WO2014061675A1 - 希少細胞の回収方法および検出方法 - Google Patents

希少細胞の回収方法および検出方法 Download PDF

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WO2014061675A1
WO2014061675A1 PCT/JP2013/078006 JP2013078006W WO2014061675A1 WO 2014061675 A1 WO2014061675 A1 WO 2014061675A1 JP 2013078006 W JP2013078006 W JP 2013078006W WO 2014061675 A1 WO2014061675 A1 WO 2014061675A1
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cells
microchamber
cell
flow path
rare
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PCT/JP2013/078006
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淳吾 荒木
久美子 星
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コニカミノルタ株式会社
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
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    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics

Definitions

  • the present invention relates to a method for recovering and detecting rare cells from cells contained in a cell suspension developed in a flow path on a microchamber chip using a cell development device having a microchamber chip.
  • Circulating tumor cells [CTC], circulating vascular endothelial cells [CEC], circulating vascular endothelial progenitor cells [CEP], various stem cells, etc. are contained in whole blood according to the pathological condition. It is a very rare cell. Despite the obvious clinical utility of rare cell detection, it is extremely difficult to detect. In recent years, various cell separation techniques have been applied to attempt detection and commercialization. In any case, the effectiveness of detection results was evaluated because of the rarity of the target (rare cell loss or unwanted cell contamination). It is important to
  • a cell suspension such as a blood-derived sample is expanded in a flat shape, and then all the expanded cells are analyzed. Thus, it can be determined whether or not the target cell exists in the cell suspension.
  • Patent Document 1 discloses a cell tissue microdevice.
  • a “cell holding chamber” is formed on the surface of the cell tissue microdevice.
  • Cells for example, primary hepatocytes, etc.
  • An organization can be formed.
  • this cell tissue microdevice When this cell tissue microdevice is used to spread the cell suspension into a flat shape, the method of simply adding the cell suspension cannot sufficiently collect the cells in the cell holding chamber. Many cells are expected to remain outside the cell holding chamber. In addition, immediately after the start of perfusion culture, cells remaining outside the cell holding chamber may be discharged from the cell tissue microdevice.
  • the present invention when a cell suspension containing a large amount of various types of cells such as blood, for example, is developed in a flow path on a microchamber chip, each of the total number of cells contained in the cell suspension
  • a method for recovering and detecting rare cells that can reduce the loss of rare cells by improving the ratio of the total number of cells that can be held in the microchamber (hereinafter also referred to as “cell recovery rate”).
  • cell recovery rate A method for recovering and detecting rare cells that can reduce the loss of rare cells by improving the ratio of the total number of cells that can be held in the microchamber.
  • the present inventors developed the cells contained in the cell suspension using the cell development device, and then determined the position of the cells developed in the flow path on the microchamber chip. It has been found that the cell recovery rate is remarkably improved by intermittently applying the moving force to be moved, and the present invention has been completed.
  • a method for collecting rare cells reflecting one aspect of the present invention is provided on a microchamber chip having a microchamber on the surface that can contain and hold cells.
  • a cell suspension is caused to flow into a cell deployment device having a flow path formed therein, and rare cells in the cell suspension are collected in a microchamber, Step (X): flowing the cell suspension into the flow path of the cell deployment device and spreading the cells into the flow path on the microchamber chip; and Step (Y): A method for collecting rare cells, including a step of intermittently applying a moving force for moving the position of a cell developed in the flow path on the microchamber chip.
  • the recovery rate of the cells into the microchamber is extremely high, that is, the flow path is provided on the microchamber. Almost all the cells developed in the formed cell deployment device can be accommodated and held in the microchamber, and the loss of rare cells that can exist in the cell suspension can be reduced.
  • FIG. 1 shows a time-dependent graph of the liquid supply pressure and the flow rate in the flow path when performing “intermittent liquid supply” to the flow path of the cell deployment device in the step (Y).
  • FIG. 2 shows a graph over time in which the flow velocity in the flow channel is plotted when the liquid is continuously fed to the flow channel of the cell deployment device.
  • FIG. 3 schematically shows a cross-sectional view of the cell deployment device cut along the flow path direction. The broken arrow indicates the liquid flow direction of the flow path.
  • FIG. 3A shows a device for cell deployment in which the bottom surface of the flow path is formed by the microchamber chip 1.
  • FIG. 3B shows a cell deployment device in which the bottom surface of the channel is formed by the microchamber chip 1 and the channel forming frame 2.
  • FIG. 4 is a diagram schematically showing a specific example of a cell deployment device.
  • 4A shows a top view of the cell deployment device
  • FIG. 4B shows a cross-sectional view of the cell deployment device of FIG. 4A cut along the line A′-A ′.
  • FIG. 5A shows an enlarged image of the surface of the microchamber chip after step (X) in Example 1.
  • FIG. 5B shows an enlarged image of the surface of the microchamber chip after the step (Y) of Example 1.
  • FIG. 6A shows an enlarged image of a microchamber containing cells in a layered state in the microchamber after step (Y) of Example 1.
  • FIG. FIG. 6B shows an enlarged image of the single-layered microchamber after step (Z) in Example 2.
  • FIG. 7 shows an enlarged image of the microchamber after staining in Example 3.
  • FIG. 8 shows a rare cell recovery system as a preferred example according to the present invention.
  • a method for recovering rare cells according to the present invention is a method for recovering rare cells that may be contained in a cell suspension from a cell suspension using a device for cell expansion.
  • the moving force is preferably a force that moves cells located outside the microchamber.
  • the method further includes a step (W) of wetting the surface of the microchamber chip by feeding an aqueous solution having a lower surface tension than water before the step (X).
  • the cells are uniformly developed in the channel above the microchamber chip by adjusting the flow rate of the cell suspension introduced into the channel.
  • step (Y) it is preferable that the moving force is intermittently applied so that cells located outside the microchamber reciprocate.
  • step (Y) it is preferable to intermittently apply the moving force by performing intermittent liquid feeding that repeats liquid feeding to the flow path and stopping of the liquid feeding.
  • the method further includes a step of taking out the micro chamber.
  • the rare cells are preferably one or more of circulating tumor cells [CTC], circulating vascular endothelial cells [CEC] and circulating vascular endothelial precursor cells [CEP].
  • CTC circulating tumor cells
  • CEC circulating vascular endothelial cells
  • CEP circulating vascular endothelial precursor cells
  • the flow path is formed by providing a flow path forming frame integrally with the microchamber chip.
  • the flow path forming frame is provided with an inlet and an outlet that communicate with the flow path.
  • a rare cell detection method reflecting one aspect of the present invention is a method for detecting a rare cell after collecting the rare cell by the rare cell collection method.
  • the cell staining solution is fed to the cell to perform cell staining and detection of rare cells.
  • liquid feeding includes continuous liquid feeding and intermittent liquid feeding.
  • a cell deployment device having a channel formed on a microchamber chip having a microchamber on its surface that can contain and hold cells, and a cell suspension for feeding a cell suspension to the channel of the cell deployment device
  • a rare cell recovery system comprising: a liquid device; and means for intermittently applying a moving force for moving the position of a cell developed on the microchamber chip.
  • recovery system which is further provided with the optical detection system which can detect the rare cell dye
  • FIG. 3A shows an example of a cell deployment device that can be used in the method for collecting rare cells according to the present invention.
  • the cell deployment device 10 includes a microchamber chip 1 in which a microchamber 6 is formed, and a microchamber chip 1 in which a flow path 5 is formed on the microchamber 6.
  • the flow channel forming frame 2 provided integrally, the inlet 3 provided in the flow channel forming frame 2, and the cell suspension flowing into the flow channel 5 from the inlet 3 are discharged from the flow channel 5. Therefore, it has an outlet portion 4 and the like provided in the flow path forming frame 2.
  • the microchamber chip 1 is also called a microchamber array [MCA], and has one or more microchambers 6 on the surface thereof.
  • the microchamber refers to a concave fine hole (microwell) capable of “accommodating” and “holding” one or more cells, and preferably has a bottom (that is, not a through hole).
  • holding means that cells contained in the microchamber are difficult to get out of the microchamber by sending a staining solution or a washing solution to the flow path of the microchamber chip for cell deployment.
  • the diameter of the upper opening of the microchamber 6 is preferably 20 ⁇ m to 500 ⁇ m.
  • the diameter is in the range of 20 ⁇ m to 500 ⁇ m, the cells can be suitably accommodated and held in the microchamber 6.
  • the depth of the microchamber 6 is preferably changed depending on the diameter of the microchamber 6, and the depth of the chamber can be appropriately determined according to the number of cells to be accommodated per microchamber. Specifically, it is preferable to appropriately determine the depth of the chamber so that about 10 to 15 cells can be accommodated. Typically, the depth of the microchamber 6 is 20 ⁇ m to 500 ⁇ m.
  • the shape of the microchamber 6 is an inverted conical shape with a flat bottom (the longitudinal section shows a trapezoidal shape), but is not limited thereto, and is, for example, a cylindrical shape, an inverted hemispherical shape, or an inverted pyramid. It may be a shape (inverted polygonal pyramid, inverted hexagonal pyramid, etc.), a rectangular parallelepiped, or the like.
  • the bottom of the microchamber 6 is typically flat, but may be a curved surface.
  • the ratio of reliably retaining the cells in the microchamber 6 is increased.
  • the bottom of the microchamber 6 is subjected to UV ozone treatment in which UV is irradiated in an air atmosphere or oxygen that is irradiated with plasma in an oxygen atmosphere. More preferably, plasma treatment or coating of a ligand (antibody) that specifically binds to the target cell is performed.
  • the material of the microchamber chip 1 the same material as that of a conventionally known microplate can be used.
  • polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyamide, polycarbonate, polydimethylsiloxane [PDMS], polymethylmethacrylate [PMMA], cyclic olefin A polymer such as a copolymer [COC] may be mentioned.
  • the microchamber chip 1 may be a combination of a plurality of materials in which a molded polymer is bonded to a substrate made of metal, glass, quartz glass, or the like.
  • the manufacturing method of the microchamber chip 1 may be a method of forming using a mold having a convex portion corresponding to the shape of the microchamber 6 on the surface of the mold substrate, and is made of the polymer, metal, glass, or the like.
  • a method of forming a microchamber by performing direct processing (for example, fine processing by lithography, excavation processing, LIGA process, etc.) on the substrate may be used, but from the viewpoint of productivity, a manufacturing method of forming using a mold is preferable. .
  • the microchamber chip 1 can be subjected to surface treatment as necessary.
  • the surface treatment include, but are not limited to, plasma treatment (oxygen plasma treatment or the like), corona discharge treatment, or treatment with a hydrophilic polymer, protein, lipid, or the like.
  • a surface treatment is performed to make the microchamber chip 1 for cell deployment non-adherent to the inner wall surface of the microchamber 6.
  • a blocking agent is used for this surface treatment.
