JP6311609B2 - 希少細胞の回収方法および検出方法 - Google Patents
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Description
工程(X):細胞展開用デバイスの流路に細胞懸濁液を流入させて、細胞をマイクロチャンバーチップ上の流路に展開する工程;および、
工程(Y):前記流路に対する送液と送液の停止とを繰り返す間欠送液を行うことで、前記マイクロチャンバーチップ上の流路に展開された細胞の位置を移動させる移動力を間欠的に付与する工程を含む希少細胞の回収方法である。
細胞染色液で染色された希少細胞を検出可能な光学検出系をさらに備えており、請求項11の検出方法を行う、上記希少細胞回収システム。
図3(A)に、本発明に係る希少細胞の回収方法に使用可能な細胞展開用デバイスの一例を示す。
マイクロチャンバーチップ1は、マイクロチャンバーアレイ〔MCA〕ともいい、その表面にマイクロチャンバー6を一個以上有する。
ここで、マイクロチャンバー6の底部と細胞との接着力を高めることで、マイクロチャンバー6内に細胞を確実に保持できる割合が高くなる。そのため、マイクロチャンバー6内の底部の細胞接着力を高める方法として、例えば、マイクロチャンバー6内の底部に対して、大気雰囲気下でUVを照射するUVオゾン処理や酸素雰囲気下でプラズマを照射する酸素プラズマ処理、あるいは目的細胞と特異的に結合するリガンド(抗体)を塗布することなどを行うことがより好ましい。
マイクロチャンバーチップ1は、必要に応じて、表面処理を施すことができる。表面処理としては、例えばプラズマ処理(酸素プラズマ処理など)やコロナ放電処理、または親水性ポリマーやタンパク質、脂質等でコーティングする処理などが挙げられるが、これらに限定されない。
細胞展開用デバイスのマイクロチャンバーチップ上には、主として細胞懸濁液を流すための流路が形成されている。
流路5の高さ7(図3(A)や図3(B)参照)、すなわち、マイクロチャンバーチップ1のマイクロチャンバー6以外の表面部分から天井部までの距離(以下「天井の高さ」ともいう。)は、50μm〜500μmであることが好ましい。
細胞懸濁液は、希少細胞を含んでいる可能性がある、例えばヒトなどの血液、リンパ液、組織液、体腔液などであり、希釈液などで適宜希釈されていてもよい。また、細胞懸濁液は、生体由来のものに限定されず、試験・研究等のために人工的に細胞を懸濁させて調製した細胞の分散液であってもよい。特に、血液から赤血球を分離した後の細胞懸濁液を適用することがCTC等の希少細胞の回収・検出には好適である。
工程(W)とは、下記の工程(X)および工程(Y)の前に、水よりも表面張力の低い水溶液を送液することによって、マイクロチャンバーチップの表面を濡らす工程である。
工程(X)とは、細胞懸濁液を流路に導入し、細胞をマイクロチャンバーチップ上の流路に(好ましくは均一に)展開する工程である。
工程(Y)とは、間欠送液等の操作により、マイクロチャンバーチップ上の流路に展開された細胞に対して、細胞の位置を移動させる移動力を間欠的に付与することで、流路に存在する細胞を移動させてマイクロチャンバー内に収容する工程である。
「間欠送液」は、図1に示すように、マイクロチャンバーチップ上の流路に展開された細胞、特にマイクロチャンバーチップのマイクロチャンバー以外の表面部分に存在する細胞を送液方向に移動させるための、相対的に短時間の「ワンショット送液」と、細胞が送液方向に基本的に移動せず細胞をマイクロチャンバーチップ表面に実質的に沈降させるための、相対的に長時間の「静置」とからなる。
また、入口部のみから間欠送液してもよいが、入口部と出口部の双方から交互に間欠送液するようにしてもよい。
流路に展開された細胞の位置が移動する移動力を付与する方法としては、マイクロチャンバーチップ上の流路に展開された細胞の位置が移動する移動力を間欠的に付与することができればよいので、上述した間欠送液に限らない。
工程(Z)とは、上記の工程(Y)の後に、上記間欠送液の最大流速と同じ流速か、またはこれより大きい流速で連続送液することによって、マイクロチャンバー内に重層して収容された細胞の一部を、マイクロチャンバー外に出す工程である。
