ１，Ａ２について照射スポットＳ１，Ｓ２が１回走査する例について説明したが、各検出領域Ａ１，Ａ２について照射スポットＳ１，Ｓ２が２回走査するようにしてもよい。このようにすることで、より確実に希少細胞（目的細胞）を検出することができる。
　また、特に図示しないが、互いに隣接する第１走査領域ＳＡ１（または第２走査領域ＳＡ２）において、移動開始位置および移動終了位置は、互いに逆の位置に設定されていてもよい。この場合、移動部１５０は、第１照射スポットＳ１（第２照射スポットＳ２）が、第１走査領域ＳＡ１（第２走査領域ＳＡ２）の一方の端部（移動開始位置）から他方の端部（移動終了位置）まで第１の方向Ｄ１（第２の方向Ｄ２）に向かって移動するように、細胞展開用デバイス１６０を移動させる。次いで、第１走査領域ＳＡ１（第２走査領域ＳＡ２）の他方の端部の移動終了位置に到達した第１照射スポットＳ１（第２照射スポットＳ２）を、次の第１走査領域ＳＡ１（第２走査領域ＳＡ２）の移動開始位置に移動させる。このとき、次の第１走査領域ＳＡ１（第２走査領域ＳＡ２）の移動開始位置は、第１走査領域ＳＡ１（第２走査領域ＳＡ２）の移動終了位置に隣接して位置する端部である。最後に、次の第１走査領域ＳＡ１（第２走査領域ＳＡ２）の移動開始位置に到達した第１照射スポットＳ１（第２照射スポットＳ２）を、その第１走査領域ＳＡ１（第２走査領域ＳＡ２）の他方の端部に位置する移動終了位置に移動させる。このとき、次の第１走査領域ＳＡ１（第２走査領域ＳＡ２）の移動終了位置は、第１走査領域ＳＡ１（第２走査領域ＳＡ２）の移動開始位置に隣接して位置する端部である。これらの工程を、最後の走査領域を走査し終わるまで繰り返す。
　また、移動部１５０は、光照射部１２０、第１検出領域規定部１４１、第２検出領域規定部１４２および光検出部１３０を移動させてもよい。具体的には、ホルダー１１０を固定した状態で、第１検出領域規定部１４１、第２検出領域規定部１４２および光検出部１３０を水平方向（ＸＹ方向）に移動させることで、励起光の第１照射スポットＳ１および第２照射スポットＳ２でチップ１６１を走査してもよい。
　［実施の形態２］
　実施の形態２に係る細胞検出装置は、第１照射スポットＳ１の走査方法が実施の形態１に係る細胞検出装置と異なる。そこで、実施の形態１での第１照射スポットＳ１の走査方法と異なる部分について、主として説明する。なお、実施の形態２の細胞検出装置は、実施の形態１に係る細胞検出装置１００を用いて行うため、その説明を省略する。
　実施の形態２では、第１照射スポットＳ１は、第１走査領域ＳＡ１のみを走査する。具体的には、第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）を１個目の第１走査領域ＳＡ１の移動開始位置から移動終了位置へ移動させ、１個目の第１走査領域ＳＡ１の移動終了位置に到達した第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）を、２個目の第１走査領域ＳＡ１の移動開始位置に移動させる。この工程を、最後の第１走査領域ＳＡ１を走査し終わるまで繰り返す。すなわち、実施の形態２では、第１照射スポットＳ１の第２走査領域ＳＡ２の走査は、行わない。
　図９は、実施の形態２における第２照射スポットＳ２の走査を説明するための図である。図１０Ａは、第２蛍光物質からの蛍光が検出された場合のシグナルを示すグラフであり、図１０Ｂは、第２蛍光物質からの蛍光が検出された場合のシグナルを示すグラフである。
　図９Ａに示されるように、実施の形態２では、第３走査領域ＳＡ３は、第２の方向Ｄ２に延在していてもよい。このとき、第３走査領域ＳＡ３の第１の方向Ｄ１における位置は、第１照射スポットＳ１の走査時に得られた細胞の位置情報に基づいて決定される。そして、第２照射スポットＳ２を第３走査領域ＳＡ３の移動開始位置から移動終了位置まで、第２の方向Ｄ２に直線的に走査する。このとき、図１０Ａに示されるように、第２照射スポットＳ２の走査では、第２蛍光物質が多くの非目的細胞を標識しているため、ほとんどの第３走査領域ＳＡ３の領域で蛍光が検出され、目的細胞に相当する位置では、１つのマイナスのピークが観察される。一方、第２走査領域ＳＡ２に第１蛍光物質がなかった場合には、図１０Ｂに示されるように、マイナスのピークが観察されない。
