WO2016121574A1 - 相互作用する分子を有する血中細胞の同時検出方法 - Google Patents

相互作用する分子を有する血中細胞の同時検出方法 Download PDF

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茉奈美 増渕
恒子 千代田
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コニカミノルタ株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a method for simultaneously detecting both a first target cell and a second target cell.
  • Blood usually contains blood cells such as red blood cells and white blood cells (neutrophils, eosinophils, basophils, lymphocytes, monocytes), but also circulating tumor cells (CTCs: Circulating Tumor Cells).
  • CTCs Circulating Tumor Cells
  • rare cells such as circulating vascular endothelial cells (CECs: Circulating Endothelial Cells), circulating vascular endothelial precursor cells (CEPs: Circulating Endothelial Progenitors), and other precursor cells may be included.
  • the cultured cell population may include stem cells, specific differentiated cells, and other characteristic cells.
  • CTC is a cell found in the blood of patients such as breast cancer, lung cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, etc., and its number reflects the metastatic nature of the cancer. Attention has been paid.
  • the density of CTC in the blood is extremely low (in the case of low, about 1 to 10 per 10 mL of whole blood), and its detection and counting are not easy.
  • a method for detecting CTC or the like from blood by performing nuclear staining or fluorescent staining when detecting rare cells such as CTC and characteristic cells is known.
  • Profiling CTC-expressing biomarkers using such means elucidates the mechanism of metastasis through comparison with profiling of biomarkers of the primary cancer, and is useful anti-cancer agent Important to promote CTC research from various points of view, such as determining molecular target drugs and identifying CTC subpopulations (CTCs with epithelial cells, mesenchymal cells, stem cells, etc.) It is.
  • Non-patent Document 1 the above mechanism comprising a substance that binds to PD-1 molecule expressed on leukocytes and inhibits interaction with PD-L1 molecule expressed on cancer cells, for example, an anti-PD-1 antibody as an active ingredient Therapeutic drugs that relieve immune suppression caused by the drug have been developed.
  • anti-PD-L1 antibody a substance that binds to PD-L1 molecule expressed on cancer cells and inhibits interaction with PD-1 molecule expressed on leukocytes, for example, anti-PD-L1 antibody is used as an active ingredient.
  • anti-PD-L1 antibody a substance that binds to PD-L1 molecule expressed on cancer cells and inhibits interaction with PD-1 molecule expressed on leukocytes.
  • anti-PD-L1 antibody for example, anti-PD-L1 antibody is used as an active ingredient.
  • the development of therapeutic drugs is also possible.
  • PD-1 molecule and PD-L1 molecule are expressed on leukocytes and cancer cells, respectively. Therefore, it is assumed that the immune system is in a suppressed state. For example, even if PD-1 molecule is expressed on leukocytes, if PD-L1 molecule is not expressed on cancer cells, leukocytes should be able to attack cancer cells without being immunosuppressed in the first place.
  • anti-cancer agents related to other mechanisms of action and leukocyte immunopotentiators are effective. Can be a therapeutic drug. This is true even when PD-L1 molecules are expressed in cancer cells, but PD-1 molecules are not expressed on leukocytes.
  • Non-Patent Document 2 In this way, in determining the administration of a therapeutic agent related to the interaction between two types of cells, information on molecular expression in both cells can be obtained regardless of which cell the molecule targeted by the therapeutic agent is present on. It is necessary to examine at the same time. For example, when an anti-PD-1 antibody is used as a therapeutic agent for cancer immunotherapy, not only information on the expression of a molecule on white blood cells (PD-1) but also a cancer that interacts with the PD-1 molecule Information on the expression of PD-L1 molecules on cells is also required, and therapeutic effects are not obtained even if anti-PD-1 antibody is administered to cancer patients that do not express PD-L1 molecules on cancer cells (Non-Patent Document 2).
  • Patent Document 2 describes a method for detecting CTC by using a blood sample derived from a patient such as cancer and performing image processing of a fluorescence image and a cell / nucleus morphological image staining a nucleus and a predetermined cell marker. Has been.
  • CTCs cells with nuclei stained are regarded as CTCs and non-CTC cells (white blood cells) as a whole, and the total number of cells is counted, or cells showing a staining pattern of a predetermined cell marker are identified as CTCs. Then, based on those results, the ratio of the number of CTCs to the total number of cells and the concentration of CTC in the blood sample are calculated, and a blood sample derived from a patient such as cancer The CTC included in is analyzed.
  • non-CTC cells as well as CTCs are to be analyzed (not only for identification and counting), but in particular, CTC expressing a predetermined molecule on the cell surface and a predetermined molecule that interacts with the molecule on the cell surface There is no specific mention of analyzing both leukocytes expressed in the same standard simultaneously.
  • the applicant was able to efficiently collect the cell suspension and necessary reagents in the respective microchambers by sequentially feeding them into the channel using the above-described device for cell deployment.
  • a method for amplifying nucleic acid contained in cells by PCR or the like has been invented, and an invention relating to the method has been filed earlier (application number: Japanese Patent Application No. 2014-191129, filing date: September 19, 2014) Day).
  • each expression state expression presence / absence / expression of molecules expressed on interacting leukocytes and molecules expressed on CTC (cancer cells).
  • CTC cancer cells
  • the present inventor performed staining of each cell marker and nucleus to identify the first target cell and the second target cell.
  • the respective expression states are measured on the same basis.
  • the inventors have found that it is possible to analyze the expression level information of each of the molecules A and B, and have completed the present invention.
  • the present invention provides a method for simultaneous detection of blood cells including the following steps (a) to (f): (a) a step of removing red blood cells from a patient's blood (sample processing step); b) adding a predetermined amount of blood treated in step (a) to the cell development substrate and arranging the first target cell and the second target cell on the substrate (cell development step); (C) a step of staining each cell marker and nuclear marker of the first target cell and the second target cell with a phosphor (staining step); (D) a step of acquiring fluorescent images of each cell marker and nuclear marker stained in step (c) (image acquisition step); (E) a step of identifying the first target cell and the second target cell from the fluorescence image of each cell marker and nuclear marker acquired in step (d) (identification step); (F) a cell expressing a specific molecule (molecule A) among the cells identified as the first target cell in step (e), and a cell identified as the second target cell in step (e)
  • the molecular expression information of the first target cell and the molecular expression information of the second target cell can be obtained on the same basis by the method of the present invention. Thereby, it can be expected to improve the reliability of the determination of medication for treatment such as cancer immunotherapy, which needs to be determined from information relating to both.
  • a molecule A for example, PD-L1 expressed in CTC
  • a molecule B for example, PD-1 expressed in leukocytes
  • FIG. 1 is a flowchart showing an embodiment of a method for simultaneously detecting a first target cell and a second target cell according to the present invention.
  • the simultaneous detection method of the first target cell and the second target cell in the present invention includes at least (a) a specimen processing step, (b) a cell expansion step, (c) a staining step, (d) an image acquisition step, (e And (f) a detection step, and (g) a data presentation step may be further included as necessary.
  • a detection method can be implemented, for example, according to the procedure according to the flowchart shown in FIG.
  • Target cell There are two types of target cells in the present invention, and these are not at least erythrocytes.
  • the first target cell is, for example, a rare cell, and includes CTC, CEC, CEP and other progenitor cells, and the second target cell is, for example, a white blood cell (lymphocyte).
  • the target molecules in the present invention are two types of molecules (proteins, particularly antigens that can be immunostained in the first embodiment) expressed on the cell surfaces of the first target cells and the second target cells, respectively. It refers to things that interact with each other.
  • the specific molecule expressed by the first target cell is referred to as “molecule A”
  • the specific molecule expressed by the second target cell is referred to as “molecule B”.
  • the target molecule may be selected in consideration of the use of the quantification or detection method of the present invention such as pathological diagnosis, and is not particularly limited.
  • Typical target molecules in the present invention include PD-L1 expressed on CTC and interacting with PD-1, and PD-1 expressed on leukocytes (T cells). These molecules are known to suppress immunity by interacting.
  • Blood Blood
  • Blood “Blood” as described herein is intended to include any component of whole blood, including red blood cells, white blood cells, platelets, endothelial cells, mesothelial cells or epithelial cells. Blood is also a component of plasma such as proteins, lipids, nucleic acids and carbohydrates, and any other cells that may be present in the blood due to pregnancy, organ transplantation, infection, trauma or disease, such as CTC, CEC, CEP Including rare cells such as other progenitor cells.
  • Leukocytes as described herein are leukocytes or cells of the hematopoietic lineage that are not reticulocytes or platelets.
  • Leukocytes include lymphocytes such as natural killer cells (“NK cells”), B cells and T cells.
  • NK cells natural killer cells
  • Leukocytes also include phagocytic cells and mast cells such as monocytes, macrophages, granulocytes.
  • erythrocytes are erythrocytes, particularly non-nucleated red blood cells.
  • Gramulocytes As described above, “granulocytes” described herein are a part of cells contained in leukocytes, and include neutrophils, eosinophils and basophils.
  • the method for simultaneous detection of blood cells according to the present invention can include two embodiments according to the step (f): how to perform the detection step.
  • the first target cell expressing the molecule A and the second target cell expressing the molecule B are detected based on the fluorescent staining of the molecule A and the molecule B.
  • a cell deployment substrate having a microchamber is used, and the molecule A is expressed based on the nucleic acid amplification reaction of each gene of the molecule A and the molecule B in the microchamber.
  • a second target cell expressing molecule B is detected.
  • the specimen processing step (a) is at least a step of removing red blood cells from the patient's blood.
  • the specimen processing step (a) is at least a step of removing red blood cells from the patient's blood.
  • a patient includes not only a subject suffering from cancer or the like but also a subject suspected of suffering from the disease.
  • Anti-coagulation treatment The blood collected and taken out of the body (whole blood) coagulates as time passes when exposed to air as it is, and the cells contained therein cannot be collected and observed. Therefore, it is preferable that the collected blood is immediately subjected to anticoagulation treatment.
  • anticoagulants for whole blood are known and can be used according to conditions such as general concentration and treatment time.
  • anticoagulant of the type that inhibits coagulation by binding to calcium ion by chelating action and removing it from the reaction system represented by ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and citric acid (including salts such as sodium salt)
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • citric acid including salts such as sodium salt
  • anticoagulant of the type that inhibits coagulation by forming a complex with antithrombin III in plasma represented by heparin, and suppressing the production of thrombin.
  • a blood collection tube in which such an anticoagulant is previously stored may be used.
  • immobilization treatment that delays cell autolysis and decay and retains its morphology and antigenicity; improves the permeability of the cell membrane and allows substances (from outside the cell to inside the cell)
  • Permeabilization treatment for facilitating penetration of fluorescently labeled antibodies that target antigens in cells, nuclear stains, etc.
  • Sites involved in immobilization of cells such as microchambers on cell development substrates
  • the immobilization process, the permeabilization process, and the blocking process are not performed at the same time as the specimen processing process, these processes may be performed at the same time as the staining process, as will be described later.
  • the cells When observing the expanded cells, the cells must be expanded so that the target cells do not overlap each other in the observation region. For this purpose, it is necessary to remove from the specimen red blood cells that account for about 96% of the formed components in the blood. By removing red blood cells, unnecessary overlapping of cells can be suppressed, and target cells can be efficiently developed to detect rare cells without reducing detection sensitivity.
  • the means for removing red blood cells is not particularly limited, but for example, red blood cells may be hemolyzed using ammonium chloride or the like.
  • the cell fraction containing at least the first target cell and the second target cell may be purified by separating red blood cells and other cells by centrifugation. These techniques are known and can be performed using appropriate centrifuges and centrifugation conditions.
  • density gradient centrifugation is known as a method capable of fractionating components in blood containing various cells according to specific gravity.
  • to remove red blood cells contained in a large amount in blood preferably further remove granulocytes, and use only the cell fraction containing the first target cell and the second target cell for the cell expansion step
  • the separation liquid used for the density gradient centrifugation method may have any specific gravity suitable for the fractionation of cells in blood and an osmotic pressure and pH that do not destroy the cells.
  • any specific gravity suitable for the fractionation of cells in blood and an osmotic pressure and pH that do not destroy the cells.
  • commercially available sucrose solutions such as Ficoll (registered trademark) and Percoll (registered trademark) can be used.
  • density gradient centrifugation is performed after adjusting the specific gravity of this separated liquid to be smaller than the specific gravity of red blood cells and larger than the specific gravity of white blood cells, the blood sample is divided into ⁇ a fraction rich in red blood cells '' and ⁇ other than red blood cells '' Can be separated into at least two layers.
  • nucleated cells other than erythrocytes that is, first target cells
  • ratio of red blood cells in a fraction containing a large amount of the second target cells can be suppressed to 2 to 6% or less.
  • lymphocytes such as T cells among the white blood cells are used as the second target cells.
  • the target cell (lymphocyte) and the first target cell (CTC) can be separated from red blood cells and white blood cells (granulocytes, etc.) other than the second target cell.
  • two or more kinds of separation liquids having different specific gravities may be used in combination. For example, if a separation liquid having a specific gravity of about 1.077 and about 1.113 is used in combination, a fraction containing a large amount of the second target cell and a fraction containing a lot of granulocytes can be obtained.
  • the cell expansion step (b) is a step of adding a predetermined amount of blood processed in the specimen processing step (a) to the cell expansion substrate and arranging the first target cell and the second target cell on the substrate. is there.
  • the cell expansion substrate in the present invention typically corresponds to a device substrate (channel substrate) used in a cell observation method described later, and forms a channel in combination with a channel forming member. By introducing the cell suspension into the channel, the cells in the cell suspension are used on the surface of the cell development substrate.
  • the cell development substrate in the present invention is formed with a fine chamber (microchamber) or groove so that cells in the cell suspension can be collected in a state suitable for fluorescence observation or nucleic acid analysis. Is preferred.
  • the groove width of the groove is in the range of 1 to 100 ⁇ m and the groove depth is in the range of 1 to 100 ⁇ m. If the dimensions are within such a range, the cells can be reliably deployed in the groove.
  • the cross-sectional shape of the groove is not particularly limited, but a V-shaped cross section is preferable because cells can be arranged closely. In addition to the V shape, for example, only one side surface of the groove may be inclined, the top and bottom of the groove may be rounded, or a U-shaped groove.
  • channel of the said dimension makes the groove width and groove depth the same dimension. If it sets in this way, while it becomes difficult for the cell which once entered in the groove
  • the groove can be processed by a known fine processing technique, but for example, a commercially available prism sheet can be substituted.
  • the prism sheet is a plate in which grooves of the same size are arranged in a plurality of rows on the upper surface of a flat plate, and the groove width and depth of the grooves that meet the above preferred ranges are commercially available.
  • the shape of the microchamber is not particularly limited.
  • an inverted frustoconical shape having a flat bottom surface and a tapered side surface is preferable.
  • the diameter and depth of the bottom surface of the microchamber can be adjusted as appropriate so that a suitable number of cells can be collected and accommodated for nucleic acid analysis and staining image observation.
  • the bottom surface has a diameter of 20 to 500 ⁇ m and a depth of 20 to 500 ⁇ m so as to accommodate 1 to 100 cells per microchamber.
  • the diameter of various cells (excluding red blood cells) in blood is generally 5 to 100 ⁇ m, and the diameter of rare cells such as CTC is said to be about 10 to 100 ⁇ m.
  • the size of the irradiation region is, for example, an ellipse having a major axis of about 100 ⁇ m and a minor axis of about 10 ⁇ m.
  • the size of the bottom surface of the microchamber is larger than the size of the irradiation area of the laser diode, and when one microchamber is irradiated with light, the light is irradiated across the adjacent microchambers. It is appropriate that no fluorescence is emitted from the microchambers simultaneously.
  • the arrangement of the plurality of microchambers on the surface of the cell development substrate is not particularly limited, but the cell recovery rate (the ratio of cells recovered in the microchamber out of all the cells in the suspension) ) Is preferably adjusted so that the orientation of the array and the spacing between the microchambers are as high as possible.
  • the microchambers it is preferable to arrange the microchambers so that the cells settle in the microchamber at at least one location from the inlet to the outlet when the cell suspension is fed into the flow path.
  • substrate materials include glass; organic plastics such as polycarbonate and polymethyl methacrylate, polyolefins; polyamides; polyesters; silicones; polyurethanes; epoxies; Polyacrylate; Polyester; Polysulfone; Polymethacrylate; Polycarbonate; PEEK; Polyimide; Polystyrene; and one or more of fluoropolymers may be included.
  • organic plastics such as polycarbonate and polymethyl methacrylate, polyolefins; polyamides; polyesters; silicones; polyurethanes; epoxies; Polyacrylate; Polyester; Polysulfone; Polymethacrylate; Polycarbonate; PEEK; Polyimide; Polystyrene; and one or more of fluoropolymers may be included.
  • the cell deployment substrate may be made of a material that allows cells to adhere easily.
  • Cell immobilization method material and structure of substrate for cell development
  • Cell immobilization methods include a method (structure method) that limits the range in which cells can move depending on the structure of the surface of the cell deployment substrate, and physics generated by the surface properties of the cell deployment substrate. It can be broadly divided into a method (interactive method) that prevents cells from adsorbing by dynamic interaction.
  • the property of the inner surface of the microchamber, particularly the bottom surface or the inside of the groove is made into a property that cells can be easily adsorbed by the interaction, that is, cell adhesion.
  • cells are easily adsorbed by physical (intermolecular) interaction, such as plastic or glass such as polystyrene, polymethylmethacrylate, or polycarbonate, on the inner wall surface of the microchamber or groove or the entire cell development substrate.
  • the property that cells are easily adsorbed is limited to only necessary portions such as a micro chamber or an inner wall surface of a groove.
  • a method of coating the inner wall surface of the microchamber or groove with a molecule that improves cell adhesion, such as poly-L-lysine can be mentioned.
  • a portion of the surface of the cell development substrate other than the inside of the microchamber or groove is treated with a blocking agent so as not to adsorb cells, or is moderately hydrophilic by UV ozone treatment or oxygen plasma treatment in which UV is irradiated in an air atmosphere.
  • a blocking agent so as not to adsorb cells, or is moderately hydrophilic by UV ozone treatment or oxygen plasma treatment in which UV is irradiated in an air atmosphere.
  • UV ozone treatment oxygen plasma treatment in which UV is irradiated in an air atmosphere.
  • a material that is easy to adsorb cells is exposed, so that the cells are adsorbed there and do not go out of the microchamber or groove again by the flow of the cell suspension. Can be.
  • a step of feeding a pre-wet solution for the purpose of improving the wettability of the surface of the cell spreading substrate may be provided prior to feeding the cell suspension.
  • the cell deployment substrate is made of a hydrophobic material such as polystyrene, even if the cell suspension is introduced into the channel, bubbles remain in the microchamber or groove due to surface tension. Thus, the cell suspension may not be able to fill all the microchambers or grooves.
  • an organic solvent having a low surface tension such as an aqueous solution of ethanol, is introduced into the flow path as a pre-wet liquid in advance before the cell suspension is spread on the surface of the cell spreading substrate.
  • the wettability of the surface of the cell development substrate can be improved.
  • physiological saline or pure water such as PBS is passed to replace and wash the pre-wet liquid, and then the cell suspension is passed.
  • the suspension enters the interior of almost any microchamber or groove, allowing the cells to be collected efficiently.
  • the pre-wet solution is not particularly limited as long as it is an aqueous solution having a surface tension lower than that of water.
  • an aqueous solution containing alcohols such as ethanol, methanol, isopropyl alcohol, preferably 30% (w / v )
  • An aqueous ethanol solution having the following concentration, or an aqueous solution containing 0.01 to 1% (w / v) of a surfactant such as Tween (registered trademark) 20, Triton X (registered trademark), or SDS can be used.
  • each marker molecule and nuclear marker of the first target cell and the second target cell are stained with a phosphor.
  • the molecule A expressed in the first target cell The molecule B, which is expressed in the second target cell and interacts with the molecule A, is stained with a phosphor. Staining with such a phosphor can be performed by using a fluorescently labeled antibody prepared from a specific antibody and a phosphor for each of the marker molecules of the first target cell and the second target cell, and the first target cell.
  • fluorescent staining using a fluorescently labeled antibody prepared from an antibody specific to each of the molecule A possessed by and the molecule B possessed by the second target cell and a phosphor, and a nuclear marker staining agent that emits fluorescence. It can be carried out.
  • a staining solution which is an aqueous solution in which a fluorescently labeled antibody or a nuclear staining agent is dissolved, is fed to a channel provided on the cell development substrate, and the channel is filled on the cell development substrate for a predetermined time.