  • the blocking agent refers to a substance that prevents the cells from adsorbing nonspecifically thereto by covering the flow path 5 on the inner surface of the microchamber chip 1 or flow path forming frame 2.
  • the surface treatment makes it easy for cells to accumulate on the bottom surface without adsorbing to the inner wall of the microchamber 6, thus facilitating cell observation in a bright field under the microscope.
  • blocking agent examples include casein, skim milk, albumin (including bovine serum albumin [BSA]), hydrophilic polymers such as polyethylene glycol, phospholipids, and low molecular compounds such as ethylenediamine and acetonitrile. These may be used alone or in combination of two or more.
  • albumin including bovine serum albumin [BSA]
  • hydrophilic polymers such as polyethylene glycol, phospholipids, and low molecular compounds such as ethylenediamine and acetonitrile.
  • the blocking solution is prepared by diluting the blocking agent with an appropriate solvent.
  • This solvent is selected according to the blocking agent.
  • a solvent that is compatible with a biological substance similar to the solvent in which the cells to be expanded are suspended is preferable.
  • phosphate buffered saline [PBS] HEPES, MEM, RPMI, phosphate buffer and the like are used.
  • FIG. 3A shows an example of the flow path, but the present invention is not limited to this example as long as the cell suspension can be circulated on the microchamber chip 1.
  • the surface of the microchamber chip 1 excluding the microchamber 6 portion is used as the bottom surface, and the inner surface of the flow path forming frame 2 provided integrally with the microchamber chip 1 is used as the side surface.
  • the flow path 5 is formed as a part and a ceiling part.
  • the flow path 5 communicates with the inlet portion 3 and the outlet portion 4 of the flow path forming frame 2, and the cell suspension flowing from the inlet portion 3 flows through the flow path 5 in the direction indicated by the dashed arrow.
  • the outlet 4 flows out.
  • the bottom surface of the flow path is formed between the surface portion of the microchamber chip 1 excluding the microchamber 6 portion and the inner surface of the flow path forming frame 2. You may form from a part.
  • the microchamber may be retained or adhered to this portion. 6 may lead to cell loss.
  • the bottom surface part in question is replaced with a part of the microchamber chip 1, or conversely, the inlet 3 or the like is formed so that the cell suspension does not flow down on the bottom surface part in question. It is desirable that the flow path is not formed by a member other than the microchamber chip 1.
  • microchamber chip 1 and the flow path forming frame 2 are preferably configured to be attachable to and detachable from each other by means such as engagement, screw fixing, and adhesion ( Not shown).
  • the height 7 of the flow path 5 (see FIGS. 3A and 3B), that is, the distance from the surface portion of the microchamber chip 1 other than the microchamber 6 to the ceiling (hereinafter referred to as “ceiling height”). Is also preferably 50 ⁇ m to 500 ⁇ m.
  • the height of the ceiling is in the range of 50 ⁇ m to 500 ⁇ m, it becomes possible to easily move the cells attached to the surface portion other than the microchamber 6 of the microchamber chip 1 by the force of the liquid flow. Moreover, the time until the cells settle on the surface of the microchamber chip 1 can be shortened. Further, it is preferable because clogging of cells in the channel is less likely to occur, and the cells can be smoothly developed.
  • the same material as that of the microchamber chip 1 is preferably used.
  • the flow path forming frame 2 may be subjected to a coating treatment with lipid or the like.
  • the flow path forming frame 2 is constituted by a flow path top plate 2a and a silicon sheet having adhesiveness on both sides, that is, a flow path seal 2b, and the flow path seal 2b.
  • the flow path 5 can also be formed by sandwiching the flow path seal 2b between the flow path top plate 2a and the microchamber chip 1 by adhesion.
  • Reference numeral 2c denotes an auxiliary frame.
  • the strength of clamping is adjusted, and the dimensions of the channel such as the ceiling height and channel volume are adjusted, and the pressure is fed into the channel. It is possible to adjust the flow rate, and hence the ease of cell deployment.
  • a reservoir 10A may be provided so as to be connected to the outlet 4 of the flow path 5.
  • the volume of the reservoir 10A is, for example, about 500 ⁇ L, and the cell suspension flowing in from the inlet portion 3 is discharged from the outlet portion 4 and temporarily stored in the reservoir 10A.
  • the cell suspension may contain rare cells, for example, blood such as human, lymph fluid, tissue fluid, body cavity fluid, etc., and may be appropriately diluted with a diluent or the like.
  • the cell suspension is not limited to those derived from living organisms, and may be a cell dispersion prepared by suspending cells artificially for testing and research.
  • application of a cell suspension after separating red blood cells from blood is suitable for collecting and detecting rare cells such as CTC.
  • rare cells include cancer cells.
  • the rare cells are any of CTC (circulating tumor cells or circulating cancer cells), CEC (circulating vascular endothelial cells) and CEP (circulating vascular endothelial progenitor cells).
  • CTC circulating tumor cells or circulating cancer cells
  • CEC circulating vascular endothelial cells
  • CEP circulating vascular endothelial progenitor cells
  • One or more types of cells may be used.
  • the diameter of various cells contained in such a cell suspension is preferably 10 to 100 ⁇ m, but at least smaller than the diameter of the microchamber.
  • the step (W) is a step of wetting the surface of the microchamber chip by feeding an aqueous solution having a surface tension lower than that of water before the following step (X) and step (Y).
  • the aqueous solution having a surface tension lower than that of water is not particularly limited as long as the surface tension is lower than that of water.
  • the preferred range of the surface tension ⁇ (mN / m) of the aqueous solution to be sent is as follows: Generally 10 ⁇ ⁇ ⁇ 60, more preferably 10 ⁇ ⁇ ⁇ 40, even more preferably 10 ⁇ ⁇ ⁇ 35, even more preferably 10 ⁇ ⁇ ⁇ 30, and even more. Preferably, 10 ⁇ ⁇ ⁇ 25.
  • aqueous solutions whose surface tension is lower than water include aqueous solutions containing alcohols such as ethanol, methanol, isopropyl alcohol, and surfactants such as TWEEN (registered trademark) 20, TRITON (registered trademark) X, and SDS.
  • An aqueous solution containing 0-1% (w / v) is relevant.
  • the surface tension of ethanol (aqueous solution) at 20 ° C. is 22.4 when the concentration is 100 wt%, 26.0 when the concentration is 70 wt%, and 47.9 when the concentration is 10%.
  • the flow path 5 is preferably filled with physiological saline (preferably the same solvent as the cell suspension used in the step (X)) such as PBS [phosphate buffered physiological saline].
  • physiological saline preferably the same solvent as the cell suspension used in the step (X)
  • PBS phosphate buffered physiological saline
  • Step (X) is a step of introducing a cell suspension into a flow path and spreading (preferably uniformly) cells into the flow path on the microchamber chip.
  • the cell suspension is continuously and uniformly fed from the inlet 3, and when the flow path is filled with physiological saline in the step (W), the physiological saline is replaced. Then, the flow path 5 is filled with the cell suspension. At this time, the physiological saline is discharged from the outlet portion 4 simultaneously with the introduction of the cell suspension from the inlet portion 3 (see FIGS. 3A and 3B).
  • continuous uniform liquid feeding refers to liquid feeding in which the flow path is maintained at a constant flow rate as shown in FIG.
  • the cells are less likely to stay in the microchamber 6 in the vicinity of the inlet portion 3 of the cell deployment device 10 in proportion to the flow rate.
  • the cell development in the longitudinal direction becomes uniform, which is preferable.
  • the flow rate of the cell suspension introduced into the flow path is set to be larger than 10 mL / min, the cells are difficult to spread in the short direction of the microchamber chip, and the cell deployment is uneven. Therefore, it is set to about 1 mL / min within a range of 10 mL / min or less.
  • the cells contained in the cell suspension by allowing it to stand for a certain period of time (for example, 1 to 15 minutes) after the introduction of the cell suspension. At this time, for example, as shown in FIG. 5A, some cells are accommodated in the microchamber 6, and some cells adhere to the surface portion other than the microchamber 6 of the microchamber chip 1.
  • step (Y) If the cells are evenly spread in the flow path on the microchamber chip 1, more cells can be recovered in the microchamber by intermittent liquid feeding performed in the following step (Y).
  • the time required to reach a predetermined cell recovery rate in the step (Y) can be shortened, that is, the cells are easily accommodated in the microchamber 6 by a smaller number of intermittent liquid feedings. Is preferable.
  • Step (Y) is a process of intermittently applying a moving force that moves the position of the cells to the cells developed in the channels on the microchamber chip by an operation such as intermittent liquid feeding. In this step, the cells existing in the cell are moved and accommodated in the microchamber.
  • This moving force is preferably a force that mainly moves cells located in the flow path outside the microchamber.
  • the “intermittent liquid feeding” is for moving cells developed in the flow path on the microchamber chip, particularly cells existing on the surface portion other than the microchamber of the microchamber chip in the liquid feeding direction.
  • the relatively short-time “one-shot feeding” and the relatively long time “in order to allow the cells to essentially settle on the surface of the microchamber chip without the cells moving in the feeding direction” "Standing".
  • the period from the start of this “one-shot liquid feeding” to the end of “stationary”, that is, from the start of “one-shot liquid feeding” to the start of the next “one-shot liquid feeding” is defined as one cycle of intermittent liquid feeding.
  • the device that drives the liquid supply does not generate a liquid supply pressure (that is, it is in a non-driven state), it will be “standing still”.
  • the standing may include a state in which the flow rate does not show zero due to the inertia of the liquid feeding pressure generated just before that.
  • the pressure is instantaneously high in the flow path, and the flow velocity from the center of the flow path to the flow path periphery on both sides in a direction perpendicular to the flow path direction is almost uniform.
  • the cells attached to the surface portion other than the microchamber of the microchamber chip are easily moved. By subsequent standing, at least a part of the moved cells is accommodated in the microchamber.
  • a solution such as a buffer that does not adversely affect the collection and detection of rare cells is sent.
  • a predetermined amount of physiological saline for example, the same buffer as the cell suspension used in the step (X) is sent to the flow path.
  • the liquid feeding amount is preferable to set the liquid feeding amount to, for example, about 1/100 to 1/2 (for example, 1/50) of the volume of the cell suspension introduced into the channel.
  • the flow rate per unit time is 1 to 1000 ⁇ L / sec when the cross-sectional area of the flow path is 1 to 1000 mm 2 (the flow rate per second is 1 mm / sec or less). It is preferable to adjust to.
  • the flow rate is preferably adjusted to 1500 ⁇ L / second or less.
  • the one-shot liquid feeding After the one-shot liquid feeding, let it stand for a predetermined time (for example, 1 to 30 seconds). Specifically, this standing is performed for 3 to 5 seconds, for example.
  • a predetermined time for example, 1 to 30 seconds. Specifically, this standing is performed for 3 to 5 seconds, for example.
  • one cycle of intermittent liquid feeding from one-shot liquid feeding to standing is repeated twice or more, more preferably 10 times or more, further preferably 60 times or more.