　また、図９Ｂに示されるように、第３走査領域ＳＡ３は、第２の方向に複数配置されていてもよい。このとき、第３走査領域ＳＡ３の移動開始位置は第１の方向Ｄ１において、第１蛍光物質からの蛍光が検出された位置より走査方向の手前側であり、移動終了位置は第１の方向Ｄ１において、第１蛍光物質からの蛍光が検出された位置より走査方向の奥側である。具体的には、第３走査領域ＳＡ３の第１の方向Ｄ１における長さは、特に限定されず、例えば１細胞の長さ程度であってもよい。そして、実施の形態１と同様に、１個目の第３走査領域ＳＡ３から最後の第３走査領域ＳＡ３まで走査する。
　（細胞検出方法）
　実施の形態２に係る細胞を検出する方法の第１工程では、第１検出領域Ａ１を第１の方向Ｄ１に走査させて、蛍光が検出された細胞の第１の方向Ｄ１における位置情報を取得する。
　第２工程では、第１工程で得られた第１の方向Ｄ１における位置情報に基づいて、第２検出領域Ａ２を第１の方向Ｄ１または第２の方向Ｄ２に走査させ励起光を照射し、第２蛍光物質からの蛍光を検出する。このとき、第１の方向Ｄ１および第２の方向Ｄ２における第２照射スポットＳ２の長さは、１細胞以下であるため、適切に第２蛍光物質からの蛍光を検出することができる。
　以上のように、実施の形態２に係る細胞検出装置１００は、実施の形態１に係る細胞検出装置１００と同様の効果を有する。
　以下、本発明の実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
　［実施例１］
　１．細胞懸濁液の調製
　がん患者から採血した末梢血をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈して血液の希釈液を得た。次いで、血液の希釈液１ｍＬにパラホルムアルデヒド（和光純薬工業株式会社）を４質量％の濃度となるように添加した後、緩やかに混和して、室温暗所にて１５分間反応させた。さらにＰＢＳを十分量添加して混和した後、懸濁液を遠心分離器により遠心分離した。遠心分離後の沈澱物に０．１質量％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳを１ｍＬ、血液循環癌細胞（ＣＴＣ）標識用にAlexa Fluor 647で標識した抗ＣＫ抗体（Micromet社）溶液１０μＬおよび白血球標識用にAlexa Fluor 488（ライフテクノロジーズ・ジャパン株式会社）で標識した抗ＣＤ４５抗体１０μＬをそれぞれ添加した。混合溶液を緩やかに混和しながら、室温暗所にて２５分間反応させた。さらに、細胞核染色用にＤＡＰＩ溶液（同仁化学研究所）を１０μＬ添加して、緩やかに混和しながら、室温暗所にて５分間反応させた。そして、遠心分離後に上澄み液とともに、細胞に結合していない抗体および蛍光色素を除去した。沈澱物にＰＢＳを添加して再び懸濁させて、細胞懸濁液を得た。なお、この細胞懸濁液に含まれている血液循環癌細胞（ＣＴＣ）の数は、他の検出方法により特定されている。本実施例では、血液循環癌細胞：１００個、血液循環癌細胞を除く全細胞（白血球）：１．０×１０６個、当該白血球のうち、非特異的に標識された白血球：２００個であった。
　２．細胞の収容（平面に展開した細胞）
　縦：２５ｍｍ、横：５ｍｍの細胞収容部１６５（図６）を有するチップ１６１の上に、細胞懸濁液を滴下した後、枠体１６２および天板１６３を配置して、細胞展開用デバイス１６０を作製した。
　３．細胞の検出
　細胞検出装置１００（図１）を用いて、血液循環癌細胞（ＣＴＣ）の検出を行った。励起光は、ＣＴＣを標識したAlexa Fluor 647を励起するＨｅ－Ｎｅレーザー光（波長６３５ｎｍ）およびＣＤ４５を標識したAlexa Fluor 488を励起する半導体レーザー（波長４８８ｎｍ）を使用した。第１検出領域規定部１４１として光照射部１２０側に円形スリットを配置することで、第１照射スポットＳ１の形状を１００μｍφの円形とした。本実施例では、第１照射スポットＳ１および第１検出領域Ａ１は、一致している。