  • the fluorescently labeled antibody may be bound to the antigen of the cells by bringing the cells contained in the microchamber or groove into contact with the staining solution.
  • a fluorescently labeled antibody against each of the marker and the target molecule can be prepared by a known technique. For example, by using various commercially available monoclonal antibodies and fluorescent labeling kits, according to the attached protocol, each of the predetermined functional groups of the monoclonal antibody and the fluorescent dye are reacted in the presence of a predetermined reagent.
  • a desired fluorescently labeled antibody can be prepared by binding or by using a biotin-avidin bond.
  • the phosphor for immunostaining is not particularly limited.
  • various known phosphors fluorescent dyes.
  • a fluorescent material having an appropriate excitation light wavelength and fluorescence wavelength may be selected and used so that each fluorescence can be measured well by using a plurality of cut filters.
  • the marker molecule used for immunostaining the first target cell and the second target cell can be identified in a sample that can be identified by a known microscopic technique, histological technique, or molecular biological technique.
  • Cells such as surface antigens, transmembrane receptors or co-receptors, proteins bound or aggregated on the surface, macromolecules such as carbohydrates, and cells such as cytoplasmic or nuclear components Including, but not limited to, internal components.
  • EpCAM epithelial cell adhesion molecule
  • MCF-7 Epithelial cell adhesion molecule
  • the protein expressed inside the cell include cytokeratin that is positive in CTC and negative in leukocytes. That is, EpCAM, cytokeratin, or the like can be used as a cell marker for CTC, and CD45 or the like can be used as a cell marker for leukocytes.
  • the cells When immunostaining is performed on these exemplified antigens (cell markers), if cells that are negative for CD45 and positive for cytokeratin are detected, the cells are CTC, positive for CD45, and positive for cytokeratin. If a negative cell is detected, it can be determined that the cell is a leukocyte.
  • the time for the staining step that is, the time for contacting the cells with the fluorescently labeled antibody solution can be adjusted appropriately so that immunostaining is sufficiently performed according to the case of performing general fluorescent immunostaining. It may be about 5 minutes to half a day.
  • the temperature of the staining step that is, the reaction temperature can be appropriately adjusted so that immunostaining is sufficiently performed in accordance with the case of performing general fluorescent immunostaining, but it is usually about 4 to 37 ° C. .
  • nuclear staining in order to identify a nucleated cell regardless of whether it is a first target cell or a second target cell, staining for a nuclear marker (nuclear staining) is also performed.
  • a nuclear staining it is preferable to use a fluorescent dye (molecule) that emits fluorescence by intercalating into double-stranded DNA.
  • fluorescent dyes are known as “nuclear stains”.
  • Hoechst dyes Hoechst 33342, Hoechst 33258, etc.
  • DAPI ', 6-diamidino-2-phenylindole
  • DAPI is capable of nuclear staining of dead cells that have become permeabilized because the cell membrane has been altered because it is not permeable to cell membranes.
  • Immunostaining for each of molecule A and molecule B is performed simultaneously with immunostaining for each cell marker of the first target cell and the second target cell, that is, these markers and molecules A and B are simultaneously subjected to multiple staining. Also good.
  • the antibody staining each cell marker is removed and immunostained with an antibody specific to molecule A and molecule B. May be detected. On the contrary, it is also possible to remove the antibody staining the molecule A and the molecule B and then newly perform immunostaining with each cell marker.
  • each cell marker of the first target cell and the second target cell is first used with a staining solution containing a fluorescently labeled antibody corresponding to the cell marker of the first target cell and the second target cell.
  • Perform fluorescent immunostaining This staining solution further contains a nuclear stain so that cell nuclei can be stained simultaneously.
  • the fluorescence-labeled antibody bound to each marker of the first target cell and the second target cell is dissociated by bringing the cell into contact with the dissociation solution.
  • a fluorescent substance that is bound in a manner other than the antigen-antibody reaction, such as a nuclear stain remains substantially unaffected by the dissociator.
  • each target molecule is subjected to fluorescent immunostaining in the same procedure using a staining solution containing fluorescently labeled antibodies corresponding to the molecules A and B.
  • the dissociating agent a substance having an action of weakening the affinity that contributes to the binding of the antigen-antibody reaction can be used, and examples thereof include acids, alkalis, salts, and surfactants. Of these, acids are preferred because of their relatively small damage to cell membranes and antigens, and their pH is preferably 1.0 to 6.0.
  • the acid may be an inorganic acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, or an organic acid such as carboxylic acid (formic acid, acetic acid, citric acid, oxalic acid, etc.) or sulfonic acid.
  • a salt having a buffering action such as hydrochloride (pH of about 1.5 to 3) may be formed.
  • surfactants have the property of destroying cell membranes (used as penetrants), so damage to cells is stronger than acids, and alkalis and salts are more damaging to antigens than acids, but are used as dissociators. It is also possible.
  • alkali for example, sodium hydroxide, glycine-sodium hydroxide salt (buffer solution having a pH of about 11) can be used.
  • salt for example, sodium chloride and ammonium sulfate can be used.
  • SDS, guanidine hydrochloride, or potassium thiosulfate can be used as the surfactant.
  • the time for the antigen-antibody dissociation step that is, the time for bringing the cells into contact with the dissociation solution can be appropriately adjusted so as to obtain an effect of sufficiently dissociating depending on the type and concentration of the dissociator used.
  • an acid of 6 to 6 is used as a dissociating agent, it is usually set to about 10 seconds to 30 minutes. However, it is preferable to adjust appropriately so as not to cause an excessive reaction that loses antigenicity.
  • a washing solution may be added as necessary to remove unreacted fluorescently labeled antibodies.
  • Fluorescence images can be taken by the same method as before.
  • each of the molecule A and the molecule B is further necessary as necessary.
  • the light is emitted from each phosphor by sequentially irradiating excitation light of an appropriate wavelength corresponding to each phosphor and cutting an unnecessary wavelength component using an appropriate filter. What is necessary is just to image, observing fluorescence.
  • observation in bright field and image photographing may be performed together.
  • Each image acquired in this step can be used in the subsequent identification step and detection step after being integrated or corrected as necessary.
  • the first target cells such as CTC and the second target cells such as leukocytes are identified from the fluorescence images of the respective cell markers and nuclear markers acquired in the image acquisition step (d).
  • leukocyte marker eg CD45
  • CTC marker eg cytokeratin
  • nuclear marker positive cell is identified as CTC
  • CTC marker negative
  • nuclear marker: Cells judged positive are identified as leukocytes.
  • a positive nuclear marker is identified as a whole cell, of which leukocyte marker: negative
  • CTC Marker CTC can be identified as positive and all other cells can be identified as leukocytes.
  • such detection can be performed based on the fluorescent staining of molecule A and molecule B.
  • each cell marker and nuclear marker are stained, the molecule A and the molecule B are stained, and the respective fluorescence images obtained in the image acquisition step (d) are superposed from here.
  • the cell is expressing the first target expressing the molecule A.
  • a cell can be identified, and similarly, if fluorescence staining for molecule B is detected in a region representing the cell identified as the second target cell, the cell expresses molecule B It can be identified as a second target cell.
  • step (d) when the fluorescence images are not acquired for the molecules A and B, only the fluorescence intensity is measured by the scanning apparatus. Obtained measurement data (operation distance and fluorescence intensity indicating the presence of molecules A and / or B) and information on the position of the substrate for cell expansion where the first and second target cells identified from the fluorescence image are present In contrast, the presence of “a first target cell expressing molecule A” and / or “a second target cell expressing molecule B” can be detected.
  • the number of cells identified as the first target cell in the identification step (e) is counted, and the first target cell expressing the molecule A in the detection step (f) It is also possible to calculate the ratio (cell ratio information) of the latter number of cells to the former number of cells.
  • the number of cells identified as the second target cell in the identification step (e) is counted, and the number of cells identified as the second target cell expressing the molecule B in the detection step (f) is determined. The number can be measured, and the ratio of the latter number of cells to the former (cell ratio information) can also be calculated.
  • the first target cell expressing molecule A and the second target cell expressing molecule B are treated in the same manner as in the first embodiment.
  • the detection step (f) by detecting based on fluorescent staining, and further acquiring each positional information, it is possible to detect a group in which each cell is close to each other.
  • the position information where cells having the target fluorescence are present is obtained. It can be acquired as coordinates from the reference point.
  • each coordinate is obtained by using a reference point as position information of a fluorescent signal corresponding to a first target cell expressing molecule A and a second target cell expressing molecule B, and the coordinates are constant. It can be determined that the cells are close to each other.
  • the “certain range” distance used for determination
  • the detection step (f) not only the presence of the first target cell expressing molecule A and the second target cell expressing molecule B is detected, but also expressed in those cells. You may make it acquire the expression level information of the molecule
  • the intensity of fluorescence emitted from a cell identified as the first target cell expressing molecule A for example, a region representing the cell identified as the first target cell in the above-described superimposition of the fluorescence images
  • the intensity of fluorescence corresponding to the molecule A contained therein can be analyzed as an index that quantitatively shows the expression level of the molecule A.
  • the intensity of the fluorescence corresponding to the molecule B contained in the region representing the cell identified as the second target cell can be analyzed as an index quantitatively indicating the expression level of the molecule B. In that case, it is necessary to pay attention to the unification of conditions such as the labeling rate of the fluorescent dye labeled with the antibody, quantum efficiency, excitation wavelength intensity, exposure time, and fading.
  • the specimen processing step (a), the cell expansion step (b), and the identification step (e) can be performed in the same manner as in the first embodiment, but are other steps combined with the first embodiment? Depending on whether they are not combined, it is different from the first embodiment or modified.
  • the staining step (c) can also be performed in the same manner as those steps in the first embodiment described above.
  • images of cell molecules A and molecules B can be acquired in addition to the first target cell, the second target and the fluorescence image of the nucleus.
  • detection steps (f) and (f ′) detection of molecule A-expressing cells (first target cells) and molecule B-expressing cells (second target cells) and analysis of expression level information in molecules A and B Is performed based on the above-described fluorescence staining and based on the nucleic acid amplification reaction described below, and the results of both can be used.
  • the fluorescent staining of molecule A and molecule B in the staining step (c) is unnecessary.
  • the image acquisition step (d) only the first target cell, the second target, and the nuclear fluorescence image need be acquired.
  • the detection step (f ′) the detection of the molecule A-expressing cell (first target cell) and the molecule B-expressing cell (second target cell) and the analysis of the expression level information as required are performed in the fluorescent staining described above. Instead of performing based on this, it is based on the nucleic acid amplification reaction described below.
  • nucleic acid detection step Detection step using nucleic acid amplification reaction
  • the detection step based on the nucleic acid amplification reaction is performed when a cell development substrate having a microchamber is used, and is emitted by the nucleic acid amplification reaction. Based on the fluorescence, each of the molecules A and B can be detected, and the expression level can be preferably quantified in detail.
  • the ratio of the number of microchambers in which the presence of molecule A or molecule B is detected can be calculated.
  • CTC is used as the first target cell
  • such a nucleic acid detection step is a flow for forming a cell deployment substrate having a microchamber formed on the surface thereof that can contain and hold cells and a channel having a ceiling on the substrate. This is performed using a flow path device provided with a path forming member.
  • the nucleic acid detection step is a preparation step for amplifying the nucleic acid contained in the cell, as will be described later, a nucleic acid amplification reaction reagent feeding step (this step is substantially the aforementioned cell expansion step (b)).
  • nucleic acid amplification reactions are known, but in the present invention, a method that can grasp the amount of nucleic acid amplification quantitatively and over time, such as TaqMan probe method, intercalator method, or cycling probe method, can be used. Such a real-time PCR method is suitable.
  • the expression levels of molecule A and molecule B can be quantified in detail for each microchamber using the fluorescence intensity expressed in the reaction as an index.
  • the fluorescence intensity of molecule A and molecule B can be quantified in detail for each microchamber using the fluorescence intensity expressed in the reaction as an index.
  • the fluorescence intensity of molecule A and molecule B can be quantified in detail for each microchamber using the fluorescence intensity expressed in the reaction as an index. It is also possible to perform a more detailed analysis using the average expression level per cell as an index.
  • the measurement value relating to the expression level information of the molecules A and B It is possible to further improve the reliability.
  • the fluorescence for staining the first target cell and the second target cell in the staining step is different from the fluorescence for detecting nucleic acid amplification of the molecules A and B in the nucleic acid amplification reaction progressing step.
  • fluorescent dyes having different maximum fluorescence wavelengths.
  • the nucleic acid amplification reaction proceeding step is carried out in the microchamber (in this case, the fluorescent substance for immunostaining and the fluorescent material for the nucleic acid amplification reaction proceeding step are of the same type whose maximum fluorescence wavelength is approximate) (Ii) If the nucleic acid amplification reaction progressing step is performed in the microchamber while leaving the fluorescently labeled antibody for immunostaining the molecules A and B, the fluorescent substance for immunostaining It is appropriate that the fluorescent substance for the nucleic acid amplification reaction proceeding step is of a different kind whose maximum fluorescence wavelength is not approximated.
  • nucleic acid amplification reaction reagent feeding process In the nucleic acid amplification reaction reagent feeding step, the nucleic acid amplification reaction reagent is fed into the flow path so that the microchamber is filled with the nucleic acid amplification reaction reagent.
  • the amount of the nucleic acid amplification reaction reagent to be fed can be adjusted appropriately so that it will be at least a sufficient amount in consideration of the volume of all the microchambers and filled with the nucleic acid amplification reaction reagent including the flow path. You may do it.
  • the nucleic acid amplification reaction reagent corresponds to the nucleic acid amplification reaction to be performed.
  • the nucleic acid amplification reaction reagents are generally primers (forward and reverse), dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), heat-resistant Taq DNA polymerase, and other Mg 2
  • dNTP dATP, dCTP, dGTP, dTTP
  • heat-resistant Taq DNA polymerase and other Mg 2
  • a reagent suitable for a nucleic acid amplification method containing a necessary element such as a + ion and using a buffer solution (such as a Tris / HCl buffer) containing a TaqMan probe or the like is used.
  • the nucleic acid amplification reaction reagent is preferably a reagent having an effect of cell lysis assistance and / or suppression of a cell-derived PCR reaction inhibitor.
  • a reagent include, for example, MightyAmp (registered trademark) DNA Polymerase Ver. 2 (Takara Bio Inc.), Allele-In-One Human Blood Purification-Opt Lysis Buffer (Cosmo Bio Inc.), EzWay (TM) Direct PCR Buffer (Tefco Corp.), Ampdirect (Shimadzu Corp.), and the like.
  • sealing liquid feeding process In the sealing liquid feeding process, by feeding the sealing liquid into the flow path, the nucleic acid amplification reaction reagent remaining in the flow path is washed away so that the nucleic acid amplification reaction reagents filling the microchamber do not communicate with each other. Fill the path with sealing liquid.
  • the amount of the sealing liquid to be fed should be sufficient to satisfy it, especially because the nucleic acid amplification reaction liquids in the microchambers do not communicate with each other.
  • the cell development substrate can be appropriately adjusted so that the surface other than the microchamber can be coated with the sealing liquid.
  • the sealing liquid one having a lighter specific gravity than the nucleic acid amplification reaction reagent is suitable so that it is not mixed with the nucleic acid amplification reaction reagent in the microchamber when the liquid is fed.
  • a common one used for nucleic acid amplification reaction such as PCR method can be used, and for example, mineral oil is preferable.
  • nucleic acid amplification reaction progression process In the nucleic acid amplification reaction progressing step, the cells (first target cells and / or second target cells) are accommodated, filled with the nucleic acid amplification reaction reagent, and sealed in the sealing chamber with the sealing liquid. A nucleic acid amplification reaction corresponding to the amplification reaction reagent is performed to amplify the nucleic acid contained in the cell. Such a nucleic acid amplification reaction proceeding step may be performed according to the selected nucleic acid amplification reaction.
  • a temperature treatment (about 94 ° C.) for converting the template DNA into a single strand by heat denaturation, a treatment for binding a primer to this single strand (about 40-60 ° C.), and a DNA polymerase
  • the temperature synthesis process (about 72 ° C.) to start and proceed with the DNA synthesis reaction is repeated for a predetermined cycle (about 30 to 40 cycles) to amplify the molecules A and B genes.
  • the measurement step is performed along with the progress of the nucleic acid amplification reaction when the fluorescence intensity is used as a quantitative index reflecting the expression level of the molecules A and B in the microchamber (amplification amount of the gene after a predetermined time).
  • fluorescence is used as a qualitative index reflecting the expression of molecule A and molecule B in the microchamber
  • this is a step performed after the nucleic acid amplification reaction.
  • the intensity of the fluorescence emitted from each microchamber is measured while irradiating predetermined excitation light corresponding to the used phosphor.
  • the excitation light source or the excitation filter and the fluorescence filter may be switched in accordance with the fluorescence to be measured.
  • a cell containing a nucleic acid having a predetermined base sequence is accommodated, and the measured fluorescence intensity is high at the position of the microchamber where the nucleic acid is amplified.
  • reflected light, transmitted light, autofluorescence, and the like for acquiring the position of the microchamber may be measured as necessary.
  • the information acquisition step is a step performed after the nucleic acid amplification reaction instead of the measurement step.
  • each fluorescence image of the substrate for cell development is obtained by irradiating a predetermined excitation light corresponding to the phosphor used in the nucleic acid amplification reaction for the molecule A or the molecule B, and the acquired fluorescence image.
  • the expression information of molecules A and B can be qualitatively acquired by confirming the presence or absence of fluorescence in the microchamber.
  • the position information of the microchamber in which the expression of the molecule A and the molecule B is confirmed and the microchamber in which the first target cell or the second target cell obtained in the identification step (e) is confirmed is superimposed.
  • the expression information of the molecule A and the molecule B in more detail.
  • positional information of each of the first target cell that expresses the molecule A and the second target cell that expresses the molecule B after the detection step (f), positional information of each of the first target cell that expresses the molecule A and the second target cell that expresses the molecule B. And / or presenting data related to the determination of administration of a drug for treatment or prevention of a disease involving an interaction between the molecules based on the analysis result of the expression level information of each of molecule A and molecule B it can.
  • a substance that inhibits the function of molecule A by causing some interaction, such as binding to molecule A, and used as a drug is drug a
  • a substance for molecule B is drug b
  • the first target cell expressing molecule A and the second target cell expressing molecule B are close to each other by analyzing the positional information and statistically processing the quantitative results obtained by analyzing a plurality of samples. It is possible to determine a threshold value at which it can be determined that there are sufficient groups. Furthermore, by analyzing the expression level information and statistically processing the quantification results obtained by analyzing a plurality of samples, it is possible to determine a threshold at which it can be determined that the molecules A and B are expressed.
  • the number of groups in which the first target cell expressing molecule A and the second target cell expressing molecule B are close to each other is equal to or greater than a threshold value.
  • / or the expression level of molecule A on the first target cell and the expression level of molecule B on the second target cell are each equal to or greater than the threshold value, Since there is a possibility that the interaction of the molecule B has an effect, it is possible to expect a drug effect for both the drug a and the drug b that can inhibit the interaction.
  • the number of groups in which the first target cell that expresses the molecule A and the second target cell that expresses the molecule B are close to each other does not reach the threshold, and either the molecule A or the molecule B If the expression level of the drug does not reach the threshold, no interaction occurs between these molecules, and the interaction does not affect the patient's symptoms. I can't expect it.
  • a blood sample collected from a cancer patient is analyzed, PD-L1 is expressed as a molecule A on CTC, and PD-1 is expressed as a molecule B on a white blood cell above a threshold, and It is determined whether or not a group in which CTCs expressing PD-L1 and leukocytes expressing PD-1 are close to each other exists above a threshold, and the anti-PD-L1 antibody as the drug a and the drug b Depending on whether or not the anti-PD-1 antibody can be expected to be effective, it is possible to present data that contributes to the determination of the administration of these drugs.
  • this data presentation step not only the above data based on the expression level information of each of the molecules A and B and the position information analysis result of the first target cell and the second target cell, but also in the identification step Based on the results of CTC identification and counting, data related to the prognosis prediction of metastatic cancer and the determination of the therapeutic effect of the administered drug may be presented together.
  • the cell analysis system of the present invention is for carrying out the method for simultaneous detection of the first target cell and the second target cell of the present invention, in which cell staining as described above and nucleic acid amplification are performed as necessary. is there.