  • the cell moves about 50 ⁇ m by one-shot liquid feeding.
  • intermittent liquid feeding when intermittent liquid feeding is performed a plurality of times, the flow rate of one-shot liquid feeding, the conditions for standing time, and the like may be different or the same in each cycle. Further, intermittent liquid feeding may be performed only from the inlet part, but intermittent liquid feeding may be alternately performed from both the inlet part and the outlet part.
  • intermittent liquid feeding may be performed once or a plurality of times from the inlet to the flow path, and then intermittent liquid feeding may be performed one or a plurality of times from the outlet to the flow path.
  • the number of intermittent liquid feedings may be an integer value that approximates the value obtained by dividing the pitch length between the microchambers by the distance that the cells move by one one-shot liquid feeding.
  • the above-mentioned series of intermittent liquid feeds alternately performed as one set may be repeated intermittent liquid feeds. In this way, the cell recovery rate can be further improved.
  • the present invention is not limited to the intermittent liquid feeding described above as long as it is an intermittent liquid feeding that reciprocally moves the cells in the flow path.
  • a gas such as nitrogen gas or air that does not adversely affect the cells is intermittently pumped into the flow path to move the cell suspension in the flow path, thereby moving the cell expanded to the flow path.
  • a moving force may be applied.
  • this pressure feed is alternately pumped from the inlet and the outlet. Is preferred.
  • the mobile force can be intermittently applied to the cells developed in the flow path, and the physiological saline is not added, the cell suspension is unnecessarily diluted. It is possible to prevent the cell recovery rate from being lowered.
  • the moving force may be intermittently applied to the cells developed in the flow path by centrifugally rotating the chamber chip so that the centrifugal force acts in the direction from the inlet to the outlet of the chamber chip.
  • the chamber chip may be rotated 180 ° to reverse the direction in which the centrifugal force acts, and the moving direction of the cell suspension may be reversed.
  • Centrifugal rotation is preferably performed at a low speed (eg, about 1 to 100 r.p.m.) at which the cell does not move too much, but it is necessary to adjust depending on the cell type and device shape.
  • a low speed eg, about 1 to 100 r.p.m.
  • a moving force may be applied to the cells in the flow path, or vibration is applied to the microchip intermittently.
  • a moving force may be applied to the cells in the flow path.
  • Step (Z) means that after step (Y), the liquid is continuously fed at the same flow rate as the maximum flow rate of the intermittent liquid feed or at a flow rate larger than this, so that the layers are accommodated in the microchamber. This is a step of removing a part of the cells out of the microchamber.
  • the cells in the microchamber are monolayered, and the cells can be easily stained or observed.
  • the cells accommodated and held in the microchamber can be formed into a single layer by combining intermittent liquid feeding and continuous liquid feeding, which is suitable for observing the cells.
  • the adhesion force between the cells in the first layer and the cells in the second layer is usually weaker than the adhesion force between the bottom surface of the microchamber 6 and the cells in the first layer. This is because if the liquid is continuously fed at a flow rate equal to or greater than the maximum flow rate of the intermittent liquid feeding, the cells in the second layer can easily come out of the micro chamber 6.
  • the rare cell detection method according to the present invention includes the following staining step and detection step in addition to the rare cell recovery method.
  • the staining step is a step of staining rare cells held in the microchamber with a staining solution capable of staining only specific rare cells of interest (for example, a solution of an antibody labeled with a fluorescent dye). It is.
  • CTC circulating tumor cells
  • CD45 is not positive (not leukocytes).
  • This nuclear staining can be performed by, for example, nuclear staining with a neutral red solution that does not kill cells, and the presence or absence of CD45 can be determined by, for example, performing an antigen-antibody reaction with a fluorescently labeled anti-CD45 antibody.
  • CEC circulating vascular endothelial cells
  • endothelial cell markers CD31 and CD51 / 61
  • fluorescence or the like a tumor cell
  • whether or not it is a tumor cell for example, stains the cells housed in the microchamber with fluorescently labeled anti-human CD146 that reacts specifically with CD146 expressed when the endothelial cells become tumorous. This makes it possible to determine which cells are endothelial cells that have become tumorous.
  • a general ALDH activity measurement method (ALDH (enzyme) of cells + BAAA (substrate, Bodipy-aminoacetaldehyde) ⁇ BAA- (Bodypy-aminoacetate, fluorescence emission)) is performed on the cell population for each microchamber to obtain ALDH activity.
  • ALDH activity measurement method AAA (enzyme) of cells + BAAA (substrate, Bodipy-aminoacetaldehyde) ⁇ BAA- (Bodypy-aminoacetate, fluorescence emission)
  • the cell population having higher ALDH activity is identified as a marker, and the cell population containing circulating vascular endothelial progenitor cells [CEP] is identified, and further, from the identified cell population, which cells are circulated vascular endothelial progenitor cells by the ALDH activity measurement method. [CEP] can be specified.
  • the staining step is a staining solution capable of staining only specific rare cells of interest (for example, an antibody labeled with a fluorescent dye).
  • Solution is introduced from the inlet 3 and reacted with the cells under specific conditions, then discharged from the outlet 4, and a washing solution is introduced from the inlet 3 in order to wash the cells and the flow path 5.
  • the cleaning process of discharging from the outlet 4 is performed once or more.
  • the cells are held in the microchamber 6, it is difficult to be discharged from the outlet portion 4 together with the staining solution and the washing solution.
  • the cells are not held in the microchamber 6 and are not held in the microchamber chip 1. The cells adhering to the surface portion are easily discharged from the outlet portion 4 together with the staining solution and the cleaning solution.
  • the cells remaining on the surface portion other than the microchamber of the microchamber chip when performing the process of staining the rare cells or the subsequent washing process to detect the rare cells May flow out from the outlet together with the staining solution or the washing solution, but the cells stored and held in the microchamber are retained in the microchamber even after the staining step or the washing step. Almost no leakage from the department.
  • the detection step is a step of detecting rare cells in the microchamber stained in the staining step with observation or a detection device.
  • a rare cell recovery system 100 as a preferred example according to the present invention can supply liquid to the above-described cell expansion device 10 and the channel 5 (see FIG. 3) of the cell expansion device 10 as illustrated in FIG.
  • a liquid feeding device 20 having an appropriate pump and a control means 17 for controlling the operation of each member including the liquid feeding of the liquid feeding device 20 and the like are provided.
  • the rare cell collection system 100 further includes an optical detection system 50 for detecting rare cells collected in the microchamber 6 of the cell deployment device 10.
  • the control means 17 is a general personal computer or the like. In the example of FIG. 8, the control means 17 includes a rare cell specifying unit 18 and a storage medium 19.
  • the storage medium 19 controls the liquid feeding device 20 to perform the above-described steps ( A program for performing X), step (Y), and step (Z) in this order is stored.
  • the storage medium 19 optionally stores a program for performing the step (W) before the step (X) and / or a program for performing the staining step and the detection step after the step (Z). .
  • the control means 17 controls the liquid feeding device 20 to store each solution (cell suspension sample 22, washing liquid 25, staining liquid (labeled antibody solution) 24, etc.) stored in the liquid feeding station 21. Is collected and fed to the channel 6 (continuous feeding, intermittent feeding).
  • the control means 17 functions as a means for moving the position of the cell developed on the microchamber chip when intermittently feeding liquid.
  • the light source 8 irradiates the excitation light 27 toward the microchamber 6 under the control of the control means 17, and the excitation light 27 is used for cell deployment.
  • the reflected light 29 and, in some cases, fluorescence 28 are generated.
  • the excitation wavelength 27 is a wavelength that can excite the aforementioned fluorescent dye.
  • the chamber detection unit 16 disposed at a predetermined light receiving position receives the reflected light 29 and determines whether the irradiation position of the excitation light 27 is the position of the microchamber 6 or the flow path 5 based on the intensity of the reflected light 29. Is identified.
  • a condensing lens 11, an emission filter 12, a pinhole member 13, a condensing lens 14, and a PMT (photomultiplier tube) are coaxially arranged in order from the bottom above the cell deployment device 10.
  • the fluorescence 28 emitted from the fluorescent label bound to the rare cells in the microchamber 6 by irradiation of the excitation light 27 is guided to the rare cell detection unit 15, and the rare cell detection unit 15 detects the fluorescence signal of the rare cells. To do. This detection may be performed using a fluorescence microscope instead of the optical detection system.
  • the control means 17 specifies the presence or position of a rare cell from the intensity of the fluorescence 28, and controls the pump of the liquid delivery device 20 to pick up the rare cell.
  • the cell deployment device 10 is tilted while being held, and is controlled by the control means 17, on the microchamber chip.
  • a shaker that intermittently applies a moving force for moving the position of the deployed cell as described above may be provided. Apart from this, it comprises a holding means capable of holding a microchamber chip, and receives the control of the control means 17 to hold one end of the cell expansion device 10 and intermittently apply centrifugal force, You may provide the centrifuge which intermittently provides the moving force which moves the position of the cell expand
  • the chamber detection unit 16 can be omitted.
  • Example 1 As the microchamber chip, a microchamber having a diameter of 100 ⁇ m and a depth of 50 ⁇ m arranged in a grid (a pitch between the centers of adjacent microchamber bottoms is 210 ⁇ m) was used.
  • the microchamber chip was made of polystyrene, and the shape of the microchamber was an inverted conical shape with a flat bottom.
  • a flow path forming frame made of polystyrene is disposed on the surface of the micro chamber chip on which the micro chamber is formed so that a flow path having a length of 15 mm, a width of 26 mm, and a height of 100 ⁇ m is formed. And the flow path forming frame were integrated.
  • the KDS 200 2 stand syringe pump (made by Kd Scientific) was used for the liquid feeding apparatus.
  • an inlet portion and an outlet portion are formed in the flow path forming frame body, and the inlet portion and the outlet portion communicate with each other through the flow path in an integrated state.
  • step (Y) intermittent feeding consisting of one-shot feeding of 0.1 ⁇ L of PBS through the flow path at a flow rate of 0.1 mL / min and subsequent standing for 5 seconds was continuously performed 10 times. An enlarged image of the microchamber surface at this time is shown in FIG. It was confirmed that most of the cells scattered outside the microchamber before the intermittent liquid feeding were accommodated in the microchamber.
  • the cell recovery rate was 98%.
  • the cell recovery rate was calculated by the number of recovered cells / total number of cells ⁇ 100 (%).
  • the cell concentration in the cell suspension was calculated using a hemocytometer and converted from the volume introduced into the flow path.
  • the cells were counted visually under a microscope. Specifically, several microchambers in the channel are selected, the number of cells held in the channel is counted, the average number of cells per microchamber is calculated, and the average number of cells is calculated in the channel. The number obtained by multiplying the total number of chambers was taken as the number of recovered cells.
  • step (Z) was performed. That is, as a step (Z), 200 ⁇ L of PBS was continuously fed at a flow rate of 0.1 mL / min.