　第１照射スポットＳ１を第１の方向（Ｘ軸方向）Ｄ１に走査して、波長６３５ｎｍの励起光を照射するとともに、Alexa Fluor 647からの蛍光を検出し、蛍光が検出された細胞のＸ座標（位置情報）を取得した。次いで、第１照射スポットＳ１を第１の方向Ｄ１に直交する第２の方向Ｄ２（Ｙ軸方向）に走査して、波長６３５ｎｍの励起光を照射するとともに、Alexa Fluor 647からの蛍光を検出し、検出された細胞のＹ座標（位置情報）を取得した（第１工程）。このとき、第１照射スポットＳ１の第１の方向Ｄ１および第２の方向Ｄ２へ走査（励起光の照射、蛍光の検出および位置情報の取得）および第１走査領域ＳＡ１間の第１照射スポットＳ１の移動に要した合計時間は、約３分であった。
　次いで、第２照射スポットＳ２を、第１工程で得られた座標（位置情報）上に移動させて、波長４８８ｎｍの励起光を照射するとともに、Alexa Fluor 488からの蛍光を検出した（第２工程）。このとき、第２照射スポットＳ２の移動（励起光の照射および蛍光の検出）に要した合計時間は、約５分であった。
　最後に、第１工程および第２工程における蛍光の検出結果に基づいて、検出された細胞が目的細胞（血液循環癌細胞）か、非目的細胞（白血球）か、を判定した。
　４．結果
　実施の形態１に係る細胞検出方法により、血液循環癌細胞（ＣＴＣ）を正確に、高感度かつ短時間（合計約８分間）に検出することができた。また、検出したＣＴＣの数は、細胞展開用デバイス１６０内に導入したＣＴＣの数と完全に一致した（１００％）。
　［実施例２］
　１．チャンバーの前処理および細胞の収容
　深さ：５０μｍ、直径：１００μｍのマイクロチャンバー（図７Ａ）を２００００個有するチップ１６１の上に、枠体１６２および天板１６３を配置して、流路１６４を有する細胞展開用デバイス１６０を作製した。流路１６４内にブロッキング溶液（３質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を１６ｍＬ／ｍｉｎで送液した。その後、ＰＢＳを流路１６４内に送液することで、余分なブロッキング液を流路１６４内から除去した。ブロッキング液を除去した流路１６４内に１６ｍＬ／ｍｉｎの流速で上記の細胞懸濁液を１０μＬ送液し、１０秒間静止した。細胞懸濁液の送液および静止を繰り返すことで、細胞収容部１６５内にすべての細胞を収容した。
　２．細胞の検出
　実施例２でも、実施の形態１に係る細胞検出装置１００（図１）を用いて、血液循環癌細胞（ＣＴＣ）の検出を行った。検出領域規定部１４０は、本実施例でも、光照射部１２０側に配置した。検出領域規定部１４０としては、矩形スリットを使用した。第１照射スポットＳ１は、短辺：２０μｍ、長辺１００μｍの矩形である。また、第２照射スポットＳ２は、１０μｍφの円形とした。第１照射スポットＳ１および第２照射スポットＳ２の走査は、実施例１と同様に行った。
　３．結果
　このとき、第１照射スポットＳ１のＸ軸方向およびＹ軸方向へ走査（励起光の照射、蛍光の検出および位置情報の取得）および第１走査領域ＳＡ１間の第１照射スポットＳ１の移動に要した合計時間は、約２分であった。また、第２照射スポットＳ２の移動（励起光の照射および蛍光の検出）に要した合計時間は、約２５分であった。実施例２においても、検出したＣＴＣの数は、細胞展開用デバイス１６０内に導入したＣＴＣの数と完全に一致した（１００％）。
　［実施例３］
　１．チャンバーの前処理および細胞の収容
　溝幅：１０μｍ、溝深さ：２０μｍの溝が全面に形成された細胞収容部１６５（図７Ｂ）を有するチップ１６１に細胞懸濁液を滴下して、細胞収容部１６５内にすべての細胞を収容した。
　２．細胞の検出
　実施例３でも、実施の形態１に係る細胞検出装置１００（図１）を用いて、血液循環癌細胞（ＣＴＣ）の検出を行った。検出領域規定部１４０は、本実施例でも、光照射部１２０側に配置した。検出領域規定部１４０としては、矩形スリットを使用した。第１照射スポットＳ１は、短辺：１０μｍ、長辺２００μｍの矩形である。また、第２照射スポットＳ２は、１０μｍφの円形とした。第１工程は、第１照射スポットＳ１を１個目の第１走査領域ＳＡ１から最後の第１走査領域ＳＡ１まで第１の方向Ｄ１に走査させた。すなわち、第１工程では、第１照射スポットＳ１は、第２走査領域ＳＡ２を走査させていない。第２工程は、第２照射スポットＳ２を第２の方向Ｄ２に直線的に走査させることで行った。
　３．結果