  • the cell analysis system of the present invention includes (A) means for removing red blood cells from the blood of a patient for performing the specimen processing step (specimen processing means); (B) a specimen for carrying out the cell expanding step. Means for adding a predetermined amount of blood processed by the processing means (A) to the cell development substrate and arranging the first target cells and the second target cells on the substrate (cell development means); (C) a staining step; Means for staining each cell marker and nuclear marker of the first target cell and the second target cell with a fluorescent substance (staining means); (D) a staining means for performing the image acquisition step ( C) means for acquiring fluorescence images of each cell marker and nuclear marker stained in (image acquisition means); (E) from each fluorescence image of each cell marker and nuclear marker acquired by image acquisition means (D), the first Target cell and number And (F) a cell that expresses a specific molecule (molecule A) among the cells identified as the first target cell by the identification means (E), and Among the cells identified
  • the staining means (C) stains the molecules A and B with a phosphor.
  • the image acquisition means (D) may further include means for acquiring fluorescent images of the molecules A and B.
  • a fluorescence image is obtained based on the position information obtained by the above-described fluorescence staining of the position information of the molecule A-expressing cell (first target cell) and the molecule B-expressing cell (second target cell). It further includes means for detecting groups in which B-expressing cells are close to each other.
  • the measurement data (operation distance and the presence of the molecules A and / or B are shown) including means for measuring only the fluorescence intensity with a scanning device. (Fluorescence intensity) and the information on the position of the substrate for cell development where the first target cell and the second target cell identified from the fluorescence image are compared, and “first target cell expressing molecule A” and / or Or means for detecting the presence of a “second target cell expressing molecule B”.
  • the detection means (F) Means for detecting nucleic acid (amplification reaction product) of each gene of B, specifically, nucleic acid amplification reaction reagent feeding means, sealing liquid feeding means and nucleic acid amplification reaction progressing means, and measuring means or information obtaining means; Become.
  • the cell detection system includes the positional information of the first target cell expressing the molecule A and the second target cell expressing the molecule B obtained by the detection means (F) and / or Or means for presenting data relating to the administration of a drug related to treatment or prevention of a disease involving the interaction between the molecules based on the analysis result of the expression level information of each of the molecules A and B (data presenting means) ).
  • Each of these means can be constructed by, for example, a liquid feeding system mechanism, an optical system mechanism, a data processing mechanism, and their control mechanism as described below, and using other appropriate known techniques. it can.
  • the cell analysis system is generally composed of a cell analysis apparatus, a flow channel device, and a reagent container having a mechanism as each means described above.
  • the flow channel device and the reagent container are used by being set in a cell analyzer (a flow channel device holder and a reagent container holder inside thereof) during operation of the system.
  • the cell analysis device can be constructed as a device integrally including all the above means (mechanisms), or can be constructed as a plurality of device groups each including one or a plurality of means (mechanisms). .
  • the cell analysis device includes at least a cell suspension in the cell expansion step, a staining solution in the staining step, and, if necessary, a nucleic acid amplification reaction reagent and a sealing solution in the nucleic acid detection step performed in the second embodiment.
  • a liquid feeding system mechanism for feeding liquid to the flow path of the flow path device, a flow path device holder for holding the flow path device used in those steps, a reagent container holder for holding the reagent container, and a cell A control mechanism for controlling the behavior of various devices included in the analysis apparatus is provided.
  • the cell analyzer further observes the cells collected on the cell development substrate of the flow channel device and fluorescently stained, and the reaction products obtained by amplifying a predetermined gene (nucleic acid) contained in the cells, and the fluorescence of those cells is observed. It is preferable that an optical system mechanism for taking an image is also provided in the same apparatus as the liquid feeding system mechanism.
  • the cell analysis apparatus further includes a mechanism necessary for performing a nucleic acid detection step such as a microchamber temperature adjustment mechanism in the same apparatus as the optical system mechanism. If necessary, the cell analyzer can further include a sample processing mechanism that can remove red blood cells and the like by density gradient centrifugation in the same apparatus as the optical system mechanism.
  • the specimen processing mechanism corresponds to a means for removing red blood cells from blood collected from a patient by lysis, centrifugation or the like, and preferably further removing unnecessary white blood cells such as granulocytes according to the embodiment.
  • the sample processing mechanism may further have a function for performing various processes that can be performed simultaneously with the sample processing, such as cell immobilization processing, permeabilization processing, and blocking processing.
  • the specimen processing mechanism for removing red blood cells and the like by centrifugation can be constructed in accordance with a conventional centrifuge that can perform centrifugation using a predetermined technique such as density gradient centrifugation.
  • the specimen processing mechanism when performing cell immobilization treatment, permeabilization treatment, blocking treatment, etc. as necessary can add reagents necessary for blood, It can be constructed using pipettes and tips.
  • the sample processing mechanism is provided in a cell analyzer equipped with a liquid delivery system or the like, for example, the sample processing is automatically performed by setting a blood collection tube containing blood in the cell analyzer. It is preferable to make it.
  • the treatment of removing red blood cells by lysis and the cell immobilization treatment performed as necessary can be performed simply by adding the patient's blood into the blood collection tube containing the reagent for that purpose (simultaneously with the anticoagulation treatment of blood) )
  • the sample processing mechanism does not need to be incorporated into the cell analyzer equipped with the liquid delivery system, etc.
  • a separate sample processing apparatus such as a general centrifuge
  • the processed specimen is set in a cell analyzer equipped with a liquid feeding mechanism or the like.
  • the liquid delivery system is controlled by the control means to control the cell suspension, staining liquid, washing liquid, nucleic acid amplification reaction reagent and sealing liquid used as necessary, and other reagents contained in the reagent container. It is a mechanism for performing suction and discharge, and sending those liquids to a flow path.
  • the liquid delivery system moves, for example, in a plane direction and a vertical direction with respect to the flow channel device (substrate for cell deployment) to enable suction and discharge of the liquid at an arbitrary position, such as a syringe pump, a replaceable chip It can be constructed using possible actuators.
  • the syringe pump has a capability of sucking and discharging the liquid used in each step at a desired flow rate.
  • the supply means aspirates a predetermined amount of liquid such as a cell suspension stored in the reagent container and then discharges the liquid in the reservoir, and the liquid is temporarily stored in the reservoir.
  • the liquid feeding means is connected to the outlet and introduces the liquid in the reservoir from the inlet to the flow path at a predetermined flow rate by suction.
  • liquid delivery system mechanism that has both a supply means and a liquid supply means, and a flow path device that has a reservoir on the outlet side.
  • the liquid delivery system mechanism sucks a predetermined amount of liquid such as cell suspension stored in the reagent container, and then discharges the liquid at a predetermined flow rate at the inlet. Introduce directly into the road. Liquid that has flowed out of the outlet through the flow path can be temporarily stored in the reservoir. After the predetermined process is completed by the liquid feeding, the liquid feeding system mechanism sucks and discharges the liquid that has filled the flow path from the inlet. The discharged liquid may be discharged from the liquid feeding system mechanism in the waste liquid storage unit of the reagent container.
  • the flow channel device that has completed the nucleic acid amplification preparation method in which the nucleic acid amplification reaction reagent and the sealing liquid are fed using the cell analyzer (liquid feeding system mechanism) is the flow channel device holder.
  • the flow path device holder is used to adjust the temperature of the substrate for cell deployment necessary for proceeding the nucleic acid amplification reaction in each microchamber.
  • means are provided.
  • Such microchamber temperature adjusting means includes, for example, a temperature adjusting element and a temperature detecting element for heating and cooling, such as a Peltier element, which are in contact with the cell deployment substrate of the channel device holder. Can be provided. Then, the control means refers to the temperature of the cell expansion substrate measured by the temperature detection element, and controls the temperature so that the cell expansion substrate reaches a predetermined temperature at a predetermined timing by heating or cooling by the temperature adjustment element. Execute.
  • the flow channel device on which the nucleic acid amplification preparation method has been performed is removed from the cell analysis device and provided separately from the device. It is also possible to transfer to an apparatus for nucleic acid amplification reaction and perform a nucleic acid amplification reaction progress step and other steps.
  • the optical system mechanism includes a member such as a laser diode (LD) serving as a light source, a condensing lens, a pinhole member, a dichroic mirror, and a fluorescent filter to excite a fluorescent substance to emit fluorescence.
  • LD laser diode
  • the fluorescent filter corresponds to the fluorescent wavelength of the fluorescent substance used for the fluorescently labeled antibody. If necessary, a plurality of fluorescent filters are prepared and used while being replaced with a filter switch.
  • the optical system mechanism further enables visual observation of fluorescence-stained cells and nucleic acid amplification reactions, such as objective lenses, eye lenses, and CCD cameras, as well as taking fluorescence images of them And a member for measuring fluorescence intensity such as a photomultiplier tube (PMT) may be further included as necessary.
  • a member for measuring fluorescence intensity such as a photomultiplier tube (PMT) may be further included as necessary.
  • An optical system mechanism including these members can be constructed in a form conforming to a fluorescence microscope, and is preferably incorporated into a cell analyzer together with a liquid feeding system mechanism.
  • the image acquisition step and the nucleic acid are performed. The measurement process included in the detection process is performed, and the observation and imaging of the fluorescent cells or the microchamber can be performed smoothly.
  • the optical system mechanism is provided in an apparatus according to a fluorescence microscope that is separate from the apparatus centering on the liquid delivery system mechanism, and the flow path device that has performed the cell expansion process and the staining process by the former apparatus is used in the latter apparatus. It is also possible to move the image acquisition process.
  • the optical system mechanism When analyzing a cell using a cell development substrate equipped with a microchamber, the optical system mechanism further specifies the position of the microchamber to be observed and the position of the cell accommodated in the microchamber. Means may be provided. For example, by providing a reference point (reticle mark) on a cell development substrate, a target microchamber (a microchamber that emits fluorescence labeled with a target cell or an expressed molecule or a nucleic acid amplification reaction product thereof), or Information on the position of the target cell itself can be acquired as coordinates from the reference point. If information based on such reference points is used, even if the cell development substrate is moved from the cell analyzer to another observation / imaging device, the target microchamber is based on that information. Or the cells can be observed immediately.
  • a reference point reticle mark
  • a target microchamber a microchamber that emits fluorescence labeled with a target cell or an expressed molecule or a nucleic acid amplification reaction product
  • the optical system mechanism is scanned on the cell deployment substrate to irradiate the fluorescent material with the excitation light from the light source and measure the intensity of the fluorescent light emitted from the fluorescent material. From the intensity relationship, it is also possible to acquire information as to which position the target object labeled with a fluorescent substance exists. Furthermore, when the cell development substrate is scanned while irradiating light from the light source, the transmitted light or reflected light, or the intensity of the autofluorescence emitted from the material for producing the cell development substrate, is measured between the microchamber and the other parts. It is possible to specify the position of the microchamber by utilizing the difference between the two.
  • the optical system mechanism in such an embodiment may further include a light receiver such as a photodiode (PD) for measuring the fluorescence, transmitted light, reflected light, or autofluorescence described above.
  • a light receiver such as a photodiode (PD) for measuring the fluorescence, transmitted light, reflected light, or autofluorescence described above.
  • PD photodiode
  • the data processing mechanism is a mechanism capable of integrating and correcting data such as fluorescence images and fluorescence intensities acquired by the optical system mechanism in the image acquisition means and the detection means.
  • the data processing program (software), a storage medium storing the program in a computer-executable format, and a computer for executing the program can be constructed.
  • Such a data processing mechanism may be provided as a separate device (such as a personal computer) that is used by being connected to a cell analysis device including a liquid feeding system mechanism and an optical system mechanism. In addition, it may be incorporated in a cell analysis apparatus equipped with an optical system mechanism or the like.
  • the data processing mechanism has at least a function for identifying the first target cell (CTC, etc.) and the second target cell (white blood cell, etc.) from the fluorescence image acquired by the image acquisition means. From the fluorescence image or other data, among these cells, the first target cell expressing molecule A (PD-L1 etc.) and the second objective expressing molecule B (PD-1 etc.) A function for detecting cells is provided.
  • a fluorescence image representing fluorescence emitted from a phosphor labeled with a cell marker of a first target cell and a fluorescence representing fluorescence emitted from a phosphor labeled with a cell marker of a second target cell
  • a process of integrating an image and a fluorescence image representing fluorescence emitted from a phosphor labeled with a nuclear marker; a region in which pixel information (luminance, color) has predetermined characteristics in the integrated image The process of identifying the second target cell; the process of counting the number of each identified cell; the process of sequentially performing these processes for all the fields of view captured, etc.
  • the program which can do is preferable.
  • the above-described program in the first embodiment of the present invention is further emitted from the above-described three kinds of fluorescent images from the fluorescent image representing the fluorescence emitted from the fluorescent substance labeled with the molecule A and the fluorescent substance labeled with the molecule B.
  • a process for detecting the expressed second target cell a process for measuring the number of cells detected in such a manner; a process for sequentially performing these processes on all fields of view obtained by imaging, etc. It is preferable to be able to do so.
  • the expression level information of each of the molecules A and B can be obtained from the fluorescence intensity of the molecule A on the first target cell and the fluorescence intensity of the molecule B on the second target cell.
  • a group in which the first target cell and the second target cell are close to each other can be detected from the positional information of the first target cell and the second target cell. It is preferable that these processes can be automatically executed.
  • the program according to the second embodiment of the present invention further includes pixel information (luminance, color) in a fluorescence image representing fluorescence emitted from a phosphor contained in a microchamber subjected to a nucleic acid amplification reaction. ) Detects a region having a predetermined characteristic as a microchamber containing a first target cell expressing molecule A and / or a second target cell expressing molecule B; It is preferable that processing for measuring the number of detected microchambers; processing for sequentially performing all of the visual fields obtained by imaging these processings can be automatically executed.
  • pixel information luminance, color
  • the first target cell expressing the molecule A and / or the molecule B is expressed. It is preferable that processing similar to the above can be automatically executed, such as processing for detection as a microchamber containing the second target cell. Furthermore, as in the first embodiment, expression level information and / or position information can also be acquired based on the fluorescence intensity. When both of these cells are contained in one microchamber formed on the cell development substrate (fluorescence of both molecule A and molecule B is detected), the cells are in proximity. In a more optimal case, the first target cell expressing molecule A and the second expressing molecule B present in one microchamber. This is a case where the number of target cells is sufficiently large.
  • the data processing mechanism may further have a function of analyzing the following information using the identification and detection results as described above.
  • the above-described program in the first embodiment of the present invention expresses, for example, the first target cell and the molecule B expressing the molecule A, and the measured number of each of the first objective cell and the second objective cell.
  • the measured number of each of the second target cells is compared, and the ratio of the number of the first target cells expressing the molecule A to the total number of the first target cells and the total number of the second target cells It is preferable that the ratio of the number of second target cells expressing the molecule B can be automatically calculated.
  • the program in the second embodiment of the present invention is measured from, for example, an integrated image of three types of fluorescent images photographed before performing the nucleic acid detection step and information indicating the position of the microchamber in the image. Measured from the number of microchambers containing the first target cell and the number of microchambers containing the second target cell, the fluorescence image taken in the nucleic acid detection process, and information indicating the position of the microchamber in the image The number of the microchamber containing the first target cell expressing molecule A and the number of the microchamber containing the second target cell expressing molecule B were compared, and the first target cell The number of microchambers containing the first target cell expressing molecule A relative to the total number of microchambers containing Rate and, it is preferable that the second number of the ratio of the micro-chamber containing a leukocyte expressing a molecule B for the total number of micro-chambers containing the target cells of, to be automatically calculated.
  • the data processing mechanism further provides a function for presenting data relating to the determination of the administration of a drug related to the treatment or prevention of a disease involving the interaction between the molecules using the results of the analysis as described above as a data presentation means. It is preferable to provide. For example, a threshold for determining that the molecule A is expressed in the CTC or that the patient-derived blood sample contains the CTC expressing the molecule A is stored in advance, and is obtained in the detection step.
  • a substance that inhibits the function of the molecule A when the latter measured value is equal to or greater than the threshold value of the former (the drug a) and the molecule B A substance that inhibits the above function and used as a drug (the drug b) may show a determination result that is effective in treating or preventing the disease of the patient.
  • the number of groups in which the first target cell expressing molecule A and the second target cell expressing molecule B are close to each other, and a threshold value associated therewith In contrast, determination results regarding the effectiveness of the drug a and the drug b may be shown.
  • the control mechanism is a mechanism that is connected to various devices of the cell analysis apparatus and can control the behavior of these devices so that the cell detection method can be performed according to a predetermined process or procedure.
  • Such a control means may be provided as a separate device (such as a personal computer) that is used by being connected to a cell analyzer equipped with a liquid feeding system mechanism, an optical system mechanism, etc., or may be fed like a microcomputer. It may be incorporated in a cell analysis apparatus equipped with a liquid system mechanism and an optical system mechanism.
  • the control program may be stored in a storage medium built in the computer, or may be placed in a state where the personal computer can be used via a network or a removable storage medium.
  • the control program can automate operations related to cell deployment means (process), staining means (process), image acquisition means (process), and the like.
  • the liquid supply system mechanism is operated so as to supply the cell suspension in the cell expansion process or the staining liquid in the staining process, or the predetermined excitation corresponding to the phosphor contained in the staining agent.
  • the optical system mechanism can be operated to irradiate light and take a fluorescent image.
  • the microchamber is further operated according to the operation of the liquid feeding system mechanism for feeding the nucleic acid amplification reaction reagent, the sealing liquid, etc. in the nucleic acid detection step, and the nucleic acid amplification reaction at a predetermined time schedule.
  • microchamber temperature control mechanism for heating or cooling, irradiation of a predetermined excitation light corresponding to the fluorescent substance of the fluorescent-labeled nucleic acid amplification probe for detecting fluorescence emitted from the amplification product of nucleic acid, and fluorescence image
  • the operation of the optical system mechanism that performs photographing can be automatically performed by a control program.
  • control mechanisms include data acquired for cell staining and nucleic acid amplification, such as fluorescence for target cell identification and target molecule gene detection, and optionally transmitted light for microchamber location. It is preferable to further have a function for storing reflected light or autofluorescence or captured fluorescent images, reading them in an appropriate process, and transferring them to an appropriate mechanism, and a program therefor.
  • the channel device is constructed by a cell deployment substrate and a channel forming member, and a space closed by these becomes a channel that can be filled with a liquid such as a cell suspension. Yes.
  • the cell deployment substrate and the flow path forming member may be attachable / detachable by means such as engagement, screw fixation, and adhesion.
  • the height of the flow path (the distance between the cell deployment substrate and the top plate member, ie, the thickness of the frame member) is preferably 50 ⁇ m to 500 ⁇ m.
  • the cell suspension (cells contained therein) in the flow path can be easily moved by the force of liquid feeding, and depending on the cells in the flow path. Since clogging is less likely to occur, the cells can be expanded smoothly.
  • the flow path forming member is mounted on a frame member that forms a side wall of the flow path that creates a space for giving the flow path a predetermined height and forms a planar range of the flow path, and a frame member. It can construct
  • the top plate member may include a space (reservoir) that temporarily communicates a liquid such as a cell suspension that communicates with the outflow port.
  • the ceiling of the flow path may have an uneven structure so that the cells can flow into the microchamber easily.
  • the position of the unevenness can be adjusted, for example, so that the center of the microchamber and the center of the concave portion and the convex portion are shifted (does not come on the vertical line).
  • the flow changes toward the microchamber with the concave and convex portions as a boundary, and cells easily enter.
  • the cell development substrate and the flow path forming member are preferably made of a transparent material such as plastic such as polystyrene, polymethyl methacrylate, polycarbonate, cycloolefin copolymer, or glass such as quartz glass.
  • Cell analysis systems usually observe and image fluorescence-stained cells, so that at least the top plate member of the flow path forming member can measure fluorescence labeled with specific cells by the optical detection system of the cell analyzer.
  • the corresponding part must be made of a transparent material.
  • the frame member may be made of a material such as silicon resin (polydimethylsiloxane: PDMS) having appropriate elasticity and adhesiveness, and the frame member is sandwiched between the cell deployment substrate and the top plate member.
  • the flow channel device may be constructed.
  • the reagent container includes a cell suspension, a staining solution (such as a fluorescently labeled antibody solution, a nuclear staining agent solution, or a mixed solution thereof), a washing solution, and a nucleic acid amplification reaction reagent and a seal in the second embodiment of the present invention.