  • the cells FIG. 6 (A) housed in the microchamber and layered in a part of the microchamber perform the step (Z). As a result, a single layer was formed (FIG. 6B).
  • Example 3 After step (Z) in Example 2, Hoechst 33342 staining solution was continuously fed at 200 ⁇ L at 0.1 mL / min. After 3 minutes, the cells were observed with a microscope. The result is shown in FIG.
  • This Hoechst 33342 staining solution was prepared by diluting “Hoechst 33342 10 mg / mL solution in water” of Molecular Probe according to the procedure manual of the company. Although only one microchamber is shown in FIG. 7, the number of cells corresponding to 90% of the total cells introduced into the cell expansion device was stained.
  • Example 1 instead of the microchamber chip, a microchamber chip that was subjected to UV ozone treatment for 0 seconds, 30 seconds, and 1 minute with a UV ozone cleaner manufactured by Meiwa Forsys was used at the bottom of the microchamber. Steps (W), (X), and (Y) were performed in the same manner as in Example 1. Thereafter, as a step (Z), 200 ⁇ L of PBS was continuously fed at a flow rate of 10 mL / min.
  • contact angle Contact angle of water and microchamber that has been subjected to UV ozone treatment
  • FTA105 dynamic contact angle meter
  • Example 7 In Example 1, except that PBS containing 3% by weight of BSA was used instead of PBS used in Example 1, and the flow rate of step (Y) was changed from 0.1 mL / min to 0.05 mL / min. Performed the steps (W), (X) and (Y) in the same manner as in Example 1, and observed the cells. As a result, it was possible to achieve a cell recovery rate substantially the same as that of Example 1 with a lower flow rate intermittent liquid feeding.
  • Example 8 As step (Y) in Example 1, a shaker (Heidolph polyMAX1040) was continuously placed 10 times at 20 rpm for 1 minute and then for 5 seconds. As a result of observing the cells, it was possible to achieve almost the same cell recovery rate as in Example 1 without driving the pump.
  • a shaker Heidolph polyMAX1040
  • Example 1 cell observation was performed in the same manner as in Example 1 except that the step (Y) was not performed. As a result, as in FIG. 5A, many cells were scattered outside the microchamber.
  • the flow path 5 is formed by the flow path forming frame 2 and the microchamber chip 1, but is not limited to this configuration. That is, the flow path may be any flow path that allows the cell suspension to circulate on the microchamber chip 1.
  • the flow path wall or ceiling is injected into the microchamber chip 1.
  • the flow path 5 may be formed integrally and continuously by molding.

Abstract

　細胞懸濁液をマイクロチャンバーチップ上の流路に展開したとき、細胞の回収率を向上することによって、希少細胞のロスを低減する希少細胞の検出方法を提供することを目的とし、マイクロチャンバーチップ１と流路形成枠体２と入口部３と出口部４とを有する細胞展開用デバイス１０を用いて、細胞懸濁液から希少細胞を検出する方法であって、入口部３から細胞懸濁液を流路５に導入し、細胞をマイクロチャンバーチップ１上の流路５に展開する工程(Ｘ)；および、間欠送液等により、マイクロチャンバーチップ１上の流路５に展開された細胞をマイクロチャンバー６内に収容する工程(Ｙ)を含む希少細胞の回収方法。

Description

希少細胞の回収方法および検出方法
　本発明は、マイクロチャンバーチップを有する細胞展開用デバイスを用い、マイクロチャンバーチップ上の流路に展開された細胞懸濁液に含有される細胞から希少細胞を回収および検出する方法に関する。
　循環腫瘍細胞〔ＣＴＣ〕、循環血管内皮細胞〔ＣＥＣ〕、循環血管内皮前駆細胞〔ＣＥＰ〕、各種幹細胞等（本明細書において、まとめて「希少細胞」という。）は病態に応じて全血中に極めて稀に存在する細胞である。希少細胞の検出は臨床的な有用性が明らかであるにもかかわらず、その検出は極めて難しい。近年様々な細胞分離手法を応用してその検出が試みられ製品化がなされているが、いずれにおいても対象の希少性が故、検出結果の有効性を評価（希少細胞のロスや不要細胞の混入の有無）することが重要である。
　例えば採血した血液などの検体中に目的とする希少細胞が存在するか否かを検査する際、血液由来検体などの細胞懸濁液を平面状に展開した後、展開された全細胞を解析することによって、細胞懸濁液中に目的細胞が存在するか否かがわかる。
　例えば、特許文献１には細胞組織体マイクロデバイスが開示されている。細胞組織体マイクロデバイス表面には「細胞保持チャンバー」が形成されており、細胞保持チャンバーに収容された細胞（例えば、初代肝細胞など）を、流路に培養液を灌流しながら培養し、細胞組織体を形成することができる。
　この細胞組織体マイクロデバイスを使用して、細胞懸濁液を平面状に展開する際、細胞懸濁液を単純に添加する方法では、細胞保持チャンバー内に充分に細胞を回収することができず、多くの細胞が細胞保持チャンバー外に残存してしまうと予測される。また灌流培養を開始した直後に、細胞保持チャンバー外に残存している細胞は、細胞組織体マイクロデバイスから排出されるおそれがある。
特開２００６－１２２０１２号公報
　本発明は、例えば血液などのような様々な種類の細胞を大量に含む細胞懸濁液を、マイクロチャンバーチップ上の流路に展開したとき、細胞懸濁液に含まれる全細胞数に対する、各マイクロチャンバーに保持することができる細胞数合計の割合（以下「細胞の回収率」ともいう。）を向上することによって、希少細胞のロスを低減することができる希少細胞の回収方法および検出方法を提供することを目的とする。
　特許文献１に開示されている細胞組織体マイクロデバイスに細胞懸濁液を添加し、所定時間静置した後、連続的に一様な送液をすると、低流量では、細胞保持チャンバー外に付着した細胞が移動せず、一方、高流量では、細胞保持チャンバー内に細胞が収容されづらく、また細胞保持チャンバー内に一旦収容された細胞が細胞保持チャンバー外に出易くなる。
　本発明者らは、送液について鋭意検討した結果、細胞展開用デバイスを用いて細胞懸濁液に含有される細胞を展開した後、マイクロチャンバーチップ上の流路に展開された細胞の位置を移動させる移動力を間欠的に付与することによって細胞の回収率が著しく向上することを見出し、本発明の完成に至った。
　すなわち、上述した目的のうちの一つを実現するために、本発明の一側面を反映した希少細胞の回収方法は、細胞を収容、保持することができるマイクロチャンバーを表面に有するマイクロチャンバーチップ上に流路が形成された細胞展開用デバイスに細胞懸濁液を流入させ、該細胞懸濁液中の希少細胞をマイクロチャンバー内に回収する方法であって、
　工程(Ｘ)：細胞展開用デバイスの流路に細胞懸濁液を流入させて、細胞をマイクロチャンバーチップ上の流路に展開する工程；および、
　工程(Ｙ)：前記マイクロチャンバーチップ上の流路に展開された細胞の位置を移動させる移動力を間欠的に付与する工程を含む希少細胞の回収方法である。
　本発明によれば、例えば血液などの細胞懸濁液に含有される様々な種類の細胞であっても、マイクロチャンバー内への細胞の回収率が極めて高い、すなわち、マイクロチャンバー上に流路が形成された細胞展開用デバイスに展開されたほぼすべての細胞をマイクロチャンバー内に収容して保持することができ、細胞懸濁液中に存在し得る希少細胞のロスを低減することができる。