染色工程は、対象とする特定の希少細胞のみを染色することが可能な染色液(例えば、蛍光色素が標識された抗体の溶液)により、マイクロチャンバー内に保持されている希少細胞を染色する工程である。
循環腫瘍細胞〔CTC〕であるか否かは、細胞の核染色が陽性であってCD45が陽性ではない(白血球ではない)ものをCTCと判別することができる。この核染色は例えば細胞を殺さないニュートラルレッド溶液による核染色、CD45の有無の判別は、例えば蛍光標識した抗CD45抗体により抗原抗体反応を行うことができる。これらの染色を、マイクロチャンバーに収容した細胞を対して行うことで、マイクロチャンバー内のどの細胞がCTCであるかを判別することができる。
また、循環血管内皮細胞〔CEC〕の場合には、例えば内皮細胞マーカー(CD31やCD51/61)の発現を蛍光等で標識した抗CD31抗体や抗CD51/61抗体による染色により判別することができる。この場合、さらに腫瘍細胞か否かは、例えば内皮細胞が腫瘍化したときに発現するCD146に対して特異的に反応する、蛍光標識等した抗ヒトCD146によりマイクロチャンバー内に収容した細胞を染色することにより、いずれの細胞が腫瘍化した内皮細胞であるか判別することができる。
例えば、マイクロチャンバー毎の細胞集団について、一般的なALDH活性測定法(細胞のALDH(酵素)+BAAA(基質、Bodipy−aminoacetaldehyde)→BAA−(Bodipy−aminoacetate、蛍光発光))を実施し、ALDH活性を指標に、よりALDH活性が高い細胞集団を循環血管内皮前駆細胞〔CEP〕を含む細胞集団を特定し、さらにこの特定した細胞集団から同様にALDH活性測定法によりどの細胞が循環血管内皮前駆細胞〔CEP〕であるか特定することができる。
検出工程は、染色工程で染色されたマイクロチャンバー内の希少細胞を観察や検出機器等で検出する工程である。
<希少細胞回収システム>
本発明に係る好ましい一例としての希少細胞回収システム100は、図8に例示するように、上述した細胞展開用デバイス10と、細胞展開用デバイス10の流路5(図3参照)に送液可能なポンプを有する送液装置20と、送液装置20の送液等を含む各部材の動作を制御する制御手段17等とを備えている。より好ましくは、希少細胞回収システム100は、さらに、前記細胞展開用デバイス10のマイクロチャンバー6内に回収された希少細胞を検出するための光学検出系50を備えている。
制御手段17は、一般的なパーソナルコンピュータ等であり、図8の例では希少細胞特定部18と記憶媒体19等とを有し、記憶媒体19は送液装置20を制御して上述した工程(X)、工程(Y)、および工程(Z)をこの順で行うためのプログラムを記憶している。また、記憶媒体19は、任意に、工程(X)の前に工程(W)を行うプログラム、および/または、工程(Z)の後に染色工程および検出工程を行うためのプログラムを記憶している。
また、制御手段17は、送液装置20を制御して、送液ステーション21に保管されている各溶液(細胞懸濁液のサンプル22、洗浄液25、及び染色液(標識抗体溶液)24等)を採液させて前記流路6に送液(連続送液、間欠送液)させる。この制御手段17は、間欠送液する際には、マイクロチャンバーチップ上に展開された細胞の位置を移動させる手段として機能する。
希少細胞をマイクロチャンバー6に回収した後に、希少細胞回収システム100の光学検出系50により上述した検出工程を行う場合、以下のように行われる。まず、細胞展開用デバイス10のマイクロチャンバー6内の細胞が存在する状態で、制御手段17の制御により、光源8がマイクロチャンバー6に向けて励起光27を照射し、励起光27が細胞展開用デバイス10のマイクロチャンバー6内や流路5で反射して反射光29と、場合により蛍光28とを生じる。ここで、励起波長27は前述の蛍光色素を励起可能な波長である。
所定の受光位置に配置されたチャンバー検出部16は、前記反射光29を受光して、反射光29の強弱から励起光27の照射位置がマイクロチャンバー6の位置であるか流路5であるかを特定する。一方、細胞展開用デバイス10の上方には、下から順に、集光レンズ11、エミッションフィルタ12、ピンホール部材13、集光レンズ14およびPMT(光電子増倍管)が同軸で配置されており、励起光27の照射によりマイクロチャンバー6内の希少細胞に結合している蛍光標識から発した蛍光28が、希少細胞検出部15に導かれて、希少細胞の蛍光シグナルを希少細胞検出部15で検出する。なお、この検出は上記光学検出系の代わりに蛍光顕微鏡を用いて行うこととしてもよい。制御手段17は、蛍光28の強度から、希少細胞の有無や位置の特定を行い、送液装置20のポンプを制御して希少細胞をピックアップする。