  • a staining solution such as a fluorescently labeled antibody solution, a nuclear staining agent solution, or a mixed solution thereof
  • a washing solution such as a stop solution and other necessary solutions, that need to be sent to the flow path when carrying out the cell detection method are contained.
  • a liquid having a relatively high storage stability such as a sealing liquid and a washing liquid can be stored in a predetermined portion of a reagent container in a sealed state in advance, such as a cell suspension, a staining liquid, or a nucleic acid.
  • a liquid that needs to be prepared immediately before staining cells or amplifying nucleic acid such as an amplification reaction reagent can be added to and stored in a predetermined part of the reagent container after preparation. Solutions that are used multiple times, such as cleaning solutions, may contain a volume of solution corresponding to each process in separate parts, or when solutions of the same composition are used repeatedly in each process The total amount of liquid may be contained in one site.
  • the reagent container is provided with a part for storing waste liquid sucked and discharged from the flow path after feeding, as necessary.
  • Example 1 Detection by immunostaining
  • A Specimen Processing Step Red blood cells were removed from a blood sample derived from a healthy person by density gradient centrifugation using Percoll (GE Healthcare, specific gravity 1.113) as a separation liquid.
  • Percoll GE Healthcare, specific gravity 1.113
  • a patient sample obtained by adding about 1000 and about 10,000 T-cells overexpressing PD-L1-positive MIA PaCa-2 cells (human pancreatic cancer-derived cell line) and PD-1 to the blood sample, respectively.
  • (B) Cell development step A flow path is formed by a cell development substrate on which 20000 micro chambers having a diameter of 100 ⁇ m and a depth of 50 ⁇ m are formed, and a flow path forming member that can form a flow path having a height of 0.1 mm and a width of 15 mm.
  • a device was formed, one outlet was connected to a syringe pump, and a reservoir for adding reagents to the other was formed.
  • PBS as a prewetting liquid was extruded into the flow path from the suction part side to the reservoir side at a flow rate of 40 mL and 40 mL / min by extrusion using a syringe pump.
  • the immobilized cell sample is centrifuged twice with PBS, added to the reservoir, and introduced into the channel at a flow rate of 100 ⁇ L and 0.1 mL / min by suction with a syringe pump. Then, the cells were accommodated in the microchamber.
  • C Staining step FITC-labeled anti-CD45 antibody (Beckman Coulter) for identifying leukocytes in a PBS solution containing 0.1% of Tween 20 for permeabilization and 3 w / v of BSA for blocking , PE-labeled anti-cytokeratin antibody (Becton Dickinson) for identification of MIA PaCa-2 cells (human pancreatic cancer-derived cell line), and Hoechst that binds to the cell nucleus, and Alexa Fluor® 647-labeled anti-PD-L1
  • a solution was prepared by adding the antibody (CST) and Alexa Fluor® 750-labeled anti-PD-1 antibody (Miltenyi Biotec). This solution was introduced from the reservoir by suction with a syringe pump, allowed to stand for 30 minutes to react with the immobilized cells, and then washed with PBS three times.
  • PD-L1 Alexa Fluor (registered trademark) 647) positive cells are detected as the number of PD-L1-expressing cells, The number of cells was measured as 860.
  • PD-1 Alexa Fluor (registered trademark) 750 positive cells were detected as the number of PD-1-expressing cells, and the number of cells was counted as 9300.
  • the proportion of cancer cells expressing PD-L1 molecules is 91% (860/950), and the proportion of cells expressing PD-1 molecules among leukocytes is 3% (9300/310000). )Met.
  • the number of PD-L1-expressing cancer cells and the number of white blood cells expressing PD-1 contained in a blood sample of a certain volume are respectively shown, thereby determining the effectiveness of a drug such as an anti-PD-L1 antibody. be able to.
  • the ratio of cancer cells expressing PD-L1 in all cancer cells and the ratio of leukocytes expressing PD-1 in total leukocytes can also be shown, respectively.
  • Example 2 Detection by PCR
  • the steps (a), (b) and (e) are performed in the same manner as in Example 1, and the step ( In c) and (d), Alexa Fluor® 647-labeled anti-PD-L1 antibody (CST) and Alexa Fluor® 750-labeled anti-PD-1 antibody (Miltenyi Biotec) are not added.
  • CST Alexa Fluor® 647-labeled anti-PD-L1 antibody
  • Alexa Fluor® 750-labeled anti-PD-1 antibody Miltenyi Biotec
  • (F ′) Nucleic Acid Detection Step As a nucleic acid amplification reaction reagent, 200 ⁇ L of a real-time PCR reaction reagent (TaqMan Universal Master Mix II, Life Technologies) for amplification of PD-L1 gene and PD-1 gene was prepared.
  • the base sequences of the primers (forward and reverse) and the probe are as follows.
  • F′-3 Nucleic Acid Amplification Reaction Progression Step and Measurement Step
  • a flow path device in which cells and nucleic acid amplification reaction reagents are stored in a microchamber and sealed with mineral oil, 95 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. The thermal reaction cycle of 1 minute was performed for 40 cycles. Thereafter, the fluorescence intensity of FAM and HEX was measured for all the microchambers.
  • (F′-4) Detection Step The number of microchambers in which cancer cells were present in the identification step (e) was 930, of which 840, 90% of the microchambers corresponded to PD-L1 expression. Fluorescence by the indicated FAM was observed. In the identification step (e), the number of microchambers in which leukocytes were present was 20000 (the number of cells identified as leukocytes was 270000), of which 5700 were 2% of the total leukocyte count (5700/270000). Fluorescence due to HEX indicating PD-1 expression was observed in the microchamber corresponding to.
  • the number of PD-L1-expressing cancer cells and the number of white blood cells expressing PD-1 contained in a blood sample of a certain volume are respectively shown, thereby determining the effectiveness of a drug such as an anti-PD-L1 antibody. be able to.
  • the ratio of cancer cells expressing PD-L1 in all cancer cells and the ratio of leukocytes expressing PD-1 in total leukocytes can also be shown, respectively.

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Abstract

　本発明は、各々相互作用している第一の目的細胞上に発現した分子（分子Ａ）と第二の目的細胞上に発現した分子（分子Ｂ）について、両者の発現状態（発現有無・発現量）を同一基準で測定するために、第一の目的細胞および第二の目的細胞に関する情報を同時に検出する方法を提供することを課題とする。　かかる課題を解決するための本発明の方法は、赤血球を除去した血液を細胞展開用基板に添加し、第一の目的細胞と第二の目的細胞に対する各マーカーおよび核マーカーを染色してそれぞれの蛍光画像を取得し、それらの蛍光画像から第一の目的細胞と第二の目的細胞を同定し、さらに分子Ａを発現している第一の目的細胞と分子Ｂを発現している第二の目的細胞を検出することにより、分子Ａおよび分子Ｂの各発現量情報を同時に解析することができる。

Description

相互作用する分子を有する血中細胞の同時検出方法
　本発明は、第一の目的細胞と第二の目的細胞の両者に対して同時に検出を行う方法に関する。
　血液中には通常、赤血球、白血球（好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球）などの血液細胞が含まれているが、さらに循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ：Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃｅｌｌｓ）、循環血管内皮細胞（ＣＥＣｓ：Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌｓ）、循環血管内皮前駆細胞（ＣＥＰｓ：Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）、その他の前駆細胞などの稀少細胞が含まれている場合がある。また、培養されている細胞集団には、幹細胞、特定の分化細胞、その他の特徴的な細胞が含まれている場合がある。
　たとえばＣＴＣは、乳癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌などの患者の血中に見出される細胞であり、その数は癌の転移性を反映しているなど、臨床上の重要な情報になることで注目されている。しかしながら、血液中のＣＴＣの密度は極めて低く（少ない場合、全血１０ｍＬあたり１～１０個程度）、その検出および計数は容易ではない。
　ＣＴＣ等の稀少細胞や特徴的な細胞の検出をする際に、核染色や蛍光染色などを行い、血液中からＣＴＣ等を検出する方法などが知られている。
　その際に、顕微鏡観察や染色を行いやすい状態にするため、たとえば、細胞を収容し保持することができるマイクロチャンバーまたは溝を表面に有する基板上に流路形成枠体を設置して作製された、細胞展開用デバイスを用いて、細胞懸濁液中の細胞を展開するシステムが用いられている（たとえば特許文献１参照）。
　このような手段を用いてＣＴＣが発現しているバイオマーカーのプロファイリングを行うことは、その原発性がんのバイオマーカーのプロファイリングとの比較を通じて転移のメカニズムを解明したり、有用な抗がん剤（分子標的薬）を判定したり、ＣＴＣの亜集団（上皮細胞、間葉系細胞、幹細胞などの特性を有するＣＴＣ）を特定したりなど、様々な観点からＣＴＣの研究を進めるためにも重要である。
　近年、がん免疫療法において、白血球を標的とする治療薬の開発が活発になっている。免疫システムにより、白血球（Ｔ細胞）はがん細胞を特異的に攻撃することができるが、白血球上に発現したＰＤ－１分子と、がん細胞上に発現したＰＤ－Ｌ１分子とが相互作用すると、免疫が抑制されることが知られている（非特許文献１）。そのため、白血球上に発現したＰＤ－１分子に結合してがん細胞上に発現したＰＤ－Ｌ１分子との相互作用を阻害する物質、たとえば抗ＰＤ－１抗体を有効成分とする、上記の機構による免疫抑制を解除する治療薬が開発されている。これとは逆に、がん細胞上に発現したＰＤ－Ｌ１分子に結合して白血球上に発現したＰＤ－１分子との相互作用を阻害する物質、たとえば抗ＰＤ－Ｌ１抗体を有効成分とする治療薬の開発も可能である。
　しかしながら、上述した抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体のような治療薬が有効であるためには、白血球上および癌細胞上にそれぞれＰＤ－１分子およびＰＤ－Ｌ１分子が発現していることによって、免疫が抑制されている状況にあることが前提となる。たとえば、白血球上にＰＤ－１分子が発現していても、がん細胞にＰＤ－Ｌ１分子が発現していなければ、そもそも免疫抑制されずに白血球が、がん細胞を攻撃できるはずであるため、抗ＰＤ－１抗体や抗ＰＤ－Ｌ１抗体のような免疫抑制の解除を目的とした治療薬ではなく、他の作用機序に関係する抗がん剤や白血球の免疫増強剤などが有効な治療薬となり得る。このことは、がん細胞にＰＤ－Ｌ１分子が発現していても、白血球上にＰＤ－１分子が発現していない場合にも当てはまる。
　このように、２種類の細胞の相互作用に関係する治療薬の投与判断には、治療薬が対象とする分子がどちらの細胞上に存在していても、両方の細胞における分子発現の情報を同時に調べる必要がある。たとえば、抗ＰＤ－１抗体をがん免疫療法の治療薬とする場合の投与判断には、白血球上の分子（ＰＤ－１）の発現情報だけでなく、ＰＤ－１分子と相互作用するがん細胞上のＰＤ－Ｌ１分子の発現情報も必要となり、がん細胞上にＰＤ－Ｌ１分子が発現していないがん患者に対して抗ＰＤ－１抗体を投与しても治療効果は得られないことが明らかとなっている（非特許文献２）。
　従来、血液試料に含まれる様々な細胞からＣＴＣ等の稀少細胞を同定し、解析する方法が知られているが、それらの方法においては、稀少細胞と同時に白血球等の稀少細胞以外の細胞も解析の対象とするようなシステムにはなっていない。たとえば特許文献２には、がん等の患者由来の血液試料を用いて、核および所定の細胞マーカーを染色した蛍光画像や細胞・核の形態画像の画像処理により、ＣＴＣを検出する方法が記載されている。この方法においては、核が染色された細胞をＣＴＣとＣＴＣではない細胞（白血球）の全体とみなしてその合計数を計測することや、所定の細胞マーカーの染色パターンを示した細胞をＣＴＣと同定してその数を計測することが行われ、それらの結果に基づき、細胞の合計数に対するＣＴＣの数の比率や血液試料中のＣＴＣの濃度を算出して、がん等の患者由来の血液試料に含まれるＣＴＣの解析を行っている。しかしながら、ＣＴＣとともにＣＴＣでない細胞も（同定および計数だけでなく）解析の対象とすること、特に細胞表面に所定の分子を発現しているＣＴＣと、その分子と相互作用する所定の分子を細胞表面に発現している白血球の両者を、同一基準で同時に解析することについてはなんら具体的に言及されてはいない。
　また、既存のフローサイトメーターによる計測では、理論上は（所定の分子を発現している）ＣＴＣと（所定の分子を発現している）白血球を同時に同定、計数および解析することは可能だが、血液試料中のＣＴＣは非常に数が少ないため検出漏れのおそれがあり、このシステムを用いてＣＴＣが関係する解析を正確に行うことは困難である。