　第１照射スポットＳ１のＸ軸方向へ走査（励起光の照射、蛍光の検出および位置情報の取得）および第１走査領域ＳＡ１間の第１照射スポットＳ１の移動に要した合計時間は、約１分であった。また、第２照射スポットＳ２の移動（励起光の照射および蛍光の検出）に要した合計時間は、約５分であった。実施例３に置いても、検出したＣＴＣの数は、細胞展開用デバイス１６０内に導入したＣＴＣの数と完全に一致した（１００％）。
　［比較例］
　１．細胞の検出
　比較例では、マイクロアレイスキャナーを用いて、血液循環癌細胞（ＣＴＣ）の検出を行った。比較例では、細胞展開用デバイス１６０の代わりに、平面基板上に細胞懸濁液を展開した。照射スポットの形状は、直径５μｍの円形である。基板全面（２５ｍｍ×７５ｍｍ）における蛍光の検出に要した時間は、約４０分であった。
　２．結果
　比較例においても、実施例１～実施例３と同様に、ＣＴＣを検出することができた。また、検出したＣＴＣの数は、細胞展開用デバイス１６０内に導入したＣＴＣの数とほぼ一致した（９８％）。しかし、照射スポットが直径５μｍのマイクロアレイスキャナーを用いた検出のため、検出時間が約４０分と非常に長くなってしまった。
　以上の結果から、本発明に係る細胞検出装置およびこの細胞検出装置を用いた細胞検出方法は、照射スポットが直径５μｍ程度のマイクロアレイスキャナーを用いた細胞検出と同程度以上の感度で、かつ短時間に希少細胞を検出することができることがわかる。
　本出願は、２０１３年１２月１６日出願の特願２０１３－２５９２２４に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
　本発明の細胞検出方法および細胞検出装置は、正確に、高感度かつ短時間で希少細胞を検出することができるため、例えば疾患の検査などに有用である。
　１００　細胞検出装置
　１１０　ホルダー
　１２０　光照射部
　１２１　第１光照射装置
　１２２　第２光照射装置
　１３０　光検出部
　１３１　第１レンズ
　１３２　第１ダイクロイックミラー
　１３３　第２レンズ
　１３４　第２ダイクロイックミラー
　１３５　対物レンズ
　１３６　フィルター
　１３７　ピンホール
　１３８　第３レンズ
　１３９　第４レンズ
　１４０　検出領域規定部
　１４１　第１検出領域規定部
　１４２　第２検出領域規定部
　１５０　移動部
　１５１　Ｘ軸移動機構
　１５２　Ｙ軸移動機構
　１６０　細胞展開用デバイス
　１６１　チップ
　１６２　枠体
　１６３　天板
　１６４　流路
　１６５　細胞収容部
　１６６　導入口
　１６７　排出口
　１６８　マイクロチャンバー
　１６９　溝
　Ａ１　第１検出領域
　Ａ２　第２検出領域
　Ｓ１　第１照射スポット
　Ｓ２　第２照射スポット
　ＳＡ１　第１走査領域
　ＳＡ２　第２走査領域
　ＳＡ３　第３走査領域

Claims (10)

  1. 　目的細胞を標識するための第１蛍光物質と、非目的細胞を標識するための第２蛍光物質と、により標識された細胞群から前記目的細胞を検出する方法であって、
    　前記細胞群に、前記第１蛍光物質を励起するための励起光を照射して蛍光を検出し、蛍光が検出された細胞の位置情報を取得する第１工程と、
    　前記蛍光が検出された細胞に、前記第２蛍光物質を励起するための励起光を照射して蛍光を検出し、蛍光が検出された細胞の位置情報を取得する第２工程と、
    　前記第１工程および前記第２工程の検出結果に基づいて、前記第１工程で検出された細胞が前記目的細胞であるかどうかを判定する第３工程と、
    　を有し、
    　前記第１工程では、走査方向に直交する方向の長さが前記細胞群の細胞２個分以上の第１検出領域を走査させ、
    　前記第２工程では、前記走査方向および前記走査方向に直交する方向の長さが前記細胞群の細胞１個分以下の第２検出領域を、前記蛍光が検出された細胞に移動させる、
    　細胞検出方法。
  2. 　前記第１工程は、前記第１検出領域を第１の方向および前記第１の方向に直交する方向である第２の方向に走査させて、前記蛍光が検出された細胞の前記第１の方向および前記第２の方向における位置情報を取得し、
    　前記第２工程は、前記第２検出領域を、前記第１工程で得られた前記第１の方向および前記第２の方向における位置情報に基づいて、前記蛍光が検出された細胞に移動させる、