上述した希少細胞回収システム100の他の例として、希少細胞回収システム100の構成に加えて、細胞展開用デバイス10を保持しつつ傾斜させて、制御手段17の制御を受けて、マイクロチャンバーチップ上に展開された細胞の位置を移動させる移動力を上述したように間欠的に付与するシェーカーを設けてもよい。これとは別に、マイクロチャンバーチップを保持可能な保持手段を備え、前記制御手段17の制御を受けて、細胞展開用デバイス10の一端部を保持して間欠的に遠心力を付与することにより、マイクロチャンバーチップ上に展開された細胞の位置を移動させる移動力を上述したように間欠的に付与する遠心装置を設けてもよい。また、細胞展開用デバイス10上のマイクロチャンバー6の位置が予め記憶されて、細胞展開デバイス10の位置制御が行われる場合や細胞展開用デバイス10に基準位置マークなどが付与されている場合など、マイクロチャンバー6の位置を特段に検出する必要なく細胞展開デバイス10の位置制御を行うなどの際には、チャンバー検出部16を省略することもできる。
マイクロチャンバーチップとして、直径100μm、深さ50μmのマイクロチャンバーが格子状に配置(隣接するマイクロチャンバー底面の中心間の距離であるピッチは210μm)されたものを使用した。マイクロチャンバーチップはポリスチレン製であり、マイクロチャンバーの形状は、底部が平坦な逆円錐形であった。
実施例1の工程(Y)の後に、工程(Z)を実施した。すなわち、工程(Z)として、PBSを流量0.1mL/分で200μL連続送液した。図6に示すように、実施例1の工程(Y)実施後、マイクロチャンバー内に収容され一部のマイクロチャンバー内で重層化した細胞(図6(A))が、工程(Z)を実施することによって単層化した(図6(B))。
実施例2の工程(Z)の後に、Hoechst33342染色液を0. 1mL/分で200μL連続送液した。3分後、顕微鏡で細胞を観察した。その結果を図7に示す。このHoechst33342染色液は、Molecular Probe社 「Hoechst33342 10mg/mL solution in water」を同社の手順書に従って希釈して調製した。
図7では、一つのマイクロチャンバーしか示していないが、細胞展開用デバイスに導入した全細胞のうち90%に相当する数の細胞が染色されていた。
実施例1において、マイクロチャンバーチップの代わりに、マイクロチャンバーの底部に、メイワフォーシス社製のUVオゾンクリーナーにてUVオゾン処理を0秒、30秒、1分間行ったマイクロチャンバーチップを使用した以外は実施例1と同様にして工程(W)、(X)、 (Y)を実施した。その後、工程(Z)として、PBSを流量10mL/分で200μL連続送液した。
)をFTA社製の動的接触角計(FTA105)にて測定した結果、70度であった。
顕微鏡で細胞を観察したら、マイクロチャンバー内に収容された第1層目の細胞が安定して保持されていた。
実施例1において、実施例1で用いたPBSの代わりにBSAを3重量%含有するPBSを用いた点、工程(Y)の流量を0.1mL/分から0.05mL/分に変更した点以外は実施例1と同様に工程(W)、(X)および(Y)を実施し細胞を観察した。この結果、より低流量の間欠送液にて実施例1とほぼ同程度の細胞回収率を達成出来た。
実施例1の工程(Y)として、シェーカー(Heidolph社polyMAX1040)を20rpm1分間とその後の5秒間の静置を連続的に10回繰り返した。細胞を観察した結果、ポンプ駆動なしで実施例1とほぼ同程度の細胞回収率を達成出来た。
実施例1において、工程(Y)を実施しなかった以外は実施例1と同様に細胞観察を行った。
その結果、図5(A)と同様に、マイクロチャンバー外にも細胞が多数散らばっていた。
2 ・・・流路形成枠体
2a・・・流路天板
2b・・・流路シール
3 ・・・入口部
4 ・・・出口部
5 ・・・流路
6 ・・・マイクロチャンバー
7 ・・・流路5の高さ
10 ・・・細胞展開用デバイス
10A ・・・リザーバー