　なお、出願人は上述した細胞展開用デバイスを用いて、細胞懸濁液や必要な試薬類を順次流路内に送液することにより、各マイクロチャンバー内において効率的に、そこに回収された細胞に含まれる核酸をＰＣＲ等により増幅する方法を発明しており、その方法等に係る発明について先に出願している（出願番号：特願２０１４－１９１１２９、出願日：平成２６年９月１９日）。
国際公開第２０１４／０６１６７５号 特表２０１３－５０８７２９公報
Nat Rev Cancer. 2012 Mar 22;12(4): 252-64 N Engl J Med 2012; 366:2443-2454June 28, 2012
　本発明者は、上述したような課題を解決するために、相互作用している白血球上に発現した分子とＣＴＣ（がん細胞）上に発現した分子について、それぞれの発現状態（発現有無・発現量）を同一基準で測定する意義を見出した。したがって本発明の目的は２種の異なる細胞に関する情報を同時に検出するための方法を提供することを目的とする。
　本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、各細胞マーカーと核の染色を行い、第一の目的細胞および第二の目的細胞を同定する方法において、さらに、第一の目的細胞と同定した細胞上にある分子Ａと、第二の目的細胞と同定した細胞上にあって、かつＡと結合性をもつ分子Ｂを検出することで、それぞれの発現状態を同一基準で測定し、分子Ａと分子Ｂにおけるそれぞれの発現量情報を解析することが可能になることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は１つの側面において、下記（ａ）～（ｆ）の各工程を含む血中細胞の同時検出方法：（ａ）患者の血液から赤血球を除去する工程（検体処理工程）；（ｂ）工程（ａ）で処理を行った既定量の血液を細胞展開用基板に添加し、第一の目的細胞および第二の目的細胞を基板上に並べる工程（細胞展開工程）；
（ｃ）第一の目的細胞と第二の目的細胞の各細胞マーカーおよび核マーカーを蛍光体で染色する工程（染色工程）；
（ｄ）工程（ｃ）で染色した各細胞マーカーおよび核マーカーの蛍光画像を取得する工程（画像取得工程）；
（ｅ）工程（ｄ）で取得した各細胞マーカーおよび核マーカーの蛍光画像から、第一の目的細胞および第二の目的細胞を同定する工程（同定工程）；
（ｆ）工程（ｅ）で第一の目的細胞と同定された細胞のうち特定の分子（分子Ａ）を発現している細胞、および工程（ｅ）で第二の目的細胞と同定された細胞のうち分子Ａと相互作用する他の特定の分子（分子Ｂ）を発現している細胞を検出する工程（検出工程）を提供する。
　本発明の方法により、第一の目的細胞の分子発現情報と第二の目的細胞の分子発現情報を同一基準で得ることができる。それにより、両者に関わる情報から判定することが必要な、がん免疫療法などの治療の投薬判断の信頼性を向上させることが期待できる。特に検査の結果、互いに相互作用をする第一の目的細胞に発現する分子Ａ（たとえばＣＴＣに発現するＰＤ－Ｌ１）と第二の目的細胞に発現する分子Ｂ（たとえば白血球に発現するＰＤ－１）が共に存在することが判明した場合、分子ＡとＢの相互作用（上記の例では免疫抑制）が生じていると推定できるため、薬剤等で対応を行う必要があると判断できる。また分子ＡもしくはＢのいずれか一方が存在しない場合は、相互作用が生じていないと推定できるため、相互作用を阻害するために一方の分子に作用させる薬剤等の投与は必要ない（その薬剤を投与しても奏功しないので、可能であれば他の薬剤の投与を検討すべきである）と判断できる。
図１は、本発明に係る第一の目的細胞と第二の目的細胞の同時検出方法の一実施形態を示すフローチャートである。
　以下、本発明を実施するための形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。
－　第一の目的細胞と第二の目的細胞の同時検出方法　－
　本発明における第一の目的細胞と第二の目的細胞の同時検出方法は、少なくとも（ａ）検体処理工程、（ｂ）細胞展開工程、（ｃ）染色工程、（ｄ）画像取得工程、（ｅ）同定工程、および（ｆ）検出工程を含み、必要に応じてさらに（ｇ）データ提示工程を含んでいてもよい。このような検出方法の各工程は、たとえば、図１に示すフローチャートに沿った手順で実施することができる。
　（目的細胞）
　本発明における目的細胞は二種あり、これらは少なくとも赤血球ではない。第一の目的細胞はたとえば稀少細胞であり、ＣＴＣ、ＣＥＣ、ＣＥＰおよびその他の前駆細胞が含まれ、また、第二の目的細胞はたとえば白血球（リンパ球）である。
　（目的分子）
　本発明における目的分子は、第一の目的細胞および第二の目的細胞それぞれの細胞表面に発現している２種類の分子（タンパク質、特に第一実施形態においては免疫染色の対象となり得る抗原）であって、互いに相互作用するものを指す。本明細書において、第一の目的細胞が発現する上記特定の分子を「分子Ａ」、第二の目的細胞が発現する上記特定の分子を「分子Ｂ」と表記する。
　目的分子は、病理診断など本発明の定量ないし検出方法の用途を考慮しながら選択すればよく、特に限定されるものではない。本発明における典型的な目的分子としては、ＣＴＣ上に発現しＰＤ－１と相互作用するＰＤ－Ｌ１、および白血球（Ｔ細胞)に発現するＰＤ－１が挙げられる。これらの分子は相互作用することによって免疫を抑制することが知られている。
　（血液）
　本明細書に記載の「血液」は、赤血球細胞、白血球細胞、血小板、内皮細胞、中皮細胞または上皮細胞を含む、全血の任意の成分を含むことを意図する。血液はまた、タンパク質、脂質、核酸および炭水化物などの血漿の成分、および妊娠、臓器移植、感染、外傷または疾患によって血液中に存在する可能性がある任意の他の細胞、たとえばＣＴＣ、ＣＥＣ、ＣＥＰ、その他の前駆細胞などの稀少細胞も含む。
　（白血球）
　本明細書に記載の「白血球」は、白血球であるか、または網状赤血球もしくは血小板ではない造血系列の細胞である。白血球は、ナチュラルキラー細胞（「ＮＫ細胞」）、Ｂ細胞およびＴ細胞などのリンパ球を含む。白血球はまた、単球、マクロファージ、顆粒球などの貪食細胞およびマスト細胞を含む。
　（赤血球）
　本明細書に記載の「赤血球」は、赤血球であり、特に非有核赤血球細胞を意味する。
　（顆粒球）
　上述したように、本明細書に記載の「顆粒球」は、白血球に含まれる細胞の一部であり、これには好中球、好酸球および好塩基球が含まれる。
　本発明に係る血中細胞の同時検出方法は、工程（ｆ）：検出工程の行い方により、２通りの実施形態を挙げることができる。第一実施形態では、分子Ａと分子Ｂの各蛍光染色に基づいて、分子Ａを発現している第一の目的細胞および分子Ｂを発現している第二の目的細胞の検出を行う。第二実施形態では、細胞展開用基板としてマイクロチャンバーを備えたものを使用し、マイクロチャンバー内における分子Ａと分子Ｂの各遺伝子の核酸増幅反応に基づいて、分子Ａを発現している第一の目的細胞および分子Ｂを発現している第二の目的細胞の検出を行う。
　―第一実施形態―
　―工程（ａ）：検体処理工程―
　検体処理工程（ａ）は、少なくとも、患者の血液から赤血球を除去する工程である。本発明に使用する検体を調製する際には、赤血球の除去およびその他の必要な前処理をあらかじめ行っておくことが適切である。なお、本明細書において患者とは癌等に罹患している対象のみならず、罹患が疑われる対象も包含する。
　（抗凝固処理）
　採取されて体外に取り出された血液（全血）は、そのまま空気に触れさせると時間の経過と共に凝固し、そこに含まれる細胞を回収して観察することができなくなる。そのため、採取された血液は直ちに抗凝固処理することが好ましい。
　全血用の抗凝固剤としては様々なものが公知であり、一般的な濃度、処理時間等の条件に従って用いることができる。例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）やクエン酸（ナトリウム塩等の塩を含む）に代表される、キレート作用によりカルシウムイオンと結合し、反応系から除去することによって凝固を阻止するタイプの抗凝固剤や、ヘパリンに代表される、血漿中のアンチトロンビンＩＩＩと複合体を形成してトロンビンの産生を抑制することにより凝固を阻止するタイプの抗凝固剤が挙げられる。このような抗凝固剤があらかじめ収容された採血管を利用してもよい。
　また、細胞に対しては、細胞の自己分解や腐敗を遅延させ、その形態や抗原性を保持するための固定化処理；細胞膜の透過性を向上させて細胞の外部から細胞の内部に物質（細胞内にある抗原を標的とする蛍光標識抗体や、核染色剤等）が浸透しやすくするための浸透化処理；細胞展開用基板上において、マイクロチャンバー等の細胞の固相化に関与する部位以外に細胞が吸着することを防止するとともに、必要に応じて行われる免疫染色において目的とする抗原以外の部位に蛍光標識抗体が非特定的に吸着することを防止するためのブロッキング処理などを必要に応じて行ってもよい。固定化処理、浸透化処理、ブロッキング処理を検体処理工程と同時に行わない場合は、それらの処理は例えば後述するように、染色工程と同時に行うようにしてもよい。
　（赤血球および顆粒球等の除去）
　展開した細胞を観察する場合においては、観察領域に対象となる細胞同士が重ならないように展開しなくてはならない。それには血液内の有形成分のうち約９６％を占める赤血球を検体から除去することが必要となる。赤血球を除去することで不必要な細胞同士の重なりを抑え、対象となる細胞を効率よく展開することで、検出感度を低下させずに稀少細胞を検出することが可能となる。
　赤血球を除去するための手段は特に限定されるものではないが、たとえば、塩化アンモニウム等を使用して赤血球を溶血させてもよい。また、遠心分離処理により、赤血球とそれ以外の細胞を分離して、少なくとも第一の目的細胞および第二の目的細胞を含む細胞画分を精製してもよい。これらの手法は公知であり、適切な遠心分離機および遠心分離条件を用いて実施することができる。
　ここで、密度勾配遠心法は、各種の細胞を含む血液中の成分を比重に従って分画することができる方法として知られている。特に、血液中に多量に含まれている赤血球を除去し、好ましくはさらに顆粒球も除去して、第一の目的細胞および第二の目的細胞を含む細胞画分のみを細胞展開工程に供するためには、密度勾配遠心法を用いることが好ましい。
　密度勾配遠心法に用いられる分離液は、血液中の細胞の分画に適した比重を有し、また細胞を破壊することのない浸透圧およびｐＨを有するよう調製したものであればよいが、例えば、市販されているフィコール（登録商標）、パーコール（登録商標）などのショ糖溶液を用いることができる。この分離液の比重を、赤血球の比重よりも小さく、白血球の比重よりも大きくなるよう調節した上で密度勾配遠心処理を行うと、血液検体を「赤血球が多く含まれる画分」と「赤血球以外の細胞が多く含まれる画分」の少なくとも二層に分離することができる。
　例えば、本発明における一つの態様において、分離液の比重を１．１１９以下、好ましくは１．１１３以下、より好ましくは１．０８５以下にすると、赤血球以外の有核細胞（つまり第一の目的細胞および第二の目的細胞）が多く含まれる画分への赤血球の混入率を２～６％またはそれ以下に抑えることができる。
　さらに、本発明における一つの態様においては白血球のうちＴ細胞などのリンパ球を第二の目的細胞とするが、この場合は分離液の比重を約１．０７７にすることにより、当該第二の目的細胞（リンパ球）および第一の目的細胞（ＣＴＣ）を、赤血球および当該第二の目的細胞以外の白血球（顆粒球等）から分離することができる。
　また、比重の異なる二種以上の分離液を併用してもよい。例えば、比重が約１．０７７と約１．１１３の分離液を併用すれば、第二の目的細胞を多く含む画分と、顆粒球を多く含む画分とを取得することができる。
　―工程（ｂ）：細胞展開工程―
　細胞展開工程（ｂ）は、検体処理工程（ａ）で処理を行った既定量の血液を細胞展開用基板に添加し、第一の目的細胞および第二の目的細胞を基板上に並べる工程である。
　（細胞展開用基板）
　本発明における細胞展開用基板は、典型的には、後述する細胞観察方法に用いられるデバイスの基板（流路基板）に相当するものであり、流路形成部材と組み合わせて流路を形成し、その流路に細胞懸濁液を導入することにより、細胞展開用基板の表面に細胞懸濁液中の細胞を展開するようにして用いられる。
　本発明における細胞展開用基板には、細胞懸濁液中の細胞を蛍光観察あるいは核酸解析に適した状態で回収することができるように微細なチャンバー（マイクロチャンバー）あるいは溝が形成されていることが好ましい。
　細胞展開用基板が溝を持つ形態の場合、前記溝の溝幅が１～１００μｍの範囲内であるとともに、溝深さが１～１００μｍの範囲内に設定されることが好ましい。寸法がこのような範囲内であれば、細胞を溝内に確実に展開することができる。前記溝の断面形状については特に限定されるものではないが、断面がＶ字状であれば、細胞を密に並べることができるので好ましい。Ｖ字状以外にも例えば溝の一方の側面のみが斜めに傾斜しているもの、溝の頂部および底部に丸みを帯びているもの、あるいはＵ字状の溝であっても良い。また上記寸法の溝は、溝幅と溝深さとを同じ寸法とすることが好ましい。このように設定すれば、一度溝内に入った細胞が移動し難くなるとともに、溝内に入った細胞が、他の細胞を堰き止めてしまうようなことも防止することができる。
　前記溝は、公知の微細加工技術で加工可能であるが、例えば市販のプリズムシートを代用することもできる。通常、プリズムシートは、平板の上面に同じ大きさの溝が複数列状に並設されたものであり、溝の溝幅および溝深さも上記の好ましい範囲に合ったものが市販されている。
　細胞展開用基板がマイクロチャンバーを持つ形態の場合、マイクロチャンバーの形状は特に限定されるものではないが、例えば、底面が平坦で側面がテーパー形状である逆円錐台形が好ましい。マイクロチャンバーの底面の直径および深さは、核酸の解析や染色像の観察に適した数の細胞を回収して収容することができるよう、適宜調節することができる。例えば、１つのマイクロチャンバーあたり１～１００個の細胞を収容できるよう、底面の直径を２０～５００μｍ、深さを２０～５００μｍの範囲とすることが好ましい。なお、血液中の種々の細胞（赤血球を除く）の直径は一般的に５～１００μｍであり、ＣＴＣ等の稀少細胞の直径は１０～１００μｍ程度と言われている。また、蛍光染色像の観察時に励起光の光源としてレーザーダイオードを用いる場合、その照射領域（スポット）のサイズは、例えば長径１００μｍ×短径１０μｍ程度の楕円形である。マイクロチャンバーの底面のサイズは、このレーザーダイオードの照射領域のサイズよりも大きくし、１つのマイクロチャンバーに光を照射しているときに、隣接するマイクロチャンバーにもまたがって光が照射されて、複数のマイクロチャンバーから同時に蛍光が発せられることがないようにすることが適切である。
　細胞展開用基板の表面上における、複数のマイクロチャンバーの配置は特に限定されるものではないが、細胞の回収率（懸濁液中の全ての細胞のうちマイクロチャンバー内に回収できた細胞の割合）がなるべく高くなるよう、配列の向きやマイクロチャンバー同士の間隔を調節されていることが好ましい。例えば、流路に細胞懸濁液を送液したときに流入口から流出口に至るまでのどこか少なくとも１箇所で細胞がマイクロチャンバーに沈降するよう、マイクロチャンバーを配列させることが好ましい。
　様々な基板材料が当技術分野において周知であり、たとえば、そのような材料は、ガラス；ポリカルボナートおよびポリメタクリル酸メチル、ポリオレフィンなどの有機プラスチック；ポリアミド；ポリエステル；シリコン；ポリウレタン；エポキシ；アクリル；ポリアクリラート；ポリエステル；ポリスルホン；ポリメタクリラート；ポリカルボナート；ＰＥＥＫ；ポリイミド；ポリスチレン；およびフルオロポリマーの１種または複数種を含んでもよい。
　細胞展開用基板は、細胞が接着しやすい材料で作製してもよい。この場合、細胞展開用基板のマイクロチャンバーの内表面あるいは溝内以外の部分には、前述したように、ブロッキング剤等による表面処理を施すことが望ましい。
　（細胞の固相化方法：細胞展開用基板の材質および構造）
　稀少細胞等の目的細胞の検出効率を高めるためには、細胞を固相化する、つまり細胞展開用基板上の細胞の位置が動かないようにする必要がある。細胞を固相化することにより、観察の対象とする細胞の位置を特定しやすくなり、必要に応じて検出された目的細胞を回収することも可能となる。
　細胞の固相化のための手法は、細胞展開用基板の表面の構造によって細胞の移動できる範囲を制限するようにする手法（構造的手法）と、細胞展開用基板の表面の性状によって生じる物理的相互作用により細胞を吸着させて動かないようにする手法（相互作用的手法）とに大別することができる。
　固相化の構造的手法としては、たとえば前述したように、細胞展開用基板の表面にマイクロチャンバーまたは溝を複数形成することによって、細胞の移動をチャンバーまたは溝の中だけに制限することが挙げられる。
　固相化の相互作用的手法としては、マイクロチャンバーの内面、特に底面または溝の内部の性状を、相互作用によって細胞が吸着しやすい性質、すなわち細胞接着性にすることが挙げられる。具体的には、たとえばマイクロチャンバーまたは溝内壁面あるいは細胞展開用基板全体をポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネートといったプラスチックやガラスのように、細胞が物理的な（分子間の）相互作用によって吸着しやすい疎水性材料で作製する方法がある。基板全体をこのような物質で作製した場合、送液の途中で細胞が吸着してしまいマイクロチャンバーまたは溝に回収されることの妨げとならないよう、細胞自体をブロッキング処理して吸着能力を失わせるか、細胞が吸着しやすい性質を、マイクロチャンバーまたは溝の内壁面等の必要な部分だけに留めることが好ましい。
　また、マイクロチャンバーまたは溝の内壁面をポリ－Ｌ－リジンのように細胞の接着性を向上する分子でコーティングする方法が挙げられる。細胞展開用基板の表面のうちマイクロチャンバーまたは溝の内部以外の部分を、細胞が吸着しないようブロッキング剤で処理するか、大気雰囲気下でＵＶを照射するＵＶオゾン処理や酸素プラズマ処理によって適度に親水化する方法もある。マイクロチャンバーまたは溝の内部には、細胞が吸着しやすい材料が露出した状態を保つことにより、そこに細胞を吸着させ、細胞懸濁液の流れによって再びマイクロチャンバーまたは溝の外に出て行かないようにすることができる。
　（プレウェット液送液工程）
　細胞展開工程（ｂ）において、細胞懸濁液を送液するのに先だって、細胞展開用基板の表面の濡れ性を改善することなどを目的としたプレウェット液を送液する工程を設けてもよい。細胞展開用基板がポリスチレンのような疎水性の材料から形成されている場合、流路内に細胞懸濁液を導入しても、表面張力の関係でマイクロチャンバーまたは溝内に気泡が残存してしまい、細胞懸濁液を全てのマイクロチャンバーまたは溝内に充填させることができないことがある。そのような問題を抑制するため、細胞懸濁液を細胞展開用基板の表面に展開する前に、予め表面張力の低い有機溶剤、例えばエタノールの水溶液をプレウェット液として、流路に導入しておくことにより、細胞展開用基板の表面の濡れ性を向上させることができる。このようにプレウェット液で処理した後、ＰＢＳ等の生理食塩水または純水を通液してプレウェット液を置換、洗浄してから、細胞懸濁液を通液するようにすれば、細胞懸濁液はほとんど全てのマイクロチャンバーまたは溝の内部に入り込み、細胞を効率的に回収することができるようになる。
　プレウェット溶液には、水よりも表面張力の低い水溶液であれば特に限定されるものではないが、例えば、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類を含む水溶液、好ましくは３０％（ｗ/ｖ）以下の濃度のエタノール水溶液や、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０，　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ（登録商標）、ＳＤＳ等の界面活性剤を０.０１～１％（ｗ/ｖ）で含む水溶液を用いることができる。
　―工程（ｃ）：染色工程―
　染色工程（ｃ）では、第一の目的細胞と第二の目的細胞の各マーカー分子および核マーカーを蛍光体で染色し、第一実施形態ではさらに、第一の目的細胞に発現する分子Ａと、第二の目的細胞に発現し、分子Ａと相互作用する分子Ｂを蛍光体で染色する。このような蛍光体での染色は、第一の目的細胞および第二の目的細胞のマーカー分子のそれぞれに対して特異的な抗体と蛍光体から作製される蛍光標識抗体や、第一の目的細胞が有する分子Ａおよび第二の目的細胞が有する分子Ｂのそれぞれに対して特異的な抗体と蛍光体から作製される蛍光標識抗体、さらに蛍光を発する核マーカーの染色剤を用いた、蛍光染色により行うことができる。
　例えば、蛍光標識抗体や核染色剤が溶解した水溶液である染色液を、細胞展開用基板上に設けた流路に送液し、所定の時間、流路を満たして、細胞展開用基板上のマイクロチャンバーまたは溝に収容された細胞と染色液を接触させることにより、その細胞が有する抗原にその蛍光標識抗体を結合させるようにすればよい。
　（抗原・抗体）
　マーカーならびに目的分子（分子Ａおよび分子Ｂ）のそれぞれに対する蛍光標識抗体は公知の手法により作製することができる。例えば、市販されている各種のモノクローナル抗体および蛍光標識キットを用いて、添付されているプロトコールに従い、モノクローナル抗体と蛍光色素のそれぞれが有する所定の官能基同士を所定の試薬の存在下に反応させて結合させることにより、あるいはビオチン－アビジン結合を利用することにより、所望の蛍光標識抗体を作製することができる。
　（蛍光体）