図１は、工程(Ｙ)で細胞展開用デバイスの流路へ「間欠送液」を行った際の送液圧と流路内での流速の経時的なグラフを示す。 図２は、細胞展開用デバイスの流路へ連続送液したときの流路内の流速をプロットした経時的なグラフを示す。 図３は、細胞展開用デバイスをその流路方向に沿って切断した断面図を模式的に示したものである。破線の矢印は、流路の液流方向を示す。図３(Ａ)は、マイクロチャンバーチップ１により流路の底面を形成した細胞展開用デバイスを示す。図３(Ｂ)は、マイクロチャンバーチップ１と流路形成枠体２とにより流路の底面を形成した細胞展開用デバイスを示す。 図４は、細胞展開用デバイスの具体例を模式的に示した図である。図４(Ａ)は、細胞展開用デバイスの上面図を示し、図４（Ｂ）は、図４(Ａ)の細胞展開用デバイスをＡ'－Ａ'線に沿って切断した断面図を示す。 図５(Ａ)は、実施例１の工程(Ｘ)後のマイクロチャンバーチップ表面の拡大画像を示す。図５(Ｂ)は、実施例１の工程(Ｙ)後のマイクロチャンバーチップ表面の拡大画像を示す。 図６(Ａ)は、実施例１の工程(Ｙ)後のマイクロチャンバーの中で、重層化された状態で細胞を収容しているマイクロチャンバーの拡大画像を示す。図６(Ｂ)は、実施例２の工程(Ｚ)後の単層化されたマイクロチャンバーの拡大画像を示す。 図７は、実施例３の染色後のマイクロチャンバーの拡大画像を示す。 図８は、本発明に係る好ましい一例としての希少細胞回収システムを示す。
　以下、本発明に係る希少細胞の回収方法および検出方法について、図１～図７を参照しながら、詳細に説明する。
　本発明に係る希少細胞の回収方法は、細胞展開用デバイスを用いて、細胞懸濁液から、細胞懸濁液に含有されている可能性のある希少細胞を回収する方法であって、工程(Ｘ)および(Ｙ)を含み、好ましくはさらに工程(Ｗ)および/または(Ｚ)を含む。
　前記移動力は、前記マイクロチャンバー外に位置する細胞を移動させる力であることが好ましい。
　前記工程(Ｘ)の前に、水よりも表面張力の低い水溶液を送液することによって、前記マイクロチャンバーチップの表面を濡らす工程(Ｗ)をさらに含むことが好ましい。
　前記工程(Ｘ)において、前記流路へ導入する細胞懸濁液の流速を調節することにより、前記マイクロチャンバーチップの上の流路に均一に細胞を展開させることが好ましい。
　前記工程(Ｙ)において、前記マイクロチャンバー外に位置する細胞が往復移動するように前記移動力を間欠的に付与することが好ましい。
　前記工程（Ｙ）において、前記流路に対する送液と送液の停止とを繰り返す間欠送液を行うことで前記移動力を間欠的に付与することが好ましい。
　前記工程(Ｙ)の後に、前記間欠送液の最大流速と同じ流速か、またはそれより大きい流速で連続送液することによって、前記マイクロチャンバー内に重層して収容された細胞の一部を、前記マイクロチャンバー外に出す工程をさらに含むことが好ましい。
　上記希少細胞が、循環腫瘍細胞〔ＣＴＣ〕、循環血管内皮細胞〔ＣＥＣ〕および循環血管内皮前駆細胞〔ＣＥＰ〕のいずれか一種以上の細胞であることが好ましい。
　前記マイクロチャンバーチップに対して流路形成枠体を一体的に設けることで前記流路が形成されていることが好ましい。
　前記流路形成枠体に前記流路に連通する入口部と出口部が設けられていることが好ましい。
　上述した目的のうちの一つを実現するために、本発明の一側面を反映した希少細胞の検出方法は、前記の希少細胞の回収方法により、希少細胞を回収した後に前記マイクロチャンバーの流路に細胞染色液を送液して、細胞染色と希少細胞の検出を行う。なお、「送液」には連続送液と間欠送液とが含まれる。
　細胞を収容、保持することができるマイクロチャンバーを表面に有するマイクロチャンバーチップ上に流路が形成された細胞展開用デバイスと、該細胞展開用デバイスの流路に細胞懸濁液を送液する送液装置と、 前記マイクロチャンバーチップ上に展開された細胞の位置を移動させる移動力を間欠的に付与する手段 とを備え、請求項１～１１のいずれかの方法を行う、希少細胞回収システム。
　細胞染色液で染色された希少細胞を検出可能な光学検出系をさらに備えており、請求項１１の検出方法を行う、上記希少細胞回収システム。
　　　　　　　　　　　　　　＜細胞展開用デバイス＞
　図３(Ａ)に、本発明に係る希少細胞の回収方法に使用可能な細胞展開用デバイスの一例を示す。
　この細胞展開用デバイス１０は、図３（Ａ）に示すように、マイクロチャンバー６が形成されたマイクロチャンバーチップ１と、マイクロチャンバー６上に流路５が形成されるようにマイクロチャンバーチップ１と一体に設けられた流路形成枠体２と、流路形成枠体２に設けられた入口部３と、入口部３から流路５に流入された細胞懸濁液を流路５から流出させるために流路形成枠体２に設けられた出口部４等とを有する。
　《マイクロチャンバーチップ》
　マイクロチャンバーチップ１は、マイクロチャンバーアレイ〔ＭＣＡ〕ともいい、その表面にマイクロチャンバー６を一個以上有する。
　マイクロチャンバーとは、一個以上の細胞を「収容」し、「保持」することができる凹状の微細穴（マイクロウェル）をいい、有底である（すなわち貫通した穴ではない）ことが好ましい。
　ここで、「保持」とは、マイクロチャンバーに収容された細胞が、細胞展開用のマイクロチャンバーチップの流路に対する染色液や洗浄液の送液等によってマイクロチャンバー外に出難いことをいう。
　また、マイクロチャンバー６の開口上部の直径は、２０μｍ～５００μｍであることが好ましい。該直径が２０μｍ～５００μｍの範囲内であると、マイクロチャンバー６内に好適に細胞を収容、保持することができる。
　マイクロチャンバー６の深さは、マイクロチャンバー６の直径によって変動させることが好ましく、マイクロチャンバー１つあたりに収容したい細胞数などに応じて、該チャンバーの深さを適宜決定することができる。具体的には、細胞を１０～１５個程度収容できるようにチャンバーの深さを適宜決定することが好ましく、典型的には、マイクロチャンバー６の深さは、２０μｍ～５００μｍである。
　マイクロチャンバー６の形状は、図３では、底部が平坦な逆円錐形である（縦断面が台形を示している。）が、これに限定されず、例えば、円筒形、逆半球形、逆角錐形（逆四角形錐や逆六角形錐等の逆多角形錐）、直方体などでもよい。マイクロチャンバー６の底部は、典型的には平坦であるが、曲面であってもよい。
　ここで、マイクロチャンバー６の底部と細胞との接着力を高めることで、マイクロチャンバー６内に細胞を確実に保持できる割合が高くなる。そのため、マイクロチャンバー６内の底部の細胞接着力を高める方法として、例えば、マイクロチャンバー６内の底部に対して、大気雰囲気下でＵＶを照射するＵＶオゾン処理や酸素雰囲気下でプラズマを照射する酸素プラズマ処理、あるいは目的細胞と特異的に結合するリガンド（抗体）を塗布することなどを行うことがより好ましい。
　マイクロチャンバーチップ１の材料としては、従来公知のマイクロプレート等と同じ材料を使用でき、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕、ポリメチルメタクリレート〔ＰＭＭＡ〕、環状オレフィンコポリマー〔ＣＯＣ〕などのポリマーが挙げられる。マイクロチャンバーチップ１は、成形されたポリマーに、金属、ガラス、石英ガラスなどからなる基板を貼り合わせたような複数の材料を組み合わせたものであってもよい。
　マイクロチャンバーチップ１の製造方法は、金型基材表面にマイクロチャンバー６の形状に対応する凸部を有する金型を用いて成形する方法であってもよく、上記ポリマーや金属、ガラスなどからなる基板に直接加工（例えばリソグラフィーによる微細加工、掘削加工、ＬＩＧＡプロセスなど）を施しマイクロチャンバーを形成する方法であってもよいが、生産性の観点から、金型を用いて成形する製造方法が好ましい。
　《表面処理》
　マイクロチャンバーチップ１は、必要に応じて、表面処理を施すことができる。表面処理としては、例えばプラズマ処理（酸素プラズマ処理など）やコロナ放電処理、または親水性ポリマーやタンパク質、脂質等でコーティングする処理などが挙げられるが、これらに限定されない。
　表面処理をする場合、細胞展開用のマイクロチャンバーチップ１を、マイクロチャンバー６の内壁面まで細胞非接着性にするための表面処理が施される。この表面処理には、ブロッキング剤が用いられる。ブロッキング剤とは、マイクロチャンバーチップ１や流路形成枠体２の内表面の流路５を被覆することで、細胞がそこに非特異的に吸着するのを抑制する物質を指す。
　表面処理により、細胞がマイクロチャンバー６の内壁に吸着することなく底面に集積しやすくなるため、顕微鏡下の明視野による細胞観察が容易となる。
　ブロッキング剤としては、例えば、カゼイン、スキムミルク、アルブミン（ウシ血清アルブミン〔ＢＳＡ〕含む。）、ポリエチレングリコール等の親水性高分子、リン脂質などの他に、エチレンジアミンやアセトニトリルなどの低分子化合物も挙げられ、一種単独で用いても二種以上併用してもよい。
　ブロッキング処理用液は、ブロッキング剤を適当な溶媒で希釈することにより調製される。この溶媒は、ブロッキング剤に応じて選択されるが、例えば、ブロッキング剤としてＢＳＡを用いる場合は、展開するための細胞が懸濁している溶媒と同様の、生体関連物質に適合する溶媒が好ましく、具体的には、リン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ、リン酸緩衝液等が用いられる。
　《流路》
　細胞展開用デバイスのマイクロチャンバーチップ上には、主として細胞懸濁液を流すための流路が形成されている。
　例えば図３(Ａ)に流路の一例を示すが、細胞懸濁液をマイクロチャンバーチップ１上で流通させることが可能なものであれば、この例に限られない。
　図３(Ａ)に示す例では、マイクロチャンバー６部分を除くマイクロチャンバーチップ１の表面を底面とするとともに、マイクロチャンバーチップ１と一体化して設けられた流路形成枠体２の内表面を側面部および天井部として流路５が形成されている。
　この流路５は、流路形成枠体２の入口部３と出口部４とに連通しており、入口部３から流入した細胞懸濁液が破線の矢印で示す方向に流路５を流れて、出口部４から流出するようになっている。
　また流路の別の例として、例えば図３(Ｂ)に示すように、流路の底面を、マイクロチャンバー６部分を除くマイクロチャンバーチップ１の表面部分と流路形成枠体２の内表面の一部とから形成してもよい。
　ただしこの場合、入口部３や出口部４の下方の細胞懸濁液が流下する部分に、マイクロチャンバー６を有しない底面部分があると、この部分に細胞が滞留や付着する等してマイクロチャンバー６に収容されず、細胞の損失につながる場合がある。
　これを防ぐために、問題となる底面部分をマイクロチャンバーチップ１の一部で置き換えたり、逆に、問題となる底面部分に細胞懸濁液が流下しないように入口部３等を形成したりして、流路がマイクロチャンバーチップ１以外の部材で形成しないようにすることが望ましい。
　マイクロチャンバーチップ１と流路形成枠体２とは、観察やメンテナンスのしやすさの観点から、係合や螺子固定、粘着等の手段で互いに取り付け・取り外し可能に構成されていることが好ましい（不図示）。
　さらに、この取り付け等により流路５を形成した後、流路形成枠体２から側面部のみを残し、天井部（流路天板）だけ取り外すこともできるように構成することが好ましい。
　流路５の高さ７（図３（Ａ）や図３（Ｂ）参照）、すなわち、マイクロチャンバーチップ１のマイクロチャンバー６以外の表面部分から天井部までの距離（以下「天井の高さ」ともいう。）は、５０μｍ～５００μｍであることが好ましい。