11 集光レンズ
12 エミッションフィルタ
13 ピンホール部材
14 集光レンズ
15 PMT
16 チャンバー検出部
17 コンピュータ
18 希少細胞特定部
19 記憶媒体
20 送液ポンプ(送液装置)
21 送液ステーション
22 サンプル
23 希釈液
24 標識抗体溶液
25 洗浄液
26 廃液容器
27 励起光
28 蛍光
29 反射光
50 光学検出系
100 希少細胞回収システム
Claims (13)
- 細胞を収容、保持することができるマイクロチャンバーを表面に有するマイクロチャンバーチップ上に流路が形成された細胞展開用デバイスに細胞懸濁液を流入させ、該細胞懸濁液中の希少細胞を前記マイクロチャンバー内に回収する方法であって、
工程(X):細胞展開用デバイスの流路に細胞懸濁液を流入させて、細胞をマイクロチャンバーチップ上に展開する工程;および、
工程(Y):前記流路に対する送液と送液の停止とを繰り返す間欠送液を行うことで、前記マイクロチャンバーチップ上に展開された細胞の位置を移動させる移動力を間欠的に付与する工程を含む希少細胞の回収方法。 - 前記移動力は、前記マイクロチャンバー外に位置する細胞を移動させる力である、請求項1に記載の希少細胞の回収方法。
- 工程(W):前記工程(X)の前に、水よりも表面張力の低い水溶液を送液することによって、前記マイクロチャンバーチップの表面を濡らす工程をさらに含む、請求項1又は2に記載の希少細胞の回収方法。
- 前記工程(X)において、前記流路へ導入する細胞懸濁液の流速を調節することにより、前記マイクロチャンバーチップの上の流路に均一に細胞を展開させる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の希少細胞の回収方法。
- 前記工程(Y)において、前記マイクロチャンバー外に位置する細胞が往復移動するように前記移動力を間欠的に付与する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の希少細胞の回収方法。
- 工程(Z):前記工程(Y)の後に、前記間欠送液の最大流速と同じ流速か、またはそれより大きい流速で連続送液することによって、前記マイクロチャンバー内に重層して収容された細胞の一部を、前記マイクロチャンバー外に出す工程をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の希少細胞の回収方法。
- 上記希少細胞が、循環腫瘍細胞〔CTC〕、循環血管内皮細胞〔CEC〕および循環血管内皮前駆細胞〔CEP〕のいずれか一種以上の細胞である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の希少細胞の回収方法。
- 前記マイクロチャンバーチップに対して流路形成枠体を一体的に設けることで前記流路が形成されている、請求項1〜7のいずれか一項に記載の希少細胞の回収方法。
- 前記流路形成枠体に前記流路に連通する入口部と出口部が設けられている、請求項8に記載の希少細胞の回収方法。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の希少細胞の回収方法により、希少細胞を回収した後に前記マイクロチャンバーの流路に細胞染色液を送液して、細胞染色と希少細胞の検出を行う、希少細胞の検出方法。
- 細胞を収容、保持することができるマイクロチャンバーを表面に有するマイクロチャンバーチップ上に流路が形成された細胞展開用デバイスと、該細胞展開用デバイスの流路に細胞懸濁液を送液する送液装置と、前記マイクロチャンバーチップ上に展開された細胞の位置を移動させる移動力を間欠的に付与する手段とを備え、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法を行う、希少細胞回収システム。
- 細胞染色液で染色された希少細胞を検出可能な光学検出系をさらに備えており、請求項10の検出方法を行う、請求項11に記載の希少細胞回収システム。
- 前記送液装置は、送液を発生させる駆動と送液圧を発生させない無駆動の状態の静置を繰り返す、請求項11に記載の希少細胞回収システム。
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