　免疫染色のための蛍光体は特に限定されるものではないが、例えば公知の様々な蛍光体（蛍光色素）を用いることが好適である。第一の目的細胞および第二の目的細胞のそれぞれにおける目的分子あるいはマーカーに対する免疫染色のための蛍光物質同士の励起光波長および蛍光波長、ならびに核染色の蛍光波長の関係性を考慮し、適切な複数枚のカットフィルターを用いることでそれぞれの蛍光をうまく測定できるよう、適切な励起光波長および蛍光波長を有する蛍光物質を選択して用いればよい。
　なお、細胞の固定化処理、浸透化処理、ブロッキング処理などを検体処理工程で行わない場合、必要に応じて染色工程においてそれらの処理を同時に行ってもよい。すなわち、蛍光標識抗体や核染色剤とともに、固定化剤、浸透化剤、ブロッキング剤のうち必要なものが溶解した水溶液を送液し、所定の時間流路を満たして細胞と反応させるようにしてもよい。
　（マーカー分子）
　本発明において第一の目的細胞と第二の目的細胞を免疫染色するために利用されるマーカー分子は、公知の顕微鏡技術、組織学的技術、または分子生物学的技術によって同定可能な、試料中に存在する任意の細胞成分であり、たとえば、表面抗原、膜貫通型の受容体またはコレセプター、表面に結合もしくは凝集しているタンパク質、炭水化物等の高分子、および細胞質成分もしくは核成分などの細胞内成分などを包含するが、これらに限定されない。
　例えば、細胞表面に発現するタンパク質としては、白血球で陽性となりＣＴＣで陰性となるＣＤ４５、白血球で陰性となりＭＣＦ－７等の上皮細胞としての性質を有するＣＴＣで陽性となるＥｐＣＡＭ（Epithelial cell adhesion molecule：上皮細胞接着分子）などが挙げられる。細胞内部に発現するタンパク質としては、例えば、ＣＴＣで陽性となり白血球では陰性となるサイトケラチンが挙げられる。すなわち、ＣＴＣの細胞マーカーとしてはＥｐＣＡＭやサイトケラチンなどを用いることができ、白血球の細胞マーカーとしてはＣＤ４５などを用いることができる。これらの例示した抗原（細胞マーカー）を対象として免疫染色を行った場合に、ＣＤ４５が陰性で、サイトケラチンが陽性の細胞が検出されればその細胞はＣＴＣであり、ＣＤ４５が陽性で、サイトケラチンが陰性の細胞が検出されれば白血球であると判定することができる。
　染色工程の時間、すなわち細胞と蛍光標識抗体溶液とを接触させる時間は、一般的な蛍光免疫染色を行う場合に準じて、免疫染色が十分に行われるよう適宜調整することができるが、通常は５分～半日程度とすればよい。
　染色工程の温度、すなわち反応温度は、一般的な蛍光免疫染色を行う場合に準じて、免疫染色が十分に行われるよう適宜調整することができるが、通常は４～３７℃程度とすればよい。
　本発明ではさらに、第一の目的細胞であるか第二の目的細胞であるかを問わず有核細胞であることを特定するために、核マーカーに対する染色（核染色）をあわせて行うようにする。核染色のためには、二本鎖ＤＮＡにインターカレートすることにより蛍光を発する蛍光色素（分子）を用いることが好適である。そのような蛍光色素は「核染色剤」として公知であり、例えば、細胞膜透過性があり生細胞の核染色が行えるＨｏｅｃｈｓｔ系色素（Hoechst 33342, Hoechst 33258等）を用いることができる。また、細胞膜透過性がないため生細胞の核染色は行えないが、細胞膜が変質しているため透過可能になっている死細胞の核染色が行えるＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）を用いることもできる。
　分子Ａおよび分子Ｂのそれぞれに対する免疫染色は、第一の目的細胞と第二の目的細胞の各細胞マーカーに対する免疫染色と同時に行う、つまりそれらのマーカーと分子ＡおよびＢとを同時に多重染色してもよい。この場合、分子Ａおよび分子Ｂに対応した蛍光標識抗体、ならびに第一の目的細胞および第二の目的細胞の各細胞マーカーに対応した蛍光標識抗体、さらに核染色剤を含有する染色液を、細胞展開基板上に保持された細胞と接触させるようにすればよい。
　また、各細胞マーカーと分子ＡおよびＢとを同時に多重染色するのではなく、各細胞マーカーを染色している抗体を外してから、新たに分子Ａと分子Ｂに特異的な抗体で免疫染色して検出してもよい。逆に、分子Ａと分子Ｂを染色している抗体を外してから、新たに各細胞マーカーで免疫染色することも可能である。
　例えば前者の場合、まず第一の目的細胞および第二の目的細胞の細胞マーカーに対応した蛍光標識抗体を含有する染色液を用いて、第一の目的細胞と第二の目的細胞の各細胞マーカーの蛍光免疫染色を行う。この染色液にはさらに核染色剤を含有させておき、細胞核も同時に染色できるようにする。次に、細胞と解離液とを接触させることより、第一の目的細胞および第二の目的細胞の各マーカーに結合した蛍光標識抗体を解離させるようにする。この際、核染色剤のように抗原抗体反応以外の様式で結合している蛍光物質は、解離剤の影響を実質的に受けずに結合を維持したままである。マーカーに対する蛍光標識抗体を解離させたあと、分子Ａおよび分子Ｂに対応した蛍光標識抗体を含有する染色液を用いて、同様の手順で各目的分子の蛍光免疫染色を行う。
　（解離剤）
　解離剤としては、抗原抗体反応の結合に寄与しているアフィニティ（親和力）を弱める作用を有する物質を用いることができ、例えば、酸、アルカリ、塩、界面活性剤などが挙げられる。このうち酸は、細胞膜や抗原に対するダメージが比較的小さいため好ましく、そのｐＨは、１．０～６．０が好ましい。酸は、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸であっても、カルボン酸（ギ酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸等）、スルホン酸等の有機酸であってもよく、例えば、グリシン塩酸塩（ｐＨ１．５～３程度）のように緩衝作用を有する塩を形成していてもよい。
　なお、界面活性剤は細胞膜を破壊する性質を持つ（浸透化剤として利用される）ため細胞に対するダメージが酸よりも強く、アルカリおよび塩は抗原に対するダメージが酸よりも強いが、解離剤として用いることも可能である。アルカリとしては、例えば水酸化ナトリウム、グリシン－水酸化ナトリウム塩（ｐＨ１１程度の緩衝液）を用いることができる。塩としては、例えば塩化ナトリウム、硫酸アンモニウムを用いることができる。界面活性剤としては、例えばＳＤＳ、塩酸グアニジン、チオ硫酸カリウムを用いることができる。
　抗原抗体解離工程の時間、すなわち細胞と解離液とを接触させる時間は、用いる解離剤の種類および濃度に応じて十分に解離する効果が得られるよう、適宜調整することができるが、例えば、ｐＨ１～６の酸を解離剤として用いる場合は、通常は１０秒～３０分間程度とすればよい。ただし、抗原性を失う程度の過剰な反応にならないように適宜調整するのが良い。
　染色工程を行った後、画像取得工程において染色された細胞の観察像を撮影する前に、必要に応じて洗浄液を添加し、未反応の蛍光標識抗体を除去してもよい。
　―工程（ｄ）：画像取得工程―
　画像取得工程（ｄ）では、染色工程（ｃ）で染色した各細胞マーカーおよび核マーカーの蛍光画像を取得する。第一実施形態ではさらにこの工程において、分子Ａと分子Ｂの蛍光画像を取得することもできる。なお、蛍光画像を取得しなかった場合には、検出工程（ｆ）において、別途走査型装置等による蛍光強度の測定を行う。
　蛍光画像の撮影は、従来と同様の方法で行うことができる。例えば、第一の目的細胞の細胞マーカー、第二の目的細胞の細胞マーカー、核マーカーそれぞれの蛍光画像を撮影するために、第一実施形態においてはさらに必要に応じて、分子Ａおよび分子Ｂそれぞれの蛍光画像を撮影するために、順次、それぞれの蛍光体に対応した適切な波長の励起光を照射し、適切なフィルターを用いて不要な波長成分をカットして、それぞれの蛍光体から発せられる蛍光を観察しながら撮像すればよい。
　また、細胞の形態を確認する等の目的のために、明視野での観察および画像撮影をあわせて行ってもよい。
　この工程において取得したそれぞれの画像は、必要に応じて統合や補正を行った上で、続く同定工程および検出工程に用いることができる。
　―工程（ｅ）：同定工程―
　同定工程（ｅ）では、画像取得工程（ｄ）で取得した各細胞マーカーおよび核マーカーの蛍光画像から、第一の目的細胞、例えばＣＴＣおよび第二の目的細胞、例えば、白血球を同定する。
　例えば、本発明の一態様において、白血球マーカー（たとえばＣＤ４５）：陰性、ＣＴＣマーカー（たとえばサイトケラチン）：陽性、核マーカー：陽性と判定される細胞をＣＴＣと同定し、白血球マーカー：陽性、ＣＴＣマーカー：陰性、核マーカー：陽性と判定される細胞を白血球と同定する。検体中に白血球がＣＴＣよりも多量に（例えばＣＴＣの１００倍以上）含まれていることが想定される場合、核マーカーが陽性であるものを細胞全体と同定し、そのうち白血球マーカー：陰性、ＣＴＣマーカー：陽性のものをＣＴＣ、それ以外の細胞すべてを白血球と同定することもできる。
　―工程（ｆ）：検出工程―
　本発明では、検出工程（ｆ）において、同定工程（ｅ）で第一の目的細胞と同定された細胞のうち分子Ａを発現している細胞、および同定工程（ｅ）で第二の目的細胞と同定された細胞のうち分子Ｂを発現している細胞を検出するようにする。
　第一実施形態では、そのような検出を分子Ａと分子Ｂの各蛍光染色に基づいて行うことができる。例えば、染色工程（ｃ）において、各細胞マーカーおよび核マーカーを染色するとともに、分子Ａと分子Ｂを染色し、ここから画像取得工程（ｄ）で得られたそれぞれの蛍光画像を重ねあわせる。その結果、同定工程（ｅ）において第一の目的細胞と同定した細胞を表している領域に分子Ａを染色した蛍光が検出された場合、その細胞は分子Ａを発現している第一の目的細胞であると同定することができ、同様に、第二の目的細胞と同定した細胞を表している領域に分子Ｂを染色した蛍光が検出された場合、その細胞は分子Ｂを発現している第二の目的細胞であると同定することができる。
　工程（ｄ）において分子ＡおよびＢについて、蛍光画像を取得しなかった場合、走査型装置により蛍光強度のみを測定する。得られた測定データ（操作距離および分子Ａおよび／またはＢの存在を示す蛍光強度）と、蛍光画像から特定した第一目的細胞および第二目的細胞が存在する細胞展開用基板の位置の情報を対比して、"分子Ａを発現している第一目的細胞"および／または"分子Ｂを発現している第二目的細胞"の存在を検出できる。
　第一実施形態においては、たとえば、同定工程（ｅ）において第一の目的細胞と同定された細胞の数を計測するとともに、検出工程（ｆ）において分子Ａを発現している第一の目的細胞と同定された細胞の数を計測し、前者の細胞数に対する後者の細胞数の割合（細胞割合情報）を算出することもできる。同様に、同定工程（ｅ）において第二の目的細胞と同定された細胞の数を計測するとともに、検出工程（ｆ）において分子Ｂを発現している第二の目的細胞と同定された細胞の数を計測し、前者に対する後者の細胞数の割合（細胞割合情報）を算出することもできる。
　また、第一実施形態においては、検出工程（ｆ）において、分子Ａを発現している第一の目的細胞および分子Ｂを発現している第二の目的細胞を第一実施形態と同様の手法で蛍光染色に基づいて検出し、さらに加えてそれぞれの位置情報を取得することで、それぞれの細胞が互いに近接する群を検出することもできる。位置情報に基づく検出を行うには、基準点（レクチルマーク）を備えた細胞展開基板を用いて細胞展開工程（ｂ）を行うことにより、目的となる蛍光を有する細胞が存在する位置情報をその基準点からの座標として取得することができる。たとえば、分子Ａを発現している第一の目的細胞および分子Ｂを発現している第二の目的細胞に対応する蛍光シグナルの位置情報として基準点を用いてそれぞれの座標を求め、座標が一定の範囲内に存在するときに、細胞同士が近接していると判断することができる。上記「一定の範囲」（判断に用いる距離）は目的とする細胞の直径や細胞密度などによって適宜決定することができる。
　検出工程（ｆ）においては、分子Ａを発現している第一の目的細胞および分子Ｂを発現している第二の目的細胞の存在を検出するだけでなく、それらの細胞に発現している分子Ａおよび分子Ｂの発現量情報を取得するようにしてもよい。
　たとえば、分子Ａを発現している第一の目的細胞と同定された細胞から発せられる蛍光の強度、たとえば前述した蛍光画像の重ねあわせにおいて、第一の目的細胞と同定した細胞を表している領域内に含まれる分子Ａに対応した蛍光の強度を、分子Ａの発現量を定量的に示した指標として解析することができる。同様に、第二の目的細胞と同定した細胞を表している領域内に含まれる分子Ｂに対応した蛍光の強度を、分子Ｂの発現量を定量的に示した指標として解析することもできる。その場合は、抗体に標識した蛍光色素の標識率、量子効率、励起波長の強度、露光時間や褪色などの条件の統一に留意する必要がある。
　―第二実施形態―
　第二実施形態では、検体処理工程（ａ）、細胞展開工程（ｂ）および同定工程（ｅ）は第一実施形態と同様に行うことができるが、その他の工程は第一実施形態と組み合わせるか組み合わせないかによって、第一実施形態と同様に行うか改変するかが異なる。
　第一実施形態と組み合わせる場合は、染色工程（ｃ）も、上述した第一実施形態におけるそれらの工程と同様に行うことができる。そして画像取得工程（ｄ）では、第一の目的細胞、第二の目的および核の蛍光画像に加えて細胞分子Ａと分子Ｂの画像を取得することができる。検出工程（ｆ）および（ｆ'）においては、分子Ａ発現細胞（第一の目的細胞）および分子Ｂ発現細胞（第二の目的細胞）の検出や分子Ａおよび分子Ｂにおける発現量情報の解析を、前述した蛍光染色に基づいて行うとともに、次に述べる核酸増幅反応に基づいて行い、それらの両方の結果を利用することができる。
　第一実施形態と組み合わせない場合は、染色工程（ｃ）における分子Ａと分子Ｂの蛍光染色は不要である。また、画像取得工程（ｄ）では、第一の目的細胞、第二の目的および核の蛍光画像のみを取得すればよい。検出工程（ｆ'）では、分子Ａ発現細胞（第一の目的細胞）および分子Ｂ発現細胞（第二の目的細胞）の検出および必要に応じて発現量情報の解析を、前述した蛍光染色に基づいて行うことに代えて、次に述べる核酸増幅反応に基づいて行うこととする。
　―工程（ｆ'）：核酸増幅反応を利用した検出工程（核酸検出工程）―
　第二実施形態における、核酸増幅反応に基づく検出工程（本明細書において「核酸検出工程」と呼ぶ。）は、マイクロチャンバーを備えた細胞展開基板を用いる場合に行われ、核酸増幅反応によって発せられる蛍光に基づいて分子ＡおよびＢそれぞれを検出し、好ましくは詳細に発現量を定量することができる。
　第二実施形態においては、同定工程（ｅ）において蛍光染色により第一の目的細胞または第二の目的細胞と同定された各細胞を格納したマイクロチャンバーの全数に対する、核酸検出工程（ｆ'）において分子Ａまたは分子Ｂの存在が検出されたマイクロチャンバーの数の割合を算出することができる。なお、第一の目的細胞としてＣＴＣを用いる場合、ＣＴＣは稀少であることから、１つのマイクロチャンバー内に回収される数はせいぜい１個であるものと想定されるので、ＣＴＣと同定された細胞を格納したマイクロチャンバーの数をＣＴＣの数とみなし、そのマイクロチャンバーのうち分子Ａに対応した蛍光が確認されたマイクロチャンバーの数を分子Ａが発現したＣＴＣの数とみなしてもよい。
　このような核酸検出工程は典型的には、細胞を収容し保持することができるマイクロチャンバーが表面に形成された細胞展開用基板と、その基板上に天井を有する流路を形成するための流路形成部材を備えた流路デバイスを用いて行われる。核酸検出工程は、具体的には、細胞に含まれる核酸を増幅するための準備段階として、後述するような核酸増幅反応試薬送液工程（この工程は実質的に前述した細胞展開工程（ｂ）において行われる）、核酸増幅反応試薬送液工程、封止液送液工程、核酸増幅反応進行工程および測定工程を含む。
　核酸増幅反応としては様々なものが公知であるが、本発明では、核酸の増幅量を定量的かつ経時的に把握することのできる方法、たとえばＴａｑＭａｎプローブ法、インターカレータ－法またはサイクリングプローブ法のようなリアルタイムＰＣＲ法が好適である。
　核酸増幅反応としてリアルタイムＰＣＲ法などを用いる場合は、その反応で表れる蛍光強度を指標として、分子Ａおよび分子Ｂの各発現量をマイクロチャンバーごとに詳細に定量することができる。この場合それぞれのマイクロチャンバーについて、分子Ａおよび分子Ｂの蛍光強度と、同定工程（ｅ）において計測された第一の目的細胞および第二の目的細胞と同定された細胞の数を対比することにより、それらの細胞１つあたりの平均発現量を指標としたより詳細な解析を行うことも可能である。
　一方、マイクロチャンバーごとにはそれらの発現量の定量を行うことのできない、リアルタイムＰＣＲ法以外の核酸増幅反応を用いる場合、あるいはリアルタイムＰＣＲ法を用いる場合であってもマイクロチャンバーごとの詳細な定量が必要でない場合は、蛍光によってマイクロチャンバーごとの分子Ａおよび分子Ｂの存在を定性的に検出すればよい。
　さらに、第一実施形態において得られる免疫染色に基づく解析結果と、第二実施形態において得られる核酸増幅反応に基づく解析結果とを照合することにより、分子Ａおよび分子Ｂの発現量情報に関する測定値の信頼性をより一層向上させることが可能である。
　また、分子Ａおよび分子Ｂの検出のための核酸増幅反応進行工程と、第一の目的細胞および第二の目的細胞の同定のための染色工程および画像取得工程におけるそれぞれの結果を明確に識別できるようにするため、染色工程において第一の目的細胞および第二の目的細胞を染色するための蛍光と、核酸増幅反応進行工程において分子Ａおよび分子Ｂの核酸増幅を検出するための蛍光とが異なる種類となるようにする、たとえば極大蛍光波長の異なる蛍光色素を用いるようにすることが好ましい。第一実施形態と第二実施形態を組み合わせる場合、（ｉ）分子Ａおよび分子Ｂを免疫染色するための蛍光標識抗体を、前述したような解離剤を用いて分子Ａおよび分子Ｂを解離させてから、マイクロチャンバー内で核酸増幅反応進行工程を行うようにする（その場合、免疫染色用の蛍光物質と核酸増幅反応進行工程用の蛍光物質は、極大蛍光波長が近似している同じ種類のものでも支障はない）か、（ｉｉ）分子Ａおよび分子Ｂを免疫染色するための蛍光標識抗体を残存させたままマイクロチャンバー内で核酸増幅反応進行工程を行うならば、免疫染色用の蛍光物質と核酸増幅反応進行工程用の蛍光物質は、極大蛍光波長が近似していない異なる種類のものにすることが適切である。
　以下、核酸検出工程に含まれる各工程について説明する。
　（核酸増幅反応試薬送液工程）
　核酸増幅反応試薬送液工程では、流路に核酸増幅反応試薬を送液し、マイクロチャンバーを核酸増幅反応試薬で満たすようにする。核酸増幅反応試薬の送液量は、全てのマイクロチャンバーの容積を考慮し、少なくともそれを満たすのに十分な量となるよう適宜調節することができ、流路を含めて核酸増幅反応試薬で満たすようにしてもよい。
　核酸増幅反応試薬は、行われる核酸増幅反応に対応したものとする。たとえば、核酸増幅反応としてＰＣＲ法を用いる場合、その核酸増幅反応試薬としては一般的に、プライマー（ｆｏｒｗａｒｄおよびｒｅｖｅｒｓｅ）、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、耐熱性のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、その他Ｍｇ2+イオンなど必要な要素を含み、ＴａｑＭａｎプローブ等を含む緩衝液（Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー等）など用いる核酸増幅法に適当な試薬が用いられる。
　核酸増幅反応試薬は、好ましくは、細胞溶解補助および／または細胞由来のＰＣＲ反応阻害物質抑制の効果を有する試薬であり、そのような試薬としては例えば、ＭｉｇｈｔｙＡｍｐ（登録商標）　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社）、Ａｌｌｅｌｅ－Ｉｎ－Ｏｎｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｂｌｏｏｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ－Ｏｐｔ　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ（コスモ・バイオ社）、ＥｚＷａｙ（ＴＭ）ダイレクトＰＣＲバッファー（テフコ社）、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（島津製作所）等が挙げられる。
　（封止液送液工程）
　封止液送液工程では、流路に封止液を送液することにより、流路に残存した核酸増幅反応試薬を押し流すことで、マイクロチャンバーを満たす核酸増幅反応試薬同士が連通しないよう、流路を封止液で満たすようにする。封止液の送液量は、全てのマイクロチャンバーの上部の流路の容積を考慮し、それを満たすのに十分な量となるよう、特にマイクロチャンバー内の核酸増幅反応液同士を連通させないため、細胞展開用基板のマイクロチャンバー以外の表面を封止液で被覆することができるよう、適宜調節することができる。
　封止液は、送液したときにマイクロチャンバー内の核酸増幅反応試薬と混合しないよう、核酸増幅反応試薬よりも比重が軽いものが適切である。そのような封止液としては、ＰＣＲ法などの核酸増幅反応に用いられる一般的なものを用いることができ、たとえばミネラルオイルが好ましい。
　（核酸増幅反応進行工程）
　核酸増幅反応進行工程では、細胞（第一の目的細胞および／または第二の目的細胞）を収容し、核酸増幅反応試薬で満たされ、封止液で封止されたマイクロチャンバー内で、その核酸増幅反応試薬に対応した核酸増幅反応を行い、細胞に含まれる核酸を増幅する。このような核酸増幅反応進行工程は、選択した核酸増幅反応に対応した操作を行えばよい。たとえばリアルタイムＰＣＲ法を選択した場合は、鋳型ＤＮＡを熱変性により一本鎖にする温度処理（約９４℃）、この一本鎖にプライマーを結合させる処理（約４０～６０℃）、さらにＤＮＡポリメラーゼを結合させてＤＮＡの合成反応を開始し、進行させる温度処理（約７２℃）を所定のサイクル（約３０～４０サイクル）繰り返し、分子Ａおよび分子Ｂの遺伝子を増幅させる。