　天井の高さが５０μｍ～５００μｍの範囲内であると、マイクロチャンバーチップ１のマイクロチャンバー６以外の表面部分に付着した細胞を液流の力で容易に動かすことが可能となる。また、細胞がマイクロチャンバーチップ１の表面に沈降するまでの時間を短縮することができる。さらに、流路内の細胞の目詰まり等が発生しにくくなり、細胞が円滑に展開することができることから好ましい。
　流路形成枠体２の材料としては、例えばマイクロチャンバーチップ１と同じ材料を用いることが好ましい。
　ここで、上記のようなマイクロチャンバーチップ１と同様の表面処理（プラズマ処理やコロナ放電処理の電気的処理や、目的の希少細胞以外の夾雑物と好適に結合するような親水性ポリマー、タンパク質、脂質等によるコーティング処理等）を流路形成枠体２に施してもよい。
　また、例えば図４(Ｂ)に示すように、流路形成枠体２を、流路天板２ａと、両面に粘着性を有するシリコンシートすなわち流路シール２ｂとにより構成し、流路シール２ｂによる粘着により、流路天板２ａとマイクロチャンバーチップ１との間に流路シール２ｂを挟持させることによって、流路５を形成することもできる。なお、符号２ｃは、補助枠を示す。
　固定手段により弾性のシリコンシートを挟持する構成とすれば、挟持する強さを調節することで、天井の高さや流路容積等の流路の寸法を調整して、流路内への送圧、流速、ひいては細胞の展開のしやすさや等を調整することができる。
　また、図４（Ｂ）に示すように、流路５の出口部４に接続するようにリザーバー１０Ａを設けてもよい。このリザーバー１０Ａの容量は例えば５００μＬ程度であり、入口部３から流入された細胞懸濁液が出口部４から排出されてリザーバー１０Ａに一時的に貯留されるようになっている。
　　　　　　　　　　　　　　　　＜細胞懸濁液＞
　細胞懸濁液は、希少細胞を含んでいる可能性がある、例えばヒトなどの血液、リンパ液、組織液、体腔液などであり、希釈液などで適宜希釈されていてもよい。また、細胞懸濁液は、生体由来のものに限定されず、試験・研究等のために人工的に細胞を懸濁させて調製した細胞の分散液であってもよい。特に、血液から赤血球を分離した後の細胞懸濁液を適用することがＣＴＣ等の希少細胞の回収・検出には好適である。
　希少細胞としては、例えば癌細胞などが挙げられる。特に、細胞懸濁液が血液または血液由来検体である場合、希少細胞は、ＣＴＣ〔循環腫瘍細胞または循環癌細胞〕、ＣＥＣ〔循環血管内皮細胞〕およびＣＥＰ〔循環血管内皮前駆細胞〕のいずれか一種以上の細胞であってもよい。
　このような細胞懸濁液に含まれる種々の細胞の直径は、１０～１００μｍであることが好ましいが、少なくともマイクロチャンバーの直径より小さいことが必要である。
　　　　　　　　　　　　　　　　　＜工程(Ｗ)＞
　工程(Ｗ)とは、下記の工程(Ｘ)および工程(Ｙ)の前に、水よりも表面張力の低い水溶液を送液することによって、マイクロチャンバーチップの表面を濡らす工程である。
　水よりも表面張力の低い水溶液としては、表面張力が水より低いものであれば特に限定されない。
　送液する水溶液の表面張力を低くするほどマイクロチャンバー６内を濡らすことができることから、送液する水溶液の表面張力γ(ｍＮ／ｍ)の好適な範囲としては、送液する温度環境下において、一般的に１０≦γ≦６０であり、より好ましくは１０≦γ≦４０であり、更により好ましくは、１０≦γ≦３５であり、更により好ましくは、１０≦γ≦３０であり、更により好ましくは、１０≦γ≦２５である。
　表面張力が水より低い水溶液としては、例えば、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類を含む水溶液や、ＴＷＥＥＮ（登録商標） 20, ＴＲＩＴＯＮ（登録商標） X、SDS等の界面活性剤を０.０１-１％（ｗ/ｖ）で含む水溶液が該当する。たとえば、エタノール（水溶液）の２０℃における表面張力は、濃度１００ｗｔ％のときは２２．４、濃度７０ｗｔ％のときは２６．０、濃度１０％のときは４７．９である。
　上記水溶液を細胞展開用デバイス１０の流路５に送液すると、マイクロチャンバー６外のみならず、マイクロチャンバー６内も濡らすことができる（図３（Ａ）又は（Ｂ）参照）。
　この後、ＰＢＳ〔リン酸緩衝生理食塩水〕等の生理食塩水（好ましくは、工程(Ｘ)で用いる細胞懸濁液と同じ溶媒）で流路５を満たしておくことが好ましい。
　　　　　　　　　　　　　　　　　＜工程(Ｘ)＞
　工程(Ｘ)とは、細胞懸濁液を流路に導入し、細胞をマイクロチャンバーチップ上の流路に（好ましくは均一に）展開する工程である。
　好ましくは、入口部３から細胞懸濁液を連続的に一様に送液し、工程(Ｗ)で流路を生理食塩水で満たしていた場合には、その生理食塩水と置換するようにして、細胞懸濁液で流路５を満たす。このとき、入口部３から細胞懸濁液を導入するのと同時に、出口部４から生理食塩水が排出される（図３（Ａ）および図３（Ｂ）参照）。
　ここで、「連続的な一様な送液（以下、連続送液ともいう）」とは、図２に示されるような、流路内が一定の流速で維持されている送液をいう。
　流路に導入する細胞懸濁液の流速については、流速に比例して細胞展開用デバイス１０の入口部３近傍のマイクロチャンバー６に細胞が留まりにくくなるため、流速を高く設定するほどマイクロチャンバー６の長手方向の細胞展開が均一になり、好ましいものとなる。
　ここで、流路の寸法等との兼ね合いもあるが、上記流速を不必要に高く設定し過ぎると、逆にマイクロチャンバーチップの短手方向に細胞が広がりにくくなる。そのため、長手方向と短手方向とにバランス良く均一に細胞が展開するように、細胞展開用デバイスに見合った流速を適宜設定する必要がある。
　後述の実施例で示す細胞展開用デバイスでは、流路に導入する細胞懸濁液の流速を１０ｍＬ／分より大きく設定するとマイクロチャンバーチップの短手方向に細胞が広がりにくくなって細胞展開が不均一となってしまうため、１０ｍＬ／分以下となる範囲で約１ｍＬ／分程度に設定している。
　細胞懸濁液の導入後、一定時間（例えば１～１５分間）静置させることによって、細胞懸濁液に含有される細胞を沈降させることが好ましい。このとき、例えば図５(Ａ)に示されるように、マイクロチャンバー６内に収容される細胞もあるが、マイクロチャンバーチップ１のマイクロチャンバー６以外の表面部分に付着する細胞もある。
　細胞がマイクロチャンバーチップ１上の流路に均一に展開されていると、下記の工程(Ｙ)で行う間欠送液でマイクロチャンバー内に細胞をより多く回収することができるようになる。
　その結果、工程(Ｙ)で所定の細胞の回収率に到達するまでの時間を短縮することができる、すなわち、より少ない回数の間欠送液によって、細胞がマイクロチャンバー６内に収容され易いことから、好適である。
　　　　　　　　　　　　　　　　　＜工程(Ｙ)＞
　工程(Ｙ)とは、間欠送液等の操作により、マイクロチャンバーチップ上の流路に展開された細胞に対して、細胞の位置を移動させる移動力を間欠的に付与することで、流路に存在する細胞を移動させてマイクロチャンバー内に収容する工程である。
　この移動力は、好ましくは、マイクロチャンバー外の流路に位置する細胞を主として移動させる程度の力である。
　《間欠送液》
　「間欠送液」は、図１に示すように、マイクロチャンバーチップ上の流路に展開された細胞、特にマイクロチャンバーチップのマイクロチャンバー以外の表面部分に存在する細胞を送液方向に移動させるための、相対的に短時間の「ワンショット送液」と、細胞が送液方向に基本的に移動せず細胞をマイクロチャンバーチップ表面に実質的に沈降させるための、相対的に長時間の「静置」とからなる。
　この「ワンショット送液」の開始から「静置」の終了、すなわち「ワンショット送液」の開始から次の「ワンショット送液」の開始までを間欠送液の１サイクルとする。
　送液を駆動する装置が、所定の送液圧を所定時間、流路内に発生させて、流路内の細胞の少なくとも一部がマイクロチャンバーの直上へ移動する送液をすると「ワンショット送液」となる。顕微鏡などで細胞の移動量を確認して送液を行うことで、ワンショット送液の送液圧や時間を設定することができる。流路内の細胞をマイクロチャンバーの直径程度移動させるワンショット送液とすることが好ましい。
　送液を駆動する装置が送液圧を発生させない（すなわち、無駆動の状態になる）と「静置」となる。静置は、その直前に発生した送液圧の慣性により流速がゼロを示さない状態を含んでいてもよい。
　このワンショット送液によって、流路内に瞬間的に圧力の高い状態、かつ、流路方向に直交する方向で流路中央部からその両側の流路周辺部までの流速が均一に近い状態となり、マイクロチャンバーチップのマイクロチャンバー以外の表面部分等に付着した細胞が移動し易くなる。その後の静置によって、移動した細胞の少なくとも一部がマイクロチャンバー内に収容される。
　ワンショット送液では、希少細胞の回収と検出に悪影響を与えない緩衝液等の溶液を送液する。好ましくは流路に対して所定量の生理食塩水（例えば、工程(Ｘ)で用いる細胞懸濁液と同じ緩衝液）を送液する。
　この送液量は、例えば、流路に導入した細胞懸濁液の体積の１/１００～１/２程度（例えば１/５０）に設定するのが好ましい。
　また、単位時間当たりの送液量については、流路の断面積が１～１０００ｍｍ2である場合、１～１０００μＬ/秒の流量（１秒間あたりの流量が、流速１ｍｍ/秒以下となる流量）に調整することが好ましい。
　具体的には、例えば、マイクロチャンバー（直径１００μｍ、深さ５０μｍ）を表面に有するマイクロチャンバーチップに流路（幅１５ｍｍ、高さ１００μｍ）が形成された細胞展開用デバイスを用いる場合、流路の断面積が１．５ｍｍ2となるので、１５００μＬ／秒以下の流量に調整することが好ましい。
　ワンショット送液後、所定時間（例えば１～３０秒間）静置させる。この静置は、具体的には、例えば３～５秒間行う。
　このワンショット送液から静置までの間欠送液１サイクルを２回以上繰り返すことが好ましく、より好ましくは１０回以上、さらに好ましくは６０回以上繰り返す。１回のワンショット送液によって、通常、細胞は５０μｍほど移動する。
　なお、間欠送液を複数回行う場合、それぞれのサイクルにおいて、ワンショット送液の流量や静置時間の条件などは異なっていても、同じであってもよい。
　また、入口部のみから間欠送液してもよいが、入口部と出口部の双方から交互に間欠送液するようにしてもよい。
　具体的には、入口部から流路に対して間欠送液を一又は複数回行った後、出口部から流路に対して間欠送液を一又は複数回を行うこととしてもよい。
　入口部と出口部の双方から交互に間欠送液を行うことで、マイクロチャンバーに収容されずに通過してしまった細胞を逆方向に往復移動させて収容することができるようになり、細胞の回収率を向上させることができる。
　ここで、間欠送液の回数については、マイクロチャンバー間のピッチの長さを１回のワンショット送液で細胞が移動する距離で除した値に近似する整数値としてもよい。
　このようにすることで、細胞懸濁液を導入した後のマイクロチャンバー表面に均一に展開した細胞の密度を極力維持しながら、マイクロチャンバー内に細胞の回収を図ることができ、マイクロチャンバー間で収容される細胞数にムラが生じにくいものとなる。この結果、一のマイクロチャンバーが細胞で飽和するおそれも低減する。