    　請求項１に記載の細胞検出方法。
  3. 　前記第１工程は、前記第１検出領域を前記第１の方向に走査させて、前記蛍光が検出された細胞の前記第１の方向における位置情報を取得し、
    　前記第２工程は、前記第２検出領域を、前記第１工程で得られた前記第１の方向における位置情報に基づいて、前記第２の方向に走査させる、
    　請求項１に記載の細胞検出方法。
  4. 　前記第１工程は、前記第１検出領域を前記第１の方向に走査させて、前記蛍光が検出された細胞の前記第１の方向における位置情報を取得し、
    　前記第２工程は、前記第２検出領域を、前記第１工程で得られた前記第１の方向における位置情報に基づいて、前記第１の方向および前記第２の方向に走査させる、
    　請求項１に記載の細胞検出方法。
  5. 　前記第１検出領域は、矩形または楕円形であり、
    　前記第１検出領域の前記走査方向に直交する方向における長さは、１０～２００μｍの範囲内であり、
    　前記第２検出領域は、円形または矩形であり、
    　前記第２検出領域の前記走査方向および前記走査方向に直交する方向における長さは、５～２５μｍの範囲内である、
    　請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞検出方法。
  6. 　前記第３工程で判定された前記目的細胞を撮像する第４工程をさらに有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞検出方法。
  7. 　目的細胞を標識するための第１蛍光物質と、非目的細胞を検出するための第２蛍光物質とにより標識された細胞群が細胞収容部に収容されているチップを保持するためのホルダーと、
    　前記チップに前記第１蛍光物質を励起するための励起光および前記第２蛍光物質を励起するための励起光を別個に照射する光照射部と、
    　前記光照射部から照射された励起光により前記第１蛍光物質からの蛍光および前記第２蛍光物質からの蛍光を検出する光検出部と、
    　前記光検出部により検出した前記第１蛍光物質から蛍光を発した細胞および前記第２蛍光物質から蛍光を発した細胞の位置情報を取得する位置情報取得部と、
    　前記光照射部と前記ホルダーとの間、または前記ホルダーと前記光検出部との間に配置され、前記第１蛍光物質からの蛍光を検出するための第１検出領域を規定する第１検出領域規定部と、
    　前記光照射部と前記ホルダーとの間、または前記ホルダーと前記光検出部との間に配置され、前記第２蛍光物質からの蛍光を検出するための第２検出領域を規定する第２検出領域規定部と、
    　前記チップにおける前記第１検出領域および前記第２検出領域を、第１の方向および前記第１の方向に直交する第２の方向に走査させるために、前記ホルダーと、前記光照射部、前記第１検出領域規定部、前記第２検出領域規定部および前記光検出部とを相対的に移動させる移動部と、
    　を有し、
    　走査方向に直交する方向における前記第１検出領域の長さは、前記細胞群の細胞２個分以上であり、
    　前記走査方向および前記走査方向に直交する方向における前記第２検出領域の長さは、前記細胞群の細胞１個分以下である、
    　細胞検出装置。
  8. 　前記第１検出領域は、矩形または楕円形であり、
    　前記第１検出領域の前記走査方向に直交する方向における長さは、１０～２００μｍの範囲内であり、
    　前記第２検出領域は、円形または矩形であり、
    　前記第２検出領域の前記走査方向および前記走査方向に直交する方向における長さは、５～２５μｍの範囲内である、
    　請求項７に記載の細胞検出装置。
  9. 　前記光検出部による前記蛍光の検出結果および前記位置情報取得部による前記蛍光の前記位置情報に基づいて、前記第１蛍光物質から蛍光を発した細胞を撮像する撮像部をさらに有する、請求項７または請求項８に記載の細胞検出装置。
  10. 　前記細胞収容部は、平板形状、マイクロチャンバー形状、または溝形状である、請求項７～９のいずれか一項に記載の細胞検出装置。
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