　（測定工程）
　測定工程は、蛍光強度をそのマイクロチャンバーにおける分子Ａおよび分子Ｂの発現量（一定時間経過後の遺伝子の増幅量）を反映した定量的な指標として用いる場合は核酸増幅反応の進行と共に行われ、また蛍光をそのマイクロチャンバーにおける分子Ａおよび分子Ｂの発現を反映した定性的な指標として用いる場合は核酸増幅反応の後に行われる工程である。測定工程では、用いられた蛍光体に対応した所定の励起光を照射しながら、各マイクロチャンバーから発せられる蛍光の強度を測定する。たとえば、光学系機構（ＰＭＴ、ＰＤ等）をマイクロチャンバーの配置に沿って走査させながら位置（移動距離）ごとに、フィルターを通過した蛍光の強度を測定することが好ましい。測定対象とする蛍光に応じて、励起光の光源または励起フィルターと蛍光フィルターとを切り替えればよい。所定の塩基配列を有する核酸を含む細胞を収容しており、その核酸が増幅されたマイクロチャンバーの位置では、測定される蛍光強度が高くなる。また、測定工程では必要に応じて、マイクロチャンバーの位置を取得するための反射光、透過光、自家蛍光等を測定してもよい。
　（情報取得工程）
　情報取得工程は上記測定工程に代えて核酸増幅反応の後に行われる工程である。上記測定工程と同様に、分子Ａまたは分子Ｂについての核酸増幅反応に用いられた蛍光体に対応した所定の励起光を照射して細胞展開用基板の蛍光画像をそれぞれ撮影し、取得した蛍光画像を重ねあわせることで、マイクロチャンバーにおける蛍光の有無を確認することにより分子Ａおよび分子Ｂの発現情報を定性的に取得することができる。さらにここで分子Ａおよび分子Ｂの発現が確認されたマイクロチャンバーと同定工程（ｅ）で取得された第一の目的細胞または第二の目的細胞が確認されたマイクロチャンバーの位置情報を重ね合わせることにで、より詳細に分子Ａおよび分子Ｂの発現情報を取得することが可能になる。
　―工程（ｇ）：データ提示工程―
　本発明では、第一実施形態、第二実施形態とも、検出工程（ｆ）のあとに、分子Ａを発現する第一の目的細胞と分子Ｂを発現する第二の目的細胞のそれぞれの位置情報および／または分子Ａと分子Ｂのそれぞれの発現量情報の解析結果に基づいて、それらの分子間の相互作用が関与する疾患の、治療または予防に係る薬剤の投与判断に関するデータを提示することができる。
　たとえば、分子Ａに結合するなど、なんらかの相互作用を起こして分子Ａの機能を阻害する物質であって薬剤として用いられるものを薬剤ａ、同様に分子Ｂに対する物質を薬剤ｂとする。また、位置情報を解析して、複数のサンプルを解析した定量結果を統計的に処理することにより、分子Ａを発現する第一の目的細胞と分子Ｂを発現する第二の目的細胞が互いに近接している群が十分に存在すると判断できる閾値を決定することができる。さらに、発現量情報を解析して、複数のサンプルを解析した定量結果を統計的に処理することにより、分子Ａと分子Ｂが発現していると判断できる閾値を決定することができる。
　このとき、ある疾患の患者から採取した血液試料を分析した結果、分子Ａを発現する第一の目的細胞と分子Ｂを発現する第二の目的細胞が互いに近接している群の数が閾値以上である、および／または、第一の目的細胞上の分子Ａの発現量および第二の目的細胞上の分子Ｂの発現量がそれぞれ閾値以上である場合には、その患者の症状に分子Ａと分子Ｂの相互作用が影響している可能性があるため、その相互作用を阻害することのできる薬剤ａ，薬剤ｂの両方について薬効が期待できる。逆に、分子Ａを発現する第一の目的細胞と分子Ｂを発現する第二の目的細胞が互いに近接している群の数が閾値に達しておらず、かつ分子Ａおよび分子Ｂのいずれかの発現量が閾値に達していない場合は、それらの分子間に相互作用は起こらず、その患者の症状に相互作用は影響していないので、薬剤ａおよびｂのどちらを投与しても効果は期待できない。
　具体例としては、癌患者から採取した血液試料を分析し、ＣＴＣ上に前記分子ＡとしてＰＤ－Ｌ１が、かつ白血球上に前記分子ＢとしてＰＤ－１がそれぞれ閾値以上発現しているかどうか、および／またはＰＤ－Ｌ１を発現したＣＴＣとＰＤ－１を発現した白血球が互いに近接している群が閾値以上存在しているかどうかを判断し、前記薬剤ａとしての抗ＰＤ－Ｌ１抗体および前記薬剤ｂとしての抗ＰＤ－１抗体の薬効が期待できるかどうかによって、それらの薬剤の投与判断に資するデータを提示することが挙げられる。
　なお、このデータ提示工程においては、分子Ａと分子Ｂの各発現量情報および第一の目的細胞と第二の目的細胞の位置情報解析結果に基づく上記のようなデータのみならず、同定工程におけるＣＴＣの同定およびその計数の結果に基づいて、転移性の癌の予後予測や投与している薬剤の治療効果の判断などに関するデータをあわせて提示するようにしてもよい。
　＜細胞解析システム＞
　本発明の細胞解析システムは、上述したような細胞染色と、必要に応じて核酸増幅を行う、本発明の第一の目的細胞と第二の目的細胞の同時検出方法を実施するためのものである。
　すなわち、本発明の細胞解析システムは、（Ａ）検体処理工程を実施するための、患者の血液から赤血球を除去する手段（検体処理手段）；（Ｂ）細胞展開工程を実施するための、検体処理手段（Ａ）で処理した既定量の血液を細胞展開用基板に添加し、第一の目的細胞および第二の目的細胞を基板上に並べる手段（細胞展開手段）；（Ｃ）染色工程を実施するための、第一の目的細胞と第二の目的細胞の各細胞マーカーおよび核マーカーを蛍光体で染色する手段（染色手段）；（Ｄ）画像取得工程を実施するための、染色手段（Ｃ）で染色した各細胞マーカーおよび核マーカーの蛍光画像を取得する手段（画像取得手段）；（Ｅ）画像取得手段（Ｄ）で取得した各細胞マーカーおよび核マーカーの蛍光画像から、第一の目的細胞および第二の目的細胞を同定する手段（同定手段）；および（Ｆ）同定手段（Ｅ）で第一の目的細胞と同定された細胞のうち、特定の分子（分子Ａ）を発現している細胞、および同定手段（Ｅ）で第二の目的細胞と同定された細胞のうち、分子Ａと相互作用する他の特定の分子（分子Ｂ）を発現している細胞を検出する手段（検出手段）を含む。
　上記検出手段（Ｆ）による検出を、分子Ａおよび分子Ｂの各蛍光染色に基づいて行う本発明の第一実施形態においては、染色手段（Ｃ）が分子Ａおよび分子Ｂを蛍光体で染色する手段をさらに含み、画像取得手段（Ｄ）が分子Ａと分子Ｂの蛍光画像を取得する手段をさらに含んでいてもよい。蛍光画像を分子Ａ発現細胞（第一の目的細胞）および分子Ｂ発現細胞（第二の目的細胞）の位置情報を前述した蛍光染色により取得した位置情報に基づいて行い、分子Ａ発現細胞および分子Ｂ発現細胞が互いに近接する群を検出する手段をさらに含む。ここで分子ＡおよびＢについての蛍光画像を取得しなかった場合、走査型装置により蛍光強度のみを測定する手段を含み、得られた測定データ（操作距離および分子Ａおよび／またはＢの存在を示す蛍光強度）と、蛍光画像から特定した第一目的細胞および第二目的細胞が存在する細胞展開用基板の位置の情報を対比して、"分子Ａを発現している第一目的細胞"および／または"分子Ｂを発現している第二目的細胞"の存在を検出する手段を含む。
　上記検出手段（Ｆ）による検出を、分子Ａと分子Ｂの各遺伝子の核酸増幅反応に基づいて行う本発明の第二実施形態においては、検出手段（Ｆ）はマイクロチャンバー内で分子Ａと分子Ｂの各遺伝子の核酸（増幅反応物）を検出する手段、具体的には、核酸増幅反応試薬送液手段、封止液送液手段および核酸増幅反応進行手段、ならびに測定手段または情報取得手段となる。
　さらに、本発明の好ましい実施形態における細胞検出システムは、検出手段（Ｆ）で取得した分子Ａを発現する第一の目的細胞と分子Ｂを発現する第二の目的細胞のそれぞれの位置情報および／または分子Ａと分子Ｂのそれぞれの発現量情報の解析結果に基づいて、それらの分子間の相互作用が関与する疾患の治療または予防に係る薬剤の投与判断に関するデータを提示する手段（データ提示手段）も備える。
　これらの各手段は、例えば以下に記載するような、送液系機構、光学系機構、データ処理機構、およびそれらの制御機構によって、またその他の適切な公知技術を利用して、構築することができる。
　細胞解析システムは一般的に、上記の各手段としての機構を備えた細胞解析装置、流路デバイスおよび試薬収容器によって構成される。流路デバイスおよび試薬収容器は、システムの運用時に細胞解析装置（その内部の流路デバイスホルダーおよび試薬収容器ホルダー）にセットして用いられる。細胞解析装置は、上記の全ての手段（機構）を一体的に備えた装置として構築することも、それぞれ一または複数の手段（機構）を備えた複数の装置群として構築することも可能である。
　＜細胞解析装置＞
　細胞解析装置は少なくとも、細胞展開工程における細胞懸濁液、染色工程における染色液、また必要に応じて、第二実施形態で行われる核酸検出工程における核酸増幅反応試薬および封止液など、各種の液体を流路デバイスの流路に送液するための送液系機構と、それらの工程に用いられる流路デバイスを保持する流路デバイスホルダーおよび試薬収容器を保持する試薬収容器ホルダー、ならびに細胞解析装置が備える各種の機器類の挙動を制御するための制御機構を備える。細胞解析装置はさらに、流路デバイスの細胞展開用基板上に回収され蛍光染色された細胞や、その細胞に含まれる所定の遺伝子（核酸）を増幅させた反応生成物を観察し、それらの蛍光画像を撮像するための光学系機構も、送液系機構と同じ装置内に備えることが好ましい。本発明の第二実施形態においては、細胞解析装置はさらに、マイクロチャンバー温度調節機構などの核酸検出工程を行うために必要な機構も、光学系機構等と同じ装置内に備えることが好ましい。必要であれば、細胞解析装置はさらに、密度勾配遠心等により赤血球等を除去することのできる検体処理機構を、光学系機構等と同じ装置内に備えるようにすることも可能である。
　（検体処理機構）
　検体処理機構は、患者から採取した血液から、溶解や遠心分離などによって赤血球を除去し、実施形態に応じて好ましくはさらに顆粒球等の不要な白血球も除去するための手段に相当する。検体処理機構はさらに、細胞の固定化処理、浸透化処理、ブロッキング処理等、検体処理と同時に行うことのできる各種の処理を行うための機能を兼ね備えていてもよい。
　遠心分離によって赤血球等を除去する場合の検体処理機構は、密度勾配遠心法など所定の手法を用いて遠心分離処理を行うことができる、従来の遠心分離機に準じて構築することができる。また、溶解によって赤血球を除去する場合、さらに必要に応じて細胞の固定化処理、浸透化処理、ブロッキング処理等も行う場合の検体処理機構は、血液に必要な試薬を添加することができるよう、ピペットやチップなどを用いて構築することができる。
　検体処理機構が、送液系機構等を備えた細胞解析装置内に設けられている場合、たとえば血液を収容した採血管をその細胞解析装置にセットすることで検体処理が自動的に行われるようにすることが好ましい。一方で、赤血球を溶解により除去する処理や必要に応じて行われる細胞の固定化処理等を、そのための試薬を収容した採血管内に患者の血液を添加するだけで（血液の抗凝固処理と同時に）行える場合、あるいは送液系機構等を備えた細胞解析装置の小型化を図る場合は、検体処理機構は送液系機構等を備えた細胞解析装置内に組み込む必要はなく、必要に応じて別個の検体処理用の装置（一般的な遠心分離機等）を利用すればよい。そのような場合は、処理済みの検体を送液系機構等を備えた細胞解析装置にセットする。
　（送液系機構）
　送液系機構は、制御手段による制御により、試薬収容器に収容されている細胞懸濁液、染色液、洗浄液、必要に応じて用いられる核酸増幅反応試薬および封止液、その他の試薬類の吸引および吐出を行い、それらの液を流路に送液するための機構である。
　送液系機構は、例えば、シリンジポンプ、交換可能なチップ、さらに任意の位置で液の吸引および吐出を可能にするため流路デバイス（細胞展開用基板）に対して平面方向および垂直方向に移動可能なアクチュエーターなどを用いて構築することができる。シリンジポンプは、各工程において用いられる液体を所望の流量で吸引および吐出ができる能力を有する。
　具体的には、供給手段および送液手段を個別に備える送液系機構と、流入口側にリザーバーを備える流路デバイスを用いることができる。この実施形態では、供給手段は、試薬収容器に収容されている細胞懸濁液等の液体を所定の量、吸引した後、リザーバーで吐出し、それらの液体はリザーバー内に一時的に貯留される。送液手段は流出口に接続され、吸引により、リザーバー内の液体を所定の流量で流入口から流路に導入する。
　また、供給手段および送液手段を兼ね備えた送液系機構と、流出口側にリザーバーを備える流路デバイスを用いることもできる。この実施形態では、送液系機構は、試薬収容器に収容されている細胞懸濁液等の液体を所定の量、吸引した後、それらの液体を流入口において所定の流量で吐出し、流路に直接的に導入する。流路を通過して流出口から流出した液体は、リザーバー内に一時的に貯留することができる。送液により所定の処理が終わった後、送液系機構は流路を満たしていた液体を流入口から吸引して排出する。排出された液体は、試薬収容器の廃液収納部において送液系機構から吐出されるようにしてもよい。
　（マイクロチャンバー温度調節機構）
　本発明の第二実施形態において、細胞解析装置（送液系機構）を用いて核酸増幅反応試薬および封止液を送液する核酸増幅準備方法を実施し終えた流路デバイスを流路デバイスホルダーにセットしたまま、ＰＣＲ等の核酸増幅反応進行工程を引き続き行う場合、流路デバイスホルダーは、各マイクロチャンバーで核酸増幅反応を進行させるために必要な、細胞展開用基板の温度を調節するための手段を備えることが好ましい。
　そのようなマイクロチャンバー温度調節手段は、例えば、ペルチェ素子のような加温と冷却を行う温度調節素子および温度検出素子とを備え、これらは流路デバイスホルダーの細胞展開用基板と接触する部位に設けることができる。そして制御手段が、温度検出素子が測定した細胞展開用基板の温度を参照しながら、温度調節素子による加温又は冷却によって、細胞展開用基板が所定のタイミングで所定の温度となるように温度制御を実行する。
　なお、細胞解析装置（送液系機構）がマイクロチャンバー温度調節機構を備えるものでない場合は、核酸増幅準備方法が行われた流路デバイスを細胞解析装置から取り外し、当該装置とは別個に設けられた核酸増幅反応用の装置に移し替えて、核酸増幅反応進行工程およびその他の工程を行うことも可能である。
　（光学系機構）
　光学系機構は、光源としてのレーザーダイオード（ＬＤ）、集光レンズ、ピンホール部材、ダイクロックミラー、蛍光フィルターなど、蛍光物質を励起して蛍光を発するようにするための部材を含む。ＬＤは、観察の対象とする蛍光物質の励起波長に対応したものとし、必要に応じて複数用意してダイクロックミラーで適切なものが照射されるようにする。蛍光フィルターは、蛍光標識抗体に用いられている蛍光物質の蛍光波長に対応したものとし、必要に応じて複数枚用意してフィルター切り替え器で交換しながら用いるようにする。
　光学系機構はさらに、対物レンズ、対眼レンズ、ＣＣＤカメラなど、蛍光染色された細胞や核酸増幅反応が進行し蛍光を発するマイクロチャンバーを目視で観察できるようにするとともに、それらの蛍光画像を撮影するための部材を含み、必要に応じてさらに、光電子倍増管（ＰＭＴ）など蛍光強度を測定するための部材を含んでいてもよい。
　これらの部材を含む光学系機構は、蛍光顕微鏡に準じた形態のものとして構築することができ、送液系機構とともに細胞解析装置内に組み込むことが好ましい。そのような実施形態であれば、細胞展開工程および染色工程を行った後、また実施形態に応じて、検出工程または核酸検出工程（測定工程）を行った後ないし行いながら、画像取得工程や核酸検出工程に含まれる測定工程を行い、蛍光を発する細胞またはマイクロチャンバーの観察および撮像をスムーズに行うことができる。また、光学系機構を、送液系機構を中心とする装置とは別個の蛍光顕微鏡に準じた装置に設け、前者の装置によって細胞展開工程および染色工程を行った流路デバイスを後者の装置に移動させて、画像取得工程を行うことも可能である。
　マイクロチャンバーを備えた細胞展開用基板を用いて細胞の解析を行う場合、光学系機構はさらに、観察の対象としているマイクロチャンバーの位置、さらにはマイクロチャンバーに収容されている細胞の位置を特定するための手段を備えていてもよい。例えば、細胞展開用基板に基準点（レクチルマーク）を設けておくことにより、目的とするマイクロチャンバー（目的とする細胞または発現分子もしくはその核酸増幅反応物を標識した蛍光を発するマイクロチャンバー）、あるいは目的とする細胞自体の位置の情報をその基準点からの座標として取得することができる。なお、このような基準点に基づく情報を利用すれば、細胞展開用基板を細胞分析装置から別の観察・撮像用の装置に移動させたときにも、その情報に基づき、目的とするマイクロチャンバーまたは細胞を直ちに観察できるようになる。
　また、画像を取得しなくとも、光源から蛍光物質に励起光を照射し、その蛍光物質が発する蛍光の強度を測定するよう、細胞展開用基板上で光学系機構を走査させ、移動距離と蛍光強度の関係から、どの位置に蛍光物質で標識された目的物が存在するかという情報を取得することも可能である。さらに、光源から細胞展開用基板に光を照射しながら走査したときに、その透過光または反射光、あるいは細胞展開用基板の作製材料が発する自家蛍光の強度が、マイクロチャンバーとそれ以外の部位とで相違することを利用して、マイクロチャンバーの位置を特定することができる。このような実施形態における光学系機構は、上記の蛍光、透過光、反射光または自家蛍光を測定するためのフォトダイオード（ＰＤ）のような受光器をさらに含んでいてもよい。マイクロチャンバーの位置に関する情報と、蛍光強度に関する情報とを統合すると、どのマイクロチャンバーに所定の種類の細胞（所定の抗原および／または遺伝子を有する細胞）が収容されていたかを正確に特定することができる。
　（データ処理機構）
　データ処理機構は、画像取得手段や検出手段において光学系機構により取得された、蛍光画像や蛍光強度等のデータの統合、補正などを行うことのできる機構であり、一般的には、画像処理等のデータ処理用プログラム（ソフトウェア）、そのプログラムをコンピュータが実行可能な様式で記憶した記憶媒体、およびそのプログラムを実行するためのコンピュータにより構築することができる。このようなデータ処理機構は、送液系機構および光学系機構等を備えた細胞解析装置に接続して使用される、別個の装置（パーソナルコンピュータ等）として設けてもよいし、送液系機構および光学系機構等を備えた細胞解析装置内に組み込むようにしてもよい。
　データ処理機構は少なくとも、画像取得手段により取得された蛍光画像から、第一の目的細胞（ＣＴＣ等）および第二の目的細胞（白血球等）を同定するための機能を備え、本発明においてはさらに、蛍光画像またはその他のデータから、それらの細胞のうち分子Ａ（ＰＤ－Ｌ１等）を発現している第一の目的細胞および分子Ｂ（ＰＤ－１等）を発現している第二の目的細胞を検出するための機能を備える。
　たとえば、同一の視野における第一の目的細胞の細胞マーカーを標識した蛍光体から発せられる蛍光を表した蛍光画像、第二の目的細胞の細胞マーカーを標識した蛍光体から発せられる蛍光を表した蛍光画像、および核マーカーを標識した蛍光体から発せられる蛍光を表した蛍光画像を統合する処理；その統合画像内でピクセル情報（輝度、色彩）が所定の特徴を有する領域を第一の目的細胞または第二の目的細胞であると同定する処理；そのように同定されたそれぞれの細胞の数を計測する処理；これらの処理を撮像した全ての視野について順次行う処理などを、自動的に実行することのできるプログラムが好ましい。
　本発明の第一実施形態における上記のプログラムはさらに、上記の３種の蛍光画像に、分子Ａを標識した蛍光体から発せられる蛍光を表した蛍光画像および分子Ｂを標識した蛍光体から発せられる蛍光を表した蛍光画像も加えて統合する処理；その統合画像内でピクセル情報（輝度、色彩）が所定の特徴を有する領域を、分子Ａを発現している第一の目的細胞または分子Ｂを発現している第二の目的細胞として検出する処理；そのようにして検出されたそれぞれの細胞の数を計測する処理；これらの処理を撮像した全ての視野について順次行う処理などを、自動的に実行できるようにすることが好ましい。
　上記の処理と同時に、第一の目的細胞上の分子Ａの蛍光強度および第二の目的細胞上の分子Ｂの蛍光強度から、分子Ａおよび分子Ｂのそれぞれの発現量情報を取得することができる。また、第一の目的細胞および第二の目的細胞の位置情報から、第一の目的細胞および第二の目的細胞が互いに近接する群を検出することもできる。これらの処理も自動的に実行できるようにすることが好ましい。
　一方、本発明の第二実施形態における上記のプログラムはさらに、核酸増幅反応を行ったマイクロチャンバーに含まれる蛍光体から発せられる蛍光を表した蛍光画像について、その画像内でピクセル情報（輝度、色彩）が所定の特徴を有する領域を、分子Ａを発現している第一の目的細胞および／または分子Ｂを発現している第二の目的細胞を収容したマイクロチャンバーとして検出する処理；そのようにして検出されたマイクロチャンバーの数を計測する処理；これらの処理を撮像した全ての視野について順次行う処理などを、自動的に実行できるようにすることが好ましい。また、蛍光画像ではなく、例えば前述した走査型の装置により分子Ａおよび分子Ｂの蛍光強度に関するデータを取得した場合も、分子Ａを発現している第一の目的細胞および／または分子Ｂを発現している第二の目的細胞を収容したマイクロチャンバーとして検出する処理など、上記と同様の処理を自動的に実行できるようにすることが好ましい。さらに、第一実施形態のときと同様、蛍光強度に基づいて発現量情報および／または位置情報を取得することもできる。なお、細胞展開用基板上に形成された１つのマイクロチャンバー内にそれらの細胞の両方が含まれている（分子Ａおよび分子Ｂの両方の蛍光が検出される）ときに、それらの細胞が近接しているとみなすことが可能であるが、より至適な場合は、１つのマイクロチャンバー内に存在する分子Ａを発現している第一の目的細胞および分子Ｂを発現している第二の目的細胞の少なくとも一方の数が十分に大きな場合である。