　さらに、上記交互に行う一連の間欠送液を１セットとして、これを繰り返す間欠送液を行ってもよい。このようにすることで、細胞の回収率をさらに向上させることができる。
　なお、入口部や出口部からの間欠送液に限らず、流路内の細胞を往復移動させる間欠送液であれば上述した間欠送液に限定されない。
　《間欠送液以外の方法》
　流路に展開された細胞の位置が移動する移動力を付与する方法としては、マイクロチャンバーチップ上の流路に展開された細胞の位置が移動する移動力を間欠的に付与することができればよいので、上述した間欠送液に限らない。
　例えば、生理食塩水の代わりに細胞に悪影響を与えない窒素ガスや空気等のガスを間欠的に流路に圧送して流路の細胞懸濁液を移動させることにより流路に展開した細胞に移動力を付与してもよい。この圧送は、流路の細胞懸濁液が過度に移動して細胞懸濁液が部分的に流路に存在しなくなる状態となるのを防ぐために、入口部と出口部とから交互に圧送するのが好ましい。
　この構成によれば、流路に展開した細胞に対して間欠的に移動力を付与できる上に、生理食塩水等を加えないので、細胞懸濁液が不必要に希釈化されてしまうことを防止することができ、細胞の回収率の低下を防止することができる。
　これとは別に、チャンバーチップをチャンバーチップの入口部から出口部の方向に遠心力が働くように遠心回転させて流路に展開した細胞に対して間欠的に移動力を付与してもよい。このとき、チャンバーチップを１８０°回転させて遠心力の働く方向を逆転し細胞懸濁液の移動方向を反転させてもよい。
　遠心回転は、細胞移動しすぎない程度の低速（例えば１～１００r.p.m.程度）で行うことが好ましいが細胞の種類やデバイス形状にもよって調節する必要がある。この構成により、上述したように生理食塩水等の添加による細胞懸濁液の希釈化とこれによる回収率の低下の防止を図ることができる。
　この他、マイクロチップをシェーカー等により間欠的に傾斜させて細胞懸濁液を移動させることで流路の細胞に対して移動力を付与してもよいし、マイクロチップに間欠的に振動を加えて流路の細胞に対して移動力を付与してもよい。
　　　　　　　　　　　　　　　　　＜工程(Ｚ)＞
　工程(Ｚ)とは、上記の工程(Ｙ)の後に、上記間欠送液の最大流速と同じ流速か、またはこれより大きい流速で連続送液することによって、マイクロチャンバー内に重層して収容された細胞の一部を、マイクロチャンバー外に出す工程である。
　工程（Ｚ）を行うことで、マイクロチャンバー内の細胞が単層化されて、細胞染色や細胞観察しやすい状態とすることができる。
　細胞を展開した後、間欠送液と連続送液とを組み合わせることによって、マイクロチャンバー内に収容、保持された細胞を単層化することができるため、細胞を観察するのに好適である。
　過剰数の細胞がマイクロチャンバー６内に収容、保持されている場合、マイクロチャンバー６の底面に付着している細胞からなる層（一層目）とその細胞層に付着している細胞からなる層（二層目）とに分けられるとすると、通常、一層目の細胞と二層目の細胞との付着力の方が、マイクロチャンバー６底面と一層目の細胞との付着力より弱いことから、上記間欠送液の最大流速と同じ流速か、またはこれより大きい流速で連続送液すると、二層目の細胞はマイクロチャンバー６外に出易くなるからである。
　本発明に係る希少細胞の検出方法は、上記希少細胞の回収方法に加えて、下記染色工程と検出工程を含む。
　《染色工程》
　染色工程は、対象とする特定の希少細胞のみを染色することが可能な染色液（例えば、蛍光色素が標識された抗体の溶液）により、マイクロチャンバー内に保持されている希少細胞を染色する工程である。
　（循環腫瘍細胞〔ＣＴＣ〕）
　循環腫瘍細胞〔ＣＴＣ〕であるか否かは、細胞の核染色が陽性であってＣＤ４５が陽性ではない（白血球ではない）ものをＣＴＣと判別することができる。この核染色は例えば細胞を殺さないニュートラルレッド溶液による核染色、ＣＤ４５の有無の判別は、例えば蛍光標識した抗ＣＤ４５抗体により抗原抗体反応を行うことができる。これらの染色を、マイクロチャンバーに収容した細胞を対して行うことで、マイクロチャンバー内のどの細胞がＣＴＣであるかを判別することができる。
　（循環血管内皮細胞〔ＣＥＣ〕）
　また、循環血管内皮細胞〔ＣＥＣ〕の場合には、例えば内皮細胞マーカー(CD31やCD51/61)の発現を蛍光等で標識した抗CD31抗体や抗CD51/61抗体による染色により判別することができる。この場合、さらに腫瘍細胞か否かは、例えば内皮細胞が腫瘍化したときに発現するCD146に対して特異的に反応する、蛍光標識等した抗ヒトCD146によりマイクロチャンバー内に収容した細胞を染色することにより、いずれの細胞が腫瘍化した内皮細胞であるか判別することができる。
　（循環血管内皮前駆細胞〔ＣＥＰ〕）
　例えば、マイクロチャンバー毎の細胞集団について、一般的なＡＬＤＨ活性測定法（細胞のＡＬＤＨ（酵素）＋ＢＡＡＡ（基質、Ｂｏｄｉｐｙ－ａｍｉｎｏａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ）→ＢＡＡ－（Ｂｏｄｉｐｙ－ａｍｉｎｏａｃｅｔａｔｅ、蛍光発光））を実施し、ＡＬＤＨ活性を指標に、よりＡＬＤＨ活性が高い細胞集団を循環血管内皮前駆細胞〔ＣＥＰ〕を含む細胞集団を特定し、さらにこの特定した細胞集団から同様にＡＬＤＨ活性測定法によりどの細胞が循環血管内皮前駆細胞〔ＣＥＰ〕であるか特定することができる。
　染色工程は、例えば、図３（Ａ）又は図３（Ｂ）に示すように、対象とする特定の希少細胞のみを染色することが可能な染色液（例えば、蛍光色素が標識された抗体の溶液）を入口部３から導入し、特定の条件で細胞と反応させた後、出口部４から排出し、さらに、細胞や流路５内を洗浄するために、洗浄液を入口部３から導入し出口部４から排出させるという洗浄工程を１回以上実施する。
　細胞はマイクロチャンバー６内に保持されているため、染色液や洗浄液とともに出口部４から排出されにくいのに対して、マイクロチャンバー６内に保持されずに、マイクロチャンバーチップ１のマイクロチャンバー６以外の表面部分に付着していた細胞は、染色液や洗浄液とともに出口部４から排出されやすい。
　すなわち、細胞を展開した後、希少細胞を検出するために、希少細胞を染色する工程やその後の洗浄工程などを実施する際に、マイクロチャンバーチップのマイクロチャンバー以外の表面部分に残存していた細胞は、染色液や洗浄液とともに出口部から流出するおそれがあるが、マイクロチャンバー内に収容、保持された細胞は、染色工程や洗浄工程を実施しても、マイクロチャンバー内に保持されるため、出口部からほとんど流出することがない。細胞をマイクロチャンバー内に保持する力を強化するためには、目的細胞を特異的に結合するリガンドをマイクロチャンバー内の底部に固定しておくことがより好ましい。
　《検出工程》
　検出工程は、染色工程で染色されたマイクロチャンバー内の希少細胞を観察や検出機器等で検出する工程である。
　マイクロチャンバー６内に保持されて染色された希少細胞は、顕微鏡下で観察や検出等をすることができる。工程（Ｚ）によりマイクロチャンバー内に保持された希少細胞を単層化した状態で検出することが好ましい。また、希少細胞の分離は、染色工程で染色された細胞を含むマイクロチャンバーから、細胞保持用ガラスマイクロピペット等により希少細胞のみを取り出すことで行うことができる。
　　　　　　　　　　　　　＜希少細胞回収システム＞
　本発明に係る好ましい一例としての希少細胞回収システム１００は、図８に例示するように、上述した細胞展開用デバイス１０と、細胞展開用デバイス１０の流路５（図３参照）に送液可能なポンプを有する送液装置２０と、送液装置２０の送液等を含む各部材の動作を制御する制御手段１７等とを備えている。より好ましくは、希少細胞回収システム１００は、さらに、前記細胞展開用デバイス１０のマイクロチャンバー６内に回収された希少細胞を検出するための光学検出系５０を備えている。
　制御手段１７は、一般的なパーソナルコンピュータ等であり、図８の例では希少細胞特定部１８と記憶媒体１９等とを有し、記憶媒体１９は送液装置２０を制御して上述した工程（Ｘ）、工程（Ｙ）、および工程（Ｚ）をこの順で行うためのプログラムを記憶している。また、記憶媒体１９は、任意に、工程（Ｘ）の前に工程（Ｗ）を行うプログラム、および／または、工程（Z)の後に染色工程および検出工程を行うためのプログラムを記憶している。
　また、制御手段１７は、送液装置２０を制御して、送液ステーション２１に保管されている各溶液（細胞懸濁液のサンプル２２、洗浄液２５、及び染色液（標識抗体溶液）２４等）を採液させて前記流路６に送液（連続送液、間欠送液）させる。この制御手段１７は、間欠送液する際には、マイクロチャンバーチップ上に展開された細胞の位置を移動させる手段として機能する。
　希少細胞をマイクロチャンバー６に回収した後に、希少細胞回収システム１００の光学検出系５０により上述した検出工程を行う場合、以下のように行われる。まず、細胞展開用デバイス１０のマイクロチャンバー６内の細胞が存在する状態で、制御手段１７の制御により、光源８がマイクロチャンバー６に向けて励起光２７を照射し、励起光２７が細胞展開用デバイス１０のマイクロチャンバー６内や流路５で反射して反射光２９と、場合により蛍光２８とを生じる。ここで、励起波長２７は前述の蛍光色素を励起可能な波長である。
　所定の受光位置に配置されたチャンバー検出部１６は、前記反射光２９を受光して、反射光２９の強弱から励起光２７の照射位置がマイクロチャンバー６の位置であるか流路５であるかを特定する。一方、細胞展開用デバイス１０の上方には、下から順に、集光レンズ１１、エミッションフィルタ１２、ピンホール部材１３、集光レンズ１４およびＰＭＴ（光電子増倍管）が同軸で配置されており、励起光２７の照射によりマイクロチャンバー６内の希少細胞に結合している蛍光標識から発した蛍光２８が、希少細胞検出部１５に導かれて、希少細胞の蛍光シグナルを希少細胞検出部１５で検出する。なお、この検出は上記光学検出系の代わりに蛍光顕微鏡を用いて行うこととしてもよい。制御手段１７は、蛍光２８の強度から、希少細胞の有無や位置の特定を行い、送液装置２０のポンプを制御して希少細胞をピックアップする。
　上述した希少細胞回収システム１００の他の例として、希少細胞回収システム１００の構成に加えて、細胞展開用デバイス１０を保持しつつ傾斜させて、制御手段１７の制御を受けて、マイクロチャンバーチップ上に展開された細胞の位置を移動させる移動力を上述したように間欠的に付与するシェーカーを設けてもよい。これとは別に、マイクロチャンバーチップを保持可能な保持手段を備え、前記制御手段１７の制御を受けて、細胞展開用デバイス１０の一端部を保持して間欠的に遠心力を付与することにより、マイクロチャンバーチップ上に展開された細胞の位置を移動させる移動力を上述したように間欠的に付与する遠心装置を設けてもよい。また、細胞展開用デバイス１０上のマイクロチャンバー６の位置が予め記憶されて、細胞展開デバイス１０の位置制御が行われる場合や細胞展開用デバイス１０に基準位置マークなどが付与されている場合など、マイクロチャンバー６の位置を特段に検出する必要なく細胞展開デバイス１０の位置制御を行うなどの際には、チャンバー検出部１６を省略することもできる。
　以下、本発明について実施例を挙げてさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
　［実施例１］
　マイクロチャンバーチップとして、直径１００μｍ、深さ５０μｍのマイクロチャンバーが格子状に配置（隣接するマイクロチャンバー底面の中心間の距離であるピッチは２１０μｍ）されたものを使用した。マイクロチャンバーチップはポリスチレン製であり、マイクロチャンバーの形状は、底部が平坦な逆円錐形であった。
　マイクロチャンバーが形成されているマイクロチャンバーチップの表面に、縦１５ｍｍ、横２６ｍｍ、高さ１００μｍの流路が形成されるように、ポリスチレン製の流路形成枠体を配設して、マイクロチャンバーチップと流路形成枠体を一体化した。得られた細胞展開用デバイスの流路は、１．５ｍｍ2の断面積、３９ｍｍ3（＝３９μＬ）の容積を有する。なお、送液装置は、KDS 200 ２本架シリンジポンプ（Kd Scientific社製）を用いた。
　なお、流路形成枠体には入口部と出口部がそれぞれ形成されており、一体化した状態で、流路を介して入口部と出口部とが連通している。
　工程(Ｗ)として、７０％エタノール水溶液を流量１ｍＬ/分（＝流速１１. １１μｍ/秒）で１００μＬ送液した後、細胞展開用デバイス１０の入口部３からＰＢＳを流量１ｍＬ/分で２００μＬ送液することによって、マイクロチャンバー内の気泡を除去した。
　工程(Ｘ)として、０．４％ホルムアルデヒドで細胞固定したＪｕｒｋａｔ細胞をＰＢＳで懸濁した細胞懸濁液（１×１０6cells/ｍＬ）を、流量０．１ｍＬ/分（＝流速１. １１μｍ/秒）で１００μＬ連続送液し、マイクロチャンバーチップ表面に細胞展開した。５分間静置した後のマイクロチャンバーチップ表面の拡大画像を図５(Ａ)に示す。白い点が細胞を表わすが、細胞はマイクロチャンバー内外に分散して沈降していた。
　工程(Ｙ)として、流量０．１ｍＬ/分でＰＢＳ０．１μＬを流路に送液するワンショット送液とその後の５秒間の静置とからなる間欠送液を連続的に１０回行った。このときのマイクロチャンバー表面の拡大画像を図５(Ｂ)に示す。間欠送液前にはマイクロチャンバー外に散らばっていた細胞のほとんどが、マイクロチャンバー内に収容されていることを確認することができた。
　細胞展開用デバイスの流路に導入した全細胞数を１００％としたとき、マイクロチャンバー内に収容された細胞数は９８％に相当した。すなわち、細胞の回収率は９８％であった。
　なお、細胞回収率については、回収細胞数／細胞全体数×１００（％）で算出した。この細胞全体数については、血球計算盤を用いて細胞懸濁液中の細胞濃度を算出し、流路に導入した体積から換算した。
　一方、回収細胞数については、細胞を顕微鏡下にて目視でカウントした。具体的には、流路内のいくつかのマイクロチャンバーを選択し、それに保持されている細胞のカウントを行い、マイクロチャンバー１つ当たりの平均細胞数を算出し、前記平均細胞数に流路内の全チャンバー数を乗じた数を回収した回収細胞数とした。
　［実施例２］
　実施例１の工程(Ｙ)の後に、工程(Ｚ)を実施した。すなわち、工程(Ｚ)として、ＰＢＳを流量０.１ｍＬ/分で２００μＬ連続送液した。図６に示すように、実施例１の工程(Ｙ)実施後、マイクロチャンバー内に収容され一部のマイクロチャンバー内で重層化した細胞（図６(Ａ)）が、工程(Ｚ)を実施することによって単層化した（図６(Ｂ)）。
　［実施例３］
　実施例２の工程(Ｚ)の後に、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色液を０. １ｍＬ/分で２００μＬ連続送液した。３分後、顕微鏡で細胞を観察した。その結果を図７に示す。このＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色液は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社 「Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２　１０ｍｇ／ｍＬ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ　ｗａｔｅｒ」を同社の手順書に従って希釈して調製した。
　図７では、一つのマイクロチャンバーしか示していないが、細胞展開用デバイスに導入した全細胞のうち９０％に相当する数の細胞が染色されていた。
　［実施例４～６］
　実施例１において、マイクロチャンバーチップの代わりに、マイクロチャンバーの底部に、メイワフォーシス社製のＵＶオゾンクリーナーにてＵＶオゾン処理を０秒、３０秒、１分間行ったマイクロチャンバーチップを使用した以外は実施例１と同様にして工程(Ｗ)、(Ｘ)、 (Ｙ)を実施した。その後、工程(Ｚ)として、ＰＢＳを流量１０ｍＬ/分で２００μＬ連続送液した。
　ＵＶオゾン処理を施したマイクロチャンバーと水の接触角（以下、接触角と略称する。
）をＦＴＡ社製の動的接触角計（ＦＴＡ１０５）にて測定した結果、７０度であった。
　顕微鏡で細胞を観察したら、マイクロチャンバー内に収容された第1層目の細胞が安定して保持されていた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　［実施例７］
　実施例１において、実施例１で用いたＰＢＳの代わりにＢＳＡを３重量％含有するＰＢＳを用いた点、工程（Ｙ）の流量を０．１ｍＬ/分から０．０５ｍＬ/分に変更した点以外は実施例１と同様に工程(Ｗ)、(Ｘ)および(Ｙ)を実施し細胞を観察した。この結果、より低流量の間欠送液にて実施例１とほぼ同程度の細胞回収率を達成出来た。
　［実施例８］
　実施例１の工程(Ｙ)として、シェーカー（Heidolph社polyMAX１０４０）を２０rpm１分間とその後の５秒間の静置を連続的に１０回繰り返した。細胞を観察した結果、ポンプ駆動なしで実施例１とほぼ同程度の細胞回収率を達成出来た。
　［比較例１］
　実施例１において、工程(Ｙ)を実施しなかった以外は実施例１と同様に細胞観察を行った。
　その結果、図５(Ａ)と同様に、マイクロチャンバー外にも細胞が多数散らばっていた。
　以上、本発明に係る実施の形態および実施例を、図面を参照しながら説明してきたが、本発明はこれら実施の形態および実施例に限定されず、本発明の要旨を逸脱しない限り、設計変更等は許容される。
　例えば、流路形成枠体２とマイクロチャンバーチップ１とにより流路５を形成しているが、この構成に限られない。すなわち、流路は、細胞懸濁液をマイクロチャンバーチップ１上で流通させることができるものであればよいことから、例えば、マイクロチャンバーチップ１に対して、流路の壁部や天井部を射出成形により一体的に連続形成して流路５を形成してもよい。
  １　・・・マイクロチャンバーチップ
  ２　・・・流路形成枠体
  ２ａ・・・流路天板
  ２ｂ・・・流路シール
  ３　・・・入口部
  ４　・・・出口部
  ５　・・・流路
  ６　・・・マイクロチャンバー
  ７　・・・流路５の高さ
１０　・・・細胞展開用デバイス
１０Ａ　・・・リザーバー
１１　集光レンズ
１２　エミッションフィルタ
１３　ピンホール部材
１４　集光レンズ
１５　ＰＭＴ
１６　チャンバー検出部
１７　コンピュータ
１８　希少細胞特定部
１９　記憶媒体
２０　送液ポンプ（送液装置）
２１　送液ステーション
２２　サンプル
２３　希釈液
２４　標識抗体溶液
２５　洗浄液
２６　廃液容器
２７　励起光
２８　蛍光
２９　反射光
５０　光学検出系
１００　希少細胞回収システム

Claims (13)

  1. 　細胞を収容、保持することができるマイクロチャンバーを表面に有するマイクロチャンバーチップ上に流路が形成された細胞展開用デバイスに細胞懸濁液を流入させ、該細胞懸濁液中の希少細胞を前記マイクロチャンバー内に回収する方法であって、
    　工程(Ｘ)：細胞展開用デバイスの流路に細胞懸濁液を流入させて、細胞をマイクロチャンバーチップ上に展開する工程；および、
    　工程(Ｙ)：前記マイクロチャンバーチップ上に展開された細胞の位置を移動させる移動力を間欠的に付与する工程を含む希少細胞の回収方法。
  2. 　前記移動力は、前記マイクロチャンバー外に位置する細胞を移動させる力である、請求項１に記載の希少細胞の回収方法。
  3. 　工程(Ｗ)：前記工程(Ｘ)の前に、水よりも表面張力の低い水溶液を送液することによって、前記マイクロチャンバーチップの表面を濡らす工程をさらに含む、請求項１又は２に記載の希少細胞の回収方法。
  4. 　前記工程(Ｘ)において、前記流路へ導入する細胞懸濁液の流速を調節することにより、前記マイクロチャンバーチップの上の流路に均一に細胞を展開させる、請求項１～３のいずれか一項に記載の希少細胞の回収方法。
  5. 　前記工程(Ｙ)において、前記マイクロチャンバー外に位置する細胞が往復移動するように前記移動力を間欠的に付与する、請求項１～４のいずれか一項に記載の希少細胞の回収方法。
  6. 　前記工程（Ｙ）において、前記流路に対する送液と送液の停止とを繰り返す間欠送液を行うことで前記移動力を間欠的に付与する、請求項１～５のいずれか一項に記載の希少細胞の回収方法。
  7. 　工程(Ｚ)：前記工程(Ｙ)の後に、前記間欠送液の最大流速と同じ流速か、またはそれより大きい流速で連続送液することによって、前記マイクロチャンバー内に重層して収容された細胞の一部を、前記マイクロチャンバー外に出す工程をさらに含む、請求項６に記載の希少細胞の回収方法。
  8. 　上記希少細胞が、循環腫瘍細胞〔ＣＴＣ〕、循環血管内皮細胞〔ＣＥＣ〕および循環血管内皮前駆細胞〔ＣＥＰ〕のいずれか一種以上の細胞である、請求項１～７のいずれか一項に記載の希少細胞の回収方法。
  9. 　前記マイクロチャンバーチップに対して流路形成枠体を一体的に設けることで前記流路が形成されている、請求項１～８のいずれか一項に記載の希少細胞の回収方法。
  10. 　前記流路形成枠体に前記流路に連通する入口部と出口部が設けられている、請求項９に記載の希少細胞の回収方法。
  11. 　請求項１～１０のいずれか一項に記載の希少細胞の回収方法により、希少細胞を回収した後に前記マイクロチャンバーの流路に細胞染色液を送液して、細胞染色と希少細胞の検出を行う、希少細胞の検出方法。
  12. 　細胞を収容、保持することができるマイクロチャンバーを表面に有するマイクロチャンバーチップ上に流路が形成された細胞展開用デバイスと、該細胞展開用デバイスの流路に細胞懸濁液を送液する送液装置と、前記マイクロチャンバーチップ上に展開された細胞の位置を移動させる移動力を間欠的に付与する手段とを備え、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法を行う、希少細胞回収システム。
  13. 　細胞染色液で染色された希少細胞を検出可能な光学検出系をさらに備えており、請求項１１の検出方法を行う、請求項１２に記載の希少細胞回収システム。
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