　データ処理機構はさらに、上述したような同定および検出の結果を用いて次のような情報を解析する機能を備えていてもよい。本発明の第一実施形態における上記プログラムは、たとえば、第一の目的細胞および第二の目的細胞のそれぞれの計測数と、分子Ａを発現している第一の目的細胞および分子Ｂを発現している第二の目的細胞のそれぞれの計測数を対比し、第一の目的細胞の全数に対する分子Ａを発現している第一の目的細胞の数の比率と、第二の目的細胞の全数に対する分子Ｂを発現している第二の目的細胞の数の比率を、自動的に算出できるようにすることが好ましい。また、本発明の第二実施形態における上記プログラムは、たとえば、核酸検出工程を行う前に撮影された３種の蛍光画像の統合画像とその画像内のマイクロチャンバーの位置を示す情報から計測した、第一の目的細胞を収容したマイクロチャンバーおよび第二の目的細胞を収容したマイクロチャンバーのそれぞれの数と、核酸検出工程において撮影された蛍光画像とその画像内のマイクロチャンバーの位置を示す情報から計測した、分子Ａを発現している第一の目的細胞を収容したマイクロチャンバーおよび分子Ｂを発現している第二の目的細胞を収容したマイクロチャンバーのそれぞれの数を対比し、第一の目的細胞を収容したマイクロチャンバーの全数に対する分子Ａを発現している第一の目的細胞を収容したマイクロチャンバーの数の比率と、第二の目的細胞を収容したマイクロチャンバーの全数に対する分子Ｂを発現している白血球を収容したマイクロチャンバーの数の比率を、自動的に算出できるようにすることが好ましい。
　データ処理機構は、さらにデータ提示手段として、上述したような解析の結果を用いて、それらの分子間の相互作用が関与する疾患の治療または予防に係る薬剤の投与判断に関するデータを提示する機能を備えることが好ましい。たとえば、ＣＴＣにおいて分子Ａが発現している、ないし患者由来の血液検体が分子Ａを発現しているＣＴＣを含有していると判定するための閾値を予め記憶しておき、検出工程で得られた発現量情報の測定値と対比して、後者の測定値が前者の閾値以上である場合に、分子Ａの機能を阻害する物質であって薬剤として用いられるもの（前記薬剤ａ）および分子Ｂの機能を阻害する物質であって薬剤として用いられるもの（前記薬剤ｂ）は、その患者の疾患の治療または予防に有効であるとの判定結果を示すようにしてもよい。同様に、検出工程で得られた位置情報に基づく、分子Ａを発現する第一の目的細胞と分子Ｂを発現する第二の目的細胞が互いに近接している群の数と、それに関する閾値とを対比して、前記薬剤ａおよび前記薬剤ｂの有効性に関する判定結果を示すようにしてもよい。
　（制御機構）
　制御機構は、所定の工程ないし手順にしたがって細胞検出方法を実施できるよう、細胞解析装置の各種の機器類に接続され、それらの機器類の挙動を制御することのできる機構であり、一般的には、そのような制御用プログラム、そのプログラムをコンピュータが実行可能な様式で記憶した記憶媒体、およびそのプログラムを実行可能なコンピュータにより構築することができる。このような制御手段は、送液系機構および光学系機構等を備えた細胞解析装置に接続して使用される、別個の装置（パーソナルコンピュータ等）として設けてもよいし、マイコンのように送液系機構および光学系機構等を備えた細胞解析装置内に組み込まれるものであってもよい。制御プログラムは、コンピュータが内蔵する記憶媒体に記憶されていてもよいし、ネットワークまたは取り外し可能な記憶媒体を介してパーソナルコンピュータが利用できる状態に置かれていてもよい。
　制御プログラムにより、細胞展開手段（工程）、染色手段（工程）、画像取得手段（工程）などに関する操作を自動化することができる。例えば、所定のタイムスケジュールで、細胞展開工程における細胞懸濁液や、染色工程における染色液を送液するよう送液系機構を操作したり、染色剤に含まれる蛍光体に対応した所定の励起光を照射し、その蛍光画像を撮影するよう光学系機構を操作したりできるものである。本発明の第二実施形態においてはさらに、所定のタイムスケジュールで、核酸検出工程における核酸増幅反応試薬、封止液などを送液するような送液系機構の操作、核酸増幅反応に従いマイクロチャンバーを加熱または冷却するためのマイクロチャンバー温度調節機構の操作、核酸の増幅産物から発せられる蛍光を検出するための、蛍光標識核酸増幅用プローブの蛍光体に対応した所定の励起光の照射および蛍光画像の撮影を行う光学系機構の操作などを、制御プログラムによって自動的に行うことができる。
　さらに、制御機構は、細胞の染色や核酸の増幅に関して取得されたデータ、例えば目的細胞の同定や目的分子の遺伝子の検出に関する蛍光、および任意で行ってもよい、マイクロチャンバーの位置特定に関する透過光、反射光または自家蛍光や、撮影された蛍光画像を記憶し、適切な工程でそれらを読み出したり、適切な機構にそれらを受け渡したりする機能、そのためのプログラムをさらに有することが好ましい。
　＜流路デバイス＞
　流路デバイスは、細胞展開用基板および流路形成部材によって構築されており、これらによって閉鎖されている空間が、細胞懸濁液等の液体を送液して満たすことのできる流路となっている。細胞展開用基板と流路形成部材とは、観察やメンテナンスのしやすさの観点から、係合、ねじ固定、粘着等の手段で取り付け・取り外しが可能なようになっていてもよい。流路の上流側および下流側の末端付近の天井側、すなわち流路形成部材には、上記の各種の液体を流入および排出させるための流入口および排出口が形成されている。
　流路の高さ（細胞展開用基板と天板部材の間隔、すなわち枠部材の厚さ）は、５０μｍ～５００μｍであることが好ましい。流路の高さがそのような範囲内であると、流路内の細胞懸濁液（そこに含まれる細胞）を送液の力で容易に移動させることができるとともに、流路の細胞による目詰まりが発生しにくいため、細胞を円滑に展開することができる。
　流路形成部材は、流路に所定の高さを持たせるための空隙を生み出すとともに流路の平面的な範囲を形作る、流路の側壁を形成する枠部材と、枠部材の上に載せられ流路の天井を形成する天板部材によって構築することができる。天板部材は、流出口と連通している、細胞懸濁液等の液体を一時的に貯留する空間（リザーバー）を備えていてもよい。また、細胞がマイクロチャンバーに細胞が入り込みやすい流れを生じるように、流路の天井部は凹凸のような構造を有してもよい。前記凹凸の位置は、例えばマイクロチャンバーの中心と凹部および凸部の中心とがずれる（垂直線上に来ない）ように調整することができ、そのような位置とすることで細胞懸濁液等の流れが凹部および凸部を境にマイクロチャンバー方面に変化し、細胞が入り込みやすくなる。
　細胞展開用基板および流路形成部材は、例えば、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンコポリマー等のプラスチック、あるいは石英ガラス等のガラスなど、透明な材料で作製されたものが好ましい。細胞解析システムでは通常、蛍光染色された細胞を観察し、撮像するので、細胞解析装置の光学検出系によって特定の細胞を標識した蛍光を測定できるよう、少なくとも流路形成部材のうち天板部材に相当する部分は透明な素材で作製する必要がある。また、枠部材は、適度な弾性と粘着性を有するシリコン樹脂（ポリジメチルシロキサン：ＰＤＭＳ等）のような材料で作製されていてもよく、この枠部材を細胞展開用基板および天板部材で挟み込むことによって流路デバイスを構築するようにしてもよい。
　＜試薬収容器＞
　試薬収容器には、細胞懸濁液、染色液（蛍光標識抗体溶液、核染色剤溶液、またはそれらの混合溶液等）、洗浄液、また本発明の第二実施形態においては核酸増幅反応試薬および封止液、その他の必要な溶液など、細胞検出方法を実施する上で流路に送液する必要のある各種の液体が収容されている。例えば、封止液、洗浄液など比較的保存性の高い液体は、密封された状態であらかじめ試薬収容器の所定の部位に収容しておくことが可能であり、細胞懸濁液、染色液、核酸増幅反応試薬など細胞の染色や核酸の増幅を行う直前に調製する必要のある液体は、調製後に試薬収容器の所定の部位に添加して収容させることができるようにする。洗浄液などのように複数回使用される溶液は、各工程に対応した容量の溶液を別個の部位に収容しておいてもよいし、各工程で同一の組成の溶液を繰り返し使用する場合はそれらの合計の用量の液体を１つの部位に収容しておいてもよい。また、試薬収容器には必要に応じて、送液後に吸引して流路から排出させた廃液を貯留する部位を設けておくようにする。
　［実施例１：免疫染色による検出］
　　（ａ）検体処理工程
　分離液としてPercoll（ＧＥヘルスケア、比重１．１１３）を利用した密度勾配遠心により、健常者由来の血液検体から赤血球を除去した。その血液検体に、ＰＤ－Ｌ１陽性のＭＩＡ　ＰａＣａ－２細胞（ヒト膵臓癌由来細胞株）とＰＤ－１を過剰発現させたＴ細胞をそれぞれ約１０００個、約１００００個ずつ添加したものを患者検体に代わるモデルサンプルとした。このサンプルを遠心して上清を除いた後、２０ｖ／ｖ％ホルマリン液（和光純薬）（ホルムアルデヒドの濃度としては、８ｗ／ｗ％）をホルムアルデヒドが４ｗ／ｗ％になるようにＰＢＳで希釈した溶液と、２０分間室温で反応させて、細胞の固定化処理を行った。
　　（ｂ）細胞展開工程
　直径１００μｍ、深さ５０μｍのマイクロチャンバーを２００００個形成した細胞展開用基板と出入口を有する高さ０．１ｍｍ、幅１５ｍｍの流路を形成できる流路形成部材とで流路デバイスを形成し、一方の出入口をシリンジポンプに連結し、もう一方に試薬を添加するためのリザーバーを形成した。プレウェット液としてＰＢＳをシリンジポンプによる押出で、吸引部側からリザーバー側に、４０ｍＬ、４０ｍＬ／ｍｉｎの流量で、流路内に導入した。固定化された細胞サンプルは、使用する直前にＰＢＳで２回遠心洗浄を行った後、リザーバーに添加し、シリンジポンプによる吸引で、１００μＬ、０．１ｍＬ／ｍｉｎの流量で流路内に導入して、マイクロチャンバー内に細胞を収容した。
　　（ｃ）染色工程
　浸透化処理のためのＴｗｅｅｎ２０を０．１％、およびブロッキング処理のためのＢＳＡを３ｗ／ｖ％含むＰＢＳ溶液に、白血球の特定のためのＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４５抗体（ベックマンコールター）、ＭＩＡ　ＰａＣａ－２細胞（ヒト膵臓癌由来細胞株）の特定のためのＰＥ標識抗サイトケラチン抗体（ベクトンディッキンソン）、および細胞核に結合するＨｏｅｃｈｓｔ、さらにＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　６４７標識抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ＣＳＴ）とＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　７５０標識抗ＰＤ－１抗体（Miltenyi Biotec）を加えた溶液を調製した。この溶液をリザーバーからシリンジポンプによる吸引で導入し、３０分間静置して固定化した細胞と反応させ、その後ＰＢＳで３回洗浄した。
　　（ｄ）画像取得工程
　染色された細胞を蛍光顕微鏡下で観察し、ＦＩＴＣ、ＰＥ、Ｈｏｅｃｈｓｔ、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　６４７、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　７５０のそれぞれに対応した画像を撮影し、それらの撮影画像を統合した。
　　（ｅ）同定工程
　画像取得工程（ｄ）において統合された撮影画像から、ＣＤ４５（ＦＩＴＣ）陰性、サイトケラチン（ＰＥ）陽性、核（Ｈｏｅｃｈｓｔ）がある細胞をがん細胞＝ＭＩＡ　ＰａＣａ－２細胞と同定し、それ以外の核（Ｈｏｅｃｈｓｔ）がある細胞を白血球と同定した。
　　（ｆ）検出工程
　さらに、同定工程（ｅ）においてがん細胞と同定した細胞のうち、ＰＤ－Ｌ１（Alexa Fluor(登録商標) 647）陽性の細胞をＰＤ－Ｌ１発現細胞数として検出し、その細胞数は８６０個と計測された。また、白血球と同定した細胞のうち、ＰＤ－１（Alexa Fluor(登録商標) 750）陽性の細胞をＰＤ－１発現細胞数として検出し、その細胞数は９３００個と計測された。がん細胞のうちＰＤ－Ｌ１分子を発現している細胞の割合は９１％（８６０／９５０）であり、白血球のうちＰＤ－１分子を発現している細胞の割合は３％（９３００／３１００００）であった。
　以上のように、一定容量の血液検体中に含まれるＰＤ－Ｌ１発現がん細胞数およびＰＤ－１発現白血球数がそれぞれ示されることで、抗ＰＤ－Ｌ１抗体等の薬剤における有効性について判断することができる。また、全がん細胞中のＰＤ－Ｌ１を発現しているがん細胞の割合および全白血球中のＰＤ－１を発現している白血球の割合をそれぞれ示すこともできる。
　［実施例２：ＰＣＲによる検出］
　目的分子の発現量情報を、ＰＣＲで計測した"マイクロチャンバー数"に基づいて解析する実施形態として、工程（ａ）、（ｂ）および（ｅ）は実施例１と同様に行い、また工程（ｃ）および（ｄ）においてはＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　６４７標識抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ＣＳＴ）とＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　７５０標識抗ＰＤ－１抗体（Miltenyi Biotec）を添加せず、したがってそれぞれに対応する画像の取得は行わないこと以外は実施例１と同様に行った。工程（ｆ）および（ｇ）は以下のような工程（ｆ'）および（ｇ'）に変更して行った。
　　（ｆ'）核酸検出工程
　核酸増幅反応試薬として、ＰＤ－Ｌ１遺伝子およびＰＤ－１遺伝子を増幅対象とするリアルタイムＰＣＲ用の反応試薬（TaqMan Universal Master Mix II, Life Technologies）を２００μＬ調製した。プライマー（forward およびreverse）、プローブの塩基配列は下記の通りである。
（ｉ）ＰＤ－Ｌ１遺伝子増幅用プライマー
ｆｏｒｗａｒｄプライマー：　５'－ＧＣＣＧＡＡＧＴＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＡＧ－３'
ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：　５'－ＴＣＴＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＣＡＴ－３'
　プローブ：　５'－ＦＡＭ－ＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡ－ＴＡＭＲＡ－３'
（ｉｉ）ＰＤ－１遺伝子増幅用プライマー
　ｆｏｒｗａｒｄプライマー：　５'－ＡＴＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧ－３'
　ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：　５'－ＴＴＡＴＴＴＡＡＡＧＧＧＧＴＴＧＧＣＣＧ－３'
　プローブ：　５'－ＨＥＸ－ＧＧＧＴＣＣＴＣＡＣＣＣＣＣＡＣＧＴＣＡ－ＢＨＱ－２－３'
　　（ｆ'－１）核酸増幅反応試薬送液工程
　　上記反応試薬２００μＬを、シリンジポンプによる吸引で、リザーバー側から０．１ｍＬ／ｍｉｎの流量で流路内に導入した。
　　（ｆ'－２）封止液送液工程
　ミネラルオイル（MP Biomedicals, Inc. 194836）２００μＬを、シリンジポンプによる吸引で、リザーバー側から０．１ｍＬ／ｍｉｎの流量で流路内に導入した。
　　（ｆ'－３）核酸増幅反応進行工程および測定工程
　マイクロチャンバー内に細胞および核酸増幅反応試薬が格納され、ミネラルオイルで封止された流路デバイスに対して、９５℃で３０秒、６０℃で１分間の熱反応サイクルを４０サイクル行った。その後、全てのマイクロチャンバーに対してＦＡＭおよびＨＥＸの蛍光強度を測定した。
　　（ｆ'－４）検出工程
　同定工程（ｅ）においてがん細胞が存在していたマイクロチャンバーの数は９３０個であり、そのうち８４０個、９０％に相当するマイクロチャンバーでＰＤ－Ｌ１の発現を示すＦＡＭによる蛍光を認めた。また、同定工程（ｅ）において白血球が存在していたマイクロチャンバーの数は２００００個（白血球と同定された細胞は２７００００個）であり、そのうち５７００個、全白血球数の２％（５７００／２７００００）に相当するマイクロチャンバーでＰＤ－１の発現を示すＨＥＸによる蛍光を認めた。
　以上のように、一定容量の血液検体中に含まれるＰＤ－Ｌ１発現がん細胞数およびＰＤ－１発現白血球数がそれぞれ示されることで、抗ＰＤ－Ｌ１抗体等の薬剤における有効性について判断することができる。また、全がん細胞中のＰＤ－Ｌ１を発現しているがん細胞の割合および全白血球中のＰＤ－１を発現している白血球の割合をそれぞれ示すこともできる。
配列番号１；ＰＤ－Ｌ１　ｆｏｒｗａｒｄ　プライマー
配列番号２；ＰＤ－Ｌ１　Ｒｅｖｅｒｓｅ　プライマー
配列番号３；ＦＡＭ修飾プローブ
配列番号４；ＰＤ－１　ｆｏｒｗａｒｄ　プライマー
配列番号５；ＰＤ－１　Ｒｅｖｅｒｓｅ　プライマー
配列番号６；ＨＥＸ修飾プローブ

Claims (11)

  1. 　下記（ａ）～（ｆ）の各工程を含む血中細胞の同時検出方法：（ａ）患者の血液から赤血球を除去する工程（検体処理工程）；（ｂ）工程（ａ）で処理を行った既定量の血液を細胞展開用基板に添加し、第一の目的細胞および第二の目的細胞を基板上に並べる工程（細胞展開工程）；
    （ｃ）第一の目的細胞と第二の目的細胞の各細胞マーカーおよび核マーカーを蛍光体で染色する工程（染色工程）；
    （ｄ）工程（ｃ）で染色した各細胞マーカーおよび核マーカーの蛍光画像を取得する工程（画像取得工程）；
    （ｅ）工程（ｄ）で取得した各細胞マーカーおよび核マーカーの蛍光画像から、第一の目的細胞および第二の目的細胞を同定する工程（同定工程）；
    （ｆ）工程（ｅ）で第一の目的細胞と同定された細胞のうち特定の分子（分子Ａ）を発現している細胞、および工程（ｅ）で第二の目的細胞と同定された細胞のうち分子Ａと相互作用する他の特定の分子（分子Ｂ）を発現している細胞を検出する工程（検出工程）。
  2. 　上記工程（ｆ）における検出を、分子Ａと分子Ｂの各蛍光染色に基づいて行い、
    　そのために上記工程（ｃ）において分子Ａと分子Ｂを蛍光体で染色することをさらに含む、請求項１に記載の血中細胞の同時検出方法。
  3. 　上記細胞展開用基板としてマイクロチャンバーを備えたものを使用し、
    　上記工程（ｆ）における検出を、分子Ａと分子Ｂの各蛍光染色に基づいて行うのに代えて、またはそれを行うとともに、マイクロチャンバー内における分子Ａと分子Ｂの各遺伝子の核酸増幅反応に基づいて行う、請求項１または２に記載の血中細胞の同時検出方法。
  4. 　上記工程（ｆ）における検出が、分子Ａを発現する第一の目的細胞と分子Ｂを発現する第二の目的細胞のそれぞれの位置情報を取得し、互いに近接する群を検出することをさらに含む、請求項１または２に記載の血中細胞の同時検出方法。
  5. 　上記工程（ｄ）において分子Ａと分子Ｂの蛍光画像を取得することをさらに含み、または上記工程(ｆ)において細胞展開用基板の蛍光画像を取得することを含む、請求項２～４のいずれか一項に記載の血中細胞の同時検出方法。
  6. 　上記細胞展開用基板として基準点（レクチルマーク）を備えたものを用いることで、細胞展開用基板上の細胞の位置またはマイクロチャンバーの位置を特定した上で蛍光を測定することを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の血中細胞の同時検出方法。
  7. 　上記工程（ｆ）においてさらに、第一の目的細胞の分子Ａと第二の目的細胞の分子Ｂのそれぞれの発現量情報を取得することを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の血中細胞の同時検出方法。
  8. 　上記工程（ａ）において、密度勾配遠心によって赤血球と顆粒球を除去する方法をとる、請求項１～７のいずれか一項に記載の血中細胞の同時検出方法。
  9. 　さらに、（ｇ）
    (i)工程（ｆ）で取得した分子Ａを発現する第一の目的細胞と分子Ｂを発現する第二の目的細胞のそれぞれの細胞割合情報、
    (ii)工程（ｆ）で取得した分子Ａを発現する第一の目的細胞と分子Ｂを発現する第二の目的細胞のそれぞれの位置情報、および
    (iii)工程（ｆ）で取得した分子Ａと分子Ｂのそれぞれの発現量情報、
    　から選ばれる少なくとも一つの情報に基づいて、それらの分子間の相互作用が関与する疾患の治療または予防に係る薬剤の投与判断に関するデータを提示する工程（データ提示工程）を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の血中細胞の同時検出方法。
  10. 　上記第一の目的細胞がＣＴＣであり上記第二の目的細胞が白血球である、請求項１～９のいずれか一項に記載の血中細胞の同時検出方法。
  11. 　上記第一の目的細胞であるＣＴＣが発現する分子ＡはＰＤ－Ｌ１であり、上記第二の目的細胞である白血球が発現する分子ＢはＰＤ－１である、請求項１０に記載の血中細胞の同時検出方法。
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